治療用分子を送達するためのカチオン性両親媒性物質と共脂質とを含む組成物
本開示は、治療薬と組み合わせて有用であり、また疾患および状態の診断および処置に有用な組成物を提供する。当該組成物は、核酸治療薬などの物質の細胞、組織、器官、および対象への送達に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、核酸とカチオン性脂質との貯蔵安定性塩、およびこの塩を使用して、哺乳動物への投与時に組織細胞に核酸を送達するための脂質処方物を製造する方法について記載されている。
【０００２】
背景技術
多種多様な核酸が、数々の疾患を処置するための治療薬として、現在開発されている。これらの核酸には、遺伝子治療におけるＤＮＡ、プラスミドベースの干渉核酸、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において使用するためのｓｉＲＮＡを含む低分子干渉核酸、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス分子、リボザイム、およびアプタマーが含まれる。これらの分子が開発されるに従い、安定で長い有効期間を有し、かつ無水有機溶媒または無水極性非プロトン性溶媒に簡単に組み込んで、極性水溶液中または非極性溶媒中で生じうる副反応を伴わずに核酸のカプセル封入を可能にする形態で、それらの分子を製造する必要性が生じてきている。
【０００３】
本発明は、生物活性のある治療用の分子の細胞内送達を容易にする、新規の脂質組成物に関する。また、本発明は、そのような脂質組成物を含み、患者の細胞内に治療有効量の生物活性分子を送達するのに有用な医薬組成物に関する。
【０００４】
対象への治療用化合物の送達は、その治療効果にとって重要であり、これは通常は、化合物の標的細胞および組織に到達する能力が限定されることにより、妨げられる可能性がある。さまざまな送達手段によって、標的とされる組織細胞に進入するこのような化合物を改善することは、極めて重要である。本発明は、生物活性分子の標的化細胞内送達を容易にする、新規の脂質、組成物、および製造方法に関する。
【０００５】
患者の組織の効果的な標的化が達成されないことが多い生物活性分子の例には、（１）免疫グロブリンタンパク質を含む多数のタンパク質、（２）ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド、（３）アンチセンスポリヌクレオチド、および（４）合成または天然の多くの低分子量化合物、例えばペプチドホルモンおよびペプチド抗生物質がある。
【０００６】
医師らが現在直面している根本的な課題の１つは、多種多様な核酸が、数々の疾患を処置するための治療薬として現在開発されていることである。これらの核酸には、遺伝子治療におけるＤＮＡ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において使用するためのプラスミド低分子干渉核酸（ｉＮＡ）、アンチセンス分子、リボザイム、アンタゴｍｉｒ、マイクロＲＮＡ、およびアプタマーが含まれる。これらの核酸が開発されていることから、簡単に作製でき、かつ標的組織に容易に送達することができる脂質処方物を製造する必要性が存在する。
【０００７】
発明の概要
本発明の一態様は、カチオン性脂質とポリヌクレオチドとの固体混合物からなる組成物であり、このカチオン性脂質分子はポリヌクレオチドと水不溶性のイオン性複合体を形成する（以下、脂質／核酸塩とする）。一実施形態において、脂質／核酸塩における、カチオン性脂質のポリヌクレオチドのヌクレオチドモノマーに対するモル比が０．１〜１０、好ましくは０．５〜２である。本発明の実施形態は、カチオン性脂質が、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；３−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）；および１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）、Ｎ4−スペルミジンコレストリルカルバメート（ＧＬ−５３）、１−（Ｎ4−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（ＧＬ−８９）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、脂質／核酸塩である。最も好ましくは、この脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、およびＤＯＴＭＡからなる群から選択される。本発明の別の態様は、核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、antagamer、プラスミドベースの干渉核酸（ｉＮＡ）、リボザイム、低分子干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、脂質／核酸塩である。好ましくは、この脂質／核酸塩は、無水固体の形態、すなわち真空中（ｉｎ ｖａｃｕｏ）で、または気流下、好ましくは窒素ガス流下で乾燥させることによって、水を除去したものである。
【０００８】
本発明の別の態様は、水性溶媒中でカチオン性脂質とポリヌクレオチドとを混合し、水不溶性沈殿物を生成し、この沈殿物を単離し、この沈殿物を乾燥させる方法によって作製される脂質／核酸塩である。一実施形態は、有機溶媒もしくは極性非プロトン性溶媒に可溶化することができる脂質／核酸塩である。
【０００９】
本発明の別の態様は、有機溶媒もしくは非プロトン性溶媒に溶解した脂質／核酸塩を含む溶液（「溶液」）である。
【００１０】
一実施形態は、カルバメート、好ましくはＮ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミンコレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミジンコレステリルカルバメート、１−（Ｎ４−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート、および２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテートからなる群から選択されるカルバメートをさらに含む溶液である。
【００１１】
別の実施形態は、中性リン脂質、好ましくはホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、およびジホスファチジルグリセロールからなる群から選択されるリン脂質、好ましくは炭素８〜２２個のアルキル鎖、最も好ましくは１８：２、２０：４、および２２：６アルキル鎖からなる群から選択される鎖から構成されるリン脂質をさらに含む溶液である。
【００１２】
別の実施形態は、ステロール、好ましくはコレステロール、ラノステロール、２４−イソプロピルコレステロール、ニカステロール、７−デヒドロコレステロール、２４−デヒドロコレステロール、ゴルゴステロール、ジノステロール、２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、カンペステロール、フコステロール、β−シトステロール、フィトスタノール、ステロールエステル、ステリルグリコシド、およびステリルアルキルエーテルからなる群から選択されたステロールをさらに含む溶液である。
【００１３】
別の実施形態は、脂質−ＰＥＧ化合物をさらに含む溶液であり、好ましくはこの脂質はリン脂質またはステロールであり、好ましくは分子量２００〜５０００ｋＤａのＰＥＧを有する。
【００１４】
本発明の別の態様は、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合コレステロール（１Ｋ）、リン脂質、およびＮ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメートからなる群から選択される１つ以上の脂質を含む溶液をさらに含む溶液である。一実施形態は、ホスファチジルエタノールアミンが、場合により不飽和結合を含む８〜２４アルキル鎖からなる溶液である。別の実施形態は、さまざまな比率の上記の組成物、好ましくはポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート４．４部／ホスファチジルエタノールアミン４．４部／コレステロールＰＥＧ１４．４部／コレステロール１．６部（質量／質量）をさらに含む溶液である。別の実施形態は、ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート８．８部／ホスファチジルエタノールアミン２．２部／コレステロールＰＥＧ１４．４部／コレステロール１．６部（質量／質量）をさらに含む溶液である。別の実施形態は、ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート６．６部／ホスファチジルエタノールアミン２．２部／コレステロールＰＥＧ１４．４部／コレステロール１．６部（質量／質量）をさらに含む溶液である。別の実施形態は、ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート４．４部／ホスファチジルエタノールアミン４．４部／コレステロールＰＥＧ２１．６部／コレステロール４．８部（質量／質量）をさらに含む溶液である。
【００１５】
本発明の別の態様は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、およびＣ１６−ＰＥＧ７５０セラミドをさらに含む溶液である。
【００１６】
本発明の別の態様は、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ、コレステロール−ＰＥＧからなる群から選択される脂質−ＰＥＧをさらに含む溶液である。
【００１７】
本発明の別の態様は、核酸の皮膚への送達に適した上記の溶液のいずれかである。
【００１８】
本発明の別の態様は、前述の溶液のいずれかから溶媒を除去することで得られる固体処方物である。
【００１９】
本発明の別の態様は、前述の溶液のいずれかから溶媒を除去し、得られた固体を水性溶液に懸濁させて、好ましくは対象への投与に適し、最も好ましくは注射に適した溶液を生成することで得られる水性処方物である。
【００２０】
本発明の別の態様は、治療用分子の肝臓、肺、または腫瘍への送達に適した上記の処方物のいずれかである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】これは、肝臓（ＡｐｏＢ）ｓｉＲＮＡ送達処方物の用量反応曲線を示している。Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、指定の用量レベルで、単一用量０．２ｍｌの処方ＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡを静脈内投与した。注射２日後に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（参照遺伝子としてＧＡＰＤＨ）によって遺伝子発現を解析するために、肝臓を採取した。総コレステロール値を解析するために、血清も採取した。各データポイントは、平均＋ＳＥＭ（ｎ＝６）を表わす。マウス肝臓におけるＡｐｏＢ遺伝子ノックダウンは、血清コレステロール値の変化と相関する。
【図２】これは、単一用量の処方ｓｉＲＮＡを投与量０．２ｍｌ／マウスおよび２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与したＢａｌｂ／Ｃマウスにおける、ＡｐｏＢ遺伝子発現と対応するコレステロール低下の経時的研究を示している。限定された時点で、上述のように遺伝子発現を解析するために、肝臓組織を採取した。肝臓における遺伝子ノックダウンと血清中のコレステロールの変化は、ほぼ３週間持続している。
【図３】１２９Ｓ１／ｓｖＩｍＪマウスに、単一用量のｓｉＲＮＡの肺特異的送達処方物を投与量０．２ｍｌ（４ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ）で静脈内投与した。３日後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（参照遺伝子としてＧＡＰＤＨおよびβ−アクチン）によって遺伝子発現を解析するために、肺および肝臓を採取した。各データポイントは、平均＋ＳＥＭ（ｎ＝５）を表わす。標的遺伝子の発現レベルは、肺（Ａ）では有意にノックダウンされていたが、肝臓（Ｂ）ではノックダウンされていなかった。Ｓｐｅｃａ−１１およびＳｐｅｃａ−１２は、異なる遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである。
【図４】１２９Ｓ１／ｓｖＩｍＪマウスに、単一用量０．２ｍｌの処方ｓｉＲＮＡを指定の用量レベルで静脈内投与した。３日後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（参照遺伝子としてＧＡＰＤＨおよびβ−アクチン）によって遺伝子発現を解析するために、肺（Ａ）および肝臓（Ｂ）を採取した。各データポイントは、平均＋ＳＥＭ（ｎ＝５）を表わす。標的遺伝子の発現レベルは、肺で用量反応的にノックダウンされていた。
【図５】Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、２ｍｇ／ｋｇで、０．２ｍｌの単一用量の処方ｓｉＲＮＡを静脈内投与した。２日後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（参照遺伝子としてＧＡＰＤＨ）によって遺伝子発現を解析するために、腫瘍（Ａ）および肝臓（Ｂ）を採取した。腫瘍モデルは、ＥＭＴ６細胞（Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来のマウス乳房肉腫）を左下葉のグリソン鞘内に注射することによって作成する。各データポイントは、平均＋ＳＥＭ（ｎ＝６）を表わす。
【００２２】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、これらの必要性を満たし、かつ核酸を有機対イオンとともに用いる新規の方法および組成物を提供することによって、さらなる目的および利点を実現する。
【００２３】
本発明は、水不溶性であり安定な形態の有機対イオン核酸塩、とりわけ有機塩−干渉核酸を提供することによって、この要求をさらに満足する。このような水不溶性の沈殿物は、有機カチオン、すなわち疎水基／親油基を有する正荷電化合物（カチオンとしてプロトン化有機アミンを含有する有機化合物、例えばカチオン性脂質およびプロカインを含むが、それらに限定されない）の溶液を核酸の水性溶液と、このカチオン性脂質分子が核酸と複合体を形成する条件下で接触させて、カチオン性化合物−核酸沈殿物を形成することにより生成する。核酸を水不溶性にさせる炭素数またはそれに十分な疎水性度を有するカチオン性有機分子の場合に、沈殿が生じる。得られる沈殿物は、核酸中に存在するヌクレオチドの数と１対１の電荷モル濃度で、カチオン性脂質分子の正電荷の総数を含む。また、核酸中に存在するヌクレオチドの数と１対１未満の電荷モル濃度は、部分的な核酸の沈殿に使用される。この核酸−有機カチオン性脂質沈殿物は、濾過、遠心分離、および化学および物理工程の当業者が利用できるその他の方法を用いて、水性液から回収することができる。沈殿したカチオン性脂質塩を乾燥させ、数々の機械的処理を施して、これを核酸薬処方物の固体剤形および液体剤形に組み込むのに適するようにしてもよい。驚くべきことに、特定の有機カチオンの核酸水不溶性有機沈殿物は、多数の一般的な有機溶媒に容易に溶媒和させることができ、これには極性非プロトン性の溶媒群（ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジン、ジグリム、およびその他のエーテルグリコール、クロロホルム、メチレンクロリド、およびその他のハロゲン化有機溶媒、テトラヒドロフラン、およびその他の環状エーテル溶媒）を含み、これらの溶媒は、無水条件下で使用することができ、試薬を新しい化学形態にする化学的変換および反応における使用で工業的価値を有することが確認されている。
【００２４】
当業者は、核酸沈殿物を無水非プロトン性溶媒に溶媒和させたときに、これを数々の反応性中間体と接触させて、その核酸を化学反応によって新しい形態の核酸に変換させることができることを容易に理解するであろう。これらの反応には、蛍光プローブまたはレポーター分子を付着させるリボースおよびデオキシリボース糖の第１級および第２級アルコールのアシル化、リボース核酸をヌクレアーゼ抵抗性２′Ｏ−メチル化リボース核酸に変換させるメチル化化学反応、核酸の反応性遊離アミノ基を保護するための、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、およびグアニンの環外アミノ基のアミド化が含まれるが、これらに限定されない。末端１級ヒドロキシル基の化学修飾は、極めて容易な反応であると想像され、これを用いてコレステロールと別の疎水性物質とを結合させて、治療用薬および遺伝子送達の用途の核酸ポリマーにすることができる。この方法の有用性は、イノシンおよび転移リボ核酸中に存在する多くの修飾ＲＮＡヌクレオシドを含む、天然リボシドの微量成分の回収および化学修飾にまで広げることができる。これらの化学的変換は、新しい物理的および化学的特性、例えば化学分解および酵素分解に対する耐性の向上、器官、組織、および細胞特異的疾患標的化などに作用し、その他の製薬用途および工業用途における核酸の価値を高めることができる。
【００２５】
核酸溶液とカチオン性脂質の溶液との接触は、典型的には水性溶液である第１の核酸溶液をカチオン性脂質の溶液と一緒に混合することによって実施する。カチオン性脂質は、有機溶媒または水性溶媒のいずれかの溶液であってよい。当業者は、この混合を任意の数の方法によって、例えば機械的手段によって、ボルテックスミキサーまたは注入ポンプおよび撹拌反応器を用いて実施可能なことを理解するであろう。
【００２６】
カチオン性脂質核酸塩の作成に使用可能なカチオン性脂質の例には、選択されたｐＨ、例えば生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ約７．０）で正味の正電荷を有する複数の脂質種のうちのいずれかが含まれる。本明細書において、生理的ｐＨとは、生体液、例えば血液またはリンパ液のｐＨ、ならびに細胞内コンパートメント、例えばエンドソーム、酸性エンドソーム、またはリソソームのｐＨを指す。このような脂質には、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；３−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）；Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）；および１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）が含まれるが、それらに限定されない。以下の脂質：１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡなどは、カチオン性であり、生理的ｐＨ未満で正電荷を有する。これらの脂質および関連する類似体は、同時係属中の米国特許出願第０８／３１６，３９９号；米国特許第５，２０８，０３６号、第５，２６４，６１８号、第５，２７９，８３３号、および第５，２８３，１８５号に記載されている。さらに、複数のカチオン性脂質の市販製剤が入手可能であり、これらは本発明において使用することができる。カチオン性脂質以外に、正電荷を有するいかなる有機カチオンも核酸沈殿に使用でき、同じように使用できる可能性がある。
【００２７】
カチオン−核酸沈殿物の作成に使用可能な有機カチオンは、水性液中でミセルを形成しても、可溶化された状態でアルコール中に含まれても、あるいは水性液とアルコールとの混合物中に含まれてもよい。また、一部の例では、有機カチオンは別の有機溶液、例えばクロロホルム中に含まれ、これを核酸を含有する水性溶液と混合することができる。有機溶媒の蒸発後、沈殿物が形成される。
【００２８】
本開示は、核酸、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、アンタゴｍｉｒ、および遺伝子サイレンシング核酸などの治療的送達に有用な薬学的に許容される核酸組成物を提供する。これらの組成物および方法は、哺乳動物における疾患の予防および／または処置に使用することができる。本発明のカチオン性脂質核酸塩は、有機溶媒、例えばジクロロメタン、クロロホルム、ＴＨＦ、１−オクタノール、および多くの生体適合性溶媒、例えばＤＭＳＯ、ジメチルアセトアミド、ラウロイルグリコール、およびその他の油性媒体、例えばミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸エステル、メチル、エチル、イソプロピル、および高級アルキル置換基に対する劇的に向上した溶解性を有するカチオン性核酸塩をもたらす。
【００２９】
これらのカチオン性脂質核酸塩は、次いで有機溶媒に再懸濁させ、別の脂質と混合して核酸脂質複合体を生成することができ、これを核酸としてプラスミドＤＮＡを用いる遺伝子治療のために、またはアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムを用いた遺伝子の下方制御のために、または核酸としてアプタマーを用いてその他の症状を抑制するために、個人に投与することができる。
【００３０】
定義
ここに示す技術用語の定義は、当業者に既知のこれらの用語に関する意味を詳述することなく含むものと解釈されるべきであり、また本発明の範囲を制限するものではない。
【００３１】
本発明の説明および請求項における用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および類似する用語の使用は、単数および複数を含むものとする。用語「包含する」、「有する」、「含む」、および「含有する」は、非限定的な用語として解釈され、すなわち、例えば「含むが、それらに限定されない」を意味する。本明細書における値の範囲の記述は、その範囲内に含まれるそれぞれのあらゆる個々の値をそれが本明細書に個別に記述されているのと同様に個別に指し、これはその範囲内の値の一部が明記されているか否かには関わらない。本明細書において使用する特定の値は、例であり、本発明の範囲を制限するものではないと理解される。
【００３２】
