毛管電気泳動を用いる、荷電シクロデキストリン類での薬学的化合物のキラル分離
【課題】毛管電気泳動によって広い範囲のキラル化合物を分割（分析）するために用いられる新規な一連の荷電シクロデキストリン類を提供すること。
【解決手段】ａ）アルファシクロデキストリン、ｂ）少なくとも約１２個の修飾されたヒドロキシル基を有するベータシクロデキストリン、及びｃ）ガンマシクロデキストリンからなる群から選ばれ、二級ヒドロキシルの少なくとも１つの修飾を含んでなることを特徴とする荷電シクロデキストリン。
【解決手段】ａ）アルファシクロデキストリン、ｂ）少なくとも約１２個の修飾されたヒドロキシル基を有するベータシクロデキストリン、及びｃ）ガンマシクロデキストリンからなる群から選ばれ、二級ヒドロキシルの少なくとも１つの修飾を含んでなることを特徴とする荷電シクロデキストリン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、毛管電気泳動によって光学異性体を分離するためにシクロデキストリン類を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬学的製剤に使用される多くの化学的化合物は、それらの薬学的性質に強く影響を与えることができる光学活性の原因となる非対称中心を有する。２種の鏡像異性体の１種が異なった薬学的性質を有する合成薬剤の例がよく知られている。例えば、（−）−プロプラノロールは、（＋）プロプラノロールよりも１００倍の薬効がある。加えて、同じ薬剤の２種の鏡像異性体の１種が、より毒性が強い場合があり、例えばサリドマイドやケタミン等が挙げられる。従って、高いラセミ体の分割能力（分解能）と高い効率で鏡像異性体を分離する分析的方法が増々重要になってきている。立体化学的に純粋な薬と、現存するラセミ化合物の念入りな試験との必要性から、効率的で、迅速で、鋭敏でしかも精確なキラル分析法の開発が必要とされている。
クロマトグラフィー技術、特に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、が鏡像異性体の分析用に普通に使用されている。かなり最近、毛管電気泳動（ＣＥ）がキラルセレクターとともに使用するものとして採用されている。使用される最も普通の戦略は、鏡像異性体対の差別的なホスト−ゲスト複合体形成のためのシクロデキストリン類の使用である〔Ｓ．ファナリー，Ｊ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，７３５：７７−１２１（１９９６）；Ｈ．ニシ及びＳ．テラベ，Ｊ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６９４：２４５−２７６（１９９５）；Ａ．ガットマン，「シクロデキストリン配列キラル分析による鏡像異性体の毛管電気泳動分離」、毛管電気泳動のハンドブック第２版、Ｊ．ランダース編、１９９７、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．の７５〜１００頁〕。固体支持体に結合した溶解剤を含む多種多様の入手可能なカラムから入念に選択しなければならないＨＰＬＣ分離とは対照的に、キラルＣＥ分析は、一般にシクロデキストリンのようなキラルセレクターを分離緩衝剤中に溶解せしめることによって簡素化される。
【０００３】
シクロデキストリン類（ＣＤ）は、α−、β−又はγ−シクロデキストリンの名前に対応する６、７、又は８個のグルコースユニットからなる環状オリゴ糖類である。ＣＤは、そのへりに二級ヒドロキシル基をもち、開口部がより大きな直径をした、先端を切り取ったトーモロコシの形をしている。内部のキャビティーは、ヒドロキシ官能を含まず、疎水性の特性を発揮する。この疎水性の性質は、ＣＤが芳香族基又はアルキル基と高度に選択的な封入複合体を形成するのを可能にする。ＣＤとそのゲスト分子との間の複合体形成定数の差が、構造的に類似した光学異性体の相対的電気泳動移動度に差を生ぜしめ、その結果、鏡像異性体を明確に分離できる。
酸性及び塩基性化合物のキラル分離において、このＣＤ複合体はイオン性の被検体の電荷の影響の下に移動する。しかしながら中性の被検体に関しては、荷電がないシクロデキストリン類は、被検体、シクロデキストリン及び複合体が全く電気泳動移動度を有さないために、適用できない。荷電シクロデキストリン類の使用は、そのため中性の化合物のキラル分離の問題を解決するために考案された。
【０００４】
メーヤーら〔Ｊ．Ｍｉｃｒｏｃｏｌ，Ｓｅｐ．，６：４３−４８（１９９４）〕とタイトら〔Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６６：４０１３−４１０１８（１９９４）〕が最初にＣＥキラル分離のためにスルホブチルエーテル β−シクロデキストリン（ＳＢＥ−βＣＤ）の使用を報告した。それに続く報告書には、キラルセレクターとしてＳＢＥＣＤを用いるアミン類と中性化合物の分析が記載されている〔デッテら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１５：７９９−８０３（１９９４）；チャンクベタッゼら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１５：８０４−８０７（１９９４）；ルーリーら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６６：４０１９−４０２６（１９９４）〕。ヴィンセントら（１９９７年４月１５日にＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙへ提出された、「毛管電気泳動用の新規な単一異性体のキラル溶解剤のファミリー、第２部：ヘプタキス−６−スルファト−β−シクロデキストリン）は、バケット形のシクロデキストリン分子の狭い末端の６−位にサルフェートエステル類を単独に有するサルフェート化されたβ−ＣＤ（７ＳβＣＤ）を合成するために、モリヤら〔Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６：１６７４−１６７７（１９３３）〕の選択的保護及び脱保護法を採用した。この合成スキームは、キャビティーの幾何学、及び天然のβ−シクロデキストリンの複合体形成性を保持するように設計された。スタルカップとその協力者〔Ａ．スタルカップ等、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６８：１３６０−１３６８（１９９６）；Ｗ．ウー等、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１８：１２８９−１３１５（１９９５）〕は、未処理の溶融シリカ毛管中での中性化合物とアミン類のラセミ体分離のために、シクロデキストリンサルフェートエステル類の混合物を使用することが、調査した４０の化合物にとって有効であったことを、最近報告した。
【０００５】
これらの勇気づける結果にもかかわらず、ＣＥによるキラル分離を行うための普遍的なシステムがない。これは、ＣＥ分離が特定のシクロデキストリンとの複合体形成の範囲に非常に依存しているためである。ＣＤのキャビティーの大きさに加えて、溶質とＣＤのへり上の官能基との相互作用がキラル選択性（分離度）に影響を与えうる。従って、特定のキラル対の分離にとって最も適した特定の荷電又は中性のシクロデキストリンの選択はなお、試行錯誤による経験的なプロセスとなったままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述の理由のために、毛管電気泳動によって広い範囲のキラル化合物を分割（分析）するために用いられる新規な一連の荷電シクロデキストリン類が必要とされている。理想的には、新規なシクロデキストリン類が簡単な手順によって合成され、そして鏡像異性体の再現可能な分離を可能にしうる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１） ａ）アルファシクロデキストリン、
ｂ）少なくとも約１２個の修飾されたヒドロキシル基を有するベータシクロデキストリン、及び
ｃ）ガンマシクロデキストリン
からなる群から選ばれ、二級ヒドロキシルの少なくとも１つの修飾を含んでなることを特徴とする荷電シクロデキストリン。
（項目２） 下記一般式
【化１】
を有し、
ａ）ｎが６又は８であり、少なくとも約１個のR1基が修飾されたヒドロキシルであり、かつ約ｎ個未満のＲ1基がヒドロキシルであるシクロデキストリン、及び
ｂ）ｎが７であり、少なくとも約５個のＲ1基が修飾されたヒドロキシルであり、かつ約３個未満のＲ1基がヒドロキシルであるシクロデキストリン
からなる群から選ばれ、ここで上記修飾されたヒドロキシルがサルフェート、カルボキシレート、ホスフェート、又は４級アミン置換基を含むことを特徴とする荷電シクロデキストリン。
（項目３） 修飾されたヒドロキシル基がサルフェート化されている項目１又は２記載の荷電されたシクロデキストリン。
（項目４） アルファシクロデキストリンが少なくとも約７個のサルフェート置換基を有することを特徴とする高度にサルフェート化されたアルファシクロデキストリン。
（項目５） ベータシクロデキストリンが少なくとも約１２個のサルフェート置換基を有することを特徴とする高度にサルフェート化されたベータシクロデキストリン。
（項目６） ガンマシクロデキストリンが少なくとも約９個のサルフェート置換基を有することを特徴とする高度にサルフェート化されたガンマシクロデキストリン。
（項目７） 項目１記載の荷電シクロデキストリンおよび電気泳動緩衝剤を含んでなることを特徴とする組成物。
（項目８） 上記シクロデキストリンの濃度が約１％〜２０％である項目７記載の組成物。
（項目９） 電気泳動緩衝剤が酸性である項目７記載の組成物。
（項目１０） 酸性緩衝剤のｐＨ範囲が約１〜５である項目９記載の組成物。
（項目１１） 電気泳動緩衝剤がリン酸塩、酢酸塩及びクエン酸塩からなる群から選ばれた電解質を含む項目７記載の組成物。
（項目１２） 試料、項目１記載の荷電シクロデキストリン、及び電気泳動緩衝剤を含んでなり、上記試料が小さなキラル分子であることを特徴とする組成物。
（項目１３） 試料が中性化合物又はアミンを含む項目１２記載の組成物。
（項目１４） 試料の濃度が約０．１〜１０ｍＭである項目１２記載の組成物。
（項目１５） シクロデキストリンが試料に対して相対的に過剰なモル数で存在する項目１５記載の組成物。
（項目１６） 試料が薬剤又は薬学的化合物を含む項目１２記載の組成物。
（項目１７） 内標準をさらに含んでなる項目１２記載の組成物。
（項目１８） 内標準が１，３，６，８−ピレネテトラスルホン酸又はその塩である項目１３記載の組成物。
（項目１９） ａ）（１）アルファシクロデキストリン、
（２）少なくとも約１２個の修飾されたヒドロキシル基を有するベータシクロデキストリン、及び
（３）ガンマシクロデキストリン
からなる群から選ばれ、二級ヒドロキシルの少なくとも１つの修飾を含むシクロデキストリンを含んでなる緩衝剤で毛管を満たす工程；
ｂ）キラル化合物の鏡像異性体を含んでなる試料を上記毛管に注入する工程；
ｃ）鏡像異性体の電気泳動分離を行う工程；及び
ｄ）キラル化合物の分離された鏡像異性体を検出する工程
を含んでなることを特徴とする小さな分子の鏡像異性体の分離方法。
（項目２０） 電気泳動分離が電気浸透フローを抑制する条件下で行われる項目１９記載の方法。
（項目２１） 毛管が被覆された毛管である項目２０記載の方法。
（項目２２） 緩衝剤が酸性である項目２０記載の方法。
（項目２３） （ａ）少なくとも約７個のサルフェート置換基を有するアルファシクロデキストリン；
（ｂ）少なくとも約１２個のサルフェート置換基を有するベータシクロデキストリン；及び
（ｃ）少なくとも約９個のサルフェート置換基を有するガンマシクロデキストリン
からなる群から選ばれた少なくとも２つの、高度にサルフェート化されたシクロデキストリンを含んでなるキラル化合物の分離用キット。
（項目２４） 少なくとも一つの電気泳動緩衝剤をさらに含んでなる項目２３記載のキット。
（項目２５） 内標準をさらに含んでなる項目２３記載のキット。
（項目２６） 少なくとも一つの毛管をさらに含んでなる項目２３記載のキット。
（項目２７） 少なくとも１つのｐＨ調節剤をさらに含んでなる項目２４記載のキット。
