毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカイン
【課題】毛乳頭細胞に作用するサイトカインの提供とその用途。
【解決手段】アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｓｅｐａｒａｔｅ）の終令幼虫の体液から単離された昆虫のサイトカインである成長阻害ペプチド（アミノ酸配列：ＥＮＦＳＧＧＣＶＡＧＹＭＲＴＰＤＧＲＣＫＰＴＦＹＱ）。該サイトカインによる毛乳頭細胞の活性化、該サイトカイン含んだ毛乳頭細胞を培養するための培地、細胞増殖剤及び養毛剤。
【解決手段】アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｓｅｐａｒａｔｅ）の終令幼虫の体液から単離された昆虫のサイトカインである成長阻害ペプチド（アミノ酸配列：ＥＮＦＳＧＧＣＶＡＧＹＭＲＴＰＤＧＲＣＫＰＴＦＹＱ）。該サイトカインによる毛乳頭細胞の活性化、該サイトカイン含んだ毛乳頭細胞を培養するための培地、細胞増殖剤及び養毛剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛乳頭細胞に作用するサイトカインに関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、タンパク質性のホルモン様物質であり、細胞の増殖、分化、機能発現などの様々な生体の機能を調節している。上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ， 以下、ＥＧＦと略称する）などの増殖因子の発見を端緒に、これまで多種類のサイトカインが、主に哺乳動物から発見されている。一般的に、サイトカインは、そのサイトカインに対応する受容体（サイトカイン受容体）を介して、その受容体を発現する細胞に作用する。
【０００３】
毛乳頭細胞は、毛髪の成長に関わる細胞であることから、養毛剤、育毛剤、発毛剤などの薬剤を開発している製薬業界および化粧品業界が注目している細胞である。これまで前記薬剤に使用されてきた活性物質は、植物由来の物質であった。生体において直接的に毛乳頭細胞に作用しているサイトカインは、前記薬剤に使用される活性物質の好ましい形態であると思われる。しかし、毛乳頭細胞に作用するサイトカインに関しては解明されていない点が多く、かかるサイトカインを含有する前記薬剤の開発には至っていない。
【０００４】
成長阻害ペプチド（Ｇｒｏｗｔｈ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ、以下、ＧＢＰと略称する）は、カリヤコマユバチ（Ｃｏｔｅｓｉａ ｋａｒｉｙａｉ）に寄生されたアワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｓｅｐａｒａｔｅ）の終令幼虫の体液から単離された昆虫のサイトカインである。ＧＢＰは、低分子量のペプチドからなるサイトカインであり、当初は鱗翅目昆虫の幼虫の発育を阻害するサイトカインとして公開された（特許文献１）。その後、ＧＢＰは、細胞増殖を誘導する作用（ヒトケラチノサイト、昆虫のＳｆ９細胞）、昆虫の血球を活性化させる作用などの複数の作用を示すサイトカインであることが明らかとなった（非特許文献１）。また、ＧＢＰを変異させた変異ペプチドの作用なども報告された（非特許文献２）。更に、ヒトケラチノサイトを用いた研究において、ＧＢＰはＥＧＦの受容体を介して作用する可能性が報告された（非特許文献３）。
【０００５】
本発明は、毛乳頭細胞に対するＧＢＰの新たな用途を見出した。
【特許文献１】特開平５−６５２９６号公報
【非特許文献１】バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ），２５０巻，１９９８年，ｐ．１９４−１９９
【非特許文献２】ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ），（米国），２７６巻，３４号，２００１年８月２４日，ｐ．３１８１３−３１８１８
【非特許文献３】ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ），（米国），２７６巻，４１号，２００１年１０月１２日，ｐ．３７９７４−３７９７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカインの提供。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
配列番号１記載のアミノ酸配列からなる化学合成可能な、毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカインを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