用語「有機カチオン」および「カチオン性脂質」は、選択されたｐＨ、例えば生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ約７．０）で正味の正電荷を有する複数の脂質種または有機化合物のうちのいずれかを指す。本発明においても有用な複数のカチオン性脂質および関連する類似体は、米国特許公開第２００６００８３７８０号；米国特許第５，２０８，０３６号；第５，２６４，６１８号；第５，２７９，８３３号；第５，２８３，１８５号；第５，７５３，６１３号；米国特許第第５，７６７，０９９号および第５，７８５，９９２号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ ９６／１０３９０号に記載されている。カチオン性脂質の例には、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）、Ｎ4−スペルミジンコレストリルカルバメート（ＧＬ−５３）、１−（Ｎ4−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（ＧＬ−８９）、およびそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。非限定的な例として、生理的ｐＨ未満で正電荷を有するカチオン性脂質には、１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ＤＯＤＭＡ、およびＤＳＤＭＡが含まれるが、それらに限定されない。一部の例では、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第３級アミン頭部基、Ｃ１８アルキル鎖、頭部基とアルキル鎖との間のエーテル結合、および０〜３個の二重結合を含む。このような脂質には、例えば、ＤＳＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、およびＤＯＤＭＡが含まれる。また、カチオン性脂質は、エーテル結合およびｐＨ滴定可能な頭部基も含んでいてよい。このような脂質には、例えばＤＯＤＭＡが含まれる。カチオン性脂質は、例えば、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、またはそれらの混合物であってもよい。本発明において有用なカチオン性脂質は、生理的ｐＨで正味の正電荷を有する複数の脂質種のうちのいずれであってもよい。このような脂質には、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＤＭＡ、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＭＲＩＥ、およびそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。さらに、複数のカチオン性脂質の市販製剤が入手可能であり、これらは本発明において使用することができる。
【００３３】
本明細書において、干渉核酸（ｉＮＡ）という用語は、ＲＩＳＣ複合体に進入したときにｍＲＮＡの酵素分解を誘導する、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する核酸二本鎖を指す。一般に、各鎖はＲＮＡヌクレオチドを主に含むが、これらの鎖はＲＮＡ類似体、ＲＮＡとＲＮＡ類似体、ＲＮＡとＤＮＡ、ＲＮＡ類似体とＤＮＡ、あるいはｉＮＡ構築体が相同ｍＲＮＡの酵素分解を誘導する限りにおいて、完全にＤＮＡである一本鎖とＲＮＡである一本鎖を含みうる。
【００３４】
極性非プロトン性溶媒は、プロトン性溶媒とイオン溶解力を共有するが、酸性水素を有さない溶媒である。これらの溶媒は、一般に、高誘電率および高極性を有する。極性非プロトン性溶媒の例は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびヘキサメチルホスホロトリアミド、アセトン、アセトニトリル、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、アセトニトリル、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）、ピリジン、テトラメチル尿素（ＴＭＵ）、尿素類似体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドＨＣＯＮ（ＣＨ３）２、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）ＣＨ３ＣＯＮ（ＣＨ３）２、およびテトラメチル尿素（ＣＨ３）２ＮＣＯＮ（ＣＨ３）２、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、および１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（ｌＨ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）である。比較的有毒なヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）をＤＭＰＵに置き換えることが可能である。
【００３５】
本明細書において、「アプタマー」または「核酸アプタマー」という用語は、標的分子と特異的に結合する核酸分子であって、自然状態で標的分子によって認識される配列を含む核酸分子を包含する。あるいは、アプタマーは、標的分子と結合する核酸分子であってもよく、このとき標的分子は核酸と自然には結合しない。
【００３６】
例えば、アプタマーを用いて、タンパク質のリガンド結合ドメインと結合させ、それにより天然リガンドとタンパク質との相互作用を妨げることができる。例えば、Ｇｏｌｄ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：７６３， １９９５； ＢｒｏｄｙおよびＧｏｌｄ， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：５， ２０００； Ｓｕｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２：１００， ２０００； Ｋｕｓｓｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：２７， ２０００； Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０， ２０００； およびＪａｙａｓｅｎａ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１６２８， １９９９を参照されたい。
【００３７】
「アンチセンス核酸」とは、ＲＮＡ−−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５， ５６６）相互作用によって標的ＲＮＡに結合して、標的ＲＮＡの活性を変化させる非酵素的核酸分子を意味する（概説は、ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ， １９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１， １００４、およびＷｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，８４９，９０２号を参照）。典型的には、アンチセンス分子は、アンチセンス分子の単一の連続する配列に沿って標的配列に相補的である。しかしながら、特定の実施形態では、アンチセンス分子は、基質分子がループを形成するように基質に結合することができ、および／またはアンチセンス分子は、アンチセンス分子がループを形成するように結合することができる。したがって、アンチセンス分子は、２つ（またはそれ以上）の非連続的基質配列に相補的であってもよく、またはアンチセンス分子の２つ（またはそれ以上）の非連続的配列部分が標的配列に相補的であってもよく、またはそれら両方であってもよい。さらに、アンチセンスＤＮＡを使用して、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によってＲＮＡを標的としてもよく、それによってＲＮａｓｅＨを活性化し、これが二本鎖中の標的ＲＮＡを消化する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈ切断を活性化することができる、１つ以上のＲＮＡｓｅ Ｈ活性化領域を含んでもよい。アンチセンスＤＮＡは、化学的に合成しても、または一本鎖ＤＮＡ発現ベクターまたはその同等物を用いて発現させてもよい。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡ鎖であり、標的遺伝子ｍＲＮＡに結合することによってＲＮＡｉを誘導することができる。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡ鎖であり、標的遺伝子ｍＲＮＡに結合することによってＲＮＡｉを誘導すると考えられている。「センスＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡに相補的な配列を有し、その相補的アンチセンスＲＮＡにアニールされてｉＮＡを形成する。これらのアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡは従来、ＲＮＡ合成機を用いて合成されてきた。
【００３８】
「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖形態または二本鎖形態のポリマーを指す。この用語は、合成、天然、および非天然であって、参照核酸と類似する結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似する形で代謝される、既知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは結合を含む核酸を包含する。このような類似体の例には、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２′−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、それらに限定されない。
【００３９】
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２′位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより作製されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または改変により、天然のＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含む。このような改変は、例えば干渉ＲＮＡの末端または内部への、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の付加を含みうる。また、本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば非天然ヌクレオチド、または化学的に合成されたヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチド含みうる。これらの改変ＲＮＡは、類似体または天然ＲＮＡの類似体と称することができる。本明細書において、「リボ核酸」および「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を指す。リボヌクレオチドは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２′位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドである。これらの用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより作製されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、修飾、および／または改変により、天然のＲＮＡとは異なる修飾および改変ＲＮＡを含む。ＲＮＡの改変には、例えば干渉ＲＮＡの末端または内部への、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチド（ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば非天然ヌクレオチド、または化学的に合成されたヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドを含む）における、非ヌクレオチド物質の付加を含みうる。これらの改変ＲＮＡは、類似体と称することができる。
【００４０】
本明細書において「ヌクレオチド」とは、当該技術分野において認識されているように、天然塩基（標準的）および当該技術分野で周知の修飾塩基を含むものである。このような塩基は、一般に、ヌクレオチドの糖部分の１′位に位置する。ヌクレオチドは、一般に、塩基、糖、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖部分、リン酸部分、および／または塩基部分で修飾されていなくても、または修飾されていてもよい（同じ意味で、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどと称することもできる；例えば、全て参考として本明細書で援用される、ＵｓｍａｎおよびＭｃＳｗｉｇｇｅｎ， ｓｕｐｒａ； Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ， 国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ９２／０７０６５号； Ｕｓｍａｎ， ｅｔ ａｌ， 国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ９３／１５１８７号； Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ， ｓｕｐｒａを参照）。Ｌｉｍｂａｃｈ， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：２１８３， １９９４に要約されているように、当該技術分野で既知の修飾核酸塩基にはいくつかの例がある。核酸分子に導入することができる塩基修飾の非限定的ないくつかの例には、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、または６−アザピリミジンもしくは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピンなどが含まれる（Ｂｕｒｇｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４０９０， １９９６； Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ， ｓｕｐｒａ）。本態様における「修飾塩基」とは、１′位のアデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル以外のヌクレオチド塩基、またはそれらの同等物を意味する。
【００４１】
本明細書において相補的なヌクレオチド塩基とは、互いに水素結合を形成する一対のヌクレオチド塩基である。ＲＮＡにおいてアデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）と対合し、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と対合する。核酸の相補的セグメントもしくは鎖は、互いにハイブリダイズする（水素結合により接合する）。「相補性」とは、核酸が、伝統的なワトソン・クリックによって、または別の非伝統的な結合様式によって、別の核酸配列と水素結合を形成しうることを意味する。
【００４２】
アンタゴｍｉｒは、新規の群の化学的に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つである。アンタゴｍｉｒは、内因性マイクロＲＮＡのサイレンシングに使用される。
【００４３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、長さ約２１〜２３ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子であり、これは遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写される遺伝子によってコードされるが、タンパク質には翻訳されない（非コードＲＮＡ）；その代わり、これらはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして既知の一次転写産物からｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれるショートステムループ構造に、そして最終的には機能的ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に部分的に相補的であり、これらの主な機能は、遺伝子発現を下方制御することである。
【００４４】
短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られている、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）という用語は、本明細書において、生物学においてさまざまな役目を果たす、長さ１６〜２９ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ分子の群を指して用いられる。最も注目に値するのは、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与し、そこで特定の遺伝子の発現に干渉することである。ＲＮＡｉ経路における役目に加え、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ関連経路においても、例えば抗ウイルス機構として、またはゲノムのクロマチン構造を形成する際にも機能を果たす。これらの経路の複雑性はようやく解明されだしたばかりである。
【００４５】
本明細書において、ＲＮＡｉという用語は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって制御され、細胞内の短い二本鎖ＲＮＡ分子によって開始されて、これらが触媒ＲＩＳＣ成分アルゴノートと相互作用する、ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングプロセスを指す。二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ様ｉＮＡもしくはｓｉＲＮＡが外因性（ＲＮＡゲノムを有するウイルスによる感染、またはトランスフェクトしたｉＮＡもしくはｓｉＲＮＡに起因する）である場合、ＲＮＡまたはｉＮＡは、細胞質内に直接取り込まれ、酵素ダイサーによって短い断片に切断される。また、開始ｄｓＲＮＡは、ゲノム内のＲＮＡコード遺伝子から発現したｐｒｅ−マイクロＲＮＡにように、内在性（細胞に由来する）であってもよい。そのような遺伝子からの一次転写産物は、まずプロセスされて、核内でｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの特徴的なステムループ構造を形成し、次いで細胞質に輸送されてダイサーによって切断される。したがって、外因性と内在性との２つのｄｓＲＮＡ経路は、ＲＩＳＣ複合体内に集まる。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性成分は、アルゴノートタンパク質と呼ばれるエンドヌクレアーゼであり、これらはその結合したｓｉＲＮＡもしくはｉＮＡに相補的な標的ｍＲＮＡ鎖を切断する。ダイサーにより生成された断片は二本鎖であるため、これらはそれぞれ理論上は、機能的ｓｉＲＮＡもしくはｉＮＡを生成することができる。しかしながら、二本の鎖のうちガイド鎖として知られる一本のみがアルゴノートタンパク質と結合し、遺伝子サイレンシングを導く。他方の非ガイド鎖、すなわちパッセンジャー鎖は、ＲＩＳＣ活性化時に分解される。
【００４６】
保存料の例には、フェノール、メチルパラベン、パラベン、ｍ−クレゾール、チオマーサル、塩化ベンジルアルコニウム、およびそれらの混合物が含まれる。
【００４７】
コア複合体
好ましくは、カチオン性脂質核酸塩を有機溶媒、とりわけ非プロトン性極性溶媒中の溶液の形態にして処方物を形成し、これを上述の１つ以上の脂質の溶液と混合する。これらの脂質は、有機溶媒、好ましくは非プロトン性極性溶媒中の溶液の形態である。
【００４８】
カチオン性脂質核酸塩を作製する際に使用可能なカチオン性脂質の例には、選択されたｐＨ、例えば生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ約７．０）で、正味の正電荷を有する複数の脂質種のうちのいずれかが含まれる。本明細書において、生理的ｐＨとは、生体液、例えば血液またはリンパ液のｐＨ、ならびに細胞内コンパートメント、例えばエンドソーム、酸性エンドソーム、またはリソソームのｐＨを指す）。そのような脂質には、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；３−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）；Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）；および１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）が含まれるが、それらに限定されない。以下の脂質：１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡなどは、カチオン性であり、生理的ｐＨ未満で正電荷を有する。これらの脂質および関連する類似体は、同時係属中の米国特許出願第０８／３１６，３９９号；米国特許第５，２０８，０３６号、第５，２６４，６１８号、第５，２７９，８３３号、および第５，２８３，１８５号に記載されている。さらに、複数のカチオン性脂質の市販製剤が入手可能であり、これらは本開示において使用することができる。
【００４９】
炭素数６超、好ましくは１５超、最も好ましくは１８超の特定の有機カチオンの核酸カチオン性有機塩沈殿物は、多くの一般的な有機溶媒に容易に溶媒和させることができ、これには極性非プロトン性の溶媒群（ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジン、ジグリム、およびその他のエーテルグリコール、クロロホルム、メチレンクロリド、およびその他のハロゲン化有機溶媒、テトラヒドロフラン、およびその他の環状エーテル溶媒）を含む。これらの溶媒は、無水条件下で使用することができ、試薬を新しい化学形態にする化学的変換および反応における使用で工業的価値を有する。
【００５０】
核酸溶液とカチオン性脂質溶液との接触は、典型的には水性溶液である核酸溶液をカチオン性脂質溶液と一緒に混合することによって実施する。カチオン性脂質は、有機溶媒または水性溶媒のいずれかの溶液であってもよい。カチオン性脂質の核酸中に存在するヌクレオチドに対する比率は、好ましくは２〜３：１（質量比）であるべきである。当業者は、この混合を任意の数の方法によって、例えば機械的手段によって、例えばボルテックス、ミキサー、または注入ポンプおよび撹拌反応器を用いて実施可能なことを理解するであろう。
【００５１】
共脂質を含む処方物
生物活性分子、特に核酸分子、例えばＤＮＡおよびｓｉＲＮＡの細胞内送達を促進するように設計された化合物は、たいていは極性ドメインと非極性ドメインとを有するため、これらは極性環境および非極性環境の双方と相互作用することができる。そのような両ドメインを有する化合物は、両親媒性物質と呼ぶことができ、開示されているそのような細胞内送達を促進する際に使用するための多くの脂質および合成脂質（ｉｎ ｖｉｔｒｏ応用またはｉｎ ｖｉｖｏ応用に関わらず）が、この定義に当てはまる。
【００５２】
コア複合体は、有機溶媒もしくは極性非プロトン性溶媒中の共脂質と混合してよい。共脂質は、（ｉ）脂質カルバメート、（ｉｉ）中性リン脂質、（ｉｉｉ）ステロール、および（ｉｖ）ステロール−ＰＥＧ化合物からなる群から選択される、１つ以上の脂質である。
【００５３】
脂質カルバメートは、以下の分子を含む。
【００５４】
【化１】
［式中、
ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔは、互いに独立して、０〜１６から選択され、
ＸおよびＹは、互いに独立して、Ｈ、Ａｃ、Ｂｏｃ、またはＰｉｖからなる群から、あるいはＣ、アミド、カルバメート、スクシンアミド、マレイミド、エポキシド、およびウレタンからなるリンカー群から選択され、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、互いに独立して、Ｃ１〜Ｃ２６アルカンもしくはアルケン、多価不飽和脂質、ステロイド、ＰＵＦＡ、グアニジン、またはアルギニンからなる群から任意の組み合わせで選択され、このときステロイドは、ラノステロール、エルゴステロール、デスモステロール、植物フィトステロール、例えばスチグマステロール、または胆汁塩もしくは胆汁塩誘導体、例えばコール酸、デオキシコール酸、ヒドロデオキシコール酸、またはデヒドロコール酸からなる群から選択される。］
