没食子酸の製造法
【課題】新規な没食子酸の製造方法を提供する。
【解決手段】以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の蛋白質を発現する微生物を用いてプロトカテク酸から没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする没食子酸の製造方法。
（Ａ）配列番号１６、２６、３０、３２または３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（Ｂ）配列番号１６、２６、３２または３４で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性を有する蛋白質（配列番号３０については３８５位のフェニルアラニンが置換または欠失した配列を含まない）
【解決手段】以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の蛋白質を発現する微生物を用いてプロトカテク酸から没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする没食子酸の製造方法。
（Ａ）配列番号１６、２６、３０、３２または３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（Ｂ）配列番号１６、２６、３２または３４で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性を有する蛋白質（配列番号３０については３８５位のフェニルアラニンが置換または欠失した配列を含まない）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗酸化剤や写真の現像剤として有用な没食子酸を、プロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性（以下、プロトカテク酸５位酸化活性という）を有する蛋白質を発現する微生物を用いて工業的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
没食子酸は、そのアルカリ性水溶液は還元力が強く、還元剤、写真の現像剤に使われる。また、タンニン合成の原料になり、青インクの製造に使われ、さらに、没食子酸プロピル、没食子酸イソアミルなどのエステルとして油脂・バターの酸化防止剤にも使用される。
【０００３】
酵素を用いた没食子酸の製造法に関しては、野生型酵素を用いた没食子酸の生産については報告例がないが、シュードモナス・エルギノーサＰＡＯ株が保有する野生型パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の３８５位のチロシンをフェニールアラニンに変換した変異酵素（以下、ＰＡＯ変異酵素と略記する）を用いることにより、試験管内でパラヒドロキシ安息香酸を出発物質としてプロトカテク酸を経由して没食子酸を生成できることが報告されている〔非特許文献１〕。ただし、ＰＡＯ変異酵素のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の比活性が、野生型酵素と比べて約５０分の１に減少し、没食子酸を合成するプロトカテク酸５位酸化活性も低いことが報告されている。また微生物を用いた没食子酸の製造法に関しては、大腸菌によりグルコースを原料にし、上記ＰＡＯ変異酵素を用いて没食子酸を生産する例が報告されている〔特許文献１、および非特許文献２〕。しかしながら、この例では、原料の一部しか没食子酸に転換しないこと、発酵時間が長いこと、前駆体3-デヒドロキシシキミ酸が大量に蓄積して没食子酸の生産量が頭打ちになっていることなどの理由から、製造コスト面で問題がある。原料として、グルコースでなく、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸およびパラヒドロキシ安息香酸などの芳香族カルボン酸を用いた場合、酵素変換によりモル数あたり100％近い没食子酸生産も期待できるが、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸およびパラヒドロキシ安息香酸を原料として微生物を培養して没食子酸を生産できることは報告されていない。
【０００４】
植物ヌルデの五倍子からの抽出法を用いて没食子酸を製造した場合、製造コストが高いことから、これら化合物を工業的に有利に製造する方法が求められている。フタル酸類（フタル酸、テレフタル酸およびイソフタル酸）は安価な原料である上、テレフタル酸はペットボトルからも再生できることから、安価な原料となる。またバイオマス利用が盛んになっているが、植物を利用してパラヒドロキシ安息香酸を大量生産することも可能となっているので、パラヒドロキシ安息香酸も安価な原料となる。このような背景から、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸などの安価な原料から没食子酸を効率よく生産する方法が所望されている。ＰＡＯ変異酵素はプロトカテク酸５位酸化活性が低いことから、没食子酸を効率よく生産するためにプロトカテク酸５位酸化活性の向上が所望されている。
【特許文献１】米国特許番号6,472,190
【非特許文献１】Entsch, B, Palfey, B.A., Ballou, D. P. と Masey, V. J. Biol. Chem. 266, 17341-17349 (1991)
【非特許文献２】Spiros Kambourakis, K.M. Draths, and J. W. Frost. J.Am.Chem.Soc. 122, 9042-9043 (2000年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸
などの安価な原料からプロトカテク酸を生産し、プロトカテク酸５位酸化活性を持つ蛋白質（以下、プロトカテク酸５位酸化酵素という）によりプロトカテク酸を没食子酸に変換することにより没食子酸を安価に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ＰＡＯ変異酵素のアミノ酸配列と相同性を有する野生型蛋白質の酵素活性を調べたところ、ＰＡＯ変異酵素のアミノ酸配列に対して４０．１％以上かつ７５．０％未満の相同性を有する、配列番号６,１０,１４,１６，１８，２０，２２，２４，２６および２８で表されるアミノ酸配列を有する野生型蛋白質について強いプロトカテク酸５位酸化活性を有することを見出した。続いて、相互に３９．１〜５８．９％の相同性を有する配列番号１６、２６、３０、３２および３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質のプロトカテク酸５位酸化活性を測定し、ＰＡＯ変異酵素の活性と比較したところ、野生型蛋白質でもＰＡＯ変異酵素よりもプロトカテク酸５位酸化活性の比活性が２倍以上高いことを見出した。
【０００７】
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ断片を含む組換えベクターを構築した後、該組換えベクターで形質転換した大腸菌を調製したところ、パラヒドロキシ安息香酸を原料として没食子酸を効率よく生産させることに成功した。
【０００８】
次に、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡをロドコッカス属RHA1株よりクローニングして、組換えベクターを構築した。該組換えベクター、および配列番号１６または３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を発現するベクターを用いて大腸菌を形質転換することにより、テレフタル酸代謝能を獲得した形質転換体を調製した。続いて該形質転換体を利用してテレフタル酸を原料として没食子酸を効率よく生産させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１５）に関する。
【００１０】
（１）以下の（Ａ）または〜（Ｂ）に記載の蛋白質を発現する微生物を用いてプロトカテク酸から没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする没食子酸の製造方法。
（Ａ）配列番号１６、２６、３０、３２または３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（Ｂ）配列番号１６、２６、３０、３２または３４で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性を有する蛋白質（配列番号３０については３８５位のフェニルアラニンが置換または欠失した配列を含まない）。
【００１１】
（２）微生物の培養物または該培養物の処理物およびプロトカテク酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする前記（１）の没食子酸の製造法。
【００１２】
（３）前記微生物がテレフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をテレフタル酸を含有する培地中でテレフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする前記（１）の没食子酸の製造方法。
【００１３】
（４）前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびテレフタル酸を水性媒体中に存
在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする前記（３）の没食子酸の製造法。
【００１４】
（５）前記微生物がフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をフタル酸を含有する培地中でフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする前記（１）の没食子酸の製造方法。
【００１５】
（６）前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする前記（５）の没食子酸の製造法。
【００１６】
（７）前記微生物がイソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をイソフタル酸を含有する培地中でイソフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする前記（１）の没食子酸の製造方法。
【００１７】
（８）前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびイソフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする前記（７）の没食子酸の製造法。
【００１８】
（９）前記微生物がパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をパラヒドロキシ安息香酸を含有する培地中でパラヒドロキシ安息香酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする前記（１）の没食子酸の製造方法。
【００１９】
（１０）前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびパラヒドロキシ安息香酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする前記（９）の没食子酸の製造法。
【００２０】
（１１）テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、前記（３）または（４）記載の没食子酸の製造方法。
【００２１】
（１２）フタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、前記（５）または（６）記載の没食子酸の製造方法。
【００２２】
（１３）イソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、イソフタル酸1,2-ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼおよびイソフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、前記（７）または（８）記載の没食子酸の製造方法。
【００２３】
（１４）前記微生物が、前記（Ａ）または（Ｂ）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡが導入された微生物である、前記（１）から（１３）のいずれか１項に記載の没食子酸の製造法。
【００２４】
（１５）微生物がエシェリヒア（Escherichia）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物であることを特徴とする、前記（１）から（１４）のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、プロトカテク酸５位酸化活性が優れた酵素蛋白質を用いて、プロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を原料として没食子酸を安価に製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２７】
本発明で用いられるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質としては、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＰＡＯ変異酵素よりもプロトカテク酸５位酸化酵素の比活性が２倍以上優れている蛋白質があげられる。例えば、配列番号１６、２６、３０、３２または３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。ここで、配列番号１６はシュードモナス・プチダKT2440由来の野生型プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列である。配列番号２６はノボスフィンゴビウム・アロマティカボランスDSM 12444由来の野生型プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列である。また、配列番号１６においては、ＰＡＯ変異酵素の変異点に対応する３８６位のTyrがPheに置換されてもよく、配列番号１６においてY386Fの変異が導入されたアミノ酸配列を配列番号３２に示す。また、配列番号２６においては、ＰＡＯ変異酵素の変異点に対応する３８４位のTyrがPheに置換されてもよく、配列番号２６においてY384Fの変異が導入されたアミノ酸配列を配列番号３４に示す。配列番号３０はコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032由来の野生型プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列において、ＰＡＯ変異酵素の変異点に対応する３８５位のTyrがPheに置換された配列である。
本発明で用いられるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質としてはまた、配列番号１６、２６、３０、３２または３４のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する蛋白質をあげることができる。ただし、配列番号３０のアミノ酸配列においては、385位のフェニルアラニンは保存されている必要があるので、385位のフェニルアラニンが欠失または置換した配列は含まない。
好ましくは、配列番号１６、２６、３０、３２および３４で表される蛋白質が配列番号４で表されるＰＡＯ変異酵素よりも酵素活性が優れている原因は、配列番号４のアミノ酸配列と配列番号１６、２６、３０、３２および３４のいずれかのアミノ酸配列の間の違いから由来しているので、これらアミノ酸配列の違いに基づいて配列番号１６、２６、３０、３２または３４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する蛋白質をあげることができる（配列番号３０については３８５位のフェニルアラニンが置換または欠失した配列を含まない）。また、該蛋白質として、配列番号１６、２６、３０、３２および３４のいずれかのアミノ酸配列と７５％以上の相同性、好ましくは９０％以上特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する蛋白質（配列番号３０については３８５位のフェニルアラニンが置換または欠失した配列を含まない）をあげることができる。さらに、相互に３７．８〜５８．９％の相同性を有する配列番号１６、２６、３０、３２および３４で表される蛋白質が配列
番号４で表されるＰＡＯ変異酵素よりもプロトカテク酸５位酸化酵素の比活性が２倍以上優れていることを本発明で見出したので、配列番号１６、２６、３０、３２および３４で表される蛋白質のいずれかの蛋白質との相同性が７５．０％以下であっても、３７．８％以上であれば、ＰＡＯ変異酵素よりもプロトカテク酸５位酸化酵素活性が２倍以上優れている酵素が容易に見出すことができる。したがって、本発明に関わるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質としては、配列番号１６、２６、３０、３２および３４で表されるアミノ酸配列と３７．８〜７５．０％の相同性を有し、配列番号４とは異なるアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性を有する蛋白質であってもよい。
【００２８】
上記の１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Res., 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Res., 13, 4431 (1985)、Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１６、２６、３０、３２および３４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換または付加される１または数個というアミノ酸の数はプロトカテク酸５位酸化酵素活性が維持される限り特に限定されないが、配列番号４のアミノ酸配列と配列番号１６、２６、３０、３２および３４のいずれかのアミノ酸配列の間の違いの個数以内であることが望ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００２９】
本発明で用いられる微生物は、上記のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現する微生物である。例えば、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物などの微生物株から上記の特性を有するものを天然から単離することにより得られる。または、このような特性を有する微生物をアメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション（以下、必要に応じてＡＴＣＣと略記する）、独立行政法人製品基盤技術基盤機構・生物遺伝資源部門（以下、必要に応じてＮＢＲＣと略記する）、または独立行政法人 理化学研究所 筑波研究所 バイオリソースセンターなどから入手することができる。
【００３０】
具体的には、アシネトバクター（Acinetobacter）属の微生物としては、例えばアシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）ADP1等をあげることができる。ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属の微生物としては、例えばブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）USDA110等をあげることができる。コリネバクテリウム（Corynebacterium）属の微生物としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032等をあげることができる。シュードモナス（Pseudomonas）属の微生物としては、例えばシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KT2440等をあげることができる。ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の微生物としては、例えばロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）CGA009等をあげることができる。シノリゾビウム（Sinorhizobium）属の微生物としては、例えばシノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）1021等をあげることができる。ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属の微生物としては、例えばブレビバクテリウム・リネンズ（Brevibacterium linens）BL2等をあげることが