化学合成可能で且つ生物に由来する夾雑物の混入が回避または低減された、毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカインを提供し得る。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、前記ＧＢＰの毛乳頭細胞に対する用途を見出した。従って、本発明によって提供されるサイトカインは、前記ＧＢＰ及びそのアナログである。以下、本発明により提供されるサイトカインを「本サイトカイン」と称する。
【００１１】
本サイトカインが対象とする毛乳頭細胞は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物の毛乳頭細胞、より好ましくはヒトの毛乳頭細胞である。毛根には、毛球というふくらんだ部分があり、その中にある毛母細胞は盛んに分裂をくり返して毛髪を形成している。成長期の毛球の内側には、毛乳頭組織があり、毛髪を成長させる栄養分が毛細血管から送りこまれる。毛髪の成長には、毛乳頭細胞の活性、毛母細胞の増殖が重要な役割を担っている。従って、これらの細胞の細胞増殖を誘導することにより毛髪の状態を良好に保つことが可能である。
【００１２】
＜本サイトカインの特長＞
前記ＥＧＦは、アミノ酸５０残基程度からなるものである。このような５０残基程度のサイトカインを化学合成によって大量に調製することは、現在の技術では不可能である。このような技術的背景から、一般的にサイトカインは、生合成に基づく手段により生産される。その手段の代表的な例として、遺伝子組換え技術を利用し、宿主生物（例えば、宿主となる生物の個体または細胞）に所望のサイトカインを生産させる手段がある。このような生合成に基づく手段により前記サイトカインを生産する場合、生合成された前記サイトカインを、その生物に由来する夾雑物から精製する精製工程が必要となる。しかし、複数の精製工程を施して、生産物中の前記サイトカインの純度を上げても、夾雑物を完全に生産物から除去することは困難である。特に、タンパク質性の夾雑物は、同様にタンパク質であるサイトカインと物理化学的な特性が同じなので、除去することは困難である。以上のように、従来のサイトカインには夾雑物の混入という問題があった。
【００１３】
一方、本サイトカインは、低分子量（アミノ酸２５残基からなるペプチド）であることを特長とするサイトカインである。２５残基のアミノ酸配列からなるペプチドは、化学合成法による合成が可能である。化学合成によりサイトカインを合成できれば、生物に由来する夾雑物の混入を回避または低減できる。
【００１４】
以上のように、本サイトカインは、従来のサイトカインの問題を克服したサイトカインである。
【００１５】
＜本サイトカインの配列＞
本サイトカインは、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるサイトカインである。
また、本サイトカインは、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるサイトカインのアナログ（類似体）であってもよい。前記アナログは、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号１記載のアミノ酸配列からなるサイトカインと同じ活性を有するサイトカインであってもよい（このようなサイトカインの例は、例えば上記の非特許文献２などに例示されている）。また、前記アナログは、例えば、これらのサイトカインにおいて、いくつかの官能基が他の官能基で置換され、且つ配列番号１記載のアミノ酸配列からなるサイトカインと同じ活性を有するサイトカインであってもよい（このようなサイトカインの例は、例えば上記の特許文献１などに例示されている）。
【００１６】
配列番号１記載のアミノ酸配列は、図１においても示される２５残基からなる配列、即ちアミノ酸の一文字表記により、ＥＮＦＳＧＧＣＶＡＧＹＭＲＴＰＤＧＲＣＫＰＴＦＹＱで表される配列である。
【００１７】
＜本サイトカインの調製＞
本サイトカインは、当業者であれば、例えばｔ−Ｂｏｃ法、Ｆ−ｍｏｃ法などの公知のペプチドの化学合成法に従って合成することができる。また、本サイトカインは、上記の特許文献１の記載にしたがって合成することも可能である。更に、本サイトカインは、ペプチドを化学合成する会社に委託して合成することも可能である。
【００１８】
＜本サイトカインの作用＞
本サイトカインは、毛乳頭細胞を活性化する。
本発明において「活性化」の用語は、毛乳頭細胞に関して用いられる場合、細胞増殖を誘導することを意味する。また、本発明において「細胞増殖」の用語は、他に特に説明がない場合、本サイトカインの作用（または存在）する条件下で毛乳頭細胞の細胞分裂を生じ、本サイトカインが作用（または存在）しない条件下と比較して細胞数が増加することを意味している。細胞分裂は、細胞分裂に至るシグナル伝達経路が活性化し、前記経路の活性化の途上で生じるＤＮＡ複製などを経た後に達成される現象である。従って、前記用語は、本サイトカインが作用（または存在）する条件下でＤＮＡ複製を生じ、本サイトカインが作用（または存在）しない条件下と比較して細胞内のＤＮＡ量が増加することをも意味している。
【００１９】
