水溶性テトラゾリウム化合物
【課題】水溶性で長波長の光吸収を呈するホルマザンを生成するとともに、水溶液中で長期間安定であり脱水素酵素または酵素基質の定量に好適な水溶性テトラゾリウム化合物を提供する。
【解決手段】下記の一般式（１）で表される水溶性テトラゾリウム化合物。式中、Ｒ１〜Ｒ１９は、それぞれ独立に、水素原子、ニトロ基、スルホン酸基、または炭素数１から４のアルキル基、アルコキシ基、スルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、但し、Ｒ１〜Ｒ１９のうち少なくとも２つは、それぞれ独立に、スルホン酸基または炭素数１〜４のスルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムである。
【化１】
【解決手段】下記の一般式（１）で表される水溶性テトラゾリウム化合物。式中、Ｒ１〜Ｒ１９は、それぞれ独立に、水素原子、ニトロ基、スルホン酸基、または炭素数１から４のアルキル基、アルコキシ基、スルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、但し、Ｒ１〜Ｒ１９のうち少なくとも２つは、それぞれ独立に、スルホン酸基または炭素数１〜４のスルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムである。
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テトラゾリウム化合物に関し、特に脱水素酵素または酵素基質を定量分析するのに好適な新規の水溶性テトラゾリウム化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸脱水素酵素（以下ＬＤＨと略称する）、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素などの各種脱水素酵素の定量分析には、従来よりテトラゾリウム化合物（テトラゾリウム塩）が用いられてきた。これは、テトラゾリウム化合物は、これら各種の脱水素酵素の作用により遊離した水素を中間電子運搬体を介して受容してホルマザンとなるので、そのホルマザンの吸光度を測定することにより脱水素酵素またはそれらの酵素基質を定量することができるからである。
【０００３】
特に、これらの脱水素酵素の内、ＬＤＨは全ての体細胞に分布し、特に心筋、肝臓、骨格筋、肝臓に多く、心筋梗塞、悪性腫瘍、肝疾患、進行性筋萎縮、血管内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合には、血清ＬＤＨ活性が著しく上昇することが知られている。従って血中のＬＤＨ活性を測定することにより、臨床上、診断に対する極めて有意義な知見を得ることができる。血中の尿酸や胆汁酸の測定においても、より生体成分の妨害を受けにくい脱水素酵素を用いる方法が望まれている。
【０００４】
また、近年、培養細胞内および細胞から漏出した脱水素酵素活性を指標とすることで、細胞増殖能および細胞毒性度合いを測定することが可能となり、化学物質の毒性や新規治療薬の効果等を簡便に知る目的に汎用されている。
【０００５】
このような目的の水素受容体としては、従来より、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−２Ｈテトラゾリウム塩化物］（以下ニトロＴＢと略称する）、［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］（以下ＭＴＴと略称する）などが一般的に用いられている。
【０００６】
しかしながら、ニトロＴＢおよびＭＴＴが水素を受容して生じるホルマザンは水に溶解せず、使用上不便であった。特に自動分析およびマイクロプレート分析においては、生成したホルマザンがセル、チューブおよびマイクロプレートなどの計測系に付着する難点があり、これらの欠点を除去するために、水溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩を使用することが必要となっていた。特に生体試料を測定する場合、試料中に含有される生体成分の色による干渉を回避するため、長波長の吸収を持つ紫から青色のホルマザンが所望されている。
【０００７】
本出願人の研究グループは、先に、これらの要求を満たす幾つかのテトラゾリウム化合物を案出している〔特許第２５９２４３６号公報（特許文献１）、特許第２８１９２５８号公報（特許文献２）、および特許第２９９５８８０号公報（特許文献３）〕。これらの特許に開示されているテトラゾリウム化合物は、脱水素酵素やその酵素基質を自動分析またはマイクロプレート分析により分析にするに際して実用に供することのできる試薬を構成するものであるが、更なる品質向上も求められている。特に、これまで提案された長波長のホルマザンを生成する水溶性テトラゾリウム化合物は、水溶液中で不安定であるため試薬として長期保存するのに難点を有していた。
【特許文献１】特許第２５９２４３６号公報
【特許文献２】特許第２８１９２５８号公報
【特許文献３】特許第２９９５８８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、水溶性で長波長の光吸収を呈するホルマザンを生成するとともに、水溶液中で長期間安定であり脱水素酵素または酵素基質の定量に好適な水溶性テトラゾリウム化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、溶解性の良好なホルマザンを生じさせ、かつ安定性の高い化合物についてさらに研究を重ねた結果、新規の水溶性テトラゾリウム化合物の合成に成功し、この化合物が優れた水素受容体で、且つこのものから生じるホルマザンが水溶性で、安定であり、分析装置への付着や沈殿を起こさず脱水素酵素やその酵素基質の測定が可能であることを見出した。
【００１０】
かくして、本発明は下記の一般式（１）で表されるテトラゾリウム化合物を提供するものである。
【００１１】
【化１】
【００１２】
式中、Ｒ１〜Ｒ１９は、それぞれ独立に、水素原子、ニトロ基、スルホン酸基、または炭素数１から４のアルキル基、アルコキシ基、スルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、但し、Ｒ１〜Ｒ１９のうち少なくとも２つは、それぞれ独立に、スルホン酸基または炭素数１〜４のスルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムである。
さらに、本発明に従えば、上記のテトラゾリウム化合物を用いることを特徴とする脱水素酵素または酵素基質の定量方法が提供され、本発明の脱水素酵素または酵素基質の定量方法には、培養細胞内または培養細胞から漏出した脱水素酵素活性を測定することも含まれる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の水溶性テトラゾリウム化合物を用いることにより、得られるホルマザンの水溶性がさらに向上し、測定機器への付着が無く、自動分析やマイクロプレート分析装置による脱水素酵素または酵素基質の高感度の定量測定が可能である。さらに、本発明のテトラゾリウムは水溶液中で長期間安定であり、試薬としての保存性においても優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のテトラゾリウム化合物の化学構造式を例示する。
【図２】本発明のテトラゾリウム化合物ｄの緩衝溶液中（５℃）の安定性を示すグラフである。
【図３】本発明のテトラゾリウム化合物ｄの緩衝溶液中（２５℃）の安定性を示すグラフである。
【図４】比較のために、水溶液中で不安定な既存の水溶性テトラゾリウム化合物の緩衝溶液中の安定性を示すグラフである。