できる。ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属の微生物としては、例えばノボスフィンゴビウム・アロマティカボランス（Novosphingobium aromaticivorans）DSM 12444等をあげることができる。ラルストニア（Ralstonia）属の微生物としては、例えばラルストニア・メタリデュランス（Ralstonia metallidurans）CH34等をあげることができる。ただし、本発明に使用できる菌株は本菌株に限定されるものではなく、その目的を達成できる菌株であればすべて使用できる。
【００３１】
本発明で用いられる微生物は、上記のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物であってもよい。本発明に使用できるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を生産する形質転換体は、例えば該ＤＮＡをモレキュラー・クローニング第２版に記載の方法に従って、上記の微生物から該蛋白質をコードするＤＮＡをクローニングし、ベクターＤＮＡと連結することで組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換することにより取得することができる。以下に、ＤＮＡのクローニングと形質転換株の作製方法について詳しく述べる。
【００３２】
上記のアシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物を公知の方法により培養する。培養後、公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。この染色体ＤＮＡから合成ＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼイション法またはＰＣＲ法などによりプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡを含む断片を取得することができる。なお、該合成ＤＮＡは、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属の細菌由来のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子（以下、プロトカテク酸５位酸化酵素遺伝子と呼ぶ）、好ましくはアシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）、ノボスフィンゴビウム・アロマティカボランス（Novosphingobium aromaticivorans）、ラルストニア・メタリデュランス（Ralstonia metallidurans）、またはブレビバクテリウム・リネンズ（Brevibacterium linens）由来のプロトカテク酸５位酸化酵素遺伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。具体的には、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）ADP1、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）USDA110、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KT2440、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）CGA009、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）1021、ブレビバクテリウム・リネンズ（Brevibacterium linens）BL2、ノボスフィンゴビウム・アロマティカボランス（Novosphingobium aromaticivorans）DSM 12444またはラルストニア・メタリデュランス（Ralstonia metallidurans）CH34のプロトカテク酸５位酸化酵素遺伝子の塩基配列、すなわち配列番号５、９、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７で表される塩基配列に基づいて設計することができる。
【００３３】
上記のプロトカテク酸５位酸化酵素遺伝子のＤＮＡを連結するベクターとしては、エシェリヒア・コリＫ１２株などにおいて自立複製可能なベクターであればプラスミドベクター、ファージベクター等いずれも使用可能であるが、具体的には、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔ストラタジーン社製、Nucleic Acids Res., 17, 9494 (1989)〕、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。
【００３４】
該ベクターに上記で取得したＤＮＡを連結して得られる組換え体ＤＮＡの宿主に用いるエシェリヒア・コリは、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができるが、具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue MRF'〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、エシェリヒア・コリC600〔Genetics, 39, 440 (1954)〕、エシェリヒア・コリY1088〔Science, 222,778 (1983)〕、エシェリヒア・コリY1090〔Science, 222, 778 (1983)〕、エシェリヒア・コリNM522〔J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)〕、エシェリヒア・コリK802〔J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)〕、エシェリヒア・コリJM105〔Gene, 38, 275 (1985)〕、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリBL21等をあげることができる。
【００３５】
ロドコッカス（Rhodococcus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物の中に、プロトカテク酸５位酸化酵素遺伝子を導入するときは、これら微生物の中で自立複製可能なベクターを用いる。好ましくは、該微生物のいずれかとエシェリヒア・コリＫ１２株の両方の微生物の中で自立複製可能なシャトル・ベクターを用いて、組換え体ＤＮＡを宿主となる該微生物に導入することができる。
【００３６】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕等をあげることができる。
【００３７】
上記のようにして得られた形質転換体から組換え体ＤＮＡを抽出し、該組換えＤＮＡに含まれる本発明のＤＮＡの塩基配列を決定することができる。塩基配列の決定には、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕または3730xl型ＤＮＡアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いることができる。
【００３８】
また、上記において決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することによっても目的とするＤＮＡを調製することもできる。
【００３９】
上記のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現する形質転換体は、下記の方法を用いて上記のＤＮＡを宿主細胞中で発現させることによって得られる。
【００４０】
上記のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡを用いる際には、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製することができる。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることもできる。本
発明のＤＮＡを発現する形質転換体は、上記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより取得することができる。
【００４１】
プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現させる宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
好ましくは、テレフタル酸、フタル酸またはイソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能（テレフタル酸、フタル酸またはイソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物を用いることができる。より好ましくは、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能を有するエシェリヒア属（Escherichia）、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、コマモナス（Comamonas）属、バチルス属（Bacillus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphigobium）属またはバークホルデリア（Burkholderia）属の細菌をあげることができる。さらに好ましくは、テレフタル酸の代謝能を有するロドコッカス属細菌RHA１とコマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）E6をあげることができる。このような微生物にプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現させることにより、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を経て没食子酸を製造することができる。すなわち、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能を有し、かつ、プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現する微生物を、それぞれ、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を含有する培地中でこれらの化合物と反応させることにより、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸から生成したプロトカテク酸から没食子酸を得ることができる。
なお、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成するプロセスは別の微生物を用いて行ってもよい。すなわち、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能を有する微生物によってテレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸から生成したプロトカテク酸を、プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現する微生物と反応させて没食子酸を得る方法も本発明の没食子酸の製造方法に含まれる。
【００４２】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００４３】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４４】
プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質、または、該蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質をコードするＤＮＡを大腸菌などの微生物に導入し、発現するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。より具体的には、ベクターとしては、例えば、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア
・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(+)（ストラタジーン社製）、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。
【００４５】
プロモーターとしては、大腸菌（エシェリヒア・コリ）等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター等の、T7プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、及びtacプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４６】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば５〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００４７】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972) 〕、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕、接合伝達法〔J. G. C. Ottow, Ann. Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (1975)〕、細胞融合法〔M.H. Gabor, J. Bacteriol., Vol.137, p.1346 (1979)〕等をあげることができる。
【００４８】
本発明で用いられるテレフタル酸、フタル酸またはイソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能（テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物は、自然界からのサンプルをもとに、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を炭素源とする集積培養法を用いて取得することができる。好ましくは、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能を有するシュードモナス属、ロドコッカス属、コマモナス属、バチルス属、マイコバクテリウム属、ノボスフィンゴビウム属またはバークホルデリア属の細菌をあげることができる。より好ましくは、プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現しているロドコッカス属RHA１をあげることができる。
なお、後述の実施例に示されるように、プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現する微生物はパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力も有しているため、プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現させた微生物をパラヒドロキシ安息香酸を含む培地で培養することにより、パラヒドロキシ安息香酸から没食子酸を製造することができる。
【００４９】
本発明で用いられるテレフタル酸の代謝能（テレフタルからプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物は、テレフタル酸からプロトカテク酸への代謝に関わるテレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、およびテレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質を生産する能力を有する微生物を挙げることができる。
本発明で用いられるフタル酸の代謝能（フタル酸からプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物は、フタル酸ジオキシゲナーゼ、フタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、フタレート4,5-シス-ジヒドロキシジオール・ジヒドロゲナーゼ、4,5-ジヒドロキシフタレート脱炭酸酵素およびフタル酸トランスポーターの蛋白質を生産する能力を有する微生物を挙げることができる。
また本発明で用いられるイソフタル酸の代謝能（イソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物は、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ、イソフタル酸ジオキシゲ
ナーゼ・レダクターゼ、イソフタル酸1,2-ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼおよびイソフタル酸トランスポーターの蛋白質を生産する能力を有する微生物を挙げることができる。これらの蛋白質を生産する能力を有する微生物は、これらの蛋白質をコードするＤＮＡを組換えＤＮＡ技術法を用いて単離した後、上記のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現する形質転換体を取得する方法と同じ方法用いて取得することもできる。
【００５０】
以上のようにして得られる本発明の微生物を、好ましくは１ｍＭ〜１Ｍのプロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を含有する培地で培養し、培養物中に没食子酸を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、没食子酸を製造することができる。本発明の微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００５１】
本発明の微生物の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、果糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独または混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。没食子酸を生産するための原料としては、プロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を添加する。
【００５２】
培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、本発明の微生物が生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても本発明の微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。
【００５３】
本発明の微生物を培養した後、プロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸もしくはパラヒドロキシ安息香酸のいずれかを含む水性媒体中に、該微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を加えることにより、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することもできる。
【００５４】