また、本発明において「細胞増殖を誘導する」とは、他に特に説明がない場合、細胞増殖を生じさせること及び既に生じている細胞増殖を促進（または延長）することを意味している。
【００２０】
＜発明の態様＞
以下、本発明の代表的な態様について説明する。
【００２１】
［培 地]
一態様において、本発明は、本サイトカインを増殖因子として含有する培地（以下、このような培地を本培地と称する）として具現化されてもよい。この培地の組成は、増殖因子として本サイトカインを用いる以外は、毛乳頭細胞を培養する場合に用いられる通常の組成を使用すればよい。
【００２２】
培養時の本サイトカインの濃度は、予備実験を行って決定すればよいが、例えば、１０−７〜１０−３ｍＭの範囲、好ましくは１０−７〜１０−４ｍＭの範囲、より好ましくは１０−６〜１０−５ｍＭの範囲、最も好ましくは１０−５ｍＭを使用すればよい。或いは、例えば、１０−１１〜１０−４ｍＭの範囲、好ましくは１０−１１〜１０−７ｍＭの範囲、より好ましくは１０−１０〜１０−７ｍＭの範囲、更に好ましくは１０−９〜１０−８ｍＭの範囲、最も好ましくは１０−９ｍＭまたは１０−８ｍＭの濃度を使用すればよい。
【００２３】
本サイトカインは、上述のように夾雑物の混入が回避または低減し得るという特長を具備する。従って、本サイトカインを増殖因子として含有する培地も、血清や従来のサイトカインを増殖因子として含有する従来の培地と比較して、夾雑物の混入が回避または低減され得る。このような特長から、本培地は、例えば、次のような用途に好適である。
【００２４】
（ａ）基礎研究用：本培地は、基礎研究において、研究対象となる毛乳頭細胞を継代培養する用途に好適である。この理由として、一般にサイトカインは低濃度で細胞に作用しえるので、培地に増殖因子として添加したサイトカインに加えて夾雑物として他のサイトカインが含まれている場合、この他のサイトカインが毛乳頭細胞に作用して実験結果に影響する可能性があることなどが挙げられる。本培地は、夾雑物の混入が回避または低減されているため、夾雑物が実験結果に影響する可能性が少ない。
【００２５】
（ｂ）再生医療用：再生医療において、細胞をインビトロで増殖させるための培地は不可欠である。再生医療において、被験者から採取された細胞は、インビトロで増殖され、被検者の体に戻され、被験者の組織、器官などを再生する。このように、再生医療においては、培養された細胞が身体に戻されることから、その戻される細胞が培養中に病原体に汚染することがないように管理する必要がある。培養中に細胞が病原体で汚染された場合、その細胞のみならず、その細胞を移植された被検者がその病原体に感染する危険性が高くなる。本培地は、夾雑物の混入が回避または低減されているため、夾雑物として混入し得る病原体（例えば、プリオン、ウイルス、細菌、真菌、原虫など）に、細胞が感染する可能性を回避または低減し得る。
【００２６】
［細胞増殖剤および養毛剤］
また、別の態様において、本発明は、本サイトカインを主成分（活性成分）として含有する細胞増殖剤として具現化されてもよい。この細胞増殖剤を投与することにより、投与部位に存在する毛乳頭細胞が活性化して増殖する。更に、別の態様において、本発明は、本サイトカインを主成分（活性成分）として含有する養毛剤として具現化されてもよい。この養毛剤により、上記に記載したように、投与部位に存在する毛乳頭細胞が活性化して増殖し、結果的に毛髪の状態を良好に保つことが可能である。
【００２７】
当業者であれば、本サイトカインを含有するこれらの薬剤を、皮膚（例えば、頭皮、頭髪）などの投与部位に応じて、各種の担体、賦形剤などを加えて適切な製剤（例えば、軟膏剤、噴霧剤）に製剤化できる。なお、「養毛剤」の用語は、適切な場合には発毛剤、育毛剤などの他の用語に置き換えてもよいだろう。
【００２８】
本発明を以下の実施例によって更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
＜実施例１＞
ＧＢＰの増殖活性
ヒト頭髪毛乳頭細胞（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を、毛乳頭細胞増殖培地（毛乳頭細胞増殖培地（ＰＣＧＭ） Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＴＰＧＭ−２５０、Ｔｏｙｏｂｏ社製）に増殖用添加物（１％牛脳下垂体抽出液、１％牛胎児血清、０．５％インシュリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン混液、０．５％サイプロテインアセテートを添加した培養液を用いて培養した。９６ウェルプレートを使い１００μＬ／ウェルの培養液で、ヒト頭髪毛乳頭細胞を１５００細胞／ウェルの細胞濃度で蒔き、３７℃、５％ＣＯ２、加湿状態で１日培養する。培養液を吸い取り、１００μＬ／ウェルの毛乳頭細胞増殖培地に０．５％牛胎児血清を添加した培養液（以下、この組成の培養液を血清含有培地と称する）を用いて１回洗浄して、さらに１００μＬ／ウェルの血清含有培地を加え３７℃、５％ＣＯ２、加湿状態で１日培養する。