本発明は、毛管電気泳動によって広範囲のキラル化合物を分離することへの要求を満足させる一連の荷電シクロデキストリン類に向けられている。好ましいキラルセレクターは、高度にスルフェート化されたα−、β−及びγ−シクロデキストリン類である。これらの荷電シクロデキストリン類は、商業的に入手可能なシクロデキストリン類よりも高度のサルフェート化と、もっと狭い異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を有する。高度にサルフェート化されたシクロデキストリン類を用いるＣＥ分析は、他のキラルセレクターに比べて多種多様のキラル薬剤の分析（分割）を改良できる。更に、高度にサルフェート化されたα−、β−、及びγ−シクロデキストリン類は、互いに補完し合う分離を生じさせ、広い範囲であっても中性及び塩基性薬剤の分析を可能にする。
本発明の荷電シクロデキストリン類は、二級ヒドロキシルの少なくとも１つの水素原子を荷電置換基で置換した、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、又はγ−シクロデキストリンでありうる。好ましい荷電シクロデキストリン類は、次のような一般式を有する：
【０００８】
【化２】
【０００９】
ｎが６又は８であるシクロデキストリンに関しては、少なくとも約１個のＲ1基は修飾されたヒドロキシルであり、かつ約ｎ個未満のＲ1基はヒドロキシルである。ｎが７であるシクロデキストリンに関しては、少なくとも約５個のＲ1基が修飾されたヒドロキシルであり、かつ約３個未満のＲ1基はヒドロキシルである。修飾されたヒドロキシルの水素原子は、好ましくはサルフェート、カルボキシレート、ホスフェート、又は四級アミン置換基によって置換される。最も好ましい置換基はサルフェートである。
好ましい高度にサルフェート化されたアルファシクロデキストリン類は少なくとも約７個のサルフェート置換基を有しており、好ましい高度にサルフェート化されたベータシクロデキストリン類は少なくとも約１２個のサルフェート置換基を有しており、そして好ましい高度にサルフェート化されたガンマシクロデキストリン類は少なくとも約９個のサルフェート置換基を有している。
【００１０】
本発明の荷電シクロデキストリン類は、毛管電気泳動によって小さな分子の鏡像異性体を分離する方法において用いることができる。この方法は、下記の諸工程を含む：ａ）毛管を、荷電シクロデキストリンと電解質とを含む電気泳動緩衝剤で満たす工程；ｂ）キラル化合物の鏡像異性体を含む試料を前記毛管に注入する工程；ｃ）鏡像異性体の電気泳動分離を行う工程；及びｄ）キラル化合物の鏡像異性体を検出する工程。電気泳動分離は、電気浸透フローを抑制する条件下で行われるのが好ましい。例えば、被覆毛管を用いてもよいし、或いは電気泳動緩衝剤が酸性であってもよい。試料は一般に小さなキラル分子（ＭＷ＜５，０００）であり、これは好ましくは中性又は基性の化合物である。１，３，６，８−ピレネテトラスルホン酸の塩等の内標準が、時間に関して標準化することを可能にするために任意に試料に添加される。
本発明の試薬は、毛管電気泳動によってキラル化合物を分離するのに使用するためのキットとして便利よく一体とすることができる。このキットには以下のａ）〜ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも２つの高度にサルフェート化されたシクロデキストリン類が含まれるであろう：ａ）少なくとも約７個のサルフェート置換基を有するアルファシクロデキストリン、ｂ）少なくとも約１２個のサルフェート置換基を有するベータシクロデキストリン、及びｃ）少なくとも約９個のサルフェート置換基を有するガンマシクロデキストリン。更に、このキットは任意に、電気泳動緩衝剤、ｐＨ調節剤、内標準、及び／又は毛管を含むことができる。
本発明のこれらの、及び他の特徴、様相、及び利点は、以下の記述、添付の特許請求の範囲、及び付随した図面によって、より良く理解されよう。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のシクロデキストリン類は、高度にサルフェート化されたα−、β−及びγ−シクロデキストリン類であって、キラルセレクターとして好適なものであり、例えば毛管電気泳動（ＣＥ）に用いることにより、化合物の鏡像異性体対の分離分割能力に優れるものである。本発明の荷電シクロデキストリン類は、従来のシクロデキストリン誘動体よりも高度のサルフェート化とより狭い不均一性を有し、鏡像異性体の分割に好適なものである。
また、高度にサルフェート化されたシクロデキストリン類を用いる本発明の毛管電気泳動（ＣＥ）分析法によれば、多種多様のキラル薬剤、特に中性の化合物及びアミン類の分解能、分割力に優れた分析が可能となる。
さらに、本発明の高度にサルフェート化されたα−、β−、及びγ−シクロデキストリン類は、毛管電気泳動によって解析されうる中性及び塩基性薬剤の数を更に拡大させるべく対象とする化合物の範囲を互いに補完するものであり、より広範囲の鏡像異性体の分離分割を可能とするものである。
また、本発明の組成物及びキットは、このような毛管電気泳動分析に好適に用いられるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】７ＳβＣＤ（Ａ）、ＨＳαＣＤ（Ｂ）、及び７ＳβＣＤとＨＳαＣＤの混合物の電気泳動図を示す。
【図２】７ＳβＣＤ（Ａ）、ＨＳβＣＤ（Ｂ）、及び７ＳβＣＤとＨＳβＣＤの混合物の電気泳動図を示す。
【図３】７ＳβＣＤ（Ａ）、ＨＳγＣＤ（Ｂ）、及び７ＳβＣＤとＨＳγＣＤの混合物の電気泳動図を示す。
【図４】（Ａ）ＡＢＩ ＳＢＥＣＤを含む荷電シクロデキストリン類、並びに（Ｂ）セレスター、及び（Ｃ）アルドリッチのサルフェート化されたシクロデキストリン類の電気泳動図を示す。
【図５】ＨＳαＣＤ（Ａ）、ＨＳβＣＤ（Ｂ）、及びＨＳγＣＤ（Ｃ）を用いて得られるアムフェタミンの電気泳動分離を示すグラフである。
【図６】ＨＳαＣＤ（Ａ）、ＨＳβＣＤ（Ｂ）、及びＨＳγＣＤ（Ｃ）を用いて得られるラセミ体のサリドマイドの電気泳動分離を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ここに記載された方法や試薬には、中性及び塩基性の薬剤の鏡像異性体を分離するための簡素で一般化された手順を要する。広範囲のキラル分子“ゲスト”に対して“ホスト”として作用する一連の新規な荷電シクロデキストリン類が、鏡像異性体対の間で区別するために用いられる。鏡像異性体間での区別的な複合体形成が、電気泳動の移動度に変化を生じさせ、毛管電気泳動中に当該鏡像異性体対の分離を起こさせる。
ＣＤ類は、互いにα（１，４）−グリコシド結合を介して結合したグルコース単位から構成されるオリゴ糖の環である。６個から１２個までのグルコース単位のＣＤが単離されているけれども、６個、７個、及び８個の単位を持ったもの、即ちそれぞれα−、β−、及びγ−ＣＤと呼ばれるものが好ましい。このＣＤ類の形は、被検体のホストとなることができる相対的に疎水性のキャビティーをもった、先端が切り取られたトーモロコシ形に似ている。天然のＣＤ類は、グリコピラノース分子の２，３及び６位にヒドロキシル基ををもつ親水性の外面領域を有する。
【００１４】
本発明のＣＤ類は、シクロデキストリン上の各グルコース単位の６位に荷電置換基を含む修飾されたヒドロキシルを有する。更に、２位及び／または３位（最もありそうには２位において）の二級ヒドロキシル少なくとも１個もまた荷電された基で置換されている。このことは、先端を切り取ったトーモロコシの狭いほうの開口部に荷電された基を持つことに加えて、荷電された基がシクロデキストリンバケットの広いほう開口部のへりにもまた存在することを意味する。この幅の広いほうのへりは、被合体形成を通じて“ゲスト”分子をくるむ部分であるから、バケットの収容末端は、天然のシクロデキストリンのそれに対して混乱（摂動）させられている。二級ヒドロキシルの変化によるバケットの混乱は、選択的な複合体形成プロセスにとって有益であることがわかった。そして、このことは予想外にもＣＤによるより良いキラル差別の結果を生じる。
ＨＳＣＤの好ましい態様の構造式は以下の通りである：
【００１５】
【化３】
【００１６】
ｎが６又は８のシクロデキストリンに関しては、少なくとも約１個のＲ1基が修飾されたヒドロキシルであり、かつ約ｎ個未満のＲ1基がヒドロキシルである。ｎが７であるシクロデキストリンに関しては、少なくとも約５個のＲ1基が修飾されたヒドロキシルであり、かつ約３個未満のＲ1基がヒドロキシルである。ヒドロキシル基を修飾する荷電置換基は、好ましくはマイナスに荷電され、例えば、カルボキシレート、ホスフェート、又はサルフェート基が挙げられる。或いは、この置換基としてはプラスに荷電されたものでもよく、例えば４級アミンで荷電されたものが挙げられる。最も好ましい置換基は、サルフェート基である。
【００１７】
α−ＣＤ類に関しては、少なくとも約７個のヒドロキシル基が置換され、そして好ましくは約１０〜１２個が置換される。もっとも好ましいα−ＣＤはサルフェート置換基で修飾された約１１個のヒドロキシル基を有する。
β−ＣＤに関しては、ＣＤの少なくとも約１２個のヒドロキシル基が荷電置換基で修飾されており、そして好ましくは約１２〜１５個が置換される。最も好ましいβ−ＣＤはサルフェート置換基で修飾された約１２個のヒドロキシル基を有する。
γ−ＣＤ類に関しては、少なくとも約９個のヒドロキシル基が置換されており、そして好ましくは約１２〜１６個が置換される。最も好ましいγ−ＣＤはサルフェート置換基で修飾された約１３個のヒドロキシル基を有する。
好ましいサルフェート化されたＣＤ類の合成には、乾燥したα−、β−、又はγ−シクロデキストリンと、１９モル当量の三酸化硫黄−トリメチルアミン複合体（錯体）とを官能基の何らの保護もなしに、ＤＭＦ中で反応させることが含まれる。この反応は高度のサルフェート化に一致したシクロデキストリンを生成する。従って、この合成による生成物は、高度にサルフェート化されたα−、β−、又はγ−シクロデキストリン類（それぞれ、ＨＳαＣＤ、ＨＳβＣＤ、又はＨＳγＣＤ）と呼ばれる。
【００１８】
多種多様な被検体のいずれをも本発明に従って評価することができる。適した被検体としては、任意の“ゲスト”、例えば荷電ＣＤ“ホスト”と複合体（錯体）を形成しうる、光学異性体、鏡像異性体対、ラセミ薬剤混合物が挙げられる。実際、荷電ＣＤ類との異なった複合体形成平衡定数を有する任意のキラル対を、ここに述べられているように、分析することができる。試料は一般に、光学活性なキラル中心を有する小さな分子（ＭＷ＜５，０００）であろう。本発明の好ましい実施態様において、試料は、例えば本願の実施例に於いて挙げられたもの等の薬学的化合物である。最も好ましい試料は中性化合物、又はアミン類である。
時間に関して標準化ができるように、少なくとも１つの内部指標を試料に添加してもよい。この指標は、鏡像異性体の相対的移動時間を比較するためのタイム・ゼロ出発点を提供する分析物成分より先に移動することが好ましい。ピレネ−１，３，６，８−テトラスルホン酸（ＰＴＳ）四ナトリウム塩が、大部分の分離にとって信頼できる指標として働きうる好ましい内標準である。酸性条件の下では、ＰＴＳはその電気泳動の移動度にだけ主として依存する短い移動時間をもったピークを生じる。その大きな分子サイズとその四つのマイナス電荷により、ＰＴＳはサルフェート化されたシクロデキストリン類と全く相互作用を有しない。
【００１９】
本発明に従って、毛管電気泳動（ＣＥ）が、キラル化合物の分離の仲立ちをつとめるように用いられる。一般に、ＣＥは、毛管、即ち内径が約２〜２，０００ミクロン（μｍ）の管に、試料成分を導入すること、および前記毛管に電界をかけることを含む。電界の電位は、毛管を通して分析物成分を引き離し、かつそれらの電気泳動の移動度に従ってそれらを分離する。
本発明のＣＥ法は、好ましくは電気浸透フロー（ＥＯＦ）を抑制する条件下で行われる。“オープン”ＣＥフォーマットを使用するときには、溶融シリカ毛管はポリマーとゲルを欠く電気伝導性緩衝剤で充填される。この溶融シリカ毛管は、約５．０よりも大きなｐＨで著しくマイナスに荷電されるようになり、このことが緩衝剤から陽イオンの層を引きつける。これらのイオンは、電位の影響下で、陰極に向かって流れるので、緩衝液と分析される試料は同じ方向で運ばれる。その結果として生じたＥＯＦは、中性の種とイオン性の種の両方を、荷電の有無にかかわらず、陰極の方に押し動かす定速成分を与える。このように、電気浸透フローを抑制しない条件下では、試料成分の移動速度は主として基底のＥＯＦ（このものは試料成分の電気泳動の移動度を圧倒できる）によって決定される。
試料成分の電気泳動の移動度に主として基づいて分離させるに十分なようにＥＯＦを抑制できる多くの方法がある。最も簡単なアプローチは、酸性のｐＨを有する電気泳動緩衝剤を用いることである。従って、本発明の好ましい緩衝剤は、約７未満のｐＨを有する。最も好ましい緩衝剤は約１〜約５のｐＨ範囲を有し、この範囲はたいていの適用においては約２．５〜４のｐＨで最適化される。
【００２０】