【図５】本発明のテトラゾリウム化合物ａによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図６】本発明のテトラゾリウム化合物ｂによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図７】本発明のテトラゾリウム化合物ｃによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図８】本発明のテトラゾリウム化合物ｄによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図９】本発明のテトラゾリウム化合物ｅによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図１０】本発明のテトラゾリウム化合物ｆによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図１１】本発明のテトラゾリウム化合物ｇによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図１２】吸光スペクトル測定により得られた還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドの検量線を示す。
【図１３】細胞数と吸光度の関係を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の前記一般式（１）の化合物は、各種の反応を工夫し常法によって製造することができる。例えば、次の一般式（２）
【００１６】
【化２】
【００１７】
で示されるフェニルヒドラジン類にアルデヒド化合物をアルコール溶媒中で反応させて、一般式（３）
【００１８】
【化３】
【００１９】
で示されるヒドラゾンを得、次いで対応するジアゾニウム塩を水溶媒中塩基性条件下で反応させて一般式（４）
【００２０】
【化４】
【００２１】
で示されるホルマザンを得る。ここで塩基性化剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが用いられる。
次いで得られた一般式（４）のホルマザンを亜硝酸ブチル又は次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤を用いアルコール溶媒中で酸化し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物を得ることができる。
【００２２】
図１には、以上のようにして合成される本発明のテトラゾリウム化合物の具体例として後記の実施例において用いられているものの化学構造式を示しているが、本発明のテトラゾリウム化合物はこれらに限定されるものではない。図１から明らかなようにそれらの化合物は、一般式（１）においてＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８がスルホン酸基、Ｒ１１、Ｒ１８がメトキシ基（化合物ａ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｂ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｃ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３、Ｒ８がニトロ基、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｄ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｅ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８がスルホアルキルオキシ基、Ｒ１１、Ｒ１８がメトキシ基（化合物ｆ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｇ）に相当するものである。
【００２３】
本発明の水溶性テトラゾリウム化合物から生じるホルマザンは、長波長領域において光吸収し且つそれぞれのテトラゾリウム化合物に特有の極大吸収波長を有している。例えば、既述の化合物ａ〜ｇから生じるホルマザンは、それぞれ、表１に示す極大吸収波長を有する。そして、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物は水溶液中できわめて安定であり、経時的に分解することはない。
【００２４】
【表１】
【００２５】
以下に本発明の特徴をさらに明らかにするため実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１は、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物の合成例を示すものである。実施例２は、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が安定であり経時的な分解を生じないことを示すものである。実施例３は、脱水素酵素反応のモデルとして１−メトキシＰＭＳ／ＮＡＤＨ系において、本発明の水溶性テトラゾリウムから生成するホルマザンの吸光度がＮＡＤＮの濃度に相関し、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が脱水素酵素またはその酵素基質の定量分析に利用できることを示すものである。実施例４は、本発明のテトラゾリウム化合物に由来するホルマザンの吸光度が１−メトキシＰＭＳ／培養細胞系における細胞数に相関しており、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が実際の培養細胞中での脱水素酵素や酵素基質の定量に用いることができることを示すものである。
【実施例１】
【００２６】
（化合物ａの合成）
ｐ−ニトロフェニルヒドラジン１０ｇ（６５．３ｍｍｏｌ）及び４−フォルミル−１，３−ベンゼン−ジスルホン酸２ナトリウム塩一水和物２０．２６ｇ（６５．３ｍｍｏｌ）をメタノール３００ｍｌに懸濁させ、２時間加熱還流した。次いで反応懸濁液を冷却後、反応懸濁液の沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物２５．３ｇを収率８６．９％で得た。
得られたヒドラゾン化合物７．６１ｇ（１７．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン２００ｍｌと水２００ｍｌの混合溶媒に溶解し、３℃に冷却した。そのヒドラゾン水溶液に２，５−ジメトキシ−４−（４−ニトロフェニルアゾ）ベンゼンジアゾニウム塩１／２塩化亜鉛を加えた。この反応溶液を０〜３℃に保持しながら、水酸化ナトリウム２．０８ｇを水４０ｍｌに溶解した水溶液を滴下し、滴下終了後６時間撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、弱酸性にした。次いで溶媒のテトラヒドロフランと水を減圧留去した。得られた粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、ホルマザン１．５ｇを収率１１％で得た。
次いで得られたホルマザン０．４６ｇ（０．６１ｍｍｏｌ）をメタノール２０ｍｌに溶解した。そのホルマザン溶液に塩酸０．５ｍｌ（４．９ｍｍｏｌ）を加えた後、亜硝酸ブチル１ｇ（９．１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。次いで溶媒のメタノールを減圧留去した後、粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物である化合物ａを３０ｍｇ、収率６．７％で得た。
プロトン核磁気共鳴分光法（以下１Ｈ−ＮＭＲと略称する）（重水、３００ＭＨｚ）δ３．６４（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．１８（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、７．８９−８．０５（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１７−８．２７（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７−８．３７（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５８−８．６８（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