【００３０】
血清含有培地にＧＢＰ（図１）を１０−９〜１００mＭの濃度で添加した培養液を作製し、前記プレート中の培養液をこのＧＢＰを添加した培養液に交換し、３７℃、５％ＣＯ２、加湿状態で３日間培養する。
【００３１】
３日後の１ウェル当たりの細胞数を、細胞内のアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）量を測定することによって比較した。この測定は、Ｖｉａｌｉｇｈｔ ＨＳ（ＬｕｍｉＴｅｃｈ社製）を用いて、この製品に添付された説明書に従い以下のようにおこなった。３日間培養した各ウェルにヌクレオチド放出試薬１００μＬを加え５分間室温で静置し、ＡＴＰを抽出した。蛍光測定用の白色プレート中の各ウェルに、上記で抽出した各々のＡＴＰ抽出液１８０μＬを移しかえ、その各々の抽出液に２０μＬのＡＴＰモニタリング試薬を加え、蛍光／発光／吸光マルチプレートリーダー：Ｇｅｎｉｏｓ（テカン社製）を用いて、その蛍光強度を測定した。この結果を図２のグラフに示す。
【００３２】
図２において、コントロールは、ＧＢＰを添加していない培養液で培養した陰性コントロールの増殖活性を示す。この陰性コントロールの蛍光強度を１００％として、他のサンプルの蛍光強度を％に変換してグラフ中に示した。この実施例の結果、１０−８〜１０−４ ｍＭのＧＢＰによって、陰性コントロール（ＧＢＰ無添加）と比較して約１１０〜１４０％の細胞増殖が観察された（図２）。
【００３３】
＜実施例２＞
無血清培地におけるＧＢＰの増殖活性
ヒト頭髪毛乳頭細胞（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を、毛乳頭細胞増殖培地（Ｔｏｙｏｂｏ社製）＋増殖用添加物（１％牛脳下垂体抽出液、１％牛胎児血清、０．５％インシュリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン混液、０．５％サイプロテロンアセテート溶液）を添加した培養液を用いて培養した。９６ウェルプレートを使い１００μＬ／ウェルの培養液で、ヒト頭髪毛乳頭細胞を１５００細胞／ウェルで蒔き３７℃、５％ ＣＯ２、加湿状態で１日培養する。培養液を吸い取り、１００μＬ／ウェルの毛乳頭細胞増殖培地に０．５％牛胎児血清を添加した培養液で１回洗浄して、１００μＬ／ウェルの毛乳頭細胞増殖培地（血清なし）を加え３７℃、５％ ＣＯ２、加湿状態で１日培養する。
【００３４】
毛乳頭細胞増殖培地（血清なし）にＧＢＰを１０−９〜１０ｍＭ添加した培養液を作製し、前記プレート中の培養液をこのＧＢＰを添加した培養液に交換し、３７℃、５％ ＣＯ２、加湿状態で３日培養する。
【００３５】
３日後の１ウェル当たりの細胞数を細胞内ＡＴＰ量の量を測定することによって比較した。その測定はＶｉａｌｉｇｈｔ ＨＳ（ＬｕｍｉＴｅｃｈ社製）を用いて、この製品に添付された説明書に従い以下のようにおこなった。３日培養した各ウェルにヌクレオチド放出試薬１００μＬを加え５分間室温で静置し、ＡＴＰを抽出した。蛍光測定用の白色プレート中の各ウェルに、上記で抽出した各々のＡＴＰ抽出液１８０μＬを移しかえ、その各々の抽出液に２０μＬのＡＴＰモニタリング試薬を加え、蛍光／発光／吸光マルチプレートリーダー：Ｇｅｎｉｏｓ（テカン社製）を用いてその蛍光を測定した。本実施例の結果を図３に示す。
【００３６】
図３において、血清を添加しない毛乳頭細胞増殖培地で培養した陰性コントロールの蛍光強度を１００％として、他のサンプルの蛍光強度を％に変換してグラフ中に示した。ＧＢＰ濃度が１０−４〜１０−７ ｍＭの間で１００％以上の活性を示した（図３）。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＧＢＰのアミノ酸配列を表わす図である。
【図２】ＧＢＰの増殖活性を示すグラフである。
【図３】ＧＢＰの増殖活性を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛乳頭細胞に作用するサイトカインに関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、タンパク質性のホルモン様物質であり、細胞の増殖、分化、機能発現などの様々な生体の機能を調節している。上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ， 以下、ＥＧＦと略称する）などの増殖因子の発見を端緒に、これまで多種類のサイトカインが、主に哺乳動物から発見されている。一般的に、サイトカインは、そのサイトカインに対応する受容体（サイトカイン受容体）を介して、その受容体を発現する細胞に作用する。
【０００３】
毛乳頭細胞は、毛髪の成長に関わる細胞であることから、養毛剤、育毛剤、発毛剤などの薬剤を開発している製薬業界および化粧品業界が注目している細胞である。これまで前記薬剤に使用されてきた活性物質は、植物由来の物質であった。生体において直接的に毛乳頭細胞に作用しているサイトカインは、前記薬剤に使用される活性物質の好ましい形態であると思われる。しかし、毛乳頭細胞に作用するサイトカインに関しては解明されていない点が多く、かかるサイトカインを含有する前記薬剤の開発には至っていない。