好適な実施形態を以下の一覧に示す（α群、β群、およびγ群；式Ｉ−ＬＸＶＩＩＩ）。式中、Ｒ1はＨであり；Ｒ2は、Ｍｅまたはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）であり；Ｒ1およびＲ2は、グアニジニルまたはＮ−ＣＮＮＨであり；あるいはＲ1はＨであり、Ｒ2はアミド結合の形成によるアルギニンである。コレステロール部分は、ラノステロール、エルゴステロール、デスモステロール、植物フィトステロール、例えばスチグマステロール、または胆汁塩もしくは胆汁塩誘導体、例えばコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、およびデヒドロコール酸に置き換えてもよい。
【００５５】
【化２】
【００５６】
【化３】
【００５７】
【化４】
【００５８】
【化５】
【００５９】
【化６】
【００６０】
【化７】
【００６１】
【化８】
【００６２】
【化９】
【００６３】
【化１０】
【００６４】
【化１１】
【００６５】
【化１２】
【００６６】
【化１３】
【００６７】
３種の塩基性ポリアミン分子から誘導された分子のその他の例は以下の通りである。
【００６８】
【化１４】
【００６９】
【化１５】
【００７０】
【化１６】
【００７１】
【化１７】
【００７２】
【化１８】
【００７３】
【化１９】
【００７４】
【化２０】
【００７５】
【化２１】
【００７６】
【化２２】
【００７７】
【化２３】
【００７８】
使用可能な多価カチオン性脂質ポリアミン、例えばＮ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート、およびリポスペルミンの例には、Ｎ４−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）、Ｎ４−スペルミジンコレステリルカルバメート（ＧＬ−５３）、１−（Ｎ４−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（ＧＬ−８９）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、ＤＯＧＳ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテートが含まれる。リポスペルミンおよびリポスペルミジンは、イオン電荷複合体を形成する核酸鎖のリン酸の酸素と複合体を形成しうる、３個以上のアミド水素を有するカチオン性基と共有結合した、１つ以上の疎水性鎖からなる二官能性分子である。
【００７９】
好適なカルバメートはコレステロール様化合物：Ｎ6−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメートであり、以下の構造：
【化２４】
を有する。
【００８０】
中性リン脂質には、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、およびジホスファチジルグリセロールが含まれるが、それらに限定されない。リン脂質アシル（脂肪酸）鎖は、飽和であっても、またはそのいずれかのアシル鎖に１つ以上の不飽和結合を有してもよく、鎖はそれぞれ８個から約２６個の炭素原子を有し、同じ（対称）または異なる（非対称）。アシル鎖中の二重結合は、独立して、シスまたはトランスのいずれかであってよく、この例としては、１−アシル鎖と２−アシル鎖が含まれ、それぞれが、独立して、リノレオイル（１８：２）、リノレノイル（１８：３）、アラキドノイル（２０：４）、およびドコサヘキサエノイル（２２：６）からなる群から選択される。
【００８１】
ステロールには、コレステロール、ラノステロール、２４−イソプロピルコレステロール、ニカステロール、７−デヒドロコレステロール、２４−デヒドロコレステロール、ゴルゴステロール、ジノステロール、２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール、およびフィトステロール（エルゴステロール、スチグマステロール、カンペステロール、フコステロール、β−シトステロールを含む）、およびフィトスタノール、ならびにステロールエステル、ステリルグリコシド、およびステリルアルキルエーテルが含まれる。
【００８２】
ステロール−ＰＥＧ化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合したステロール、例えばＰＥＧ結合コレステロールであり、このときＰＥＧは、５０００ダルトン未満、好ましくは２０００ダルトン未満、最も好ましくは２００〜１０００ダルトンである。
【００８３】
請求項に記載の処方物中に使用する、固体の安定形態のカチオン性脂質核酸塩、とりわけカチオン性脂質干渉核酸塩は、カチオン性脂質の溶液を核酸の水性溶液と、このカチオン性脂質分子が核酸と複合体を形成する条件下で接触させて、カチオン性脂質核酸塩沈殿物を形成することにより生成する。親油性部分を有する、あるいは核酸を水不溶性にさせるのに十分な疎水性度を有するカチオン性有機分子の場合に、沈殿が生じる。得られる沈殿物は、核酸を完全な親水性からより低い親水性へと低下させる、あるいは核酸を部分的もしくは完全に疎水性にさせる、好ましくは核酸中に存在するヌクレオチドの数と１対１のモル濃度の比のカチオン性脂質分子の正電荷の総数を含む。この核酸塩有機カチオン性脂質沈殿物は、濾過、遠心分離、および化学工程の分野の当業者が利用できるその他の方法を用いて、水性液から回収することができる。沈殿したカチオン性脂質塩を乾燥させ、数々の機械的処理を施して、これを核酸薬剤の固体剤形および液体剤形に組み込むのに適するようにしてもよい。
【００８４】
次いで、カチオン性脂質核酸塩を１つ以上の脂質、例えば別のカチオン性脂質である両親媒性物質、例えばＮ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート、リン脂質、疎水性脂質、好ましくはステロール、例えばコレステロール、およびＰＥＧ結合脂質、好ましくはＰＥＧ結合ステロールと混合することによって、処方物を生成する。
【００８５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合脂質には、ＰＥＧ結合コレステロールおよびＰＥＧ結合コレステロール誘導体、およびＰＥＧ結合フィトステロール、例えばＰＥＧ−カンペステロール、ＰＥＧ−シトステロール、およびＰＥＧ−スチグマステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ、およびセラミド−ＰＥＧが含まれる。
【００８６】
本開示は、核酸、プラスミド、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、アンタゴｍｉｒ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、遺伝子サイレンシング干渉核酸、およびそれらの混合物の治療的送達に有用な、薬学的に許容される核酸組成物を提供する。これらの組成物および方法は、哺乳動物における疾患の予防および／または処置に使用することができる。
【００８７】
請求項に記載の脂質／核酸処方物は、カチオン性脂質核酸塩を有機溶媒または非プロトン性溶媒に再懸濁させることによって作製することができ、別の脂質と混合し、溶媒の蒸発なのどのさらなる処理を行なって核酸脂質複合体を生成することができる。これを個人に投与して、核酸としてプラスミドＤＮＡを用いた遺伝子治療、またはアンチセンス、リボザイム、アンタゴｍｉｒ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｉＮＡを用いた遺伝子の下方制御、または核酸としてアプタマーを用いたその他の状態の抑制を行なうことができる。
【００８８】
また、本開示は、これらの必要性を満たし、かつ６００ｎｍを下回る、好ましくは４００ｎｍを下回る、最も好ましくは２００ｎｍを下回る単分散の粒径分布を有する脂質と核酸との自己乳化性複合体を提供することによって、さらなる目的および利点を実現する。
【００８９】
投与のための組成物および処方物
本開示の核酸−脂質組成物は、さまざまな経路により投与して、例えば、静脈内経路、非経口経路、腹腔内経路、または局所経路により、全身送達を実施することができる。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡを細胞内に、例えば肺や肝臓などの標的組織あるいは炎症組織の細胞内に送達することができる。一部の実施形態では、本開示は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡの送達のための方法を提供する。核酸−脂質組成物は、対象に静脈内投与、皮下投与、または腹腔内投与することができる。一部の実施形態では、本開示は、哺乳動物対象の肺への干渉ＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達ための方法を提供する。
【００９０】
一部の実施形態では、本開示は、哺乳動物対象において疾患または障害を処置する方法を提供する。核酸、カチオン性脂質、両親媒性物質、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ結合コレステロールを含有する本開示の組成物の治療有効量を、この組成物による低下、減少、下方制御、またはサイレンシングが可能な遺伝子の発現または過剰発現に関連する疾患または障害を有する対象に投与することができる。
【００９１】
本開示の組成物および方法は、種々の粘膜投与法により対象に投与することができるが、これには経口送達、直腸送達、膣内送達、鼻腔内送達、肺内送達、または経皮的送達もしくは皮膚送達によるもの、あるいは目、耳、皮膚、またはその他の粘膜面への局所送達によるものが含まれる。本開示の一部の態様において、粘膜組織層は上皮細胞層を含む。この上皮細胞は、肺上皮細胞、気道上皮細胞、気管支上皮細胞、肺胞上皮細胞、鼻上皮細胞、口腔上皮細胞、表皮上皮細胞、または胃腸上皮細胞であってよい。本開示の組成物は、従来の作動装置、例えば機械的スプレー装置、ならびに加圧式、電気作動式、またはその他のタイプの作動装置を用いて投与することができる。
【００９２】
本開示の組成物は、鼻用スプレーまたは肺用スプレーとして水性溶液の形態で投与してもよく、当業者に既知の種々の方法によってスプレー形態で投薬してもよい。本開示の組成物の肺送達は、エアロゾル化、微粒化、または霧化されていてもよい、液滴、粒子、またはスプレーの形態の組成物を投与することによって達成される。組成物の粒子、スプレー、またはエアロゾルは、液体または固体のいずれかの形態であってもよい。鼻用スプレーとして液剤を投薬するのに好適なシステムは、米国特許第４，５１１，０６９号に記載されている。このような処方物は、好都合には、本開示による組成物を水に溶解させて水性溶液を生成し、その溶液を殺菌することによって製造することができる。この処方物は、多回投与容器、例えば米国特許第４，５１１，０６９号に開示されている密封式投薬システムで付与することができる。その他の適切な鼻用スプレー送達システムは、Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ， Ｙ． Ｗ． Ｃｈｉｅｎ ｅｄ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８５；および米国特許第４，７７８，８１０号に記載されている。さらなるエアロゾル送達形態には、例えば、圧縮空気ネブライザー、ジェットネブライザー、超音波ネブライザー、および圧電式ネブライザーを含んでもよく、これらは薬剤溶媒、たとえば水、エタノール、またはそれらの混合物などに溶解または懸濁させた生物活性物質を送達する。
【００９３】
本開示の鼻用および肺用スプレー溶液は、典型的には、薬剤、または場合により界面活性剤、例えば非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート−８０）および１つ以上の緩衝剤を含んで処方された送達用の薬剤を含む。本開示の一部の実施形態では、鼻用スプレー溶液は、推進剤をさらに含む。鼻用スプレー溶液のｐＨは、およそｐＨ６．８〜７．２であってよい。また、使用する薬剤溶媒は、ｐＨ４〜６の弱酸性の水性緩衝剤であってもよい。化学的安定性を向上または維持するために、他の成分を添加してもよく、これには保存料、界面活性剤、分散剤、またはガスが含まれる。
【００９４】
一部の実施形態では、本開示の組成物を含有する溶液と、肺用、粘膜用、または鼻腔内用のスプレーもしくはエアロゾルの作動装置とを含む医薬製品が開示される。
【００９５】
本開示の組成物の剤形は、液滴または乳剤の形態、あるいはエアロゾルの形態の液体であってよい。
【００９６】
本開示の組成物の剤形は固体であってもよく、これは投与前に液体中で再構成させることができる。この固体は、粉剤として投与してもよい。この固体は、カプセル剤、錠剤、またはゲルの形態であってもよい。
【００９７】
本開示の範囲内で肺送達用の組成物を処方するために、生物活性物質を種々の薬学的に許容される添加剤、ならびに活性物質を分散させるための基剤または担体と混合することができる。添加剤の例には、ｐＨ調整剤、例えばアルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸、およびそれらの混合物が含まれる。その他の添加剤には、局所麻酔薬（例えば、ベンジルアルコール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）、溶解度向上剤（例えば、シクロデキストリンおよびそれらの誘導体）、安定剤（例えば、血清アルブミン）、および還元剤（例えば、グルタチオン）が含まれる。粘膜送達用組成物が液剤である場合、０．９％（ｗ／ｖ）生理食塩溶液の浸透圧（１とする）を基準にして測定した処方物の浸透圧は、典型的には、投与部位の粘膜に実質的な不可逆的組織損傷を生じさせない値に調整する。一般に、溶液の浸透圧は、約１／３〜３、より典型的には１／２〜２、最も多くの場合３／４〜１．７の値に調整する。
【００９８】
生物活性物質は、基剤または媒体中に分散されていてもよく、これにはその活性物質および任意の所望の添加剤を分散させることができる親水性化合物を含んでいてもよい。基剤は、さまざまな適切な担体から選択することができ、これにはポリカルボン酸もしくはその塩、カルボン酸無水物（例えば、マレイン酸無水物）と別のモノマー（例えば、メチル（メタ）アクリレート、アクリル酸など）とのコポリマー、親水性ビニルポリマー、例えばポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース誘導体、例えばヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど、および天然ポリマー、例えばキトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸、およびそれらの非毒性金属塩が含まれるが、それらに限定されない。多くの場合、基剤または担体として、生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸−グリコール酸）コポリマー、およびそれらの混合物が選択される。代替的または付加的に、合成脂肪酸エステル、例えばポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなども担体として使用することができる。親水性ポリマーおよびその他の担体は、単独でまたは組み合わせて使用することができ、部分結晶化、イオン結合、架橋などにより、担体の構造完全性を向上させることができる。担体は、流体もしくは粘性溶液、ゲル、ペースト、粉末、マイクロスフェア、およびフィルムを含むさまざまな形態で提供して、鼻粘膜に直接塗布することができる。これに関連して、選択された担体の使用は、生物活性物質の吸収促進をもたらしうる。
【００９９】
粘膜送達用、鼻送達用、または肺送達用の処方物は、基剤または賦形剤として、親水性低分子量化合物を含有していてもよい。そのような親水性低分子量化合物は通過媒体を提供し、それを通して水溶性活性物質、例えば生理活性ペプチドもしくはタンパク質が基剤を通って身体表面に拡散することができ、そこで活性物質が吸収される。親水性低分子量化合物は、場合により、粘膜または投与環境から水分を吸収し、水溶性の活性ペプチドを溶解させる。親水性低分子量化合物の分子量は、一般に１０，０００以下、好ましくは３０００以下である。親水性低分子量化合物の例には、ポリオール化合物、例えばオリゴ糖、二糖、および単糖が含まれ、これにはショ糖、マンニトール、乳糖、Ｌ−アラビノース、Ｄ−エリトロース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、ラクツロース、セロビオース、ゲンチビオース、グリセリン、ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物を含む。親水性低分子量化合物のさらなる例には、Ｎ−メチルピロリドン、アルコール（例えば、オリゴビニルアルコール、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコールなど）、およびそれらの混合物が含まれる。
【０１００】
あるいは、本開示の組成物は、薬学的に許容される担体物質として、生理的条件に近づけるために必要とされる物質、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、および湿潤剤、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、およびそれらの混合物を含有してもよい。固体組成物の場合、従来の非毒性の薬学的に許容される担体を用いてもよく、これには例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが含まれる。
【０１０１】
本開示の特定の実施形態では、生物活性物質は、徐放性処方物として、例えば、持続放出性ポリマーを含む組成物として投与してもよい。活性物質は、迅速放出を防ぐ担体、例えば制御放出媒体、例えばポリマー、マイクロカプセル化送達系、または生体接着ゲルを用いて製造することができる。本開示の種々の組成物における活性物質の持続的送達は、組成物中に吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムヒドロゲルおよびゼラチンを含めることによって実現することができる。
【０１０２】
本開示を特定の実施形態に関連して記載し、説明の目的で多くの詳細を示してきたが、本開示がさらなる実施形態を含むこと、また本明細書に記載されている詳細の一部を本開示から逸脱することなく大幅に変更することができることは、当業者には明らかであろう。本開示は、そのようなさらなる実施形態、変更形態、および相当物を含む。とりわけ、本開示は、種々の例示的構成要素および例の特長、表現、または要素の任意の組み合わせを含む。
【０１０３】
本発明を特定の実施形態に関連して記載し、説明の目的で多くの詳細を示してきたが、本発明がさらなる実施形態を含むこと、また本明細書に記載した詳細の一部を本発明から逸脱することなく大幅に変更することができることは、当業者には明らかであろう。本発明は、そのようなさらなる実施形態、変更形態、および相当物を含む。とりわけ、本発明は、種々の例示的構成要素および例の特長、表現、または要素の任意の組み合わせを含む。
【０１０４】
実施例
実施例１〜４：核酸／カチオン性脂質塩
核酸／カチオン性脂質塩を以下の方法で製造した。清浄で乾燥した透明なホウケイ酸ガラスバイアル中で、２ｍｇのカチオン性脂質を０．１ｍＬのクロロホルムに溶解させ、バイアルに窒素ガスを送入してクロロホルムを蒸発させ、真空槽に入れて真空中（ｉｎ ｖａｃｕｏ）で乾燥させることによって、残留した微量のクロロホルムを全て除去した。バイアルを真空槽から取り出し、０．１ｍＬのエタノールを添加した。このバイアルをＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ライナー付きキャップで密閉し、シーリングテープでしっかりと巻いた。このバイアルをボルテックスまたは／および超音波処理して、カチオン性脂質を溶解させた。
【０１０５】
カチオン性脂質のエタノール溶液を１ｍｇのｓｉＲＮＡを含有する水性溶液に添加した。このカチオン性脂質のｓｉＲＮＡ溶液への添加により、速やかに凝集が起こり、カチオン性脂質とｓｉＲＮＡとから構成される水不溶性のカチオン性脂質／核酸塩を形成した。
【０１０６】
次いで管内のこの水不溶性のカチオン性脂質／核酸塩をエッペンドルフ微量遠心機で最大速度にて１５分間遠心分離し、ペレットを形成した。毎回の遠心分離後に上澄みを回収し、ＯＤ２６０で上澄み中のｓｉＲＮＡの量を測定した。
【０１０７】
残りの実施例では、核酸／カチオン性脂質塩を有機溶媒に可溶化し、さらなる脂質と混合して処方物にした。
【０１０８】
第１表は、本方法を用いて核酸／カチオン性脂質塩を形成するために使用したカチオン性脂質の一覧である。
【０１０９】
第１表
【表１】
【０１１０】
第２表は、ｓｉＲＮＡを水不溶性にするｓｉＲＮＡ／脂質の比率の測定の概要である。
【０１１１】
第２表
【表２】
【０１１２】
実施例５〜１８：肝臓ｓｉＲＮＡ送達処方物
肝臓ｓｉＲＮＡ送達処方物を以下の方法で製造した。実施例１〜４と同様に作製したカチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ塩（カチオン性脂質と複合体を形成する１ｍｇのｓｉＲＮＡを含有）を遠心分離し、乾燥させたあと、その塩を１００μＬのクロロホルムに再懸濁させ、クロロホルム中の脂質の混合物（第３表に指定の特定のカルバメート、リン脂質、および脂質−ＰＥＧに従って、４．４ｍｇのカルバメート、２．７〜４．４ｍｇのリン脂質、３．２ｍｇのコレステロール、および１４．４ｍｇの脂質−ＰＥＧ）と混合した。この混合物を真空下で乾燥させ、使用まで４℃で保管した。注射前、振盪しながら９％ショ糖溶液を添加して、ｓｉＲＮＡ／脂質処方物の等張性自己乳化性ｓｉＲＮＡ／脂質懸濁液を形成した。この処方物を投与量０．２ｍｌでＣＤｌマウスに尾静脈投与した。２日後、マウスを致死させて肝臓を採取し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を解析した。ｓｉＲＮＡ用量２ｍｇ／ｋｇで、８０％超の標的遺伝子のサイレンシングが認められた。
【０１１３】
第３表：肝臓送達処方物
【表３】
【０１１４】
図１は、実施例１１の処方物をマウスに注射することによる試験の結果を記載している。これらの結果は、請求項に記載の処方物としてのＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡの注射が、ｓｉＲＮＡ０．５〜４ｍｇ／ｋｇの投薬量で、肝臓におけるＡｐｏＢ遺伝子発現の発現ノックダウン、および血清コレステロール値の低下に有効であることを示している。
【０１１５】
図２は、実施例１１の請求項に記載の処方物としてのＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡに対する身体反応の経時変化を示している。これらの結果は、注射１４日後まで、ＡｐｏＢ ｍｉＲＮＡ発現および血清コレステロールが低下していることを示している。
【０１１６】
実施例２０〜２５：肺ｓｉＲＮＡ送達処方物