赤外分光法（以下ＩＲと略称する）（臭化カリウム錠剤法、以下ＫＢｒと略称する）３４６０、３１００、１６１０、１５２５、１５００、１３４５、１２３０、１１１８ｃｍ−１。
質量分析法（質量スペクトル、以下ＭＳと略称する）ｍ／ｅ＝７３５（Ｍ＋１）。
【００２７】
（化合物ｂの合成）
上記化合物ａと同様な方法で合成し、同定した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール、３００ＭＨｚ）δ７．６３−７．７８（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０１−８．０８（４Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１８−８．２８（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３２−８．３８（２Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４４−８．５４（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３１００、１６２０、１５２０、１４５５、１３５０、１２２０、１０３０、８５０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝６３０（Ｍ＋１）。
【００２８】
（化合物ｃの合成）
上記化合物ａと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール、３００ＭＨｚ）δ７．９８−８．１２（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１４−８．２１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２３−８．３７（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４１−８．５７（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７１−８．７５（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４８０、３１００、１６３８、１５４０、１３５５、１２３０、１１４０、８５５、６１０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝８３４（Ｍ＋１）。
【００２９】
（化合物ｄの合成）
ｐ−ニトロフェニルヒドラジン１４ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）及びｐ−ニトロベンズアルデヒド１３．８ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）をメタノール４００ｍｌに懸濁させ、２時間加熱還流した。次いで反応懸濁液を冷却後、反応懸濁液の沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物２３．６ｇを収率９０．１％で得た。
４−アミノ−１，１’−アゾベンゼン−３，４−ジスルフォン酸ナトリウム塩３１．２ｇを水２００ｍｌに懸濁し、５℃以下に冷却した。その懸濁液に濃塩酸２５．７ｍｌを、次いで水５０ｍｌに溶解した亜硝酸ナトリウム５．６７ｇを加えた後、０〜５℃で１時間撹拌し、ジアゾニウム化合物水溶液を得た。
ヒドラゾン化合物７．６１ｇ（１７．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン３００ｍｌと水５０ｍｌの混合溶媒に溶解し、３℃に冷却した。そのヒドラゾン水溶液に合成したジアゾニウム化合物水溶液を加えた。この反応溶液を０〜３℃に保持しながら、水１６０ｍｌに溶解した水酸化ナトリウム１３．２ｇを滴下し、滴下終了後３時間撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、弱酸性にした。次いで溶媒のテトラヒドロフランと水を減圧留去した。濃縮物をジメチルフォルムアミドとエーテルで再沈殿精製し、ジアゾニウム塩５２ｇを収率９０．６％で得た。
次いで得られたホルマザン３ｇ（４．３ｍｍｏｌ）をメタノール２００ｍｌとジメチルフォルムアミド５０ｍｌの混合溶液に溶解した。そのホルマザン溶液に塩酸９ｍｌ（０．１１ｍｏｌ）を加えた後、次亜塩素酸ナトリウム水溶液２０ｍｌを添加し室温で１時間撹拌した。反応後、その反応溶液の溶媒であるメタノールとジメチルフォルムアミドを減圧留去した後、粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物である化合物ｄを０．８ｇ、収率２７．６％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ８．１２−８．１９（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２０−８．２３（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２３−８．２６（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３５−８．４０（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．６０−８．６８（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７１（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７４（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３５００、３１１０、１６３０、１５５０、１４７５、１３６５、１２４０、１０５０、８７０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝６７５（Ｍ＋１）。
【００３０】
（化合物ｅの合成）
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ７．８３−７．９７（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９７−８．０９（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０９−８．１８（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２０−８．２６（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７−８．３３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３３−８．４１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４３−８．５３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３０８０、１６３０、１５３０、１４１０、１３４０、１２２０、１０３０、８５０、７４５、６１０、５６０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝７３１（Ｍ＋１）。
【００３１】
（化合物ｆの合成）