この好ましいｐＨ範囲で適当な緩衝能を有する電解質が、電気泳動緩衝剤の成分として含有される。酸性ｐＨにおいて使用されるに適した電解質としては、有機もしくは無機の、リン酸塩、酢酸塩、又はクエン酸塩が挙げられる。好ましい電気泳動緩衝剤の電解質はリン酸トリエチルアンモニウム塩である。緩衝剤中の電解質のモル濃度は一般に約５〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭであり、そして最も好ましくは約２５〜５０ｍＭである。電解質のより高い濃度を有する緩衝剤のイオン強度は望ましくないジュール熱効果を生じさせる場合がある。
ＥＯＦを抑制するための他の方法は、被覆毛管を使用することである。毛管の表面は、緩衝剤系に界面活性剤、双性イオン塩、又は親水性綿状ポリマー等の添加剤を含有させることによってダイナミックに被覆することができる。しかしながら、好ましい毛管コーティングは、毛管表面に化学的に結合した、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、又はジオールエポキシコーティング等のポリマーであろう。最も好ましいポリマーコーティングは、簡単にＰＶＡとして知られるポリ（ビニルアルコール）である。
【００２１】
本発明を実施するのに用いられる毛管は一般に、約１０μｍ〜約２００μｍのサイズ範囲の内径を有する。最も好ましくは、約２５μｍの内径を有する毛管が鏡像異性体のＣＥ分離用に使用される。毛管の好ましい長さは、約１０〜約１００ｃｍであり、最も好ましくは約２７ｃｍである。検出窓は、好ましくはカラムの出口から約６．５ｃｍの毛管中に位置する。
特定の被検体“ゲスト”とともに用いるためのα−、β−、又はγ−シクロデキストリン“ホスト”の選択は、一般に経験に基づく事柄である。ＣＤ誘導体を選択するための大まかな指針は、α−ＣＤでの分離は１つの芳香族環をもった化合物に関して好ましく、β−ＣＤは置換芳香族環をもった化合物に関して好ましく、そしてγ−ＣＤは複数の環をもった化合物に関して好ましい。しかしながら、図４と５に示したように、実際の結果ではこの一般的な経験則から実質的に逸脱することがある。
【００２２】
同様に、電気泳動分離中の、毛管内における荷電α−、β−、又はγ−シクロデキストリンの濃度は、各キラル化合物に関して経験的な手法で最適化されうる。一般に、荷電シクロデキストリンの濃度は、試料成分に対して相対的に過剰のモル数であるべきである。最適化のための適したＣＤ濃度範囲は、約１％〜約２０％であり、好ましくは約２％〜約１０％の狭められた範囲である。荷電ＣＤの最も好ましい濃度は約５％である。
【００２３】
ＣＤ類は好ましくは電気泳動緩衝剤に添加され、そして毛管中に導入される。分離緩衝液は水中２０％ＨＳＣＤ１部中、電気泳動緩衝剤（例えば５０ｍＭリン酸トリエチルアンモニウム塩、ｐＨ２．５）の２Ｘ溶液２部、及び水１部を混合することによって調製することができる。毛管を２０ｐｓｉの圧力で、１分間、分離緩衝液を用いてすすぐ。試料の注入後、毛管の入口と出口が分離緩衝液中に浸漬され、そしてそれから電圧がかけられて電気泳動を開始する。好ましさの点では比較的劣る代替方法として、ＣＤ類を毛管壁に結合させる方法やＣＤ類をゲル母体に含有させる方法がある。
試料は、水中メタノール０〜５０％中に被検体を検出可能な濃度、一般的には約０．１〜１０ｍＭ、そして好ましくは約１ｍＭで溶解させることによって調製される。更にＰＴＳ等の内標準が、被検体の約半分の濃度、好ましくは約０．５ｍＭで試料に添加されうる。試料はそれから、界面動電注入、水圧、真空、又はシリンジポンプによって導入されうる。好ましくは、試料は、０．５〜約１５ｐｓｉの範囲、最も好ましくは約０．５ｐｓｉの圧力で、かつ約１〜９９秒の期間中で、最も好ましくは約２〜５秒で、圧力注入によって毛管カラムに導入される。
【００２４】
Ｐ／ＡＣＥ２０００シリーズ、Ｐ／ＡＣＥ５０００シリーズ、又はＰ／ＡＣＥ ＭＤＱ毛管電気泳動システム（ベックスマン・インスツルメンツ・インコーポレーテッド、フラートン、ＣＡ）。加えて、ベックマン システム ゴールドTM（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＧｏｌｄTM）ソフトウェアー、ベックマン Ｐ／ＡＣＥTMソフトウエァー、又はＩＢＭ ＰＳ／２、ＩＢＭ３５０ ４６６ＤＸ２もしくはＩＢＭ３５０−Ｐ９０ＰＣによって制御されたベックマンＰ／ＡＣＥTMステーションソフトウェアを本発明を実施する際に用いることができる。試料は、１ｋＶ〜約１００ｋＶ、好ましくは５ｋＶ〜約２０ｋＶ、そして最も好ましくは約７．５ｋＶ〜約１２ｋＶの範囲の電圧で電気泳動にかけられる。
検出は好ましくはＵＶ吸収によって、好ましくは、試料成分と内標準を検出するが荷電ＣＤは検出しない波長で行われる。検出のための好ましい波長は、約１８０ｎｍ〜約３８０ｎｍの範囲であり、最も好ましい検出波長は約２１４ｎｍである。
【００２５】
ＣＥが、電気浸透フローを抑制する条件下、例えば酸性ｐＨで行われるとき、ＣＥは検出窓口の最も近くに置かれた陽極とともに、反対の極性を用いて好ましく行われる。これらの条件下で、被検体は陽極の方に移動するマイナスに荷電されたシクロデキストリンとの複合体形成によって陽極に引っぱられる。しかしながら、より速く移動する大きな（メジャー）ピークの末尾が小さな（マイナー）ピークをおおい隠すならば、ピークの移動順序を逆にすることが望ましいことがある。一般に、好ましい分離条件は、小さな汚染物質が主成分に向かって移動する条件である。移動順序の逆転は、緩衝剤のｐＨを約７より大きく、好ましくは約ｐＨ８に緩衝剤のｐＨを上げることによって、しかも陰極が検出窓口に最も近くなるように極性を変えることによって達成することができる。そのような条件下では、ＥＯＦは、遊離の、被検体を結合した荷電シクロデキストリン類を含めて全化合物を陰極へ運び去るのに十分強い。
【００２６】
ＣＥによるキラル分析を最適化するための系統的な機構を促進するために、本発明の試薬を便利よく一体化してキットとすることができる。最適なシクロデキストリン“ホスト”を選択するのを助けるために、キットには以下のａ）〜ｃ）からなる群から選ばれた少なくとも二つの高度にサルフェート化されたシクロデキストリン類が含められるであろう：ａ）少なくとも約７個のサルフェート置換基を有するアルファシクロデキストリン；ｂ）少なくとも約１２個のサルフェート置換基を有するベータシクロデキストリン；及びｃ）少なくとも約９個のサルフェート置換基を有するガンマシクロデキストリン。
更に、キットは、少なくとも一つの電気泳動緩衝剤を、好ましくは酸性のｐＨで任意に含んでもよい。しかしながら、もっと高いｐＨで用いるための別の緩衝剤を、ＮａＯＨ又はリン酸等のｐＨ調節剤に加えて含有してもよい。緩衝剤の組成及び／又はｐＨを変えることで、分析（分割）性能を改良したり及び／又は分析を受けているキラル対の移動順序を逆転させることができる。キットヘの更なる添加物としては、ＰＴＳ等の内部標準、被覆もしくは未被覆毛管が挙げられる。
【００２７】
本発明のこれまでに述べた態様には多くの利点、例えば合成の簡単なワン・ステップ法、多種多様な光学異性体の再現性のよい分離、並びに数多くの中性及び塩基性キラル化合物の改善された分割分析等がある。この方法は費用が安く、しかも作業を最適化するために多数の異なった固定相カラムを必要とするＨＰＬＣを使用するキラル分析法に比べて万能である。本発明の試薬、方法、及びキットは、薬剤、食物栄養物、環境汚染物質、殺虫剤、又はそれ以外のラセミ体混合物の立体化学的純度を監視するための品質管理システムに容易に適合させることができる。
【実施例】
【００２８】
本発明の材料や方法は、以下の例を参照することでより良く理解されよう。
【００２９】
例１
ＨＳＣＤ類の合成
この最初の一連の例は、結果として得られる生成物の一貫して高度のサルフェート化のみならず、サルフェート化された、α−、β−、又はγ−シクロデキストリン類を合成するために使用されうる簡単かつ単一工程法を説明している。
高度にサルフェート化したα−シクロデキストリンの合成は、機械的な攪拌器を装備し、乾燥した２リットル反応器に、オーブンで乾燥したα−シクロデキストリン１００ｇ（１０２．８ｍｍｏｌ）と無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）９００ｍｌを添加することで行った。この容器をオイルバス中で５０℃で撹絆しながら加熱して大部分の固体を溶解した。３００ｍｌのＤＭＦ中での三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（２７２ｇ、１９５３ｍｍｏｌ）の部分溶解混合物を、反応器にゆっくりと注ぎ、５０℃で激しく攪拌した。ガム状の生成物が３５分後に形成され、そし攪拌を中断した。室温に冷却した後、溶媒をデカンテーションによって除去し、ガム状の生成物を３００ｍｌの試薬アルコールで２回洗浄し、そして溶媒を再びデカンテーションによって除去した。
同様に、高度にサルフェート化されたβ−シクロデキストリンの合成を、機械的な攪拌器を装備し、乾燥された２リットル反応器に、オーブン乾燥したβ−シクロデキストリン１００ｇ（８８．１ｍｍｏｌ）と５００ｍｌの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を添加することによって行った。この容器をオイル浴中で５０℃で攪拌しながら加熱し、固体の大部分を溶解した。３００ｍｌのＤＭＦ中での三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（２４０ｇ、１７２４ｍｌ）の部分溶解混合物を、この反応器にゆっくりと注ぎ、５０℃で１時間、激しく攪拌した。ガム状の生成物が形成され、そして攪拌が中断された。溶媒を熱いうちにデカンテーションによって除去し、このガム状の生成物を３００ｍｌの試薬アルコールで２回洗浄し、そして溶媒を再びデカンテーションによって除去した。
【００３０】
高度にスルフェート化されたγ−シクロデキストリンを製造するための類似した合成スキームを、機械的な攪拌器を装備し、乾燥された２リットル反応器に、オーブン乾燥したγ−シクロデキストリン１００ｇ（７７．１ｍｍｏｌ）と９００ｍｌの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を添加することによって行った。この容器をオイル浴中で５０℃で攪拌しながら加熱し、固体の大部分を溶解した。３００ｍｌのＤＭＦ中での三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（２０４ｇ、１４６０ｍｍｏｌ）の部分溶解混合物をこの反応器にゆっくりと注ぎ、５０℃で激しく攪拌した。ガム状の生成物が３５分後に形成され、そして攪拌が中断された。室温に冷却した後、溶媒をデカンテーションによって除去し、ガム状の生成物を３００ｍｌの試薬アルコールで２回洗浄してから、再び溶媒をデカンテーションによって除去した。
上述の合成スキームから、このガム状の生成物を３７５ｍｌの４Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し、そして攪拌した。この溶液を約１０のｐＨに維持し、２リットルの丸底フラスコに移して、それから回転蒸発して減圧下で少量の水とともにトリメチルアミンを除去した。それから、このフラスコを一晩中、冷室に置いた。残りの溶液（約６００ｍｌ）から析出した固体をろ過によって集めた。約８００ｍｌのアセトンをろ液の各々に添加し、そしてこの各々が軟らかなガムを形成した。この混合物を１０分間、激しく攪拌し、それからアセトンをデカンテーションによって除去した。次いで、別に８００ｍｌのアセトンを添加し、１０分間攪拌してからデカンテーションによって除去した。このガム状の生成物を各々、５００ｍｌの脱イオン水に溶解し、この溶液を激しく攪拌しながら２リットルのメタノール中にゆっくりと注いだ。この結果生成した灰色がかった白色固体をろ過によって集め、３００ｍｌのメタノールで３回洗浄し、一晩、高真空下１１０℃で乾燥した。
【００３１】
水に再懸濁されたときには、全種のＨＳＣＤの溶液は、三酸化硫黄−トリメチルアミン複合体に由来する不純物により明るい茶褐色を呈している。この溶液は、脱色化する活性炭（アルドリッチＣａｔ．Ｎｏ．１６，１５５−１）で処理することによって容易に脱色され、そしてそれから遠心分離と０．４５μｍの注射器型フィルターを通してのろ過によって浄化した。
４つの異なったロットのＨＳβＣＤ、１ロットのＨＳαＣＤ、及び１ロットのＨＳγＣＤが元素分析にかけられ、ヴインセント等によって採用されたモリヤ等の方法によって合成された多数の７ＳβＣＤと比較された。サルフェート化の程度を表１にまとめて示したように、各ロットに関して測定した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