【０００４】
成長阻害ペプチド（Ｇｒｏｗｔｈ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ、以下、ＧＢＰと略称する）は、カリヤコマユバチ（Ｃｏｔｅｓｉａ ｋａｒｉｙａｉ）に寄生されたアワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｓｅｐａｒａｔｅ）の終令幼虫の体液から単離された昆虫のサイトカインである。ＧＢＰは、低分子量のペプチドからなるサイトカインであり、当初は鱗翅目昆虫の幼虫の発育を阻害するサイトカインとして公開された（特許文献１）。その後、ＧＢＰは、細胞増殖を誘導する作用（ヒトケラチノサイト、昆虫のＳｆ９細胞）、昆虫の血球を活性化させる作用などの複数の作用を示すサイトカインであることが明らかとなった（非特許文献１）。また、ＧＢＰを変異させた変異ペプチドの作用なども報告された（非特許文献２）。更に、ヒトケラチノサイトを用いた研究において、ＧＢＰはＥＧＦの受容体を介して作用する可能性が報告された（非特許文献３）。
【０００５】
本発明は、毛乳頭細胞に対するＧＢＰの新たな用途を見出した。
【特許文献１】特開平５−６５２９６号公報
【非特許文献１】バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ），２５０巻，１９９８年，ｐ．１９４−１９９
【非特許文献２】ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ），（米国），２７６巻，３４号，２００１年８月２４日，ｐ．３１８１３−３１８１８
【非特許文献３】ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ），（米国），２７６巻，４１号，２００１年１０月１２日，ｐ．３７９７４−３７９７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカインの提供。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
配列番号１記載のアミノ酸配列からなる化学合成可能な、毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカインを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
化学合成可能で且つ生物に由来する夾雑物の混入が回避または低減された、毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカインを提供し得る。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、前記ＧＢＰの毛乳頭細胞に対する用途を見出した。従って、本発明によって提供されるサイトカインは、前記ＧＢＰ及びそのアナログである。以下、本発明により提供されるサイトカインを「本サイトカイン」と称する。
【００１１】
本サイトカインが対象とする毛乳頭細胞は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物の毛乳頭細胞、より好ましくはヒトの毛乳頭細胞である。毛根には、毛球というふくらんだ部分があり、その中にある毛母細胞は盛んに分裂をくり返して毛髪を形成している。成長期の毛球の内側には、毛乳頭組織があり、毛髪を成長させる栄養分が毛細血管から送りこまれる。毛髪の成長には、毛乳頭細胞の活性、毛母細胞の増殖が重要な役割を担っている。従って、これらの細胞の細胞増殖を誘導することにより毛髪の状態を良好に保つことが可能である。
【００１２】
＜本サイトカインの特長＞
前記ＥＧＦは、アミノ酸５０残基程度からなるものである。このような５０残基程度のサイトカインを化学合成によって大量に調製することは、現在の技術では不可能である。このような技術的背景から、一般的にサイトカインは、生合成に基づく手段により生産される。その手段の代表的な例として、遺伝子組換え技術を利用し、宿主生物（例えば、宿主となる生物の個体または細胞）に所望のサイトカインを生産させる手段がある。このような生合成に基づく手段により前記サイトカインを生産する場合、生合成された前記サイトカインを、その生物に由来する夾雑物から精製する精製工程が必要となる。しかし、複数の精製工程を施して、生産物中の前記サイトカインの純度を上げても、夾雑物を完全に生産物から除去することは困難である。特に、タンパク質性の夾雑物は、同様にタンパク質であるサイトカインと物理化学的な特性が同じなので、除去することは困難である。以上のように、従来のサイトカインには夾雑物の混入という問題があった。
【００１３】
一方、本サイトカインは、低分子量（アミノ酸２５残基からなるペプチド）であることを特長とするサイトカインである。２５残基のアミノ酸配列からなるペプチドは、化学合成法による合成が可能である。化学合成によりサイトカインを合成できれば、生物に由来する夾雑物の混入を回避または低減できる。
