本発明は一般的には、製剤に含まれる治療用タンパク質中のＡｓｐ−Ａｓｐモチーフにおけるアスパルチル異性化を阻害するｐＨを有する製剤に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】

関連出願の相互参照

本出願は、２００８年１１月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／１１６，５４１号の優先権を主張し、この開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】

本発明は、一般的には、製剤に含まれる治療用タンパク質中のＡｓｐ−Ａｓｐモチーフにおけるアスパルチル異性化を阻害するｐＨを有する製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】

タンパク質製剤

バイオテクノロジーの進歩により、組換えＤＮＡ技術を用いて、医薬用途における様々なタンパク質を生産することが可能となった。タンパク質は従来の有機薬剤及び無機薬剤よりも大きく、また複雑であるため（つまり複雑な３次元構造に加えて複数の官能基を有する）、かかるタンパク質の製剤には特別な考慮を必要とする。タンパク質は分解されやすく、化学的不安定性（例えば、新たな化学的性質を生じる結合形成又は開裂によるタンパク質の改変）又は物理的不安定性（例えば、タンパク質の高次構造における変化）に関与し得る。物理的不安定性は例えば、変性、凝集、沈殿又は吸着によって生じ得る。化学的不安定性はアミド分解、ラセミ化、異性化、加水分解、酸化、ベータ脱離又はジスルフィド交換によって生じ得る。
【０００４】

アミド分解、凝集、及び断片化を最小限にするために、モノクローナル抗体を含む治療用タンパク質において弱酸性の緩衝液を含む製剤が用いられている。例えば、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，１７１，５８６号（ｐＨ５．０の酢酸緩衝液を含む安定な抗体製剤溶液について記載されている）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．の国際公開第２００４／０１９８６１号（ｐＨ５．５の酢酸緩衝液中に調製されたペグ化抗ＴＮＦα Ｆａｂ断片について記載されている）；Ｎｅｓｔａの国際公開第２００４／００４６３９号（ｐＨ６．０の５０ｍＭコハク酸緩衝液に調製された腫瘍によって活性化する抗毒素であるｈｕＣ２４２−ＤＭ１について記載されている）；Ｋａｉｓｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．の国際公開第０３／０３９４８５号（ｐＨ６．０のコハク酸ナトリウム緩衝液中で高度に安定なヒト化ＩＬ−２受容体抗体であるダクリズマブについて報告している）；及びＯｌｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．の国際公開第０３／０１５８９４号（ｐＨ６．０のヒスチジン緩衝液中の１００ｍｇ／ｍＬのＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）製剤溶液について記載されている）を参照されたい。
【０００５】

ｐＨ４〜６の条件下では、タンパク質中のアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基は異性化を受けることによって分解し得る。Ａｓｐの異性化は、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）を形成するための速い加水分解開裂を受ける環状イミド中間体（スクシンイミド）、又はモル比が約３：１のＡｓｐを介して進む。Ｗａｋａｎａｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６：１５３４−１５４４（２００７）を参照されたい。ＡｓｐのＣ末端側にある残基がＡｓｐの異性化に対する感受性に影響し、Ａｓｐ−Ｇｌｙ中のＡｓｐが特に異性化の影響を受けやすい（同文献）。治療用抗体中のＡｓｐ異性化は、特に抗体の抗原結合領域、例えば相補性決定領域（ＣＤＲ）にＡｓｐが生じると、抗原結合活性の実質的な損失を引き起こし得る。従って当該技術分野において、かかる製剤に含まれる治療用タンパク質中のＡｓｐ−Ａｓｐ部分におけるアスパルチル異性化を阻害する製剤が必要とされている。
【０００６】

抗ＳＴＥＡＰ−１抗体

ＳＴＥＡＰ−１は６つの膜貫通ドメインと細胞内Ｎ末端及びＣ末端の分子トポロジーを特徴とする細胞表面抗原であり、これはＳＴＥＡＰ−１が３つの細胞外ループ及び２つの細胞内ループを形成するように「曲がりくねって」折りたたまれていることを示唆している。ＳＴＥＡＰ−１は正常なヒト組織において主に前立腺細胞で発現する。ＳＴＥＡＰ−１はまた、様々な状態の前立腺癌、さらに肺、結腸、卵巣、膀胱、及び膵臓癌などの他のヒトの癌、並びにユーイング肉腫にも高値で発現する。Ｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１４５２３−１４５２８（１９９９）；国際公開第９９／６２９４１号；Ｃｈａｌｌｉｔａ−Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６７：５７９８−５８０５；及び国際公開第２００８／０５２１８７号を参照されたい。
【０００７】

ＳＴＥＡＰ−１に結合する特定の抗体については記載されている（参照により本明細書に明らかに組み込まれる、国際公開第２００８／０５２１８７号を参照）。さらに、それらの抗体に由来する免疫抱合体が前立腺腫瘍異種移植モデルにおいて腫瘍体積を縮小することが示されている（同文献）。従って、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体又は免疫抱合体は、例えば前立腺癌などの癌の治療に有用である。従って、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体又は免疫抱合体を投与する上で適した製剤が癌の治療に有用となる。
【０００８】

本発明は上述の必要性を満たし、さらなる利益を提供する。
【発明の概要】
【０００９】

本発明は、Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフを有する治療用タンパク質を少なくとも部分的に含む製剤であり、Ａｓｐ−ＡｓｐモチーフにおけるＡｓｐ残基のアスパルチル異性化を阻害することによってタンパク質の安定性を向上した製剤に関する。１つの様態においては、この製剤はＡｓｐ−ＡｓｐモチーフにおけるＡｓｐ残基のアスパルチル異性化を阻害するｐＨを有する。
【００１０】

１つの様態においては、Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフを有する治療用タンパク質を含む製剤であり、ｐＨが６．０を超え、かつ９．０未満である製剤を提供する。１つの実施形態においては、このｐＨは６．２５〜７．０である。別の実施形態においては、このｐＨは約６．５である。別の実施形態においては、この治療用タンパク質は抗体である。かかる実施形態の１つにおいては、この抗体はＡｓｐ−Ａｓｐモチーフを含む超可変領域（ＨＶＲ）を含む。かかる実施形態の１つにおいては、このＡｓｐ−ＡｓｐモチーフはＨＶＲ−Ｈ３中に生じる。
【００１１】

さらなる実施形態においては、この抗体は配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗ＳＴＥＡＰ−１抗体である。かかる実施形態の１つにおいては、この抗ＳＴＥＡＰ−１抗体はさらに、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、から選択される１つ以上のＨＶＲを含む。かかる実施形態の１つにおいては、この抗体は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、を含む。
【００１２】

さらなる実施形態においては、この抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗ＳＴＥＡＰ−１抗体であり、かつ配列番号８〜１０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。かかる実施形態の１つにおいては、この抗体はさらに、配列番号５〜６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００１３】

さらなる実施形態においては、この抗体は細胞毒性薬と結合している。かかる実施形態の１つにおいては、この細胞毒性薬はアウリスタチンである。別のかかる実施形態においては、この細胞毒性薬はメイタンシノイド薬剤部分である。
【００１４】

さらなる実施形態においては、この抗体は４０℃で４週間保存した場合に５℃で６ヶ月間保存した場合と比較して≦２５％の抗原結合の損失を示す。
【００１５】

さらなる実施形態においては、製剤は、２０ｍＭの濃度のヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。さらなる実施形態においては、製剤は、２０ｍＭの濃度のヒスチジン−塩化物緩衝液を含む。さらなる実施形態においては、製剤は、６０ｍＭ〜２５０ｍＭの量のトレハロース及びショ糖から選択される糖を含む。さらなる実施形態においては、製剤は、０．０１％〜０．１％の量のポリソルベート２０を含む。
【００１６】

上述の実施形態のいずれも、単独又は配合剤として存在し得る。
【００１７】

別の様態においては、上記で提供した実施形態のいずれかにおける抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を含む製剤を哺乳類に投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。
【００１８】

さらなる様態においては、製剤のｐＨをアスパルチル異性化を阻害する上で十分なｐＨまで上昇させる工程を含む、製剤に含まれ、かつＡｓｐ−Ａｓｐモチーフを含む、治療用タンパク質中のアスパルチル異性化の阻害方法を提供する。１つの実施形態においては、この治療用タンパク質は上記で提供した実施形態のいずれかにおける抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】

【図１】ヒト、マウス及びカニクイザル由来ＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸配列の配列比較を示す。
【図２Ａ】ある抗ＳＴＥＡＰ−１抗体由来のＶＬドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】ある抗ＳＴＥＡＰ−１抗体由来のＶＨドメインのアミノ酸配列を示す。
【図３】ｐＨ５．５の抗ＳＴＥＡＰ−１抗体製剤を実施例Ａに記載しているように４０℃で各種期間保存後のイオン交換クロマトグラフィーから得られた溶出プロファイルを示す。
【図４】実施例Ｂに記載している、ｉｓｏ−Ａｓｐの存在を示すトリプシンのペプチドマップを示す。
【図５】実施例Ｂに記載している、異性化を受けた特定のＡｓｐ残基を同定した、電子移動解離質量分析（ＥＴＤ−ＭＳ）の結果を示す。
【図６】４０℃で４週間保存した抗ＳＴＥＡＰ−１抗体製剤は抗原結合性の損失を示したことを示す。ｐＨを上昇させた製剤の４０℃での結合の損失は減少した。製剤を５℃で６ヶ月間保存した場合にはいずれのｐＨにおいても結合の損失は観察されなかった。
【図７】疎水性相互作用クロマトグラフィーによって検出された、４０℃で各種期間保存した後のｉｓｏ−Ａｓｐ及びスクシンイミドを含む抗体の存在を示す。
【図８】実施例Ｄに記載している、各種温度で各種期間保存した後の抗ＳＴＥＡＰ−１抗体調製物中のＩｓｏ−Ａｓｐ及びスクシンイミドの量（パーセンテージで表す）を示す。
【図９】Ａｓｐからｉｓｏ−Ａｓｐへの反応における一次反応速度の仮説を示す。
【図１０】実施例Ｅに記載している、各種温度で決定された、Ａｓｐからｉｓｏ−Ａｓｐへの異性化率を示す。
【図１１】図１０に示した率を用いて作製したアレニウスプロットである。プロットは、約２５〜３０Ｋｃａｌ／ｍｏｌのＡｓｐ−Ａｓｐ異性化の活性化エネルギーを予測する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】

Ｉ．定義

「製剤」という用語は、活性成分を含むが、その製剤を投与する対象に容認しがたい毒性を有する付加的な成分を含まない調製物を意味する。かかる製剤は通常無菌的である。
【００２１】

「無菌」製剤とは、防腐処理されているか、すべての微生物及びそれらの胞子を含まない。
【００２２】

本明細書において、「凍結」製剤は０℃未満の製剤である。通常、凍結製剤は凍結乾燥されておらず、事前又は事後にも凍結乾燥処理を受けない。好ましくは、凍結製剤は、保存用の凍結薬剤原料（例えば、ステンレススチールタンク、ＰＥＴＧボトル、及びＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（商標）保存システム（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ））又は凍結薬剤製品（最終的にはバイアル形状）を含む。
【００２３】

「安定な」製剤は、本明細書におけるタンパク質が保存に際して物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物活性を本質的に保持する製剤を意味する。好ましくは、このタンパク質は保存に際して物理的及び化学的安定性、並びに生物活性を本質的に保持する。保存期間は通常、製剤の意図された貯蔵寿命に基づいて選択される。タンパク質の安定性を測定する様々な分析技術が当該技術分野において使用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ２４７−３０１， Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ， Ａ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． １０： ２９−９０（１９９３）に概説されている。安定性は選択される温度で選択される期間測定することができる。好ましくは、この製剤は約４０℃で少なくとも２〜４週間安定であり；並びに／又は約５℃及び／若しくは１５℃で少なくとも３ヶ月、好ましくは１〜２年安定であり；並びに／又は−２０℃で少なくとも３ヶ月、好ましくは少なくとも１〜２年安定である。さらに、この製剤は好ましくは凍結（例えば−７０℃に）及び融解の後、例えば１、２、又は３回の凍結及び融解の後でも安定である。安定性は、凝集形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた混濁度測定及び／又は目視検査）；陽イオン交換クロマトグラフィー又はキャピラリーゾーン電気泳動を用いた電荷不均一性の評価により；アミノ末端又はカルボキシ末端配列解析；質量分析；不完全な抗体とインタクト抗体を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析；ペプチドマッピング（例えばトリプシン又はＬｙｓ−Ｃの）解析；抗体の生物活性又は結合機能の評価；などの方法を含む様々な異なる方法によって定性的に及び／又は定量的に評価することができる。安定性は１つ以上の：凝集、アミド分解（例えばＡｓｎアミド分解）、酸化（例えばＭｅｔ酸化）、異性化（例えばＡｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／断片化（例えばヒンジ領域の断片化）、スクシンイミド形成、不対システイン、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセッシング、グリコシル化の種差、などを含み得る。「改善された安定性」を有する製剤は、保存に際して、異なる製剤中のタンパク質と比較して、より高い物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物活性を保持する製剤中に含まれるタンパク質を意味する。
【００２４】

「アスパルチル異性化」とはタンパク質中のＡｓｐ残基のイソアスパラギン酸への変換を意味する。
【００２５】

「Ａｓｐ−Ａｓｐ」又は「ＤＤ」モチーフとはタンパク質中の２つの連続したアスパラギン酸残基を意味する。
【００２６】

「アスパルチル異性化の阻害」及びその文法的変形は、指定のｐＨ（例えば６．５）の指定の製剤中に含まれるタンパク質中のＡｓｐ−Ａｓｐにおけるアスパルチル異性化が、同じ製剤中により低いｐＨ（例えば５．５）で含まれるタンパク質中のＡｓｐ−Ａｓｐにおけるアスパルチル異性化値と比較して、部分的に又は完全に阻害されていることを意味する。アスパルチル異性化の阻害は、例えばｉｓｏ−Ａｓｐを定量するＨＩＣを用いて直接的に、又は例えばタンパク質の生物活性を定量することによって間接的に決定し得る。１つの実施形態においては、Ａｓｐ−Ａｓｐにおけるアスパルチル異性化は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害される。
【００２７】

「治療用タンパク質」とは、疾患又は病状を呈する哺乳類の治療に使用されるタンパク質である。本明細書に開示する治療用抗体は抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を含む。
【００２８】

「ＳＴＥＡＰ−１」という用語は、特に記載のない限り、霊長類（例えばヒト及びサル）、及び齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物由来の天然ＳＴＥＡＰ−１を意味する。この用語は「完全長」のプロセッシングされていないＳＴＥＡＰ−１、並びに細胞内でのプロセッシングによるいずれの形態のＳＴＥＡＰ−１も包含する。この用語はまた、天然に生じるＳＴＥＡＰ−１の変異、例えばスプライス変異又は対立遺伝子多型も包含する。ヒト、マウス、及びカニクイザル由来のＳＴＥＡＰ−１の具体例を図１に示す。
【００２９】