表１に示したように、本発明のＨＳＣＤ類を製造するのに用いられる合成手順では、平均値でグルコース１分子当り、少なくとも約ｌ．６個のサルフェート分子という高度のサルフェート化（＞１１）が一貫して達成された。
【００３４】
例２
間接ＵＶ検出によるサルフェート化されたβ−ＣＤ類の特徴づけ
この例は、本発明のＨＳＣＤ類がヴィンセント等のサルフェート化されたＣＤよりも、もっと高度にサルフェート化され、しかも商業的に入手できる数種のサルフェート化されたＣＤ類よりも異成分がより少ないことを示している。
シクロデキストリン１つ当り平均値で４のサルフェート化度をもったスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリン類（ＳＢＥ−βＣＤ）がパーキンエルマー／ＡＢＩ（フォスター市、ＣＡ）から購入された。更に、サルフェート化されたβ−ＣＤ類（サルフェート化度（平均値）＝４）の混合物をセレスター（ハモンド、インディアナ）から供給を受け、またβ−ＣＤ１つ当り７〜１０のサルフェート化度（平均値）を有するサルフェート化されたシクロデキストリンをアルドリッチ（ミルウォーキー、ウィスコンシン）から入手した。これらの商業的に入手できる荷電ＣＤ類を、ヴィンセント等の６−シクロデキストリンのＣ−６サルフェートエステル（７ＳβＣＤ、ｂ−ＣＤ当り７のサルフェート基）や、例１に従って合成されたα−、β−、及びγ−ＨＳＣＤ類と比較した。
【００３５】
間接ＵＶ検出によるＣＥ分析が、ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレーテッドから入手した５０μm×２７ｃｍのＰＶＡで共有結合的に被覆された毛管を用い、２５４ｎｍで検出するＵＶ検出器（Ｐ／Ｎ ２２３２１１１）を装備した、ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレーテッド（フラートン、ＣＡ）によるＰ／ＡＣＥ ５０００ ＣＥシステムにおいて遂行された。分離緩衝剤は、ＴｒｉｓでｐＨ８．０に調節された４０ｍＭのｐ−トルエンスルホン酸（ＴＳＡ）から構成された。この方法では、非吸収性のスルフェート化されたシクロデキストリン類が、陽極に電気泳動的に移動するイオン性の発色団、ＴＳＡにとって替り、より近いＵＶ吸収帯をつくる。その結果、アニオン性の被検体が、それらが検出器を通過するときにネガティブな吸収の信号を生ずる。そのピークは直接ＵＶ吸収検出で得られたものよりも広く、これは恐らく、サルフェート化されたシクロデキストリン被検体とＴＳＡをバックグラウンドとする発色団との間の移動度の不完全な適合によるのであろう。
【００３６】
ＨＳαＣＤ、ＨＳβＣＤ、及びＨＳγＣＤについての得られた電気泳動図を、それぞれ図１、２、及び３に示す。このα−、β−及びγ−ＨＳＣＤ類の全てが７ＳβＣＤよりも短い移動時間をもったピークを生じるが、このことはサルフェート化の度合いが各ＨＳＣＤの７よりも高いことを示唆している。ＨＳＣＤと７ＳβＣＤの混合物が２つの明確に区別されるピークを生じるという事実は、べックマンＨＳＣＤ類は、完全にランダムにサルフェート化されたスピーシーズのグロスな混合物ではないことを暗示している。更には、仮にこの混合物が８、９、又は１０個のサルフェート基をもつＨＳＣＤ分子を含むとしたら、予期される電気泳動図はＨＳＣＤと７ＳβＣＤの各ピークの間に明確な分離を示すことはないであろう。したがって、これらの結果は、ＨＳＣＤ類のサルフェート化の平均の度合が１０より大きいことを確証している。
ＨＳＣＤ類のピークが７ＳβＣＤのピークよりもずっと広くはないという事実は、ＨＳＣＤ類の分子の不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が広くないことを示唆している。比較として、ＳＢＥ−βＣＤ、セレスターのサルフェートシクロデキストリン、及びアルドリツチのサルフェート化されたβ−ＣＤの電気泳動図（図４）は、幾つかのはっきりと区別されるピークからなり、もっとずっと複雑である。比較によって、このＨＳＣＤは、商業的に入手できる他のサルフェート化されたシクロデキストリン類に比べて、サルフェート化の度合がより高く、かつ不均一性がより狭いシクロデキストリン類の混合物である。
【００３７】
例３
高度にサルフェート化されたβ−シクロデキストリン（ＨＳβＣＤ）を用いるキラル分離
ＣＥのためのキラルセレクターの選択において最も重要な因子は、最も多種多様な被検体を分割分析する能力である。従って、我々は、ＨＳβＣＤを用いた中性及び塩基性薬剤のエナンチオマー分離が、ＡＢＩからのＳＢＥＣＤ（β−ＣＤ当り平均４個のスルホブチルエーテル基）、セレスターからのサルフェート化されたβ−ＣＤ類（β−ＣＤ当り可変数のサルフェート基）、及びヴィンセント等のβ−シクロデキストリンのＣ−６サルフェートエステル（７ＳβＣＤ、β−ＣＤ当り７個のサルフェート基）を用いたキラル分離に好適にも匹敵することを立証するための比較研究を行った。
【００３８】
ホスフェート緩衝剤は、リン酸を、トリエチルアミン又はＮａＯＨ溶液等の対応する塩基で滴定することで調製した。サルフェート化されたβ−ＣＤを、２５ｍＭのリン酸トリエチルアンモニウム中でｐＨ２．５で溶解した。サルフェート含量の不正確な性格により、サルフェート化されたβ−ＣＤ類の濃度は、体積当りの重量の基準で表現した。アミノベースのラセミ体は水に溶解されたけれども、中性のラセミ体の試料は水中５０％のメタノールに溶解された。毛管に注入された全試料は、１ｍＭのラセミ体混合物と、内標準として０．５ｍＭの１，３，６，８−ピレネテトラスルホン酸ナトリウム塩（ＰＴＳ）を含有した。ＰＴＳは、その４つのマイナス電荷のために、混合物中の任意の化合物に向かって移動した。
中性化合物やアミン類の多数のラセミ体が、実質上同じ分離条件の下で毛管電気泳動にかけられた。分離は、２５μｍ×２７ｃｍの未処理の溶融シリカ毛管を用いる、２１４ｎｍでのＵＶ検出器を装備した、ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレーテッド（フラートン、ＣＡ）によるＰ／ＡＣＥ ５０００ ＣＥシステム上で遂行された。サルフェート化されたシクロデキストリン類の濃度が変えられた（表２Ａと２Ｂ参照）。電気泳動が、逆極性の条件下、１０又は１２ｋＶ適用電圧で行われた。その結果を表２Ａと２Ｂにまとめて示す。カッコ内に示されたパーセントの値は、最適の分離を生じさせた分離緩衝剤中のサルフェート化されたシクロデキストリンの濃度を示している。
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
試験された中性化合物の内の７つ及びアミン類の全ては、公知の薬剤である。分析されたアミン類の２つ、フルオキセチン及びヴェラパミルは市販されている薬剤（それぞれＰｒｏｚａｃ（登録商標）及びＶｅｒｅｌａｎ(登録商標)）のカプセルから入手した。表２Ａと２Ｂの結果は、ピーク中心間の差△×と４σ、ピークの２つの標準偏差の平均値の指標として定義される、複数のピークの分割（分割能）Ｒを示している。これらの結果は、簡単な１工程合成において調製されたＨＳβＣＤは、１８個の中性ラセミ体及び１１個のアミン鏡像異性体対に関して良好な分解能（＞１）を与えたことを示している。ラセミ体の幾つか（グルテチミド、ロラゼパム、プラズィクワンテル、ヒドロベンゾイン、α−シクロプロピルベンジルアルコール及び１，１′−ビ−２−ナフトール）は、ＨＳβＣＤを用いて著しく大きな分解能の値（＞７）を生じた。これと比べて、７ＳβＣＤは、もっとずっと少数のキラル対（８個の中性化合物、及び８個のアミン類）に関して適当な分離を生じた。
【００４２】
ＨＳβＣＤを用いるときの中性ラセミ体の電気泳動図からの１つの観察結果は、移動時間は一般に７ＳβＣＤ分離に関して対応する時間よりもっと遅かったということであった。このことは、７ＳβＣＤと中性化合物の大部分との間の複合体形成平衡定数は、ＨＳβＣＤの対応する値よりも高いことを示唆している。
この高い親和力は、７ＳβＣＤが試験した中性化合物の大部分に関して粗悪な分離を生じさせる、即ち複合体形成が両鏡像異性体に関して強すぎるために、その結果キラル識別ができないことの主な理由と符合しているものと思われる。
キラルアミン類に関しては、逆の傾向が観察された。ＨＳβＣＤによって生じた移動時間は、７ＳβＣＤを用いて得られたものよりも殆ど全てに関して短かった。この結果の理由の１つは、ＨＳβＣＤのサルフェート化の度合いが高いほど、もっとマイナスに荷電されるために陽極の方への電気泳動の移動度を高くするということである。マイナスの増大した電荷が、サルフェート化されたシクロデキストリンとプロトン化されたアミン類との間に、より高い静電引力をも生じさせるということが言えそうである。より高い複合体形成定数がより低い分解能を生じさせてしまったと思われる中性被検体のケースと違って、アミン類に関するベックマンのＨＳβＣＤの明らかに高い親和力が、７ＳβＣＤよりも数多くの好結果のキラルアミン分離を生じさせた。
これらの結果は、種々の荷電ＣＤ類の中に分解能(分割力)に大きな差があることを示している。７よりも大きな平均スルフェート化の程度を有するこれらのＣＤ類は、より広い範囲の分子種(表２Aと２B参照)について実質的により良いキラル分割を示した。これに関して、ここに述べられた簡単な、一工程での、高収率な合成を用いて調製されたＨＳβＣＤは、試験した種々のサルフェート化シクロデキストリン類のいずれとも好適にも匹敵するものであった。
【００４３】
例４
ＣＥ分離の再現性に関する、異なった合成ロットの効果
キラルセレクターに関する他の重要な評価基準は、異なった合成ロット間での性能の再現性である。三つの異なった型のヒドロキシル(各グルコース単位における２−、３、及び６−位)の直接スルフェート化が、７SβＣＤ化合物の５段工程合成よりももっとランダムな置換を生じさせると予想されたから、ＨＳＣＤの異なったロット内での変動は考慮されなければならない可能な手段であった。この点から考えて、５つの合成から得られた５つの異なったロットのＨＳＣＤ（ＧＳ４７４７−６５、ＧＳ４７４７−７０、ＧＳ４７４７−８２、ＧＳ４７４７−８５及びＧＳ４７４７−９０）を、５−(４−メチルフェニル)−５−フェニルヒダントイン、α−メチル−α−フェニルサクシンイミド、及びサリドマイドラセミ体の分離について試験した。表３の結果は、移動時間と分解能(分割力)の再現性が合成ロットのうちの４つに関して非常に良好であることを示している。ロット８５だけが速い移動と低い分解能を生じさせて、他のものとは多少違っていた。これらの結果は、保護されていないβ−ＨＳＣＤの直接スルフェート化の簡単な手順を用いて繰返し合成することがＣＥのキラルセレクターとして再現可能性に優れた性能と一致する生成物を産することを示している。
【００４４】
【表４】
【００４５】
例５
高度にサルフェート化されたα−、β−、及びγ−シクロデキストリン類を用いるキラル分離
この例は、分離することができるキラル化合物の範囲が、ＣＥ−ベースキラル分離に高度にサルフェート化されたα−及びγ−シクロデキストリン類（それぞれＨＳαＣＤ及びＨＳγＣＤ）を含めることによって拡大されることを示している。表４の結果は、３つの異なったＨＳＣＤ類によって引き起こされる分離は、多種多様な中性及び塩基性の薬剤を網羅するように互いに補完し合っていることを示している。ＨＳγＣＤは、薬学的に重要なフェネチルアミン類の鏡像異性体を分離するのに特に効果的であることが判明した。アンフェタミンとサリドマイドのキラルＣＥ分析の例が、それぞれ図５と６に示されている。アンフェタミンについての最適な分解能（分割）（Ｒ＝２１．６８）がＨＳγＣＤを用いて得られたのに対して、ＨＳβＣＤはサリドマイドの最良の分解能(分割)（Ｒ＝３．３７）を生じさせた。
【００４６】
【表５】
【００４７】
