治療および診断におけるプレターゲッティングに適したアネキシン誘導体
本発明は、腫瘍性の疾患、神経変性の疾患、循環器病、自己免疫疾患、および炎症性の疾患のような疾患の治療および診断のための方法および組成物を提供する。前記方法は、プレターゲッティングの概念に基づき、アネキシンと結合した認識可能な化合物Ａを含んでなる複合体を投与することと、化合物Ａを認識し、結合する化合物Ｂと結合した薬学的または診断的な化合物を含んでなる複合体を投与することを含んでなる。前記組成物には、標的細胞により内部移行されないアネキシン、アネキシン変異体、その誘導体、およびその複合体が含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、アネキシンの分野に関する。より具体的には、三量体および二次元ネットワークを形成しない新規のアネキシン、アネキシンの変異体、およびその誘導体を用いて特定の標的に対して化合物を送達することにより、対象を治療および診断するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、リン脂質分子およびいくつかのタンパク質分子の二重層からなる形質膜（ＰＭ）により包まれている。種々のリン脂質分子は、二重層の基礎的要素を形成する。リン脂質分子は、二重層の２つのリーフレットにわたって非対称的に分布する。例えば、ホスファチジルコリンは両方の層に存在する一方、スフィンゴミエリンは外界に面する外側のリーフレットにおいてのみ見られる。一方、ホスファチジルセリン（ＰＳ）のようなアミノリン脂質は、細胞の細胞質ゾルに面する内部のリーフレットに主に存在する（Zwaal and Schroit, Blood 89:1121-32 (1997)）。アミノリン脂質転位酵素は、ＰＳを形質膜の外側から内側の層またはリーフレットに輸送し、ＰＳの非対称的な分布を作る。ＰＭの非対称的な構造は、生きている細胞の特徴である。それらは、ＰＭにおけるリン脂質種の不均一な分布を作り、且つ維持するためにエネルギーを費やす。
【０００３】
細胞は、ある一定の状況下でＰＭのリン脂質構造を変化させることができ、細胞の活性化および乱れを引き起こす。プログラム細胞死（ＰＣＤ）は、ＰＭの外側のリーフレットにおけるＰＳの出現を伴う（Fadok et al., J. Immunol. 148:2207-16 (1992)）。形態学および生化学に基づいて、少なくとも４の型のＰＣＤが同定されている：（１）アポトーシス、（２）アポトーシス様ＰＣＤ、（３）ネクローシス様ＰＣＤ、およびネクローシス。各型は、ＰＳの細胞表面の外側の層への露出により特徴付けられるＰＭの非対称的な変化を伴う。ＰＭの外側の層におけるＰＳの露出は、細胞の種々の活性化および乱れた状態のよい指標となる。しかしながら、ＰＳの露出は、もっぱら、結果的に細胞死になる細胞プロセスに付随しない。一過性且つ可逆的なＰＳの露出は、いくつかの細胞型に対して報告されており、活性化Ｂ細胞、シンシチウムを形成するための未分化筋細胞、クラミジア感染細胞、腫瘍脈管構造の内皮細胞（米国特許第6,312,694号）、および貪食マクロファージ（Kenis et al. J. Biol. Chem. 2004 279: 52623-9）が含まれる。加えて、いくつかの細胞プロセスおよび条件は、ＰＭの外側のリーフレットにおいてＰＳの発現を伴うことが見出されている。これらには、血小板活性化、赤血球成熟、免疫系の刺激、筋細胞シンチウムの形成、腫瘍における新血管形成（米国特許第6,312,694号）、および腫瘍増殖（Rao et al., Thromb. Res. 67:517-31 (1992)）が含まれる。
【０００４】
加えて、細胞は、その表面からそれら自身の部分を散らすことができ、結果として膜に包まれたミクロ粒子を生じる。これらのミクロ粒子は、膜の外側の層に露出したＰＳのようなアミノリン脂質を有する。これらのミクロ粒子は、感染症、ＡＩＤＳ、アテローム性動脈硬化症のような疾患に関連する。それ故、細胞表面におけるアミノリン脂質は、種々の活性化および乱された細胞の状態の指標となる。さらに、露出したアミノリン脂質を示すミクロ粒子は、離れた細胞の活性化および乱れを反映する。それ故、ＰＭの表面におけるリン脂質は、疾患の研究、診断、予防および治療を含む種々の目的に対する魅力的な標的を構築する。好ましくは、ＰＭの外側のリーフレットにおけるＰＳは、疾患の研究、診断、予防および治療に対する標的を構築する。
【０００５】
疾患の薬理学的および遺伝的な治療は、疾患を有する細胞に対する薬理学的に活性のある化合物の送達に基づき、前記化合物は、好ましくは細胞内で作用する。現在の治療は、薬物の全身性の送達を利用し、所望の標的に到達する前に薬物は全身を循環する。この薬物送達の方法は、化合物の全身性の希釈を結果として生じる。結果として、治療的な効果を達成するためにはより高い濃度の薬物が必要とされる。これは、望ましくない毒性の副作用および薬物のコストの増大を伴う。
【０００６】
これらの問題に対する解決策は、標的化薬物送達システムにより提供される。ターゲッティング薬剤は、薬物に直接的または間接的に結合し、疾患を有する細胞が集積している場所に薬物を導く。
【０００７】
最近、我々は、ターゲッティングおよび細胞流入（cell-entry）剤としてのアネキシン、その誘導体およびアネキシン-Ｃｙｓ変異体ならびに治療的および診断的な適用に対するそれらの使用について述べている（WO 2006/003488, 2006年1月12日に公開）。アネキシンの主な標的はホスファチジルセリン（ＰＳ）であり、細胞により露出されてプログラム細胞死を実行し、代謝ストレスのようなストレスがかかる。アネキシン、誘導体およびアネキシンＣｙｓ変異体は、WO 2006/003488において述べられているように、ＰＳが露出した細胞表面に結合し、続いて内部移行する。前記内部移行は、表面に結合したアネキシンの枯渇を結果として生じる。この現象は、プレターゲッティングの概念を利用する治療および診断の方法におけるアネキシンの使用を妨げる。
【０００８】
プレターゲッティングは、バックグラウンドシグナルおよび全身性の毒性負荷を減少させるために、診断を目的としたレポーティング化合物および／または治療的を目的とした薬剤を、疾患を有する組織に対して多ステップの方法でターゲッティングする方法である。前記プレターゲッティングの概念は、相互に高い親和性を有する２つの化合物ＡおよびＢを用いる。化合物Ａはターゲッティング機能を有し、化合物Ｂはレポーターおよび／または治療的な機能を有する。第一に、ターゲッティング機能を有する化合物Ａを対象に投与する。一定時間後、循環している化合物Ａが十分に除去された後、レポーターおよび／または治療的な薬剤を有する化合物Ｂを対象に与える。後者の化合物は、そのターゲッティング機能により化合物Ａが保持される部位に集積する。この方法は、望ましい効果を得るために投与される必要がある化合物Ｂの量を減少させる。さらに、レポーターおよび／または治療的な薬剤が化合物Ａに直接結合した場合、化合物Ａに関連するバックグラウンドシグナルおよび望ましくない毒性の副作用を回避するであろう。
【０００９】
相互に高い親和性を有し、且つプレターゲッティングに適したＡおよびＢの化合物の組み合わせの例には、ストレプトアビジン／アビジンおよびビオチンの組み合わせ、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドの組み合わせ、モルホリノのような相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの類似体（デオキシリボース-ホスホジエステル鎖の代わりにモルホリノ-ホスポロジイミデート鎖を含む合成オリゴヌクレオチド類似体）、ペプチド核酸（デオキシリボース-ホスホジエステル鎖の代わりにＮ-アミノエチル-グリシン鎖を含む合成オリゴヌクレオチド類似体，ＰＮＡ）およびアプタマー（特異的に結合するオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド）、抗体およびハプテンの組み合わせ、ならびに受容体およびリガンドの組み合わせが含まれる。これらの組み合わせは、プレターゲッティングの方法を通して癌のイメージングおよび治療のための放射性核種の送達において使用される（Sharkey et al, Clin. Cancer Res. 2005, 11:7109-21）。
【００１０】
プレターゲッティングの方法を首尾よく実行するために必要なことは、化合物Ａの化合物Ｂに対する到達性である。標的細胞による化合物Ａの内部移行は、この方法の有効性を低下させる。
【００１１】
特許出願WO 2006/003488は、アネキシン、その誘導体、およびアネキシン-Ｃｙｓ変異体がその表面にＰＳを露出する細胞により内部移行されることを述べている。内部移行のメカニズムは、アネキシン三量体の形成および大きな二次元ネットワークにおけるアネキシン三量体の組織化に基づく（Kenis et al. J. Biol. Chem. 2004 279: 52623-9）。このメカニズムは、アネキシン、その誘導体、およびアネキシン-Ｃｙｓ変異体のプレターゲッティングの方法における化合物Ａのターゲッティング部分としての効率的な使用を低下させる。
【００１２】
Mira et al., J. Biol. Chem. 1997, 272: 10474-82は、アネキシン変異体Ｍ１〜Ｍ４について述べており、細胞質ゾルのホスホリパーゼＡ２の阻害におけるＣａ２＋結合およびその効果に影響を与えることを述べている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の１つの実施形態によると、疾患を診断および治療するためのプレターゲッティング方法に適したアネキシン変異体が提供される。これらのアネキシン変異体は、十分な親和性でＰＳと結合し、細胞の表面において三量体および二次元ネットワークを形成することができず、それ故、それら自身の内部移行を誘発しない。
【００１４】
本発明のもう１つの実施形態は、プレターゲッティング方法に対して親和性の化合物Ａで誘導体化されたアネキシンおよびその変異体に関する。そのような親和性化合物には、ビオチン、１以上のビオチン群を含有する化合物、ストレプトアビジン、アビジン、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、モルホリノ、ＰＮＡ’ｓ、アプタマー、レセプター、レセプターに対して高い親和性を有する化合物およびグロブリンまたはそれらの部分が含まれる。本発明において、親和性化合物Ａは、認識可能な化合物（Ａ）、または化合物Ａとして同じ意味で使用される。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態は、システイン残基との接合を介して親和性化合物Ａで誘導体化される、特許出願WO 2006/003488によるアネキシン-Ｃｙｓ変異体、アネキシンおよびその誘導体を包含する。
【００１６】
本発明の１つの実施形態は、アネキシン誘導体および複合体と組み合わせて、蛍光化合物、放射性核種、ＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤、細胞分裂停止剤、ならびにサイトカイン、補体因子、毒素、および免疫グロブリンを含む治療的な生物学的製剤と接合された、親和性化合物Ｂの使用に関する。親和性化合物Ｂは、本発明の他の実施形態の親和性化合物Ａに対して高い親和性を有する。本発明において、親和性化合物Ｂは、化合物Ａを認識する化合物（Ｂ）として、または化合物Ｂとして同じ意味で使用される。
【００１７】
本発明の１つの実施形態は、上述した親和性化合物Ａとアネキシン誘導体の少なくとも１の複合体および任意に少なくとも１の薬学的に許容可能な賦形剤を含むキットである。
【００１８】
本発明のもう１つの実施形態は、薬学的化合物を標的細胞に送達するための方法に関し、第１に上述した組成物の複合体をターゲッティングすること、第２に上述した組成物の治療的な複合体を投与することを含む。より具体的には、この実施形態は、疾患を治療または予防する方法を含み、前記薬学的化合物は、疾患を治療または予防するのに効果的な治療的な化合物である。
【００１９】
本発明の１つの実施形態は、標的細胞に対して診断的な化合物を送達するための方法に関し、第１に上述した組成物のターゲッティング複合体を投与すること、第２に上述した組成物の診断的な複合体を投与することを含む。より具体的には、この実施形態は、疾患を診断することおよび治療の有効性を決定することを含んでなり、前記診断的な化合物は、光学的なイメージング、核イメージング、ＭＲＩ、ＣＴおよび超音波を含んでなるイメージング様式により検出することができる分子イメージング化合物である。
【００２０】
本発明をより理解するために、他のおよびさらなる目的と共に、付随する図と組み合わせて以下の記述を参照されたく、その範囲は付属の特許請求の範囲に示す。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
本発明は、部分的に、アネキシン分子間の分子間相互作用に関与するアミノ酸を同定するための定方向の検索に基づく。分子モデリングおよびタンパク質データベース（ＰＤＢ、１ＡＶＲおよびＡＮＸ）から入手可能な結晶構造のドッキングは、三量体形成に関与するアミノ酸を明らかにした。これらのアミノ酸は、らせんIＡ、IＤ、IIＡ、IIＤ、IIIＣ、IIIＤおよびIVＥならびにらせんIＣとIＤ、IIＥとIIIＡ、IIIＣとIIIＤ、IIIＤとIIIＥ、IVＡとIVＢを結合する配列において見られる（アネキシンＡ５分子におけるこれらのらせんの所在について、Huber et al. EMBO J. 12:3867-74 (1990)を参照されたい）。本発明の１つの実施形態のアネキシン変異体は、らせんIＡ、IＤ、IIＡ、IIＤ、IIIＣ、IIIＤおよびIVＥ、ならびにらせんIＣとIＤ、IIＥとIIIＡ、IIIＣとIIIＤ、IIIＤとIIIＥ、IVＡとIVＢを結合する配列において置換された１以上のアミノ酸を有し、細胞の表面において三量体および二次元ネットワークを形成するそれらの能力を改善し、結果としてそれらの細胞への内部移行を改善する。アネキシン変異体は、細胞の表面により長く残り、それ故プレターゲッティング法に対して適している。
【００２２】