抗体の「生物活性」とは抗体の抗原への結合能を意味する。
【００３０】

「等張性」とは、目的の製剤が本質的にヒトの血液と同じ浸透圧を有することを意味する。等張性の製剤は通常約２５０〜３５０ミリオスモルの浸透圧となる。浸透圧は例えば、蒸気圧又は氷点下降型（ｉｃｅ−ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｙｐｅ）浸透圧計で測定することが可能である。
【００３１】

本明細書において使用されるとき、「緩衝液」とは、その溶液中の酸−塩基共役成分の作用によってｐＨの変化に耐える、緩衝化した溶液を意味する。かかる緩衝液の例としては、酢酸、コハク酸、グルコン酸、ヒスチジン、クエン酸、グリシルグリシン、及びその他の有機酸緩衝液が挙げられる。
【００３２】

「ヒスチジン緩衝液」とはヒスチジンイオンを含む緩衝液を意味する。ヒスチジン緩衝液の例としては、ヒスチジン塩化物、ヒスチジン酢酸、ヒスチジンリン酸、及びヒスチジン硫酸などが挙げられる。ヒスチジン酢酸緩衝液はＬ−ヒスチジン（塩基を含まない、固体）を酢酸（液体）を用いて滴定することによって調製することが可能である。
【００３３】

本明細書において「糖」とは、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖アルコール、還元糖、非還元糖などの一般組成（ＣＨ２Ｏ）ｎ及びその誘導体を含む。本明細書における糖の例としては、グルコース、ショ糖、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、デキストラン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、シリトール（ｓｙｌｉｔｏｌ）、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、グルシトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロースなどが挙げられる。本明細書における糖類は、トレハロース又はスクショ糖ロースなどの非還元二糖類の場合もある。
【００３４】

「界面活性剤」とは、表面活性の薬剤、好ましくは非イオン界面活性剤を意味する。本明細書において、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０）；ポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）；トライトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、若しくはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、若しくはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、若しくはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、若しくはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、若しくはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ココイルメチルタウリンナトリウム若しくはオレイルメチルタウリン二ナトリウム；並びにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｔｅｒｓｏｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）；ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレンとプロピレングリコールとのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）などが挙げられる。
【００３５】

「約」という用語は、数値に換算して、その数値のプラス又はマイナス５％を意味する。
【００３６】

本明細書において「抗体」という用語は広義に使用され、抗体が所望の生物活性を示す限り、特に完全長のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体断片を意味する。
【００３７】

本明細書において使用されるとき、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、つまり、通常モノクローナル抗体の産生時に生じ、少量がモノクローナル抗体に含まれる可能性のある変異体を除いて、単一及び／又は同じエピトープに結合する集団を含む個々の抗体を意味する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。修飾「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を表し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法により作製することができ、また、組換えＤＮＡ法によって作製することもできる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技法を用いたファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００３８】

所望の生物活性を示す限り、本明細書におけるモノクローナル抗体には、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、その鎖の残りが、別の種由来又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びにこの抗体の断片が具体的に含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体がある。
【００３９】

「抗体断片」は、その抗体の抗原結合領域を含むすべての完全長抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片；二特異性抗体（二重特異性抗体）；線状抗体；一本鎖抗体分子；並びに抗体断片から形成された多重特異性抗体などが挙げられる。
【００４０】

「完全長抗体」は、抗原結合可変領域並びに軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）及び重鎖定常ドメインであるＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３を含む抗体である。この定常ドメインは天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。ある実施形態においては、完全長抗体は１つ以上のエフェクター機能を有する。
【００４１】

本明細書における「アミノ酸配列変異体」抗体は、参照抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。通常、アミノ酸配列変異体は、参照抗体と少なくとも約７０％の相同性を有するものであり、好ましくは、参照抗体と少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％相同なものである。このアミノ酸配列変異体は、参照抗体と比較して特定の位置に置換、欠失、及び／又は付加を有する。本明細書におけるアミノ酸配列変異体の例には、酸性変異体（例えば、脱アミド化抗体変異体）、塩基性変異体、抗体の１本又は２本の軽鎖にアミノ末端リーダー伸長（例えばＶＨＳ−）を有する抗体、抗体の１本又は２本の重鎖にＣ末端リシン残基を有する抗体などがあり、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列変異体の組み合わせを含む。１つの実施形態においては、抗体変異体は、その抗体の１本又は２本の軽鎖にアミノ末端リーダー伸長を含み、参照抗体と比較したその他のアミノ酸配列及び／又はグリコシル化の差異をさらに有し得る。
【００４２】

本明細書における「グリコシル化変異体」抗体は、参照抗体に結合した１つ以上の炭水化物部分とは異なる炭水化物部分が１つ以上結合した抗体である。本明細書におけるグリコシル化変異体の例には、抗体のＦｃ領域にＧ０オリゴ糖構造の代わりにＧ１又はＧ２オリゴ糖構造が結合した抗体、抗体の１本又は２本の軽鎖に１つ又は２つの炭水化物部分が結合した抗体、抗体の１本又は２本の重鎖に炭水化物部分が結合していない抗体などがあり、グリコシル化変化の組み合わせがある。
【００４３】

本明細書における「アミノ末端リーダー伸長」は、抗体の任意の１つ以上の重鎖又は軽鎖のアミノ末端に存在するアミノ末端リーダー配列の１つ以上のアミノ酸残基を意味する。アミノ末端リーダー伸長の例は、抗体変異体の１つ若しくは両方の軽鎖に存在する３つのアミノ酸残基であるＶＨＳを含むか、ＶＨＳからなる。
【００４４】

「相同性」は、配列を比較して、必要な場合にはギャップを導入して、最大相同パーセントに達した後に、同一なアミノ酸配列変異体における残基パーセンテージとして定義される。配列比較のための方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知である。かかるコンピュータプログラムの１つは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．によって著され、ユーザー文書と共に１９９１年１２月１０日に米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ ２０５５９に提出された「Ａｌｉｇｎ２」がある。
【００４５】

抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物活性を意味する。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害作用；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。
【００４６】

重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、完全長抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。完全長抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかをさらに「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２に分け得る。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。
【００４７】

「抗体依存性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識した後に標的細胞を溶解させる、細胞を介した反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子におけるＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５，５００，３６２号又は第５，８２１，３３７号に記載されている、インビトロ ＡＤＣＣアッセイを行うことができる。このアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などが挙げられる。あるいは又は追加して、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ（ＵＳＡ） ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されている動物モデルにおいてインビボで評価することができる。
【００４８】

「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現してエフェクター機能を担う白血球である。好ましくは、これらの細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現してＡＤＣＣエフェクター機能を担う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然供給源から、例えば本明細書に記載されるように血液又はＰＢＭＣから単離することができる。
【００４９】

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について述べるために使用される。１つの実施形態においては、ＦｃＲは天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合し（ガンマ受容体）、かつ、これらの受容体の対立遺伝子多型及び選択的にスプライシングされた形態を含むＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）などがあり、それらは主に細胞質ドメインが異なるが類似したアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有する（Ｄａｅｒｏｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５ ：２０３−２３４（１９９７）の総説Ｍを参照）。ＦｃＲについては、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． １２６：３３０−４１（１９９５）に総説されている。本明細書における「ＦｃＲ」という用語は、将来同定されるものを含めたその他のＦｃＲを包含する。この用語は、母体ＩｇＧの胎児への輸送を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：２４９（１９９４））。
【００５０】

「補体依存性細胞傷害作用」又は「ＣＤＣ」は、補体存在下で分子が標的を溶解する能力を意味する。補体活性化経路は、補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）がコグネイト抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）へ結合することにより開始する。補体活性化を評価するためには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２： １６３（１９９６）に記載されているＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００５１】

「天然抗体」は、通常は２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する一方で、ジスルフィド結合数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で多様である。各重鎖及び軽鎖は、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を、もう一端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられる。
【００５２】

「可変」という用語は、抗体間において可変ドメインの特定部分の配列が広範囲に渡って異なり、それぞれの特定の抗体の特定の抗原に対する結合及び特異性に使用されるという事実を意味する。しかし可変性は、抗体の可変ドメイン全体に渡り均等に分布しているわけではなく、軽鎖と重鎖の可変ドメイン両方における超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲを含む。ＦＲの大部分はβシート立体配置を採り、３つの超可変領域により連結されており、これら超可変領域はβシート構造と連結し、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成している。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって互いにごく近接し、もう一方の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接には関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）での抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００５３】

本明細書において使用されるとき、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれ、主として抗原との結合に関わる抗体のアミノ酸残基を意味する。これらは通常、重鎖中の３つのＨＶＲ（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３）、及び軽鎖中の３つのＨＶＲ（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３）である。いくつかの実施形態においては、超可変領域は軽鎖可変ドメイン中の２４〜３４位のアミノ酸残基（ＨＶＲ−Ｌ１）、５０〜５６位のアミノ酸残基（ＨＶＲ−Ｌ２）、及び８９〜９７位のアミノ酸残基（ＨＶＲ−Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメインの３１〜３５位のアミノ酸残基（ＨＶＲ−Ｈ１）、５０〜６５位のアミノ酸残基（ＨＶＲ−Ｈ２）及び９５〜１０２位のアミノ酸残基（ＨＶＲ−Ｈ３）を含む（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ．（１９９１））。ＨＶＲ−Ｈ３は抗体への正確な特異性を付与するための特有の役割を果たすと考えられる。例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１−２５（Ｌｏ， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）中のＸｕ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７−４５；Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗｕ（２００３）を参照されたい。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基は、本明細書において定義する超可変領域残基以外の、可変ドメインの残基である。
【００５４】

抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、それぞれが単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片と、残りの「Ｆｃ」断片を生産し、その名称には容易に結晶化できる能力が反映されている。ペプシン処理によって２つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）_２断片が生じ、この断片は依然として抗原を架橋できる。
【００５５】

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む、最小限の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するために、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用するのはこの立体配置である。まとめると、６つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（すなわち抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含む、Ｆｖの半分）でさえも、結合部位全体より親和性は低いが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００５６】

Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数残基が付加している点でＦａｂ断片と異なる。本明細書におけるＦａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（類）が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’名である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、本来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として生産された。抗体断片のその他の化学的カップリングも既知である。
【００５７】

任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。
【００５８】

「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、このＦｖポリペプチドは、このｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ．１１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００５９】

「二特異性抗体」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を意味し、この断片は、同じポリペプチド鎖中で可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に連結した可変重鎖ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上のこれら２つのドメイン間で対形成するには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインを別の鎖の相補性ドメインと対形成させて２つの抗原結合部位を生じさせる。二特異性抗体については、例えば、欧州特許公開第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に詳述されている。
【００６０】

「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、齧歯類）抗体は、非ヒト免疫グロブリンの最小限の配列を含むキメラ抗体である。大抵の場合、ヒト化抗体はレシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び／又は能力を有する、合成抗体又はマウス、ラット、ウサギ、若しくは非ヒト霊長類抗体などの非ヒトドナー抗体の超可変領域由来の残基に置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基に置換されている。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに向上するために行われる。通常、ヒト化抗体は可変ドメインのうちの少なくとも１つ、典型的には２つを実質的にすべて含む。ここですべての若しくは実質的にすべての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに相当し、すべて若しくは実質的にすべてのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃも含む。詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００６１】

「裸の抗体」は、（本明細書において定義される通り）細胞毒性部分又は放射性標識などの異種分子と結合していない抗体である。
【００６２】

「親和性成熟した」抗体は、変異していない親抗体に比べてその抗体の抗原親和性を改善する１つ以上の変異を、１つ以上の超可変領域に有する抗体である。好ましい親和性成熟した抗体は、標的抗原に対する親和性をナノモル又はピコモルでさえ有する。親和性成熟した抗体は、当該技術分野において既知の方法によって生産される。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２）には、ＶＨ及びＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟について記載されている。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発については、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４（７）：３３１０−９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載されている。
【００６３】

「アゴニスト抗体」は、受容体に結合してそれを活性化する抗体である。一般に、アゴニスト抗体の受容体活性化能は、その受容体の天然アゴニストリガンドと少なくとも質的に同程度である（及び本質的に量的にも同程度であり得る）。
【００６４】

「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離及び／又は回収された抗体である。その天然環境の混入成分は、その抗体の診断的用途又は治療的用途を妨害する物質であり、それらには、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク質様若しくは非タンパク質様の溶質が含まれ得る。特定の態様においては、抗体は、（１）ローリー法によって決定した場合に抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで精製されるか、（２）スピニングカップ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ）シークエネーターの使用により、少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列若しくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に精製されるか、又は（３）クーマシーブルー若しくは銀染色を用いた、又は好ましくは蛍光染色を用いたＣＥ−ＳＤＳによる還元条件若しくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製され得る。単離された抗体には、抗体の少なくとも１つの天然環境成分が存在しないため、組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕ抗体が含まれる。しかし通常、単離された抗体は、少なくとも１回の精製工程によって調製される。
【００６５】

本明細書において使用する場合の「増殖阻害剤」は、細胞、例えばＳＴＥＡＰ−１を発現している癌細胞の増殖をインビトロ又はインビボのいずれかで阻害する化合物又は組成物を意味する。従って、増殖阻害剤は、Ｓ相のＳＴＥＡＰ−１発現細胞のパーセンテージを有意に低減する薬剤であり得る。増殖阻害剤の例には、Ｇ１停止及びＭ相停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を（Ｓ相以外の位置で）遮断する薬剤を含む。古典的なＭ相遮断薬には、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、並びにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなどのトポＩＩ阻害剤がある。Ｇ１で停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、及びａｒａ−ＣのようなＤＮＡアルキル化剤などは、Ｓ相停止にも及ぶ。さらなる情報は、Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．によるＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌ， ｅｄｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １、標題「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ， ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ， ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ： Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９５）の特に１３頁に見出すことができる。
【００６６】

「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞の断片化、及び／又は小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成によって決定されるプログラム細胞死を誘導する抗体である。この細胞は通常、その抗体が結合する抗原（例えばＳＴＥＡＰ−１）を発現する細胞である。１つの実施形態においては、この細胞は腫瘍細胞である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の移行をアネキシンの結合によって測定することができ；ＤＮＡの断片化をＤＮＡラダー形成によって評価することができ；及びＤＮＡの断片化に伴う核／クロマチンの凝縮を低二倍体細胞の増加によって評価することができる。ある実施形態においては、アポトーシスを誘導する抗体は、その抗体が結合する抗原を発現する細胞を用いたアネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞と比較して約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘導する抗体である。
【００６７】

「治療」は、治療法及び予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）若しくは予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を意味する。治療を必要とする者には、疾患既往者及び疾患を予防すべき者が含まれる。よって、本明細書において治療すべき患者は、疾患を呈すると診断された者又は疾患の素因があるか疾患感受性である者であり得る。
【００６８】