本発明を、その幾つかの好ましい態様を参照して著しく詳しく述べたけれども、他の態様も可能である。例えば、シクロデキストリン類は、ホスフェート等の他のマイナスに荷電された置換基、或いは４級アミンのようなプラスに荷電された置換基で修飾することもできる。更には、ＣＥ分離は、荷電ＣＤ複合体の分解能(分割力)を改良するために、異なった緩衝剤、又はｐＨ条件を用いて実施してもよい。そのため、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲は、ここに記載されている好ましい態様の記載に制限すべきものではない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、毛管電気泳動によって光学異性体を分離するためにシクロデキストリン類を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬学的製剤に使用される多くの化学的化合物は、それらの薬学的性質に強く影響を与えることができる光学活性の原因となる非対称中心を有する。２種の鏡像異性体の１種が異なった薬学的性質を有する合成薬剤の例がよく知られている。例えば、（−）−プロプラノロールは、（＋）プロプラノロールよりも１００倍の薬効がある。加えて、同じ薬剤の２種の鏡像異性体の１種が、より毒性が強い場合があり、例えばサリドマイドやケタミン等が挙げられる。従って、高いラセミ体の分割能力（分解能）と高い効率で鏡像異性体を分離する分析的方法が増々重要になってきている。立体化学的に純粋な薬と、現存するラセミ化合物の念入りな試験との必要性から、効率的で、迅速で、鋭敏でしかも精確なキラル分析法の開発が必要とされている。
クロマトグラフィー技術、特に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、が鏡像異性体の分析用に普通に使用されている。かなり最近、毛管電気泳動（ＣＥ）がキラルセレクターとともに使用するものとして採用されている。使用される最も普通の戦略は、鏡像異性体対の差別的なホスト−ゲスト複合体形成のためのシクロデキストリン類の使用である〔Ｓ．ファナリー，Ｊ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，７３５：７７−１２１（１９９６）；Ｈ．ニシ及びＳ．テラベ，Ｊ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６９４：２４５−２７６（１９９５）；Ａ．ガットマン，「シクロデキストリン配列キラル分析による鏡像異性体の毛管電気泳動分離」、毛管電気泳動のハンドブック第２版、Ｊ．ランダース編、１９９７、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．の７５〜１００頁〕。固体支持体に結合した溶解剤を含む多種多様の入手可能なカラムから入念に選択しなければならないＨＰＬＣ分離とは対照的に、キラルＣＥ分析は、一般にシクロデキストリンのようなキラルセレクターを分離緩衝剤中に溶解せしめることによって簡素化される。
【０００３】
シクロデキストリン類（ＣＤ）は、α−、β−又はγ−シクロデキストリンの名前に対応する６、７、又は８個のグルコースユニットからなる環状オリゴ糖類である。ＣＤは、そのへりに二級ヒドロキシル基をもち、開口部がより大きな直径をした、先端を切り取ったトーモロコシの形をしている。内部のキャビティーは、ヒドロキシ官能を含まず、疎水性の特性を発揮する。この疎水性の性質は、ＣＤが芳香族基又はアルキル基と高度に選択的な封入複合体を形成するのを可能にする。ＣＤとそのゲスト分子との間の複合体形成定数の差が、構造的に類似した光学異性体の相対的電気泳動移動度に差を生ぜしめ、その結果、鏡像異性体を明確に分離できる。
酸性及び塩基性化合物のキラル分離において、このＣＤ複合体はイオン性の被検体の電荷の影響の下に移動する。しかしながら中性の被検体に関しては、荷電がないシクロデキストリン類は、被検体、シクロデキストリン及び複合体が全く電気泳動移動度を有さないために、適用できない。荷電シクロデキストリン類の使用は、そのため中性の化合物のキラル分離の問題を解決するために考案された。
【０００４】
メーヤーら〔Ｊ．Ｍｉｃｒｏｃｏｌ，Ｓｅｐ．，６：４３−４８（１９９４）〕とタイトら〔Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６６：４０１３−４１０１８（１９９４）〕が最初にＣＥキラル分離のためにスルホブチルエーテル β−シクロデキストリン（ＳＢＥ−βＣＤ）の使用を報告した。それに続く報告書には、キラルセレクターとしてＳＢＥＣＤを用いるアミン類と中性化合物の分析が記載されている〔デッテら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１５：７９９−８０３（１９９４）；チャンクベタッゼら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１５：８０４−８０７（１９９４）；ルーリーら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６６：４０１９−４０２６（１９９４）〕。ヴィンセントら（１９９７年４月１５日にＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙへ提出された、「毛管電気泳動用の新規な単一異性体のキラル溶解剤のファミリー、第２部：ヘプタキス−６−スルファト−β−シクロデキストリン）は、バケット形のシクロデキストリン分子の狭い末端の６−位にサルフェートエステル類を単独に有するサルフェート化されたβ−ＣＤ（７ＳβＣＤ）を合成するために、モリヤら〔Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６：１６７４−１６７７（１９３３）〕の選択的保護及び脱保護法を採用した。この合成スキームは、キャビティーの幾何学、及び天然のβ−シクロデキストリンの複合体形成性を保持するように設計された。スタルカップとその協力者〔Ａ．スタルカップ等、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６８：１３６０−１３６８（１９９６）；Ｗ．ウー等、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１８：１２８９−１３１５（１９９５）〕は、未処理の溶融シリカ毛管中での中性化合物とアミン類のラセミ体分離のために、シクロデキストリンサルフェートエステル類の混合物を使用することが、調査した４０の化合物にとって有効であったことを、最近報告した。
【０００５】
これらの勇気づける結果にもかかわらず、ＣＥによるキラル分離を行うための普遍的なシステムがない。これは、ＣＥ分離が特定のシクロデキストリンとの複合体形成の範囲に非常に依存しているためである。ＣＤのキャビティーの大きさに加えて、溶質とＣＤのへり上の官能基との相互作用がキラル選択性（分離度）に影響を与えうる。従って、特定のキラル対の分離にとって最も適した特定の荷電又は中性のシクロデキストリンの選択はなお、試行錯誤による経験的なプロセスとなったままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述の理由のために、毛管電気泳動によって広い範囲のキラル化合物を分割（分析）するために用いられる新規な一連の荷電シクロデキストリン類が必要とされている。理想的には、新規なシクロデキストリン類が簡単な手順によって合成され、そして鏡像異性体の再現可能な分離を可能にしうる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１） ａ）アルファシクロデキストリン、
ｂ）少なくとも約１２個の修飾されたヒドロキシル基を有するベータシクロデキストリン、及び
ｃ）ガンマシクロデキストリン
からなる群から選ばれ、二級ヒドロキシルの少なくとも１つの修飾を含んでなることを特徴とする荷電シクロデキストリン。
（項目２） 下記一般式
【化１】
を有し、
ａ）ｎが６又は８であり、少なくとも約１個のR1基が修飾されたヒドロキシルであり、かつ約ｎ個未満のＲ1基がヒドロキシルであるシクロデキストリン、及び
ｂ）ｎが７であり、少なくとも約５個のＲ1基が修飾されたヒドロキシルであり、かつ約３個未満のＲ1基がヒドロキシルであるシクロデキストリン
からなる群から選ばれ、ここで上記修飾されたヒドロキシルがサルフェート、カルボキシレート、ホスフェート、又は４級アミン置換基を含むことを特徴とする荷電シクロデキストリン。
（項目３） 修飾されたヒドロキシル基がサルフェート化されている項目１又は２記載の荷電されたシクロデキストリン。
（項目４） アルファシクロデキストリンが少なくとも約７個のサルフェート置換基を有することを特徴とする高度にサルフェート化されたアルファシクロデキストリン。
（項目５） ベータシクロデキストリンが少なくとも約１２個のサルフェート置換基を有することを特徴とする高度にサルフェート化されたベータシクロデキストリン。
（項目６） ガンマシクロデキストリンが少なくとも約９個のサルフェート置換基を有することを特徴とする高度にサルフェート化されたガンマシクロデキストリン。
（項目７） 項目１記載の荷電シクロデキストリンおよび電気泳動緩衝剤を含んでなることを特徴とする組成物。
（項目８） 上記シクロデキストリンの濃度が約１％〜２０％である項目７記載の組成物。
（項目９） 電気泳動緩衝剤が酸性である項目７記載の組成物。
（項目１０） 酸性緩衝剤のｐＨ範囲が約１〜５である項目９記載の組成物。
（項目１１） 電気泳動緩衝剤がリン酸塩、酢酸塩及びクエン酸塩からなる群から選ばれた電解質を含む項目７記載の組成物。
（項目１２） 試料、項目１記載の荷電シクロデキストリン、及び電気泳動緩衝剤を含んでなり、上記試料が小さなキラル分子であることを特徴とする組成物。
（項目１３） 試料が中性化合物又はアミンを含む項目１２記載の組成物。
（項目１４） 試料の濃度が約０．１〜１０ｍＭである項目１２記載の組成物。
（項目１５） シクロデキストリンが試料に対して相対的に過剰なモル数で存在する項目１５記載の組成物。
（項目１６） 試料が薬剤又は薬学的化合物を含む項目１２記載の組成物。
（項目１７） 内標準をさらに含んでなる項目１２記載の組成物。
（項目１８） 内標準が１，３，６，８−ピレネテトラスルホン酸又はその塩である項目１３記載の組成物。
（項目１９） ａ）（１）アルファシクロデキストリン、
（２）少なくとも約１２個の修飾されたヒドロキシル基を有するベータシクロデキストリン、及び
（３）ガンマシクロデキストリン
からなる群から選ばれ、二級ヒドロキシルの少なくとも１つの修飾を含むシクロデキストリンを含んでなる緩衝剤で毛管を満たす工程；
ｂ）キラル化合物の鏡像異性体を含んでなる試料を上記毛管に注入する工程；
ｃ）鏡像異性体の電気泳動分離を行う工程；及び
ｄ）キラル化合物の分離された鏡像異性体を検出する工程
を含んでなることを特徴とする小さな分子の鏡像異性体の分離方法。
（項目２０） 電気泳動分離が電気浸透フローを抑制する条件下で行われる項目１９記載の方法。
（項目２１） 毛管が被覆された毛管である項目２０記載の方法。
（項目２２） 緩衝剤が酸性である項目２０記載の方法。
（項目２３） （ａ）少なくとも約７個のサルフェート置換基を有するアルファシクロデキストリン；
（ｂ）少なくとも約１２個のサルフェート置換基を有するベータシクロデキストリン；及び
（ｃ）少なくとも約９個のサルフェート置換基を有するガンマシクロデキストリン
からなる群から選ばれた少なくとも２つの、高度にサルフェート化されたシクロデキストリンを含んでなるキラル化合物の分離用キット。
（項目２４） 少なくとも一つの電気泳動緩衝剤をさらに含んでなる項目２３記載のキット。
（項目２５） 内標準をさらに含んでなる項目２３記載のキット。
（項目２６） 少なくとも一つの毛管をさらに含んでなる項目２３記載のキット。
（項目２７） 少なくとも１つのｐＨ調節剤をさらに含んでなる項目２４記載のキット。
本発明は、毛管電気泳動によって広範囲のキラル化合物を分離することへの要求を満足させる一連の荷電シクロデキストリン類に向けられている。好ましいキラルセレクターは、高度にスルフェート化されたα−、β−及びγ−シクロデキストリン類である。これらの荷電シクロデキストリン類は、商業的に入手可能なシクロデキストリン類よりも高度のサルフェート化と、もっと狭い異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を有する。高度にサルフェート化されたシクロデキストリン類を用いるＣＥ分析は、他のキラルセレクターに比べて多種多様のキラル薬剤の分析（分割）を改良できる。更に、高度にサルフェート化されたα−、β−、及びγ−シクロデキストリン類は、互いに補完し合う分離を生じさせ、広い範囲であっても中性及び塩基性薬剤の分析を可能にする。
本発明の荷電シクロデキストリン類は、二級ヒドロキシルの少なくとも１つの水素原子を荷電置換基で置換した、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、又はγ−シクロデキストリンでありうる。好ましい荷電シクロデキストリン類は、次のような一般式を有する：
【０００８】
【化２】
【０００９】