本発明は、一般的に、a）少なくとも１のリン脂質、特にホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合し、且つb）細胞内へ内部移行しないアネキシン変異体に関する。「アネキシン」という用語は、リン脂質、特にホスファチジルセリンに結合することができるタンパク質を意味し、いわゆるアネキシンファミリーの一員である。前記ファミリーは、多くのメンバーを含み；それについてならびにタンパク質および核酸配列についての情報は、例えばhttp://snoops.bch.ed.ac.uk/annexins/seq/search.phpで見ることができる。例によると、配列番号１のアミノ酸配列を有するアネキシンＡ５についてここでは言及されているが、他のアネキシンも同様に本発明のアネキシン変異体を作るためおよび使用するために使用することができる。図２は、ヒトアネキシンＡ１〜Ａ１１およびＡ１３のアラインメントを含む。Ａ１、Ａ６、Ａ７およびＡ１１のようないくつかのアネキシンは、Ｎ末端に長い伸長を有する。これらの部分は図２には含まれず、本発明の目的に対して関連性があまりないと考えられている。以下において、アネキシンＡ５のアミノ酸配列および位置について言及されているが、図２のアラインメントまたは図２に示されていないアネキシンの対応するアラインメントを用いて見出だされる対応する位置を選択することにより、Ａ５にあてはまるものは他のアネキシン、特にヒトアネキシンにもあてはまる。
【００２３】
本発明による特別なアネキシン変異体は、図１によるアミノ酸配列を有し（配列番号１）、細胞への内部移行を阻害するために修飾され、上述したらせんおよび結合配列内の１以上のアミノ酸は異なるアミノ酸により置換される。これらのアミノ酸は、アネキシンＡ５の１６〜２９、５９〜７４、８８〜１０２、１３５〜１４５、１５６〜１６９、２０２〜２３１、２５９〜２６６、および３０５〜３１７の位置にあり、これらの位置は配列番号１および図２において下線を引く。アネキシン変異体は１以上のこれらの修飾を含み、細胞に内部移行しないというアネキシンの特徴は満たされていると考えられる。それ故、本発明は、a）少なくとも１のリン脂質に結合し、且つb）上述したような１以上のアミノ酸修飾を含むアネキシン変異体も含んでなる。
【００２４】
好ましい修飾は、置換、特に無極性のアミノ酸による極性のアミノ酸の置換である。それ故、置換に対して好ましいアミノ酸には、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）が含まれる。それらは、例えば、アラニン（Ａ）もしくはグリシン（Ｇ）、または他のアネキシンの対応する位置にある無極性アミノ酸により置換されてよい（図２を参照されたい）。置換されるアミノ酸の適切な例には、Ｅ２１、Ｋ２５（例えばＧ、Ｔによる）、Ｒ６２（例えばＧ、Ａ）、Ｄ６３（例えばＧ、Ａ、Ｐ）、Ｋ６９、Ｄ９１、Ｋ９６、Ｈ９７、Ｋ１００、Ｅ１３７（例えばＡ、Ｇ、Ｖ）、Ｄ１３８、Ｄ１３９、Ｎ１５９（例えばＡ、Ｇ、Ｓ）、Ｒ１６０、Ｒ２０６、Ｋ２０７、Ｑ２１９、Ｄ２２５、Ｒ２２６、Ｄ２６４、Ｋ３０８、Ｋ３０９が含まれる。位置Ｅ７１、Ｄ１４３、Ｅ２２７およびＤ３０２における修飾Ｍ１〜Ｍ４は、本発明によるとあまり好ましくない。
【００２５】
細胞の部位におけるアネキシンの三量体化をさらに減少させるために、異なる領域に少なくとも２、または少なくとも３の置換、例えば、Ｒ６２Ａ＋Ｅ１３７ＧまたはＫ６９Ａ＋Ｋ１００Ａ＋Ｎ１５９Ｓ等を有することが好ましい。
【００２６】
アネキシン変異体は、１以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加をさらに含んでよく、前記アミノ酸の置換、欠失、または付加は、アネキシン変異体が少なくとも１のリン脂質および少なくとも１の認識可能な化合物Ａに結合する能力に実質的に影響を与えず、前記アミノ酸の置換、欠失、または付加は、認識可能な化合物Ａの細胞への内部移行が阻害されることに実質的に影響を与えない。
【００２７】
前記置換は、アネキシンがリン脂質に十分に結合するようになされるべきである。十分な結合とは、Ｃａ２＋イオンの存在下において約１０−６Ｍ以下の解離定数であることを意味する。
【００２８】
本発明はさらに、上記で定義したような認識可能な化合物Ａと結合したアネキシン分子または変異体に関し、前記アネキシン変異体は、標的細胞により内部移行されない。前記認識可能な化合物Ａは、例えば、ビオチンまたは複数のビオチンの複合体であってよい。他の適切な例には、アビジンもしくはストレプトアビジン、オリゴヌクレオチドもしくはモルホリノ化合物の形態のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド類似体またはＰＮＡまたはアプタマーが含まれる。
【００２９】
もう１つの実施形態において、前記認識可能な化合物Ａは、レセプターもしくはその一部、またはレセプターリガンドもしくはその一部である。認識可能な化合物Ａの他の例には、抗体もしくはその断片、例えばラクダ様の起源に由来する切断された抗体であるナノ体（nanobody）、または抗原が含まれる。
【００３０】
認識可能な化合物は、それ自体既知の方法によりアネキシンと結合させることができる。１つの方法は、前記認識可能な化合物がおそらく誘導体化された形態である特定のアミノ酸に共有結合的に結合することにある。特に適しているのは、例えばビオチンの場合、アネキシンのシステイン残基に対する結合であり、マレイミド基で誘導体化され得る。アネキシンの機能的な性質を妨げないために、認識可能な化合物と結合するアミノ酸は、アネキシン分子の凹面側に位置する。配列番号１においてイタリックのアミノ酸記号で表されている。さらに、これらの位置は、アネキシンの三量体化および内部移行を妨げるために上記選択された領域に位置するか、または位置しなくてよい。それ故、好ましい位置は、配列番号１において太字のイタリックで示した位置であり、すなわち、アネキシンＡ５の配列１〜１５、４６〜５８、８６〜８７、１１８〜１３４、（１７０）、２４５〜２４８および２８０〜２９４ならびに他のアネキシンの対応する配列（図２参照）であるが、下線を引いたイタリックの位置（１６〜１９、２４、２８、５９〜６４、８８〜８９、１３５、１５７〜１６９、２０３〜２１９）もシステイン残基を導入するために使用することができる。
【００３１】
システイン残基はこれらの配列の外側に天然に存在することがより好ましく、特に、三量体化を妨げる目的で本発明によりアミノ酸が置換される部分に存在するものが他のアミノ酸で置換されることが好ましい。そのような他のアミノ酸は、Ｇ、ＡまたはＳのような中性の小さなアミノ酸であるか、または、もう１つのアネキシンの同じ位置に存在するアミノ酸であってよい。例えば、アネキシンＡ４のＣ１０７はＶまたはＡで適切に置換されてよく、アネキシンＡ３のＣ２０１（および多くの他のアネキシンにおける対応物）はＧまたはＡで置換されてよく、アネキシンＡ５のＣ３１５（および多くの他のアネキシンにおける対応物）はＶ、ＡまたはＳで置換されてよい。アネキシンＡ８のＣ２９２は、誘導体化に適した位置にあるため置換される必要がない。前記アミノ酸置換は、当業者に周知の組み換え技術により行うことができ、以下の実施例において示す。
【００３２】
本発明は、１のアミノ酸の位置１〜１９、２４、２８、４６〜６４、８６〜８９、１１８〜１３５、１４９〜１５０、１５７〜１７０、２０３〜２１９、２４５〜２４８および２８０〜２９４においてシステイン残基を含み、これらの位置の外側にはシステイン残基を含まず、さらに、位置１６〜２９、５９〜７４、８８〜１０２、１３５〜１４５、１５６〜１６９、２０２〜２３１、２５９〜２６６および３０５〜３１７におけるＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓの１以上のアミノ酸の、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒ、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＳｅｒによる置換を含み；例えば図２に示すように、他のアネキシンにおける対応するアミノ酸の位置に当てはまる。アネキシンは、タンパク質自体、あるいはスペーサーおよび／または認識可能な化合物との接合体であってよい。前記システイン残基は、例えば認識可能な群（Ａ）で置換されてよい。
【００３３】
アネキシン変異体と認識可能な化合物Ａとの複合体は、薬剤または診断薬を特定の部位、特にＰＳを露出する細胞にターゲティングするための治療方法または診断方法において使用することができる。そのような方法において、アネキシン変異体と認識可能な化合物Ａとの複合体を含む組成物は、そのような治療または診断方法が意図される対象に最初に投与され、化合物Ａを認識し、結合する化合物Ｂおよび診断的または治療的な化合物を含んでなる少なくとも１の複合体を含む組成物が続いて前記対象に投与される。化合物Ｂは、特に、化合物Ａの特異的な対応物であり、例えば、化合物Ａがビオチンである場合、ストレプトアビジンまたはアビジンである。同様に、化合物Ｂは、特に化合物Ａがストレプトアビジンまたはアビジンである場合、ビオチンまたは複数のビオチンの複合体であってよい。化合物Ｂは、オリゴヌクレオチド、モルホリノ、ＰＮＡまたはアプタマーであってもよく、上述したアネキシン分子に結合するオリゴヌクレオチド、モルホリノ、ＰＮＡまたはアプタマー対応物に対して高い親和性を有する。レセプターまたはその一部であってもよく、化合物Ａはレセプターリガンドであり、逆も同じである。化合物は、化合物Ａを抗体とする抗原またはその断片であってもよく、逆もまた同じである。
【００３４】
本発明の診断方法において使用することができる診断薬は、蛍光性の群、放射性核種、ＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤、超音波剤、およびそれらの組み合わせから選択されてよい。蛍光性の群の適切な例は、フルオレセイン、アレキサス（Alexas）、フィコエリトリン、Ｃｙ-化合物、ナノ結晶およびそれらの組み合わせである。放射性核種の適切な例には、炭素-１１、フッ素-１８、インジウム-１１１、ヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、窒素-１３、酸素-１５、テクネチウム-９９ｍ、ジルコニウム-８９、Ｇａ-６７、Ｇａ-６８、Ｃｕ-６４およびそれらの組み合わせが含まれ、化合物Ｂに結合する適切な分子または化合物Ｂ自体に組み込まれる。ＭＲＩ造影剤は、ガドリニウム、磁気粒子および常磁性粒子から選択されてよい。
【００３５】
本発明の治療方法において使用することができる治療的な化合物は、例えば、毒素、酵素、酵素阻害剤、脂質、糖類、免疫グロブリンまたはその断片、免疫複合体、化学療法化合物、光増感剤、放射性核種、細胞死誘発剤、細胞死阻害剤、線維素溶解性化合物、およびそれらの組み合わせであってよい。前記毒素は、Ｄｔ、ＰＥ，Ｐ３８、Ｐ４０、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（gelonin）、シュードモナス、外毒素、赤痢菌毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（pokeweed antiviral protein）、およびそれらの組み合わせから選択されてよい。化合物Ｂと結合することができる酵素の例には、ペルオキシダーゼ、アルカラーゼ、カスパーゼ、およびそれらの組み合わせが含まれる。脂質は、例えば、リン脂質、脂肪酸、テルペン、ステロイド、およびそれらの組み合わせから選択されてよい。脂質は、リポソームの膜中に包埋されてよい。
【００３６】
化学療法剤の例には、ＢｉＣＮＵ、ブレオマイシン、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン（cisplatin, cisplatinum）、クロランブシル、２-クロロデオキシアデノシン、クラジラビン、シタラビン、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エトポシド、５-フルオロウラシル、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルフェラン、メトトレキサート、ミトラマイシン、ミトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、オキザリプラチン、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、ラルトリテクスド（raltritexe）、セムスチン、トムデックス、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、およびそれらの混合物が含まれる。
【００３７】
光増感剤の例には、フタロシアニン、ロドポルフィリン、ロドクロリン、メソロドクロリン（mesorhodochlorin）、フィロエリトリンおよびその誘導体、ポルフォリンおよびその誘導体、金属-ピロール（pyrollic）化合物、ならびにそれらの混合物が含まれる。
【００３８】
本発明の方法において有益に使用することができる細胞死誘発剤は、アポトーシス誘発剤、キナーゼ阻害剤、ミトコンドリア透過移行活性化因子の活性化因子、細胞死誘発タンパク質をコードするポリヌクレオチド、膜を横切るイオン輸送の活性化因子、細胞死阻害タンパク質をコードするポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチド、細胞死阻害タンパク質と相互作用するポリヌクレオチドおよび前記タンパク質を阻害するポリヌクレオチド、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択されてよい。
【００３９】
治療的な放射性核酸の例には、32P、89Sr、90Y、103Pd、125I、131I、137Cs、153Sm、186Re、188Re、192Ir、64Cu、67Cu、67Ga、86Y、105Rh、111In、114mIn、124I、149Pm、166Ho、169Yb、177Lu、211At、213Bi、225Aが含まれる。
【００４０】
前記治療的および診断的な化合物は、当業者に既知の方法により化合物Ｂと結合することができる。例えば、前記治療的または診断的な化合物がタンパク質である場合、任意に、臭化シアンまたは他の化学的もしくは物理的な方法により活性化した後、リジンまたはアルギニン残基を介して結合させることができる。前記化合物がホスファチジルエタノールアミンのような脂質である場合、当該分野で既知の方法を用いてアミノ基に結合され得る。前記化合物がポリヌクレオチドである場合、当該分野で既知の方法を用いて、例えばそのヒドロキシル基に結合され得る。前記化合物が放射性核種である場合、キレート化剤を化合物Ｂと結合させて選択した放射性核種をキレート化することにより、直接的または間接的に結合され得る。