該培養物の処理物として、本発明の微生物を担体に固定化したものを用いてもよい。その場合には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。また、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出して得られるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を含有する抽出物、該抽出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処理を行って得られるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質の部分精製成分等を担体に固定化したものも、本発明の没食子酸の製造に使用することができる。
【００５５】
これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、またはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる方法により行うことができる。
【００５６】
反応に用いる水性媒体は、プロトカテク酸を含有する水溶液または適当な緩衝液、例えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）とすることができる。この水性媒体には、さらに菌体の細胞膜の物質透過性を高める必要のあるときには、トルエン、キシレン、非イオン性界面活性剤等を０．０５〜２．０％（ｗ／ｖ）添加することもできる
。
【００５７】
水性媒体中の反応原料となるプロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の濃度は、０．１ｍＭ〜１Ｍ程度が適当である。上記の水性媒体における酵素反応温度およびｐＨは特に限定されないが、通常１０〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃が適当であり、反応液中のｐＨは５〜１０、好ましくは６〜９付近とすることができる。また、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。発明で使用する酵素は、菌体抽出液をそのまま又はそれから遠心分離、濾過等で集め、これを水又は緩衝液に懸濁して得ることができる。このようにして得られた酵素をプロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸と水の存在下、反応させるが、反応液中のプロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の濃度は酵素の活性を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利である。反応は静置、攪拌、振盪のいずれの方法で行ってもよい。また、酵素を適当な支持体に固定化してカラムに充填し、プロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を含む溶液を流す方法も利用できる。反応は、通常１０〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃、ｐＨ５〜９、好ましくはｐ６〜８で行う。
【００５８】
なお、上記水性媒体には、反応時に酸化剤を添加すると、没食子酸の生成収率が一層向上する場合がある。酸化剤としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の硝酸塩、塩化第二鉄等の金属塩、ハロゲン、ペルオクソ酸等が挙げられ、好ましくは、亜硝酸ナトリウム、塩化第二鉄が挙げられる。添加濃度は、酸化剤の種類によって異なるが、没食子酸の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常０．００１〜０．０５％（Ｗ/Ｖ)、好ましくは０．００５〜０．０２％である。
【００５９】
培養終了後の培養液または反応液中からの没食子酸は、酢酸エチル等の有機溶剤によって抽出することにより単離・精製することができる。また、必要に応じて遠心分離等により該培養液から菌体等の不溶成分を除いた後、例えば、活性炭を用いる方法、イオン交換樹脂を用いる方法、結晶化法、沈殿法等の方法を単独でまたは組み合わせることによって没食子酸を採取することができる。
【００６０】
以下に本発明の方法を実施例により具体的に述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６１】
実施例１．没食子酸合成活性を有する野生型水酸化酵素を下記のようにして同定した。
（１）シュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列と相同性を有する蛋白質のデータベース検索
シュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素は、パラヒドロキシ安息香酸を酸化してプロトカテク酸を生成する活性を保有するが、プロトカテク酸５位酸化活性を生成する活性は全く保有していないことが知られている〔Entsch, B, Palfey, B.A., Ballou, D. P. と Masey, V. J. Biol. Chem. 266, 17341-17349 (1991)〕。当該水酸化酵素と相同性を有するが、その相同性の値が大きくない蛋白質の中に、シュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素とは異なる活性、すなわちプロトカテク酸５位酸化活性を保有する蛋白質があるか調べてみることにした。具体的には、当該水酸化酵素７５％以下の相同性を有する蛋白質をナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（以下、ＮＣＢＩと略記する）のジェンバンク（GenBank；以下、ＧＢと略記する）データベースから、配列番号２に示すシュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列を問い合わせ配列とするＢＬＡＳＴ相同性解析法を用いて検索を行った。その結果、表１に示す１２種類の蛋白質が得られた。それぞれの蛋白質の略号とシュードモナス・アルギノサPAO
株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素との相同性％を表１に示した。
【表１】
【００６２】
（２）染色体ＤＮＡの単離精製
表１記載の１２種類の蛋白質をコードするＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングするために、各菌株の染色体ＤＮＡを下記のようにして調製または入手した。
【００６３】
菌株アシネトバクター・カルコアセティカスADP1（ＡＴＣＣ番号：33305）はＡＴＣＣから入手し、また菌株コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032（ＮＢＲＣ番号：12168）はＮＢＲＣから入手した。これらの菌株は各機関から入手した情報に従って培養した。菌株ブラディリゾビウム・ジャポニカムUSDA110および菌株シノリゾビウム・メリロティ1021は財団法人かずさＤＮＡ研究所の柴田大輔博士より分与を受け、同博士から教授された方法に従って培養した。これら培養菌体から染色体DNAをディーエヌイージー・ティシュ・キット（キアゲン社製（DNeasy tissue kit；Qiagen）を用いて単離精製した。菌株カウロバクター・クレセントスCB15の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：19089D）、菌株シュードモナス・プチダKT2440の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：47054D）、菌株ロドシュード
モナス・パルストリスCGA009の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：BAA-98D）、菌株ブレビバクテリウム・リネンズBL2の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：9175D）、菌株ノボスフィンゴビウム・アロマティカボランスDSM 12444の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：700278Ｄ）、および菌株ラルストニア・メタリデュランスCH34の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：43123Ｄ）はＡＴＣＣから入手した。
【００６４】
（３）ＰＣＲプライマーの設計と調製
表２に示す１２種類の遺伝子について、ＮＣＢＩのGenBankデータベースより塩基配列データ（配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７）をインターネット経由で取得した。各塩基配列データのＧＢアクセッション番号は表２に示した。これらの塩基配列をもとに各遺伝子のＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングするためのＰＣＲプライマーを設計し、合成した。各ＰＣＲプライマーの塩基配列は表２に示した。
【００６５】
（４）ＰＣＲ法による各酵素をコードするＤＮＡの増幅
ロシュ・ダイアグノスティクス社から購入したエキスパンド・ハイ・フィデリティ・ＰＣＲシステム（Expand High Fidelity PCR System）およびロシュ・ダイアグノスティクス社から購入したジー・シー・リッチ・ＰＣＲシステム（GC Rich PCR System）を用いて、上記２で得た染色体ＤＮＡを鋳型にし、表２記載のＤＮＡプライマーを用いて、添付の説明書に従って表２に示した遺伝子のＤＮＡを増幅させた。なお、ジー・シー・リッチ・ＰＣＲシステムを用いたＰＣＲ反応はデメチルスルホオキシドと7-deasa-dGTPの存在下で実施した。
【表２】
【００６６】
（５）遺伝子のクローニング
上記４で得られたHFM5遺伝子のＤＮＡ、HFM77遺伝子のＤＮＡ、HFM86遺伝子のＤＮＡ、HFM122遺伝子のＤＮＡ、HFM145遺伝子のＤＮＡ、HFM305遺伝子のＤＮＡ、HFM339遺伝子のＤＮＡ、HFM388遺伝子のＤＮＡ、HFM544遺伝子のＤＮＡ、HFM545遺伝子のＤＮＡ、HFM689遺伝子のＤＮＡおよびHFM737遺伝子のＤＮＡをそれぞれクローンテック社から購入したＢＤ・イン−フュージョン・ＰＣＲ・クローニング・キット（BD In-Fusion PCR Cloning Kit）を用いて、大腸菌T7プロモーターを利用した大腸菌用発現ベクターであるプラスミドpROX1（ロシュ・アプライド・サイエンス社から入手した；塩基配列は配列番号５９に示した）の制限酵素部位Nco Iと制限酵素部位Sma I の間にクローニングし、それぞれの遺伝子を発現するプラスミドpROX_HFM5、pROX_HFM77、pROX_HFM86、pROX_HFM122、pROX_HFM145、pROX_HFM305、pROX_HFM339、pROX_HFM388、pROX_HFM544、pROX_HFM545、pROX_HFM689およびpROX_HFM737を得た。なお、これら発現プラスミドは、各野生型酵素のＣ末端にGly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His（配列番号８２）の１０アミノ酸のペプチドが付加された酵素蛋白質が発現する構造を有する。
【００６７】
これらプラスミドに組み込まれたＤＮＡの塩基配列は、財団法人かずさＤＮＡ研究所の柴田大輔博士に依頼して、ジデオキシヌクレオチド酵素法（dideoxychain termination法）〔Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 74, p.5463, (1977)〕により決定され、それぞれのプラスミドが目的の遺伝子を含むことを確認した。
【００６８】
（６）形質転換株の造成と培養
上記５で述べたプラスミドpROX_HFM5、pROX_HFM77、pROX_HFM86、pROX_HFM122、pROX_HFM145、pROX_HFM305、pROX_HFM339、pROX_HFM388、pROX_HFM544、pROX_HFM545、pROX_HFM689およびpROX_HFM737をそれぞれ大腸菌K-12 BL21(DE3)株にカルシウムイオンを用いる形質転換法を用いて導入することにより、形質転換株BL21/ pROX_HFM5、BL21/ pROX_HFM77、BL21/ pROX_HFM86、BL21/ pROX_HFM122、BL21/ pROX_HFM145、BL21/ pROX_HFM305、BL21/pROX_HFM339、BL21/ pROX_HFM388、BL21/ pROX_HFM544、BL21/pROX_HFM545、BL21/ pROX_HFM689、およびBL21/ pROX_HFM737を造成した。なお、BL21(DE3)株は、大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所 ナショナル・バイオ・リソース・プロジェクトより菌株番号ME9026として入手した。
【００６９】
（７）上記形質転換株を用いた没食子酸の生産
上記１２種類の形質転換体を５ｍｌのＬＢ培地で一晩培養した。プラスミドを維持するためにアンピシリンを最終濃度１００ｐｐｍになるように加えた。新しいＬＢ培地に１／１００容量接種し、25℃で培養し対数増殖期にＩＰＴＧ（isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside）を終濃度１ｍＭになるように添加し、３時間タンパク誘導を行った。タンパク誘導後、大腸菌を遠心によって集菌した。上清を捨て、500μlのＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール）に懸濁した。大腸菌懸濁液を超音波破砕機によって、細胞破砕を行った。大腸菌懸濁液は遠心分離（４℃、１０分、２００００×g）を行い、上清と沈殿物に分離し、上清を粗酵素液とした。粗酵素液のタンパク濃度をブラッドフォード法に基づいたバイオラッド（Bio-Rad）プロテイン・アッセイ(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)を用いて計測し、１ｍｇ/ｍｌになるようにＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈した。
【００７０】
没食子酸合成反応は０．５ｍＭの基質（プロトカテク酸またはパラヒドロキシ安息香酸）、０．０１ｍＭ ＦＡＤ、０．０１ｍＭ ＦＭＮ、２．５ｍＭ ＮＡＤＨ、２５ｍＭ ＮＡＤＰＨを含むＨＥＰＥＳ緩衝液中で１００μlの反応系で行った。プロトカテク酸を基質にした場合、粗酵素６８μgを反応液に加えて反応を開始した。酵素反応液は３０℃で反応を行い０時間および１時間後に１ｍｌの酢酸エチルにて反応を停止した。また、パラヒドロキシ安息香酸を基質にした場合、粗酵素１０μgを反応液に加えて反応を開始した。酵素反応液は３０℃で反応を行い、０分および３０分後に１ｍｌの酢酸エチルにて反応を停止した。さらに１５０μlのＨＥＰＥＳ緩衝液と２Ｎ ＨＣｌ １．５μlを加えて、５分間激しく混和し、遠心分離（室温、５分、２００００×g）を行った。二層に分離した反応液・酢酸エチル混和物の上層（酢酸エチル層）を８００μl回収し、新しい１．５mlチューブに移した。
【００７１】
真空遠心乾燥機で乾燥後、１０μl アセトニトリルを加え、５分間激しく混和し、さらに１９０μlの水で希釈し、孔径０．２μｍのフィルター（Millex-LG）で濾過し、バイアル瓶に注入した。バイアル瓶はＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）にセットし、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計による解析を行った。没食子酸はＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて検出した。標品の没食子酸と比較して、高速液体クロマトグラフィーの保持時間と質量分析計からの質量値を合わせて生産された没食子酸を同定した。
【００７２】
１２種類のHFM酵素群のうち、１０種類（HFM5、HFM86、HFM145、HFM305、HFM339、HFM388
、HFM544、HFM545、HFM689およびHFM737）はプロトカテク酸を基質にした場合、没食子酸を合成した。それぞれの粗酵素タンパク１ｍｇ当たりの１時間当たりの没食子酸合成はHFM5（151μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM86（30μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM145（249μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM305（359μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM339（20μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM388（11μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM544（35μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM545（8μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM689（350μM/時間/mg 粗酵素タンパク）およびHFM737（41μM/時間/mg 粗酵素タンパク）であった。HFM 145、HFM 305及びHFM689で特に没食子酸合成活性が強かった。
【００７３】
実施例２．単離した水酸化酵素の活性とＰＡＯ変異酵素の活性を以下のようにして比較した。
１．ポリシストロン型発現プラスミドの構築
上記HFM145酵素遺伝子、HFM305酵素遺伝子及びHFM689酵素遺伝子を大腸菌 JM109株、大腸菌 JM109(DE3)株や大腸菌 BL21(DE3)株で各遺伝子の転写・翻訳効率に依存しない効率よい発現を行うために、目的遺伝子の転写は疑似遺伝子に依存し、疑似遺伝子の翻訳効率を維持した状態で目的遺伝子も翻訳される発現系の構築を行った。より具体的にはＴ７プロモーター配列と疑似遺伝子及び目的遺伝子をHindIII部位とSphI部位を介してpUC19プラスミドＤＮＡ内に挿入するために、配列番号６０〜６３で表される４本の合成ＤＮＡを合成した。これら合成ＤＮＡをpUC19（タカラバイオ（株）社製）のHindIII部位とSphI部位の間に挿入し、発現ベクターpUTCH19を構築した。
【００７４】
２．ＰＡＯ変異酵素の造成とベクターへの組み込み
シュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素遺伝子塩基配列データ（NC_002516）をＮＣＢＩのGenBankデータベースよりインターネット経由で取得した。この塩基配列をもとに各遺伝子のＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングするための配列番号６４で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号６５で表されるリバースPCRプライマーを設計し、合成した。シュードモナス・アルギノサPAO株の染色体DNA（ＡＴＣＣ番号：47085D-5）をＡＴＣＣから入手し、これを鋳型として、２種のPCRプライマーとPrimeSTAR酵素（タカラ・バイオ社製）を用いたＰＣＲによりパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素遺伝子のＤＮＡを増幅させた後、Taq ポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）による3'末端にＡ残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素蛋白質HFM300をコードするＤＮＡを運ぶプラスミドpT7Blue_HFM300を造成した。pT7Blue_HFM300から制限酵素HindIIIと制限酵素 XbaIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_HFM300を造成した。
【００７５】