「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳類における生理的状態を意味するか記述する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽腫及び網膜芽腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫及び滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ、及び膵島細胞癌を含む）、中皮腫、神経鞘腫（聴神経腫を含む）、髄膜腫、腺癌、黒色腫、及び白血病又はリンパ系悪性疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。かかる癌のさらに特定の例としては、扁平上皮癌（例えば上皮扁平上皮癌）；小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌を含む肺癌；腹膜癌；肝細胞癌；消化管癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌若しくは胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌；膵臓癌；膠芽腫；子宮頚癌；卵巣癌；肝癌；膀胱癌；ヘパトーマ；乳癌；結腸癌；直腸癌；直腸結腸癌；子宮内膜癌又は子宮癌；唾液腺癌；腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）癌又は腎臓（ｒｅｎａｌ）癌；前立腺癌；外陰部癌；甲状腺癌；肝癌；肛門癌；陰茎癌；精巣癌；食道癌；胆道腫瘍；並びに頭頚部癌が挙げられる。前立腺癌の具体例としてはアンドロゲン依存性前立腺癌がある。
【００６９】

「有効量」という用語は、患者における疾患を治療するのに有効な薬物の量を意味する。その疾患が癌の場合、有効量の薬物は癌細胞数を減少させ；腫瘍の大きさを縮小させ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させ）；腫瘍の転移を阻害し（すなわち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させ）；腫瘍の増殖をある程度阻害し；及び／又は癌に関連する１つ以上の症状をある程度軽減することができる。薬物が既存の癌細胞の増殖を（部分的に又は完全に）阻害する及び／又は殺すという点において、その薬物は細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性であり得る。有効量は、無進行生存を延長し、客観的奏効（部分奏効（ＰＲ）又は完全奏効（ＣＲ）を含む）をもたらし、全生存期間を延長し、及び／又は１つ以上の癌の症状を改善し得る。
【００７０】

「ＳＴＥＡＰ−１を発現している癌」とは、その細胞表面にＳＴＥＡＰ−１タンパク質を有する細胞を含む癌である。ＳＴＥＡＰ−１を「過剰発現している」癌とは、同じ種類の組織の非癌性細胞と比較して、その細胞表面に有意に高値のＳＴＥＡＰ−１を有する癌である。かかる過剰発現は、遺伝子増幅又は転写若しくは翻訳の増加によって起こり得る。ＳＴＥＡＰ−１の発現（又は過剰発現）は、細胞表面に存在するＳＴＥＡＰ−１値の増加を評価することによって（例えば免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣにより）、診断又は予後アッセイで決定することができる。あるいは又は追加して、その細胞中のＳＴＥＡＰ−１をコードする核酸値を、例えば蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開された国際公開第９８／４５４７９号を参照）、サザンブロット法、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法（リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）など）によって、測定することができる。また、例えば血中循環癌細胞（ＣＴＣ）の表面に存在するＳＴＥＡＰ−１を検出することによって、血清などの生体液中に存在するＳＴＥＡＰ−１を測定することで、ＳＴＥＡＰ−１の発現を試験することもできる（Ｓｃｈａｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １３：２０２３−２０２９（２００７） を参照）。上記アッセイの他に、当業者は様々なインビボアッセイを利用することができる。例えば、検出可能なラベル、例えば放射性同位体などで任意に、直接又は間接的に標識した抗体に患者の体内中の細胞を暴露し、その後、例えば放射能を外部スキャンすることにより又は抗体にあらかじめ曝露された患者から採取した生検を分析することにより、患者の細胞と抗体の結合を評価することができる。
【００７１】

本明細書中において使用される「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能を阻害若しくは阻止し、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、並びに細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の小分子毒素若しくはその断片並びに／又は変異体を含む酵素活性毒素を含むことを意味する。
【００７２】

「化学療法剤」とは、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログであるトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成アナログＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソ尿素；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ， Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ３３：１８３−１８６（１９９４）参照））；ジネマイシンＡを含むジネマイシン；エスペラマイシン；並びに、ネオカルチノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｃｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射液（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ＰＥＧ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エピチロン、及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジンアナログ；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリニン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン加工ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンなどのプラチナ剤；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、及びビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む、微小管形成からチューブリン重合を阻止するビンカ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボビン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含めたレチノイン酸などのレチノイド；クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、又はリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））などのビスホスフォネート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係づけられているシグナル伝達経路における遺伝子発現、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）を阻害するもの；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン並びに遺伝子治療用ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリホシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ又はエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ（ｏｒａｆｅｎｉｂ）、ＡＢＴ５１０；オブリマーセン（ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎ）ナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））などのＢｃｌ−２阻害剤；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（下記定義参照）；チロシンキナーゼ阻害剤（下記定義参照）；並びに上記いずれかの薬学的に許容できる塩、酸若しくは誘導体；並びにＣＨＯＰ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法についての略語、及びＦＯＬＦＯＸ、５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を用いた治療方式についての略語、などの、上記のうち２つ以上の組み合わせがある。
【００７３】

本定義にはまた、腫瘍におけるホルモン作用を制御又は阻害する抗ホルモン剤も含まれ、これらの抗ホルモン剤としては、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、及びＳＥＲＭ３などの選択的エストロゲンレセプターモデュレータ（ＳＥＲＭ）を含む、混合されたアゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン；フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））及びＥＭ８００（これら薬剤はエストロゲンレセプター（ＥＲ）の二量体化を遮断し、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲのターンオーバーを増加させ、かつ／又はＥＲ値を抑制する）などのアゴニスト特性を有さない純粋な抗エストロゲン剤；フォルメスタン及びエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）などのステロイド系アロマターゼ阻害剤、アナストラゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））及びアミノグルテチミドなどの非ステロイド系アロマターゼ阻害剤、並びにボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、イミダゾールを含むその他のアロマターゼ阻害剤を含む、アロマターゼ阻害剤；ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプテレリン（ｔｒｉｐｔｅｒｅｌｉｎ）を含む黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト；酢酸メゲストロール及び酢酸メドロキシプロゲステロンなどのプロゲスチン、ジエチルスチルベストロール及びプレマリンなどのエストロゲン、並びにフルオキシメステロン、すべてのトランスレチノイン酸及びフェンレチニドなどのアンドロゲン／レチノイドを含む性ステロイド剤；オナプリストン；；抗プロゲステロン剤；エストロゲン受容体ダウンレギュレータ（ＥＲＤ）；フルタミド、ニルタミド及びビカルタミドなどの抗アンドロゲン剤；テストラクトン；並びに上記いずれかの薬学的に許容できる塩、酸又は誘導体；並びに上記のうち２つ以上の組み合わせである。
【００７４】

ＩＩ．製剤のための抗体及び免疫抱合体

（Ａ）方法及び組成物

１つの様態においては、本発明に従って調製された治療用タンパク質はＡｓｐ−Ａｓｐモチーフを含むタンパク質である。１つの実施形態においては、この治療用タンパク質は抗体又は免疫抱合体である。かかる抗体及び免疫抱合体は下記のように例示される。
【００７５】

（ｉ）抗体の選択と調製

好ましくは、抗体が結合するその抗原はタンパク質であり、疾患又は障害を患う哺乳動物へのその抗体の投与がその哺乳動物に治療上の利益をもたらすことができる。しかし、非ポリペプチド抗原に対する抗体（腫瘍関連糖脂質抗原など；米国特許第５，０９１，１７８号参照）も考えられている。
【００７６】

その抗原がポリペプチドである場合、その抗原は膜貫通分子（例えば受容体）又は成長因子などのリガンドであり得る。抗原の例としては、レニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、及びフォンビルブラント因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼすなわちヒト尿プラスミノーゲン活性化因子又はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−アルファ及びベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミューラー阻害物質；レラクシンＡ鎖；レラクシンＢ鎖；プロレラクシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４などの細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子に対するレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、若しくは６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、若しくはＮＴ−６）などの神経栄養因子又はＮＧＦ−ｂなどの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−ｂ１、ＴＧＦ−ｂ２、ＴＧＦ−ｂ３、ＴＧＦ−ｂ４、又はＴＧＦ−ｂ５を含むＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；ＴＮＦ−アルファ又はＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ４０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；抗毒素；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−アルファ、−ベータ、−ガンマなどのインターフェロン；例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；例えばＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９及びＩＬ−１０などのインターロイキン（ＩＬ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープ部分などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭなどのインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原；並びに上記ポリペプチドのうちの任意の断片などの分子がある。
【００７７】

本発明に包含される抗体の分子標的の例としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４及びＣＤ４０などのＣＤタンパク質；ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体などのＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー；ＣＤ２０又はＢＲ３などのＢ細胞表面抗原；ＤＲ５を含む腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのメンバー；例えばアネキシン２、カドヘリン−１、Ｃａｖ−１、Ｃｄ３４、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＧＬ、Ｆａｓ、ヘプシン、ＨＥＲ２、ＫＡＩ１、ＭＳＲ１、ＰＡＴＥ、ＰＭＥＰＡ−１、プロスタシン、プロステイン、ＰＳＣＡ、ＰＳＧＲ、ＰＳＭＡ、ＲＴＶＰ−１、ＳＴ７、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＲＰＭ２、及びＴｒｐ−ｐ８などの前立腺細胞表面抗原；ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン、及びそのアルファ又はベータサブユニットのいずれかを含むアルファｖ／ベータ３インテグリン（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）などの細胞接着分子；ＶＥＧＦなどの成長因子及びその受容体；組織因子（ＴＦ）；ＴＮＦ−アルファ又はＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；アルファインターフェロン（アルファ−ＩＦＮ）；ＩＬ−８などのインターロイキン；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣなどがある。
【００７８】

他の分子に結合し得る可溶性抗原又はその断片を、抗体を生成するための免疫原として使用することができる。受容体などの膜貫通分子については、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）を免疫原として使用することができる。あるいは、膜貫通分子を発現している細胞を免疫原として使用することもできる。この細胞は、天然供給源（例えば、癌細胞株）由来であってもよく、膜貫通分子を発現させるために組換え技術によって形質転換された細胞であってもよい。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は、当業者に明らかであろう。
【００７９】

抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の生産のためのＳＴＥＡＰ−１抗原は、例えばＳＴＥＡＰ−１の可溶性型、ＳＴＥＡＰ−１の細胞外ループ、又は所望のエピトープを含有するその部分であり得る。あるいは、細胞表面にＳＴＥＡＰ−１を発現している細胞（例えばＳＴＥＡＰ−１をコードするベクターを用いて形質転換した２９３Ｔ細胞）を抗体生産に用いることもできる（例えばＣｈａｌｌｉｔａ−Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６７：５７９８−８０５（２００７）を参照）。
【００８０】

（ｉｉ）モノクローナル抗体

モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、つまり、その集団を含む個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る可能性のある変異体を除いて、同一及び／又は同じエピトープと結合する。従って、修飾「モノクローナル」とは、別個の抗体の混合物ではない抗体の特徴を示す。
【００８１】

例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。ハイブリドーマ法において、マウス、又はハムスターなどのその他の適した宿主動物を、免疫を与えるために使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を生産する、又は生産できるリンパ球を誘発させるために本明細書の上記のように免疫する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化する場合もある。リンパ球をその後、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させる（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））。
【００８２】

このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは未融合の親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ以上の物質を含有する適切な培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失している場合、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ損失細胞の増殖を阻止する物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
【００８３】

好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択される抗体生産細胞によって抗体の安定な高値の生産を持続させ、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性の細胞である。これらのうちの好ましい骨髄腫細胞株は、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手できるＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１、並びにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳＡから入手できるＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞などのマウス腫瘍由来の細胞株である。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株については記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１（１９８４）；及びＢｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７））。
【００８４】

抗原に対するモノクローナル抗体の生産をハイブリドーマ細胞が増殖している培地を用いてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により生産されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって決定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード解析によって決定することができる。
【００８５】

所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有する抗体を生産するハイブリドーマ細胞を同定した後に、限界希釈法によりそのクローンをサブクローニングして、標準的な方法により生育させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））。この目的に適した培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地がある。さらに、このハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。このサブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性ークロマトグラフィーなどの従来からの抗体精製手法によって培地、腹水、又は血清から適切に分離される。
【００８６】

モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列が決定される。ハイブリドーマ細胞は、このＤＮＡの好ましい供給源として用いられる。組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成するため、そのＤＮＡは一旦単離後は発現ベクター中に配置してよく、次にその発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は別の状況では抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞に導入される。抗体をコードするＤＮＡを細菌中で組換え発現させることの総説については、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ５：２５６−２６２（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖｓ．， １３０：１５１−１８８（１９９２）がある。
【００８７】

さらなる実施形態においては、モノクローナル抗体又は抗体断片は、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載されている技術を用いて抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１−５９７（１９９１）にはファージライブラリーを用いたマウス及びヒト抗体それぞれの単離について記載されている。鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：７７９−７８３（１９９２））並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための感染及びインビボ組換えの併用（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．， ２１：２２６５−２２６６（１９９３））による高親和性（ｎＭ範囲の）ヒト抗体の生産について記載されている。これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための従来のハイブリドーマ技術への実行可能な代替法である。
【００８８】

ＤＮＡはまた、例えばヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列をマウスの相同配列と置き換えることで、又は免疫グロブリンのコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべて又は部分を共有的に連結することによって改変もできる（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１（１９８４））。典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは抗体の定常ドメインと置換され、又はかかる非免疫グロブリンポリペプチドは、ある抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を生み出すために、抗体の抗原結合部位の各種ドメインと置換される。
【００８９】

モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖、又はその部分のアミノ酸配列は、例えば相当するＤＮＡ配列に由来し得る。例えば、このＶＨ、ＶＬ、及び／又は１つ以上のＨＶＲのアミノ酸配列を用い得る。
【００９０】

（ｉｉｉ）ヒト化抗体

非ヒト抗体をヒト化するための方法については、当該技術分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基をその抗体に有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「インポート（ｉｍｐｏｒｔ）」可変ドメインから取り入れられ、しばしば「インポート」残基と称される。ヒト化は本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従ってヒト抗体の対応配列を超可変領域の配列に置換することによって行うことができる。従って、かかる「ヒト化」抗体は、非ヒト種由来の対応する配列に置換されているインタクトのヒト可変ドメインよりも実質的に小さい、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部の超可変領域残基と、おそらく一部のＦＲ残基とが、齧歯類抗体の類似部位由来の残基に置換されているヒト抗体である。
【００９１】

ヒト化抗体を作製する際に使用される、軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法により、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。その後、その齧歯類の配列に最も近似したヒト配列を、ヒト化抗体に対するヒトフレームワーク領域（ＦＲ）とする（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１（１９８７））。別の方法では、特定のサブグループに属する軽鎖又は重鎖の全ヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを複数の異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２６２３（１９９３））。
【００９２】

ある実施形態においては、抗体は、抗原に対する高い親和性及び他の好都合な生物学的特性を保持してヒト化される。この目標を実現するために、１つの実施形態においては、ヒト化抗体は、親配列及び様々な概念上のヒト化産物を、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて解析する過程により調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に使用可能であり、当業者に周知である。選択される候補免疫グロブリン配列の予測される三次元立体構造を図示し、表示するコンピュータプログラムも使用可能である。これらの表示を調査することが、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の予測される役割の解析を可能にする、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力における残基の影響が解析できる。従って、標的抗原への親和性の向上などの求められる抗体の特徴を達成するために、ＦＲ残基をレシピエント及びインポート配列から選択し、組み合わせることができる。通常、超可変領域残基は直接的に、及び最も実質的に抗原結合への影響に関与している。
【００９３】