【００４１】
前記複合体は、リン脂質を発現する細胞または細胞粒子の存在または非存在を検出するためにも使用されてよく、
a）認識可能な化合物Ａおよびアネキシンまたはアネキシン変異体を含んでなる少なくとも１の複合体を含む組成物を対象に投与することと；
b）化合物Ａを認識する化合物Ｂおよび診断的な薬剤を含んでなる少なくとも１の複合体を含む組成物を対象に投与することと；
c）光学的なイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、ＰＥＴイメージング、ＭＲＩイメージング、ＣＴイメージング、および超音波イメージングのような検出ステップを対象に行うことを含んでなる。
【００４２】
本発明は、上述した診断方法を行うのに適した診断キットにも関し、アネキシン変異体と親和性化合物Ａとの少なくとも１の複合体、任意に、検出可能な（レポーター）化合物と親和性化合物Ｂとの複合体、ならびに任意に、診断方法を行うために必要な希釈剤およびさらなる構成要素を含んでなる。好ましくは、前記アネキシン変異体の複合体および前記検出可能な化合物の複合体は別々に調製される。
【００４３】
本発明は、上述した治療方法を行うのに適した医薬キットにも関し、薬学的に許容可能な賦形剤と合わせた親和性化合物Ａとアネキシン変異体との少なくとも１の複合体、任意に、治療的な化合物と親和性化合物との複合体、ならびに任意に、治療方法を行うのに必要な希釈剤およびさらなる構成要素を含んでなる。好ましくは、前記アネキシン変異体の複合体および前記治療的な化合物の複合体は別々に調製される。
【００４４】
本発明は、腫瘍性の疾患、神経変性の疾患、循環器病、自己免疫疾患、および炎症性の疾患のような疾患の治療、診断、予防、および研究のための方法および組成物を提供する。前記方法は、アネキシンおよびアネキシン変異体を含んでなるターゲッティング複合体ならびに分子イメージング剤および薬学的な化合物を含んでなる治療的な複合体をそれぞれ対象に投与することを含む。
【００４５】
本発明は、アネキシンのＰＳ発現細胞に対する結合能力に関する。本発明は、疾患を診断および治療するためのプレターゲッティング方法におけるアネキシンの使用に関する。アネキシンは、肝臓、脾臓および腎臓、ならびに骨髄の細網内皮系により吸収されることが既知である。診断的な化合物および治療的な化合物と接合したアネキシンを注入することは、高いバックグラウンドシグナルおよび望ましくない毒性の副作用を結果として生じる。それ故、本発明は、アネキシンが、蛍光性の群、放射性核種、ＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤および超音波剤のような診断的な化合物とも、毒素、酵素、脂質、糖類、免疫グロブリンもしくはその断片、免疫複合体、化学療法化合物、光増感剤、放射性核種、細胞死誘発剤、細胞死阻害剤、線維素溶解性化合物のような治療的な化合物とも対象に投与する前に接合しない方法を提供する。代わりに、本発明は、アネキシンが認識可能な化合物Ａと結合する方法を提供し、ビオチン、複合ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、モルホリノ、ＰＮＡ、アプタマー、レセプターおよびレセプターリガンドならびに抗体を含んでなるが、これらに限定されない組から選択される。本発明は、アネキシンと認識可能な化合物Ａとの複合体を標的細胞に送達することにより、および続いて化合物Ａを認識する化合物Ｂと診断的な化合物または治療的な化合物との複合体を標的細胞に送達することにより、診断的または治療的な化合物を標的細胞に送達するための方法を提供する。前記接合されたアネキシンは、対象に投与される。一定時間後、例えば１時間〜２４時間後、化合物Ａに対して高い親和性を有する化合物Ｂとの診断的または治療的な複合体は、同じ対象に注入される。化合物Ｂは、化合物Ａと接合したアネキシンが細胞表面に結合する部位に集積する。
【００４６】
アネキシンは、構造的および機能的な特徴を共有するタンパク質の多重遺伝子ファミリーを構成する。アネキシンポリペプチドは、空隙でいわゆるアネキシン折り畳みを形成するドメインに組織化される（Gerke and Moss, Physiol. Rev. 82:331-71 (2002)）。前記ドメインはカルシウム結合部位を含み、リン脂質膜との相互作用が生じ得る。一度リン脂質表面に結合すると、アネキシンは、タンパク質−タンパク質相互作用を通して二次元格子を形成し得る（Oling et al., J. Mol. Biol. 304: 561-73 (2001)）。アネキシンの生理的な意義はあまり知られていないが、それらのリン脂質結合活性に関連すると考えられている。アネキシンはシグナル配列を有さず、それ故、細胞内である一定の役割を果たすと考えられる。アネキシンの細胞外局在化については報告されているが、これが細胞溶解のような選択的な過程または特異的な事象により起こるかどうかは知られていない。WO 2006/003488によると、アネキシンおよびアネキシン-Ｃｙｓ変異体は、細胞表面に発現したＰＳに結合した後、それら自身の内部移行を引き起こす。内部移行の現象は、プレターゲッティング方法の効果を減少させる。本発明は、標的細胞により内部移行されないアネキシンに関する。より内部移行されないアネキシンの変異体を見つけるために、内部移行のメカニズムは、その構造-機能の関連性について調べられた。内部移行は、リン脂質二重層上に二次元ネットワークを形成するアネキシン三量体の形成により引き起こされる（Kenis et al., J. Biol. Chem. 279:52623-9 (2004)）。前記アネキシン三量体は、アネキシン分子間の非共有結合性の相互作用により生じる。
【実施例】
【００４７】
例１：６２、６９、１００、１３７、１３８および１５９の位置の１以上のアミノ酸がアラニンおよびグリシンで置換されたアネキシンＡ５-２Ｄ変異体の製造
ヒトアネキシンＡ５ ｃＤＮＡは、当該分野で標準的な技術を用いて、健康なボランティアからの白血球ｃＤＮＡライブラリーから調製された。ｃＤＮＡ配列をコードするアミノ酸配列は、図１に示した。プライマーは、ＰＣＲ技術によりアネキシンＡ５を突然変異させるために設計され、結果として得られるｃＤＮＡは以下の置換を除いて図１のアミノ酸配列でコードされ、それはｃＤＮＡにおいて単独で行われるだけでなく、組み合わせても行われる：R62A、K69A、K100A、E137A、D138G、およびN159A。注釈は、アミノ酸に対して１文字コードを使用し、置換が起こるアミノ酸配列において数字で表した位置を使用し、数字の左は本来のアミノ酸を意味し、数字の右は置換を意味する。
【００４８】
アネキシンＡ５-２Ｄ ｃＤＮＡは、当該分野で既知の標準技術を用いて細菌性の発現ベクターへクローン化された。結果として得られる細菌性の発現ベクターで形質転換された大腸菌は、発酵槽中で培養された。細菌により産生されたアネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、当業者に既知の標準的なクロマトグラフィー技術を用いて大腸菌ライセートから単離および精製された。
【００４９】
精製されたアネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにおいて約３４ｋＤａの均一なバンドとして現れ、ＢｉａＣｏｒｅを用いたプラズモン表面共鳴技術により測定した場合、完全なカルシウム依存性ホスファチジルセリン結合活性を示した。
【００５０】
例２：６２、６９、１００、１３７、１３８および１５９の位置の１以上のアミノ酸がアラニンおよびグリシンで置換され、２位のグルタミンがシステインで置換された、アネキシンＡ５-２Ｄ変異体の製造
アネキシンＡ５-２Ｄ ｃＤＮＡは、本発明の実施例１で述べたように調製された。プライマーは、ＰＣＲ技術によりアネキシンＡ５-２Ｄ ｃＤＮＡを突然変異させるように設計され、結果として得られるｃＤＮＡは、２位のグルタミンがシステインで置換されていることを除いて、アネキシンＡ５-２Ｄのアミノ酸配列でコードされている。
【００５１】
精製されたアネキシンＡ５-２Ｄ-Ｃｙｓ２変異体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにおいて約３４ｋＤａの均一なバンドとして現れ、ＢｉａＣｏｒｅを用いてプラズモン表面共鳴により測定した場合、完全にカルシウム依存性のホスファチジルセリン結合活性を示した。
【００５２】
例３：６２、６９、１００、１３７、１３８および１５９の位置の１以上のアミノ酸がアラニンおよびグリシンで置換され、１６５位のグリシンがシステインで置換された、アネキシンＡ５-２Ｄ変異体の製造
アネキシンＡ５-２Ｄ ｃＤＮＡは、本発明の実施例１で述べたように調製された。プライマーは、ＰＣＲ技術によりアネキシンＡ５-２Ｄ ｃＤＮＡを突然変異させるように設計され、結果として得られるｃＤＮＡは、１６５位のグリシンがシステインで置換されていることを除いて、アネキシンＡ５-２Ｄのアミノ酸配列でコードされている。
【００５３】
精製されたアネキシンＡ５-２Ｄ-Ｃｙｓ１６５変異体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにおいて約３４ｋＤａの均一なバンドとして現れ、ＢｉａＣｏｒｅを用いてプラズモン表面共鳴技術により測定した場合、完全にカルシウム依存性のホスファチジルセリン結合活性を示した。
【００５４】
例４：６２、６９、１００、１３７、１３８および１５９の位置の１以上のアミノ酸がアラニンおよびグリシンで置換されたアネキシンＡ５-２Ｄのリン脂質二重層に対する結合
この例では、アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、アネキシンＡ５のようにリン脂質二重層のＰＳにカルシウム依存性に結合することができるが、リン脂質表面において二次元ネットワークを形成する能力を欠き、細胞に内部移行しないことを示す。
【００５５】
アネキシンＡ５-２ＤのＰＳを含むリン脂質二重層への結合は、楕円偏光法により研究された（Andree et al., J. Biol. Chem. 265:4923-4928 (1990)）。カルシウムの非存在下において、アネキシンＡ５-２Ｄ変異体はリン脂質表面に結合せず、カルシウム濃度の増大により、アネキシンＡ５のカルシウム依存性の結合等温線と同様の結合における増大が観察された。
【００５６】
アネキシンＡ５-２Ｄのリン脂質表面への結合は、電子顕微鏡により分析された（Mosser et al., J. Mol. Biol. 271:241-5 (1991)）。アネキシンＡ５と異なり、アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、規則正しい二次元ネットワークを形成しなかった。
【００５７】
ジャーカット細胞は、蛍光性のアネキシンＡ５-２Ｄまたは蛍光性のアネキシンＡ５、およびアポトーシスの刺激と共にインキュベートされた。前記細胞は、共焦点走査レーザー顕微鏡により、蛍光性のアネキシンＡ５-２Ｄまたは蛍光性のアネキシンＡ５の局在化について分析された（Kenis et al., J. Biol. Chem. 279:52623-9 (2004)）。アネキシンＡ５は、内部移行された。アネキシンＡ５-２Ｄは内部移行されなかったが、血漿膜に結合したままであった。
【００５８】
例５：６２、６９、１００、１３７、１３８および１５９の位置のアミノ酸がアラニンおよびグリシンで置換され、２位のグルタミンおよび３１５位のシステインがそれぞれシステインおよびセリンで置換されたアネキシンＡ５-２Ｄ変異体とマレイミド活性化ビオチンとの結合
アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、実施例２で述べたように調製された。アネキシンＡ５-２Ｄ変異体のＰＳ結合活性に影響を与えることなく、チオール化学を通してアネキシンＡ５-２Ｄ変異体に化合物が容易に結合することを可能にするために、システインは３１５位で除去され、２位に組み込まれた。
【００５９】
EZ-リンク PEO-マレイミド活性化ビオチン（Pierce）を、10 mMの濃度で、25 mM Hepes/NaOH, pH 7.0, 140 mM NaCl, 1 mM EDTAに溶解した。3.4 mg/mlのアネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、25 mM Hepes/NaOH, pH 7.0, 140 mM NaCl, 1 mM EDTAに透析した。200μlのビオチン溶液を1 ml アネキシンＡ５-２Ｄ変異体に添加した。混合物を37℃で120分間インキュベートし、その後25 mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 1 mM EDTAに透析した。
【００６０】
得られる接合体は、楕円偏光法によりそのＰＳ結合活性を分析され、アビジン（Pierce）を用いてビオチン基の到達性について試験された。ビオチン化されたアネキシンＡ５-２ＤはＰＳ結合性が損なわれず、アビジンは、リン脂質表面においてビオチン化されたアネキシンＡ５-２Ｄに容易に結合した。
【００６１】
例６：６２、６９、１００、１３７、１３８および１５９の位置のアミノ酸がアラニンおよびグリシンで置換され、２位のグルタミンおよび３１５位のシステインがそれぞれシステインおよびセリンで置換されたアネキシンＡ５-２Ｄ変異体とマレイミド活性化アビジンとの結合
アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、実施例２に記載したように調製された。アネキシンＡ５-２Ｄ変異体のＰＳ結合活性に影響を与えることなく、チオール化学を通してアネキシンＡ５-２Ｄ変異体に化合物が容易に結合することを可能にするために、システインは３１５位で除去され、２位に組み込まれた。
【００６２】
イムノピュア（Immunopure）アビジン（Pierce）を、8 mg/mlの濃度で、25 mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaClに溶解した。1 mgのSulfo-SMCC (Pierce)をアビジン溶液に加え、混合物を室温で60分間インキュベートした。過剰な架橋剤は、ＰＤ１０カラム（GE-アマシャム/ファルマシア）を用いたゲルろ過により除去した。マレイミド活性化アビジンを1 mg/mlのアネキシンＡ５-２Ｄ変異体に加え、25 mM Hepes/NaOH, pH 7.0, 140 mM NaCl, 1 mM EDTAに透析した。混合物を37℃で120分間インキュベートした。