ｎが６又は８であるシクロデキストリンに関しては、少なくとも約１個のＲ1基は修飾されたヒドロキシルであり、かつ約ｎ個未満のＲ1基はヒドロキシルである。ｎが７であるシクロデキストリンに関しては、少なくとも約５個のＲ1基が修飾されたヒドロキシルであり、かつ約３個未満のＲ1基はヒドロキシルである。修飾されたヒドロキシルの水素原子は、好ましくはサルフェート、カルボキシレート、ホスフェート、又は四級アミン置換基によって置換される。最も好ましい置換基はサルフェートである。
好ましい高度にサルフェート化されたアルファシクロデキストリン類は少なくとも約７個のサルフェート置換基を有しており、好ましい高度にサルフェート化されたベータシクロデキストリン類は少なくとも約１２個のサルフェート置換基を有しており、そして好ましい高度にサルフェート化されたガンマシクロデキストリン類は少なくとも約９個のサルフェート置換基を有している。
【００１０】
本発明の荷電シクロデキストリン類は、毛管電気泳動によって小さな分子の鏡像異性体を分離する方法において用いることができる。この方法は、下記の諸工程を含む：ａ）毛管を、荷電シクロデキストリンと電解質とを含む電気泳動緩衝剤で満たす工程；ｂ）キラル化合物の鏡像異性体を含む試料を前記毛管に注入する工程；ｃ）鏡像異性体の電気泳動分離を行う工程；及びｄ）キラル化合物の鏡像異性体を検出する工程。電気泳動分離は、電気浸透フローを抑制する条件下で行われるのが好ましい。例えば、被覆毛管を用いてもよいし、或いは電気泳動緩衝剤が酸性であってもよい。試料は一般に小さなキラル分子（ＭＷ＜５，０００）であり、これは好ましくは中性又は基性の化合物である。１，３，６，８−ピレネテトラスルホン酸の塩等の内標準が、時間に関して標準化することを可能にするために任意に試料に添加される。
本発明の試薬は、毛管電気泳動によってキラル化合物を分離するのに使用するためのキットとして便利よく一体とすることができる。このキットには以下のａ）〜ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも２つの高度にサルフェート化されたシクロデキストリン類が含まれるであろう：ａ）少なくとも約７個のサルフェート置換基を有するアルファシクロデキストリン、ｂ）少なくとも約１２個のサルフェート置換基を有するベータシクロデキストリン、及びｃ）少なくとも約９個のサルフェート置換基を有するガンマシクロデキストリン。更に、このキットは任意に、電気泳動緩衝剤、ｐＨ調節剤、内標準、及び／又は毛管を含むことができる。
本発明のこれらの、及び他の特徴、様相、及び利点は、以下の記述、添付の特許請求の範囲、及び付随した図面によって、より良く理解されよう。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のシクロデキストリン類は、高度にサルフェート化されたα−、β−及びγ−シクロデキストリン類であって、キラルセレクターとして好適なものであり、例えば毛管電気泳動（ＣＥ）に用いることにより、化合物の鏡像異性体対の分離分割能力に優れるものである。本発明の荷電シクロデキストリン類は、従来のシクロデキストリン誘動体よりも高度のサルフェート化とより狭い不均一性を有し、鏡像異性体の分割に好適なものである。
また、高度にサルフェート化されたシクロデキストリン類を用いる本発明の毛管電気泳動（ＣＥ）分析法によれば、多種多様のキラル薬剤、特に中性の化合物及びアミン類の分解能、分割力に優れた分析が可能となる。
さらに、本発明の高度にサルフェート化されたα−、β−、及びγ−シクロデキストリン類は、毛管電気泳動によって解析されうる中性及び塩基性薬剤の数を更に拡大させるべく対象とする化合物の範囲を互いに補完するものであり、より広範囲の鏡像異性体の分離分割を可能とするものである。
また、本発明の組成物及びキットは、このような毛管電気泳動分析に好適に用いられるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】７ＳβＣＤ（Ａ）、ＨＳαＣＤ（Ｂ）、及び７ＳβＣＤとＨＳαＣＤの混合物の電気泳動図を示す。
【図２】７ＳβＣＤ（Ａ）、ＨＳβＣＤ（Ｂ）、及び７ＳβＣＤとＨＳβＣＤの混合物の電気泳動図を示す。
【図３】７ＳβＣＤ（Ａ）、ＨＳγＣＤ（Ｂ）、及び７ＳβＣＤとＨＳγＣＤの混合物の電気泳動図を示す。
【図４】（Ａ）ＡＢＩ ＳＢＥＣＤを含む荷電シクロデキストリン類、並びに（Ｂ）セレスター、及び（Ｃ）アルドリッチのサルフェート化されたシクロデキストリン類の電気泳動図を示す。
【図５】ＨＳαＣＤ（Ａ）、ＨＳβＣＤ（Ｂ）、及びＨＳγＣＤ（Ｃ）を用いて得られるアムフェタミンの電気泳動分離を示すグラフである。
【図６】ＨＳαＣＤ（Ａ）、ＨＳβＣＤ（Ｂ）、及びＨＳγＣＤ（Ｃ）を用いて得られるラセミ体のサリドマイドの電気泳動分離を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ここに記載された方法や試薬には、中性及び塩基性の薬剤の鏡像異性体を分離するための簡素で一般化された手順を要する。広範囲のキラル分子“ゲスト”に対して“ホスト”として作用する一連の新規な荷電シクロデキストリン類が、鏡像異性体対の間で区別するために用いられる。鏡像異性体間での区別的な複合体形成が、電気泳動の移動度に変化を生じさせ、毛管電気泳動中に当該鏡像異性体対の分離を起こさせる。
ＣＤ類は、互いにα（１，４）−グリコシド結合を介して結合したグルコース単位から構成されるオリゴ糖の環である。６個から１２個までのグルコース単位のＣＤが単離されているけれども、６個、７個、及び８個の単位を持ったもの、即ちそれぞれα−、β−、及びγ−ＣＤと呼ばれるものが好ましい。このＣＤ類の形は、被検体のホストとなることができる相対的に疎水性のキャビティーをもった、先端が切り取られたトーモロコシ形に似ている。天然のＣＤ類は、グリコピラノース分子の２，３及び６位にヒドロキシル基ををもつ親水性の外面領域を有する。
【００１４】
本発明のＣＤ類は、シクロデキストリン上の各グルコース単位の６位に荷電置換基を含む修飾されたヒドロキシルを有する。更に、２位及び／または３位（最もありそうには２位において）の二級ヒドロキシル少なくとも１個もまた荷電された基で置換されている。このことは、先端を切り取ったトーモロコシの狭いほうの開口部に荷電された基を持つことに加えて、荷電された基がシクロデキストリンバケットの広いほう開口部のへりにもまた存在することを意味する。この幅の広いほうのへりは、被合体形成を通じて“ゲスト”分子をくるむ部分であるから、バケットの収容末端は、天然のシクロデキストリンのそれに対して混乱（摂動）させられている。二級ヒドロキシルの変化によるバケットの混乱は、選択的な複合体形成プロセスにとって有益であることがわかった。そして、このことは予想外にもＣＤによるより良いキラル差別の結果を生じる。
ＨＳＣＤの好ましい態様の構造式は以下の通りである：
【００１５】
【化３】
【００１６】
ｎが６又は８のシクロデキストリンに関しては、少なくとも約１個のＲ1基が修飾されたヒドロキシルであり、かつ約ｎ個未満のＲ1基がヒドロキシルである。ｎが７であるシクロデキストリンに関しては、少なくとも約５個のＲ1基が修飾されたヒドロキシルであり、かつ約３個未満のＲ1基がヒドロキシルである。ヒドロキシル基を修飾する荷電置換基は、好ましくはマイナスに荷電され、例えば、カルボキシレート、ホスフェート、又はサルフェート基が挙げられる。或いは、この置換基としてはプラスに荷電されたものでもよく、例えば４級アミンで荷電されたものが挙げられる。最も好ましい置換基は、サルフェート基である。
【００１７】
α−ＣＤ類に関しては、少なくとも約７個のヒドロキシル基が置換され、そして好ましくは約１０〜１２個が置換される。もっとも好ましいα−ＣＤはサルフェート置換基で修飾された約１１個のヒドロキシル基を有する。
β−ＣＤに関しては、ＣＤの少なくとも約１２個のヒドロキシル基が荷電置換基で修飾されており、そして好ましくは約１２〜１５個が置換される。最も好ましいβ−ＣＤはサルフェート置換基で修飾された約１２個のヒドロキシル基を有する。
γ−ＣＤ類に関しては、少なくとも約９個のヒドロキシル基が置換されており、そして好ましくは約１２〜１６個が置換される。最も好ましいγ−ＣＤはサルフェート置換基で修飾された約１３個のヒドロキシル基を有する。
好ましいサルフェート化されたＣＤ類の合成には、乾燥したα−、β−、又はγ−シクロデキストリンと、１９モル当量の三酸化硫黄−トリメチルアミン複合体（錯体）とを官能基の何らの保護もなしに、ＤＭＦ中で反応させることが含まれる。この反応は高度のサルフェート化に一致したシクロデキストリンを生成する。従って、この合成による生成物は、高度にサルフェート化されたα−、β−、又はγ−シクロデキストリン類（それぞれ、ＨＳαＣＤ、ＨＳβＣＤ、又はＨＳγＣＤ）と呼ばれる。
【００１８】
多種多様な被検体のいずれをも本発明に従って評価することができる。適した被検体としては、任意の“ゲスト”、例えば荷電ＣＤ“ホスト”と複合体（錯体）を形成しうる、光学異性体、鏡像異性体対、ラセミ薬剤混合物が挙げられる。実際、荷電ＣＤ類との異なった複合体形成平衡定数を有する任意のキラル対を、ここに述べられているように、分析することができる。試料は一般に、光学活性なキラル中心を有する小さな分子（ＭＷ＜５，０００）であろう。本発明の好ましい実施態様において、試料は、例えば本願の実施例に於いて挙げられたもの等の薬学的化合物である。最も好ましい試料は中性化合物、又はアミン類である。
時間に関して標準化ができるように、少なくとも１つの内部指標を試料に添加してもよい。この指標は、鏡像異性体の相対的移動時間を比較するためのタイム・ゼロ出発点を提供する分析物成分より先に移動することが好ましい。ピレネ−１，３，６，８−テトラスルホン酸（ＰＴＳ）四ナトリウム塩が、大部分の分離にとって信頼できる指標として働きうる好ましい内標準である。酸性条件の下では、ＰＴＳはその電気泳動の移動度にだけ主として依存する短い移動時間をもったピークを生じる。その大きな分子サイズとその四つのマイナス電荷により、ＰＴＳはサルフェート化されたシクロデキストリン類と全く相互作用を有しない。
【００１９】
本発明に従って、毛管電気泳動（ＣＥ）が、キラル化合物の分離の仲立ちをつとめるように用いられる。一般に、ＣＥは、毛管、即ち内径が約２〜２，０００ミクロン（μｍ）の管に、試料成分を導入すること、および前記毛管に電界をかけることを含む。電界の電位は、毛管を通して分析物成分を引き離し、かつそれらの電気泳動の移動度に従ってそれらを分離する。
本発明のＣＥ法は、好ましくは電気浸透フロー（ＥＯＦ）を抑制する条件下で行われる。“オープン”ＣＥフォーマットを使用するときには、溶融シリカ毛管はポリマーとゲルを欠く電気伝導性緩衝剤で充填される。この溶融シリカ毛管は、約５．０よりも大きなｐＨで著しくマイナスに荷電されるようになり、このことが緩衝剤から陽イオンの層を引きつける。これらのイオンは、電位の影響下で、陰極に向かって流れるので、緩衝液と分析される試料は同じ方向で運ばれる。その結果として生じたＥＯＦは、中性の種とイオン性の種の両方を、荷電の有無にかかわらず、陰極の方に押し動かす定速成分を与える。このように、電気浸透フローを抑制しない条件下では、試料成分の移動速度は主として基底のＥＯＦ（このものは試料成分の電気泳動の移動度を圧倒できる）によって決定される。
試料成分の電気泳動の移動度に主として基づいて分離させるに十分なようにＥＯＦを抑制できる多くの方法がある。最も簡単なアプローチは、酸性のｐＨを有する電気泳動緩衝剤を用いることである。従って、本発明の好ましい緩衝剤は、約７未満のｐＨを有する。最も好ましい緩衝剤は約１〜約５のｐＨ範囲を有し、この範囲はたいていの適用においては約２．５〜４のｐＨで最適化される。
【００２０】
この好ましいｐＨ範囲で適当な緩衝能を有する電解質が、電気泳動緩衝剤の成分として含有される。酸性ｐＨにおいて使用されるに適した電解質としては、有機もしくは無機の、リン酸塩、酢酸塩、又はクエン酸塩が挙げられる。好ましい電気泳動緩衝剤の電解質はリン酸トリエチルアンモニウム塩である。緩衝剤中の電解質のモル濃度は一般に約５〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭであり、そして最も好ましくは約２５〜５０ｍＭである。電解質のより高い濃度を有する緩衝剤のイオン強度は望ましくないジュール熱効果を生じさせる場合がある。
ＥＯＦを抑制するための他の方法は、被覆毛管を使用することである。毛管の表面は、緩衝剤系に界面活性剤、双性イオン塩、又は親水性綿状ポリマー等の添加剤を含有させることによってダイナミックに被覆することができる。しかしながら、好ましい毛管コーティングは、毛管表面に化学的に結合した、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、又はジオールエポキシコーティング等のポリマーであろう。最も好ましいポリマーコーティングは、簡単にＰＶＡとして知られるポリ（ビニルアルコール）である。