肺ｓｉＲＮＡ送達処方物を以下の方法で製造した。実施例１〜４と同様に作製したカチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ塩（カチオン性脂質と複合体を形成する１ｍｇのｓｉＲＮＡを含有）を遠心分離し、乾燥させたあと、その塩を１００μＬのクロロホルムに再懸濁させ、クロロホルム中の脂質の混合物（第４表に指定の特定のカルバメート、リン脂質、および脂質−ＰＥＧに従って、８．８ｍｇのカルバメート、２．２ｍｇのリン脂質、１．６ｍｇのコレステロール、および１４．４ｍｇの脂質−ＰＥＧ）と混合した。この混合物を真空下で乾燥させ、使用まで４℃で保管した。注射前、振盪しながら９％ショ糖溶液を添加して、ｓｉＲＮＡ／脂質処方物の等張性自己乳化性ｓｉＲＮＡ／脂質懸濁液を形成した。この処方物を投与量０．２ｍｌで１２９Ｓ１／ｓｖＩｍＪマウスに尾静脈投与した。２日後、マウスを致死させた。肺および肝臓を採取し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を解析した。
【０１１７】
第４表：肺送達処方物
【表４】
【０１１８】
図３は、請求項に記載の処方物をマウスに注射することによる試験の結果を記載している。これらの結果は、実施例２０の処方物としてのＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡおよびβ−アクチンの注射が、肺における相当する遺伝子の発現のノックダウンに有効であるが、この処方物は、肝臓におけるこれらの遺伝子の発現をほんのわずかに変化させるのみであることを示している。
【０１１９】
図４は、実施例２０の請求項に記載の処方物としてのＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡおよびβ−アクチン ＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡの注射に対する、肺の用量反応を示している。これらの結果は、ｓｉＲＮＡ２〜１２ｍｇ／ｋｇの投薬量で、これらの発現が低下すること、またこれらのｓｉＲＮＡ２〜８ｍｇ／ｋｇの投薬量では、肝臓発現にほとんど作用しないことを示している。
【０１２０】
実施例２６〜３２：腫瘍ｓｉＲＮＡ送達処方物
腫瘍ｓｉＲＮＡ送達処方物を以下の方法で製造した。実施例１〜４と同様に作製したカチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ塩（カチオン性脂質と複合体を形成する１ｍｇのｓｉＲＮＡを含有）を遠心分離し、乾燥させたあと、その塩を１００μＬのクロロホルムに再懸濁させ、クロロホルム中の脂質の混合物（第５表に指定の特定のカルバメート、リン脂質、および脂質−ＰＥＧに従って、４．４ｍｇのカルバメート、４．４ｍｇのリン脂質、２．４ｍｇのコレステロール、および２１．６ｍｇの脂質−ＰＥＧ）と混合した。この混合物を真空下で乾燥させ、使用まで４℃で保管した。注射前、振盪しながら９％ショ糖溶液を添加して、ｓｉＲＮＡ／脂質処方物の等張性自己乳化性ｓｉＲＮＡ／脂質懸濁液を形成した。この処方物を投与量０．２ｍｌでＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈投与した。ｓｉＲＮＡ処方物の投与５日前に、このマウスの肝臓にＥＭＴ６細胞を移植した。２日後、マウスを致死させた。腫瘍および肝臓を採取し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を解析した。
【０１２１】
第５表：腫瘍送達処方物
【表５】
【０１２２】
図５は、請求項に記載の処方物をマウスに注射することによる試験の結果を記載している。これらの結果は、実施例２７の処方物としてのラミンｓｉＲＮＡの注射は、腫瘍における相当する遺伝子の発現のノックダウンに有効であるが、この処方物が、肝臓におけるこれらの遺伝子の発現をそれほど変化させなかったことを示している。
【０１２３】
実施例３３：骨髄ｓｉＲＮＡ送達処方物
骨髄ｓｉＲＮＡ送達処方物を以下の方法で製造した。実施例１〜４と同様に作製したＤＯＴＭＡ／ｓｉＲＮＡ塩（ＤＯＴＭＡと複合体を形成する１ｍｇのｓｉＲＮＡを含有）を遠心分離し、乾燥させたあと、その塩を１００μＬのクロロホルムに再懸濁させ、クロロホルム中の脂質（６．６ｍｇのＮ6−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート、２．２ｍｇのＤＬｉｎＰＥ（１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、２．４ｍｇのコレステロール、および２１．６ｍｇのコレステロール−ＰＥＧ（コレステロール−ポリ（エチレングリコール）） ６６０）と混合した。この混合物を真空下で乾燥させ、使用まで４℃で保管した。注射前、振盪しながら９％ショ糖溶液を添加して、ｓｉＲＮＡ／脂質処方物の等張性自己乳化性ｓｉＲＮＡ／脂質懸濁液を形成した。この処方物を投与量０．２ｍｌでＣＤｌマウスに尾静脈投与した。２日後、マウスを致死させた。骨髄および肝臓を採取し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を解析した。
【０１２４】
実施例３４：皮膚処方物
皮膚ｓｉＲＮＡ送達処方物を以下の方法で製造した。蛍光標識したｓｉＲＮＡまたは蛍光標識していないｓｉＲＮＡを実験に使用した。ｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＭＡカチオン性脂質塩を実施例１と同様に製造した。次いで、このｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＭＡカチオン性脂質塩を１−オクタノールに溶解させた。ラウロイルグリコールおよびアゾンを含有する別の賦形剤の添加後、この処方物をブタ皮膚表面に塗布した。５時間のインキュベーション後、この処方物を除去し、皮膚表面を濯いで取り込まれていないｓｉＲＮを除去した。次いで、この皮膚組織を固定し、切断し（５μｍ厚）、核染色用のＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡下で蛍光強度を観察した。
【０１２５】
実施例３５：Ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子ノックダウン試験
実施した動物試験に使用した全ての手順は、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＡＣＵＣ）に承認されたものであり、該当する場合には、地方、州、および連邦の規制に準拠した。マウスに、投与量０．２ｍｌでｓｉＲＮＡ処方物を尾静脈投与した。投与２日後にマウスの組織を採取し、Ｔｕｒｂｏｃａｐｔｕｒｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてｍＲＮＡを単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（ＳｅｎｓｉＭｉｘ ＳＹＢＲ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ、Ｂｉｏｌｉｎｅ社）により遺伝子発現の変化を解析した。
【０１２６】
実施例３６：カチオン性脂質を含むｓｉＲＮＡのスケールアップ沈殿
ｉｎ ｖｉｖｏでの送達ｓｉＲＮＡの臨床試験のためにより大量の沈殿物を生成する目的で、１ｇのＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡを５００ｍｌのＲＮａｓｅを含まない水に室温で完全に可溶化した。２グラムの乾燥ＤＯＴＭＡを２５ｍｌの無水エタノールに溶解して、ＤＯＴＭＡ溶液を製造した。ｓｉＲＮＡ溶液を撹拌プレート上で撹拌しながら、ＤＯＴＭＡ溶液をｓｉＲＮＡ溶液にゆっくりと添加した。沈殿物が速やかに形成される。この混合物を室温で２０分間、続いて４℃で３０分〜数時間インキュベートした。この混合物を３０，０００ｇで３０分間遠心分離した。上澄みを除去し、固体を真空下で乾燥させた。
【０１２７】
実施例３７：カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）の水性溶液および核酸／ＤＯＴＭＡ塩の製造
清浄で乾燥した透明なホウケイ酸ガラスバイアル中で、２ｍｇのＤＯＴＭＡを０．１ｍＬのクロロホルムに溶解させ、バイアルに窒素ガスを送入してクロロホルムを蒸発させ、真空槽に入れて真空中（ｉｎ ｖａｃｕｏ）で乾燥させることによって、残留した微量のクロロホルムを全て除去した。バイアルを真空槽から取り出し、１ｍＬの滅菌水を添加した。このバイアルをＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ライナー付きキャップで密閉し、シーリングテープでしっかりと巻いた。このバイアルをボルテックスまたは／および超音波処理して澄明にした。
【０１２８】
１ｍｇのｓｉＲＮＡを含有する水性溶液をＤＯＴＭＡの水性溶液に添加した。このＤＯＴＭＡカチオン性脂質の水性溶液へのｓｉＲＮＡの添加により、速やかに凝集が起こり、ＤＯＴＭＡとｓｉＲＮＡとから構成される水不溶性のカチオン性脂質／核酸塩を形成した。
【０１２９】
管内の水不溶性のカチオン性脂質／核酸塩を氷上で少なくとも１０分間冷却した。次いで管内のこの水不溶性のカチオン性脂質／核酸塩をエッペンドルフ微量遠心機で最大速度にて１５分間遠心分離し、ペレットを形成した。水層を慎重に除去し、塩ペレットを真空槽に入れて真空中（ｉｎ ｖａｃｕｏ）で乾燥させ、さらに水分を除去した。
【０１３０】
実施例３８：カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）の水性溶液および核酸／ＤＯＴＭＡ塩の製造
実施例３５の方法を実施したが、ｓｉＲＮＡのＤＯＴＭＡへの添加後、得られた混合物を氷上で冷却せずに、そのまま遠心分離した。
【０１３１】
実施例３９：カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）の水性溶液および核酸／ＤＯＴＭＡ塩の製造
実施例３６の方法を実施したが、ＤＯＴＭＡの水性溶液をｓｉＲＮＡ溶液に添加した。
【０１３２】
実施例４０：カチオン性脂質１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）のエタノール溶液および核酸／ＤＬｉｎＤＭＡ塩の製造
実施例３５の方法を実施したが、カチオン性脂質としてＤＬｉｎＤＭＡを使用した。
【０１３３】
実施例４１：カチオン性脂質Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）のエタノール溶液および核酸／ＤＯＴＡＰ塩の製造
実施例３５の方法を実施したが、カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを使用し、この脂質をエタノールに可溶化した。
【０１３４】
実施例４２：カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）の水性溶液および核酸／ＤＯＴＭＡ塩の製造
実施例３５の方法を実施したが、ｓｉＲＮＡの代わりに細菌プラスミドを使用した。
【０１３５】
実施例４３：カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）のエタノール溶液および核酸／ＤＯＴＭＡ塩の製造
実施例４０の方法を実施したが、ＤＯＴＭＡを水ではなくエタノールに可溶化した。
【０１３６】
実施例４４：核酸とカチオン性脂質との混合後の液体からの核酸／カチオン性脂質塩の単離
実施例１〜４および３５〜４１のとおり核酸とカチオン性脂質とを混合したあと、混合物を氷上で少なくとも１０分間冷却してから遠心分離した。
【０１３７】
実施例４５：核酸とカチオン性脂質との混合後の液体からの核酸／カチオン性脂質塩の単離
核酸およびカチオン性脂質塩を実施例４２と同様に製造するが、混合物を遠心分離せずに乾燥させた。
【０１３８】
実施例４６：核酸とカチオン性脂質との混合後の液体からの核酸／カチオン性脂質塩の単離
核酸およびカチオン性脂質塩を実施例４３と同様に製造するが、混合物を濾過して沈殿した塩を回収した。
【０１３９】
実施例４７：核酸とカチオン性脂質との混合後の液体からの核酸／カチオン性脂質塩の単離
核酸およびカチオン性脂質塩を実施例４２と同様に製造するが、混合物を遠心分離前に冷却しなかった。
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、核酸とカチオン性脂質との貯蔵安定性塩、およびこの塩を使用して、哺乳動物への投与時に組織細胞に核酸を送達するための脂質処方物を製造する方法について記載されている。
【０００２】
背景技術
多種多様な核酸が、数々の疾患を処置するための治療薬として、現在開発されている。これらの核酸には、遺伝子治療におけるＤＮＡ、プラスミドベースの干渉核酸、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において使用するためのｓｉＲＮＡを含む低分子干渉核酸、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス分子、リボザイム、およびアプタマーが含まれる。これらの分子が開発されるに従い、安定で長い有効期間を有し、かつ無水有機溶媒または無水極性非プロトン性溶媒に簡単に組み込んで、極性水溶液中または非極性溶媒中で生じうる副反応を伴わずに核酸のカプセル封入を可能にする形態で、それらの分子を製造する必要性が生じてきている。
【０００３】
本発明は、生物活性のある治療用の分子の細胞内送達を容易にする、新規の脂質組成物に関する。また、本発明は、そのような脂質組成物を含み、患者の細胞内に治療有効量の生物活性分子を送達するのに有用な医薬組成物に関する。
【０００４】
対象への治療用化合物の送達は、その治療効果にとって重要であり、これは通常は、化合物の標的細胞および組織に到達する能力が限定されることにより、妨げられる可能性がある。さまざまな送達手段によって、標的とされる組織細胞に進入するこのような化合物を改善することは、極めて重要である。本発明は、生物活性分子の標的化細胞内送達を容易にする、新規の脂質、組成物、および製造方法に関する。
【０００５】
患者の組織の効果的な標的化が達成されないことが多い生物活性分子の例には、（１）免疫グロブリンタンパク質を含む多数のタンパク質、（２）ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド、（３）アンチセンスポリヌクレオチド、および（４）合成または天然の多くの低分子量化合物、例えばペプチドホルモンおよびペプチド抗生物質がある。
【０００６】
医師らが現在直面している根本的な課題の１つは、多種多様な核酸が、数々の疾患を処置するための治療薬として現在開発されていることである。これらの核酸には、遺伝子治療におけるＤＮＡ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において使用するためのプラスミド低分子干渉核酸（ｉＮＡ）、アンチセンス分子、リボザイム、アンタゴｍｉｒ、マイクロＲＮＡ、およびアプタマーが含まれる。これらの核酸が開発されていることから、簡単に作製でき、かつ標的組織に容易に送達することができる脂質処方物を製造する必要性が存在する。
【０００７】
発明の概要
本発明の一態様は、カチオン性脂質とポリヌクレオチドとの固体混合物からなる組成物であり、このカチオン性脂質分子はポリヌクレオチドと水不溶性のイオン性複合体を形成する（以下、脂質／核酸塩とする）。一実施形態において、脂質／核酸塩における、カチオン性脂質のポリヌクレオチドのヌクレオチドモノマーに対するモル比が０．１〜１０、好ましくは０．５〜２である。本発明の実施形態は、カチオン性脂質が、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；３−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）；および１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）、Ｎ4−スペルミジンコレストリルカルバメート（ＧＬ−５３）、１−（Ｎ4−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（ＧＬ−８９）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、脂質／核酸塩である。最も好ましくは、この脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、およびＤＯＴＭＡからなる群から選択される。本発明の別の態様は、核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、antagamer、プラスミドベースの干渉核酸（ｉＮＡ）、リボザイム、低分子干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、脂質／核酸塩である。好ましくは、この脂質／核酸塩は、無水固体の形態、すなわち真空中（ｉｎ ｖａｃｕｏ）で、または気流下、好ましくは窒素ガス流下で乾燥させることによって、水を除去したものである。
【０００８】
本発明の別の態様は、水性溶媒中でカチオン性脂質とポリヌクレオチドとを混合し、水不溶性沈殿物を生成し、この沈殿物を単離し、この沈殿物を乾燥させる方法によって作製される脂質／核酸塩である。一実施形態は、有機溶媒もしくは極性非プロトン性溶媒に可溶化することができる脂質／核酸塩である。
【０００９】
本発明の別の態様は、有機溶媒もしくは非プロトン性溶媒に溶解した脂質／核酸塩を含む溶液（「溶液」）である。
【００１０】
一実施形態は、カルバメート、好ましくはＮ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミンコレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミジンコレステリルカルバメート、１−（Ｎ４−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート、および２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテートからなる群から選択されるカルバメートをさらに含む溶液である。
【００１１】
別の実施形態は、中性リン脂質、好ましくはホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、およびジホスファチジルグリセロールからなる群から選択されるリン脂質、好ましくは炭素８〜２２個のアルキル鎖、最も好ましくは１８：２、２０：４、および２２：６アルキル鎖からなる群から選択される鎖から構成されるリン脂質をさらに含む溶液である。
【００１２】
別の実施形態は、ステロール、好ましくはコレステロール、ラノステロール、２４−イソプロピルコレステロール、ニカステロール、７−デヒドロコレステロール、２４−デヒドロコレステロール、ゴルゴステロール、ジノステロール、２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、カンペステロール、フコステロール、β−シトステロール、フィトスタノール、ステロールエステル、ステリルグリコシド、およびステリルアルキルエーテルからなる群から選択されたステロールをさらに含む溶液である。
【００１３】
別の実施形態は、脂質−ＰＥＧ化合物をさらに含む溶液であり、好ましくはこの脂質はリン脂質またはステロールであり、好ましくは分子量２００〜５０００ｋＤａのＰＥＧを有する。
【００１４】
本発明の別の態様は、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合コレステロール（１Ｋ）、リン脂質、およびＮ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメートからなる群から選択される１つ以上の脂質を含む溶液をさらに含む溶液である。一実施形態は、ホスファチジルエタノールアミンが、場合により不飽和結合を含む８〜２４アルキル鎖からなる溶液である。別の実施形態は、さまざまな比率の上記の組成物、好ましくはポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート４．４部／ホスファチジルエタノールアミン４．４部／コレステロールＰＥＧ１４．４部／コレステロール１．６部（質量／質量）をさらに含む溶液である。別の実施形態は、ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート８．８部／ホスファチジルエタノールアミン２．２部／コレステロールＰＥＧ１４．４部／コレステロール１．６部（質量／質量）をさらに含む溶液である。別の実施形態は、ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート６．６部／ホスファチジルエタノールアミン２．２部／コレステロールＰＥＧ１４．４部／コレステロール１．６部（質量／質量）をさらに含む溶液である。別の実施形態は、ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート４．４部／ホスファチジルエタノールアミン４．４部／コレステロールＰＥＧ２１．６部／コレステロール４．８部（質量／質量）をさらに含む溶液である。
【００１５】
本発明の別の態様は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、およびＣ１６−ＰＥＧ７５０セラミドをさらに含む溶液である。
【００１６】
本発明の別の態様は、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ、コレステロール−ＰＥＧからなる群から選択される脂質−ＰＥＧをさらに含む溶液である。
【００１７】
本発明の別の態様は、核酸の皮膚への送達に適した上記の溶液のいずれかである。
【００１８】
本発明の別の態様は、前述の溶液のいずれかから溶媒を除去することで得られる固体処方物である。
【００１９】
本発明の別の態様は、前述の溶液のいずれかから溶媒を除去し、得られた固体を水性溶液に懸濁させて、好ましくは対象への投与に適し、最も好ましくは注射に適した溶液を生成することで得られる水性処方物である。
【００２０】
本発明の別の態様は、治療用分子の肝臓、肺、または腫瘍への送達に適した上記の処方物のいずれかである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】これは、肝臓（ＡｐｏＢ）ｓｉＲＮＡ送達処方物の用量反応曲線を示している。Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、指定の用量レベルで、単一用量０．２ｍｌの処方ＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡを静脈内投与した。注射２日後に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（参照遺伝子としてＧＡＰＤＨ）によって遺伝子発現を解析するために、肝臓を採取した。総コレステロール値を解析するために、血清も採取した。各データポイントは、平均＋ＳＥＭ（ｎ＝６）を表わす。マウス肝臓におけるＡｐｏＢ遺伝子ノックダウンは、血清コレステロール値の変化と相関する。
【図２】これは、単一用量の処方ｓｉＲＮＡを投与量０．２ｍｌ／マウスおよび２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与したＢａｌｂ／Ｃマウスにおける、ＡｐｏＢ遺伝子発現と対応するコレステロール低下の経時的研究を示している。限定された時点で、上述のように遺伝子発現を解析するために、肝臓組織を採取した。肝臓における遺伝子ノックダウンと血清中のコレステロールの変化は、ほぼ３週間持続している。
【図３】１２９Ｓ１／ｓｖＩｍＪマウスに、単一用量のｓｉＲＮＡの肺特異的送達処方物を投与量０．２ｍｌ（４ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ）で静脈内投与した。３日後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（参照遺伝子としてＧＡＰＤＨおよびβ−アクチン）によって遺伝子発現を解析するために、肺および肝臓を採取した。各データポイントは、平均＋ＳＥＭ（ｎ＝５）を表わす。標的遺伝子の発現レベルは、肺（Ａ）では有意にノックダウンされていたが、肝臓（Ｂ）ではノックダウンされていなかった。Ｓｐｅｃａ−１１およびＳｐｅｃａ−１２は、異なる遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである。