同様に、配列番号６６で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号６７で表されるリバースPCRプライマーを用いるＰＣＲ法により、酵素蛋白質HFM300の385番目のチロシンをフェニールアラニンに置換した変異酵素蛋白質HFM300Y385F（ＰＡＯ変異酵素）をコードするＤＮＡを増幅し、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、蛋白質HFM300Y385FをコードするＤＮＡを運ぶプラスミドpT7Blue_HFM300Y385Fを造成した。pT7Blue_HFM300Y385Fから制限酵素HindIIIと制限酵素XbaIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_HFM300Y385Fを造成した。
【００７６】
３．酵素蛋白質HFM145、酵素蛋白質HFM305および．酵素蛋白質HFM689を発現するプラスミドの構築
実施例１の結果から、酵素蛋白質HFM145、酵素蛋白質HFM305および酵素蛋白質HFM689を発現する形質転換株の培養抽出液を用いたときに、良好な没食子酸の生成が観察された。そこで、酵素蛋白質HFM145、酵素蛋白質HFM305および酵素蛋白質HFM689を効率よく発現する
プラスミドの構築を行った。上記プラスミドpROX_HFM145、pROX_HFM305およびpROX_HFM689から生産される酵素蛋白質HFM145、酵素蛋白質HFM305および酵素蛋白質HFM689は、いずれもＣ末端に10アミノ酸のペプチド（Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His（配列番号８２））が付加されている。これらペプチドを除去した酵素蛋白質を発現するプラスミドを構築するために、まず表３に示すＰＣＲプライマーを設計し、合成した。
【表３】
【００７７】
pROX_HFM145、pROX_HFM305、pROX_HFM689のプラスミドＤＮＡを鋳型として、上表のPCRプライマーとPrimeSTAR酵素（タカラ・バイオ社製）を用いたＰＣＲにより目的ＤＮＡを増幅させた後、Taq ポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）による3'末端にＡ残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、プラスミドpT7Blue_HFM145、プラスミドpT7Blue_HFM305、プラスミドpT7Blue_HFM689を造成した。これらプラスミドから制限酵素HindIIIと制限酵素XbaIまたはKpnIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_HFM145、pUTCH_HFM305、pUTCH_HFM689を造成した。
【００７８】
４．変異酵素蛋白質HFM145Y385F、変異酵素蛋白質HFM305Y386Fおよび変異酵素蛋白質HFM6895Y384を発現するプラスミドの構築
これまでにプロトカテク酸から没食子酸を生成する活性を持つことが証明された酵素は、酵素蛋白質HFM300の385番目のチロシンをフェニールアラニンに置換した変異酵素蛋白質HFM300Y385Fのみであった。そこで、酵素蛋白質HFM145の385番目のチロシンをフェニールアランニンに置換した変異酵素蛋白質HFM145Y385F、酵素蛋白質HFM305の386番目のチロシンをフェニールアランニンに置換した変異酵素蛋白質HFM305Y386F、酵素蛋白質HFM689の384番目のチロシンをフェニールアランニンに置換した変異酵素蛋白質HFM689Y384Fを発現するプラスミドを
上記３に述べた方法と同様の方法により構築した。
【表４】
【００７９】
まず表４に示すＰＣＲプライマーを設計し、合成した。pROX_HFM145、pROX_HFM305、pROX_HFM689のプラスミドＤＮＡを鋳型として、表４のPCRプライマーとPrimeSTAR酵素（タカラ・バイオ社製）を用いたＰＣＲ法により目的ＤＮＡを増幅させた後、Taq ポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）による3'末端にＡ残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、プラスミドpT7Blue_HFM145Y385F、プラスミドpT7Blue_HFM305Y386F、プラスミドpT7Blue_HFM689Y384Fを造成した。これらプラスミドから制限酵素HindIIIと制限酵素XabIまたはKpnIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_HFM145Y385F、pUTCH_HFM305Y386F、pUTCH_HFM689Y384Fを造成した。
【００８０】
５．蛋白質HFM300、HFM300Y385F、HFM145、HFM145Y385F、HFM305、HFM305Y386F、HFM689、およびHFM689Y384Fの大腸菌による生産
プラスミドpUTCH_HFM300、pUTCH_HFM300Y385F、pUTCH_HFM145、pUTCH_HFM145Y385F、pUTCH_HFM305、pUTCH_HFM305Y386F、pUTCH_HFM689およびpUTCH_HFM689Y384Fをそれぞれ大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/pUTCH_HFM300、JM109/pUTCH_HFM300Y385F、JM109/pUTCH_HFM145、JM109/pUTCH_HFM145Y385F、JM109/pUTCH_HFM305、JM109/pUTCH_HFM305Y386F、JM109/pUTCH_HFM689FおよびJM109/pUTCH_HFM689Y384Fを造成した。これら形質転換体を、lacプロモーター誘導発現用培地であるオーバーナイト・エクスプレス・インスタントＴＢ（Overnight Express Instant TB；Novagen社製；以下、ＯＥＩ−ＴＢ培地と略す）を用いて、３７℃で１４時間培養した。集菌後、ＨＥＰＥＳ−グリシン緩衝液 ０．５ｍｌに懸濁した。この懸濁液に対して超音波破砕処理を加え、遠心した後、上清を回収して粗酵素液とした。続いて、粗酵素液の蛋白質濃度をブラッドフォード法により計測し、１ｍｇ／ｍｌに調製した。
【００８１】
６．没食子酸合成酵素活性の測定
上記５で調製した粗酵素液の没食子酸合成酵素活性を次のようにして測定した。酵素反応は、プロトカテク酸（基質）５００μＭ、ＦＡＤ １０μＭ、ＦＭＮ １０μＭ、ＮＡＤＨ
２．５ｍＭ、ＮＡＤＰ ２．５ｍＭ、粗酵素液６８μｇを含む１００μｌの反応液で３０℃で１時間行った。反応後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）を用いて、生成した没食子酸の量を測定した。その結果、組換え大腸菌JM109/pUTCH_HFM300、JM109/pUTCH_HFM300Y385F、JM109/pUTCH_HFM145、JM109/pUTCH_HFM145Y385F、JM109/pUTCH_HFM305、JM109/pUTCH_HFM305Y386F、JM109/pUTCH_HFM689FおよびJM109/pUTCH_HFM689Y384Fにおいて、それぞれ１ｍｇ蛋白質あたり、１３３μＭ、１３３μＭ、１７２μＭ、８６５μＭ、１４６６μＭ、４０８μＭ、５００μＭ、４２８μＭの没食子酸が検出された。この活性測定結果より、各没食子酸合成酵素の活性比は下表のとおりである。
【表５】
【００８２】
発現ベクターpUTCH19においては、該ベクターに組み込まれた遺伝子は同じ発現効率で蛋
白質が生産されるように設計されているが、そのことを確認するために、上記粗酵素液内の没食子酸合成酵素蛋白質の量を下記のようにして測定した。上記で１ｍｇ／ｍｌに調製した粗酵素タンパク液１０μL(１０μg)にβ−メルカプトエタノール(９９．５％を０．２５μｌ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１．２５μｌ、染色液１．２５μｌ加えて、５分間煮沸処理を行った。冷却した泳動用サンプルをポリアクリルアミドゲル（ATTO
e-PAGEL E-T1020L）のウェルにアプライし、２０ｍＡで８０分間泳動した。ゲルをクマシブリリアントブルー溶液（ATTO EzStainAqua）を用いてタンパク染色を行った。蒸留水で十分に脱色し、スキャナーを用いて画像を電子的に取り込んだ。ベクターコントロールと比較して、新しく発現したタンパクの中にHFM酵素タンパクのアミノ酸配列から予想される分子量（約４４ｋＤ）のシグナルが見られた。電子的に取り込んだ画像を画像処理ソフトウェアNIH ImageJ（http://www.bioarts.co.jp/~ijjp/ij/）で解析したところ、各HFM酵素タンパクの発現量はサンプル間で違いは観察されなかった。
【００８３】
実施例３．パラヒドロキシ安息香酸を原料とする大腸菌による没食子酸の生産を下記のようにして行った。
組換え大腸菌JM109/pUTCH_HFM300、JM109/pUTCH_HFM300Y385FおよびJM109/pUTCH_HFM305を、ＯＥＩ−ＴＢ培地を用いて、２５℃で一晩培養した後、集菌し、培地を捨てた。０．５ｍＭパラヒドロキシ安息香酸と１ｍＭ ＩＰＴＧを含む新しいＬＢ培地（ｐＨ５．９５）３ｍｌを加え、２５℃で２０時間培養した。培養液を０．１ｍｌ取り、酢酸エチル１ｍｌを加えた後、５分間攪拌した。ＨＥＰＥＳ−グリシン緩衝液０．１５ｍｌと５μlの２Ｎ ＨＣｌを添加した後、５分間遠心分離を行った。上層８００μlを採取し、乾燥させた。乾燥物をアセトニトリル１０μlに溶解した、水１９０μlを加えた後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）を用いて、生成した没食子酸の量を測定した。その結果は、組換え大腸菌JM109/pUTCH_HFM300、JM109/pUTCH_HFM300Y385FおよびJM109/pUTCH_HFM305の没食子酸生成量はそれぞれ.４μＭ、２．５μＭ、４２μＭであった。したがって、JM109/pUTCH_HFM305の没食子酸生産性はJM109/pUTCH_HFM300の９．５倍、JM109/pUTCH_HFM300Y385Fの１７．１倍であった。
【００８４】
実施例４．大腸菌によるテレフタル酸からの没食子酸の生産を下記のようにして行った。１．テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡクローニング
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）RHA1株のテレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ酵素遺伝子の塩基配列データ（NC_008268、NC_008269、NC_008270、NC_008271）をＮＣＢＩのGenBankデータベースよりインターネット経由で取得した。この塩基配列をもとに各遺伝子のＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングするための配列番号８０で表されるフォワードPCRプライマーおよび配列番号８１で表されるリバースPCRプライマーを設計し、合成した。Rhodococcus sp. RHA1株の染色体DNAを鋳型として、２種のPCRプライマーとPrimeSTAR酵素（タカラ・バイオ社製）を用いたＰＣＲによりテレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ酵素遺伝子のＤＮＡを増幅させた後、Taq ポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）による３'末端にＡ残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを運ぶプラスミドpT7Blue_TPACB1を造成した。pT7Blue_TPACB1から制限酵素HindIIIと制限酵素XbaIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_TPACB1を造成した。
なお、Rhodococcus sp. RHA1株は長岡科学技術大学の福田雅夫博士より分与を受け、同博
士から教授された方法に従って培養した。培養菌体から染色体DNAをディーエヌイージー・ティシュ・キット（キアゲン社製（DNeasy tissue kit；Qiagen）を用いて単離精製した。
【００８５】
２．テレフタル酸からの没食子酸の合成
pUTCH_TPACB1とpRTCH_HFM145_Y385F またはpUTCH_TPACB1とpRTCH_HFM305を用いて大腸菌JM109(DE3)を形質転換し、組換え大腸菌JM109(DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM145_Y385F)、およびJM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM305)を得た。
得られた組換え大腸菌JM109(DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM145_Y385F)、JM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM305)を５ｍｌのＯＥＩ−ＴＢ培地を用いて３７℃で１４時間培養した。集菌後、ＬＢ培地（カナマイシン５０ｐｐｍ、アンピシリン１００ｐｐｍ、 ＩＰＴＧ １ｍＭ、ｐＨ５．９５）３ｍｌに懸濁し、２５℃で４時間培養した。菌懸濁液５００μｌを取り、１．５ｍｌチューブに移した。テレフタル酸を終濃度０．５ｍＭになるように添加した。０．５、２４時間に菌懸濁液から１００μｌとり、１ｍｌの酢酸エチル、１５０μLのＨＥＰＥＳ緩衝液 ５μｌの２Ｎ ＨＣｌを加え、激しく５分間懸濁し、遠心にかけた。二層に分かれた上層（酢酸エチル層）を８００μｌとり、新しい１．５ｍＭチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを１０μLのアセトニトリルで激しく懸濁し、１９０μLの水で希釈した。孔径０．２μｍのフィルターで濾過し、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）で解析した。
【００８６】
その結果、ＯＥＩ−ＴＢ培地中の培養時間が４時間のときは、組換え大腸菌JM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM145_Y385F)とJM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM305)はそれぞれ２μＭと３９μＭの没食子酸の生産が観察された。また、ＯＥＩ−ＴＢ培地中の培養時間が２０時間のときは、組換え大腸菌JM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM145_Y385F)とJM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM305)はそれぞれ６６μＭと９μＭの没食子酸の生産が観察された。
【技術分野】
【０００１】
抗酸化剤や写真の現像剤として有用な没食子酸を、プロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性（以下、プロトカテク酸５位酸化活性という）を有する蛋白質を発現する微生物を用いて工業的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
没食子酸は、そのアルカリ性水溶液は還元力が強く、還元剤、写真の現像剤に使われる。また、タンニン合成の原料になり、青インクの製造に使われ、さらに、没食子酸プロピル、没食子酸イソアミルなどのエステルとして油脂・バターの酸化防止剤にも使用される。
【０００３】
酵素を用いた没食子酸の製造法に関しては、野生型酵素を用いた没食子酸の生産については報告例がないが、シュードモナス・エルギノーサＰＡＯ株が保有する野生型パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の３８５位のチロシンをフェニールアラニンに変換した変異酵素（以下、ＰＡＯ変異酵素と略記する）を用いることにより、試験管内でパラヒドロキシ安息香酸を出発物質としてプロトカテク酸を経由して没食子酸を生成できることが報告されている〔非特許文献１〕。ただし、ＰＡＯ変異酵素のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の比活性が、野生型酵素と比べて約５０分の１に減少し、没食子酸を合成するプロトカテク酸５位酸化活性も低いことが報告されている。また微生物を用いた没食子酸の製造法に関しては、大腸菌によりグルコースを原料にし、上記ＰＡＯ変異酵素を用いて没食子酸を生産する例が報告されている〔特許文献１、および非特許文献２〕。しかしながら、この例では、原料の一部しか没食子酸に転換しないこと、発酵時間が長いこと、前駆体3-デヒドロキシシキミ酸が大量に蓄積して没食子酸の生産量が頭打ちになっていることなどの理由から、製造コスト面で問題がある。原料として、グルコースでなく、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸およびパラヒドロキシ安息香酸などの芳香族カルボン酸を用いた場合、酵素変換によりモル数あたり100％近い没食子酸生産も期待できるが、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸およびパラヒドロキシ安息香酸を原料として微生物を培養して没食子酸を生産できることは報告されていない。
【０００４】
植物ヌルデの五倍子からの抽出法を用いて没食子酸を製造した場合、製造コストが高いことから、これら化合物を工業的に有利に製造する方法が求められている。フタル酸類（フタル酸、テレフタル酸およびイソフタル酸）は安価な原料である上、テレフタル酸はペットボトルからも再生できることから、安価な原料となる。またバイオマス利用が盛んになっているが、植物を利用してパラヒドロキシ安息香酸を大量生産することも可能となっているので、パラヒドロキシ安息香酸も安価な原料となる。このような背景から、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸などの安価な原料から没食子酸を効率よく生産する方法が所望されている。ＰＡＯ変異酵素はプロトカテク酸５位酸化活性が低いことから、没食子酸を効率よく生産するためにプロトカテク酸５位酸化活性の向上が所望されている。
【特許文献１】米国特許番号6,472,190
【非特許文献１】Entsch, B, Palfey, B.A., Ballou, D. P. と Masey, V. J. Biol. Chem. 266, 17341-17349 (1991)
【非特許文献２】Spiros Kambourakis, K.M. Draths, and J. W. Frost. J.Am.Chem.Soc. 122, 9042-9043 (2000年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸
などの安価な原料からプロトカテク酸を生産し、プロトカテク酸５位酸化活性を持つ蛋白質（以下、プロトカテク酸５位酸化酵素という）によりプロトカテク酸を没食子酸に変換することにより没食子酸を安価に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ＰＡＯ変異酵素のアミノ酸配列と相同性を有する野生型蛋白質の酵素活性を調べたところ、ＰＡＯ変異酵素のアミノ酸配列に対して４０．１％以上かつ７５．０％未満の相同性を有する、配列番号６,１０,１４,１６，１８，２０，２２，２４，２６および２８で表されるアミノ酸配列を有する野生型蛋白質について強いプロトカテク酸５位酸化活性を有することを見出した。続いて、相互に３９．１〜５８．９％の相同性を有する配列番号１６、２６、３０、３２および３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質のプロトカテク酸５位酸化活性を測定し、ＰＡＯ変異酵素の活性と比較したところ、野生型蛋白質でもＰＡＯ変異酵素よりもプロトカテク酸５位酸化活性の比活性が２倍以上高いことを見出した。
【０００７】
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ断片を含む組換えベクターを構築した後、該組換えベクターで形質転換した大腸菌を調製したところ、パラヒドロキシ安息香酸を原料として没食子酸を効率よく生産させることに成功した。
【０００８】