【００１４】
以上のように、本サイトカインは、従来のサイトカインの問題を克服したサイトカインである。
【００１５】
＜本サイトカインの配列＞
本サイトカインは、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるサイトカインである。
また、本サイトカインは、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるサイトカインのアナログ（類似体）であってもよい。前記アナログは、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号１記載のアミノ酸配列からなるサイトカインと同じ活性を有するサイトカインであってもよい（このようなサイトカインの例は、例えば上記の非特許文献２などに例示されている）。また、前記アナログは、例えば、これらのサイトカインにおいて、いくつかの官能基が他の官能基で置換され、且つ配列番号１記載のアミノ酸配列からなるサイトカインと同じ活性を有するサイトカインであってもよい（このようなサイトカインの例は、例えば上記の特許文献１などに例示されている）。
【００１６】
配列番号１記載のアミノ酸配列は、図１においても示される２５残基からなる配列、即ちアミノ酸の一文字表記により、ＥＮＦＳＧＧＣＶＡＧＹＭＲＴＰＤＧＲＣＫＰＴＦＹＱで表される配列である。
【００１７】
＜本サイトカインの調製＞
本サイトカインは、当業者であれば、例えばｔ−Ｂｏｃ法、Ｆ−ｍｏｃ法などの公知のペプチドの化学合成法に従って合成することができる。また、本サイトカインは、上記の特許文献１の記載にしたがって合成することも可能である。更に、本サイトカインは、ペプチドを化学合成する会社に委託して合成することも可能である。
【００１８】
＜本サイトカインの作用＞
本サイトカインは、毛乳頭細胞を活性化する。
本発明において「活性化」の用語は、毛乳頭細胞に関して用いられる場合、細胞増殖を誘導することを意味する。また、本発明において「細胞増殖」の用語は、他に特に説明がない場合、本サイトカインの作用（または存在）する条件下で毛乳頭細胞の細胞分裂を生じ、本サイトカインが作用（または存在）しない条件下と比較して細胞数が増加することを意味している。細胞分裂は、細胞分裂に至るシグナル伝達経路が活性化し、前記経路の活性化の途上で生じるＤＮＡ複製などを経た後に達成される現象である。従って、前記用語は、本サイトカインが作用（または存在）する条件下でＤＮＡ複製を生じ、本サイトカインが作用（または存在）しない条件下と比較して細胞内のＤＮＡ量が増加することをも意味している。
【００１９】
また、本発明において「細胞増殖を誘導する」とは、他に特に説明がない場合、細胞増殖を生じさせること及び既に生じている細胞増殖を促進（または延長）することを意味している。
【００２０】
＜発明の態様＞
以下、本発明の代表的な態様について説明する。
【００２１】
［培 地]
一態様において、本発明は、本サイトカインを増殖因子として含有する培地（以下、このような培地を本培地と称する）として具現化されてもよい。この培地の組成は、増殖因子として本サイトカインを用いる以外は、毛乳頭細胞を培養する場合に用いられる通常の組成を使用すればよい。
【００２２】
培養時の本サイトカインの濃度は、予備実験を行って決定すればよいが、例えば、１０−７〜１０−３ｍＭの範囲、好ましくは１０−７〜１０−４ｍＭの範囲、より好ましくは１０−６〜１０−５ｍＭの範囲、最も好ましくは１０−５ｍＭを使用すればよい。或いは、例えば、１０−１１〜１０−４ｍＭの範囲、好ましくは１０−１１〜１０−７ｍＭの範囲、より好ましくは１０−１０〜１０−７ｍＭの範囲、更に好ましくは１０−９〜１０−８ｍＭの範囲、最も好ましくは１０−９ｍＭまたは１０−８ｍＭの濃度を使用すればよい。
【００２３】
本サイトカインは、上述のように夾雑物の混入が回避または低減し得るという特長を具備する。従って、本サイトカインを増殖因子として含有する培地も、血清や従来のサイトカインを増殖因子として含有する従来の培地と比較して、夾雑物の混入が回避または低減され得る。このような特長から、本培地は、例えば、次のような用途に好適である。
【００２４】
（ａ）基礎研究用：本培地は、基礎研究において、研究対象となる毛乳頭細胞を継代培養する用途に好適である。この理由として、一般にサイトカインは低濃度で細胞に作用しえるので、培地に増殖因子として添加したサイトカインに加えて夾雑物として他のサイトカインが含まれている場合、この他のサイトカインが毛乳頭細胞に作用して実験結果に影響する可能性があることなどが挙げられる。本培地は、夾雑物の混入が回避または低減されているため、夾雑物が実験結果に影響する可能性が少ない。
【００２５】