【００６３】
アビジンとアネキシンＡ５-２Ｄ変異体との接合は、楕円偏光法により、ＰＳに対する結合能について試験された。前記接合体は、ＰＳ結合性を損なわなかった。
【００６４】
例７：アネキシンＡ５-２Ｄ変異体およびプレターゲッティングを用いてインビボで腫瘍を可視化する方法
２位または１６５位にシステインを有するアネキシンＡ５-２Ｄ変異体が設計され、それぞれ実施例２および３に示したように作られた。Ｃｙｓ-アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、実施例５に記載したように、マレイミド-ビオチンを用いてビオチン化された。
【００６５】
ビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄは、腫瘍を有するマウスに静脈内注射された。循環するビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄのレベルは、微速度の自発的なクリアランスまたは例えば静脈内投与されたアビジンを用いた強制的なクリアランスにより減少した。例えば蛍光性の化合物または放射性核種のような分子イメージングプローブに接合したストレプトアビジンが、静脈内に投与された。その後マウスは、蛍光プローブと接合したストレプトアビジンが使用された場合は全身の光学的なイメージャーを用いて、または放射性核種と接合したストレプトアビジンが使用された場合はSPECT、PET、SPECT/CTもしくはPET/CTを用いてイメージングが行われた。
【００６６】
この可視化の方法は、腫瘍および転位を局在化および定量化するため、ならびに抗腫瘍治療の効果を決定するために適用することができる。
【００６７】
例８：アネキシンＡ５-２Ｄ変異体およびプレターゲッティングを用いて、インビトロで不安定なアテローム硬化型のプラークを可視化する方法
２位または１６５位にシステインを有するアネキシンＡ５-２Ｄ変異体が設計され、実施例２および３にそれぞれ示したように作られた。Ｃｙｓ-アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、実施例５で述べたように、マレイミド-ビオチンを用いてビオチン化された。
【００６８】
ビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄは、アテローム硬化性の病変に罹患しているマウスに静脈投与された。循環しているビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄのレベルは、微速度の自発的なクリアランスまたは例えば静脈内投与されたアビジンを用いた強制的なクリアランスにより減少した。例えば蛍光性の化合物または放射性核種のような分子イメージングプローブに接合したストレプトアビジンが、静脈内に投与された。その後マウスは、蛍光プローブと接合したストレプトアビジンが使用された場合は全身の光学的なイメージャーを用いて、または放射性核種と接合したストレプトアビジンが使用された場合はSPECT、PET、SPECT/CTもしくはPET/CTを用いてイメージングが行われた。
【００６９】
この可視化の方法は、不安定なアテローム硬化性プラークを局在化するためおよび不安定なアテローム硬化性プラークを安定なアテローム硬化性プラークと区別することに対して適用することができる。前記可視化の方法は、不安定なアテローム硬化性プラークを安定化する薬剤の効果を決定するために適用され得る。
【００７０】
例９：アネキシンＡ５-２Ｄ変異体およびプレターゲッティングを用いた、インビボでの腫瘍の治療方法
２位または１６５位にシステインを有するアネキシンＡ５-２Ｄ変異体が設計され、実施例２および３にそれぞれ示したように作られた。Ｃｙｓ-アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、実施例５で述べたようにマレイミド-ビオチンを用いてビオチン化した。
【００７１】
ビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄは、腫瘍を有するマウスに静脈投与された。循環しているビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄのレベルは、微速度の自発的なクリアランスまたは例えば静脈内投与されたアビジンを用いた強制的なクリアランスにより減少した。例えば、ドキソルビシンおよびシスプラチンのような抗癌化合物と接合された、または例えばドキソルビシンおよびシスプラチンをカプセル化したリポソームのような抗癌化合物のキャリアと接合されたストレプトアビジンが静脈投与された。
【００７２】
このプレターゲッティング治療方法は、抗癌剤を腫瘍に局在性に送達するために適用することができる。
【００７３】
例１０：アネキシンＡ５-２Ｄ変異体およびプレターゲッティングを使用した、インビボでの不安定なアテローム硬化性プラークの治療方法
２位または１６５位にシステインを有するアネキシンＡ５-２Ｄ変異体が設計され、実施例２および３にそれぞれ示すように作られた。Ｃｙｓ-アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、実施例５で述べたように、マレイミド-ビオチンを用いてビオチン化された。
【００７４】
ビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄは、アテローム硬化性の病変に罹患しているマウスに静脈投与された。循環しているビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄのレベルは、微速度の自発的なクリアランスまたは例えば静脈内投与されたアビジンを用いた強制的なクリアランスにより減少した。例えば、スタチンおよび抗炎症性化合物のようなアテローム硬化性プラークを安定化する化合物と接合した、または例えばスタチンおよび抗炎症性化合物をカプセル化するリポソームのようなアテローム硬化性プラークを安定化する化合物のキャリアと接合したストレプトアビジンが静脈内投与された。
【００７５】
このプレターゲッティング治療方法は、アテローム硬化性プラークを安定化する化合物をアテローム硬化性プラークに対して局在性に送達するために適用することができる。
【００７６】
全ての実施例、開示されている方法および／または組成物、およびここで権利請求されているものは、本発明の開示を考慮に入れて、必要以上の実験をすることなく作られ、行うことができる。一方、本発明の方法および組成物は、好ましい実施形態の見地から記載されており、本発明の概念、精神および範囲から離れることなく、ここで述べられている方法およびまたは組成物ならびに方法のステップまたはステップの配列においてバリエーションが適用されてよいことは、当業者に自明であろう。ここで述べられている化合物を含む組成物が、構造的および機能的に関連する化合物を含む組成物で置換されてよいことは、当業者に自明であろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、アネキシンの分野に関する。より具体的には、三量体および二次元ネットワークを形成しない新規のアネキシン、アネキシンの変異体、およびその誘導体を用いて特定の標的に対して化合物を送達することにより、対象を治療および診断するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、リン脂質分子およびいくつかのタンパク質分子の二重層からなる形質膜（ＰＭ）により包まれている。種々のリン脂質分子は、二重層の基礎的要素を形成する。リン脂質分子は、二重層の２つのリーフレットにわたって非対称的に分布する。例えば、ホスファチジルコリンは両方の層に存在する一方、スフィンゴミエリンは外界に面する外側のリーフレットにおいてのみ見られる。一方、ホスファチジルセリン（ＰＳ）のようなアミノリン脂質は、細胞の細胞質ゾルに面する内部のリーフレットに主に存在する（Zwaal and Schroit, Blood 89:1121-32 (1997)）。アミノリン脂質転位酵素は、ＰＳを形質膜の外側から内側の層またはリーフレットに輸送し、ＰＳの非対称的な分布を作る。ＰＭの非対称的な構造は、生きている細胞の特徴である。それらは、ＰＭにおけるリン脂質種の不均一な分布を作り、且つ維持するためにエネルギーを費やす。
【０００３】
細胞は、ある一定の状況下でＰＭのリン脂質構造を変化させることができ、細胞の活性化および乱れを引き起こす。プログラム細胞死（ＰＣＤ）は、ＰＭの外側のリーフレットにおけるＰＳの出現を伴う（Fadok et al., J. Immunol. 148:2207-16 (1992)）。形態学および生化学に基づいて、少なくとも４の型のＰＣＤが同定されている：（１）アポトーシス、（２）アポトーシス様ＰＣＤ、（３）ネクローシス様ＰＣＤ、およびネクローシス。各型は、ＰＳの細胞表面の外側の層への露出により特徴付けられるＰＭの非対称的な変化を伴う。ＰＭの外側の層におけるＰＳの露出は、細胞の種々の活性化および乱れた状態のよい指標となる。しかしながら、ＰＳの露出は、もっぱら、結果的に細胞死になる細胞プロセスに付随しない。一過性且つ可逆的なＰＳの露出は、いくつかの細胞型に対して報告されており、活性化Ｂ細胞、シンシチウムを形成するための未分化筋細胞、クラミジア感染細胞、腫瘍脈管構造の内皮細胞（米国特許第6,312,694号）、および貪食マクロファージ（Kenis et al. J. Biol. Chem. 2004 279: 52623-9）が含まれる。加えて、いくつかの細胞プロセスおよび条件は、ＰＭの外側のリーフレットにおいてＰＳの発現を伴うことが見出されている。これらには、血小板活性化、赤血球成熟、免疫系の刺激、筋細胞シンチウムの形成、腫瘍における新血管形成（米国特許第6,312,694号）、および腫瘍増殖（Rao et al., Thromb. Res. 67:517-31 (1992)）が含まれる。
【０００４】
加えて、細胞は、その表面からそれら自身の部分を散らすことができ、結果として膜に包まれたミクロ粒子を生じる。これらのミクロ粒子は、膜の外側の層に露出したＰＳのようなアミノリン脂質を有する。これらのミクロ粒子は、感染症、ＡＩＤＳ、アテローム性動脈硬化症のような疾患に関連する。それ故、細胞表面におけるアミノリン脂質は、種々の活性化および乱された細胞の状態の指標となる。さらに、露出したアミノリン脂質を示すミクロ粒子は、離れた細胞の活性化および乱れを反映する。それ故、ＰＭの表面におけるリン脂質は、疾患の研究、診断、予防および治療を含む種々の目的に対する魅力的な標的を構築する。好ましくは、ＰＭの外側のリーフレットにおけるＰＳは、疾患の研究、診断、予防および治療に対する標的を構築する。
【０００５】
疾患の薬理学的および遺伝的な治療は、疾患を有する細胞に対する薬理学的に活性のある化合物の送達に基づき、前記化合物は、好ましくは細胞内で作用する。現在の治療は、薬物の全身性の送達を利用し、所望の標的に到達する前に薬物は全身を循環する。この薬物送達の方法は、化合物の全身性の希釈を結果として生じる。結果として、治療的な効果を達成するためにはより高い濃度の薬物が必要とされる。これは、望ましくない毒性の副作用および薬物のコストの増大を伴う。
【０００６】
これらの問題に対する解決策は、標的化薬物送達システムにより提供される。ターゲッティング薬剤は、薬物に直接的または間接的に結合し、疾患を有する細胞が集積している場所に薬物を導く。
【０００７】
最近、我々は、ターゲッティングおよび細胞流入（cell-entry）剤としてのアネキシン、その誘導体およびアネキシン-Ｃｙｓ変異体ならびに治療的および診断的な適用に対するそれらの使用について述べている（WO 2006/003488, 2006年1月12日に公開）。アネキシンの主な標的はホスファチジルセリン（ＰＳ）であり、細胞により露出されてプログラム細胞死を実行し、代謝ストレスのようなストレスがかかる。アネキシン、誘導体およびアネキシンＣｙｓ変異体は、WO 2006/003488において述べられているように、ＰＳが露出した細胞表面に結合し、続いて内部移行する。前記内部移行は、表面に結合したアネキシンの枯渇を結果として生じる。この現象は、プレターゲッティングの概念を利用する治療および診断の方法におけるアネキシンの使用を妨げる。
【０００８】
プレターゲッティングは、バックグラウンドシグナルおよび全身性の毒性負荷を減少させるために、診断を目的としたレポーティング化合物および／または治療的を目的とした薬剤を、疾患を有する組織に対して多ステップの方法でターゲッティングする方法である。前記プレターゲッティングの概念は、相互に高い親和性を有する２つの化合物ＡおよびＢを用いる。化合物Ａはターゲッティング機能を有し、化合物Ｂはレポーターおよび／または治療的な機能を有する。第一に、ターゲッティング機能を有する化合物Ａを対象に投与する。一定時間後、循環している化合物Ａが十分に除去された後、レポーターおよび／または治療的な薬剤を有する化合物Ｂを対象に与える。後者の化合物は、そのターゲッティング機能により化合物Ａが保持される部位に集積する。この方法は、望ましい効果を得るために投与される必要がある化合物Ｂの量を減少させる。さらに、レポーターおよび／または治療的な薬剤が化合物Ａに直接結合した場合、化合物Ａに関連するバックグラウンドシグナルおよび望ましくない毒性の副作用を回避するであろう。
【０００９】
相互に高い親和性を有し、且つプレターゲッティングに適したＡおよびＢの化合物の組み合わせの例には、ストレプトアビジン／アビジンおよびビオチンの組み合わせ、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドの組み合わせ、モルホリノのような相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの類似体（デオキシリボース-ホスホジエステル鎖の代わりにモルホリノ-ホスポロジイミデート鎖を含む合成オリゴヌクレオチド類似体）、ペプチド核酸（デオキシリボース-ホスホジエステル鎖の代わりにＮ-アミノエチル-グリシン鎖を含む合成オリゴヌクレオチド類似体，ＰＮＡ）およびアプタマー（特異的に結合するオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド）、抗体およびハプテンの組み合わせ、ならびに受容体およびリガンドの組み合わせが含まれる。これらの組み合わせは、プレターゲッティングの方法を通して癌のイメージングおよび治療のための放射性核種の送達において使用される（Sharkey et al, Clin. Cancer Res. 2005, 11:7109-21）。