次に、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡをロドコッカス属RHA1株よりクローニングして、組換えベクターを構築した。該組換えベクター、および配列番号１６または３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を発現するベクターを用いて大腸菌を形質転換することにより、テレフタル酸代謝能を獲得した形質転換体を調製した。続いて該形質転換体を利用してテレフタル酸を原料として没食子酸を効率よく生産させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１５）に関する。
【００１０】
（１）以下の（Ａ）または〜（Ｂ）に記載の蛋白質を発現する微生物を用いてプロトカテク酸から没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする没食子酸の製造方法。
（Ａ）配列番号１６、２６、３０、３２または３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（Ｂ）配列番号１６、２６、３０、３２または３４で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性を有する蛋白質（配列番号３０については３８５位のフェニルアラニンが置換または欠失した配列を含まない）。
【００１１】
（２）微生物の培養物または該培養物の処理物およびプロトカテク酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする前記（１）の没食子酸の製造法。
【００１２】
（３）前記微生物がテレフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をテレフタル酸を含有する培地中でテレフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする前記（１）の没食子酸の製造方法。
【００１３】
（４）前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびテレフタル酸を水性媒体中に存
在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする前記（３）の没食子酸の製造法。
【００１４】
（５）前記微生物がフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をフタル酸を含有する培地中でフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする前記（１）の没食子酸の製造方法。
【００１５】
（６）前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする前記（５）の没食子酸の製造法。
【００１６】
（７）前記微生物がイソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をイソフタル酸を含有する培地中でイソフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする前記（１）の没食子酸の製造方法。
【００１７】
（８）前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびイソフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする前記（７）の没食子酸の製造法。
【００１８】
（９）前記微生物がパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をパラヒドロキシ安息香酸を含有する培地中でパラヒドロキシ安息香酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする前記（１）の没食子酸の製造方法。
【００１９】
（１０）前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびパラヒドロキシ安息香酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする前記（９）の没食子酸の製造法。
【００２０】
（１１）テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、前記（３）または（４）記載の没食子酸の製造方法。
【００２１】
（１２）フタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、前記（５）または（６）記載の没食子酸の製造方法。
【００２２】
（１３）イソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、イソフタル酸1,2-ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼおよびイソフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、前記（７）または（８）記載の没食子酸の製造方法。
【００２３】
（１４）前記微生物が、前記（Ａ）または（Ｂ）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡが導入された微生物である、前記（１）から（１３）のいずれか１項に記載の没食子酸の製造法。
【００２４】
（１５）微生物がエシェリヒア（Escherichia）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物であることを特徴とする、前記（１）から（１４）のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、プロトカテク酸５位酸化活性が優れた酵素蛋白質を用いて、プロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を原料として没食子酸を安価に製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２７】
本発明で用いられるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質としては、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＰＡＯ変異酵素よりもプロトカテク酸５位酸化酵素の比活性が２倍以上優れている蛋白質があげられる。例えば、配列番号１６、２６、３０、３２または３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。ここで、配列番号１６はシュードモナス・プチダKT2440由来の野生型プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列である。配列番号２６はノボスフィンゴビウム・アロマティカボランスDSM 12444由来の野生型プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列である。また、配列番号１６においては、ＰＡＯ変異酵素の変異点に対応する３８６位のTyrがPheに置換されてもよく、配列番号１６においてY386Fの変異が導入されたアミノ酸配列を配列番号３２に示す。また、配列番号２６においては、ＰＡＯ変異酵素の変異点に対応する３８４位のTyrがPheに置換されてもよく、配列番号２６においてY384Fの変異が導入されたアミノ酸配列を配列番号３４に示す。配列番号３０はコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032由来の野生型プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列において、ＰＡＯ変異酵素の変異点に対応する３８５位のTyrがPheに置換された配列である。
本発明で用いられるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質としてはまた、配列番号１６、２６、３０、３２または３４のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する蛋白質をあげることができる。ただし、配列番号３０のアミノ酸配列においては、385位のフェニルアラニンは保存されている必要があるので、385位のフェニルアラニンが欠失または置換した配列は含まない。
好ましくは、配列番号１６、２６、３０、３２および３４で表される蛋白質が配列番号４で表されるＰＡＯ変異酵素よりも酵素活性が優れている原因は、配列番号４のアミノ酸配列と配列番号１６、２６、３０、３２および３４のいずれかのアミノ酸配列の間の違いから由来しているので、これらアミノ酸配列の違いに基づいて配列番号１６、２６、３０、３２または３４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する蛋白質をあげることができる（配列番号３０については３８５位のフェニルアラニンが置換または欠失した配列を含まない）。また、該蛋白質として、配列番号１６、２６、３０、３２および３４のいずれかのアミノ酸配列と７５％以上の相同性、好ましくは９０％以上特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する蛋白質（配列番号３０については３８５位のフェニルアラニンが置換または欠失した配列を含まない）をあげることができる。さらに、相互に３７．８〜５８．９％の相同性を有する配列番号１６、２６、３０、３２および３４で表される蛋白質が配列
番号４で表されるＰＡＯ変異酵素よりもプロトカテク酸５位酸化酵素の比活性が２倍以上優れていることを本発明で見出したので、配列番号１６、２６、３０、３２および３４で表される蛋白質のいずれかの蛋白質との相同性が７５．０％以下であっても、３７．８％以上であれば、ＰＡＯ変異酵素よりもプロトカテク酸５位酸化酵素活性が２倍以上優れている酵素が容易に見出すことができる。したがって、本発明に関わるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質としては、配列番号１６、２６、３０、３２および３４で表されるアミノ酸配列と３７．８〜７５．０％の相同性を有し、配列番号４とは異なるアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性を有する蛋白質であってもよい。
【００２８】
上記の１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸５位酸化酵素活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Res., 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Res., 13, 4431 (1985)、Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１６、２６、３０、３２および３４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換または付加される１または数個というアミノ酸の数はプロトカテク酸５位酸化酵素活性が維持される限り特に限定されないが、配列番号４のアミノ酸配列と配列番号１６、２６、３０、３２および３４のいずれかのアミノ酸配列の間の違いの個数以内であることが望ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００２９】
本発明で用いられる微生物は、上記のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現する微生物である。例えば、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物などの微生物株から上記の特性を有するものを天然から単離することにより得られる。または、このような特性を有する微生物をアメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション（以下、必要に応じてＡＴＣＣと略記する）、独立行政法人製品基盤技術基盤機構・生物遺伝資源部門（以下、必要に応じてＮＢＲＣと略記する）、または独立行政法人 理化学研究所 筑波研究所 バイオリソースセンターなどから入手することができる。
【００３０】
具体的には、アシネトバクター（Acinetobacter）属の微生物としては、例えばアシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）ADP1等をあげることができる。ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属の微生物としては、例えばブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）USDA110等をあげることができる。コリネバクテリウム（Corynebacterium）属の微生物としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032等をあげることができる。シュードモナス（Pseudomonas）属の微生物としては、例えばシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KT2440等をあげることができる。ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属の微生物としては、例えばロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）CGA009等をあげることができる。シノリゾビウム（Sinorhizobium）属の微生物としては、例えばシノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）1021等をあげることができる。ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属の微生物としては、例えばブレビバクテリウム・リネンズ（Brevibacterium linens）BL2等をあげることが
できる。ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属の微生物としては、例えばノボスフィンゴビウム・アロマティカボランス（Novosphingobium aromaticivorans）DSM 12444等をあげることができる。ラルストニア（Ralstonia）属の微生物としては、例えばラルストニア・メタリデュランス（Ralstonia metallidurans）CH34等をあげることができる。ただし、本発明に使用できる菌株は本菌株に限定されるものではなく、その目的を達成できる菌株であればすべて使用できる。
【００３１】
本発明で用いられる微生物は、上記のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物であってもよい。本発明に使用できるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を生産する形質転換体は、例えば該ＤＮＡをモレキュラー・クローニング第２版に記載の方法に従って、上記の微生物から該蛋白質をコードするＤＮＡをクローニングし、ベクターＤＮＡと連結することで組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換することにより取得することができる。以下に、ＤＮＡのクローニングと形質転換株の作製方法について詳しく述べる。
【００３２】
上記のアシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物を公知の方法により培養する。培養後、公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。この染色体ＤＮＡから合成ＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼイション法またはＰＣＲ法などによりプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡを含む断片を取得することができる。なお、該合成ＤＮＡは、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属の細菌由来のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子（以下、プロトカテク酸５位酸化酵素遺伝子と呼ぶ）、好ましくはアシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）、ノボスフィンゴビウム・アロマティカボランス（Novosphingobium aromaticivorans）、ラルストニア・メタリデュランス（Ralstonia metallidurans）、またはブレビバクテリウム・リネンズ（Brevibacterium linens）由来のプロトカテク酸５位酸化酵素遺伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。具体的には、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）ADP1、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）USDA110、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KT2440、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）CGA009、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）1021、ブレビバクテリウム・リネンズ（Brevibacterium linens）BL2、ノボスフィンゴビウム・アロマティカボランス（Novosphingobium aromaticivorans）DSM 12444またはラルストニア・メタリデュランス（Ralstonia metallidurans）CH34のプロトカテク酸５位酸化酵素遺伝子の塩基配列、すなわち配列番号５、９、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７で表される塩基配列に基づいて設計することができる。
【００３３】
上記のプロトカテク酸５位酸化酵素遺伝子のＤＮＡを連結するベクターとしては、エシェリヒア・コリＫ１２株などにおいて自立複製可能なベクターであればプラスミドベクター、ファージベクター等いずれも使用可能であるが、具体的には、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔ストラタジーン社製、Nucleic Acids Res., 17, 9494 (1989)〕、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。
【００３４】
該ベクターに上記で取得したＤＮＡを連結して得られる組換え体ＤＮＡの宿主に用いるエシェリヒア・コリは、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができるが、具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue MRF'〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、エシェリヒア・コリC600〔Genetics, 39, 440 (1954)〕、エシェリヒア・コリY1088〔Science, 222,778 (1983)〕、エシェリヒア・コリY1090〔Science, 222, 778 (1983)〕、エシェリヒア・コリNM522〔J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)〕、エシェリヒア・コリK802〔J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)〕、エシェリヒア・コリJM105〔Gene, 38, 275 (1985)〕、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリBL21等をあげることができる。
【００３５】