【図４】１２９Ｓ１／ｓｖＩｍＪマウスに、単一用量０．２ｍｌの処方ｓｉＲＮＡを指定の用量レベルで静脈内投与した。３日後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（参照遺伝子としてＧＡＰＤＨおよびβ−アクチン）によって遺伝子発現を解析するために、肺（Ａ）および肝臓（Ｂ）を採取した。各データポイントは、平均＋ＳＥＭ（ｎ＝５）を表わす。標的遺伝子の発現レベルは、肺で用量反応的にノックダウンされていた。
【図５】Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、２ｍｇ／ｋｇで、０．２ｍｌの単一用量の処方ｓｉＲＮＡを静脈内投与した。２日後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（参照遺伝子としてＧＡＰＤＨ）によって遺伝子発現を解析するために、腫瘍（Ａ）および肝臓（Ｂ）を採取した。腫瘍モデルは、ＥＭＴ６細胞（Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来のマウス乳房肉腫）を左下葉のグリソン鞘内に注射することによって作成する。各データポイントは、平均＋ＳＥＭ（ｎ＝６）を表わす。
【００２２】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、これらの必要性を満たし、かつ核酸を有機対イオンとともに用いる新規の方法および組成物を提供することによって、さらなる目的および利点を実現する。
【００２３】
本発明は、水不溶性であり安定な形態の有機対イオン核酸塩、とりわけ有機塩−干渉核酸を提供することによって、この要求をさらに満足する。このような水不溶性の沈殿物は、有機カチオン、すなわち疎水基／親油基を有する正荷電化合物（カチオンとしてプロトン化有機アミンを含有する有機化合物、例えばカチオン性脂質およびプロカインを含むが、それらに限定されない）の溶液を核酸の水性溶液と、このカチオン性脂質分子が核酸と複合体を形成する条件下で接触させて、カチオン性化合物−核酸沈殿物を形成することにより生成する。核酸を水不溶性にさせる炭素数またはそれに十分な疎水性度を有するカチオン性有機分子の場合に、沈殿が生じる。得られる沈殿物は、核酸中に存在するヌクレオチドの数と１対１の電荷モル濃度で、カチオン性脂質分子の正電荷の総数を含む。また、核酸中に存在するヌクレオチドの数と１対１未満の電荷モル濃度は、部分的な核酸の沈殿に使用される。この核酸−有機カチオン性脂質沈殿物は、濾過、遠心分離、および化学および物理工程の当業者が利用できるその他の方法を用いて、水性液から回収することができる。沈殿したカチオン性脂質塩を乾燥させ、数々の機械的処理を施して、これを核酸薬処方物の固体剤形および液体剤形に組み込むのに適するようにしてもよい。驚くべきことに、特定の有機カチオンの核酸水不溶性有機沈殿物は、多数の一般的な有機溶媒に容易に溶媒和させることができ、これには極性非プロトン性の溶媒群（ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジン、ジグリム、およびその他のエーテルグリコール、クロロホルム、メチレンクロリド、およびその他のハロゲン化有機溶媒、テトラヒドロフラン、およびその他の環状エーテル溶媒）を含み、これらの溶媒は、無水条件下で使用することができ、試薬を新しい化学形態にする化学的変換および反応における使用で工業的価値を有することが確認されている。
【００２４】
当業者は、核酸沈殿物を無水非プロトン性溶媒に溶媒和させたときに、これを数々の反応性中間体と接触させて、その核酸を化学反応によって新しい形態の核酸に変換させることができることを容易に理解するであろう。これらの反応には、蛍光プローブまたはレポーター分子を付着させるリボースおよびデオキシリボース糖の第１級および第２級アルコールのアシル化、リボース核酸をヌクレアーゼ抵抗性２′Ｏ−メチル化リボース核酸に変換させるメチル化化学反応、核酸の反応性遊離アミノ基を保護するための、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、およびグアニンの環外アミノ基のアミド化が含まれるが、これらに限定されない。末端１級ヒドロキシル基の化学修飾は、極めて容易な反応であると想像され、これを用いてコレステロールと別の疎水性物質とを結合させて、治療用薬および遺伝子送達の用途の核酸ポリマーにすることができる。この方法の有用性は、イノシンおよび転移リボ核酸中に存在する多くの修飾ＲＮＡヌクレオシドを含む、天然リボシドの微量成分の回収および化学修飾にまで広げることができる。これらの化学的変換は、新しい物理的および化学的特性、例えば化学分解および酵素分解に対する耐性の向上、器官、組織、および細胞特異的疾患標的化などに作用し、その他の製薬用途および工業用途における核酸の価値を高めることができる。
【００２５】
核酸溶液とカチオン性脂質の溶液との接触は、典型的には水性溶液である第１の核酸溶液をカチオン性脂質の溶液と一緒に混合することによって実施する。カチオン性脂質は、有機溶媒または水性溶媒のいずれかの溶液であってよい。当業者は、この混合を任意の数の方法によって、例えば機械的手段によって、ボルテックスミキサーまたは注入ポンプおよび撹拌反応器を用いて実施可能なことを理解するであろう。
【００２６】
カチオン性脂質核酸塩の作成に使用可能なカチオン性脂質の例には、選択されたｐＨ、例えば生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ約７．０）で正味の正電荷を有する複数の脂質種のうちのいずれかが含まれる。本明細書において、生理的ｐＨとは、生体液、例えば血液またはリンパ液のｐＨ、ならびに細胞内コンパートメント、例えばエンドソーム、酸性エンドソーム、またはリソソームのｐＨを指す。このような脂質には、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；３−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）；Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）；および１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）が含まれるが、それらに限定されない。以下の脂質：１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡなどは、カチオン性であり、生理的ｐＨ未満で正電荷を有する。これらの脂質および関連する類似体は、同時係属中の米国特許出願第０８／３１６，３９９号；米国特許第５，２０８，０３６号、第５，２６４，６１８号、第５，２７９，８３３号、および第５，２８３，１８５号に記載されている。さらに、複数のカチオン性脂質の市販製剤が入手可能であり、これらは本発明において使用することができる。カチオン性脂質以外に、正電荷を有するいかなる有機カチオンも核酸沈殿に使用でき、同じように使用できる可能性がある。
【００２７】
カチオン−核酸沈殿物の作成に使用可能な有機カチオンは、水性液中でミセルを形成しても、可溶化された状態でアルコール中に含まれても、あるいは水性液とアルコールとの混合物中に含まれてもよい。また、一部の例では、有機カチオンは別の有機溶液、例えばクロロホルム中に含まれ、これを核酸を含有する水性溶液と混合することができる。有機溶媒の蒸発後、沈殿物が形成される。
【００２８】
本開示は、核酸、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、アンタゴｍｉｒ、および遺伝子サイレンシング核酸などの治療的送達に有用な薬学的に許容される核酸組成物を提供する。これらの組成物および方法は、哺乳動物における疾患の予防および／または処置に使用することができる。本発明のカチオン性脂質核酸塩は、有機溶媒、例えばジクロロメタン、クロロホルム、ＴＨＦ、１−オクタノール、および多くの生体適合性溶媒、例えばＤＭＳＯ、ジメチルアセトアミド、ラウロイルグリコール、およびその他の油性媒体、例えばミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸エステル、メチル、エチル、イソプロピル、および高級アルキル置換基に対する劇的に向上した溶解性を有するカチオン性核酸塩をもたらす。
【００２９】
これらのカチオン性脂質核酸塩は、次いで有機溶媒に再懸濁させ、別の脂質と混合して核酸脂質複合体を生成することができ、これを核酸としてプラスミドＤＮＡを用いる遺伝子治療のために、またはアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムを用いた遺伝子の下方制御のために、または核酸としてアプタマーを用いてその他の症状を抑制するために、個人に投与することができる。
【００３０】
定義
ここに示す技術用語の定義は、当業者に既知のこれらの用語に関する意味を詳述することなく含むものと解釈されるべきであり、また本発明の範囲を制限するものではない。
【００３１】
本発明の説明および請求項における用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および類似する用語の使用は、単数および複数を含むものとする。用語「包含する」、「有する」、「含む」、および「含有する」は、非限定的な用語として解釈され、すなわち、例えば「含むが、それらに限定されない」を意味する。本明細書における値の範囲の記述は、その範囲内に含まれるそれぞれのあらゆる個々の値をそれが本明細書に個別に記述されているのと同様に個別に指し、これはその範囲内の値の一部が明記されているか否かには関わらない。本明細書において使用する特定の値は、例であり、本発明の範囲を制限するものではないと理解される。
【００３２】
用語「有機カチオン」および「カチオン性脂質」は、選択されたｐＨ、例えば生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ約７．０）で正味の正電荷を有する複数の脂質種または有機化合物のうちのいずれかを指す。本発明においても有用な複数のカチオン性脂質および関連する類似体は、米国特許公開第２００６００８３７８０号；米国特許第５，２０８，０３６号；第５，２６４，６１８号；第５，２７９，８３３号；第５，２８３，１８５号；第５，７５３，６１３号；米国特許第第５，７６７，０９９号および第５，７８５，９９２号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ ９６／１０３９０号に記載されている。カチオン性脂質の例には、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）、Ｎ4−スペルミジンコレストリルカルバメート（ＧＬ−５３）、１−（Ｎ4−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（ＧＬ−８９）、およびそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。非限定的な例として、生理的ｐＨ未満で正電荷を有するカチオン性脂質には、１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ＤＯＤＭＡ、およびＤＳＤＭＡが含まれるが、それらに限定されない。一部の例では、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第３級アミン頭部基、Ｃ１８アルキル鎖、頭部基とアルキル鎖との間のエーテル結合、および０〜３個の二重結合を含む。このような脂質には、例えば、ＤＳＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、およびＤＯＤＭＡが含まれる。また、カチオン性脂質は、エーテル結合およびｐＨ滴定可能な頭部基も含んでいてよい。このような脂質には、例えばＤＯＤＭＡが含まれる。カチオン性脂質は、例えば、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、またはそれらの混合物であってもよい。本発明において有用なカチオン性脂質は、生理的ｐＨで正味の正電荷を有する複数の脂質種のうちのいずれであってもよい。このような脂質には、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＤＭＡ、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＭＲＩＥ、およびそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。さらに、複数のカチオン性脂質の市販製剤が入手可能であり、これらは本発明において使用することができる。
【００３３】
本明細書において、干渉核酸（ｉＮＡ）という用語は、ＲＩＳＣ複合体に進入したときにｍＲＮＡの酵素分解を誘導する、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する核酸二本鎖を指す。一般に、各鎖はＲＮＡヌクレオチドを主に含むが、これらの鎖はＲＮＡ類似体、ＲＮＡとＲＮＡ類似体、ＲＮＡとＤＮＡ、ＲＮＡ類似体とＤＮＡ、あるいはｉＮＡ構築体が相同ｍＲＮＡの酵素分解を誘導する限りにおいて、完全にＤＮＡである一本鎖とＲＮＡである一本鎖を含みうる。
【００３４】
極性非プロトン性溶媒は、プロトン性溶媒とイオン溶解力を共有するが、酸性水素を有さない溶媒である。これらの溶媒は、一般に、高誘電率および高極性を有する。極性非プロトン性溶媒の例は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキサンおよびヘキサメチルホスホロトリアミド、アセトン、アセトニトリル、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、アセトニトリル、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）、ピリジン、テトラメチル尿素（ＴＭＵ）、尿素類似体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドＨＣＯＮ（ＣＨ３）２、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）ＣＨ３ＣＯＮ（ＣＨ３）２、およびテトラメチル尿素（ＣＨ３）２ＮＣＯＮ（ＣＨ３）２、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、および１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（ｌＨ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）である。比較的有毒なヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）をＤＭＰＵに置き換えることが可能である。
【００３５】
本明細書において、「アプタマー」または「核酸アプタマー」という用語は、標的分子と特異的に結合する核酸分子であって、自然状態で標的分子によって認識される配列を含む核酸分子を包含する。あるいは、アプタマーは、標的分子と結合する核酸分子であってもよく、このとき標的分子は核酸と自然には結合しない。
【００３６】
例えば、アプタマーを用いて、タンパク質のリガンド結合ドメインと結合させ、それにより天然リガンドとタンパク質との相互作用を妨げることができる。例えば、Ｇｏｌｄ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：７６３， １９９５； ＢｒｏｄｙおよびＧｏｌｄ， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：５， ２０００； Ｓｕｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２：１００， ２０００； Ｋｕｓｓｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：２７， ２０００； Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０， ２０００； およびＪａｙａｓｅｎａ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１６２８， １９９９を参照されたい。
【００３７】
「アンチセンス核酸」とは、ＲＮＡ−−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５， ５６６）相互作用によって標的ＲＮＡに結合して、標的ＲＮＡの活性を変化させる非酵素的核酸分子を意味する（概説は、ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ， １９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１， １００４、およびＷｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，８４９，９０２号を参照）。典型的には、アンチセンス分子は、アンチセンス分子の単一の連続する配列に沿って標的配列に相補的である。しかしながら、特定の実施形態では、アンチセンス分子は、基質分子がループを形成するように基質に結合することができ、および／またはアンチセンス分子は、アンチセンス分子がループを形成するように結合することができる。したがって、アンチセンス分子は、２つ（またはそれ以上）の非連続的基質配列に相補的であってもよく、またはアンチセンス分子の２つ（またはそれ以上）の非連続的配列部分が標的配列に相補的であってもよく、またはそれら両方であってもよい。さらに、アンチセンスＤＮＡを使用して、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によってＲＮＡを標的としてもよく、それによってＲＮａｓｅＨを活性化し、これが二本鎖中の標的ＲＮＡを消化する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈ切断を活性化することができる、１つ以上のＲＮＡｓｅ Ｈ活性化領域を含んでもよい。アンチセンスＤＮＡは、化学的に合成しても、または一本鎖ＤＮＡ発現ベクターまたはその同等物を用いて発現させてもよい。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡ鎖であり、標的遺伝子ｍＲＮＡに結合することによってＲＮＡｉを誘導することができる。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡ鎖であり、標的遺伝子ｍＲＮＡに結合することによってＲＮＡｉを誘導すると考えられている。「センスＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡに相補的な配列を有し、その相補的アンチセンスＲＮＡにアニールされてｉＮＡを形成する。これらのアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡは従来、ＲＮＡ合成機を用いて合成されてきた。
【００３８】
「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖形態または二本鎖形態のポリマーを指す。この用語は、合成、天然、および非天然であって、参照核酸と類似する結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似する形で代謝される、既知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは結合を含む核酸を包含する。このような類似体の例には、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２′−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、それらに限定されない。
【００３９】
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２′位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより作製されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または改変により、天然のＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含む。このような改変は、例えば干渉ＲＮＡの末端または内部への、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の付加を含みうる。また、本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば非天然ヌクレオチド、または化学的に合成されたヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチド含みうる。これらの改変ＲＮＡは、類似体または天然ＲＮＡの類似体と称することができる。本明細書において、「リボ核酸」および「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を指す。リボヌクレオチドは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２′位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドである。これらの用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより作製されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、修飾、および／または改変により、天然のＲＮＡとは異なる修飾および改変ＲＮＡを含む。ＲＮＡの改変には、例えば干渉ＲＮＡの末端または内部への、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチド（ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば非天然ヌクレオチド、または化学的に合成されたヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドを含む）における、非ヌクレオチド物質の付加を含みうる。これらの改変ＲＮＡは、類似体と称することができる。
【００４０】