【００１０】
プレターゲッティングの方法を首尾よく実行するために必要なことは、化合物Ａの化合物Ｂに対する到達性である。標的細胞による化合物Ａの内部移行は、この方法の有効性を低下させる。
【００１１】
特許出願WO 2006/003488は、アネキシン、その誘導体、およびアネキシン-Ｃｙｓ変異体がその表面にＰＳを露出する細胞により内部移行されることを述べている。内部移行のメカニズムは、アネキシン三量体の形成および大きな二次元ネットワークにおけるアネキシン三量体の組織化に基づく（Kenis et al. J. Biol. Chem. 2004 279: 52623-9）。このメカニズムは、アネキシン、その誘導体、およびアネキシン-Ｃｙｓ変異体のプレターゲッティングの方法における化合物Ａのターゲッティング部分としての効率的な使用を低下させる。
【００１２】
Mira et al., J. Biol. Chem. 1997, 272: 10474-82は、アネキシン変異体Ｍ１〜Ｍ４について述べており、細胞質ゾルのホスホリパーゼＡ２の阻害におけるＣａ２＋結合およびその効果に影響を与えることを述べている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の１つの実施形態によると、疾患を診断および治療するためのプレターゲッティング方法に適したアネキシン変異体が提供される。これらのアネキシン変異体は、十分な親和性でＰＳと結合し、細胞の表面において三量体および二次元ネットワークを形成することができず、それ故、それら自身の内部移行を誘発しない。
【００１４】
本発明のもう１つの実施形態は、プレターゲッティング方法に対して親和性の化合物Ａで誘導体化されたアネキシンおよびその変異体に関する。そのような親和性化合物には、ビオチン、１以上のビオチン群を含有する化合物、ストレプトアビジン、アビジン、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、モルホリノ、ＰＮＡ’ｓ、アプタマー、レセプター、レセプターに対して高い親和性を有する化合物およびグロブリンまたはそれらの部分が含まれる。本発明において、親和性化合物Ａは、認識可能な化合物（Ａ）、または化合物Ａとして同じ意味で使用される。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態は、システイン残基との接合を介して親和性化合物Ａで誘導体化される、特許出願WO 2006/003488によるアネキシン-Ｃｙｓ変異体、アネキシンおよびその誘導体を包含する。
【００１６】
本発明の１つの実施形態は、アネキシン誘導体および複合体と組み合わせて、蛍光化合物、放射性核種、ＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤、細胞分裂停止剤、ならびにサイトカイン、補体因子、毒素、および免疫グロブリンを含む治療的な生物学的製剤と接合された、親和性化合物Ｂの使用に関する。親和性化合物Ｂは、本発明の他の実施形態の親和性化合物Ａに対して高い親和性を有する。本発明において、親和性化合物Ｂは、化合物Ａを認識する化合物（Ｂ）として、または化合物Ｂとして同じ意味で使用される。
【００１７】
本発明の１つの実施形態は、上述した親和性化合物Ａとアネキシン誘導体の少なくとも１の複合体および任意に少なくとも１の薬学的に許容可能な賦形剤を含むキットである。
【００１８】
本発明のもう１つの実施形態は、薬学的化合物を標的細胞に送達するための方法に関し、第１に上述した組成物の複合体をターゲッティングすること、第２に上述した組成物の治療的な複合体を投与することを含む。より具体的には、この実施形態は、疾患を治療または予防する方法を含み、前記薬学的化合物は、疾患を治療または予防するのに効果的な治療的な化合物である。
【００１９】
本発明の１つの実施形態は、標的細胞に対して診断的な化合物を送達するための方法に関し、第１に上述した組成物のターゲッティング複合体を投与すること、第２に上述した組成物の診断的な複合体を投与することを含む。より具体的には、この実施形態は、疾患を診断することおよび治療の有効性を決定することを含んでなり、前記診断的な化合物は、光学的なイメージング、核イメージング、ＭＲＩ、ＣＴおよび超音波を含んでなるイメージング様式により検出することができる分子イメージング化合物である。
【００２０】
本発明をより理解するために、他のおよびさらなる目的と共に、付随する図と組み合わせて以下の記述を参照されたく、その範囲は付属の特許請求の範囲に示す。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
本発明は、部分的に、アネキシン分子間の分子間相互作用に関与するアミノ酸を同定するための定方向の検索に基づく。分子モデリングおよびタンパク質データベース（ＰＤＢ、１ＡＶＲおよびＡＮＸ）から入手可能な結晶構造のドッキングは、三量体形成に関与するアミノ酸を明らかにした。これらのアミノ酸は、らせんIＡ、IＤ、IIＡ、IIＤ、IIIＣ、IIIＤおよびIVＥならびにらせんIＣとIＤ、IIＥとIIIＡ、IIIＣとIIIＤ、IIIＤとIIIＥ、IVＡとIVＢを結合する配列において見られる（アネキシンＡ５分子におけるこれらのらせんの所在について、Huber et al. EMBO J. 12:3867-74 (1990)を参照されたい）。本発明の１つの実施形態のアネキシン変異体は、らせんIＡ、IＤ、IIＡ、IIＤ、IIIＣ、IIIＤおよびIVＥ、ならびにらせんIＣとIＤ、IIＥとIIIＡ、IIIＣとIIIＤ、IIIＤとIIIＥ、IVＡとIVＢを結合する配列において置換された１以上のアミノ酸を有し、細胞の表面において三量体および二次元ネットワークを形成するそれらの能力を改善し、結果としてそれらの細胞への内部移行を改善する。アネキシン変異体は、細胞の表面により長く残り、それ故プレターゲッティング法に対して適している。
【００２２】
本発明は、一般的に、a）少なくとも１のリン脂質、特にホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合し、且つb）細胞内へ内部移行しないアネキシン変異体に関する。「アネキシン」という用語は、リン脂質、特にホスファチジルセリンに結合することができるタンパク質を意味し、いわゆるアネキシンファミリーの一員である。前記ファミリーは、多くのメンバーを含み；それについてならびにタンパク質および核酸配列についての情報は、例えばhttp://snoops.bch.ed.ac.uk/annexins/seq/search.phpで見ることができる。例によると、配列番号１のアミノ酸配列を有するアネキシンＡ５についてここでは言及されているが、他のアネキシンも同様に本発明のアネキシン変異体を作るためおよび使用するために使用することができる。図２は、ヒトアネキシンＡ１〜Ａ１１およびＡ１３のアラインメントを含む。Ａ１、Ａ６、Ａ７およびＡ１１のようないくつかのアネキシンは、Ｎ末端に長い伸長を有する。これらの部分は図２には含まれず、本発明の目的に対して関連性があまりないと考えられている。以下において、アネキシンＡ５のアミノ酸配列および位置について言及されているが、図２のアラインメントまたは図２に示されていないアネキシンの対応するアラインメントを用いて見出だされる対応する位置を選択することにより、Ａ５にあてはまるものは他のアネキシン、特にヒトアネキシンにもあてはまる。
【００２３】
本発明による特別なアネキシン変異体は、図１によるアミノ酸配列を有し（配列番号１）、細胞への内部移行を阻害するために修飾され、上述したらせんおよび結合配列内の１以上のアミノ酸は異なるアミノ酸により置換される。これらのアミノ酸は、アネキシンＡ５の１６〜２９、５９〜７４、８８〜１０２、１３５〜１４５、１５６〜１６９、２０２〜２３１、２５９〜２６６、および３０５〜３１７の位置にあり、これらの位置は配列番号１および図２において下線を引く。アネキシン変異体は１以上のこれらの修飾を含み、細胞に内部移行しないというアネキシンの特徴は満たされていると考えられる。それ故、本発明は、a）少なくとも１のリン脂質に結合し、且つb）上述したような１以上のアミノ酸修飾を含むアネキシン変異体も含んでなる。
【００２４】
好ましい修飾は、置換、特に無極性のアミノ酸による極性のアミノ酸の置換である。それ故、置換に対して好ましいアミノ酸には、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）が含まれる。それらは、例えば、アラニン（Ａ）もしくはグリシン（Ｇ）、または他のアネキシンの対応する位置にある無極性アミノ酸により置換されてよい（図２を参照されたい）。置換されるアミノ酸の適切な例には、Ｅ２１、Ｋ２５（例えばＧ、Ｔによる）、Ｒ６２（例えばＧ、Ａ）、Ｄ６３（例えばＧ、Ａ、Ｐ）、Ｋ６９、Ｄ９１、Ｋ９６、Ｈ９７、Ｋ１００、Ｅ１３７（例えばＡ、Ｇ、Ｖ）、Ｄ１３８、Ｄ１３９、Ｎ１５９（例えばＡ、Ｇ、Ｓ）、Ｒ１６０、Ｒ２０６、Ｋ２０７、Ｑ２１９、Ｄ２２５、Ｒ２２６、Ｄ２６４、Ｋ３０８、Ｋ３０９が含まれる。位置Ｅ７１、Ｄ１４３、Ｅ２２７およびＤ３０２における修飾Ｍ１〜Ｍ４は、本発明によるとあまり好ましくない。
【００２５】
細胞の部位におけるアネキシンの三量体化をさらに減少させるために、異なる領域に少なくとも２、または少なくとも３の置換、例えば、Ｒ６２Ａ＋Ｅ１３７ＧまたはＫ６９Ａ＋Ｋ１００Ａ＋Ｎ１５９Ｓ等を有することが好ましい。
【００２６】
アネキシン変異体は、１以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加をさらに含んでよく、前記アミノ酸の置換、欠失、または付加は、アネキシン変異体が少なくとも１のリン脂質および少なくとも１の認識可能な化合物Ａに結合する能力に実質的に影響を与えず、前記アミノ酸の置換、欠失、または付加は、認識可能な化合物Ａの細胞への内部移行が阻害されることに実質的に影響を与えない。
【００２７】
前記置換は、アネキシンがリン脂質に十分に結合するようになされるべきである。十分な結合とは、Ｃａ２＋イオンの存在下において約１０−６Ｍ以下の解離定数であることを意味する。
【００２８】
本発明はさらに、上記で定義したような認識可能な化合物Ａと結合したアネキシン分子または変異体に関し、前記アネキシン変異体は、標的細胞により内部移行されない。前記認識可能な化合物Ａは、例えば、ビオチンまたは複数のビオチンの複合体であってよい。他の適切な例には、アビジンもしくはストレプトアビジン、オリゴヌクレオチドもしくはモルホリノ化合物の形態のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド類似体またはＰＮＡまたはアプタマーが含まれる。
【００２９】
もう１つの実施形態において、前記認識可能な化合物Ａは、レセプターもしくはその一部、またはレセプターリガンドもしくはその一部である。認識可能な化合物Ａの他の例には、抗体もしくはその断片、例えばラクダ様の起源に由来する切断された抗体であるナノ体（nanobody）、または抗原が含まれる。
【００３０】
認識可能な化合物は、それ自体既知の方法によりアネキシンと結合させることができる。１つの方法は、前記認識可能な化合物がおそらく誘導体化された形態である特定のアミノ酸に共有結合的に結合することにある。特に適しているのは、例えばビオチンの場合、アネキシンのシステイン残基に対する結合であり、マレイミド基で誘導体化され得る。アネキシンの機能的な性質を妨げないために、認識可能な化合物と結合するアミノ酸は、アネキシン分子の凹面側に位置する。配列番号１においてイタリックのアミノ酸記号で表されている。さらに、これらの位置は、アネキシンの三量体化および内部移行を妨げるために上記選択された領域に位置するか、または位置しなくてよい。それ故、好ましい位置は、配列番号１において太字のイタリックで示した位置であり、すなわち、アネキシンＡ５の配列１〜１５、４６〜５８、８６〜８７、１１８〜１３４、（１７０）、２４５〜２４８および２８０〜２９４ならびに他のアネキシンの対応する配列（図２参照）であるが、下線を引いたイタリックの位置（１６〜１９、２４、２８、５９〜６４、８８〜８９、１３５、１５７〜１６９、２０３〜２１９）もシステイン残基を導入するために使用することができる。
【００３１】
システイン残基はこれらの配列の外側に天然に存在することがより好ましく、特に、三量体化を妨げる目的で本発明によりアミノ酸が置換される部分に存在するものが他のアミノ酸で置換されることが好ましい。そのような他のアミノ酸は、Ｇ、ＡまたはＳのような中性の小さなアミノ酸であるか、または、もう１つのアネキシンの同じ位置に存在するアミノ酸であってよい。例えば、アネキシンＡ４のＣ１０７はＶまたはＡで適切に置換されてよく、アネキシンＡ３のＣ２０１（および多くの他のアネキシンにおける対応物）はＧまたはＡで置換されてよく、アネキシンＡ５のＣ３１５（および多くの他のアネキシンにおける対応物）はＶ、ＡまたはＳで置換されてよい。アネキシンＡ８のＣ２９２は、誘導体化に適した位置にあるため置換される必要がない。前記アミノ酸置換は、当業者に周知の組み換え技術により行うことができ、以下の実施例において示す。
【００３２】
本発明は、１のアミノ酸の位置１〜１９、２４、２８、４６〜６４、８６〜８９、１１８〜１３５、１４９〜１５０、１５７〜１７０、２０３〜２１９、２４５〜２４８および２８０〜２９４においてシステイン残基を含み、これらの位置の外側にはシステイン残基を含まず、さらに、位置１６〜２９、５９〜７４、８８〜１０２、１３５〜１４５、１５６〜１６９、２０２〜２３１、２５９〜２６６および３０５〜３１７におけるＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓの１以上のアミノ酸の、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒ、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＳｅｒによる置換を含み；例えば図２に示すように、他のアネキシンにおける対応するアミノ酸の位置に当てはまる。アネキシンは、タンパク質自体、あるいはスペーサーおよび／または認識可能な化合物との接合体であってよい。前記システイン残基は、例えば認識可能な群（Ａ）で置換されてよい。
【００３３】