（ｂ）再生医療用：再生医療において、細胞をインビトロで増殖させるための培地は不可欠である。再生医療において、被験者から採取された細胞は、インビトロで増殖され、被検者の体に戻され、被験者の組織、器官などを再生する。このように、再生医療においては、培養された細胞が身体に戻されることから、その戻される細胞が培養中に病原体に汚染することがないように管理する必要がある。培養中に細胞が病原体で汚染された場合、その細胞のみならず、その細胞を移植された被検者がその病原体に感染する危険性が高くなる。本培地は、夾雑物の混入が回避または低減されているため、夾雑物として混入し得る病原体（例えば、プリオン、ウイルス、細菌、真菌、原虫など）に、細胞が感染する可能性を回避または低減し得る。
【００２６】
［細胞増殖剤および養毛剤］
また、別の態様において、本発明は、本サイトカインを主成分（活性成分）として含有する細胞増殖剤として具現化されてもよい。この細胞増殖剤を投与することにより、投与部位に存在する毛乳頭細胞が活性化して増殖する。更に、別の態様において、本発明は、本サイトカインを主成分（活性成分）として含有する養毛剤として具現化されてもよい。この養毛剤により、上記に記載したように、投与部位に存在する毛乳頭細胞が活性化して増殖し、結果的に毛髪の状態を良好に保つことが可能である。
【００２７】
当業者であれば、本サイトカインを含有するこれらの薬剤を、皮膚（例えば、頭皮、頭髪）などの投与部位に応じて、各種の担体、賦形剤などを加えて適切な製剤（例えば、軟膏剤、噴霧剤）に製剤化できる。なお、「養毛剤」の用語は、適切な場合には発毛剤、育毛剤などの他の用語に置き換えてもよいだろう。
【００２８】
本発明を以下の実施例によって更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
＜実施例１＞
ＧＢＰの増殖活性
ヒト頭髪毛乳頭細胞（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を、毛乳頭細胞増殖培地（毛乳頭細胞増殖培地（ＰＣＧＭ） Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＴＰＧＭ−２５０、Ｔｏｙｏｂｏ社製）に増殖用添加物（１％牛脳下垂体抽出液、１％牛胎児血清、０．５％インシュリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン混液、０．５％サイプロテインアセテートを添加した培養液を用いて培養した。９６ウェルプレートを使い１００μＬ／ウェルの培養液で、ヒト頭髪毛乳頭細胞を１５００細胞／ウェルの細胞濃度で蒔き、３７℃、５％ＣＯ２、加湿状態で１日培養する。培養液を吸い取り、１００μＬ／ウェルの毛乳頭細胞増殖培地に０．５％牛胎児血清を添加した培養液（以下、この組成の培養液を血清含有培地と称する）を用いて１回洗浄して、さらに１００μＬ／ウェルの血清含有培地を加え３７℃、５％ＣＯ２、加湿状態で１日培養する。
【００３０】
血清含有培地にＧＢＰ（図１）を１０−９〜１００mＭの濃度で添加した培養液を作製し、前記プレート中の培養液をこのＧＢＰを添加した培養液に交換し、３７℃、５％ＣＯ２、加湿状態で３日間培養する。
【００３１】
３日後の１ウェル当たりの細胞数を、細胞内のアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）量を測定することによって比較した。この測定は、Ｖｉａｌｉｇｈｔ ＨＳ（ＬｕｍｉＴｅｃｈ社製）を用いて、この製品に添付された説明書に従い以下のようにおこなった。３日間培養した各ウェルにヌクレオチド放出試薬１００μＬを加え５分間室温で静置し、ＡＴＰを抽出した。蛍光測定用の白色プレート中の各ウェルに、上記で抽出した各々のＡＴＰ抽出液１８０μＬを移しかえ、その各々の抽出液に２０μＬのＡＴＰモニタリング試薬を加え、蛍光／発光／吸光マルチプレートリーダー：Ｇｅｎｉｏｓ（テカン社製）を用いて、その蛍光強度を測定した。この結果を図２のグラフに示す。
【００３２】
図２において、コントロールは、ＧＢＰを添加していない培養液で培養した陰性コントロールの増殖活性を示す。この陰性コントロールの蛍光強度を１００％として、他のサンプルの蛍光強度を％に変換してグラフ中に示した。この実施例の結果、１０−８〜１０−４ ｍＭのＧＢＰによって、陰性コントロール（ＧＢＰ無添加）と比較して約１１０〜１４０％の細胞増殖が観察された（図２）。
【００３３】
＜実施例２＞
無血清培地におけるＧＢＰの増殖活性
ヒト頭髪毛乳頭細胞（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を、毛乳頭細胞増殖培地（Ｔｏｙｏｂｏ社製）＋増殖用添加物（１％牛脳下垂体抽出液、１％牛胎児血清、０．５％インシュリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン混液、０．５％サイプロテロンアセテート溶液）を添加した培養液を用いて培養した。９６ウェルプレートを使い１００μＬ／ウェルの培養液で、ヒト頭髪毛乳頭細胞を１５００細胞／ウェルで蒔き３７℃、５％ ＣＯ２、加湿状態で１日培養する。培養液を吸い取り、１００μＬ／ウェルの毛乳頭細胞増殖培地に０．５％牛胎児血清を添加した培養液で１回洗浄して、１００μＬ／ウェルの毛乳頭細胞増殖培地（血清なし）を加え３７℃、５％ ＣＯ２、加湿状態で１日培養する。