本明細書においてヒト化抗体は、例えば、ヒト重鎖可変ドメインに組み入れられた非ヒト超可変領域残基を含み、これらにＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ（１９９１）に述べられた可変ドメイン番号付与システムを利用して６９Ｈ、７１Ｈ及び７３Ｈからなる群より選択される位置にフレームワーク領域（ＦＲ）の置換を含み得る。１つの実施形態においては、ヒト化抗体は６９Ｈ、７１Ｈ及び７３Ｈの位置のすべて又はそのうちの２つにＦＲ置換を含む。
【００９４】

本明細書において特に目的のヒト化抗体はＳＴＥＡＰ−１に結合し、かつＡｓｐ−Ａｓｐモチーフを含む。国際公開第２００８／０５２１８７号において、ＨＶＲ−Ｈ３中にＡｓｐ−Ａｓｐモチーフを有するヒト化ＳＴＥＡＰ−１抗体の例が記載されている。かかる抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列（ＨＶＲを含む）を本明細書において提供する。国際公開第２００８／０５２１８７号に記載されているかかる抗体のすべての実施形態は、参照により本明細書に明らかに組み込まれる。
【００９５】

本特許出願は、本明細書に記載したいずれの抗体由来の親和性成熟した抗体も考慮し、かかる親和性成熟した抗体は好ましくはＡｓｐ−Ａｓｐモチーフを含む。親抗体は、本明細書に記載したヒト抗体又はヒト化抗体であり得る。ヒト化抗体及び親和性成熟した抗体の様々な形態も考慮する。例えば、ヒト化抗体及び親和性成熟した抗体は、免疫抱合体を生成するために定常領域と結合している及び／又は１つ以上の細胞毒性薬と結合し得る、Ｆａｂのような抗体断片であってもよい。あるいは、ヒト化抗体及び親和性成熟した抗体は、免疫抱合体を生成するために１つ以上の細胞毒性薬と結合している、完全長ＩｇＧ１抗体のような完全長抗体であってもよい。
【００９６】

（ｉｖ）ヒト抗体

ヒト化の代わりとして、ヒト抗体を生成することができる。例えば現在では、免疫化に際して内生免疫グロブリン生産の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを生産することができる形質転換動物（例えばマウス）を生産することができる。例えば、キメラ及び生殖細胞変異体マウス中の抗体重鎖連結領域（Ｊ_Ｈ）遺伝子のホモ接合性欠失が内生抗体生産の完全な阻害を生じることが記載されている。かかる生殖細胞変異体マウス中へのヒト生殖細胞免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原投与に際してヒト抗体の生産を生じる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．， ７：３３（１９９３）；又は米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号及び第５，５４５，８０７号を参照されたい。
【００９７】

あるいは、免疫化されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体及び抗体断片を生産するために、ファージディスプレイ法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０））を使用することができる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３又はｆｄのような糸状バクテリオファージの主又は副のいずれかの外套タンパク質中にインフレームでクローニングされて、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体断片が検出される。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡのコピーを含むため、抗体の機能特性に基づく選択は、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択も生じる。従って、このファージはＢ細胞の特性のいくらかを模倣する。ファージディスプレイ法は様々な形式で行うことができる。それらの総説については、例えばＪｏｈｎｓｏｎ， Ｋｅｖｉｎ Ｓ． ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ， Ｄａｖｉｄ Ｊ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントの複数の供給源をファージディスプレイ法に使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８（１９９１）は免疫下マウスの脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムな組み合わせライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーの構築、及び抗原の多様なアレイに対する抗体の単離は、本質的にＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７（１９９１）、又はＧｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５−７３４（１９９３）の技術に従って行うことができる。米国特許第５，５６５，３３２号及び米国特許第５，５７３，９０５号も参照されたい。ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖ可変ドメイン配列は、上記の既知のヒト定常ドメイン配列と連結することができる。上記で考察したように、ヒト抗体はインビトロで活性化Ｂ細胞から生成することも可能である（米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号を参照）。
【００９８】

（ｖ）抗体断片

抗体断片を生産するために、様々な方法が開発されている。従来は、これらの断片は完全長抗体のタンパク質分解に由来した（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４： １０７−１１７（１９９２）；及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１（１９８５）を参照）。しかし、これらの断片は現在では組換え宿主細胞から直接生産することができる。例えば、抗体断片は、上記で考察した抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収することも、Ｆ（ａｂ’）_２断片から化学的にカップリングすることもできる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）_２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することもできる。抗体断片を生産するためのその他の技術は当業者には明白であろう。別の実施形態においては、選択される抗体は一本鎖Ｆｖ断片である（ｓｃＦｖ）。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；及び第５，５８７，４５８号を参照されたい。この抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているように、線状抗体でもあり得る。かかる線状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であり得る。
【００９９】

（ｖｉ）二重特異性抗体

二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例となる二重特異性抗体は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の２つの異なるエピトープに結合し得る。その他のこれら抗体はＳＴＥＡＰ−１結合部位に、例えばアネキシン２、カドヘリン−１、Ｃａｖ−１、Ｃｄ３４、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＧＬ、Ｆａｓ、ヘプシン、ＨＥＲ２、ＫＡＩ１、ＭＳＲ１、ＰＡＴＥ、ＰＭＥＰＡ−１、プロスタシン、プロステイン、ＰＳＣＡ、ＰＳＧＲ、ＰＳＭＡ、ＲＴＶＰ−１、ＳＴ７、ＳＴＥＡＰ−２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＲＰＭ２、及びＴｒｐ−ｐ８などのその他の前立腺細胞表面抗原への結合部位を結合させたものであり得る（前立腺細胞表面抗原の例については、例えばＴｒｉｃｏｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １０：３９４３−３９５３（２００４）を参照）。あるいは、ＳＴＥＡＰ−１アームはＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２若しくはＣＤ３）又はＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）（ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）など）のような白血球上のトリガー分子に結合しているアームと連結し得、これにより、ＳＴＥＡＰ−１を発現している細胞への細胞抵抗機構に関与している。二重特異性抗体はＳＴＥＡＰ−１を発現している細胞に細胞毒性薬を局在させるために使用し得る。これらの抗体はＳＴＥＡＰ−１結合アームを細胞毒性薬（サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、又は放射性同位体ハプテン）に結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）_２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１００】

二重特異性抗体を生産する方法は当該技術分野において周知である。従来の完全長二重特異性抗体の生産は、２本の鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖、軽鎖対の共発現に基づいている（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５：５３７−５３９（１９８３））。同様の方法は国際公開第９３／０８８２９号及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。異なるアプローチに従って、所望の結合特異性（抗体抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインが免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。この融合は好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する。軽鎖との結合に必要な部位を含む第一重鎖定常領域（ＣＨ１）を、その融合のうちの少なくとも１つに有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡと、必要な場合、免疫グロブリン軽鎖が、別の発現ベクター中に挿入されて、適した宿主生物中に同時に導入される。これにより、構築において３本のポリペプチド鎖を同じ率で使用することにより最適な収量が得られる場合には、実施形態中の３つのポリペプチド断片の相互の割合を調製することによって高い柔軟性が得られる。しかし、同率の少なくとも２本のポリペプチド鎖の発現が高収率を生む場合や、使用率が特に効果を示さない場合には、ポリペプチド鎖３本のうち２本又はすべてをコードする配列を１つの発現ベクターに挿入することも可能である。
【０１０１】

このアプローチにおける好ましい実施形態においては、この二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖を有するアームと、ハイブリッド免疫グロブリン重−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）を有する別のアームとを含む。この非対称構造は、免疫グロブリン軽鎖が二重特性分子の片方のみに存在して分離が容易となることから、所望の二重特異性化合物を目的としていない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの分離を促進する。このアプローチは国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体の生成の詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１０２】

米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている別のアプローチに従って、抗体分子対の間の界面を操作して、組換え細胞培養からのヘテロ二量体の回収率を最大化することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣ_Ｈ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、一次抗体の界面由来の１本以上の小さなアミノ酸側鎖が大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換される。大きな側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置換することにより、二次抗体の界面上に大きな側鎖と同一又は同程度の大きさの代償的な「空洞」が形成される。これは、ホモ二量体などのその他の望まれない最終産物に比べてヘテロ二量体の収率を増加させるメカニズムを提供する。
【０１０３】

二重特異性抗体は架橋又は「ヘテロ抱合体」抗体を含む。例えばヘテロ抱合体に含まれる抗体の１つとしては、一方がアビジンにカップリングし、他方がビオチンにカップリングしたものがあり得る。かかる抗体は、例えば、目的としていない細胞に免疫系細胞を標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号、及び欧州特許公開第０３０８９号）提唱されている。ヘテロ抱合体抗体はいずれかの適切な架橋方法を用いて作製することができる。適切な架橋剤は当該技術分野において周知であり、いくつかの架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１０４】

抗体断片から二重特異性抗体を生成する技術は文献にも記載されている。例えば特異性抗体は化学的結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９： ８１（１９８５）には、Ｆ（ａｂ’）_２断片を生成するために完全長抗体をタンパク質分解的に開裂する方法について記載されている。これらの断片は、隣接するジチオールを安定化して、分子間ジスルフィド形成を阻止するジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。生成されたＦ（ａｂ’）_２断片はその後、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つがその後、メルカプトエチルアミンと共にＦａｂ’−チオールへ再変換されて、二重特異性抗体を形成させるために、等モル量のその他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合される。生産された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のために使用することができる。
【０１０５】

近年の進歩によって、二重特異性抗体を形成するために化学的に結合できるＦａｂ’−ＳＨ断片を、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収することが容易になった。Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７５： ２１７−２２５（１９９２）には完全にヒト化した二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）_２分子の生産について記載されている。それぞれのＦａｂ’断片を別々にＥ．ｃｏｌｉから分泌させ、二重特異性抗体を形成させるために、直接インビトロで化学的に結合させる。このようにして形成された二重特異性抗体はＨＥＲ２受容体及び正常なヒトＴ細胞を過剰発現している細胞に結合し、並びにヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性のトリガーとなることができる。組換え細胞培養から直接二重特異性抗体断片を生産し、単離する様々な技術も記載されている。例えば二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて生産された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体ホモ二量体は、単量体を形成するためにヒンジ領域で還元され、その後抗体ヘテロ二量体を形成するために再度酸化された。この方法は抗体ホモ二量体の生産にも利用することができる。、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されている「二重特異性抗体」技術は、二重特異性抗体断片を生産する別のメカニズムも提供した。この断片は、同一鎖上の２つのドメイン間で対形成するには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、一断片のＶＨドメイン及びＶＬドメインは、別の断片の相補性ＶＬドメイン及びＶＨドメインと対形成せざるを得ず、それによって、２つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体断片を単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０１０６】

二価超の結合価を有する抗体についても意図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７： ６０（１９９１）。
【０１０７】

（ｖｉｉ）その他のアミノ酸配列の改変

本明細書に記載された抗体のアミノ酸配列の変異についても意図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性が改善することが所望の場合もある。抗体のアミノ酸配列変異体は抗体をコードする核酸中に適切なヌクレオチドの変異を導入すること、又はペプチド合成によって調製することができる。かかる改変は、例えば抗体のアミノ酸配列における残基からの欠失、及び／又はそれら残基への挿入、及び／又はそれら残基の置換を含む。欠失、挿入及び置換のいずれの組み合わせも最終構築物を得るために作製される。提供された最終構築物は、所望の特徴を有する。アミノ酸変異はまた、グリコシル化部位の数又は位置の変化などの抗体の翻訳後プロセッシングも変化し得る。
【０１０８】

突然変異生成における好ましい位置である、抗体の特定の残基又は領域を同定するために有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる。ここでは、アミノ酸と抗原、例えばＳＴＥＡＰ−１抗原との相互作用に影響を及ぼすために、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電した残基）、中性又は陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）によって置換された。置換への機能的な感受性を示すそれらのアミノ酸の位置は、その後さらなる又はその他変異を置換位置に、又は置換位置中に導入することによって、改良される。従って、アミノ酸配列変異が導入される位置はあらかじめ決められているが、その変異自身の性質をあらかじめ決めておく必要はない。例えば、所定の位置で生じた変異の機能を解析するために、アラニンスキャニング又はランダム突然変異生成が標的コドン又は領域で行われ、発現している抗体変異体が所望の活性のためにスクリーニングされる。
【０１０９】

アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さにおよぶアミノ及び／又はカルボキシ末端融合、並びに１つ以上のアミノ酸残基の配列間挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端にメチオニン残基を有する抗体又は細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体などが挙げられる。その他の挿入による抗体分子の変異体には、Ｎ末端又はＣ末端への、酵素（例えばＡＤＥＰＴ）への、又は抗体の血清半減期を上昇するポリペプチドとの融合などがある。
【０１１０】

別の種類の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体の少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる残基で置き換えられている。置換による突然変異生成において最も関心をひく部位としては超可変領域があるが、ＦＲ又はＦｃ領域の変異も意図される。保存的な置換を「好ましい置換」と題して表１に示す。１つ以上の生物学的特性（例えば安定性又は有効性）を変化させるが、他の特性（例えば抗原特異性）を変異しない置換が作製され得る。好ましい置換により所望の特性を有する抗体が得られた場合には、その後、表１において「置換例」と称したさらなる置換的変化が行われ、又は下記のアミノ酸クラスの参照中にさらに記載されるように、より改善された特性を得るために導入されて、抗体をスクリーニングし得る。

表１



【０１１１】

抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）例えばシート又はヘリックス構造などの、置換の領域中のポリペプチド骨格主鎖の構造、（ｂ）標的位置での分子の電荷又は疎水性、（ｃ）側鎖の容積、を維持することに及ぼすそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって行われる。アミノ酸は、（Ａ． Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．， ｐｐ． ７３−７５， Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５）に記載の）側鎖の性質の類似性により以下の群に分けてよい：

（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）

（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）

（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）

（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０１１２】

あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖の性質に基づいて以下の群に分けてよい：

（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；

（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；

（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；

（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；

（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；

（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

非保存的置換はこれらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスのものに交換することを必要とする。
【０１１３】

抗体の特定の構造を維持することに関与しない任意のシステイン残基を、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、通常はセリンに、置換する場合もある。逆にシステイン結合をその安定性（特にその抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合に）を改善するために抗体に付加する場合もある。
【０１１４】

１つの実施形態においては、置換による変異体は親抗体の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。通常、得られた変異体で、さらなる開発のために選択される変異体は、それらを生成した親抗体と比較して、改善された生物学的特性を有する。かかる置換による変異体を生成するための適した方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟を伴う。簡単に説明すると、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７箇所の部位）は各部位で可能なすべてのアミノ置換を生成するために変異される。このようにして生成されたその抗体変異体は糸状ファージ粒子から、それぞれの粒子中にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として一価の形態で提示される。ファージディスプレイされた変異対はその後それらの生物活性（例えば結合親和性）を指標に本明細書に開示するようにスクリーニングされる。改変候補の超可変領域部位を同定するためには、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するためのアラニンスキャニング突然変異生成が行われる場合もある。あるいは又は追加して、抗体とその抗原の間の接触点を同定するために抗原抗体複合体の結晶構造を解析することも有用となり得る。かかる接触残基及び近傍残基が、本明細書において詳述した技術に従って置換するための候補である。かかる変異体が一度生成されれば、本明細書に記載されたように、変異体の一群がスクリーニングされ、１つ以上の関連したアッセイにおいて優れた特性を示した抗体がさらなる開発のために選択され得る。
【０１１５】