【００２１】
本発明を実施するのに用いられる毛管は一般に、約１０μｍ〜約２００μｍのサイズ範囲の内径を有する。最も好ましくは、約２５μｍの内径を有する毛管が鏡像異性体のＣＥ分離用に使用される。毛管の好ましい長さは、約１０〜約１００ｃｍであり、最も好ましくは約２７ｃｍである。検出窓は、好ましくはカラムの出口から約６．５ｃｍの毛管中に位置する。
特定の被検体“ゲスト”とともに用いるためのα−、β−、又はγ−シクロデキストリン“ホスト”の選択は、一般に経験に基づく事柄である。ＣＤ誘導体を選択するための大まかな指針は、α−ＣＤでの分離は１つの芳香族環をもった化合物に関して好ましく、β−ＣＤは置換芳香族環をもった化合物に関して好ましく、そしてγ−ＣＤは複数の環をもった化合物に関して好ましい。しかしながら、図４と５に示したように、実際の結果ではこの一般的な経験則から実質的に逸脱することがある。
【００２２】
同様に、電気泳動分離中の、毛管内における荷電α−、β−、又はγ−シクロデキストリンの濃度は、各キラル化合物に関して経験的な手法で最適化されうる。一般に、荷電シクロデキストリンの濃度は、試料成分に対して相対的に過剰のモル数であるべきである。最適化のための適したＣＤ濃度範囲は、約１％〜約２０％であり、好ましくは約２％〜約１０％の狭められた範囲である。荷電ＣＤの最も好ましい濃度は約５％である。
【００２３】
ＣＤ類は好ましくは電気泳動緩衝剤に添加され、そして毛管中に導入される。分離緩衝液は水中２０％ＨＳＣＤ１部中、電気泳動緩衝剤（例えば５０ｍＭリン酸トリエチルアンモニウム塩、ｐＨ２．５）の２Ｘ溶液２部、及び水１部を混合することによって調製することができる。毛管を２０ｐｓｉの圧力で、１分間、分離緩衝液を用いてすすぐ。試料の注入後、毛管の入口と出口が分離緩衝液中に浸漬され、そしてそれから電圧がかけられて電気泳動を開始する。好ましさの点では比較的劣る代替方法として、ＣＤ類を毛管壁に結合させる方法やＣＤ類をゲル母体に含有させる方法がある。
試料は、水中メタノール０〜５０％中に被検体を検出可能な濃度、一般的には約０．１〜１０ｍＭ、そして好ましくは約１ｍＭで溶解させることによって調製される。更にＰＴＳ等の内標準が、被検体の約半分の濃度、好ましくは約０．５ｍＭで試料に添加されうる。試料はそれから、界面動電注入、水圧、真空、又はシリンジポンプによって導入されうる。好ましくは、試料は、０．５〜約１５ｐｓｉの範囲、最も好ましくは約０．５ｐｓｉの圧力で、かつ約１〜９９秒の期間中で、最も好ましくは約２〜５秒で、圧力注入によって毛管カラムに導入される。
【００２４】
Ｐ／ＡＣＥ２０００シリーズ、Ｐ／ＡＣＥ５０００シリーズ、又はＰ／ＡＣＥ ＭＤＱ毛管電気泳動システム（ベックスマン・インスツルメンツ・インコーポレーテッド、フラートン、ＣＡ）。加えて、ベックマン システム ゴールドTM（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＧｏｌｄTM）ソフトウェアー、ベックマン Ｐ／ＡＣＥTMソフトウエァー、又はＩＢＭ ＰＳ／２、ＩＢＭ３５０ ４６６ＤＸ２もしくはＩＢＭ３５０−Ｐ９０ＰＣによって制御されたベックマンＰ／ＡＣＥTMステーションソフトウェアを本発明を実施する際に用いることができる。試料は、１ｋＶ〜約１００ｋＶ、好ましくは５ｋＶ〜約２０ｋＶ、そして最も好ましくは約７．５ｋＶ〜約１２ｋＶの範囲の電圧で電気泳動にかけられる。
検出は好ましくはＵＶ吸収によって、好ましくは、試料成分と内標準を検出するが荷電ＣＤは検出しない波長で行われる。検出のための好ましい波長は、約１８０ｎｍ〜約３８０ｎｍの範囲であり、最も好ましい検出波長は約２１４ｎｍである。
【００２５】
ＣＥが、電気浸透フローを抑制する条件下、例えば酸性ｐＨで行われるとき、ＣＥは検出窓口の最も近くに置かれた陽極とともに、反対の極性を用いて好ましく行われる。これらの条件下で、被検体は陽極の方に移動するマイナスに荷電されたシクロデキストリンとの複合体形成によって陽極に引っぱられる。しかしながら、より速く移動する大きな（メジャー）ピークの末尾が小さな（マイナー）ピークをおおい隠すならば、ピークの移動順序を逆にすることが望ましいことがある。一般に、好ましい分離条件は、小さな汚染物質が主成分に向かって移動する条件である。移動順序の逆転は、緩衝剤のｐＨを約７より大きく、好ましくは約ｐＨ８に緩衝剤のｐＨを上げることによって、しかも陰極が検出窓口に最も近くなるように極性を変えることによって達成することができる。そのような条件下では、ＥＯＦは、遊離の、被検体を結合した荷電シクロデキストリン類を含めて全化合物を陰極へ運び去るのに十分強い。
【００２６】
ＣＥによるキラル分析を最適化するための系統的な機構を促進するために、本発明の試薬を便利よく一体化してキットとすることができる。最適なシクロデキストリン“ホスト”を選択するのを助けるために、キットには以下のａ）〜ｃ）からなる群から選ばれた少なくとも二つの高度にサルフェート化されたシクロデキストリン類が含められるであろう：ａ）少なくとも約７個のサルフェート置換基を有するアルファシクロデキストリン；ｂ）少なくとも約１２個のサルフェート置換基を有するベータシクロデキストリン；及びｃ）少なくとも約９個のサルフェート置換基を有するガンマシクロデキストリン。
更に、キットは、少なくとも一つの電気泳動緩衝剤を、好ましくは酸性のｐＨで任意に含んでもよい。しかしながら、もっと高いｐＨで用いるための別の緩衝剤を、ＮａＯＨ又はリン酸等のｐＨ調節剤に加えて含有してもよい。緩衝剤の組成及び／又はｐＨを変えることで、分析（分割）性能を改良したり及び／又は分析を受けているキラル対の移動順序を逆転させることができる。キットヘの更なる添加物としては、ＰＴＳ等の内部標準、被覆もしくは未被覆毛管が挙げられる。
【００２７】
本発明のこれまでに述べた態様には多くの利点、例えば合成の簡単なワン・ステップ法、多種多様な光学異性体の再現性のよい分離、並びに数多くの中性及び塩基性キラル化合物の改善された分割分析等がある。この方法は費用が安く、しかも作業を最適化するために多数の異なった固定相カラムを必要とするＨＰＬＣを使用するキラル分析法に比べて万能である。本発明の試薬、方法、及びキットは、薬剤、食物栄養物、環境汚染物質、殺虫剤、又はそれ以外のラセミ体混合物の立体化学的純度を監視するための品質管理システムに容易に適合させることができる。
【実施例】
【００２８】
本発明の材料や方法は、以下の例を参照することでより良く理解されよう。
【００２９】
例１
ＨＳＣＤ類の合成
この最初の一連の例は、結果として得られる生成物の一貫して高度のサルフェート化のみならず、サルフェート化された、α−、β−、又はγ−シクロデキストリン類を合成するために使用されうる簡単かつ単一工程法を説明している。
高度にサルフェート化したα−シクロデキストリンの合成は、機械的な攪拌器を装備し、乾燥した２リットル反応器に、オーブンで乾燥したα−シクロデキストリン１００ｇ（１０２．８ｍｍｏｌ）と無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）９００ｍｌを添加することで行った。この容器をオイルバス中で５０℃で撹絆しながら加熱して大部分の固体を溶解した。３００ｍｌのＤＭＦ中での三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（２７２ｇ、１９５３ｍｍｏｌ）の部分溶解混合物を、反応器にゆっくりと注ぎ、５０℃で激しく攪拌した。ガム状の生成物が３５分後に形成され、そし攪拌を中断した。室温に冷却した後、溶媒をデカンテーションによって除去し、ガム状の生成物を３００ｍｌの試薬アルコールで２回洗浄し、そして溶媒を再びデカンテーションによって除去した。
同様に、高度にサルフェート化されたβ−シクロデキストリンの合成を、機械的な攪拌器を装備し、乾燥された２リットル反応器に、オーブン乾燥したβ−シクロデキストリン１００ｇ（８８．１ｍｍｏｌ）と５００ｍｌの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を添加することによって行った。この容器をオイル浴中で５０℃で攪拌しながら加熱し、固体の大部分を溶解した。３００ｍｌのＤＭＦ中での三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（２４０ｇ、１７２４ｍｌ）の部分溶解混合物を、この反応器にゆっくりと注ぎ、５０℃で１時間、激しく攪拌した。ガム状の生成物が形成され、そして攪拌が中断された。溶媒を熱いうちにデカンテーションによって除去し、このガム状の生成物を３００ｍｌの試薬アルコールで２回洗浄し、そして溶媒を再びデカンテーションによって除去した。
【００３０】
高度にスルフェート化されたγ−シクロデキストリンを製造するための類似した合成スキームを、機械的な攪拌器を装備し、乾燥された２リットル反応器に、オーブン乾燥したγ−シクロデキストリン１００ｇ（７７．１ｍｍｏｌ）と９００ｍｌの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を添加することによって行った。この容器をオイル浴中で５０℃で攪拌しながら加熱し、固体の大部分を溶解した。３００ｍｌのＤＭＦ中での三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（２０４ｇ、１４６０ｍｍｏｌ）の部分溶解混合物をこの反応器にゆっくりと注ぎ、５０℃で激しく攪拌した。ガム状の生成物が３５分後に形成され、そして攪拌が中断された。室温に冷却した後、溶媒をデカンテーションによって除去し、ガム状の生成物を３００ｍｌの試薬アルコールで２回洗浄してから、再び溶媒をデカンテーションによって除去した。
上述の合成スキームから、このガム状の生成物を３７５ｍｌの４Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し、そして攪拌した。この溶液を約１０のｐＨに維持し、２リットルの丸底フラスコに移して、それから回転蒸発して減圧下で少量の水とともにトリメチルアミンを除去した。それから、このフラスコを一晩中、冷室に置いた。残りの溶液（約６００ｍｌ）から析出した固体をろ過によって集めた。約８００ｍｌのアセトンをろ液の各々に添加し、そしてこの各々が軟らかなガムを形成した。この混合物を１０分間、激しく攪拌し、それからアセトンをデカンテーションによって除去した。次いで、別に８００ｍｌのアセトンを添加し、１０分間攪拌してからデカンテーションによって除去した。このガム状の生成物を各々、５００ｍｌの脱イオン水に溶解し、この溶液を激しく攪拌しながら２リットルのメタノール中にゆっくりと注いだ。この結果生成した灰色がかった白色固体をろ過によって集め、３００ｍｌのメタノールで３回洗浄し、一晩、高真空下１１０℃で乾燥した。
【００３１】
水に再懸濁されたときには、全種のＨＳＣＤの溶液は、三酸化硫黄−トリメチルアミン複合体に由来する不純物により明るい茶褐色を呈している。この溶液は、脱色化する活性炭（アルドリッチＣａｔ．Ｎｏ．１６，１５５−１）で処理することによって容易に脱色され、そしてそれから遠心分離と０．４５μｍの注射器型フィルターを通してのろ過によって浄化した。
４つの異なったロットのＨＳβＣＤ、１ロットのＨＳαＣＤ、及び１ロットのＨＳγＣＤが元素分析にかけられ、ヴインセント等によって採用されたモリヤ等の方法によって合成された多数の７ＳβＣＤと比較された。サルフェート化の程度を表１にまとめて示したように、各ロットに関して測定した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
表１に示したように、本発明のＨＳＣＤ類を製造するのに用いられる合成手順では、平均値でグルコース１分子当り、少なくとも約ｌ．６個のサルフェート分子という高度のサルフェート化（＞１１）が一貫して達成された。
【００３４】
例２
間接ＵＶ検出によるサルフェート化されたβ−ＣＤ類の特徴づけ
この例は、本発明のＨＳＣＤ類がヴィンセント等のサルフェート化されたＣＤよりも、もっと高度にサルフェート化され、しかも商業的に入手できる数種のサルフェート化されたＣＤ類よりも異成分がより少ないことを示している。