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ２．２２−２．４８（４Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、３．１０−３．２８（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、３．６６（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．１３（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．２１−４．３０（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、６．６６−６．６８（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、６．８９−６．９３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．４１（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．７０−７．７５（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９１（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１２−８．２２（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４２−８．４８（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５２−８．５８（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４７５、２９５０、１６２０、１５１０、１３５０、１２１０、１０５０、８６０、６１０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝８５１（Ｍ＋１）。
【００３２】
（化合物ｇの合成）
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ７．５３−７．６３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９６−８．０１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０９−８．２６（６Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２８−８．４２（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５２−８．６４（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３１００、１６００、１５３０、１３５０、１２３０、１２００、１０４０、８５０、６１０、５５０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝７０５（Ｍ＋１）。
【実施例２】
【００３３】
化合物ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇを１ｍＭ濃度になるよう、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０）で調製した。溶液は４℃または２５℃で保存し、各化合物について、既述の表１に示すホルマザンの極大吸収波長における吸光度を測定した。図２および図３に化合物ｄの測定結果を示す。他の化合物についても同様の結果が得られ、全ての化合物において３０日間吸光度の変化は見られず、本発明の化合物は水溶液中でホルマザンに分解することがなく安定であることが確認された。
なお、図４には比較のために特許第２９９５８８０号公報（特許文献３）に開示している水溶性テトラゾリウム化合物の緩衝液中の吸光度変化を示しており、経時的な安定性において幾分難点があることが理解される。
【実施例３】
【００３４】
１ｍＭの化合物ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅまたはｆと、５μＭの１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルスルフェート（以下１−メトキシＰＭＳと略称する）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌに、５ｍＭの還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨと略称する）をそれぞれ０、１０、２０、３０、４０及び５０μｌ加え（それぞれのＮＡＤＨ最終濃度は、０、１０、２０、３０、４０及び５０μｍｏｌ／ｌである。）、５分間室温で反応させた後、吸光度を測定した。得られた吸収スペクトルを化合物ごとに図５（化合物ａ）、図６（化合物ｂ）、図７（化合物ｃ）、図８（化合物ｄ）、図９（化合物ｅ）、図１０（化合物ｆ）、図１１（化合物ｇ）に示す。ＮＡＤＨ濃度変化に伴い、化合物ａでは５２７ｎｍ、化合物ｂでは４９３ｎｍ、化合物ｃでは４７２ｎｍ、化合物ｄでは５３０ｎｍ、化合物ｅでは４７４ｎｍ、化合物ｆでは５３０ｎｍ、化合物ｇでは４７３ｎｍの吸光度が上昇し、ホルマザンの生成が確認された。またホルマザンの測定セルへの吸着も認められなかった。
また、図１２に示されるようにＮＡＤＨと吸光度との間には良好な直線性の検量線が得られ、本発明の化合物が脱水素酵素反応の定量分析に使用できることが確認された。
【実施例４】
【００３５】
化合物ｄおよび１−メトキシＰＭＳを１５０ｍＭ食塩水に各々５ｍＭおよび０．２ｍＭ溶解し、試薬溶液を調製した。ヒト子宮頚癌細胞を９６穴マイクロプレートに２５０００細胞／ウェルから倍希釈法により１００ｕｌずつ播種し、細胞培養用インキュベーター中、３７℃、３時間インキュベーションした。試薬溶液１０ｕｌずつ各ウエルに添加し、インキュベーター中、３７℃、１．５時間インキュベーション後、マイクロプレートリーダーで５３０ｎｍの吸光度を測定した。マイクロプレートへのホルマザンの吸着は観測されず、細胞数（酵素または基質の濃度に対応する）と吸光度との間には良好な検量線が得られた（図１３）。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、長期間使用できる安定な試薬を用いる高感度の臨床検査法として、ＬＤＨをはじめとする生体中の各種の脱水素酵素を定量分析することにより疾病の診断や治療にきわめて有意義な知見を得るのに利用され、さらに、培養細胞内または培養細胞から漏出する脱水素酵素を測定することにより、新しい化学物質や薬剤の開発に際してそれらの毒性や効能等を知る手段としても有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テトラゾリウム化合物に関し、特に脱水素酵素または酵素基質を定量分析するのに好適な新規の水溶性テトラゾリウム化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸脱水素酵素（以下ＬＤＨと略称する）、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素などの各種脱水素酵素の定量分析には、従来よりテトラゾリウム化合物（テトラゾリウム塩）が用いられてきた。これは、テトラゾリウム化合物は、これら各種の脱水素酵素の作用により遊離した水素を中間電子運搬体を介して受容してホルマザンとなるので、そのホルマザンの吸光度を測定することにより脱水素酵素またはそれらの酵素基質を定量することができるからである。
【０００３】