本明細書において「ヌクレオチド」とは、当該技術分野において認識されているように、天然塩基（標準的）および当該技術分野で周知の修飾塩基を含むものである。このような塩基は、一般に、ヌクレオチドの糖部分の１′位に位置する。ヌクレオチドは、一般に、塩基、糖、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖部分、リン酸部分、および／または塩基部分で修飾されていなくても、または修飾されていてもよい（同じ意味で、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどと称することもできる；例えば、全て参考として本明細書で援用される、ＵｓｍａｎおよびＭｃＳｗｉｇｇｅｎ， ｓｕｐｒａ； Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ， 国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ９２／０７０６５号； Ｕｓｍａｎ， ｅｔ ａｌ， 国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ９３／１５１８７号； Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ， ｓｕｐｒａを参照）。Ｌｉｍｂａｃｈ， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：２１８３， １９９４に要約されているように、当該技術分野で既知の修飾核酸塩基にはいくつかの例がある。核酸分子に導入することができる塩基修飾の非限定的ないくつかの例には、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、または６−アザピリミジンもしくは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピンなどが含まれる（Ｂｕｒｇｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４０９０， １９９６； Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ， ｓｕｐｒａ）。本態様における「修飾塩基」とは、１′位のアデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル以外のヌクレオチド塩基、またはそれらの同等物を意味する。
【００４１】
本明細書において相補的なヌクレオチド塩基とは、互いに水素結合を形成する一対のヌクレオチド塩基である。ＲＮＡにおいてアデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）と対合し、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と対合する。核酸の相補的セグメントもしくは鎖は、互いにハイブリダイズする（水素結合により接合する）。「相補性」とは、核酸が、伝統的なワトソン・クリックによって、または別の非伝統的な結合様式によって、別の核酸配列と水素結合を形成しうることを意味する。
【００４２】
アンタゴｍｉｒは、新規の群の化学的に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つである。アンタゴｍｉｒは、内因性マイクロＲＮＡのサイレンシングに使用される。
【００４３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、長さ約２１〜２３ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子であり、これは遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写される遺伝子によってコードされるが、タンパク質には翻訳されない（非コードＲＮＡ）；その代わり、これらはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして既知の一次転写産物からｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれるショートステムループ構造に、そして最終的には機能的ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に部分的に相補的であり、これらの主な機能は、遺伝子発現を下方制御することである。
【００４４】
短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られている、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）という用語は、本明細書において、生物学においてさまざまな役目を果たす、長さ１６〜２９ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ分子の群を指して用いられる。最も注目に値するのは、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与し、そこで特定の遺伝子の発現に干渉することである。ＲＮＡｉ経路における役目に加え、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ関連経路においても、例えば抗ウイルス機構として、またはゲノムのクロマチン構造を形成する際にも機能を果たす。これらの経路の複雑性はようやく解明されだしたばかりである。
【００４５】
本明細書において、ＲＮＡｉという用語は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって制御され、細胞内の短い二本鎖ＲＮＡ分子によって開始されて、これらが触媒ＲＩＳＣ成分アルゴノートと相互作用する、ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングプロセスを指す。二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ様ｉＮＡもしくはｓｉＲＮＡが外因性（ＲＮＡゲノムを有するウイルスによる感染、またはトランスフェクトしたｉＮＡもしくはｓｉＲＮＡに起因する）である場合、ＲＮＡまたはｉＮＡは、細胞質内に直接取り込まれ、酵素ダイサーによって短い断片に切断される。また、開始ｄｓＲＮＡは、ゲノム内のＲＮＡコード遺伝子から発現したｐｒｅ−マイクロＲＮＡにように、内在性（細胞に由来する）であってもよい。そのような遺伝子からの一次転写産物は、まずプロセスされて、核内でｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの特徴的なステムループ構造を形成し、次いで細胞質に輸送されてダイサーによって切断される。したがって、外因性と内在性との２つのｄｓＲＮＡ経路は、ＲＩＳＣ複合体内に集まる。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性成分は、アルゴノートタンパク質と呼ばれるエンドヌクレアーゼであり、これらはその結合したｓｉＲＮＡもしくはｉＮＡに相補的な標的ｍＲＮＡ鎖を切断する。ダイサーにより生成された断片は二本鎖であるため、これらはそれぞれ理論上は、機能的ｓｉＲＮＡもしくはｉＮＡを生成することができる。しかしながら、二本の鎖のうちガイド鎖として知られる一本のみがアルゴノートタンパク質と結合し、遺伝子サイレンシングを導く。他方の非ガイド鎖、すなわちパッセンジャー鎖は、ＲＩＳＣ活性化時に分解される。
【００４６】
保存料の例には、フェノール、メチルパラベン、パラベン、ｍ−クレゾール、チオマーサル、塩化ベンジルアルコニウム、およびそれらの混合物が含まれる。
【００４７】
コア複合体
好ましくは、カチオン性脂質核酸塩を有機溶媒、とりわけ非プロトン性極性溶媒中の溶液の形態にして処方物を形成し、これを上述の１つ以上の脂質の溶液と混合する。これらの脂質は、有機溶媒、好ましくは非プロトン性極性溶媒中の溶液の形態である。
【００４８】
カチオン性脂質核酸塩を作製する際に使用可能なカチオン性脂質の例には、選択されたｐＨ、例えば生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ約７．０）で、正味の正電荷を有する複数の脂質種のうちのいずれかが含まれる。本明細書において、生理的ｐＨとは、生体液、例えば血液またはリンパ液のｐＨ、ならびに細胞内コンパートメント、例えばエンドソーム、酸性エンドソーム、またはリソソームのｐＨを指す）。そのような脂質には、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；３−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）；Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）；および１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）が含まれるが、それらに限定されない。以下の脂質：１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡなどは、カチオン性であり、生理的ｐＨ未満で正電荷を有する。これらの脂質および関連する類似体は、同時係属中の米国特許出願第０８／３１６，３９９号；米国特許第５，２０８，０３６号、第５，２６４，６１８号、第５，２７９，８３３号、および第５，２８３，１８５号に記載されている。さらに、複数のカチオン性脂質の市販製剤が入手可能であり、これらは本開示において使用することができる。
【００４９】
炭素数６超、好ましくは１５超、最も好ましくは１８超の特定の有機カチオンの核酸カチオン性有機塩沈殿物は、多くの一般的な有機溶媒に容易に溶媒和させることができ、これには極性非プロトン性の溶媒群（ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジン、ジグリム、およびその他のエーテルグリコール、クロロホルム、メチレンクロリド、およびその他のハロゲン化有機溶媒、テトラヒドロフラン、およびその他の環状エーテル溶媒）を含む。これらの溶媒は、無水条件下で使用することができ、試薬を新しい化学形態にする化学的変換および反応における使用で工業的価値を有する。
【００５０】
核酸溶液とカチオン性脂質溶液との接触は、典型的には水性溶液である核酸溶液をカチオン性脂質溶液と一緒に混合することによって実施する。カチオン性脂質は、有機溶媒または水性溶媒のいずれかの溶液であってもよい。カチオン性脂質の核酸中に存在するヌクレオチドに対する比率は、好ましくは２〜３：１（質量比）であるべきである。当業者は、この混合を任意の数の方法によって、例えば機械的手段によって、例えばボルテックス、ミキサー、または注入ポンプおよび撹拌反応器を用いて実施可能なことを理解するであろう。
【００５１】
共脂質を含む処方物
生物活性分子、特に核酸分子、例えばＤＮＡおよびｓｉＲＮＡの細胞内送達を促進するように設計された化合物は、たいていは極性ドメインと非極性ドメインとを有するため、これらは極性環境および非極性環境の双方と相互作用することができる。そのような両ドメインを有する化合物は、両親媒性物質と呼ぶことができ、開示されているそのような細胞内送達を促進する際に使用するための多くの脂質および合成脂質（ｉｎ ｖｉｔｒｏ応用またはｉｎ ｖｉｖｏ応用に関わらず）が、この定義に当てはまる。
【００５２】
コア複合体は、有機溶媒もしくは極性非プロトン性溶媒中の共脂質と混合してよい。共脂質は、（ｉ）脂質カルバメート、（ｉｉ）中性リン脂質、（ｉｉｉ）ステロール、および（ｉｖ）ステロール−ＰＥＧ化合物からなる群から選択される、１つ以上の脂質である。
【００５３】
脂質カルバメートは、以下の分子を含む。
【００５４】
【化１】
［式中、
ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔは、互いに独立して、０〜１６から選択され、
ＸおよびＹは、互いに独立して、Ｈ、Ａｃ、Ｂｏｃ、またはＰｉｖからなる群から、あるいはＣ、アミド、カルバメート、スクシンアミド、マレイミド、エポキシド、およびウレタンからなるリンカー群から選択され、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、互いに独立して、Ｃ１〜Ｃ２６アルカンもしくはアルケン、多価不飽和脂質、ステロイド、ＰＵＦＡ、グアニジン、またはアルギニンからなる群から任意の組み合わせで選択され、このときステロイドは、ラノステロール、エルゴステロール、デスモステロール、植物フィトステロール、例えばスチグマステロール、または胆汁塩もしくは胆汁塩誘導体、例えばコール酸、デオキシコール酸、ヒドロデオキシコール酸、またはデヒドロコール酸からなる群から選択される。］
好適な実施形態を以下の一覧に示す（α群、β群、およびγ群；式Ｉ−ＬＸＶＩＩＩ）。式中、Ｒ1はＨであり；Ｒ2は、Ｍｅまたはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）であり；Ｒ1およびＲ2は、グアニジニルまたはＮ−ＣＮＮＨであり；あるいはＲ1はＨであり、Ｒ2はアミド結合の形成によるアルギニンである。コレステロール部分は、ラノステロール、エルゴステロール、デスモステロール、植物フィトステロール、例えばスチグマステロール、または胆汁塩もしくは胆汁塩誘導体、例えばコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、およびデヒドロコール酸に置き換えてもよい。
【００５５】
【化２】
【００５６】
【化３】
【００５７】
【化４】
【００５８】
【化５】
【００５９】
【化６】
【００６０】
【化７】
【００６１】
【化８】
【００６２】
【化９】
【００６３】
【化１０】
【００６４】
【化１１】
【００６５】
【化１２】
【００６６】
【化１３】
【００６７】
３種の塩基性ポリアミン分子から誘導された分子のその他の例は以下の通りである。
【００６８】
【化１４】
【００６９】
【化１５】
【００７０】
【化１６】
【００７１】
【化１７】
【００７２】
【化１８】
【００７３】
【化１９】
【００７４】
【化２０】
【００７５】
【化２１】
【００７６】
【化２２】
【００７７】
【化２３】
【００７８】
使用可能な多価カチオン性脂質ポリアミン、例えばＮ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート、およびリポスペルミンの例には、Ｎ４−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）、Ｎ４−スペルミジンコレステリルカルバメート（ＧＬ−５３）、１−（Ｎ４−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（ＧＬ−８９）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、ＤＯＧＳ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテートが含まれる。リポスペルミンおよびリポスペルミジンは、イオン電荷複合体を形成する核酸鎖のリン酸の酸素と複合体を形成しうる、３個以上のアミド水素を有するカチオン性基と共有結合した、１つ以上の疎水性鎖からなる二官能性分子である。
【００７９】
好適なカルバメートはコレステロール様化合物：Ｎ6−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメートであり、以下の構造：
【化２４】
を有する。
【００８０】
中性リン脂質には、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、およびジホスファチジルグリセロールが含まれるが、それらに限定されない。リン脂質アシル（脂肪酸）鎖は、飽和であっても、またはそのいずれかのアシル鎖に１つ以上の不飽和結合を有してもよく、鎖はそれぞれ８個から約２６個の炭素原子を有し、同じ（対称）または異なる（非対称）。アシル鎖中の二重結合は、独立して、シスまたはトランスのいずれかであってよく、この例としては、１−アシル鎖と２−アシル鎖が含まれ、それぞれが、独立して、リノレオイル（１８：２）、リノレノイル（１８：３）、アラキドノイル（２０：４）、およびドコサヘキサエノイル（２２：６）からなる群から選択される。
【００８１】
ステロールには、コレステロール、ラノステロール、２４−イソプロピルコレステロール、ニカステロール、７−デヒドロコレステロール、２４−デヒドロコレステロール、ゴルゴステロール、ジノステロール、２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール、およびフィトステロール（エルゴステロール、スチグマステロール、カンペステロール、フコステロール、β−シトステロールを含む）、およびフィトスタノール、ならびにステロールエステル、ステリルグリコシド、およびステリルアルキルエーテルが含まれる。
【００８２】
ステロール−ＰＥＧ化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合したステロール、例えばＰＥＧ結合コレステロールであり、このときＰＥＧは、５０００ダルトン未満、好ましくは２０００ダルトン未満、最も好ましくは２００〜１０００ダルトンである。
【００８３】
請求項に記載の処方物中に使用する、固体の安定形態のカチオン性脂質核酸塩、とりわけカチオン性脂質干渉核酸塩は、カチオン性脂質の溶液を核酸の水性溶液と、このカチオン性脂質分子が核酸と複合体を形成する条件下で接触させて、カチオン性脂質核酸塩沈殿物を形成することにより生成する。親油性部分を有する、あるいは核酸を水不溶性にさせるのに十分な疎水性度を有するカチオン性有機分子の場合に、沈殿が生じる。得られる沈殿物は、核酸を完全な親水性からより低い親水性へと低下させる、あるいは核酸を部分的もしくは完全に疎水性にさせる、好ましくは核酸中に存在するヌクレオチドの数と１対１のモル濃度の比のカチオン性脂質分子の正電荷の総数を含む。この核酸塩有機カチオン性脂質沈殿物は、濾過、遠心分離、および化学工程の分野の当業者が利用できるその他の方法を用いて、水性液から回収することができる。沈殿したカチオン性脂質塩を乾燥させ、数々の機械的処理を施して、これを核酸薬剤の固体剤形および液体剤形に組み込むのに適するようにしてもよい。
【００８４】
次いで、カチオン性脂質核酸塩を１つ以上の脂質、例えば別のカチオン性脂質である両親媒性物質、例えばＮ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート、リン脂質、疎水性脂質、好ましくはステロール、例えばコレステロール、およびＰＥＧ結合脂質、好ましくはＰＥＧ結合ステロールと混合することによって、処方物を生成する。
【００８５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合脂質には、ＰＥＧ結合コレステロールおよびＰＥＧ結合コレステロール誘導体、およびＰＥＧ結合フィトステロール、例えばＰＥＧ−カンペステロール、ＰＥＧ−シトステロール、およびＰＥＧ−スチグマステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ、およびセラミド−ＰＥＧが含まれる。
【００８６】
本開示は、核酸、プラスミド、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマー、アンタゴｍｉｒ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、遺伝子サイレンシング干渉核酸、およびそれらの混合物の治療的送達に有用な、薬学的に許容される核酸組成物を提供する。これらの組成物および方法は、哺乳動物における疾患の予防および／または処置に使用することができる。
【００８７】
請求項に記載の脂質／核酸処方物は、カチオン性脂質核酸塩を有機溶媒または非プロトン性溶媒に再懸濁させることによって作製することができ、別の脂質と混合し、溶媒の蒸発なのどのさらなる処理を行なって核酸脂質複合体を生成することができる。これを個人に投与して、核酸としてプラスミドＤＮＡを用いた遺伝子治療、またはアンチセンス、リボザイム、アンタゴｍｉｒ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｉＮＡを用いた遺伝子の下方制御、または核酸としてアプタマーを用いたその他の状態の抑制を行なうことができる。
【００８８】
また、本開示は、これらの必要性を満たし、かつ６００ｎｍを下回る、好ましくは４００ｎｍを下回る、最も好ましくは２００ｎｍを下回る単分散の粒径分布を有する脂質と核酸との自己乳化性複合体を提供することによって、さらなる目的および利点を実現する。
【００８９】
投与のための組成物および処方物
本開示の核酸−脂質組成物は、さまざまな経路により投与して、例えば、静脈内経路、非経口経路、腹腔内経路、または局所経路により、全身送達を実施することができる。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡを細胞内に、例えば肺や肝臓などの標的組織あるいは炎症組織の細胞内に送達することができる。一部の実施形態では、本開示は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡの送達のための方法を提供する。核酸−脂質組成物は、対象に静脈内投与、皮下投与、または腹腔内投与することができる。一部の実施形態では、本開示は、哺乳動物対象の肺への干渉ＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達ための方法を提供する。
【００９０】
一部の実施形態では、本開示は、哺乳動物対象において疾患または障害を処置する方法を提供する。核酸、カチオン性脂質、両親媒性物質、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ結合コレステロールを含有する本開示の組成物の治療有効量を、この組成物による低下、減少、下方制御、またはサイレンシングが可能な遺伝子の発現または過剰発現に関連する疾患または障害を有する対象に投与することができる。
【００９１】
本開示の組成物および方法は、種々の粘膜投与法により対象に投与することができるが、これには経口送達、直腸送達、膣内送達、鼻腔内送達、肺内送達、または経皮的送達もしくは皮膚送達によるもの、あるいは目、耳、皮膚、またはその他の粘膜面への局所送達によるものが含まれる。本開示の一部の態様において、粘膜組織層は上皮細胞層を含む。この上皮細胞は、肺上皮細胞、気道上皮細胞、気管支上皮細胞、肺胞上皮細胞、鼻上皮細胞、口腔上皮細胞、表皮上皮細胞、または胃腸上皮細胞であってよい。本開示の組成物は、従来の作動装置、例えば機械的スプレー装置、ならびに加圧式、電気作動式、またはその他のタイプの作動装置を用いて投与することができる。
【００９２】
本開示の組成物は、鼻用スプレーまたは肺用スプレーとして水性溶液の形態で投与してもよく、当業者に既知の種々の方法によってスプレー形態で投薬してもよい。本開示の組成物の肺送達は、エアロゾル化、微粒化、または霧化されていてもよい、液滴、粒子、またはスプレーの形態の組成物を投与することによって達成される。組成物の粒子、スプレー、またはエアロゾルは、液体または固体のいずれかの形態であってもよい。鼻用スプレーとして液剤を投薬するのに好適なシステムは、米国特許第４，５１１，０６９号に記載されている。このような処方物は、好都合には、本開示による組成物を水に溶解させて水性溶液を生成し、その溶液を殺菌することによって製造することができる。この処方物は、多回投与容器、例えば米国特許第４，５１１，０６９号に開示されている密封式投薬システムで付与することができる。その他の適切な鼻用スプレー送達システムは、Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ， Ｙ． Ｗ． Ｃｈｉｅｎ ｅｄ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８５；および米国特許第４，７７８，８１０号に記載されている。さらなるエアロゾル送達形態には、例えば、圧縮空気ネブライザー、ジェットネブライザー、超音波ネブライザー、および圧電式ネブライザーを含んでもよく、これらは薬剤溶媒、たとえば水、エタノール、またはそれらの混合物などに溶解または懸濁させた生物活性物質を送達する。
【００９３】
本開示の鼻用および肺用スプレー溶液は、典型的には、薬剤、または場合により界面活性剤、例えば非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート−８０）および１つ以上の緩衝剤を含んで処方された送達用の薬剤を含む。本開示の一部の実施形態では、鼻用スプレー溶液は、推進剤をさらに含む。鼻用スプレー溶液のｐＨは、およそｐＨ６．８〜７．２であってよい。また、使用する薬剤溶媒は、ｐＨ４〜６の弱酸性の水性緩衝剤であってもよい。化学的安定性を向上または維持するために、他の成分を添加してもよく、これには保存料、界面活性剤、分散剤、またはガスが含まれる。