ロドコッカス（Rhodococcus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物の中に、プロトカテク酸５位酸化酵素遺伝子を導入するときは、これら微生物の中で自立複製可能なベクターを用いる。好ましくは、該微生物のいずれかとエシェリヒア・コリＫ１２株の両方の微生物の中で自立複製可能なシャトル・ベクターを用いて、組換え体ＤＮＡを宿主となる該微生物に導入することができる。
【００３６】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕等をあげることができる。
【００３７】
上記のようにして得られた形質転換体から組換え体ＤＮＡを抽出し、該組換えＤＮＡに含まれる本発明のＤＮＡの塩基配列を決定することができる。塩基配列の決定には、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕または3730xl型ＤＮＡアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いることができる。
【００３８】
また、上記において決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することによっても目的とするＤＮＡを調製することもできる。
【００３９】
上記のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現する形質転換体は、下記の方法を用いて上記のＤＮＡを宿主細胞中で発現させることによって得られる。
【００４０】
上記のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡを用いる際には、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製することができる。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることもできる。本
発明のＤＮＡを発現する形質転換体は、上記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより取得することができる。
【００４１】
プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現させる宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
好ましくは、テレフタル酸、フタル酸またはイソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能（テレフタル酸、フタル酸またはイソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物を用いることができる。より好ましくは、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能を有するエシェリヒア属（Escherichia）、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、コマモナス（Comamonas）属、バチルス属（Bacillus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphigobium）属またはバークホルデリア（Burkholderia）属の細菌をあげることができる。さらに好ましくは、テレフタル酸の代謝能を有するロドコッカス属細菌RHA１とコマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）E6をあげることができる。このような微生物にプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現させることにより、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を経て没食子酸を製造することができる。すなわち、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能を有し、かつ、プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現する微生物を、それぞれ、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を含有する培地中でこれらの化合物と反応させることにより、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸から生成したプロトカテク酸から没食子酸を得ることができる。
なお、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成するプロセスは別の微生物を用いて行ってもよい。すなわち、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能を有する微生物によってテレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸から生成したプロトカテク酸を、プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現する微生物と反応させて没食子酸を得る方法も本発明の没食子酸の製造方法に含まれる。
【００４２】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００４３】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４４】
プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質、または、該蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質をコードするＤＮＡを大腸菌などの微生物に導入し、発現するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。より具体的には、ベクターとしては、例えば、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア
・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(+)（ストラタジーン社製）、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。
【００４５】
プロモーターとしては、大腸菌（エシェリヒア・コリ）等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター等の、T7プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、及びtacプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４６】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば５〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００４７】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972) 〕、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕、接合伝達法〔J. G. C. Ottow, Ann. Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (1975)〕、細胞融合法〔M.H. Gabor, J. Bacteriol., Vol.137, p.1346 (1979)〕等をあげることができる。
【００４８】
本発明で用いられるテレフタル酸、フタル酸またはイソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能（テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物は、自然界からのサンプルをもとに、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を炭素源とする集積培養法を用いて取得することができる。好ましくは、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の代謝能を有するシュードモナス属、ロドコッカス属、コマモナス属、バチルス属、マイコバクテリウム属、ノボスフィンゴビウム属またはバークホルデリア属の細菌をあげることができる。より好ましくは、プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現しているロドコッカス属RHA１をあげることができる。
なお、後述の実施例に示されるように、プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現する微生物はパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力も有しているため、プロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現させた微生物をパラヒドロキシ安息香酸を含む培地で培養することにより、パラヒドロキシ安息香酸から没食子酸を製造することができる。
【００４９】
本発明で用いられるテレフタル酸の代謝能（テレフタルからプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物は、テレフタル酸からプロトカテク酸への代謝に関わるテレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、およびテレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質を生産する能力を有する微生物を挙げることができる。
本発明で用いられるフタル酸の代謝能（フタル酸からプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物は、フタル酸ジオキシゲナーゼ、フタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、フタレート4,5-シス-ジヒドロキシジオール・ジヒドロゲナーゼ、4,5-ジヒドロキシフタレート脱炭酸酵素およびフタル酸トランスポーターの蛋白質を生産する能力を有する微生物を挙げることができる。
また本発明で用いられるイソフタル酸の代謝能（イソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力）を有する微生物は、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ、イソフタル酸ジオキシゲ
ナーゼ・レダクターゼ、イソフタル酸1,2-ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼおよびイソフタル酸トランスポーターの蛋白質を生産する能力を有する微生物を挙げることができる。これらの蛋白質を生産する能力を有する微生物は、これらの蛋白質をコードするＤＮＡを組換えＤＮＡ技術法を用いて単離した後、上記のプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を発現する形質転換体を取得する方法と同じ方法用いて取得することもできる。
【００５０】
以上のようにして得られる本発明の微生物を、好ましくは１ｍＭ〜１Ｍのプロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を含有する培地で培養し、培養物中に没食子酸を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、没食子酸を製造することができる。本発明の微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００５１】
本発明の微生物の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、果糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独または混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。没食子酸を生産するための原料としては、プロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を添加する。
【００５２】
培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、本発明の微生物が生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても本発明の微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。
【００５３】
本発明の微生物を培養した後、プロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸もしくはパラヒドロキシ安息香酸のいずれかを含む水性媒体中に、該微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を加えることにより、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することもできる。
【００５４】
該培養物の処理物として、本発明の微生物を担体に固定化したものを用いてもよい。その場合には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。また、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出して得られるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質を含有する抽出物、該抽出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処理を行って得られるプロトカテク酸５位酸化酵素蛋白質の部分精製成分等を担体に固定化したものも、本発明の没食子酸の製造に使用することができる。
【００５５】
これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、またはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる方法により行うことができる。
【００５６】
反応に用いる水性媒体は、プロトカテク酸を含有する水溶液または適当な緩衝液、例えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）とすることができる。この水性媒体には、さらに菌体の細胞膜の物質透過性を高める必要のあるときには、トルエン、キシレン、非イオン性界面活性剤等を０．０５〜２．０％（ｗ／ｖ）添加することもできる
。
【００５７】
水性媒体中の反応原料となるプロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の濃度は、０．１ｍＭ〜１Ｍ程度が適当である。上記の水性媒体における酵素反応温度およびｐＨは特に限定されないが、通常１０〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃が適当であり、反応液中のｐＨは５〜１０、好ましくは６〜９付近とすることができる。また、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。発明で使用する酵素は、菌体抽出液をそのまま又はそれから遠心分離、濾過等で集め、これを水又は緩衝液に懸濁して得ることができる。このようにして得られた酵素をプロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸と水の存在下、反応させるが、反応液中のプロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸の濃度は酵素の活性を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利である。反応は静置、攪拌、振盪のいずれの方法で行ってもよい。また、酵素を適当な支持体に固定化してカラムに充填し、プロトカテク酸、テレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸またはパラヒドロキシ安息香酸を含む溶液を流す方法も利用できる。反応は、通常１０〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃、ｐＨ５〜９、好ましくはｐ６〜８で行う。
【００５８】
なお、上記水性媒体には、反応時に酸化剤を添加すると、没食子酸の生成収率が一層向上する場合がある。酸化剤としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の硝酸塩、塩化第二鉄等の金属塩、ハロゲン、ペルオクソ酸等が挙げられ、好ましくは、亜硝酸ナトリウム、塩化第二鉄が挙げられる。添加濃度は、酸化剤の種類によって異なるが、没食子酸の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常０．００１〜０．０５％（Ｗ/Ｖ)、好ましくは０．００５〜０．０２％である。
【００５９】
培養終了後の培養液または反応液中からの没食子酸は、酢酸エチル等の有機溶剤によって抽出することにより単離・精製することができる。また、必要に応じて遠心分離等により該培養液から菌体等の不溶成分を除いた後、例えば、活性炭を用いる方法、イオン交換樹脂を用いる方法、結晶化法、沈殿法等の方法を単独でまたは組み合わせることによって没食子酸を採取することができる。
【００６０】
以下に本発明の方法を実施例により具体的に述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６１】
実施例１．没食子酸合成活性を有する野生型水酸化酵素を下記のようにして同定した。
（１）シュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列と相同性を有する蛋白質のデータベース検索
シュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素は、パラヒドロキシ安息香酸を酸化してプロトカテク酸を生成する活性を保有するが、プロトカテク酸５位酸化活性を生成する活性は全く保有していないことが知られている〔Entsch, B, Palfey, B.A., Ballou, D. P. と Masey, V. J. Biol. Chem. 266, 17341-17349 (1991)〕。当該水酸化酵素と相同性を有するが、その相同性の値が大きくない蛋白質の中に、シュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素とは異なる活性、すなわちプロトカテク酸５位酸化活性を保有する蛋白質があるか調べてみることにした。具体的には、当該水酸化酵素７５％以下の相同性を有する蛋白質をナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（以下、ＮＣＢＩと略記する）のジェンバンク（GenBank；以下、ＧＢと略記する）データベースから、配列番号２に示すシュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素のアミノ酸配列を問い合わせ配列とするＢＬＡＳＴ相同性解析法を用いて検索を行った。その結果、表１に示す１２種類の蛋白質が得られた。それぞれの蛋白質の略号とシュードモナス・アルギノサPAO
株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素との相同性％を表１に示した。
【表１】
【００６２】
（２）染色体ＤＮＡの単離精製
表１記載の１２種類の蛋白質をコードするＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングするために、各菌株の染色体ＤＮＡを下記のようにして調製または入手した。
【００６３】