抗体の別の種類のアミノ酸変異体は、抗体の本来のグリコシル化のパターンを変化させる。その変化とは、抗体中にみられる１つ以上の炭水化物部分を欠失すること、及び／又は抗体には存在しない１つ以上のグリコシル化位置を付加することを意味する。
【０１１６】

抗体のグリコシル化は典型的には、Ｎ−結合又はＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を意味する。アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン、ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸、のトリペプチド配列が炭水化物部部のアスパラギン側鎖への酵素的結合における認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することがグリコシル化する可能性のある位置を形成する。Ｏ−結合グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうちの１つとヒドロキシアミノ酸、一般にはセリン又はトレオニン、との結合を意味する。ヒドロキシアミノ酸としては５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも利用できる。
【０１１７】

抗体へのグリコシル化位置の付加は、（Ｎ−結合グリコシル化については）１つ以上の上述のトリペプチドを含むようにアミノ酸配列を変化させることによって適切に実現される。変異は本来の抗体の配列に１つ以上のセリン又はトレオニン残基を付加すること、又はセリン又はトレオニン残基で置換することによっても作製できる（Ｏ−結合グリコシル化）。
【０１１８】

この抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合した炭水化物が変異され得る。例えば、抗体のＦｃ領域に結合したフコースを欠いた、成熟した炭水化物構造を有する抗体が米国特許第２００３／０１５７１０８ Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ．に記載されている。米国特許第２００４／００９３６２１ Ａ１号（協和発酵工業株式会社）も参照されたい。抗体のＦｃ領域に結合した炭水化物部分に二等分性のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体は国際公開第０３／０１１８７８号、Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．及び米国特許第６，６０２，６８４号、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．に参照されている。抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体は国際公開第９７／３００８７号、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．に報告されている。その抗体のＦｃ領域に変異された炭水化物が結合した抗体については国際公開第９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）及び国際公開第９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）も参照されたい。Ｆｃ領域にかかる炭水化物構造が結合した主要な種の抗体を含む抗体組成物が本明細書において意図される。
【０１１９】

抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該技術分野において既知の様々な方法によって調製される。これらの方法は、天然資源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又はオリゴヌクレオチドを介した（又は部位特異的な）突然変異生成による調製、ＰＣＲ突然変異生成、及び先に調製された変異体のカセット突然変異生成又は抗体の非変異体などを含むが、これらに限定されない。
【０１２０】

（ｖｉｉｉ）システイン改変抗体

１つの様態においては、本発明の抗体は、国際公開第２００６／０３４４８８号（その全体は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように遊離システインアミノ酸で親抗体の１つ以上のアミノ酸を置換した、システイン改変抗体（ＴｈｉｏＭＡｂとも呼ばれる）を含む。システイン改変抗体は、０．６〜１．０の範囲のチオール反応価を有する１つ以上の遊離アミノ酸を含む。遊離システインアミノ酸は、親抗体中に改変され、ジスルフィド架橋の一部ではないシステイン残基である。システイン改変抗体は改変されたシステイン部位における細胞毒性及び／又は画像化化合物の、例えばマレイミド又はハロアセチルを介した結合に有効である。マレイミド基へのＣｙｓ残基のチオール官能基の求核的反応は、リジン残基などのアミノ基又はＮ末端アミノ基のようなタンパク質中でのその他いずれかのアミノ酸官能基と比較して、約１０００倍高い。ヨードアセチル及びマレイミド薬剤中のチオールに特異的な官能基はアミン基と反応する場合もあるが、より高いｐＨ（＞９．０）及びより長い反応時間を必要とする（Ｇａｒｍａｎ， １９９７， Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ）。
【０１２１】

システイン改変抗体は癌の治療に有用になり得、細胞表面及び膜貫通型受容体に特異的な抗体、並びに腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含む。かかる抗体は裸の抗体（薬剤又は標識部分と結合していない）又は免疫抱合体とも呼ばれる、抗体−薬剤結合体（ＡＤＣ）として使用され得る。本発明のシステイン改変抗体は位置特異的及びチオール反応性薬剤と能率的に結合し得る。チオール反応性薬剤は多機能リンカー試薬、標識補足試薬、蛍光団試薬、又は薬剤−リンカー中間体の場合がある。システイン改変抗体は検出可能な標識で標識され、固相支持上に固定され及び／又は薬剤部分と結合し得る。チオール反応性は、アミノ酸と反応性システインアミノ酸との置換が、Ｌ−１０〜Ｌ−２０、Ｌ−３８〜Ｌ−４８、Ｌ−１０５〜Ｌ−１１５、Ｌ−１３９〜Ｌ−１４９、Ｌ−１６３〜Ｌ−１７３の範囲のアミノ酸〜選択される軽鎖中に；Ｈ−３５〜Ｈ−４５、Ｈ−８３〜Ｈ−９３、Ｈ−１１４〜Ｈ−１２７、及びＨ−１７０〜Ｈ−１８４の範囲のアミノ酸から選択される重鎖中に；Ｈ−２６８〜Ｈ−２９１、Ｈ−３１９〜Ｈ−３４４、Ｈ−３７０〜Ｈ−３８０及びＨ−３９５〜Ｈ−４０５から選択される範囲のＦｃ領域中に形成され得る任意の抗体に対して一般化され得る。ここでアミノ酸位置の番号付与はカバット番号付与システム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）の１位から始まり、国際公開第２００６／０３４４８８号に開示されているように、その後連続して続く。特定の実施形態においては、アミノ酸とシステインの置換はＥＵ番号付与に従った重鎖のＡ１１８（すなわちＡ１１８Ｃ）位、及び／又はカバット番号付与に従った軽鎖のＶ２０５（すなわちＶ２０５Ｃ）位で行い得る。チオール反応性はまた、抗体の特定のドメイン、例えば軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、並びに重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３に対しても一般化され得る。０．６以上のチオール反応価を生じるシステイン置換は、ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２）を含むＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、それぞれのインタクト抗体の重鎖定常ドメインα、δ、ε、γ、及びμにおいて行い得る。かかる抗体とそれらの使用については国際公開第２００６／０３４４８８号に開示されている。
【０１２２】

本発明のシステイン改変抗体は、親抗体の抗原結合能を、好ましくは少なくともある程度保持する。従って、システイン改変抗体は抗原に、好ましくは特異的に、結合することができる。かかる抗原には、例えば腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、細胞表面受容体タンパク質及びその他の細胞表面分子、膜貫通型タンパク質、シグナリングタンパク質、細胞生存制御因子、細胞増殖制御因子、組織発生若しくは分化に関わる（例えば機能的に貢献することが知られ、又は推測されている）分子、リンフォカイン、サイトカイン、細胞周期に関与する分子、脈管形成に関与する分子、並びに血管形成に関わる（例えば機能的に貢献することが知られ、又は推測されている）分子などがある。
【０１２３】

本発明の抗体は、反応基が例えばマレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、又はその他のチオール反応性結合パートナーである、チオール反応性剤と結合し得る（Ｈａｕｇｌａｎｄ， ２００３， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ， １９９２， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ３：２；Ｇａｒｍａｎ， １９９７， Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １：２；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｇ． ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ｐｐ． ４０−５５， ６４３−６７１）。このパートナーは、細胞毒性薬（例えばドキソルビシン若しくは百日咳毒素などの毒素）、フルオレセイン若しくはローダミンなどの蛍光色素のような蛍光団、画像用若しくは放射性の治療用金属に対するキレート剤、ペプチジル若しくは非ペプチジル標識又は検出用タグ、若しくはポリエチレングリコールの様々な異性体などのクリアランス改変剤、第三成分に結合するペプチド、又はその他の炭水化物若しくは脂肪親和性剤などであり得る。
【０１２４】

（ｉｘ）所望の特性を有する抗体のスクリーニング

抗体を生成する技術については上述した。所望の場合には、特定の生物学的特性を有する抗体がさらに選択され得る。
【０１２５】

例えば、細胞の表面においてＳＴＥＡＰ−１に結合する抗体を免疫組織化学的手法、ＦＡＣｓ、又はその他の適した技術によって同定することができる。ＳＴＥＡＰ−１に結合し、かつ腫瘍の増殖をインビボで阻害する抗体を、Ｃｈａｌｌｉｔａ−Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６７：５７９８−５８０５（２００７）に記載されたアッセイを用いて同定することができる。簡単に説明すると、患者由来のアンドロゲン依存性前立腺癌異種移植片ＬＡＰＣ−９ＡＤ又は膀胱癌ＵＭ−ＵＣ−３異種移植片を含むＳＣＩＤマウスを抗ＳＴＥＡＰ−１抗体（又はかかる抗体を含む免疫抱合体）を用いて処理し、その後、腫瘍の体積及び／又はＰＳＡ値を有効性を評価するために測定することがが能である。ＳＴＥＡＰ−１に結合してＳＴＥＡＰ−１を介した細胞間伝達を阻止する抗体を上記のＣｈａｌｌｉｔａ−Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．の論文に記載されたアッセイを用いて同定することができる。簡単に説明すると、ドナー及びアクセプターＰＣ３細胞を、適したドナー及びアクセプター色素に結合させ、それらを混合して生じた細胞間伝達を色の変化によって検出する。
【０１２６】

（ｘ）免疫抱合体

本発明は、化学療法剤などの細胞毒性薬、毒素（例えば低分子毒素若しくは、それらの断片及び／又は変異体を含む、バクテリア、菌類、植物、又は動物由来の酵素的に活性な毒素）、又は放射性同位元素（すなわち放射性結合体）と結合した抗体を含む免疫抱合体にも関する。
【０１２７】

かかる免疫抱合体の生成において有用な化学療法剤について上記した。抗体と、カリケアマイシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）及びＣＣ１０６５などの１つ以上の低分子毒素の抱合体も本明細書において意図される。
【０１２８】

本発明の１つの実施形態においては、この抗体は１つ以上のメイタンシン分子に結合している（例えば、１抗体分子当たり約１〜約１０メイタンシン分子）。メイタンシンは、メイタンシノイド−抗体抱合体を生成するために、Ｍａｙ−ＳＨ３に還元されて改変された抗体と反応し得る、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換され得る（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２： １２７−１３１（１９９２））。
【０１２９】

別の免疫抱合体は、１つ以上のカリケアマイシン分子と結合した抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはピコモル濃度未満の濃度において二本鎖ＤＮＡ開裂を生じ得る。使用され得るカリケアマイシンの構造的類似体には、γ_１^Ｉ、α_２^Ｉ、α_３^Ｉ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−γ_１^Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ^Ｉ_１（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３： ３３３６−３３４２（１９９３）、及びＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８： ２９２５−２９２８（１９９８））などがあるが、これらに限定されない。参照により本明細書に明らかに組み込まれる、米国特許第５，７１４，５８６号、第５，７１２，３７４号、第５，２６４，５８６号、及び第５，７７３，００１号も参照されたい。
【０１３０】

使用され得る酵素的に活性な毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ゴーヤー（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、サポナリア（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、阻害剤、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）などが含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開された国際公開第９３／２１２３２号を参照されたい。
【０１３１】

本発明はさらに、抗体及び核酸分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）などのＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間で形成された免疫抱合体についても意図する。本発明はさらに、抗体及び放射性同位元素の間で形成された免疫抱合体についても意図する。放射性結合型抗体の生産には様々な放射活性同位元素が利用可能である。例としては、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２及びＬｕの放射性同位元素などがある。
【０１３２】

さらに別の実施形態においては、腫瘍のプレ標的化を促進するために、抗体を「受容体」（ストレプトアビジンなど）に結合させ得る。このプレ標的化において、抗体−受容体抱合体を患者に投与し、その後結合していない抱合体を、クリアリング剤と続く細胞毒性薬に結合している「リガンド」（例えばアビジン）の投与を用いて血行から除去する。
【０１３３】

抗体及び細胞毒性薬の抱合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能基誘導体（ジメチルアジプイミドＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベリン酸など）、アルデヒド（グルトアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドペンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリレン２、６−ジイソシアネ−トなど）、及びビス活性フッ素化合物（１、５−ジフルオロ−２、４−ジニトロベンゼンなど）の様々な二官能基タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。例えば、リシン抗毒素はＶｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８： １０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素−１４で標識された１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペント酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は放射性ヌクレオチドを抗体に結合させるためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞毒性薬剤の放出を促進する、「開裂可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２： １２７−１３１（１９９２））を使用することができる。
【０１３４】

典型的には、ペプチドに基づいた薬剤部分を、１つ以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製することができる。かかるペプチド結合は例えば、ペプチド合成の分野では周知である液相合成方法（Ｅ． Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋ． Ｌｕｂｋｅ， “Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐｐ ７６−１３６， １９６５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照）に従って調製することができる。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤部分は米国特許第５６３５４８３号；米国特許第５７８０５８８号；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ（１９８９） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１：５４６３−５４６５；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ（１９９８） Ａｎｔｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １３：２４３−２７７；Ｐｅｔｔｉｔ， Ｇ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， １９９６， ７１９−７２５；及びＰｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ（１９９６） Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １ ５：８５９−８６３の方法に従って調製することができる。Ｄｏｒｏｎｉｎａ（２００３） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１（７）：７７８−７８４；“Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ Ｌｉｇａｎｄｓ”、米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９Ａ１号も参照し、この全体は参照により本明細書に組み込まれる（例えばリンカー及びリンカーに結合したＭＭＡＥ及びＭＭＡＦなどのモノメチルバリンの調製方法）。
【０１３５】

メイタンシン及びメイタンシノイド

いくつかの実施形態においては、この免疫抱合体は、１つ以上のメイタンシノイドに結合した本発明の抗体（完全長又は断片）を含む。
【０１３６】

メイタンシノイドはチューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは当初、東アフリカの灌木であるメイテナスセラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａ）から単離された（米国特許第３８９６１１１号）。続いて、メンタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを特定の微生物が生産することも見出された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノール並びに誘導体、及びその類似体が、例えば米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第４，２６０，６０８号；第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６３号；及び第４，３７１，５３３号に開示されている。
【０１３７】

メイタンシノイド薬剤部分は、（ｉ）発酵若しくは化学的改変、発酵産物の誘導体化によって比較的容易に調製できる、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを介した抗体への結合に適した官能基との誘導体化を受け入れられる、（ｉｉｉ）血漿中で安定である、並びにと（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して効果的である、ことから抗体薬剤抱合体中の魅力ある薬剤部分である。
【０１３８】

メイタンシノイド薬剤部分としての使用に適しているメイタンシン化合物は当該技術分野において周知であり、天然資源から既知の方法に従って単離することができ、遺伝子工学的手法（Ｙｕ ｅｔ ａｌ（２００２）ＰＮＡＳ９９：７９６８−７９７３を参照）を用いて生産することができ、又はメイタンシノール及びメイタンシノール類似体を既知の方法に従って合成して調製することができる。
【０１３９】