【００３４】
毛乳頭細胞増殖培地（血清なし）にＧＢＰを１０−９〜１０ｍＭ添加した培養液を作製し、前記プレート中の培養液をこのＧＢＰを添加した培養液に交換し、３７℃、５％ ＣＯ２、加湿状態で３日培養する。
【００３５】
３日後の１ウェル当たりの細胞数を細胞内ＡＴＰ量の量を測定することによって比較した。その測定はＶｉａｌｉｇｈｔ ＨＳ（ＬｕｍｉＴｅｃｈ社製）を用いて、この製品に添付された説明書に従い以下のようにおこなった。３日培養した各ウェルにヌクレオチド放出試薬１００μＬを加え５分間室温で静置し、ＡＴＰを抽出した。蛍光測定用の白色プレート中の各ウェルに、上記で抽出した各々のＡＴＰ抽出液１８０μＬを移しかえ、その各々の抽出液に２０μＬのＡＴＰモニタリング試薬を加え、蛍光／発光／吸光マルチプレートリーダー：Ｇｅｎｉｏｓ（テカン社製）を用いてその蛍光を測定した。本実施例の結果を図３に示す。
【００３６】
図３において、血清を添加しない毛乳頭細胞増殖培地で培養した陰性コントロールの蛍光強度を１００％として、他のサンプルの蛍光強度を％に変換してグラフ中に示した。ＧＢＰ濃度が１０−４〜１０−７ ｍＭの間で１００％以上の活性を示した（図３）。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＧＢＰのアミノ酸配列を表わす図である。
【図２】ＧＢＰの増殖活性を示すグラフである。
【図３】ＧＢＰの増殖活性を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列からなる化学合成可能な、毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカイン。
【請求項２】
配列番号１記載のアミノ酸配列、または
該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなる化学合成可能なサイトカインであって、毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカイン。
【請求項３】
請求項１または２に記載のサイトカインであって、前記毛乳頭細胞が哺乳動物の毛乳頭細胞であるサイトカイン。
【請求項４】
請求項１または２に記載のサイトカインであって、前記毛乳頭細胞がヒトの毛乳頭細胞であるサイトカイン。
【請求項５】
毛乳頭細胞を培養するための培地であって、請求項１〜４の何れか１項に記載のサイトカインを含有することを特徴とする培地。
【請求項６】
毛乳頭細胞を増殖させるための細胞増殖剤であって、請求項１〜４の何れか１項に記載のサイトカインを含有することを特徴とする細胞増殖剤。
【請求項７】
毛乳頭細胞の細胞増殖を誘導して毛髪の状態を良好に保つための養毛剤であって、請求項１〜４の何れか１項に記載のサイトカインを含有することを特徴とする養毛剤。
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列からなる化学合成可能な、毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカイン。
【請求項２】
配列番号１記載のアミノ酸配列、または
該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなる化学合成可能なサイトカインであって、毛乳頭細胞を活性化するためのサイトカイン。
【請求項３】
請求項１または２に記載のサイトカインであって、前記毛乳頭細胞が哺乳動物の毛乳頭細胞であるサイトカイン。
【請求項４】
請求項１または２に記載のサイトカインであって、前記毛乳頭細胞がヒトの毛乳頭細胞であるサイトカイン。
【請求項５】
毛乳頭細胞を培養するための培地であって、請求項１〜４の何れか１項に記載のサイトカインを含有することを特徴とする培地。
【請求項６】
毛乳頭細胞を増殖させるための細胞増殖剤であって、請求項１〜４の何れか１項に記載のサイトカインを含有することを特徴とする細胞増殖剤。
【請求項７】
毛乳頭細胞の細胞増殖を誘導して毛髪の状態を良好に保つための養毛剤であって、請求項１〜４の何れか１項に記載のサイトカインを含有することを特徴とする養毛剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−４５０９８（Ｐ２００６−４５０９８Ａ）
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２２６９８５（Ｐ２００４−２２６９８５）
【出願日】平成１６年８月３日（２００４．８．３）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月３日（２００４．８．３）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
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