菌株アシネトバクター・カルコアセティカスADP1（ＡＴＣＣ番号：33305）はＡＴＣＣから入手し、また菌株コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032（ＮＢＲＣ番号：12168）はＮＢＲＣから入手した。これらの菌株は各機関から入手した情報に従って培養した。菌株ブラディリゾビウム・ジャポニカムUSDA110および菌株シノリゾビウム・メリロティ1021は財団法人かずさＤＮＡ研究所の柴田大輔博士より分与を受け、同博士から教授された方法に従って培養した。これら培養菌体から染色体DNAをディーエヌイージー・ティシュ・キット（キアゲン社製（DNeasy tissue kit；Qiagen）を用いて単離精製した。菌株カウロバクター・クレセントスCB15の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：19089D）、菌株シュードモナス・プチダKT2440の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：47054D）、菌株ロドシュード
モナス・パルストリスCGA009の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：BAA-98D）、菌株ブレビバクテリウム・リネンズBL2の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：9175D）、菌株ノボスフィンゴビウム・アロマティカボランスDSM 12444の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：700278Ｄ）、および菌株ラルストニア・メタリデュランスCH34の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：43123Ｄ）はＡＴＣＣから入手した。
【００６４】
（３）ＰＣＲプライマーの設計と調製
表２に示す１２種類の遺伝子について、ＮＣＢＩのGenBankデータベースより塩基配列データ（配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７）をインターネット経由で取得した。各塩基配列データのＧＢアクセッション番号は表２に示した。これらの塩基配列をもとに各遺伝子のＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングするためのＰＣＲプライマーを設計し、合成した。各ＰＣＲプライマーの塩基配列は表２に示した。
【００６５】
（４）ＰＣＲ法による各酵素をコードするＤＮＡの増幅
ロシュ・ダイアグノスティクス社から購入したエキスパンド・ハイ・フィデリティ・ＰＣＲシステム（Expand High Fidelity PCR System）およびロシュ・ダイアグノスティクス社から購入したジー・シー・リッチ・ＰＣＲシステム（GC Rich PCR System）を用いて、上記２で得た染色体ＤＮＡを鋳型にし、表２記載のＤＮＡプライマーを用いて、添付の説明書に従って表２に示した遺伝子のＤＮＡを増幅させた。なお、ジー・シー・リッチ・ＰＣＲシステムを用いたＰＣＲ反応はデメチルスルホオキシドと7-deasa-dGTPの存在下で実施した。
【表２】
【００６６】
（５）遺伝子のクローニング
上記４で得られたHFM5遺伝子のＤＮＡ、HFM77遺伝子のＤＮＡ、HFM86遺伝子のＤＮＡ、HFM122遺伝子のＤＮＡ、HFM145遺伝子のＤＮＡ、HFM305遺伝子のＤＮＡ、HFM339遺伝子のＤＮＡ、HFM388遺伝子のＤＮＡ、HFM544遺伝子のＤＮＡ、HFM545遺伝子のＤＮＡ、HFM689遺伝子のＤＮＡおよびHFM737遺伝子のＤＮＡをそれぞれクローンテック社から購入したＢＤ・イン−フュージョン・ＰＣＲ・クローニング・キット（BD In-Fusion PCR Cloning Kit）を用いて、大腸菌T7プロモーターを利用した大腸菌用発現ベクターであるプラスミドpROX1（ロシュ・アプライド・サイエンス社から入手した；塩基配列は配列番号５９に示した）の制限酵素部位Nco Iと制限酵素部位Sma I の間にクローニングし、それぞれの遺伝子を発現するプラスミドpROX_HFM5、pROX_HFM77、pROX_HFM86、pROX_HFM122、pROX_HFM145、pROX_HFM305、pROX_HFM339、pROX_HFM388、pROX_HFM544、pROX_HFM545、pROX_HFM689およびpROX_HFM737を得た。なお、これら発現プラスミドは、各野生型酵素のＣ末端にGly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His（配列番号８２）の１０アミノ酸のペプチドが付加された酵素蛋白質が発現する構造を有する。
【００６７】
これらプラスミドに組み込まれたＤＮＡの塩基配列は、財団法人かずさＤＮＡ研究所の柴田大輔博士に依頼して、ジデオキシヌクレオチド酵素法（dideoxychain termination法）〔Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 74, p.5463, (1977)〕により決定され、それぞれのプラスミドが目的の遺伝子を含むことを確認した。
【００６８】
（６）形質転換株の造成と培養
上記５で述べたプラスミドpROX_HFM5、pROX_HFM77、pROX_HFM86、pROX_HFM122、pROX_HFM145、pROX_HFM305、pROX_HFM339、pROX_HFM388、pROX_HFM544、pROX_HFM545、pROX_HFM689およびpROX_HFM737をそれぞれ大腸菌K-12 BL21(DE3)株にカルシウムイオンを用いる形質転換法を用いて導入することにより、形質転換株BL21/ pROX_HFM5、BL21/ pROX_HFM77、BL21/ pROX_HFM86、BL21/ pROX_HFM122、BL21/ pROX_HFM145、BL21/ pROX_HFM305、BL21/pROX_HFM339、BL21/ pROX_HFM388、BL21/ pROX_HFM544、BL21/pROX_HFM545、BL21/ pROX_HFM689、およびBL21/ pROX_HFM737を造成した。なお、BL21(DE3)株は、大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所 ナショナル・バイオ・リソース・プロジェクトより菌株番号ME9026として入手した。
【００６９】
（７）上記形質転換株を用いた没食子酸の生産
上記１２種類の形質転換体を５ｍｌのＬＢ培地で一晩培養した。プラスミドを維持するためにアンピシリンを最終濃度１００ｐｐｍになるように加えた。新しいＬＢ培地に１／１００容量接種し、25℃で培養し対数増殖期にＩＰＴＧ（isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside）を終濃度１ｍＭになるように添加し、３時間タンパク誘導を行った。タンパク誘導後、大腸菌を遠心によって集菌した。上清を捨て、500μlのＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール）に懸濁した。大腸菌懸濁液を超音波破砕機によって、細胞破砕を行った。大腸菌懸濁液は遠心分離（４℃、１０分、２００００×g）を行い、上清と沈殿物に分離し、上清を粗酵素液とした。粗酵素液のタンパク濃度をブラッドフォード法に基づいたバイオラッド（Bio-Rad）プロテイン・アッセイ(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)を用いて計測し、１ｍｇ/ｍｌになるようにＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈した。
【００７０】
没食子酸合成反応は０．５ｍＭの基質（プロトカテク酸またはパラヒドロキシ安息香酸）、０．０１ｍＭ ＦＡＤ、０．０１ｍＭ ＦＭＮ、２．５ｍＭ ＮＡＤＨ、２５ｍＭ ＮＡＤＰＨを含むＨＥＰＥＳ緩衝液中で１００μlの反応系で行った。プロトカテク酸を基質にした場合、粗酵素６８μgを反応液に加えて反応を開始した。酵素反応液は３０℃で反応を行い０時間および１時間後に１ｍｌの酢酸エチルにて反応を停止した。また、パラヒドロキシ安息香酸を基質にした場合、粗酵素１０μgを反応液に加えて反応を開始した。酵素反応液は３０℃で反応を行い、０分および３０分後に１ｍｌの酢酸エチルにて反応を停止した。さらに１５０μlのＨＥＰＥＳ緩衝液と２Ｎ ＨＣｌ １．５μlを加えて、５分間激しく混和し、遠心分離（室温、５分、２００００×g）を行った。二層に分離した反応液・酢酸エチル混和物の上層（酢酸エチル層）を８００μl回収し、新しい１．５mlチューブに移した。
【００７１】
真空遠心乾燥機で乾燥後、１０μl アセトニトリルを加え、５分間激しく混和し、さらに１９０μlの水で希釈し、孔径０．２μｍのフィルター（Millex-LG）で濾過し、バイアル瓶に注入した。バイアル瓶はＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）にセットし、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計による解析を行った。没食子酸はＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて検出した。標品の没食子酸と比較して、高速液体クロマトグラフィーの保持時間と質量分析計からの質量値を合わせて生産された没食子酸を同定した。
【００７２】
１２種類のHFM酵素群のうち、１０種類（HFM5、HFM86、HFM145、HFM305、HFM339、HFM388
、HFM544、HFM545、HFM689およびHFM737）はプロトカテク酸を基質にした場合、没食子酸を合成した。それぞれの粗酵素タンパク１ｍｇ当たりの１時間当たりの没食子酸合成はHFM5（151μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM86（30μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM145（249μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM305（359μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM339（20μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM388（11μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM544（35μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM545（8μM/時間/mg 粗酵素タンパク）、HFM689（350μM/時間/mg 粗酵素タンパク）およびHFM737（41μM/時間/mg 粗酵素タンパク）であった。HFM 145、HFM 305及びHFM689で特に没食子酸合成活性が強かった。
【００７３】
実施例２．単離した水酸化酵素の活性とＰＡＯ変異酵素の活性を以下のようにして比較した。
１．ポリシストロン型発現プラスミドの構築
上記HFM145酵素遺伝子、HFM305酵素遺伝子及びHFM689酵素遺伝子を大腸菌 JM109株、大腸菌 JM109(DE3)株や大腸菌 BL21(DE3)株で各遺伝子の転写・翻訳効率に依存しない効率よい発現を行うために、目的遺伝子の転写は疑似遺伝子に依存し、疑似遺伝子の翻訳効率を維持した状態で目的遺伝子も翻訳される発現系の構築を行った。より具体的にはＴ７プロモーター配列と疑似遺伝子及び目的遺伝子をHindIII部位とSphI部位を介してpUC19プラスミドＤＮＡ内に挿入するために、配列番号６０〜６３で表される４本の合成ＤＮＡを合成した。これら合成ＤＮＡをpUC19（タカラバイオ（株）社製）のHindIII部位とSphI部位の間に挿入し、発現ベクターpUTCH19を構築した。
【００７４】
２．ＰＡＯ変異酵素の造成とベクターへの組み込み
シュードモナス・アルギノサPAO株のパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素遺伝子塩基配列データ（NC_002516）をＮＣＢＩのGenBankデータベースよりインターネット経由で取得した。この塩基配列をもとに各遺伝子のＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングするための配列番号６４で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号６５で表されるリバースPCRプライマーを設計し、合成した。シュードモナス・アルギノサPAO株の染色体DNA（ＡＴＣＣ番号：47085D-5）をＡＴＣＣから入手し、これを鋳型として、２種のPCRプライマーとPrimeSTAR酵素（タカラ・バイオ社製）を用いたＰＣＲによりパラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素遺伝子のＤＮＡを増幅させた後、Taq ポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）による3'末端にＡ残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、パラヒドロキシ安息香酸水酸化酵素蛋白質HFM300をコードするＤＮＡを運ぶプラスミドpT7Blue_HFM300を造成した。pT7Blue_HFM300から制限酵素HindIIIと制限酵素 XbaIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_HFM300を造成した。
【００７５】
同様に、配列番号６６で表されるフォワードPCRプライマーと配列番号６７で表されるリバースPCRプライマーを用いるＰＣＲ法により、酵素蛋白質HFM300の385番目のチロシンをフェニールアラニンに置換した変異酵素蛋白質HFM300Y385F（ＰＡＯ変異酵素）をコードするＤＮＡを増幅し、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、蛋白質HFM300Y385FをコードするＤＮＡを運ぶプラスミドpT7Blue_HFM300Y385Fを造成した。pT7Blue_HFM300Y385Fから制限酵素HindIIIと制限酵素XbaIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_HFM300Y385Fを造成した。
【００７６】
３．酵素蛋白質HFM145、酵素蛋白質HFM305および．酵素蛋白質HFM689を発現するプラスミドの構築
実施例１の結果から、酵素蛋白質HFM145、酵素蛋白質HFM305および酵素蛋白質HFM689を発現する形質転換株の培養抽出液を用いたときに、良好な没食子酸の生成が観察された。そこで、酵素蛋白質HFM145、酵素蛋白質HFM305および酵素蛋白質HFM689を効率よく発現する
プラスミドの構築を行った。上記プラスミドpROX_HFM145、pROX_HFM305およびpROX_HFM689から生産される酵素蛋白質HFM145、酵素蛋白質HFM305および酵素蛋白質HFM689は、いずれもＣ末端に10アミノ酸のペプチド（Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His（配列番号８２））が付加されている。これらペプチドを除去した酵素蛋白質を発現するプラスミドを構築するために、まず表３に示すＰＣＲプライマーを設計し、合成した。
【表３】
【００７７】
pROX_HFM145、pROX_HFM305、pROX_HFM689のプラスミドＤＮＡを鋳型として、上表のPCRプライマーとPrimeSTAR酵素（タカラ・バイオ社製）を用いたＰＣＲにより目的ＤＮＡを増幅させた後、Taq ポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）による3'末端にＡ残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、プラスミドpT7Blue_HFM145、プラスミドpT7Blue_HFM305、プラスミドpT7Blue_HFM689を造成した。これらプラスミドから制限酵素HindIIIと制限酵素XbaIまたはKpnIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_HFM145、pUTCH_HFM305、pUTCH_HFM689を造成した。
【００７８】
４．変異酵素蛋白質HFM145Y385F、変異酵素蛋白質HFM305Y386Fおよび変異酵素蛋白質HFM6895Y384を発現するプラスミドの構築
これまでにプロトカテク酸から没食子酸を生成する活性を持つことが証明された酵素は、酵素蛋白質HFM300の385番目のチロシンをフェニールアラニンに置換した変異酵素蛋白質HFM300Y385Fのみであった。そこで、酵素蛋白質HFM145の385番目のチロシンをフェニールアランニンに置換した変異酵素蛋白質HFM145Y385F、酵素蛋白質HFM305の386番目のチロシンをフェニールアランニンに置換した変異酵素蛋白質HFM305Y386F、酵素蛋白質HFM689の384番目のチロシンをフェニールアランニンに置換した変異酵素蛋白質HFM689Y384Fを発現するプラスミドを
上記３に述べた方法と同様の方法により構築した。
【表４】
【００７９】
まず表４に示すＰＣＲプライマーを設計し、合成した。pROX_HFM145、pROX_HFM305、pROX_HFM689のプラスミドＤＮＡを鋳型として、表４のPCRプライマーとPrimeSTAR酵素（タカラ・バイオ社製）を用いたＰＣＲ法により目的ＤＮＡを増幅させた後、Taq ポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）による3'末端にＡ残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、プラスミドpT7Blue_HFM145Y385F、プラスミドpT7Blue_HFM305Y386F、プラスミドpT7Blue_HFM689Y384Fを造成した。これらプラスミドから制限酵素HindIIIと制限酵素XabIまたはKpnIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_HFM145Y385F、pUTCH_HFM305Y386F、pUTCH_HFM689Y384Fを造成した。
【００８０】
５．蛋白質HFM300、HFM300Y385F、HFM145、HFM145Y385F、HFM305、HFM305Y386F、HFM689、およびHFM689Y384Fの大腸菌による生産
プラスミドpUTCH_HFM300、pUTCH_HFM300Y385F、pUTCH_HFM145、pUTCH_HFM145Y385F、pUTCH_HFM305、pUTCH_HFM305Y386F、pUTCH_HFM689およびpUTCH_HFM689Y384Fをそれぞれ大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/pUTCH_HFM300、JM109/pUTCH_HFM300Y385F、JM109/pUTCH_HFM145、JM109/pUTCH_HFM145Y385F、JM109/pUTCH_HFM305、JM109/pUTCH_HFM305Y386F、JM109/pUTCH_HFM689FおよびJM109/pUTCH_HFM689Y384Fを造成した。これら形質転換体を、lacプロモーター誘導発現用培地であるオーバーナイト・エクスプレス・インスタントＴＢ（Overnight Express Instant TB；Novagen社製；以下、ＯＥＩ−ＴＢ培地と略す）を用いて、３７℃で１４時間培養した。集菌後、ＨＥＰＥＳ−グリシン緩衝液 ０．５ｍｌに懸濁した。この懸濁液に対して超音波破砕処理を加え、遠心した後、上清を回収して粗酵素液とした。続いて、粗酵素液の蛋白質濃度をブラッドフォード法により計測し、１ｍｇ／ｍｌに調製した。
【００８１】
６．没食子酸合成酵素活性の測定
上記５で調製した粗酵素液の没食子酸合成酵素活性を次のようにして測定した。酵素反応は、プロトカテク酸（基質）５００μＭ、ＦＡＤ １０μＭ、ＦＭＮ １０μＭ、ＮＡＤＨ
２．５ｍＭ、ＮＡＤＰ ２．５ｍＭ、粗酵素液６８μｇを含む１００μｌの反応液で３０℃で１時間行った。反応後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）を用いて、生成した没食子酸の量を測定した。その結果、組換え大腸菌JM109/pUTCH_HFM300、JM109/pUTCH_HFM300Y385F、JM109/pUTCH_HFM145、JM109/pUTCH_HFM145Y385F、JM109/pUTCH_HFM305、JM109/pUTCH_HFM305Y386F、JM109/pUTCH_HFM689FおよびJM109/pUTCH_HFM689Y384Fにおいて、それぞれ１ｍｇ蛋白質あたり、１３３μＭ、１３３μＭ、１７２μＭ、８６５μＭ、１４６６μＭ、４０８μＭ、５００μＭ、４２８μＭの没食子酸が検出された。この活性測定結果より、各没食子酸合成酵素の活性比は下表のとおりである。