アネキシン変異体と認識可能な化合物Ａとの複合体は、薬剤または診断薬を特定の部位、特にＰＳを露出する細胞にターゲティングするための治療方法または診断方法において使用することができる。そのような方法において、アネキシン変異体と認識可能な化合物Ａとの複合体を含む組成物は、そのような治療または診断方法が意図される対象に最初に投与され、化合物Ａを認識し、結合する化合物Ｂおよび診断的または治療的な化合物を含んでなる少なくとも１の複合体を含む組成物が続いて前記対象に投与される。化合物Ｂは、特に、化合物Ａの特異的な対応物であり、例えば、化合物Ａがビオチンである場合、ストレプトアビジンまたはアビジンである。同様に、化合物Ｂは、特に化合物Ａがストレプトアビジンまたはアビジンである場合、ビオチンまたは複数のビオチンの複合体であってよい。化合物Ｂは、オリゴヌクレオチド、モルホリノ、ＰＮＡまたはアプタマーであってもよく、上述したアネキシン分子に結合するオリゴヌクレオチド、モルホリノ、ＰＮＡまたはアプタマー対応物に対して高い親和性を有する。レセプターまたはその一部であってもよく、化合物Ａはレセプターリガンドであり、逆も同じである。化合物は、化合物Ａを抗体とする抗原またはその断片であってもよく、逆もまた同じである。
【００３４】
本発明の診断方法において使用することができる診断薬は、蛍光性の群、放射性核種、ＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤、超音波剤、およびそれらの組み合わせから選択されてよい。蛍光性の群の適切な例は、フルオレセイン、アレキサス（Alexas）、フィコエリトリン、Ｃｙ-化合物、ナノ結晶およびそれらの組み合わせである。放射性核種の適切な例には、炭素-１１、フッ素-１８、インジウム-１１１、ヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、窒素-１３、酸素-１５、テクネチウム-９９ｍ、ジルコニウム-８９、Ｇａ-６７、Ｇａ-６８、Ｃｕ-６４およびそれらの組み合わせが含まれ、化合物Ｂに結合する適切な分子または化合物Ｂ自体に組み込まれる。ＭＲＩ造影剤は、ガドリニウム、磁気粒子および常磁性粒子から選択されてよい。
【００３５】
本発明の治療方法において使用することができる治療的な化合物は、例えば、毒素、酵素、酵素阻害剤、脂質、糖類、免疫グロブリンまたはその断片、免疫複合体、化学療法化合物、光増感剤、放射性核種、細胞死誘発剤、細胞死阻害剤、線維素溶解性化合物、およびそれらの組み合わせであってよい。前記毒素は、Ｄｔ、ＰＥ，Ｐ３８、Ｐ４０、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（gelonin）、シュードモナス、外毒素、赤痢菌毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（pokeweed antiviral protein）、およびそれらの組み合わせから選択されてよい。化合物Ｂと結合することができる酵素の例には、ペルオキシダーゼ、アルカラーゼ、カスパーゼ、およびそれらの組み合わせが含まれる。脂質は、例えば、リン脂質、脂肪酸、テルペン、ステロイド、およびそれらの組み合わせから選択されてよい。脂質は、リポソームの膜中に包埋されてよい。
【００３６】
化学療法剤の例には、ＢｉＣＮＵ、ブレオマイシン、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン（cisplatin, cisplatinum）、クロランブシル、２-クロロデオキシアデノシン、クラジラビン、シタラビン、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エトポシド、５-フルオロウラシル、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルフェラン、メトトレキサート、ミトラマイシン、ミトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、オキザリプラチン、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、ラルトリテクスド（raltritexe）、セムスチン、トムデックス、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、およびそれらの混合物が含まれる。
【００３７】
光増感剤の例には、フタロシアニン、ロドポルフィリン、ロドクロリン、メソロドクロリン（mesorhodochlorin）、フィロエリトリンおよびその誘導体、ポルフォリンおよびその誘導体、金属-ピロール（pyrollic）化合物、ならびにそれらの混合物が含まれる。
【００３８】
本発明の方法において有益に使用することができる細胞死誘発剤は、アポトーシス誘発剤、キナーゼ阻害剤、ミトコンドリア透過移行活性化因子の活性化因子、細胞死誘発タンパク質をコードするポリヌクレオチド、膜を横切るイオン輸送の活性化因子、細胞死阻害タンパク質をコードするポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチド、細胞死阻害タンパク質と相互作用するポリヌクレオチドおよび前記タンパク質を阻害するポリヌクレオチド、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択されてよい。
【００３９】
治療的な放射性核酸の例には、32P、89Sr、90Y、103Pd、125I、131I、137Cs、153Sm、186Re、188Re、192Ir、64Cu、67Cu、67Ga、86Y、105Rh、111In、114mIn、124I、149Pm、166Ho、169Yb、177Lu、211At、213Bi、225Aが含まれる。
【００４０】
前記治療的および診断的な化合物は、当業者に既知の方法により化合物Ｂと結合することができる。例えば、前記治療的または診断的な化合物がタンパク質である場合、任意に、臭化シアンまたは他の化学的もしくは物理的な方法により活性化した後、リジンまたはアルギニン残基を介して結合させることができる。前記化合物がホスファチジルエタノールアミンのような脂質である場合、当該分野で既知の方法を用いてアミノ基に結合され得る。前記化合物がポリヌクレオチドである場合、当該分野で既知の方法を用いて、例えばそのヒドロキシル基に結合され得る。前記化合物が放射性核種である場合、キレート化剤を化合物Ｂと結合させて選択した放射性核種をキレート化することにより、直接的または間接的に結合され得る。
【００４１】
前記複合体は、リン脂質を発現する細胞または細胞粒子の存在または非存在を検出するためにも使用されてよく、
a）認識可能な化合物Ａおよびアネキシンまたはアネキシン変異体を含んでなる少なくとも１の複合体を含む組成物を対象に投与することと；
b）化合物Ａを認識する化合物Ｂおよび診断的な薬剤を含んでなる少なくとも１の複合体を含む組成物を対象に投与することと；
c）光学的なイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、ＰＥＴイメージング、ＭＲＩイメージング、ＣＴイメージング、および超音波イメージングのような検出ステップを対象に行うことを含んでなる。
【００４２】
本発明は、上述した診断方法を行うのに適した診断キットにも関し、アネキシン変異体と親和性化合物Ａとの少なくとも１の複合体、任意に、検出可能な（レポーター）化合物と親和性化合物Ｂとの複合体、ならびに任意に、診断方法を行うために必要な希釈剤およびさらなる構成要素を含んでなる。好ましくは、前記アネキシン変異体の複合体および前記検出可能な化合物の複合体は別々に調製される。
【００４３】
本発明は、上述した治療方法を行うのに適した医薬キットにも関し、薬学的に許容可能な賦形剤と合わせた親和性化合物Ａとアネキシン変異体との少なくとも１の複合体、任意に、治療的な化合物と親和性化合物との複合体、ならびに任意に、治療方法を行うのに必要な希釈剤およびさらなる構成要素を含んでなる。好ましくは、前記アネキシン変異体の複合体および前記治療的な化合物の複合体は別々に調製される。
【００４４】
本発明は、腫瘍性の疾患、神経変性の疾患、循環器病、自己免疫疾患、および炎症性の疾患のような疾患の治療、診断、予防、および研究のための方法および組成物を提供する。前記方法は、アネキシンおよびアネキシン変異体を含んでなるターゲッティング複合体ならびに分子イメージング剤および薬学的な化合物を含んでなる治療的な複合体をそれぞれ対象に投与することを含む。
【００４５】
本発明は、アネキシンのＰＳ発現細胞に対する結合能力に関する。本発明は、疾患を診断および治療するためのプレターゲッティング方法におけるアネキシンの使用に関する。アネキシンは、肝臓、脾臓および腎臓、ならびに骨髄の細網内皮系により吸収されることが既知である。診断的な化合物および治療的な化合物と接合したアネキシンを注入することは、高いバックグラウンドシグナルおよび望ましくない毒性の副作用を結果として生じる。それ故、本発明は、アネキシンが、蛍光性の群、放射性核種、ＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤および超音波剤のような診断的な化合物とも、毒素、酵素、脂質、糖類、免疫グロブリンもしくはその断片、免疫複合体、化学療法化合物、光増感剤、放射性核種、細胞死誘発剤、細胞死阻害剤、線維素溶解性化合物のような治療的な化合物とも対象に投与する前に接合しない方法を提供する。代わりに、本発明は、アネキシンが認識可能な化合物Ａと結合する方法を提供し、ビオチン、複合ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、モルホリノ、ＰＮＡ、アプタマー、レセプターおよびレセプターリガンドならびに抗体を含んでなるが、これらに限定されない組から選択される。本発明は、アネキシンと認識可能な化合物Ａとの複合体を標的細胞に送達することにより、および続いて化合物Ａを認識する化合物Ｂと診断的な化合物または治療的な化合物との複合体を標的細胞に送達することにより、診断的または治療的な化合物を標的細胞に送達するための方法を提供する。前記接合されたアネキシンは、対象に投与される。一定時間後、例えば１時間〜２４時間後、化合物Ａに対して高い親和性を有する化合物Ｂとの診断的または治療的な複合体は、同じ対象に注入される。化合物Ｂは、化合物Ａと接合したアネキシンが細胞表面に結合する部位に集積する。
【００４６】
アネキシンは、構造的および機能的な特徴を共有するタンパク質の多重遺伝子ファミリーを構成する。アネキシンポリペプチドは、空隙でいわゆるアネキシン折り畳みを形成するドメインに組織化される（Gerke and Moss, Physiol. Rev. 82:331-71 (2002)）。前記ドメインはカルシウム結合部位を含み、リン脂質膜との相互作用が生じ得る。一度リン脂質表面に結合すると、アネキシンは、タンパク質−タンパク質相互作用を通して二次元格子を形成し得る（Oling et al., J. Mol. Biol. 304: 561-73 (2001)）。アネキシンの生理的な意義はあまり知られていないが、それらのリン脂質結合活性に関連すると考えられている。アネキシンはシグナル配列を有さず、それ故、細胞内である一定の役割を果たすと考えられる。アネキシンの細胞外局在化については報告されているが、これが細胞溶解のような選択的な過程または特異的な事象により起こるかどうかは知られていない。WO 2006/003488によると、アネキシンおよびアネキシン-Ｃｙｓ変異体は、細胞表面に発現したＰＳに結合した後、それら自身の内部移行を引き起こす。内部移行の現象は、プレターゲッティング方法の効果を減少させる。本発明は、標的細胞により内部移行されないアネキシンに関する。より内部移行されないアネキシンの変異体を見つけるために、内部移行のメカニズムは、その構造-機能の関連性について調べられた。内部移行は、リン脂質二重層上に二次元ネットワークを形成するアネキシン三量体の形成により引き起こされる（Kenis et al., J. Biol. Chem. 279:52623-9 (2004)）。前記アネキシン三量体は、アネキシン分子間の非共有結合性の相互作用により生じる。
【実施例】
【００４７】
例１：６２、６９、１００、１３７、１３８および１５９の位置の１以上のアミノ酸がアラニンおよびグリシンで置換されたアネキシンＡ５-２Ｄ変異体の製造
ヒトアネキシンＡ５ ｃＤＮＡは、当該分野で標準的な技術を用いて、健康なボランティアからの白血球ｃＤＮＡライブラリーから調製された。ｃＤＮＡ配列をコードするアミノ酸配列は、図１に示した。プライマーは、ＰＣＲ技術によりアネキシンＡ５を突然変異させるために設計され、結果として得られるｃＤＮＡは以下の置換を除いて図１のアミノ酸配列でコードされ、それはｃＤＮＡにおいて単独で行われるだけでなく、組み合わせても行われる：R62A、K69A、K100A、E137A、D138G、およびN159A。注釈は、アミノ酸に対して１文字コードを使用し、置換が起こるアミノ酸配列において数字で表した位置を使用し、数字の左は本来のアミノ酸を意味し、数字の右は置換を意味する。
【００４８】
アネキシンＡ５-２Ｄ ｃＤＮＡは、当該分野で既知の標準技術を用いて細菌性の発現ベクターへクローン化された。結果として得られる細菌性の発現ベクターで形質転換された大腸菌は、発酵槽中で培養された。細菌により産生されたアネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、当業者に既知の標準的なクロマトグラフィー技術を用いて大腸菌ライセートから単離および精製された。
【００４９】
精製されたアネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにおいて約３４ｋＤａの均一なバンドとして現れ、ＢｉａＣｏｒｅを用いたプラズモン表面共鳴技術により測定した場合、完全なカルシウム依存性ホスファチジルセリン結合活性を示した。
【００５０】
例２：６２、６９、１００、１３７、１３８および１５９の位置の１以上のアミノ酸がアラニンおよびグリシンで置換され、２位のグルタミンがシステインで置換された、アネキシンＡ５-２Ｄ変異体の製造
アネキシンＡ５-２Ｄ ｃＤＮＡは、本発明の実施例１で述べたように調製された。プライマーは、ＰＣＲ技術によりアネキシンＡ５-２Ｄ ｃＤＮＡを突然変異させるように設計され、結果として得られるｃＤＮＡは、２位のグルタミンがシステインで置換されていることを除いて、アネキシンＡ５-２Ｄのアミノ酸配列でコードされている。
【００５１】