特に、これらの脱水素酵素の内、ＬＤＨは全ての体細胞に分布し、特に心筋、肝臓、骨格筋、肝臓に多く、心筋梗塞、悪性腫瘍、肝疾患、進行性筋萎縮、血管内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合には、血清ＬＤＨ活性が著しく上昇することが知られている。従って血中のＬＤＨ活性を測定することにより、臨床上、診断に対する極めて有意義な知見を得ることができる。血中の尿酸や胆汁酸の測定においても、より生体成分の妨害を受けにくい脱水素酵素を用いる方法が望まれている。
【０００４】
また、近年、培養細胞内および細胞から漏出した脱水素酵素活性を指標とすることで、細胞増殖能および細胞毒性度合いを測定することが可能となり、化学物質の毒性や新規治療薬の効果等を簡便に知る目的に汎用されている。
【０００５】
このような目的の水素受容体としては、従来より、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−２Ｈテトラゾリウム塩化物］（以下ニトロＴＢと略称する）、［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］（以下ＭＴＴと略称する）などが一般的に用いられている。
【０００６】
しかしながら、ニトロＴＢおよびＭＴＴが水素を受容して生じるホルマザンは水に溶解せず、使用上不便であった。特に自動分析およびマイクロプレート分析においては、生成したホルマザンがセル、チューブおよびマイクロプレートなどの計測系に付着する難点があり、これらの欠点を除去するために、水溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩を使用することが必要となっていた。特に生体試料を測定する場合、試料中に含有される生体成分の色による干渉を回避するため、長波長の吸収を持つ紫から青色のホルマザンが所望されている。
【０００７】
本出願人の研究グループは、先に、これらの要求を満たす幾つかのテトラゾリウム化合物を案出している〔特許第２５９２４３６号公報（特許文献１）、特許第２８１９２５８号公報（特許文献２）、および特許第２９９５８８０号公報（特許文献３）〕。これらの特許に開示されているテトラゾリウム化合物は、脱水素酵素やその酵素基質を自動分析またはマイクロプレート分析により分析にするに際して実用に供することのできる試薬を構成するものであるが、更なる品質向上も求められている。特に、これまで提案された長波長のホルマザンを生成する水溶性テトラゾリウム化合物は、水溶液中で不安定であるため試薬として長期保存するのに難点を有していた。
【特許文献１】特許第２５９２４３６号公報
【特許文献２】特許第２８１９２５８号公報
【特許文献３】特許第２９９５８８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、水溶性で長波長の光吸収を呈するホルマザンを生成するとともに、水溶液中で長期間安定であり脱水素酵素または酵素基質の定量に好適な水溶性テトラゾリウム化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、溶解性の良好なホルマザンを生じさせ、かつ安定性の高い化合物についてさらに研究を重ねた結果、新規の水溶性テトラゾリウム化合物の合成に成功し、この化合物が優れた水素受容体で、且つこのものから生じるホルマザンが水溶性で、安定であり、分析装置への付着や沈殿を起こさず脱水素酵素やその酵素基質の測定が可能であることを見出した。
【００１０】
かくして、本発明は下記の一般式（１）で表されるテトラゾリウム化合物を提供するものである。
【００１１】
【化１】
【００１２】
式中、Ｒ１〜Ｒ１９は、それぞれ独立に、水素原子、ニトロ基、スルホン酸基、または炭素数１から４のアルキル基、アルコキシ基、スルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、但し、Ｒ１〜Ｒ１９のうち少なくとも２つは、それぞれ独立に、スルホン酸基または炭素数１〜４のスルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムである。
さらに、本発明に従えば、上記のテトラゾリウム化合物を用いることを特徴とする脱水素酵素または酵素基質の定量方法が提供され、本発明の脱水素酵素または酵素基質の定量方法には、培養細胞内または培養細胞から漏出した脱水素酵素活性を測定することも含まれる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の水溶性テトラゾリウム化合物を用いることにより、得られるホルマザンの水溶性がさらに向上し、測定機器への付着が無く、自動分析やマイクロプレート分析装置による脱水素酵素または酵素基質の高感度の定量測定が可能である。さらに、本発明のテトラゾリウムは水溶液中で長期間安定であり、試薬としての保存性においても優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のテトラゾリウム化合物の化学構造式を例示する。
【図２】本発明のテトラゾリウム化合物ｄの緩衝溶液中（５℃）の安定性を示すグラフである。
【図３】本発明のテトラゾリウム化合物ｄの緩衝溶液中（２５℃）の安定性を示すグラフである。
【図４】比較のために、水溶液中で不安定な既存の水溶性テトラゾリウム化合物の緩衝溶液中の安定性を示すグラフである。
【図５】本発明のテトラゾリウム化合物ａによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図６】本発明のテトラゾリウム化合物ｂによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図７】本発明のテトラゾリウム化合物ｃによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図８】本発明のテトラゾリウム化合物ｄによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図９】本発明のテトラゾリウム化合物ｅによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図１０】本発明のテトラゾリウム化合物ｆによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図１１】本発明のテトラゾリウム化合物ｇによる生成ホルマザンの吸光スペクトルを示す。
【図１２】吸光スペクトル測定により得られた還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドの検量線を示す。
【図１３】細胞数と吸光度の関係を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の前記一般式（１）の化合物は、各種の反応を工夫し常法によって製造することができる。例えば、次の一般式（２）
【００１６】
【化２】
【００１７】
で示されるフェニルヒドラジン類にアルデヒド化合物をアルコール溶媒中で反応させて、一般式（３）
【００１８】
【化３】
【００１９】
で示されるヒドラゾンを得、次いで対応するジアゾニウム塩を水溶媒中塩基性条件下で反応させて一般式（４）
【００２０】
【化４】
【００２１】
で示されるホルマザンを得る。ここで塩基性化剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが用いられる。
次いで得られた一般式（４）のホルマザンを亜硝酸ブチル又は次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤を用いアルコール溶媒中で酸化し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物を得ることができる。
【００２２】