【表５】
【００８２】
発現ベクターpUTCH19においては、該ベクターに組み込まれた遺伝子は同じ発現効率で蛋
白質が生産されるように設計されているが、そのことを確認するために、上記粗酵素液内の没食子酸合成酵素蛋白質の量を下記のようにして測定した。上記で１ｍｇ／ｍｌに調製した粗酵素タンパク液１０μL(１０μg)にβ−メルカプトエタノール(９９．５％を０．２５μｌ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１．２５μｌ、染色液１．２５μｌ加えて、５分間煮沸処理を行った。冷却した泳動用サンプルをポリアクリルアミドゲル（ATTO
e-PAGEL E-T1020L）のウェルにアプライし、２０ｍＡで８０分間泳動した。ゲルをクマシブリリアントブルー溶液（ATTO EzStainAqua）を用いてタンパク染色を行った。蒸留水で十分に脱色し、スキャナーを用いて画像を電子的に取り込んだ。ベクターコントロールと比較して、新しく発現したタンパクの中にHFM酵素タンパクのアミノ酸配列から予想される分子量（約４４ｋＤ）のシグナルが見られた。電子的に取り込んだ画像を画像処理ソフトウェアNIH ImageJ（http://www.bioarts.co.jp/~ijjp/ij/）で解析したところ、各HFM酵素タンパクの発現量はサンプル間で違いは観察されなかった。
【００８３】
実施例３．パラヒドロキシ安息香酸を原料とする大腸菌による没食子酸の生産を下記のようにして行った。
組換え大腸菌JM109/pUTCH_HFM300、JM109/pUTCH_HFM300Y385FおよびJM109/pUTCH_HFM305を、ＯＥＩ−ＴＢ培地を用いて、２５℃で一晩培養した後、集菌し、培地を捨てた。０．５ｍＭパラヒドロキシ安息香酸と１ｍＭ ＩＰＴＧを含む新しいＬＢ培地（ｐＨ５．９５）３ｍｌを加え、２５℃で２０時間培養した。培養液を０．１ｍｌ取り、酢酸エチル１ｍｌを加えた後、５分間攪拌した。ＨＥＰＥＳ−グリシン緩衝液０．１５ｍｌと５μlの２Ｎ ＨＣｌを添加した後、５分間遠心分離を行った。上層８００μlを採取し、乾燥させた。乾燥物をアセトニトリル１０μlに溶解した、水１９０μlを加えた後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）を用いて、生成した没食子酸の量を測定した。その結果は、組換え大腸菌JM109/pUTCH_HFM300、JM109/pUTCH_HFM300Y385FおよびJM109/pUTCH_HFM305の没食子酸生成量はそれぞれ.４μＭ、２．５μＭ、４２μＭであった。したがって、JM109/pUTCH_HFM305の没食子酸生産性はJM109/pUTCH_HFM300の９．５倍、JM109/pUTCH_HFM300Y385Fの１７．１倍であった。
【００８４】
実施例４．大腸菌によるテレフタル酸からの没食子酸の生産を下記のようにして行った。１．テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡクローニング
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）RHA1株のテレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ酵素遺伝子の塩基配列データ（NC_008268、NC_008269、NC_008270、NC_008271）をＮＣＢＩのGenBankデータベースよりインターネット経由で取得した。この塩基配列をもとに各遺伝子のＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローニングするための配列番号８０で表されるフォワードPCRプライマーおよび配列番号８１で表されるリバースPCRプライマーを設計し、合成した。Rhodococcus sp. RHA1株の染色体DNAを鋳型として、２種のPCRプライマーとPrimeSTAR酵素（タカラ・バイオ社製）を用いたＰＣＲによりテレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼ酵素遺伝子のＤＮＡを増幅させた後、Taq ポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）による３'末端にＡ残基を付与する処理を行った。ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した後、pT7Blue-T ベクターに組み込むことにより、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを運ぶプラスミドpT7Blue_TPACB1を造成した。pT7Blue_TPACB1から制限酵素HindIIIと制限酵素XbaIにより各酵素蛋白質をコードするＤＮＡを切り出し、発現ベクターpUTCH19に組み込むことにより、プラスミドpUTCH_TPACB1を造成した。
なお、Rhodococcus sp. RHA1株は長岡科学技術大学の福田雅夫博士より分与を受け、同博
士から教授された方法に従って培養した。培養菌体から染色体DNAをディーエヌイージー・ティシュ・キット（キアゲン社製（DNeasy tissue kit；Qiagen）を用いて単離精製した。
【００８５】
２．テレフタル酸からの没食子酸の合成
pUTCH_TPACB1とpRTCH_HFM145_Y385F またはpUTCH_TPACB1とpRTCH_HFM305を用いて大腸菌JM109(DE3)を形質転換し、組換え大腸菌JM109(DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM145_Y385F)、およびJM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM305)を得た。
得られた組換え大腸菌JM109(DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM145_Y385F)、JM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM305)を５ｍｌのＯＥＩ−ＴＢ培地を用いて３７℃で１４時間培養した。集菌後、ＬＢ培地（カナマイシン５０ｐｐｍ、アンピシリン１００ｐｐｍ、 ＩＰＴＧ １ｍＭ、ｐＨ５．９５）３ｍｌに懸濁し、２５℃で４時間培養した。菌懸濁液５００μｌを取り、１．５ｍｌチューブに移した。テレフタル酸を終濃度０．５ｍＭになるように添加した。０．５、２４時間に菌懸濁液から１００μｌとり、１ｍｌの酢酸エチル、１５０μLのＨＥＰＥＳ緩衝液 ５μｌの２Ｎ ＨＣｌを加え、激しく５分間懸濁し、遠心にかけた。二層に分かれた上層（酢酸エチル層）を８００μｌとり、新しい１．５ｍＭチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを１０μLのアセトニトリルで激しく懸濁し、１９０μLの水で希釈した。孔径０．２μｍのフィルターで濾過し、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）で解析した。
【００８６】
その結果、ＯＥＩ−ＴＢ培地中の培養時間が４時間のときは、組換え大腸菌JM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM145_Y385F)とJM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM305)はそれぞれ２μＭと３９μＭの没食子酸の生産が観察された。また、ＯＥＩ−ＴＢ培地中の培養時間が２０時間のときは、組換え大腸菌JM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM145_Y385F)とJM109 (DE3)/(pUTCH_TPACB1, pRTCH_HFM305)はそれぞれ６６μＭと９μＭの没食子酸の生産が観察された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の蛋白質を発現する微生物を用いてプロトカテク酸から没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする没食子酸の製造方法。
（Ａ）配列番号１６、２６、３０、３２または３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（Ｂ）配列番号１６、２６、３０、３２または３４で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性を有する蛋白質（配列番号３０については３８５位のフェニルアラニンが置換または欠失した配列を含まない）。
【請求項２】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびプロトカテク酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項１に記載の没食子酸の製造法。
【請求項３】
前記微生物がさらにテレフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をテレフタル酸を含有する培地中でテレフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする請求項１に記載の没食子酸の製造方法。
【請求項４】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびテレフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項３に記載の没食子酸の製造法。
【請求項５】
前記微生物がさらにフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をフタル酸を含有する培地中でフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする請求項１に記載の没食子酸の製造方法。
【請求項６】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項５に記載の没食子酸の製造法。
【請求項７】
前記微生物がさらにイソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をイソフタル酸を含有する培地中でイソフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする請求項１に記載の没食子酸の製造方法。
【請求項８】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびイソフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項７に記載の没食子酸の製造法。
【請求項９】
前記微生物がさらにパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をパラヒドロキシ安息香酸を含有する培地中でパラヒドロキシ安息香酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする請求項１に記載の没食子酸の製造方法。
【請求項１０】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびパラヒドロキシ安息香酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項９に記載の没食子酸の製造法。
【請求項１１】
テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、請求項３または４記載の没食子酸の製造方法。
【請求項１２】
フタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、請求項５または６記載の没食子酸の製造方法。
【請求項１３】
イソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、イソフタル酸1,2-ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼおよびイソフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、請求項７または８記載の没食子酸の製造方法。
【請求項１４】
前記微生物が、前記（Ａ）または（Ｂ）の蛋白質をコードするＤＮＡが導入された微生物であることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか１項に記載の没食子酸の製造法。
【請求項１５】
微生物がエシェリヒア（Escherichia）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物であることを特徴とする、請求項１から１４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載の蛋白質を発現する微生物を用いてプロトカテク酸から没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする没食子酸の製造方法。
（Ａ）配列番号１６、２６、３０、３２または３４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（Ｂ）配列番号１６、２６、３０、３２または３４で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸の５位を酸化する酵素活性を有する蛋白質（配列番号３０については３８５位のフェニルアラニンが置換または欠失した配列を含まない）。
【請求項２】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびプロトカテク酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項１に記載の没食子酸の製造法。
【請求項３】
前記微生物がさらにテレフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をテレフタル酸を含有する培地中でテレフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする請求項１に記載の没食子酸の製造方法。
【請求項４】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびテレフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項３に記載の没食子酸の製造法。
【請求項５】
前記微生物がさらにフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をフタル酸を含有する培地中でフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする請求項１に記載の没食子酸の製造方法。
【請求項６】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項５に記載の没食子酸の製造法。
【請求項７】
前記微生物がさらにイソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をイソフタル酸を含有する培地中でイソフタル酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする請求項１に記載の没食子酸の製造方法。
【請求項８】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびイソフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項７に記載の没食子酸の製造法。
【請求項９】
前記微生物がさらにパラヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する能力を保有する微生物であり、該微生物をパラヒドロキシ安息香酸を含有する培地中でパラヒドロキシ安息香酸と反応させることにより、没食子酸を生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする請求項１に記載の没食子酸の製造方法。
【請求項１０】
前記微生物の培養物または該培養物の処理物およびパラヒドロキシ安息香酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に没食子酸を生成、蓄積させ、該媒体から没食子酸を採取することを特徴とする請求項９に記載の没食子酸の製造法。
【請求項１１】
テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、請求項３または４記載の没食子酸の製造方法。
【請求項１２】
フタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、テレフタル酸1,2-ジヒドロジオール ジヒドロゲナーゼおよびテレフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、請求項５または６記載の没食子酸の製造方法。
【請求項１３】
イソフタル酸からプロトカテク酸を生成する能力が、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ、イソフタル酸ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ、イソフタル酸1,2-ジヒドロジオールジヒドロゲナーゼおよびイソフタル酸トランスポーターの蛋白質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、請求項７または８記載の没食子酸の製造方法。
【請求項１４】
前記微生物が、前記（Ａ）または（Ｂ）の蛋白質をコードするＤＮＡが導入された微生物であることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか１項に記載の没食子酸の製造法。
【請求項１５】
微生物がエシェリヒア（Escherichia）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物であることを特徴とする、請求項１から１４のいずれか１項に記載の製造法。
【公開番号】特開２００９−６５８３９（Ｐ２００９−６５８３９Ａ）
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３４４６３（Ｐ２００７−２３４４６３）
【出願日】平成１９年９月１０日（２００７．９．１０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６、１７年度、経済産業省、「地域新生コンソーシアム研究開発事業」、課題「最新型質量分析器を用いた有用水酸化酵素の高速探索法の開発」の成果、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願平成１８年度、経済産業省、「戦略的基盤技術高度化支援事業」、課題「機能性化成品を生産する微生物の高速育種法の開発」の成果、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０３１３５５４６）株式会社ジナリス (3)
【出願人】（３０２０４４５４６）株式会社トランスサイエンス (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１０日（２００７．９．１０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６、１７年度、経済産業省、「地域新生コンソーシアム研究開発事業」、課題「最新型質量分析器を用いた有用水酸化酵素の高速探索法の開発」の成果、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願平成１８年度、経済産業省、「戦略的基盤技術高度化支援事業」、課題「機能性化成品を生産する微生物の高速育種法の開発」の成果、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０３１３５５４６）株式会社ジナリス (3)
【出願人】（３０２０４４５４６）株式会社トランスサイエンス (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]