メイタンシノイド薬剤部分の例としては、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４２５６７４６号）（水素化アルミニウムリチウムによるアンサミトシンＰ２の還元によって調製される）；Ｃ−２０−ヒドロキシ（又はＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許番号第４３６１６５０号及び第４３０７０１６号）（ストレプトミセス若しくはアクチノミセスを用いた脱メチル作用又はＬＡＨを用いた脱塩によって調製される）；及びＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化によって調製される）などの改変された芳香環を有するメイタンシノイド薬剤部分並びにその他の位置に改変を有するメイタンシノイド薬剤部分がある。
【０１４０】

メイタンシノイド薬剤部分の例としては、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４４２４２１９号）（メイタンシノールをＨ_２Ｓ又はＰ_２Ｓ_５と反応させることによって調製される）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ_２ＯＲ）（米国特許第４３３１５９８号）；Ｃ−１４−ヒドロキシメチル又はアシルオキシメチル（ＣＨ_２ＯＨ又はＣＨ_２ＯＡｃ）（米国特許第４４５０２５４号）（ノカルジアから調製される）；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトミセスによるメイタンシノールの変換によって調製される）；Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号及び第４，３１５，９２９号）（トレウィアヌドロフローラ（Ｔｒｅｗｉａｎｕｄｌｆｌｏｒａ）より単離される）；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号及び第４，３２２，３４８号）（ストレプトミセスによるメイタンシノールの脱メチル化によって調製される）；及び４，５−デオキシ（米国特許第４３７１５３３号）（メイタンシノールを三塩化チタン／ＬＡＨによる還元によって調製される）などの改変を有するメイタンシノイド薬剤部分なども挙げられる。
【０１４１】

メイタンシノイド薬剤部分の実施形態の例としては、下記の構造を有するＤＭ１；ＤＭ３；及びＤＭ４；などがあり、










式中、波線は抗体薬剤抱合体の薬剤の硫黄原子のリンカー（Ｌ）への共有結合を示す。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）はＳＭＣＣによってＤＭ１に結合することが報告されている（国際公開第２００５／０３７９９２号、その全体は参照により本明細書に明らかに組み込まれる）。本発明の抗体薬剤抱合体は本明細書に開示する方法に従って調製することができる。
【０１４２】

メイタンシノイド抗体薬剤抱合体のその他の例は以下の構造及び略語で示される（式中、Ａｂは抗体であり、ｐは１〜約８である）：






【０１４３】

ＤＭ１がＢＭＰＥＯリンカーを介して抗体のチオール基に結合している抗体薬剤抱合体の例は、以下の構造及び略語で示され：




式中、Ａｂは抗体であり；ｎは０、１、若しくは２；並びにｐは１、２、３、若しくは４である。
【０１４４】

例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；第５，４１６，０６４号；第６，４４１，１６３号及び欧州特許出願公開第０４２５２３５Ｂ１号にメイタンシノイドを含む免疫抱合体、その作製方法、及びそれらの治療的用途が開示されており、それらの開示は参照により本明細書に明らかに組み込まれる。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３（１９９６）にはヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合したＤＭ１と示されるメイタンシノイドを含む免疫抱合体について記載されている。この抱合体は培養結腸癌細胞に対して高い細胞毒性を有することが見出され、インビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性が示された。Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）にはメイタンシノイドがヒト結腸癌細胞株への抗原に結合したマウス抗体Ａ７にジスルフィドリンカーを介して結合した免疫抱合体、又はＨＥＲ−２／ｎｅｕ腫瘍遺伝子に結合した別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１について記載されている。１つの細胞当たり３×１０^５のＨＥＲ−２表面抗原を発現しているヒト乳房癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３に対してのＴＡ．１−メイタンシノイド抱合体の細胞毒性がインビトロで試験された。この薬剤抱合体は、１つの抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることによって増加させることができる、遊離メイタンシノイド薬剤と同程度の細胞毒性を示した。Ａ７−メイタンシノイド抱合体は、マウスにおいて低い全身性の細胞毒性を示した。
【０１４５】

抗ＳＴＥＡＰ−１抗体−メイタンシノイド抱合体は、好ましくは抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物活性も有意に減少させることなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合することによって調製される。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号（その開示は参照により本明細書に明らかに組み込まれる）を参照されたい。１分子の毒素／抗体でさえも、裸の抗体の使用よりも細胞毒性を上昇させることが期待されるが、１つの抗体分子当たり、平均３〜４個のメイタンシノイド分子が結合しているものが、抗体の機能又は溶解性に否定的な作用を及ぼすことなく、標的細胞の細胞毒性を効果的に上昇させることが示されている。メイタンシノイドは当該技術分野において周知であり、既知の方法によって合成すること、又は天然資源から単離することができる。メイタンシノイドは、例えば、本明細書の上記で参照した米国特許第５，２０８，０２０号並びにその他の特許及び非特許文献に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール及び芳香環又はメイタンシノールエステルなどのメイタンシノール分子のその他の位置が改変されたメイタンシノール類似体である。
【０１４６】

抗体−メイタンシノイド抱合体を作製するための多くの連結基が当該技術分野において知られており、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、第６，４４１，１６３号、又は欧州特許出願公開第０４２５２３５Ｂ１号、Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）及び米国特許第２００５／０１６９９３３Ａ１号に開示されており、それらの開示は参照により本明細書に明らかに組み込まれる。リンカー成分ＳＭＣＣを含む抗体−メイタンシノイド抱合体は２００５年５月３１日に出願された米国特許出願第１１／１４１３４４号「抗体薬剤抱合体及び方法」に開示されているように調製することができる。この連結基は、上述の特許に開示されているように、ジスルフィド基、チオエステル基、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基、又はエステラーゼに不安定な基を含む。本明細書ではさらなる連結基について記載し、例示した。
【０１４７】

抗体及びメイタンシノイドの抱合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能基誘導体（ジメチルアジプイミドＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベリン酸など）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドペンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２、６−ジイソシアネートなど）、及びビス活性フッ素化合物（１、５−ジフルオロ−２、４−ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能基タンパク質カップリング剤（リンカー）を用いて作製することができる。好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７（１９７８））及びＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）がある。
【０１４８】

リンカーは様々な位置で、結合の種類によって、メイタンシノイド分子に結合することができる。例えばエステル結合は、ヒドロキシル基を用いた標準的なカップリング技術を用いた反応によって形成することができる。この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルによって改変されたＣ−１４位、ヒドロキシル基によって改変されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位に生じる可能性がある。好ましい実施形態においては、この結合はメイタンシノール又はメイタンシノール類似体のＣ−３位に形成される。
【０１４９】

１つの実施形態においては、本発明のいずれの抗体（完全長又は断片）も１つ以上のメイタンシノイド分子に結合している。免疫抱合体の１つの実施形態、すなわち細胞毒性薬ＤはメイタンシノイドＤＭ１、ＤＭ３、又はＤＭ４である。免疫抱合体のかかる実施形態の１つにおいては、リンカーはＳＰＤＰ、ＳＭＣＣ、ＩＴ、ＳＰＤＰ、及びＳＰＰからなる群より選択される。
【０１５０】

アウリスタチン免疫抱合体

ある好ましい実施形態においては、免疫抱合体はドラスタチン又はドラスタチンペプチド類似体及び誘導体、すなわちアウリスタチン（米国特許第５６３５４８３号；第５７８０５８８号）に結合した抗体を含む。ドラスタチン及びアウリスタチンが微小管動態、ＧＴＰ加水分解、及び細胞分裂を干渉し（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ（２００１） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４５（１２）：３５８０−３５８４）、並びに抗癌作用（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌作用（Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ（１９９８） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４２：２９６１−２９６５）を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤部分はペプチド薬剤部分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に結合し得る（国際公開第０２／０８８１７２号）。
【０１５１】

アウリスタチンの実施形態の例としては、Ｎ末端に結合したモノメチルアウリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦがあり、これらは「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ Ｌｉｇａｎｄｓ」（米国特許出願公開第２００５−０２３８６４９Ａ１号）に開示されており、この開示の全体は参照により明らかに組み込まれる。さらなる実施形態においては、モノメチルアウリスタチン薬剤部分はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含む。
【０１５２】

さらなる実施形態においては、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐを有する免疫抱合体を提供し、式中：

（ａ）Ａｂは抗体であり、

（ｂ）Ｌはリンカーであり；

（ｃ）Ｄは式Ｄ_Ｅ又はＤ_Ｆの薬剤であり、

式中、Ｒ^２及びＲ^６はそれぞれメチルであり、Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれイソプロピルであり、Ｒ^７はｓｅｃ−ブチルであり、Ｒ^８はそれぞれ独立してＣＨ_３、Ｏ−ＣＨ_３、ＯＨ、及びＨから選択され；Ｒ^９はＨであり；Ｒ^１０はアリールであり；Ｚは−Ｏ−若しくは−ＮＨ−であり；Ｒ^１１はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル、若しくは−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−ＣＨ_３であり；並びにＲ^１８は−Ｃ（Ｒ^８）_２−Ｃ（Ｒ^８）_２−アリールであり；並びに

（ｄ）ｐは約１〜８である。
【０１５３】

リンカー成分（Ｌ）の例は下記を単独で、又は組み合わせて含む：

ＭＣ＝６−マレイミドカプロイル

Ｖａｌ−Ｃｉｔ又は「ｖｃ」＝バリン−シトルリン（プロテアーゼを開裂できるリンカー中のジペプチドの例）

シトルリン＝２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸

ＰＡＢ＝ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「自壊的」リンカー成分の例）

Ｍｅ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ＝Ｎ−メチル−バリン−シトルリン（ここでリンカーペプチド結合はカテプシンＢによるその開裂が妨げられるように改変されている）

ＭＣ（ＰＥＧ）６−ＯＨ＝マレイミドカプロイル−ポリエチレングリコール（抗体システインに結合し得る）。
【０１５４】

さらなる実施形態においては、リンカーは抗体上のチオール基（例えば、ＴｈｉｏＭＡｂ）を介して結合している。１つの実施形態においては、リンカーをプロテアーゼによって開裂することができる。１つの実施形態においては、リンカーはｖａｌ−ｃｉｔジペプチドを含む。１つの実施形態においては、リンカーはｐ−アミノベンジル単位を含む。１つの実施形態においては、ｐ−アミノベンジル単位はリンカー中の薬剤及びプロテアーゼ開裂部位の間に位置している。１つの実施形態においては、このｐ−アミノベンジル単位はｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）である。１つの実施形態においては、リンカーは６−マレイミドカプロイルを含む。１つの実施形態においては、この６−マレイミドカプロイルはリンカー中の薬剤及びプロテアーゼ開裂部位の間に位置している。上記実施形態は単独で又は他のものとの任意の組み合わせとして生じ得る。
【０１５５】

さらなる実施形態においては、薬剤は下記から選択される：

ＭＭＡＥ＝モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＷ７１８）

ＭＭＡＦ＝薬剤のＣ末端にフェニルアラニンを有するアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の変異体（ＭＷ７３１．５）

ＭＭＡＦ−ＤＭＡＥＡ＝Ｃ末端フェニルアラニン結合へのアミド結合中にＤＭＡＥＡ（ジメチルアミノエチルアミン）を有するＭＭＡＦ（ＭＷ８０１．５）

ＭＭＡＦ−ＴＥＧ＝フェニルアラニンとエステル結合しているテトラエチレングリコールを有するＭＭＡＦ

ＭＭＡＦ−ＮｔＢｕ＝ＭＭＡＦのＣ末端にアミドとして結合しているＮ−ｔ−ブチル。

ある実施形態においては、この薬剤はＭＭＡＥ及びＭＭＡＦから選択される。
【０１５６】

１つの実施形態においては、免疫抱合体は下記の式を有し、




式中、Ａｂは抗体、Ｓは硫黄原子、及びｐは２〜５である。かかる実施形態においては、免疫抱合体はＡｂ−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと称される。別の実施形態においては、免疫抱合体はＡｂ−ＭＣ−ＭＭＡＥである。
【０１５７】

別の実施形態においては、免疫抱合体は下記の式を有し、




式中、Ａｂは抗体、Ｓは硫黄原子、及びｐは２〜５である。かかる実施形態においては、免疫抱合体はＡｂ−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦと称される。別の実施形態においては、免疫抱合体はＡｂ−ＭＣ−ＭＭＡＦである。
【０１５８】

（ｘｉ）その他の抗体改変

本明細書においてその他の抗体改変が意図される。例えば、抗体は様々な非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマーのうちの１つに結合し得る。抗体は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合（例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルのそれぞれ）によって、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）、又はマクロエマルジョン中に調製されたマイクロカプセル中に封入することもできる。かかる技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｌｏ， Ａ．， Ｅｄ．，（１９８０）中に開示されている。
【０１５９】

エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞介在性障害作用（ＡＤＣＣ） 及び／又は補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の増幅に関連して本発明の抗体を改変することが所望の場合もある。これらは抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成される。あるいは又は追加して、システイン残基がＦｃ領域に導入され、それによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成が生じ得る。このようにして生成されたホモ二量体型抗体は改善された内部移行能及び／又は増加した補体介在細胞死及び抗体依存性細胞介在性障害作用（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １７６：１１９１−１１９５（１９９２） 及び Ｓｈｏｐｅｓ， Ｂ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照されたい。抗腫瘍活性が増幅したホモ二量体型抗体は、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されているようにヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製され得る。あるいは、２つのＦｃ領域を有するように抗体を改変することができ、それによって補体溶解及びＡＤＣＣ能が増幅され得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９−２３０（１９８９）を参照されたい。
【０１６０】

国際公開第００／４２０７２号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）にはヒトエフェクター細胞存在下で改善されたＡＤＣＣ機能を有する抗体について記載されている。ここでこの抗体はそのＦｃ領域にアミノ酸置換を有する。好ましくは、改善されたＡＤＣＣ機能を有するこの抗体はＦｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位にアミノ酸置換を含む。好ましくは、別のＦｃ領域はこれらの位置に、１つ、２つ、若しくは３つの置換を含む又はそれらの置換からなる、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域である。
【０１６１】

Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）が改変された抗体については国際公開第９９／５１６４２号、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、米国特許第６，２４２，１９５Ｂ１号、米国特許第６，５２８，６２４Ｂ１号及び米国特許第６，５３８，１２４号（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。この抗体は、そのＦｃ領域の２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３及び／又は３３４位に１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【０１６２】

抗体の血中半減期を延長するために、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に抗体断片）に組み込み得る。本明細書において使用されるとき、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボでの血中半減期の延長に関係したＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、又はＩｇＧ_４）のＦｃ領域のエピトープを意味する。そのＦｃ領域に置換を有する抗体及び血中半減期の延びた抗体については国際公開第００／４２０７２号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）にも記載されている。
【０１６３】

３つ以上の（好ましくは４つ）の機能抗原結合部位を有する改変抗体についても意図された（米国特許出願第ＵＳ２００２／０００４５８７ Ａ１号、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）。
【０１６４】