精製されたアネキシンＡ５-２Ｄ-Ｃｙｓ２変異体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにおいて約３４ｋＤａの均一なバンドとして現れ、ＢｉａＣｏｒｅを用いてプラズモン表面共鳴により測定した場合、完全にカルシウム依存性のホスファチジルセリン結合活性を示した。
【００５２】
例３：６２、６９、１００、１３７、１３８および１５９の位置の１以上のアミノ酸がアラニンおよびグリシンで置換され、１６５位のグリシンがシステインで置換された、アネキシンＡ５-２Ｄ変異体の製造
アネキシンＡ５-２Ｄ ｃＤＮＡは、本発明の実施例１で述べたように調製された。プライマーは、ＰＣＲ技術によりアネキシンＡ５-２Ｄ ｃＤＮＡを突然変異させるように設計され、結果として得られるｃＤＮＡは、１６５位のグリシンがシステインで置換されていることを除いて、アネキシンＡ５-２Ｄのアミノ酸配列でコードされている。
【００５３】
精製されたアネキシンＡ５-２Ｄ-Ｃｙｓ１６５変異体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにおいて約３４ｋＤａの均一なバンドとして現れ、ＢｉａＣｏｒｅを用いてプラズモン表面共鳴技術により測定した場合、完全にカルシウム依存性のホスファチジルセリン結合活性を示した。
【００５４】
例４：６２、６９、１００、１３７、１３８および１５９の位置の１以上のアミノ酸がアラニンおよびグリシンで置換されたアネキシンＡ５-２Ｄのリン脂質二重層に対する結合
この例では、アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、アネキシンＡ５のようにリン脂質二重層のＰＳにカルシウム依存性に結合することができるが、リン脂質表面において二次元ネットワークを形成する能力を欠き、細胞に内部移行しないことを示す。
【００５５】
アネキシンＡ５-２ＤのＰＳを含むリン脂質二重層への結合は、楕円偏光法により研究された（Andree et al., J. Biol. Chem. 265:4923-4928 (1990)）。カルシウムの非存在下において、アネキシンＡ５-２Ｄ変異体はリン脂質表面に結合せず、カルシウム濃度の増大により、アネキシンＡ５のカルシウム依存性の結合等温線と同様の結合における増大が観察された。
【００５６】
アネキシンＡ５-２Ｄのリン脂質表面への結合は、電子顕微鏡により分析された（Mosser et al., J. Mol. Biol. 271:241-5 (1991)）。アネキシンＡ５と異なり、アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、規則正しい二次元ネットワークを形成しなかった。
【００５７】
ジャーカット細胞は、蛍光性のアネキシンＡ５-２Ｄまたは蛍光性のアネキシンＡ５、およびアポトーシスの刺激と共にインキュベートされた。前記細胞は、共焦点走査レーザー顕微鏡により、蛍光性のアネキシンＡ５-２Ｄまたは蛍光性のアネキシンＡ５の局在化について分析された（Kenis et al., J. Biol. Chem. 279:52623-9 (2004)）。アネキシンＡ５は、内部移行された。アネキシンＡ５-２Ｄは内部移行されなかったが、血漿膜に結合したままであった。
【００５８】
例５：６２、６９、１００、１３７、１３８および１５９の位置のアミノ酸がアラニンおよびグリシンで置換され、２位のグルタミンおよび３１５位のシステインがそれぞれシステインおよびセリンで置換されたアネキシンＡ５-２Ｄ変異体とマレイミド活性化ビオチンとの結合
アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、実施例２で述べたように調製された。アネキシンＡ５-２Ｄ変異体のＰＳ結合活性に影響を与えることなく、チオール化学を通してアネキシンＡ５-２Ｄ変異体に化合物が容易に結合することを可能にするために、システインは３１５位で除去され、２位に組み込まれた。
【００５９】
EZ-リンク PEO-マレイミド活性化ビオチン（Pierce）を、10 mMの濃度で、25 mM Hepes/NaOH, pH 7.0, 140 mM NaCl, 1 mM EDTAに溶解した。3.4 mg/mlのアネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、25 mM Hepes/NaOH, pH 7.0, 140 mM NaCl, 1 mM EDTAに透析した。200μlのビオチン溶液を1 ml アネキシンＡ５-２Ｄ変異体に添加した。混合物を37℃で120分間インキュベートし、その後25 mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 1 mM EDTAに透析した。
【００６０】
得られる接合体は、楕円偏光法によりそのＰＳ結合活性を分析され、アビジン（Pierce）を用いてビオチン基の到達性について試験された。ビオチン化されたアネキシンＡ５-２ＤはＰＳ結合性が損なわれず、アビジンは、リン脂質表面においてビオチン化されたアネキシンＡ５-２Ｄに容易に結合した。
【００６１】
例６：６２、６９、１００、１３７、１３８および１５９の位置のアミノ酸がアラニンおよびグリシンで置換され、２位のグルタミンおよび３１５位のシステインがそれぞれシステインおよびセリンで置換されたアネキシンＡ５-２Ｄ変異体とマレイミド活性化アビジンとの結合
アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、実施例２に記載したように調製された。アネキシンＡ５-２Ｄ変異体のＰＳ結合活性に影響を与えることなく、チオール化学を通してアネキシンＡ５-２Ｄ変異体に化合物が容易に結合することを可能にするために、システインは３１５位で除去され、２位に組み込まれた。
【００６２】
イムノピュア（Immunopure）アビジン（Pierce）を、8 mg/mlの濃度で、25 mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaClに溶解した。1 mgのSulfo-SMCC (Pierce)をアビジン溶液に加え、混合物を室温で60分間インキュベートした。過剰な架橋剤は、ＰＤ１０カラム（GE-アマシャム/ファルマシア）を用いたゲルろ過により除去した。マレイミド活性化アビジンを1 mg/mlのアネキシンＡ５-２Ｄ変異体に加え、25 mM Hepes/NaOH, pH 7.0, 140 mM NaCl, 1 mM EDTAに透析した。混合物を37℃で120分間インキュベートした。
【００６３】
アビジンとアネキシンＡ５-２Ｄ変異体との接合は、楕円偏光法により、ＰＳに対する結合能について試験された。前記接合体は、ＰＳ結合性を損なわなかった。
【００６４】
例７：アネキシンＡ５-２Ｄ変異体およびプレターゲッティングを用いてインビボで腫瘍を可視化する方法
２位または１６５位にシステインを有するアネキシンＡ５-２Ｄ変異体が設計され、それぞれ実施例２および３に示したように作られた。Ｃｙｓ-アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、実施例５に記載したように、マレイミド-ビオチンを用いてビオチン化された。
【００６５】
ビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄは、腫瘍を有するマウスに静脈内注射された。循環するビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄのレベルは、微速度の自発的なクリアランスまたは例えば静脈内投与されたアビジンを用いた強制的なクリアランスにより減少した。例えば蛍光性の化合物または放射性核種のような分子イメージングプローブに接合したストレプトアビジンが、静脈内に投与された。その後マウスは、蛍光プローブと接合したストレプトアビジンが使用された場合は全身の光学的なイメージャーを用いて、または放射性核種と接合したストレプトアビジンが使用された場合はSPECT、PET、SPECT/CTもしくはPET/CTを用いてイメージングが行われた。
【００６６】
この可視化の方法は、腫瘍および転位を局在化および定量化するため、ならびに抗腫瘍治療の効果を決定するために適用することができる。
【００６７】
例８：アネキシンＡ５-２Ｄ変異体およびプレターゲッティングを用いて、インビトロで不安定なアテローム硬化型のプラークを可視化する方法
２位または１６５位にシステインを有するアネキシンＡ５-２Ｄ変異体が設計され、実施例２および３にそれぞれ示したように作られた。Ｃｙｓ-アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、実施例５で述べたように、マレイミド-ビオチンを用いてビオチン化された。
【００６８】
ビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄは、アテローム硬化性の病変に罹患しているマウスに静脈投与された。循環しているビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄのレベルは、微速度の自発的なクリアランスまたは例えば静脈内投与されたアビジンを用いた強制的なクリアランスにより減少した。例えば蛍光性の化合物または放射性核種のような分子イメージングプローブに接合したストレプトアビジンが、静脈内に投与された。その後マウスは、蛍光プローブと接合したストレプトアビジンが使用された場合は全身の光学的なイメージャーを用いて、または放射性核種と接合したストレプトアビジンが使用された場合はSPECT、PET、SPECT/CTもしくはPET/CTを用いてイメージングが行われた。
【００６９】
この可視化の方法は、不安定なアテローム硬化性プラークを局在化するためおよび不安定なアテローム硬化性プラークを安定なアテローム硬化性プラークと区別することに対して適用することができる。前記可視化の方法は、不安定なアテローム硬化性プラークを安定化する薬剤の効果を決定するために適用され得る。
【００７０】
例９：アネキシンＡ５-２Ｄ変異体およびプレターゲッティングを用いた、インビボでの腫瘍の治療方法
２位または１６５位にシステインを有するアネキシンＡ５-２Ｄ変異体が設計され、実施例２および３にそれぞれ示したように作られた。Ｃｙｓ-アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、実施例５で述べたようにマレイミド-ビオチンを用いてビオチン化した。
【００７１】
ビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄは、腫瘍を有するマウスに静脈投与された。循環しているビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄのレベルは、微速度の自発的なクリアランスまたは例えば静脈内投与されたアビジンを用いた強制的なクリアランスにより減少した。例えば、ドキソルビシンおよびシスプラチンのような抗癌化合物と接合された、または例えばドキソルビシンおよびシスプラチンをカプセル化したリポソームのような抗癌化合物のキャリアと接合されたストレプトアビジンが静脈投与された。
【００７２】
このプレターゲッティング治療方法は、抗癌剤を腫瘍に局在性に送達するために適用することができる。
【００７３】
例１０：アネキシンＡ５-２Ｄ変異体およびプレターゲッティングを使用した、インビボでの不安定なアテローム硬化性プラークの治療方法
２位または１６５位にシステインを有するアネキシンＡ５-２Ｄ変異体が設計され、実施例２および３にそれぞれ示すように作られた。Ｃｙｓ-アネキシンＡ５-２Ｄ変異体は、実施例５で述べたように、マレイミド-ビオチンを用いてビオチン化された。
【００７４】
ビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄは、アテローム硬化性の病変に罹患しているマウスに静脈投与された。循環しているビオチン化アネキシンＡ５-２Ｄのレベルは、微速度の自発的なクリアランスまたは例えば静脈内投与されたアビジンを用いた強制的なクリアランスにより減少した。例えば、スタチンおよび抗炎症性化合物のようなアテローム硬化性プラークを安定化する化合物と接合した、または例えばスタチンおよび抗炎症性化合物をカプセル化するリポソームのようなアテローム硬化性プラークを安定化する化合物のキャリアと接合したストレプトアビジンが静脈内投与された。
【００７５】
このプレターゲッティング治療方法は、アテローム硬化性プラークを安定化する化合物をアテローム硬化性プラークに対して局在性に送達するために適用することができる。
【００７６】
全ての実施例、開示されている方法および／または組成物、およびここで権利請求されているものは、本発明の開示を考慮に入れて、必要以上の実験をすることなく作られ、行うことができる。一方、本発明の方法および組成物は、好ましい実施形態の見地から記載されており、本発明の概念、精神および範囲から離れることなく、ここで述べられている方法およびまたは組成物ならびに方法のステップまたはステップの配列においてバリエーションが適用されてよいことは、当業者に自明であろう。ここで述べられている化合物を含む組成物が、構造的および機能的に関連する化合物を含む組成物で置換されてよいことは、当業者に自明であろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）少なくとも１のリン脂質に結合し；
b）らせんIＡ、IＤ、IIＡ、IIＤ、IIIＣ、IIIＤおよびIVＥならびにらせんIＣとIＤ、IIＥとIIIＡ、IIIＣとIIIＤ、IIIＤとIIIＥ、およびIVＡとIVＢを結合する配列における１以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されることにより、アネキシン変異体の細胞への内部移行が障害され；
c）認識可能な化合物に結合するアネキシン変異体。
【請求項２】
請求項１に記載のアネキシン変異体であって、前記アネキシンは、アネキシンＡ５について配列番号１または他のアネキシンについて対応する配列を含んでなり、細胞への内部移行を阻害するために１以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアネキシン変異体。
【請求項３】
請求項２に記載のアネキシン変異体であって、前記１以上のアミノ酸は、１６〜２９、５９〜７４、８８〜１０２、１３５〜１４５、１５６〜１６９、２０２〜２３１、２５９〜２６６および３０５〜３１７の位置、または他のアネキシンについて対応する配列に位置するアネキシン変異体。
【請求項４】