図１には、以上のようにして合成される本発明のテトラゾリウム化合物の具体例として後記の実施例において用いられているものの化学構造式を示しているが、本発明のテトラゾリウム化合物はこれらに限定されるものではない。図１から明らかなようにそれらの化合物は、一般式（１）においてＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８がスルホン酸基、Ｒ１１、Ｒ１８がメトキシ基（化合物ａ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｂ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｃ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３、Ｒ８がニトロ基、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｄ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｅ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８がスルホアルキルオキシ基、Ｒ１１、Ｒ１８がメトキシ基（化合物ｆ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｇ）に相当するものである。
【００２３】
本発明の水溶性テトラゾリウム化合物から生じるホルマザンは、長波長領域において光吸収し且つそれぞれのテトラゾリウム化合物に特有の極大吸収波長を有している。例えば、既述の化合物ａ〜ｇから生じるホルマザンは、それぞれ、表１に示す極大吸収波長を有する。そして、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物は水溶液中できわめて安定であり、経時的に分解することはない。
【００２４】
【表１】
【００２５】
以下に本発明の特徴をさらに明らかにするため実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１は、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物の合成例を示すものである。実施例２は、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が安定であり経時的な分解を生じないことを示すものである。実施例３は、脱水素酵素反応のモデルとして１−メトキシＰＭＳ／ＮＡＤＨ系において、本発明の水溶性テトラゾリウムから生成するホルマザンの吸光度がＮＡＤＮの濃度に相関し、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が脱水素酵素またはその酵素基質の定量分析に利用できることを示すものである。実施例４は、本発明のテトラゾリウム化合物に由来するホルマザンの吸光度が１−メトキシＰＭＳ／培養細胞系における細胞数に相関しており、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が実際の培養細胞中での脱水素酵素や酵素基質の定量に用いることができることを示すものである。
【実施例１】
【００２６】
（化合物ａの合成）
ｐ−ニトロフェニルヒドラジン１０ｇ（６５．３ｍｍｏｌ）及び４−フォルミル−１，３−ベンゼン−ジスルホン酸２ナトリウム塩一水和物２０．２６ｇ（６５．３ｍｍｏｌ）をメタノール３００ｍｌに懸濁させ、２時間加熱還流した。次いで反応懸濁液を冷却後、反応懸濁液の沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物２５．３ｇを収率８６．９％で得た。
得られたヒドラゾン化合物７．６１ｇ（１７．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン２００ｍｌと水２００ｍｌの混合溶媒に溶解し、３℃に冷却した。そのヒドラゾン水溶液に２，５−ジメトキシ−４−（４−ニトロフェニルアゾ）ベンゼンジアゾニウム塩１／２塩化亜鉛を加えた。この反応溶液を０〜３℃に保持しながら、水酸化ナトリウム２．０８ｇを水４０ｍｌに溶解した水溶液を滴下し、滴下終了後６時間撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、弱酸性にした。次いで溶媒のテトラヒドロフランと水を減圧留去した。得られた粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、ホルマザン１．５ｇを収率１１％で得た。
次いで得られたホルマザン０．４６ｇ（０．６１ｍｍｏｌ）をメタノール２０ｍｌに溶解した。そのホルマザン溶液に塩酸０．５ｍｌ（４．９ｍｍｏｌ）を加えた後、亜硝酸ブチル１ｇ（９．１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。次いで溶媒のメタノールを減圧留去した後、粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物である化合物ａを３０ｍｇ、収率６．７％で得た。
プロトン核磁気共鳴分光法（以下１Ｈ−ＮＭＲと略称する）（重水、３００ＭＨｚ）δ３．６４（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．１８（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、７．８９−８．０５（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１７−８．２７（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７−８．３７（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５８−８．６８（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
赤外分光法（以下ＩＲと略称する）（臭化カリウム錠剤法、以下ＫＢｒと略称する）３４６０、３１００、１６１０、１５２５、１５００、１３４５、１２３０、１１１８ｃｍ−１。
質量分析法（質量スペクトル、以下ＭＳと略称する）ｍ／ｅ＝７３５（Ｍ＋１）。
【００２７】
（化合物ｂの合成）
上記化合物ａと同様な方法で合成し、同定した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール、３００ＭＨｚ）δ７．６３−７．７８（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０１−８．０８（４Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１８−８．２８（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３２−８．３８（２Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４４−８．５４（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３１００、１６２０、１５２０、１４５５、１３５０、１２２０、１０３０、８５０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝６３０（Ｍ＋１）。
【００２８】
（化合物ｃの合成）
上記化合物ａと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール、３００ＭＨｚ）δ７．９８−８．１２（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１４−８．２１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２３−８．３７（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４１−８．５７（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７１−８．７５（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４８０、３１００、１６３８、１５４０、１３５５、１２３０、１１４０、８５５、６１０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝８３４（Ｍ＋１）。