本明細書に開示する抗体は免疫リポソームとしても調製してよい。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号；並びに１９９７年１０月２３日に公開された国際公開第９７／３８７３１号などに記載された、当該技術分野において既知の方法によって調製される。増幅した循環時間を有するリポソームについては米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１６５】

特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む液体組成物を用いた逆相蒸発抱によって生成することができる。所望の直径のリポソームを得るために、既定の細孔径のフィルターを介してリポソームを排出する。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７： ２８６−２８８（１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合され得る。化学療法剤は任意にリポソームの中に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。
【０１６６】

（Ｂ）抗体及び免疫抱合体の例

Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフを含む抗体（例えば、モノクローナル抗体）が、本明細書に開示する製剤との使用において特に意図される。例えば、ＶＨ又はＶＬの任意の領域にＡｓｐ−Ａｓｐモチーフを含む抗体であり得る。特定の実施形態においては、Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフは抗原結合に影響を及ぼす、いずれかのＨＶＲ、及びある実施形態においてはＨＶＲ−Ｈ３の領域に生じるが、これに限定されない。
【０１６７】

１つの実施形態においては、Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフを含む抗体は抗ＳＴＥＡＰ−１抗体である。国際公開第２００８／０５２１８７号はＨＶＲ−Ｈ３にＡｓｐ−Ａｓｐモチーフを含む抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の例を提供する。国際公開第２００８／０５２１８７号に記載されているかかる抗体のすべての実施形態は、参照により本明細書に明らかに組み込まれる。本明細書に提供する特定のそれらの抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列は図２Ａ及び２Ｂに示される。特定のそれら抗体のＨＶＲのアミノ酸配列は下記の通りである：

ＨＶＲ−Ｌ１：ＫＳＳＱＳＬＬＹＲＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１１）

ＨＶＲ−Ｌ２：ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号１２）

ＨＶＲ−Ｌ３：ＱＱＹＹＮＹＰＲＴ（配列番号１３）

ＨＶＲ−Ｈ１：ＧＹＳＩＴＳＤＹＡＷＮ（配列番号１４）

ＨＶＲ−Ｈ２：ＧＹＩＳＮＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号１５）

ＨＶＲ−Ｈ３：ＥＲＮＹＤＹＤＤＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号１６）。

国際公開第２００８／０５２１８７号に記載されたいずれかの抗体を含む製剤が本発明において明らかに意図される。
【０１６８】

ある実施形態においては、ＳＴＥＡＰ−１抗体は、いずれかのＨＶＲ及びある実施形態においてはＨＶＲ−Ｈ３などの抗抗原結合に影響を及ぼす領域にＡｓｐ−Ａｓｐモチーフを含むが、これに限定されない。１つの実施形態においては、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。かかる実施形態の１つにおいては、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、から選択される１つ以上のＨＶＲをさらに含む。かかる実施形態の１つにおいては、抗体は（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ、を含む。
【０１６９】

ある実施形態においては、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は配列番号８〜１０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。１つの実施形態においては、抗体は配列番号５〜６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む。上記実施形態のいずれにおいても、ＨＶＲ−Ｈ３中のＡｓｐ−Ａｓｐモチーフは保存されている。上記ＶＨ実施形態のいずれにおいても、ＶＨは配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、並びに任意に（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；及び（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、から選択される少なくとも１つのＨＶＲを含む。上記ＶＬ実施形態のいずれにおいても、ＶＬは（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、から選択される少なくとも１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。ある実施形態においては、ＶＨ及びＶＬは図２Ａ及び２Ｂに従って、例えば、配列番号５と配列番号８、並びに配列番号６と配列番号９若しくは１０が対になっている。
【０１７０】

上述のいずれかの免疫抱合体において使用される抗体の例には、本明細書に記載される抗ＳＴＥＡＰ−１抗体がある。好ましい抗ＳＴＥＡＰ−１抗体及び免疫抱合体（ＴｈｉｏＭＡｂ免疫抱合体を含む）は国際公開第２００８／０５２１８７号にも記載されており、この文献は参照により本明細書に明らかに組み込まれる。かかる免疫抱合体を含む製剤も本発明によって明らかに意図される。ある実施形態においては、上記抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は任意に細胞毒性薬に結合している。１つの実施形態においては、細胞毒性薬はアウリスタチンである。かかる実施形態の１つにおいては、このアウリスタチンはＭＭＡＥ又はＭＭＡＦである。
【０１７１】

ＩＩＩ．製剤の例

本明細書における発明は、Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフ中のＡｓｐ残基のアスパルチル異性化を阻害するｐＨを有する製剤であって、Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフを有する治療用タンパク質を含む製剤に、少なくとも部分的に関する。
【０１７２】

１つの様態においては、Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフを有する治療用タンパク質を含む製剤であり、ｐＨが６．０を超え、かつ９．０未満である製剤を提供する。１つの実施形態においては、このｐＨは６．０超を超え、かつ８．０未満である。別の実施形態においては、このｐＨは６．２５〜７．５である。別の実施形態においては、このｐＨは６．２５〜７．０である。別の実施形態においては、このｐＨは６．５〜７．５である。別の実施形態においては、このｐＨは６．５〜７．０である。別の実施形態においては、このｐＨは約６．５である。別の実施形態においては、このｐＨは６．０〜９．０の範囲にあり、その範囲の始点及び終点は、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、及び９．０から選択され、始点のｐＨは終点のｐＨよりも低い。
【０１７３】

特定の治療用タンパク質に特に適しているｐＨ、又はｐＨの範囲は、例えば様々なｐＨのＡｓｐ−Ａｓｐモチーフを含む治療用タンパク質を形成して、タンパク質の安定性を最適化するｐＨを選択することによって実験的に決定することができる。例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ異性化の最大阻害を示すｐＨ（例えば塩基性ｐＨ）は望ましくないレベルのアミド分解、凝集、及び断片化を誘導し得、一方、アミド分解、凝集及び断片化を最少化するｐＨ（例えば酸性ｐＨ）は望ましくないレベルのＡｓｐ−Ａｓｐ異性化を誘導し得る。タンパク質の安定性を最適化するｐＨはこのようにこれら分解過程のバランスをとることによって達成される。本明細書における教示に基づき、これらｐＨは上記に提供した、弱酸性から塩基性のｐＨ範囲になることが予想される。
【０１７４】

ある実施形態においては、タンパク質中のアスパルチル異性化を十分に阻害するｐＨまで製剤のｐＨを上昇させる工程を含む、Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフを含む治療用タンパク質におけるアスパルチル異性化の阻害方法を提供する。かかるｐＨは任意の上述のｐＨであり得る。このアスパルチル異性化は最初のｐＨでみられたアスパルチル異性化と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％９７％、９８％、９９％又は１００％阻害され得る。ある実施形態においては、本明細書に上述された任意の実施形態に提供されるように製剤中の治療用タンパク質を維持する工程を含む、Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフを含む治療用タンパク質におけるアスパルチル異性化の阻害方法を提供する。上述のある実施形態においては、製剤のｐＨが６．５の場合に、製剤のｐＨが５．５の場合の異性化値と比較して、治療用タンパク質中のアスパルチル異性化が阻害される。この治療用タンパク質は、例えば、本明細書に提供したいずれかの抗ＳＴＥＡＰ−１抗体、又はそのＡＤＣであり得る。この製剤は本明細書に記載された製剤であり得る。
【０１７５】

Ａｓｐ−Ａｓｐ異性化は、本明細書の実施例に記載しているように、例えば質量分析、ペプチドマッピング、電子移動解離質量分析、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて決定することができる。製剤中の治療用タンパク質におけるアミド分解、凝集及び／又は断片化は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６８６−７０６（２００６）に解説されている分析手法によって決定することができる。アミド分解、凝集及び／又は断片化の評価方法の例を下記にさらに提供する。
【０１７６】

凝集は、室温で白色蛍光下において白黒バックグラウンドに対する試料の色、外観及び透明性を観察することによって評価することができる。加えて、（希釈、又は未希釈）製剤のＵＶ吸光度も凝集の評価に使用することができる。１つの実施形態においては、ＵＶ吸光度は石英キュベットを用い、１ｃｍ光路長でＨＰ８４５３分光光度計上の２７８ｎｍ及び３２０ｎｍにおいて測定される。３２０ｎｍにおいて測定された吸光度は、より大きな凝集、気泡及び粒子によるバックグラウンドの光散乱を修正するために用いられる。製剤緩衝液に対する測定を対照とする。タンパク質濃度は１．６５（ｍｇ／ｍＬ）^−１ｃｍ^−１の吸光率を用いて決定される。
【０１７７】

電荷変異体における変化を測定するために、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いることができる。１つの実施形態においては、このアッセイはＨＰ１１００（商標）ＨＰＬＣシステム上のＤＩＯＮＥＸＰＲＯＰＡＣＷＣＸ−１０（商標）カラムを用いる。試料をｐＨ７．９で２０ｍＭＨＥＰＥＳを含む移動相Ａを用いて１ｍｇ／ｍＬに希釈する。３０〜５０μＬの希釈した試料をその後４０℃を維持したままカラムに添加する。ピークを、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．９を含む移動相Ｂを用いた浅いＮａＣｌ勾配で溶出する。溶出を２８０ｎｍでモニターする。データをＨＰ ＣＨＥＭＳＴＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウェア（ＲｅｖＢ．０１．０３又はそれより新しい）を用いて解析する。
【０１７８】

製剤中のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の純度はキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）によって決定することができる。このアッセイはＢＩＯＣＡＰＸＬ（商標）キャピラリー、５０ｕｍＩ．Ｄ．を用い、合計４４．６ｃｍ、検出器までの長さ４０ｃｍのＢＩＯＲＡＤ ＢＩＯＦＯＣＵＳ（商標）３０００（商標）キャピラリー電気泳動システム上で行うことができる。
【０１７９】

凝集と断片を定量するために、サイズ排除クロマトグラフィーを用いることができる。このアッセイではＨＰ１１００（商標）ＨＰＬＣシステム上のＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬ（商標）、７．８×３００ｍｍカラムを使用することができる。試料を移動相を用いて１〜２ｍｇ／ｍＬに希釈し、２５〜５０μＬ量を注入する。移動相はｐＨ６．２での２００ｍＭリン酸カリウム及び２５０ｍＭ塩化カリウムであり、タンパク質を定組成勾配、０．５ｍＬ／分で３０分間溶出する。溶出液の吸光度を２８０ｎｍでモニターする。積分はＨＰ ＣＨＥＭＳＴＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウェア（ＲｅｖＢ．０１．０３又はそれより新しい）を用いて行う。
【０１８０】

製剤中の治療用タンパク質の安定性はタンパク質の活性を決定することによって評価することができる。治療用タンパク質が抗体の場合、例えばＥＬＩＳＡ又は細胞表面抗原を試験するための細胞を使用したアッセイ、例えば本明細書の実施例Ａに記載されている細胞を使用したアッセイなどによって、抗体の抗原に結合する能力が維持されているか及び／又はどの程度維持されているかを決定することによって安定性を評価することができる。ある実施形態においては、製剤中の抗体（本明細書で提供したいずれかの抗ＳＴＥＡＰ−１抗体又は免疫抱合体など）は、４０℃で４週間保存した場合に、５℃で６ヶ月間、それ以外は実質的に同一の条件で、例えば、上述のｐＨ及び／又は抗体／ＡＤＣ濃度、緩衝液成分、下記の製剤の例に記載された糖成分及び／又は界面活性剤成分で保存した場合と比較して、≦４０％又は３０％、及び好ましくは≦２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％の抗原結合能の損失を示す。
【０１８１】

治療用タンパク質（例えば、本明細書に記載した抗体又はＡＤＣ）は製剤中に、例えば、１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、及び特定の実施形態においては、５〜５０ｍｇ／ｍＬ、及び特定の実施形態においては、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ又は１００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。様々な実施形態においては、治療用タンパク質の濃度は対象への投与に適していて、かつ対象への投与に際して治療効果を提供する。特定の実施形態においては、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体又はＡＤＣは１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、又は２５ｍｇ／ｍＬの濃度である。
【０１８２】

別の様態においては、製剤は例えば上記で提供したｐＨのヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。ヒスチジン酢酸は１ｍｍ〜１００ｍＭの濃度であり得、及びある実施形態においては、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は４０ｍＭであり得る。ヒスチジン酢酸緩衝液については、例えば、国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されており、それらは参照により本明細書に明らかに組み込まれる。実施形態の１例においては、ヒスチジン酢酸緩衝液は、例えば、裸の抗ＳＴＥＡＰ−１抗体、又は一方で、例えば抗ＳＴＥＡＰ−１ＡＤＣなどのＡＤＣのような、「裸の」抗体に対して使用される。別の様態においては、製剤ヒスチジン塩化物緩衝液を含む。ヒスチジン塩化物は１ｍｍ〜１００ｍＭの濃度であり得、及びある実施形態においては、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は４０ｍＭであり得る。実施形態の１例においては、ヒスチジン塩化物緩衝液は例えば、抗ＳＴＥＡＰ−１ＡＤＣなどのＡＤＣに、また一方で例えば、裸の抗ＳＴＥＡＰ−１抗体などの「裸の」抗体に対して使用される。さらなる実施形態の例においては、ヒスチジン塩化物緩衝液は、製剤を凍結乾燥する場合に使用される。
【０１８３】

別の様態においては、製剤は糖を含む。かかる実施形態の１つにおいては、この糖はトレハロース及びショ糖からなる群から選択される。かかる実施形態の１つにおいては、トレハロース又はショ糖は約６０ｍＭ〜約２５０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態においては、トレハロース又はショ糖は１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、又は２５０ｍＭで存在する。
【０１８４】

別の様態においては、製剤は界面活性剤を含む。かかる実施形態の１つにおいては、この界面活性剤はポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０として一般に知られている）である。かかる実施形態の１つにおいては、このポリソルベート２０は約０．００５％〜約０．１％の濃度で存在する。特定の実施形態においては、ポリソルベート２０は０．００５％、０．０１％、０．０１２５％、０．０１５％、０．０１７５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％又は０．１％ポリソルベート２０濃度で存在する。
【０１８５】

別の様態においては、上述のｐＨにおける製剤は、上記に提供した１つ以上の実施形態のいずれかにおけるヒスチジン−酢酸緩衝液、糖、及び界面活性剤を含む。さらなる様態においては、上述のｐＨにおける製剤は、上記に提供した１つ以上の実施形態のいずれかにおけるヒスチジン塩化物緩衝液、糖、及び界面活性剤を含む。
【０１８６】

ＩＶ．製剤を用いた治療

１つの実施形態において、本発明は、本明細書に記載した製剤を、疾患又は障害を治療する有効量で投与する工程を含む、対象における疾患又は障害の治療方法を提供する。
【０１８７】