シクロデキストリン１つ当り平均値で４のサルフェート化度をもったスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリン類（ＳＢＥ−βＣＤ）がパーキンエルマー／ＡＢＩ（フォスター市、ＣＡ）から購入された。更に、サルフェート化されたβ−ＣＤ類（サルフェート化度（平均値）＝４）の混合物をセレスター（ハモンド、インディアナ）から供給を受け、またβ−ＣＤ１つ当り７〜１０のサルフェート化度（平均値）を有するサルフェート化されたシクロデキストリンをアルドリッチ（ミルウォーキー、ウィスコンシン）から入手した。これらの商業的に入手できる荷電ＣＤ類を、ヴィンセント等の６−シクロデキストリンのＣ−６サルフェートエステル（７ＳβＣＤ、ｂ−ＣＤ当り７のサルフェート基）や、例１に従って合成されたα−、β−、及びγ−ＨＳＣＤ類と比較した。
【００３５】
間接ＵＶ検出によるＣＥ分析が、ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレーテッドから入手した５０μm×２７ｃｍのＰＶＡで共有結合的に被覆された毛管を用い、２５４ｎｍで検出するＵＶ検出器（Ｐ／Ｎ ２２３２１１１）を装備した、ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレーテッド（フラートン、ＣＡ）によるＰ／ＡＣＥ ５０００ ＣＥシステムにおいて遂行された。分離緩衝剤は、ＴｒｉｓでｐＨ８．０に調節された４０ｍＭのｐ−トルエンスルホン酸（ＴＳＡ）から構成された。この方法では、非吸収性のスルフェート化されたシクロデキストリン類が、陽極に電気泳動的に移動するイオン性の発色団、ＴＳＡにとって替り、より近いＵＶ吸収帯をつくる。その結果、アニオン性の被検体が、それらが検出器を通過するときにネガティブな吸収の信号を生ずる。そのピークは直接ＵＶ吸収検出で得られたものよりも広く、これは恐らく、サルフェート化されたシクロデキストリン被検体とＴＳＡをバックグラウンドとする発色団との間の移動度の不完全な適合によるのであろう。
【００３６】
ＨＳαＣＤ、ＨＳβＣＤ、及びＨＳγＣＤについての得られた電気泳動図を、それぞれ図１、２、及び３に示す。このα−、β−及びγ−ＨＳＣＤ類の全てが７ＳβＣＤよりも短い移動時間をもったピークを生じるが、このことはサルフェート化の度合いが各ＨＳＣＤの７よりも高いことを示唆している。ＨＳＣＤと７ＳβＣＤの混合物が２つの明確に区別されるピークを生じるという事実は、べックマンＨＳＣＤ類は、完全にランダムにサルフェート化されたスピーシーズのグロスな混合物ではないことを暗示している。更には、仮にこの混合物が８、９、又は１０個のサルフェート基をもつＨＳＣＤ分子を含むとしたら、予期される電気泳動図はＨＳＣＤと７ＳβＣＤの各ピークの間に明確な分離を示すことはないであろう。したがって、これらの結果は、ＨＳＣＤ類のサルフェート化の平均の度合が１０より大きいことを確証している。
ＨＳＣＤ類のピークが７ＳβＣＤのピークよりもずっと広くはないという事実は、ＨＳＣＤ類の分子の不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が広くないことを示唆している。比較として、ＳＢＥ−βＣＤ、セレスターのサルフェートシクロデキストリン、及びアルドリツチのサルフェート化されたβ−ＣＤの電気泳動図（図４）は、幾つかのはっきりと区別されるピークからなり、もっとずっと複雑である。比較によって、このＨＳＣＤは、商業的に入手できる他のサルフェート化されたシクロデキストリン類に比べて、サルフェート化の度合がより高く、かつ不均一性がより狭いシクロデキストリン類の混合物である。
【００３７】
例３
高度にサルフェート化されたβ−シクロデキストリン（ＨＳβＣＤ）を用いるキラル分離
ＣＥのためのキラルセレクターの選択において最も重要な因子は、最も多種多様な被検体を分割分析する能力である。従って、我々は、ＨＳβＣＤを用いた中性及び塩基性薬剤のエナンチオマー分離が、ＡＢＩからのＳＢＥＣＤ（β−ＣＤ当り平均４個のスルホブチルエーテル基）、セレスターからのサルフェート化されたβ−ＣＤ類（β−ＣＤ当り可変数のサルフェート基）、及びヴィンセント等のβ−シクロデキストリンのＣ−６サルフェートエステル（７ＳβＣＤ、β−ＣＤ当り７個のサルフェート基）を用いたキラル分離に好適にも匹敵することを立証するための比較研究を行った。
【００３８】
ホスフェート緩衝剤は、リン酸を、トリエチルアミン又はＮａＯＨ溶液等の対応する塩基で滴定することで調製した。サルフェート化されたβ−ＣＤを、２５ｍＭのリン酸トリエチルアンモニウム中でｐＨ２．５で溶解した。サルフェート含量の不正確な性格により、サルフェート化されたβ−ＣＤ類の濃度は、体積当りの重量の基準で表現した。アミノベースのラセミ体は水に溶解されたけれども、中性のラセミ体の試料は水中５０％のメタノールに溶解された。毛管に注入された全試料は、１ｍＭのラセミ体混合物と、内標準として０．５ｍＭの１，３，６，８−ピレネテトラスルホン酸ナトリウム塩（ＰＴＳ）を含有した。ＰＴＳは、その４つのマイナス電荷のために、混合物中の任意の化合物に向かって移動した。
中性化合物やアミン類の多数のラセミ体が、実質上同じ分離条件の下で毛管電気泳動にかけられた。分離は、２５μｍ×２７ｃｍの未処理の溶融シリカ毛管を用いる、２１４ｎｍでのＵＶ検出器を装備した、ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレーテッド（フラートン、ＣＡ）によるＰ／ＡＣＥ ５０００ ＣＥシステム上で遂行された。サルフェート化されたシクロデキストリン類の濃度が変えられた（表２Ａと２Ｂ参照）。電気泳動が、逆極性の条件下、１０又は１２ｋＶ適用電圧で行われた。その結果を表２Ａと２Ｂにまとめて示す。カッコ内に示されたパーセントの値は、最適の分離を生じさせた分離緩衝剤中のサルフェート化されたシクロデキストリンの濃度を示している。
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
試験された中性化合物の内の７つ及びアミン類の全ては、公知の薬剤である。分析されたアミン類の２つ、フルオキセチン及びヴェラパミルは市販されている薬剤（それぞれＰｒｏｚａｃ（登録商標）及びＶｅｒｅｌａｎ(登録商標)）のカプセルから入手した。表２Ａと２Ｂの結果は、ピーク中心間の差△×と４σ、ピークの２つの標準偏差の平均値の指標として定義される、複数のピークの分割（分割能）Ｒを示している。これらの結果は、簡単な１工程合成において調製されたＨＳβＣＤは、１８個の中性ラセミ体及び１１個のアミン鏡像異性体対に関して良好な分解能（＞１）を与えたことを示している。ラセミ体の幾つか（グルテチミド、ロラゼパム、プラズィクワンテル、ヒドロベンゾイン、α−シクロプロピルベンジルアルコール及び１，１′−ビ−２−ナフトール）は、ＨＳβＣＤを用いて著しく大きな分解能の値（＞７）を生じた。これと比べて、７ＳβＣＤは、もっとずっと少数のキラル対（８個の中性化合物、及び８個のアミン類）に関して適当な分離を生じた。
【００４２】
ＨＳβＣＤを用いるときの中性ラセミ体の電気泳動図からの１つの観察結果は、移動時間は一般に７ＳβＣＤ分離に関して対応する時間よりもっと遅かったということであった。このことは、７ＳβＣＤと中性化合物の大部分との間の複合体形成平衡定数は、ＨＳβＣＤの対応する値よりも高いことを示唆している。
この高い親和力は、７ＳβＣＤが試験した中性化合物の大部分に関して粗悪な分離を生じさせる、即ち複合体形成が両鏡像異性体に関して強すぎるために、その結果キラル識別ができないことの主な理由と符合しているものと思われる。
キラルアミン類に関しては、逆の傾向が観察された。ＨＳβＣＤによって生じた移動時間は、７ＳβＣＤを用いて得られたものよりも殆ど全てに関して短かった。この結果の理由の１つは、ＨＳβＣＤのサルフェート化の度合いが高いほど、もっとマイナスに荷電されるために陽極の方への電気泳動の移動度を高くするということである。マイナスの増大した電荷が、サルフェート化されたシクロデキストリンとプロトン化されたアミン類との間に、より高い静電引力をも生じさせるということが言えそうである。より高い複合体形成定数がより低い分解能を生じさせてしまったと思われる中性被検体のケースと違って、アミン類に関するベックマンのＨＳβＣＤの明らかに高い親和力が、７ＳβＣＤよりも数多くの好結果のキラルアミン分離を生じさせた。
これらの結果は、種々の荷電ＣＤ類の中に分解能(分割力)に大きな差があることを示している。７よりも大きな平均スルフェート化の程度を有するこれらのＣＤ類は、より広い範囲の分子種(表２Aと２B参照)について実質的により良いキラル分割を示した。これに関して、ここに述べられた簡単な、一工程での、高収率な合成を用いて調製されたＨＳβＣＤは、試験した種々のサルフェート化シクロデキストリン類のいずれとも好適にも匹敵するものであった。
【００４３】
例４
ＣＥ分離の再現性に関する、異なった合成ロットの効果
キラルセレクターに関する他の重要な評価基準は、異なった合成ロット間での性能の再現性である。三つの異なった型のヒドロキシル(各グルコース単位における２−、３、及び６−位)の直接スルフェート化が、７SβＣＤ化合物の５段工程合成よりももっとランダムな置換を生じさせると予想されたから、ＨＳＣＤの異なったロット内での変動は考慮されなければならない可能な手段であった。この点から考えて、５つの合成から得られた５つの異なったロットのＨＳＣＤ（ＧＳ４７４７−６５、ＧＳ４７４７−７０、ＧＳ４７４７−８２、ＧＳ４７４７−８５及びＧＳ４７４７−９０）を、５−(４−メチルフェニル)−５−フェニルヒダントイン、α−メチル−α−フェニルサクシンイミド、及びサリドマイドラセミ体の分離について試験した。表３の結果は、移動時間と分解能(分割力)の再現性が合成ロットのうちの４つに関して非常に良好であることを示している。ロット８５だけが速い移動と低い分解能を生じさせて、他のものとは多少違っていた。これらの結果は、保護されていないβ−ＨＳＣＤの直接スルフェート化の簡単な手順を用いて繰返し合成することがＣＥのキラルセレクターとして再現可能性に優れた性能と一致する生成物を産することを示している。
【００４４】
【表４】
【００４５】
例５
高度にサルフェート化されたα−、β−、及びγ−シクロデキストリン類を用いるキラル分離
この例は、分離することができるキラル化合物の範囲が、ＣＥ−ベースキラル分離に高度にサルフェート化されたα−及びγ−シクロデキストリン類（それぞれＨＳαＣＤ及びＨＳγＣＤ）を含めることによって拡大されることを示している。表４の結果は、３つの異なったＨＳＣＤ類によって引き起こされる分離は、多種多様な中性及び塩基性の薬剤を網羅するように互いに補完し合っていることを示している。ＨＳγＣＤは、薬学的に重要なフェネチルアミン類の鏡像異性体を分離するのに特に効果的であることが判明した。アンフェタミンとサリドマイドのキラルＣＥ分析の例が、それぞれ図５と６に示されている。アンフェタミンについての最適な分解能（分割）（Ｒ＝２１．６８）がＨＳγＣＤを用いて得られたのに対して、ＨＳβＣＤはサリドマイドの最良の分解能(分割)（Ｒ＝３．３７）を生じさせた。
【００４６】
【表５】
【００４７】
本発明を、その幾つかの好ましい態様を参照して著しく詳しく述べたけれども、他の態様も可能である。例えば、シクロデキストリン類は、ホスフェート等の他のマイナスに荷電された置換基、或いは４級アミンのようなプラスに荷電された置換基で修飾することもできる。更には、ＣＥ分離は、荷電ＣＤ複合体の分解能(分割力)を改良するために、異なった緩衝剤、又はｐＨ条件を用いて実施してもよい。そのため、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲は、ここに記載されている好ましい態様の記載に制限すべきものではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−１３２９０７（Ｐ２０１０−１３２９０７Ａ）
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９６１９７（Ｐ２００９−２９６１９７）
【出願日】平成２１年１２月２５日（２００９．１２．２５）
【分割の表示】特願平１０−２０９６５６の分割
【原出願日】平成１０年７月２４日（１９９８．７．２４）
【出願人】（５１０００５８８９）ベックマン・コールター・インコーポレーテッド (174)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２５日（２００９．１２．２５）
【分割の表示】特願平１０−２０９６５６の分割
【原出願日】平成１０年７月２４日（１９９８．７．２４）
【出願人】（５１０００５８８９）ベックマン・コールター・インコーポレーテッド (174)
【Ｆターム（参考）】
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