【００９４】
一部の実施形態では、本開示の組成物を含有する溶液と、肺用、粘膜用、または鼻腔内用のスプレーもしくはエアロゾルの作動装置とを含む医薬製品が開示される。
【００９５】
本開示の組成物の剤形は、液滴または乳剤の形態、あるいはエアロゾルの形態の液体であってよい。
【００９６】
本開示の組成物の剤形は固体であってもよく、これは投与前に液体中で再構成させることができる。この固体は、粉剤として投与してもよい。この固体は、カプセル剤、錠剤、またはゲルの形態であってもよい。
【００９７】
本開示の範囲内で肺送達用の組成物を処方するために、生物活性物質を種々の薬学的に許容される添加剤、ならびに活性物質を分散させるための基剤または担体と混合することができる。添加剤の例には、ｐＨ調整剤、例えばアルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸、およびそれらの混合物が含まれる。その他の添加剤には、局所麻酔薬（例えば、ベンジルアルコール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）、溶解度向上剤（例えば、シクロデキストリンおよびそれらの誘導体）、安定剤（例えば、血清アルブミン）、および還元剤（例えば、グルタチオン）が含まれる。粘膜送達用組成物が液剤である場合、０．９％（ｗ／ｖ）生理食塩溶液の浸透圧（１とする）を基準にして測定した処方物の浸透圧は、典型的には、投与部位の粘膜に実質的な不可逆的組織損傷を生じさせない値に調整する。一般に、溶液の浸透圧は、約１／３〜３、より典型的には１／２〜２、最も多くの場合３／４〜１．７の値に調整する。
【００９８】
生物活性物質は、基剤または媒体中に分散されていてもよく、これにはその活性物質および任意の所望の添加剤を分散させることができる親水性化合物を含んでいてもよい。基剤は、さまざまな適切な担体から選択することができ、これにはポリカルボン酸もしくはその塩、カルボン酸無水物（例えば、マレイン酸無水物）と別のモノマー（例えば、メチル（メタ）アクリレート、アクリル酸など）とのコポリマー、親水性ビニルポリマー、例えばポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース誘導体、例えばヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど、および天然ポリマー、例えばキトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸、およびそれらの非毒性金属塩が含まれるが、それらに限定されない。多くの場合、基剤または担体として、生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸−グリコール酸）コポリマー、およびそれらの混合物が選択される。代替的または付加的に、合成脂肪酸エステル、例えばポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなども担体として使用することができる。親水性ポリマーおよびその他の担体は、単独でまたは組み合わせて使用することができ、部分結晶化、イオン結合、架橋などにより、担体の構造完全性を向上させることができる。担体は、流体もしくは粘性溶液、ゲル、ペースト、粉末、マイクロスフェア、およびフィルムを含むさまざまな形態で提供して、鼻粘膜に直接塗布することができる。これに関連して、選択された担体の使用は、生物活性物質の吸収促進をもたらしうる。
【００９９】
粘膜送達用、鼻送達用、または肺送達用の処方物は、基剤または賦形剤として、親水性低分子量化合物を含有していてもよい。そのような親水性低分子量化合物は通過媒体を提供し、それを通して水溶性活性物質、例えば生理活性ペプチドもしくはタンパク質が基剤を通って身体表面に拡散することができ、そこで活性物質が吸収される。親水性低分子量化合物は、場合により、粘膜または投与環境から水分を吸収し、水溶性の活性ペプチドを溶解させる。親水性低分子量化合物の分子量は、一般に１０，０００以下、好ましくは３０００以下である。親水性低分子量化合物の例には、ポリオール化合物、例えばオリゴ糖、二糖、および単糖が含まれ、これにはショ糖、マンニトール、乳糖、Ｌ−アラビノース、Ｄ−エリトロース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、ラクツロース、セロビオース、ゲンチビオース、グリセリン、ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物を含む。親水性低分子量化合物のさらなる例には、Ｎ−メチルピロリドン、アルコール（例えば、オリゴビニルアルコール、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコールなど）、およびそれらの混合物が含まれる。
【０１００】
あるいは、本開示の組成物は、薬学的に許容される担体物質として、生理的条件に近づけるために必要とされる物質、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、および湿潤剤、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、およびそれらの混合物を含有してもよい。固体組成物の場合、従来の非毒性の薬学的に許容される担体を用いてもよく、これには例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが含まれる。
【０１０１】
本開示の特定の実施形態では、生物活性物質は、徐放性処方物として、例えば、持続放出性ポリマーを含む組成物として投与してもよい。活性物質は、迅速放出を防ぐ担体、例えば制御放出媒体、例えばポリマー、マイクロカプセル化送達系、または生体接着ゲルを用いて製造することができる。本開示の種々の組成物における活性物質の持続的送達は、組成物中に吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムヒドロゲルおよびゼラチンを含めることによって実現することができる。
【０１０２】
本開示を特定の実施形態に関連して記載し、説明の目的で多くの詳細を示してきたが、本開示がさらなる実施形態を含むこと、また本明細書に記載されている詳細の一部を本開示から逸脱することなく大幅に変更することができることは、当業者には明らかであろう。本開示は、そのようなさらなる実施形態、変更形態、および相当物を含む。とりわけ、本開示は、種々の例示的構成要素および例の特長、表現、または要素の任意の組み合わせを含む。
【０１０３】
本発明を特定の実施形態に関連して記載し、説明の目的で多くの詳細を示してきたが、本発明がさらなる実施形態を含むこと、また本明細書に記載した詳細の一部を本発明から逸脱することなく大幅に変更することができることは、当業者には明らかであろう。本発明は、そのようなさらなる実施形態、変更形態、および相当物を含む。とりわけ、本発明は、種々の例示的構成要素および例の特長、表現、または要素の任意の組み合わせを含む。
【０１０４】
実施例
実施例１〜４：核酸／カチオン性脂質塩
核酸／カチオン性脂質塩を以下の方法で製造した。清浄で乾燥した透明なホウケイ酸ガラスバイアル中で、２ｍｇのカチオン性脂質を０．１ｍＬのクロロホルムに溶解させ、バイアルに窒素ガスを送入してクロロホルムを蒸発させ、真空槽に入れて真空中（ｉｎ ｖａｃｕｏ）で乾燥させることによって、残留した微量のクロロホルムを全て除去した。バイアルを真空槽から取り出し、０．１ｍＬのエタノールを添加した。このバイアルをＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ライナー付きキャップで密閉し、シーリングテープでしっかりと巻いた。このバイアルをボルテックスまたは／および超音波処理して、カチオン性脂質を溶解させた。
【０１０５】
カチオン性脂質のエタノール溶液を１ｍｇのｓｉＲＮＡを含有する水性溶液に添加した。このカチオン性脂質のｓｉＲＮＡ溶液への添加により、速やかに凝集が起こり、カチオン性脂質とｓｉＲＮＡとから構成される水不溶性のカチオン性脂質／核酸塩を形成した。
【０１０６】
次いで管内のこの水不溶性のカチオン性脂質／核酸塩をエッペンドルフ微量遠心機で最大速度にて１５分間遠心分離し、ペレットを形成した。毎回の遠心分離後に上澄みを回収し、ＯＤ２６０で上澄み中のｓｉＲＮＡの量を測定した。
【０１０７】
残りの実施例では、核酸／カチオン性脂質塩を有機溶媒に可溶化し、さらなる脂質と混合して処方物にした。
【０１０８】
第１表は、本方法を用いて核酸／カチオン性脂質塩を形成するために使用したカチオン性脂質の一覧である。
【０１０９】
第１表
【表１】
【０１１０】
第２表は、ｓｉＲＮＡを水不溶性にするｓｉＲＮＡ／脂質の比率の測定の概要である。
【０１１１】
第２表
【表２】
【０１１２】
実施例５〜１８：肝臓ｓｉＲＮＡ送達処方物
肝臓ｓｉＲＮＡ送達処方物を以下の方法で製造した。実施例１〜４と同様に作製したカチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ塩（カチオン性脂質と複合体を形成する１ｍｇのｓｉＲＮＡを含有）を遠心分離し、乾燥させたあと、その塩を１００μＬのクロロホルムに再懸濁させ、クロロホルム中の脂質の混合物（第３表に指定の特定のカルバメート、リン脂質、および脂質−ＰＥＧに従って、４．４ｍｇのカルバメート、２．７〜４．４ｍｇのリン脂質、３．２ｍｇのコレステロール、および１４．４ｍｇの脂質−ＰＥＧ）と混合した。この混合物を真空下で乾燥させ、使用まで４℃で保管した。注射前、振盪しながら９％ショ糖溶液を添加して、ｓｉＲＮＡ／脂質処方物の等張性自己乳化性ｓｉＲＮＡ／脂質懸濁液を形成した。この処方物を投与量０．２ｍｌでＣＤｌマウスに尾静脈投与した。２日後、マウスを致死させて肝臓を採取し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を解析した。ｓｉＲＮＡ用量２ｍｇ／ｋｇで、８０％超の標的遺伝子のサイレンシングが認められた。
【０１１３】
第３表：肝臓送達処方物
【表３】
【０１１４】
図１は、実施例１１の処方物をマウスに注射することによる試験の結果を記載している。これらの結果は、請求項に記載の処方物としてのＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡの注射が、ｓｉＲＮＡ０．５〜４ｍｇ／ｋｇの投薬量で、肝臓におけるＡｐｏＢ遺伝子発現の発現ノックダウン、および血清コレステロール値の低下に有効であることを示している。
【０１１５】
図２は、実施例１１の請求項に記載の処方物としてのＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡに対する身体反応の経時変化を示している。これらの結果は、注射１４日後まで、ＡｐｏＢ ｍｉＲＮＡ発現および血清コレステロールが低下していることを示している。
【０１１６】
実施例２０〜２５：肺ｓｉＲＮＡ送達処方物
肺ｓｉＲＮＡ送達処方物を以下の方法で製造した。実施例１〜４と同様に作製したカチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ塩（カチオン性脂質と複合体を形成する１ｍｇのｓｉＲＮＡを含有）を遠心分離し、乾燥させたあと、その塩を１００μＬのクロロホルムに再懸濁させ、クロロホルム中の脂質の混合物（第４表に指定の特定のカルバメート、リン脂質、および脂質−ＰＥＧに従って、８．８ｍｇのカルバメート、２．２ｍｇのリン脂質、１．６ｍｇのコレステロール、および１４．４ｍｇの脂質−ＰＥＧ）と混合した。この混合物を真空下で乾燥させ、使用まで４℃で保管した。注射前、振盪しながら９％ショ糖溶液を添加して、ｓｉＲＮＡ／脂質処方物の等張性自己乳化性ｓｉＲＮＡ／脂質懸濁液を形成した。この処方物を投与量０．２ｍｌで１２９Ｓ１／ｓｖＩｍＪマウスに尾静脈投与した。２日後、マウスを致死させた。肺および肝臓を採取し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を解析した。
【０１１７】
第４表：肺送達処方物
【表４】
【０１１８】
図３は、請求項に記載の処方物をマウスに注射することによる試験の結果を記載している。これらの結果は、実施例２０の処方物としてのＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡおよびβ−アクチンの注射が、肺における相当する遺伝子の発現のノックダウンに有効であるが、この処方物は、肝臓におけるこれらの遺伝子の発現をほんのわずかに変化させるのみであることを示している。
【０１１９】
図４は、実施例２０の請求項に記載の処方物としてのＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡおよびβ−アクチン ＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡの注射に対する、肺の用量反応を示している。これらの結果は、ｓｉＲＮＡ２〜１２ｍｇ／ｋｇの投薬量で、これらの発現が低下すること、またこれらのｓｉＲＮＡ２〜８ｍｇ／ｋｇの投薬量では、肝臓発現にほとんど作用しないことを示している。
【０１２０】
実施例２６〜３２：腫瘍ｓｉＲＮＡ送達処方物
腫瘍ｓｉＲＮＡ送達処方物を以下の方法で製造した。実施例１〜４と同様に作製したカチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ塩（カチオン性脂質と複合体を形成する１ｍｇのｓｉＲＮＡを含有）を遠心分離し、乾燥させたあと、その塩を１００μＬのクロロホルムに再懸濁させ、クロロホルム中の脂質の混合物（第５表に指定の特定のカルバメート、リン脂質、および脂質−ＰＥＧに従って、４．４ｍｇのカルバメート、４．４ｍｇのリン脂質、２．４ｍｇのコレステロール、および２１．６ｍｇの脂質−ＰＥＧ）と混合した。この混合物を真空下で乾燥させ、使用まで４℃で保管した。注射前、振盪しながら９％ショ糖溶液を添加して、ｓｉＲＮＡ／脂質処方物の等張性自己乳化性ｓｉＲＮＡ／脂質懸濁液を形成した。この処方物を投与量０．２ｍｌでＢａｌｂ／ｃマウスに尾静脈投与した。ｓｉＲＮＡ処方物の投与５日前に、このマウスの肝臓にＥＭＴ６細胞を移植した。２日後、マウスを致死させた。腫瘍および肝臓を採取し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を解析した。
【０１２１】
第５表：腫瘍送達処方物
【表５】
【０１２２】
図５は、請求項に記載の処方物をマウスに注射することによる試験の結果を記載している。これらの結果は、実施例２７の処方物としてのラミンｓｉＲＮＡの注射は、腫瘍における相当する遺伝子の発現のノックダウンに有効であるが、この処方物が、肝臓におけるこれらの遺伝子の発現をそれほど変化させなかったことを示している。
【０１２３】
実施例３３：骨髄ｓｉＲＮＡ送達処方物
骨髄ｓｉＲＮＡ送達処方物を以下の方法で製造した。実施例１〜４と同様に作製したＤＯＴＭＡ／ｓｉＲＮＡ塩（ＤＯＴＭＡと複合体を形成する１ｍｇのｓｉＲＮＡを含有）を遠心分離し、乾燥させたあと、その塩を１００μＬのクロロホルムに再懸濁させ、クロロホルム中の脂質（６．６ｍｇのＮ6−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート、２．２ｍｇのＤＬｉｎＰＥ（１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、２．４ｍｇのコレステロール、および２１．６ｍｇのコレステロール−ＰＥＧ（コレステロール−ポリ（エチレングリコール）） ６６０）と混合した。この混合物を真空下で乾燥させ、使用まで４℃で保管した。注射前、振盪しながら９％ショ糖溶液を添加して、ｓｉＲＮＡ／脂質処方物の等張性自己乳化性ｓｉＲＮＡ／脂質懸濁液を形成した。この処方物を投与量０．２ｍｌでＣＤｌマウスに尾静脈投与した。２日後、マウスを致死させた。骨髄および肝臓を採取し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を解析した。
【０１２４】
実施例３４：皮膚処方物
皮膚ｓｉＲＮＡ送達処方物を以下の方法で製造した。蛍光標識したｓｉＲＮＡまたは蛍光標識していないｓｉＲＮＡを実験に使用した。ｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＭＡカチオン性脂質塩を実施例１と同様に製造した。次いで、このｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＭＡカチオン性脂質塩を１−オクタノールに溶解させた。ラウロイルグリコールおよびアゾンを含有する別の賦形剤の添加後、この処方物をブタ皮膚表面に塗布した。５時間のインキュベーション後、この処方物を除去し、皮膚表面を濯いで取り込まれていないｓｉＲＮを除去した。次いで、この皮膚組織を固定し、切断し（５μｍ厚）、核染色用のＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡下で蛍光強度を観察した。
【０１２５】
実施例３５：Ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子ノックダウン試験
実施した動物試験に使用した全ての手順は、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＡＣＵＣ）に承認されたものであり、該当する場合には、地方、州、および連邦の規制に準拠した。マウスに、投与量０．２ｍｌでｓｉＲＮＡ処方物を尾静脈投与した。投与２日後にマウスの組織を採取し、Ｔｕｒｂｏｃａｐｔｕｒｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてｍＲＮＡを単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（ＳｅｎｓｉＭｉｘ ＳＹＢＲ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ、Ｂｉｏｌｉｎｅ社）により遺伝子発現の変化を解析した。
【０１２６】
実施例３６：カチオン性脂質を含むｓｉＲＮＡのスケールアップ沈殿
ｉｎ ｖｉｖｏでの送達ｓｉＲＮＡの臨床試験のためにより大量の沈殿物を生成する目的で、１ｇのＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡを５００ｍｌのＲＮａｓｅを含まない水に室温で完全に可溶化した。２グラムの乾燥ＤＯＴＭＡを２５ｍｌの無水エタノールに溶解して、ＤＯＴＭＡ溶液を製造した。ｓｉＲＮＡ溶液を撹拌プレート上で撹拌しながら、ＤＯＴＭＡ溶液をｓｉＲＮＡ溶液にゆっくりと添加した。沈殿物が速やかに形成される。この混合物を室温で２０分間、続いて４℃で３０分〜数時間インキュベートした。この混合物を３０，０００ｇで３０分間遠心分離した。上澄みを除去し、固体を真空下で乾燥させた。
【０１２７】
実施例３７：カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）の水性溶液および核酸／ＤＯＴＭＡ塩の製造
清浄で乾燥した透明なホウケイ酸ガラスバイアル中で、２ｍｇのＤＯＴＭＡを０．１ｍＬのクロロホルムに溶解させ、バイアルに窒素ガスを送入してクロロホルムを蒸発させ、真空槽に入れて真空中（ｉｎ ｖａｃｕｏ）で乾燥させることによって、残留した微量のクロロホルムを全て除去した。バイアルを真空槽から取り出し、１ｍＬの滅菌水を添加した。このバイアルをＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ライナー付きキャップで密閉し、シーリングテープでしっかりと巻いた。このバイアルをボルテックスまたは／および超音波処理して澄明にした。
【０１２８】
１ｍｇのｓｉＲＮＡを含有する水性溶液をＤＯＴＭＡの水性溶液に添加した。このＤＯＴＭＡカチオン性脂質の水性溶液へのｓｉＲＮＡの添加により、速やかに凝集が起こり、ＤＯＴＭＡとｓｉＲＮＡとから構成される水不溶性のカチオン性脂質／核酸塩を形成した。
【０１２９】
管内の水不溶性のカチオン性脂質／核酸塩を氷上で少なくとも１０分間冷却した。次いで管内のこの水不溶性のカチオン性脂質／核酸塩をエッペンドルフ微量遠心機で最大速度にて１５分間遠心分離し、ペレットを形成した。水層を慎重に除去し、塩ペレットを真空槽に入れて真空中（ｉｎ ｖａｃｕｏ）で乾燥させ、さらに水分を除去した。
【０１３０】
実施例３８：カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）の水性溶液および核酸／ＤＯＴＭＡ塩の製造
実施例３５の方法を実施したが、ｓｉＲＮＡのＤＯＴＭＡへの添加後、得られた混合物を氷上で冷却せずに、そのまま遠心分離した。
【０１３１】
実施例３９：カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）の水性溶液および核酸／ＤＯＴＭＡ塩の製造
実施例３６の方法を実施したが、ＤＯＴＭＡの水性溶液をｓｉＲＮＡ溶液に添加した。
【０１３２】
実施例４０：カチオン性脂質１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）のエタノール溶液および核酸／ＤＬｉｎＤＭＡ塩の製造
実施例３５の方法を実施したが、カチオン性脂質としてＤＬｉｎＤＭＡを使用した。
【０１３３】
実施例４１：カチオン性脂質Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）のエタノール溶液および核酸／ＤＯＴＡＰ塩の製造
実施例３５の方法を実施したが、カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを使用し、この脂質をエタノールに可溶化した。
【０１３４】
実施例４２：カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）の水性溶液および核酸／ＤＯＴＭＡ塩の製造
実施例３５の方法を実施したが、ｓｉＲＮＡの代わりに細菌プラスミドを使用した。
【０１３５】
実施例４３：カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）のエタノール溶液および核酸／ＤＯＴＭＡ塩の製造
実施例４０の方法を実施したが、ＤＯＴＭＡを水ではなくエタノールに可溶化した。
【０１３６】
実施例４４：核酸とカチオン性脂質との混合後の液体からの核酸／カチオン性脂質塩の単離
実施例１〜４および３５〜４１のとおり核酸とカチオン性脂質とを混合したあと、混合物を氷上で少なくとも１０分間冷却してから遠心分離した。
【０１３７】
実施例４５：核酸とカチオン性脂質との混合後の液体からの核酸／カチオン性脂質塩の単離
核酸およびカチオン性脂質塩を実施例４２と同様に製造するが、混合物を遠心分離せずに乾燥させた。
【０１３８】
実施例４６：核酸とカチオン性脂質との混合後の液体からの核酸／カチオン性脂質塩の単離
核酸およびカチオン性脂質塩を実施例４３と同様に製造するが、混合物を濾過して沈殿した塩を回収した。
【０１３９】
実施例４７：核酸とカチオン性脂質との混合後の液体からの核酸／カチオン性脂質塩の単離
核酸およびカチオン性脂質塩を実施例４２と同様に製造するが、混合物を遠心分離前に冷却しなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性脂質とポリヌクレオチドとの固体混合物からなる組成物であって、前記固体混合物が、前記カチオン性脂質とポリヌクレオチドとが水を含有する溶媒中で混合されたときに即座に沈殿し、このとき前記カチオン性脂質は前記ポリヌクレオチドと水不溶性のイオン性複合体を形成し、前記複合体が乾燥無水固体として単離される、組成物。
【請求項２】