請求項２または３に記載のアネキシン変異体であって、前記１以上のアミノ酸は極性アミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇおよび／またはＬｙｓであり、無極性アミノ酸で置換されたアネキシン変異体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のアネキシン変異体であって、親和性化合物は、１以上のビオチン、アビジンもしくはストレプトアビジン、オリゴヌクレオチドもしくはモルホリノ、ペプチド核酸およびアプタマー、レセプターもしくはその一部、レセプターリガンドもしくはその一部、抗体もしくはその断片、ならびに抗原から選択されるアネキシン変異体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のアネキシン変異体であって、前記アネキシンは、アネキシンＡ５の１〜１５、４６〜５８、８６〜８７、１１８〜１３４、１６２〜１６７、２４５〜２４８および２８０〜２９４のアミノ酸の位置においてシステイン残基を介して結合され、前記アネキシンは、アネキシンＡ５の２０〜２３、２５〜２７、２９〜４５、６５〜８５、９０〜１１７、１３６〜１４８、１５１〜１５６、１７１〜２０２、２２０〜２４４、２４９〜２７９および２９５〜３１９の位置にシステイン残基を有さないアネキシン変異体。
【請求項７】
アネキシンが、アネキシンＡ５について配列番号１、または他のアネキシンについては対応する配列を含んでなり、１６〜２９、５９〜７４、８８〜１０２、１３５〜１４５、１５６〜１６９、２０２〜２３１、２５９〜２６６および３０５〜３１７の位置または他のアネキシンの場合の対応する配列における１以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、１〜１９、２４、２８、４６〜６４、８６〜８９、１１８〜１３５、１４９〜１５０、１５７〜１７０、２０３〜２１９、２４５〜２４８および２８０〜２９４の位置における１以上のアミノ酸は、任意に置換されたシステイン残基で置換されたアネキシン変異体。
【請求項８】
対象における標的細胞に診断化合物を送達するための方法であって：
a）請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１のアネキシン変異体を含んでなる組成物を対象に投与することと；
b）アネキシン変異体に結合する認識可能な化合物（Ａ）を認識し、結合する化合物（Ｂ）と診断的な化合物との少なくとも１の複合体を含んでなる組成物を対象に投与すること
を含んでなる方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記診断的な薬剤は、蛍光性の群、放射性核種、ＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤、超音波剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項１０】
対象における標的細胞に薬学的な化合物を送達するための方法であって：
a）請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１のアネキシン変異体を含んでなる組成物を対象に投与することと；
b）アネキシン変異体に結合する認識可能な化合物（Ａ）を認識し、結合する化合物（Ｂ）と薬学的な化合物との少なくとも１の複合体を含んでなる組成物を対象に投与すること
を含んでなる方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記薬学的な化合物は、毒素、酵素、酵素阻害剤、脂質、糖類、免疫グロブリンもしくはその断片、免疫複合体、化学療法化合物、光増感剤、放射性核種、細胞死誘発剤、細胞死阻害剤、線維素溶解性化合物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、前記認識する化合物（Ｂ）は、ストレプトアビジンもしくはアビジン、ビオチンもしくは複数のビオチンの複合体、オリゴヌクレオチドもしくはモルホリノ、ペプチド核酸およびアプタマー、受容器もしくはその一部、受容器リガンドもしくはその一部、抗体もしくはその断片、および抗原から選択される方法。
【請求項１３】
リン脂質を発現する細胞または細胞粒子の存在または非存在を検出するための方法であって：
a）認識可能な化合物Ａおよびアネキシンまたはアネキシン変異体を含んでなる少なくとも１の複合体を含む組成物を対象に投与することと；
b）化合物Ａを認識する化合物Ｂおよび診断的な薬剤を含んでなる少なくとも１の複合体を含む組成物を対象に投与することと；
c）対象に対して、光学的なイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、ＰＥＴイメージング、ＭＲＩイメージング、ＣＴイメージング、および超音波イメージングからなる群より選択される検出ステップを行うこと
を含んでなる方法。
【請求項１４】
a）請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１のアネキシン変異体；および
b）前記アネキシン変異体を認識することができる診断的または治療的な化合物
を含んでなるキット。
【請求項１５】
診断における、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアネキシン変異体の使用。
【請求項１６】
治療における、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアネキシン変異体の使用。
【請求項１】
a）少なくとも１のリン脂質に結合し；
b）らせんIＡ、IＤ、IIＡ、IIＤ、IIIＣ、IIIＤおよびIVＥならびにらせんIＣとIＤ、IIＥとIIIＡ、IIIＣとIIIＤ、IIIＤとIIIＥ、およびIVＡとIVＢを結合する配列における１以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されることにより、アネキシン変異体の細胞への内部移行が障害され；
c）認識可能な化合物に結合するアネキシン変異体。
【請求項２】
請求項１に記載のアネキシン変異体であって、前記アネキシンは、アネキシンＡ５について配列番号１または他のアネキシンについて対応する配列を含んでなり、細胞への内部移行を阻害するために１以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアネキシン変異体。
【請求項３】
請求項２に記載のアネキシン変異体であって、前記１以上のアミノ酸は、１６〜２９、５９〜７４、８８〜１０２、１３５〜１４５、１５６〜１６９、２０２〜２３１、２５９〜２６６および３０５〜３１７の位置、または他のアネキシンについて対応する配列に位置するアネキシン変異体。
【請求項４】
請求項２または３に記載のアネキシン変異体であって、前記１以上のアミノ酸は極性アミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇおよび／またはＬｙｓであり、無極性アミノ酸で置換されたアネキシン変異体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のアネキシン変異体であって、親和性化合物は、１以上のビオチン、アビジンもしくはストレプトアビジン、オリゴヌクレオチドもしくはモルホリノ、ペプチド核酸およびアプタマー、レセプターもしくはその一部、レセプターリガンドもしくはその一部、抗体もしくはその断片、ならびに抗原から選択されるアネキシン変異体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のアネキシン変異体であって、前記アネキシンは、アネキシンＡ５の１〜１５、４６〜５８、８６〜８７、１１８〜１３４、１６２〜１６７、２４５〜２４８および２８０〜２９４のアミノ酸の位置においてシステイン残基を介して結合され、前記アネキシンは、アネキシンＡ５の２０〜２３、２５〜２７、２９〜４５、６５〜８５、９０〜１１７、１３６〜１４８、１５１〜１５６、１７１〜２０２、２２０〜２４４、２４９〜２７９および２９５〜３１９の位置にシステイン残基を有さないアネキシン変異体。
【請求項７】
アネキシンが、アネキシンＡ５について配列番号１、または他のアネキシンについては対応する配列を含んでなり、１６〜２９、５９〜７４、８８〜１０２、１３５〜１４５、１５６〜１６９、２０２〜２３１、２５９〜２６６および３０５〜３１７の位置または他のアネキシンの場合の対応する配列における１以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、１〜１９、２４、２８、４６〜６４、８６〜８９、１１８〜１３５、１４９〜１５０、１５７〜１７０、２０３〜２１９、２４５〜２４８および２８０〜２９４の位置における１以上のアミノ酸は、任意に置換されたシステイン残基で置換されたアネキシン変異体。
【請求項８】
対象における標的細胞に診断化合物を送達するための方法であって：
a）請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１のアネキシン変異体を含んでなる組成物を対象に投与することと；
b）アネキシン変異体に結合する認識可能な化合物（Ａ）を認識し、結合する化合物（Ｂ）と診断的な化合物との少なくとも１の複合体を含んでなる組成物を対象に投与すること
を含んでなる方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記診断的な薬剤は、蛍光性の群、放射性核種、ＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤、超音波剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項１０】
対象における標的細胞に薬学的な化合物を送達するための方法であって：
a）請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１のアネキシン変異体を含んでなる組成物を対象に投与することと；
b）アネキシン変異体に結合する認識可能な化合物（Ａ）を認識し、結合する化合物（Ｂ）と薬学的な化合物との少なくとも１の複合体を含んでなる組成物を対象に投与すること
を含んでなる方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記薬学的な化合物は、毒素、酵素、酵素阻害剤、脂質、糖類、免疫グロブリンもしくはその断片、免疫複合体、化学療法化合物、光増感剤、放射性核種、細胞死誘発剤、細胞死阻害剤、線維素溶解性化合物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、前記認識する化合物（Ｂ）は、ストレプトアビジンもしくはアビジン、ビオチンもしくは複数のビオチンの複合体、オリゴヌクレオチドもしくはモルホリノ、ペプチド核酸およびアプタマー、受容器もしくはその一部、受容器リガンドもしくはその一部、抗体もしくはその断片、および抗原から選択される方法。
【請求項１３】
リン脂質を発現する細胞または細胞粒子の存在または非存在を検出するための方法であって：
a）認識可能な化合物Ａおよびアネキシンまたはアネキシン変異体を含んでなる少なくとも１の複合体を含む組成物を対象に投与することと；
b）化合物Ａを認識する化合物Ｂおよび診断的な薬剤を含んでなる少なくとも１の複合体を含む組成物を対象に投与することと；
c）対象に対して、光学的なイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、ＰＥＴイメージング、ＭＲＩイメージング、ＣＴイメージング、および超音波イメージングからなる群より選択される検出ステップを行うこと
を含んでなる方法。
【請求項１４】
a）請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１のアネキシン変異体；および
b）前記アネキシン変異体を認識することができる診断的または治療的な化合物
を含んでなるキット。
【請求項１５】
診断における、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアネキシン変異体の使用。
【請求項１６】
治療における、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアネキシン変異体の使用。
【公表番号】特表２００９−５１９９２５（Ｐ２００９−５１９９２５Ａ）
【公表日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４５５２１（Ｐ２００８−５４５５２１）
【出願日】平成１８年１２月１２日（２００６．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０５０３１５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６９８９５
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０８１７７１７２）モサメディックス・ビー．ブイ． (4)
【氏名又は名称原語表記】ＭｏｓａＭｅｄｉｘ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｍｏｎｎｉｋｅｎｄｉｊｋ ４， ＮＬ−４４７４ ＮＤ Ｋａｔｔｅｎｄｉｊｋｅ， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１２日（２００６．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０５０３１５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６９８９５
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０８１７７１７２）モサメディックス・ビー．ブイ． (4)
【氏名又は名称原語表記】ＭｏｓａＭｅｄｉｘ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｍｏｎｎｉｋｅｎｄｉｊｋ ４， ＮＬ−４４７４ ＮＤ Ｋａｔｔｅｎｄｉｊｋｅ， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
【Ｆターム（参考）】
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