【００２９】
（化合物ｄの合成）
ｐ−ニトロフェニルヒドラジン１４ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）及びｐ−ニトロベンズアルデヒド１３．８ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）をメタノール４００ｍｌに懸濁させ、２時間加熱還流した。次いで反応懸濁液を冷却後、反応懸濁液の沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物２３．６ｇを収率９０．１％で得た。
４−アミノ−１，１’−アゾベンゼン−３，４−ジスルフォン酸ナトリウム塩３１．２ｇを水２００ｍｌに懸濁し、５℃以下に冷却した。その懸濁液に濃塩酸２５．７ｍｌを、次いで水５０ｍｌに溶解した亜硝酸ナトリウム５．６７ｇを加えた後、０〜５℃で１時間撹拌し、ジアゾニウム化合物水溶液を得た。
ヒドラゾン化合物７．６１ｇ（１７．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン３００ｍｌと水５０ｍｌの混合溶媒に溶解し、３℃に冷却した。そのヒドラゾン水溶液に合成したジアゾニウム化合物水溶液を加えた。この反応溶液を０〜３℃に保持しながら、水１６０ｍｌに溶解した水酸化ナトリウム１３．２ｇを滴下し、滴下終了後３時間撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、弱酸性にした。次いで溶媒のテトラヒドロフランと水を減圧留去した。濃縮物をジメチルフォルムアミドとエーテルで再沈殿精製し、ジアゾニウム塩５２ｇを収率９０．６％で得た。
次いで得られたホルマザン３ｇ（４．３ｍｍｏｌ）をメタノール２００ｍｌとジメチルフォルムアミド５０ｍｌの混合溶液に溶解した。そのホルマザン溶液に塩酸９ｍｌ（０．１１ｍｏｌ）を加えた後、次亜塩素酸ナトリウム水溶液２０ｍｌを添加し室温で１時間撹拌した。反応後、その反応溶液の溶媒であるメタノールとジメチルフォルムアミドを減圧留去した後、粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物である化合物ｄを０．８ｇ、収率２７．６％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ８．１２−８．１９（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２０−８．２３（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２３−８．２６（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３５−８．４０（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．６０−８．６８（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７１（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７４（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３５００、３１１０、１６３０、１５５０、１４７５、１３６５、１２４０、１０５０、８７０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝６７５（Ｍ＋１）。
【００３０】
（化合物ｅの合成）
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ７．８３−７．９７（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９７−８．０９（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０９−８．１８（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２０−８．２６（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７−８．３３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３３−８．４１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４３−８．５３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３０８０、１６３０、１５３０、１４１０、１３４０、１２２０、１０３０、８５０、７４５、６１０、５６０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝７３１（Ｍ＋１）。
【００３１】
（化合物ｆの合成）
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ２．２２−２．４８（４Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、３．１０−３．２８（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、３．６６（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．１３（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．２１−４．３０（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、６．６６−６．６８（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、６．８９−６．９３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．４１（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．７０−７．７５（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９１（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１２−８．２２（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４２−８．４８（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５２−８．５８（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４７５、２９５０、１６２０、１５１０、１３５０、１２１０、１０５０、８６０、６１０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝８５１（Ｍ＋１）。
【００３２】
（化合物ｇの合成）