カチオン性脂質の前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドモノマーに対するモル比が０．１〜１０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
カチオン性脂質の前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドモノマーに対するモル比が０．５〜２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記カチオン性脂質が、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；３−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）；および１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）、Ｎ4−スペルミジンコレストリルカルバメート（ＧＬ−５３）、１−（Ｎ4−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（ＧＬ−８９）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記脂質が、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、およびＤＯＴＭＡからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、アンタガマー（antagamer）、プラスミド、プラスミド干渉核酸（ｉＮＡ）、リボザイム、低分子干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記カチオン性脂質と前記ポリヌクレオチドとの電荷比が１：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記混合物が、水を含有する溶媒中で前記カチオン性脂質と前記ポリヌクレオチドとを混合し、水不溶性沈殿物を生成し、前記沈殿物を単離し、前記沈殿物を乾燥させて無水固体を形成する方法よって作製される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記混合物は、無水の有機溶媒もしくは極性非プロトン性溶媒に可溶化することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
無水の有機溶媒もしくは非プロトン性溶媒に溶解された請求項１に記載の組成物を含む溶液。
【請求項１１】
カルバメートをさらに含む、請求項１０に記載の溶液。
【請求項１２】
前記カルバメートが、Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミンコレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミジンコレステリルカルバメート、１−（Ｎ４−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート、および２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテートからなる群から選択される、請求項１１に記載の溶液。
【請求項１３】
中性リン脂質をさらに含む、請求項１０に記載の溶液。
【請求項１４】
前記リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリン、およびジホスファチジルグリセロール（ＰＧ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の溶液。
【請求項１５】
前記リン脂質が、炭素８〜２２個のアルキル鎖から構成される、請求項１３に記載の溶液。
【請求項１６】
前記アルキル鎖が、１８：２、２０：４、および２２：６アルキル鎖からなる群から選択される、請求項１５に記載の溶液。
【請求項１７】
ステロールをさらに含む、請求項１０に記載の溶液。
【請求項１８】
前記ステロールが、コレステロール、ラノステロール、２４−イソプロピルコレステロール、ニカステロール、７−デヒドロコレステロール、２４−デヒドロコレステロール、ゴルゴステロール、ジノステロール、２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、カンペステロール、フコステロール、β−シトステロール、フィトスタノール、ステロールエステル、ステリルグリコシド、およびステリルアルキルエーテルからなる群から選択される、請求項１７に記載の溶液。
【請求項１９】
脂質−ＰＥＧ化合物をさらに含む、請求項１０に記載の溶液。
【請求項２０】
前記脂質が、リン脂質、グリセリル脂質、コレステロール、ラノステロール、２４−イソプロピルコレステロール、ニカステロール、７−デヒドロコレステロール、２４−デヒドロコレステロール、ゴルゴステロール、ジノステロール、２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、カンペステロール、フコステロール、β−シトステロール、フィトスタノール、ステロールエステル、ステリルグリコシド、およびステリルアルキルエーテルからなる群から選択される、請求項１９に記載の溶液。
【請求項２１】
前記ＰＥＧが、分子量２００〜５０００ｋＤａを有する、請求項１９に記載の溶液。
【請求項２２】
コレステロール、コレステロールＰＥＧ、ＰＥ、およびＮ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメートからなる群から選択される１つ以上の脂質をさらに含む、請求項１０に記載の溶液。
【請求項２３】
ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート４．４部／ＰＥ２．７〜４．４部／コレステロールＰＥＧ１４．４部／コレステロール１．６部（質量／質量）からなる、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２４】
ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート８．８部／ＰＥ２．２部／コレステロールＰＥＧ１４．４部／コレステロール１．６部（質量／質量）からなる、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２５】
ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート６．６部／ＰＥ２．２部／コレステロールＰＥＧ１４．４部／コレステロール１．６部（質量／質量）からなる、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２６】
ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート４．４部／ＰＥ４．４部／コレステロールＰＥＧ２１．６部／コレステロール４．８部（質量／質量）からなる、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２７】
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、およびＣ１６ ＰＥＧ７５０セラミドをさらに含む、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２８】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、およびコレステロール−ＰＥＧをさらに含む、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２９】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２０００をさらに含む、請求項２２に記載の溶液。
【請求項３０】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、およびＤＯＰＥ−ＰＥＧ ２０００をさらに含む、請求項２２に記載の溶液。
【請求項３１】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、コレステロール−ＰＥＧ ６６０、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２０００をさらに含む、請求項２２に記載の溶液。
【請求項３２】
請求項１０から３１までのいずれか１項に記載の溶液から前記有機溶媒もしくは非プロトン性溶媒を除去することによって得られる、固体処方物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の処方物を水性溶液に懸濁させることによって得られる、水性処方物。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドを皮膚に送達するのに適した処方物の形の、請求項１０から３１までのいずれか１項に記載の溶液。
【請求項３５】
哺乳動物に核酸を送達するのに適した、請求項３３に記載の水性処方物。
【請求項３６】
注射に適した、請求項３３に記載の水性処方物。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドを肝臓に送達するのに適した、請求項３６に記載の水性処方物。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチドを肺に送達するのに適した、請求項３６に記載の水性処方物。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドを腫瘍に送達するのに適した、請求項３６に記載の水性処方物。
【請求項１】
カチオン性脂質とポリヌクレオチドとの固体混合物からなる組成物であって、前記固体混合物が、前記カチオン性脂質とポリヌクレオチドとが水を含有する溶媒中で混合されたときに即座に沈殿し、このとき前記カチオン性脂質は前記ポリヌクレオチドと水不溶性のイオン性複合体を形成し、前記複合体が乾燥無水固体として単離される、組成物。
【請求項２】
カチオン性脂質の前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドモノマーに対するモル比が０．１〜１０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
カチオン性脂質の前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドモノマーに対するモル比が０．５〜２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記カチオン性脂質が、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；３−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）；および１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）、Ｎ4−スペルミジンコレストリルカルバメート（ＧＬ−５３）、１−（Ｎ4−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（ＧＬ−８９）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記脂質が、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、およびＤＯＴＭＡからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、アンタガマー（antagamer）、プラスミド、プラスミド干渉核酸（ｉＮＡ）、リボザイム、低分子干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記カチオン性脂質と前記ポリヌクレオチドとの電荷比が１：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記混合物が、水を含有する溶媒中で前記カチオン性脂質と前記ポリヌクレオチドとを混合し、水不溶性沈殿物を生成し、前記沈殿物を単離し、前記沈殿物を乾燥させて無水固体を形成する方法よって作製される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記混合物は、無水の有機溶媒もしくは極性非プロトン性溶媒に可溶化することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
無水の有機溶媒もしくは非プロトン性溶媒に溶解された請求項１に記載の組成物を含む溶液。
【請求項１１】
カルバメートをさらに含む、請求項１０に記載の溶液。
【請求項１２】
前記カルバメートが、Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミンコレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミジンコレステリルカルバメート、１−（Ｎ４−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート、および２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテートからなる群から選択される、請求項１１に記載の溶液。
【請求項１３】
中性リン脂質をさらに含む、請求項１０に記載の溶液。
【請求項１４】
前記リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリン、およびジホスファチジルグリセロール（ＰＧ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の溶液。
【請求項１５】
前記リン脂質が、炭素８〜２２個のアルキル鎖から構成される、請求項１３に記載の溶液。
【請求項１６】
前記アルキル鎖が、１８：２、２０：４、および２２：６アルキル鎖からなる群から選択される、請求項１５に記載の溶液。
【請求項１７】
ステロールをさらに含む、請求項１０に記載の溶液。
【請求項１８】
前記ステロールが、コレステロール、ラノステロール、２４−イソプロピルコレステロール、ニカステロール、７−デヒドロコレステロール、２４−デヒドロコレステロール、ゴルゴステロール、ジノステロール、２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、カンペステロール、フコステロール、β−シトステロール、フィトスタノール、ステロールエステル、ステリルグリコシド、およびステリルアルキルエーテルからなる群から選択される、請求項１７に記載の溶液。
【請求項１９】
脂質−ＰＥＧ化合物をさらに含む、請求項１０に記載の溶液。
【請求項２０】
前記脂質が、リン脂質、グリセリル脂質、コレステロール、ラノステロール、２４−イソプロピルコレステロール、ニカステロール、７−デヒドロコレステロール、２４−デヒドロコレステロール、ゴルゴステロール、ジノステロール、２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、カンペステロール、フコステロール、β−シトステロール、フィトスタノール、ステロールエステル、ステリルグリコシド、およびステリルアルキルエーテルからなる群から選択される、請求項１９に記載の溶液。
【請求項２１】
前記ＰＥＧが、分子量２００〜５０００ｋＤａを有する、請求項１９に記載の溶液。
【請求項２２】
コレステロール、コレステロールＰＥＧ、ＰＥ、およびＮ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメートからなる群から選択される１つ以上の脂質をさらに含む、請求項１０に記載の溶液。
【請求項２３】
ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート４．４部／ＰＥ２．７〜４．４部／コレステロールＰＥＧ１４．４部／コレステロール１．６部（質量／質量）からなる、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２４】
ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート８．８部／ＰＥ２．２部／コレステロールＰＥＧ１４．４部／コレステロール１．６部（質量／質量）からなる、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２５】
ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート６．６部／ＰＥ２．２部／コレステロールＰＥＧ１４．４部／コレステロール１．６部（質量／質量）からなる、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２６】
ポリヌクレオチド１部／Ｎ６−テトラキス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンコレステリルカルバメート４．４部／ＰＥ４．４部／コレステロールＰＥＧ２１．６部／コレステロール４．８部（質量／質量）からなる、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２７】
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、およびＣ１６ ＰＥＧ７５０セラミドをさらに含む、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２８】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、およびコレステロール−ＰＥＧをさらに含む、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２９】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２０００をさらに含む、請求項２２に記載の溶液。
【請求項３０】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、およびＤＯＰＥ−ＰＥＧ ２０００をさらに含む、請求項２２に記載の溶液。
【請求項３１】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、コレステロール、コレステロール−ＰＥＧ ６６０、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２０００をさらに含む、請求項２２に記載の溶液。
【請求項３２】
請求項１０から３１までのいずれか１項に記載の溶液から前記有機溶媒もしくは非プロトン性溶媒を除去することによって得られる、固体処方物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の処方物を水性溶液に懸濁させることによって得られる、水性処方物。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドを皮膚に送達するのに適した処方物の形の、請求項１０から３１までのいずれか１項に記載の溶液。
【請求項３５】
哺乳動物に核酸を送達するのに適した、請求項３３に記載の水性処方物。
【請求項３６】
注射に適した、請求項３３に記載の水性処方物。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドを肝臓に送達するのに適した、請求項３６に記載の水性処方物。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチドを肺に送達するのに適した、請求項３６に記載の水性処方物。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドを腫瘍に送達するのに適した、請求項３６に記載の水性処方物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５２６８５８（Ｐ２０１２−５２６８５８Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１９２３（Ｐ２０１２−５１１９２３）
【出願日】平成２２年５月１６日（２０１０．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５０４９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３５２０７
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１２７８６０４）
【氏名又は名称原語表記】Ｋｕｎｙｕａｎ Ｃｕｉ
【住所又は居所原語表記】３２２４ １８９ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ ＳＥ， Ｂｏｔｈｅｌｌ， ＷＡ ９８０１２−７９６２， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【出願人】（５１１２７８６１５）
【氏名又は名称原語表記】Ｄｏｎｇ Ｌｉａｎｇ
【住所又は居所原語表記】４９１８ １４８ｔｈ Ｐｌａｃｅ ＳＥ， Ｅｖｅｒｅｔｔ， ＷＡ ９８２０８−８８１１， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【出願人】（５１１２７８６２６）
【氏名又は名称原語表記】Ｄａｖｉｄ Ｓｗｅｅｄｌｅｒ
【住所又は居所原語表記】５１６ Ｅ． Ｕｎｉｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ， ＃２０２， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ ９８１２２， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１６日（２０１０．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５０４９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３５２０７
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１２７８６０４）
【氏名又は名称原語表記】Ｋｕｎｙｕａｎ Ｃｕｉ
【住所又は居所原語表記】３２２４ １８９ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ ＳＥ， Ｂｏｔｈｅｌｌ， ＷＡ ９８０１２−７９６２， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【出願人】（５１１２７８６１５）
【氏名又は名称原語表記】Ｄｏｎｇ Ｌｉａｎｇ
【住所又は居所原語表記】４９１８ １４８ｔｈ Ｐｌａｃｅ ＳＥ， Ｅｖｅｒｅｔｔ， ＷＡ ９８２０８−８８１１， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【出願人】（５１１２７８６２６）
【氏名又は名称原語表記】Ｄａｖｉｄ Ｓｗｅｅｄｌｅｒ
【住所又は居所原語表記】５１６ Ｅ． Ｕｎｉｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ， ＃２０２， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ ９８１２２， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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