製剤が抗ＳＴＥＡＰ−１抗体（「裸の」抗ＳＴＥＡＰ−１抗体並びにＡＤＣを含む）を含む場合、この製剤は癌の治療に用いることができる。この癌は、通常、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体が癌細胞に結合することができるように、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞を含む。従って、この実施形態における発明は、対象においてＳＴＥＡＰ−１を発現している癌の治療方法に関し、この方法は、本明細書に記載した抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を含む製剤を、癌の治療における有効量で対象に投与する工程を含む。かかる製剤を用いて治療できる様々な癌としては、前立腺癌、ユーイング肉腫、肺癌、結腸癌、膀胱癌、卵巣癌、及び膵臓癌などが挙げられる。Ｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１４５２３−１４５２８（１９９９）；国際公開第９９／６２９４１号；Ｃｈａｌｌｉｔａ−Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６７：５７９８−５８０５；及び国際公開第２００８／０５２１８７号を参照されたい。
【０１８８】

患者は抗体製剤と化学療法剤を組み合わせて治療され得る。組み合わせ投与としては、別々の製剤又は単一の製剤を用いた同時投与又は併用投与、及びいずれかの順序での連続投与がある。このように、化学療法剤は抗体製剤の投与前又は投与後に投与し得る。この実施形態においては、少なくとも１回の化学療法剤の投与と少なくとも１回の抗体製剤投与との間隔は、好ましくは約１ヶ月以下であり、最も好ましくは約２週間以下である。あるいは、化学療法剤及び抗体製剤は単一の製剤又は別々の製剤で、患者に同時投与する。
【０１８９】

患者は抗ＳＴＥＡＰ−１抗体製剤と二次抗体の組み合わせによって治療され得る。二次抗体は、例えば、アネキシン２、カドヘリン−１、Ｃａｖ−１、Ｃｄ３４、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ２、ＥＲＧＬ、Ｆａｓ、ヘプシン、ＨＥＲ２、ＫＡＩ１、ＭＳＲ１、ＰＡＴＥ、ＰＭＥＰＡ−１、プロスタシン、プロステイン、ＰＳＣＡ、ＰＳＧＲ、ＰＳＭＡ、ＲＴＶＰ−１、ＳＴ７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＲＰＭ２、及びＴｒｐ−ｐ８などの前立腺細胞表面抗原に結合する抗体を含み得る。組み合わせ投与は、別々の製剤若しくは単一製剤を用いた同時投与若しくは併用投与、並びにそれぞれを順番に連続しての投与がある。従って、この二次抗体は抗ＳＴＥＡＰ−１抗体製剤の投与に先立って、又はその後に投与し得る。この実施形態においては、少なくとも１つの二次抗体の投与と少なくとも１つの抗ＳＴＥＡＰ−１抗体製剤投与との間隔は、好ましくは約１ヶ月以下であり、最も好ましくは約２週間以下である。あるいは、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体製剤と二次抗体は単一製剤又は別々の製剤で、患者に同時投与される。
【０１９０】

本明細書に記載した製剤を用いた治療は、好ましくは、癌の徴候又は症状の改善をもたらす。例えば、かかる治療は生存率（全生存及び／又は無進行生存）における改善をもたらし、及び／又は客観的な臨床反応（部分的又は完全な）をもたらし得る。さらに、化学療法剤と抗体製剤の併用治療は、相乗的な、又は単純に付加したよりも大きな治療上の利益を患者にもたらす。
【０１９１】

製剤は、静脈内投与（例えば、ボーラスとして又は一定期間に渡る連続注入として）、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、骨液嚢内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路などの既知の方法に従ってヒト患者に投与することができる。抗体組成物の静脈内、筋肉内又は皮下投与が好ましく、静脈内投与が最も好ましい。
【０１９２】

皮下送達において、製剤は、シリンジ；注入装置（例えばＩＮＪＥＣＴ−ＥＡＳＥ（商標）及びＧＥＮＪＥＣＴ（商標）装置）；注入ペン（ＧＥＮＰＥＮ（商標）など）；無針装置（例えば、ＭＥＤＩＪＥＣＴＯＲ（商標）及びＢＩＯＪＥＣＴＯＲ（商標））；又は皮下的なパッチ送達システムを介して投与し得る。
【０１９３】

疾患の予防若しくは治療において、適切な抗体の量は、上記で定義された治療される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、その抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、治療歴、患者の既往歴及び抗体に対する反応、並びに担当医の裁量によって変わる。抗体は患者に対して一度に、又は治療期間に渡って適切に投与される。疾患の種類及び重症度によって、患者へ投与する初回用量の候補は約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗ＳＴＥＡＰ−１抗体であり、例えば１回以上の個別投与、又は連続注入により投与される。抗体の用量は通常、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。化学療法剤を投与する場合には、通常はそれらの既知用量で投与され、又は薬剤の複合作用、若しくは化学療法剤の投与に起因する負の副作用のために任意に低用量を投与する。化学療法剤の調製及び投与計画は使用説明書に従って、又は当業者による経験的な決定に従って用い得る。これら化学療法剤の調製及び投与計画はＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｅｄ．， Ｍ．Ｃ． Ｐｅｒｒｙ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ（１９９２）にも記載されている。
【０１９４】

その他の治療レジメンは、二次（三次、四次など）化学療法剤（すなわち異なる化学療法剤の「カクテル」）；別のモノクローナル抗体；増殖阻害剤；細胞毒性薬；化学療法剤；ＥＧＦＲを標的とする薬剤；チロシンキナーゼ阻害剤；抗血管形成剤；及び／又はサイトカイン；などが挙げられるが、これらに限定されない抗体と併用してもよい。上記治療レジメンに加えて、患者に癌細胞の外科的除去及び／又は放射線治療を行ってもよい。
【０１９５】

本明細書に提供する製剤（例えば、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体製剤）は診断目的、例えばインビボ診断造影用に投与してもよい。かかる実施形態においては、抗体は検出のために直接又は間接的に標識され得る。
【０１９６】

Ｖ．製造品

本発明の別の実施形態においては、本発明の製剤を含み、本発明の製剤の使用に関する使用説明書を提供する製造品を提供する。この製造品は容器も含む。適した容器としては、例えば、瓶、バイアル（例えば、二腔バイアル）、シリンジ（二腔シリンジなど）及び試験管などが挙げられる。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成してよい。容器は製剤を保持し、容器に貼られた、又は容器に付随したラベルは使用方法を示す。製剤を保持する容器は、再構成された製剤の反復投与（例えば２〜６回の投与）を可能にする複数回使用用バイアルでよい。製造品には、商業上及び利用者の観点から所望のその他の材料（その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び前項で示した使用方法に関する添付文書などを含む）をさらに含んでよい。
【０１９７】

本発明は下記の実施例を参照によりさらに十分に理解されるであろう。しかし、それらは本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。引用したすべての文献及び特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９８】

実施例

Ａ．イオン交換クロマトグラフィーによるスクシンイミド中間体の同定

配列番号６及び１０でそれぞれ示される重鎖及び軽鎖可変領域を有する完全長抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を、ｐＨ５．５において１００ｍＭトレハロース及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭヒスチジン酢酸緩衝液中で調剤した。試料を４０℃で維持し（「ストレス条件」）、０、１、２、又は４週間後に、イオン交換クロマトグラフィーによって解析した。図３はそれらの時点で生じた溶出プロファイルを示す。「塩基性」ピーク（矢印）について、ストレス条件下で時間の経過と共に、溶出ピークが３．９％〜２０．７％に増加した。
【０１９９】

試料の「効能」は、細胞を使用したアッセイにおける抗体の抗原への結合能を評価することにより決定した。このアッセイにおいて、ＳＴＥＡＰ−１が安定的に形質転換されたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、０．２ｍｇ／ｍＬＧ４１８を含む１０％ＦＢＳ及び１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）培地（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア）を含むＨＡＭ’ｓＦ１２／ＤＭＥＭ（１：１）を用いた培地で生育させた。細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現値を〜２７０，０００ｓｉｔｅｓ／細胞になるようにスキャッチャード解析によって決定した。ＬＢ５０細胞をポリ−Ｄ−リジンが塗布された９６穴マイクロタイター細胞培養プレートに１×１０^５細胞／穴になるように播種して、一晩、３７℃及び５％ＣＯ_２でインキュベートした。インキュベーションの後、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体と対照試料をアッセイ用希釈剤（ＰＢＳ＋０．２５％ＢＳＡ）を用いて希釈し、プレートに添加した。プレートをその後インキュベートして、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体をＬＢ５０細胞上に発現しているＳＴＥＡＰ−１に結合させた。プレートをその後結合していない抗体を除去するために洗浄した。結合した抗ＳＴＥＡＰ−１抗体をＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と、結合した抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の量に比例した比色シグナルを生産するＳｕｒｅＢｌｕｅＲｅｓｅｒｖｅ（商標）テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ（ＴＭＢ）基質溶液を用いて検出した。図３の表の最後のカラムに示すように、ストレス条件下では時間の経過と共に、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の効能が損失した。
【０２００】

イオン交換ピークに相当する画分を回収し、質量分析を行った。塩基性ピーク（図３中の矢印）は主要なピークよりも少ない質量１８Ｄａを有し、これがスクシンイミド中間体であることを示している。スクシンイミド中間体の存在はアスパラギンのアミド分解又はアスパラギン酸の異性化のどちらかが存在することを示唆した。
【０２０１】

Ｂ．ペプチドマッピング及びＥＴＤ−ＭＳによる、Ｉｓｏ−Ａｓｐの同定

ペプチド（トリプシン）マッピングを試料について行った。図４に示すように、逆相クロマトグラフィーにおいて２つのペプチド（Ｔ１１及びＴ１１−ｉｓｏ−Ａｓｐ）が別々に移動していることは、２つのペプチドが異なる荷電表面を提示していることを示している。しかしながら、２つのペプチドは質量分析において同じ質量を有することから、１つのペプチドがｉｓｏ−Ａｓｐを含むことが示唆される。ペプチド断片については電子移動解離質量分析を行い、得られたデータは図５に示されるように、ＨＶＲ−Ｈ３（ＣＤＲ３）中のＡｓｐ−Ａｓｐ配列における最初のＡｓｐが異性化したことを示した。このＡｓｐは図５（ＮＹＤＹＤＤＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＣＳＴＫ（配列番号１７））の５位のペプチドに相当し、これは上記配列番号１６の７位に相当する。
【０２０２】

Ｃ．ｐＨ上昇の効果

実施例Ａの抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を図６に示すように、様々なｐＨの２４０ｍＭショ糖及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭヒスチジン塩化物緩衝液中に調製した。ｐＨ５．５において４週間４０℃で保存した場合、抗体のＳＴＥＡＰ−１抗原への結合の損失が示された。高いｐＨを有する製剤において、４０℃での結合の損失が低下することが示された。５℃で６ヶ月間保存した場合には、いずれのｐＨにおいても結合の損失はみられなかった。
【０２０３】

Ｄ．Ｉｓｏ−Ａｓｐ及びスクシンイミドのＨＩＣ検出

上記実施例Ｃに記載したように、ｐＨ５．５で調製し、４０℃で０、１、２、及び４週間保存した抗ＳＴＥＡＰ−１抗体中のｉｓｏ−Ａｓｐ及びスクシンイミドの量を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて定量した。図７はｉｓｏ−Ａｓｐ及びスクシンイミドを含む溶出プロファイルを示す。図８は、示されたように様々な温度で様々な期間保存した抗ＳＴＥＡＰ−１抗体中のｉｓｏ−Ａｓｐ及びスクシンイミドの量（パーセンテージで表した）を示す。イオン交換クロマトグラフィーを用いた場合には、ｉｓｏ−Ａｓｐのピークが主要なピーク下に現れるため、ｉｓｏ−Ａｓｐ及びスクシンイミドの量を定量するためＨＩＣが必要とされた。
【０２０４】

Ｅ．Ａｓｐからｉｓｏ−Ａｓｐへの異性化率

抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を上記実施例Ｃに記載したように、ｐＨ５．５で調製した。Ａｓｐからｉｓｏ−Ａｓｐへの一次反応速度を仮定し（図９）、Ａｓｐからｉｓｏ−Ａｓｐへの異性化率を様々な温度下で決定した（図１０）。図１０で決定した率を用いてアレニウスプロットを作製した（図１１）。プロットはＡｓｐ−Ａｓｐ異性化の活性エネルギーが約２５〜３０ｋｃａｌ／ｍｏｌであることを示している。
【０２０５】

前述の発明は、理解を明確にする目的で例証及び実施例によって詳述しているが、この記載及び実施例は本発明の範囲を限定するように解釈すべきではない。本発明において引用したすべての特許及び科学論文の開示は、その全体が参照により本明細書に明らかに組み込まれる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】

Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフを有する治療用タンパク質を含む製剤であり、前記Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフ中のＡｓｐ残基のアスパルチル異性化を阻害するｐＨを有する製剤。
【請求項２】

Ａｓｐ−Ａｓｐモチーフを有する治療用タンパク質を含む製剤であり、ｐＨが６．０を超え、かつ９．０未満である製剤。
【請求項３】

前記ｐＨが６．２５〜７．０である、請求項２に記載の製剤。
【請求項４】

前記ｐＨが約６．５である、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】

前記治療用タンパク質が抗体である、請求項２に記載の製剤。
【請求項６】

前記抗体がＡｓｐ−Ａｓｐモチーフを有する超可変領域（ＨＶＲ）を含む、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】

前記Ａｓｐ−ＡｓｐモチーフがＨＶＲ−Ｈ３中に生じる、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】

前記抗体が配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む抗ＳＴＥＡＰ−１抗体である、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】

前記抗ＳＴＥＡＰ−１抗体が、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される１つ以上のＨＶＲをさらに含む、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】

前記抗体が（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】

前記抗体が配列番号８〜１０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項８に記載の製剤。
【請求項１２】

前記抗体が配列番号５〜６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】

前記抗体が細胞毒性薬と結合している、請求項８に記載の製剤。
【請求項１４】

前記細胞毒性薬がアウリスタチンである、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１５】

前記細胞毒性薬がメイタンシノイド薬剤部分である、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１６】

前記抗体が４０℃で４週間保存した場合に、５℃で６ヶ月間保存した場合と比較して≦２５％の抗原結合の損失を示す、請求項５ないし８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１７】

２０ｍＭの濃度のヒスチジン−酢酸緩衝液を含む、請求項５ないし８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１８】

２０ｍＭの濃度のヒスチジン−塩化物緩衝液を含む、請求項５ないし８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１９】

６０ｍＭ〜２５０ｍＭの量で存在するトレハロース及びショ糖から選択される糖を含む、請求項５ないし８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２０】

０．０１％〜０．１％の量のポリソルベート２０を含む、請求項５ないし８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２１】

請求項８に記載の製剤を哺乳類に投与する工程を含む、癌の治療方法。
【請求項２２】

製剤に含まれ、かつＡｓｐ−Ａｓｐモチーフを含む治療用タンパク質におけるアスパルチル異性化の阻害方法であり、製剤のｐＨをアスパルチル異性化を阻害する上で十分なｐＨまで上昇させる工程を含む、アスパルチル異性化の阻害方法。
【請求項２３】

前記治療用タンパク質が抗体である、請求項２２に記載の方法。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【公表番号】特表２０１２−５０９３４４（Ｐ２０１２−５０９３４４Ａ）
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３７６０８（Ｐ２０１１−５３７６０８）
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６５０８４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５９７８７
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック，　インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】