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ７．５３−７．６３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９６−８．０１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０９−８．２６（６Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２８−８．４２（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５２−８．６４（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３１００、１６００、１５３０、１３５０、１２３０、１２００、１０４０、８５０、６１０、５５０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝７０５（Ｍ＋１）。
【実施例２】
【００３３】
化合物ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇを１ｍＭ濃度になるよう、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０）で調製した。溶液は４℃または２５℃で保存し、各化合物について、既述の表１に示すホルマザンの極大吸収波長における吸光度を測定した。図２および図３に化合物ｄの測定結果を示す。他の化合物についても同様の結果が得られ、全ての化合物において３０日間吸光度の変化は見られず、本発明の化合物は水溶液中でホルマザンに分解することがなく安定であることが確認された。
なお、図４には比較のために特許第２９９５８８０号公報（特許文献３）に開示している水溶性テトラゾリウム化合物の緩衝液中の吸光度変化を示しており、経時的な安定性において幾分難点があることが理解される。
【実施例３】
【００３４】
１ｍＭの化合物ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅまたはｆと、５μＭの１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルスルフェート（以下１−メトキシＰＭＳと略称する）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌに、５ｍＭの還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨと略称する）をそれぞれ０、１０、２０、３０、４０及び５０μｌ加え（それぞれのＮＡＤＨ最終濃度は、０、１０、２０、３０、４０及び５０μｍｏｌ／ｌである。）、５分間室温で反応させた後、吸光度を測定した。得られた吸収スペクトルを化合物ごとに図５（化合物ａ）、図６（化合物ｂ）、図７（化合物ｃ）、図８（化合物ｄ）、図９（化合物ｅ）、図１０（化合物ｆ）、図１１（化合物ｇ）に示す。ＮＡＤＨ濃度変化に伴い、化合物ａでは５２７ｎｍ、化合物ｂでは４９３ｎｍ、化合物ｃでは４７２ｎｍ、化合物ｄでは５３０ｎｍ、化合物ｅでは４７４ｎｍ、化合物ｆでは５３０ｎｍ、化合物ｇでは４７３ｎｍの吸光度が上昇し、ホルマザンの生成が確認された。またホルマザンの測定セルへの吸着も認められなかった。
また、図１２に示されるようにＮＡＤＨと吸光度との間には良好な直線性の検量線が得られ、本発明の化合物が脱水素酵素反応の定量分析に使用できることが確認された。
【実施例４】
【００３５】
化合物ｄおよび１−メトキシＰＭＳを１５０ｍＭ食塩水に各々５ｍＭおよび０．２ｍＭ溶解し、試薬溶液を調製した。ヒト子宮頚癌細胞を９６穴マイクロプレートに２５０００細胞／ウェルから倍希釈法により１００ｕｌずつ播種し、細胞培養用インキュベーター中、３７℃、３時間インキュベーションした。試薬溶液１０ｕｌずつ各ウエルに添加し、インキュベーター中、３７℃、１．５時間インキュベーション後、マイクロプレートリーダーで５３０ｎｍの吸光度を測定した。マイクロプレートへのホルマザンの吸着は観測されず、細胞数（酵素または基質の濃度に対応する）と吸光度との間には良好な検量線が得られた（図１３）。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、長期間使用できる安定な試薬を用いる高感度の臨床検査法として、ＬＤＨをはじめとする生体中の各種の脱水素酵素を定量分析することにより疾病の診断や治療にきわめて有意義な知見を得るのに利用され、さらに、培養細胞内または培養細胞から漏出する脱水素酵素を測定することにより、新しい化学物質や薬剤の開発に際してそれらの毒性や効能等を知る手段としても有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）で表されることを特徴とする水溶性テトラゾリウム化合物。
【化１】
（式中、Ｒ１〜Ｒ１９は、それぞれ独立に、水素原子、ニトロ基、スルホン酸基、または炭素数１から４のアルキル基、アルコキシ基、スルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、但し、Ｒ１〜Ｒ１９のうち少なくとも２つは、それぞれ独立に、スルホン酸基または炭素数１〜４のスルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムである。）
【請求項２】
請求項１のテトラゾリウム化合物を用いることを特徴とする脱水素酵素または酵素基質の定量方法。
【請求項３】
培養細胞内の脱水素酵素活性を測定することを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
培養細胞から漏出した脱水酵素活性を測定することを特徴とする請求項２の方法。
【請求項１】
下記の一般式（１）で表されることを特徴とする水溶性テトラゾリウム化合物。
【化１】
（式中、Ｒ１〜Ｒ１９は、それぞれ独立に、水素原子、ニトロ基、スルホン酸基、または炭素数１から４のアルキル基、アルコキシ基、スルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、但し、Ｒ１〜Ｒ１９のうち少なくとも２つは、それぞれ独立に、スルホン酸基または炭素数１〜４のスルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムである。）
【請求項２】
請求項１のテトラゾリウム化合物を用いることを特徴とする脱水素酵素または酵素基質の定量方法。
【請求項３】
培養細胞内の脱水素酵素活性を測定することを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
培養細胞から漏出した脱水酵素活性を測定することを特徴とする請求項２の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
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【図４】
【図５】
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【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２３７８６
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【発行日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３６０３（Ｐ２００５−５１３６０３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００９９５３
【国際出願日】平成１６年７月１３日（２００４．７．１３）
【出願人】（５９０００５０８１）株式会社同仁化学研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【発行日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００９９５３
【国際出願日】平成１６年７月１３日（２００４．７．１３）
【出願人】（５９０００５０８１）株式会社同仁化学研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
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