液滴形成器具、液滴形成方法および核酸増幅方法
【課題】基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を同時かつ簡易に形成すること。
【解決手段】液滴形成器具１は、分注細管部材１１と液滴形成部材１３とを備える。分注細管部材１１は、上面に注入口１１１が形成される。また、下面には、基板３を連結したときに各スポット３１と対応する位置にそれぞれ分注口１１３が形成され、注入口１１１から注入された核酸増幅用溶液を各分注口１１３に分注する。液滴形成部材１３は、基板３を気密状態で着脱自在に連結し、分注細管部材１１の各分注口１１３から分注された核酸増幅用溶液を案内し、隣接するスポット３１間が仕切られた状態で基板３上面の各スポット３１に液滴を形成する。
【解決手段】液滴形成器具１は、分注細管部材１１と液滴形成部材１３とを備える。分注細管部材１１は、上面に注入口１１１が形成される。また、下面には、基板３を連結したときに各スポット３１と対応する位置にそれぞれ分注口１１３が形成され、注入口１１１から注入された核酸増幅用溶液を各分注口１１３に分注する。液滴形成部材１３は、基板３を気密状態で着脱自在に連結し、分注細管部材１１の各分注口１１３から分注された核酸増幅用溶液を案内し、隣接するスポット３１間が仕切られた状態で基板３上面の各スポット３１に液滴を形成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成器具、この液滴形成器具を用いた液滴形成方法および核酸増幅方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学分野において、ＤＮＡやＲＮＡを活用した診断が注目を集めている。また、農業分野では、品種の判定や遺伝子組み換え作物の判定にＤＮＡ鑑定が活用されている。このような診断や品種の判定では、血液や組織、細胞等の生体試料や作物試料中に検出対象のＤＮＡまたはＲＮＡが存在するか否か、あるいはその塩基配列の変異等の判別を行うが、試料中に含まれる核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）は微量である場合が多い。このため、事前に試料を増幅処理し、例えばＰＣＲ法によって検出対象の核酸をＰＣＲ増幅している。検出対象の核酸がＲＮＡの場合には、試料を高温下で熱変性させ、逆転写酵素を用いてＤＮＡに逆転写した後で、ＰＣＲ増幅している。
【０００３】
また、試料の微量化に伴い、増幅処理を基板上で行う方法が提案されている。例えば、基板上面の複数の液滴形成位置に微細な加工を施してスポットを形成し、各スポットに微量の試料や増幅用の試薬を分注して増幅処理するようにしたものが知られている。また、基板に核酸の抽出や増幅、電気泳動による検出等を行う機能部を設け、この基板上で一連の工程を行えるようにしたものも知られている（特許文献１，２参照）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−９５１３４号公報
【特許文献２】特許第３５４５１５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、基板上面の複数の液滴形成位置にスポットを形成し、各スポットに試料や増幅用の試薬を分注して増幅処理する場合、各スポットそれぞれに対して個別に手作業で分注を行わなければならず、手間であった。また、多連のピペットを用いれば、複数のスポットに同時に試料や増幅用の試薬を分注することができるが、各スポットは密集して形成されており、分注時に隣接するスポットとの間で試料や試薬が混合してしまい、コンタミネーションが生じるという問題もあった。
【０００６】
本発明は、上記に鑑みなされたものであって、基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を同時かつ確実に形成することができる液滴形成器具、液滴形成方法および核酸増幅方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した課題を解決し、目的を達成するため、本発明にかかる液滴形成器具は、核酸分析の増幅工程で用いられる基板を気密状態で着脱自在に連結し、前記基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成器具であって、前記基板を連結したときに前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、前記核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成されることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明にかかる液滴形成器具は、上記の発明において、前記流路は同一径で形成され、前記注入口と前記各開口との間の流路長がそれぞれ等しくなるように形成されることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明にかかる液滴形成器具は、上記の発明において、前記流路は、前記注入口から注入される前記核酸増幅用溶液が前記各開口に同量ずつ供給されるように、前記注入口と開口との間の流路長に応じた径で形成されることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明にかかる液滴形成器具は、上記の発明において、前記基板の各液滴形成位置には、親水性領域と撥水性領域のパターンによって形成された液滴形成部が形成されており、前記各開口は、前記液滴形成部と同じまたは前記液滴形成部より小さな径で形成されることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明にかかる液滴形成器具は、上記の発明において、前記各開口の径は、０．０５ｍｍから５ｍｍの範囲で形成されることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明にかかる液滴形成器具は、上記の発明において、前記各開口が形成され、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成部材と、前記注入口が形成され、前記液滴形成部材を介して前記核酸増幅用溶液を前記基板の各液滴形成位置に分注する分注細管部材とに分離可能に構成されることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明にかかる液滴形成器具は、上記の発明において、前記液滴形成部材は、シリコンゴム、フッ素ゴムまたはアクリルゴムで形成されることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明にかかる液滴形成方法は、核酸分析の増幅工程で用いられる基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成器具であって、前記基板を連結したときに前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、前記核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具を用いた液滴形成方法であって、前記液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、を含むことを特徴とする。
【００１５】
また、本発明にかかる液滴形成方法は、上記の発明において、前記液滴形成工程の後、前記注入口からオイルを注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に形成された前記核酸増幅用溶液の液滴を前記オイルで被膜する被膜形成工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、核酸分析の増幅工程で用いられる基板上の複数の液滴形成位置にそれぞれ検体を分注する検体分注工程と、前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、前記基板を前記液滴形成器具が連結された状態で増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、を含むことを特徴とする。
【００１７】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、前記検体分注工程は、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ同一の検体を分注することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、核酸分析の増幅工程で用いられる基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、検体および核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、前記注入口から前記検体を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記検体の液滴を形成するとともに、前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、前記基板を増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、を含むことを特徴とする。
【００１９】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、核酸分析の増幅工程で用いられる基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、検体と混合された核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、前記注入口から前記検体と混合された核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記検体と混合された核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、前記基板を増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、を含むことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、前記液滴形成器具は、前記各開口が形成され、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成部材と、前記注入口が形成され、前記液滴形成部材を介して前記核酸増幅用溶液、前記検体または前記検体と混合された核酸増幅用溶液を前記基板の各液滴形成位置に分注する分注細管部材とに分離可能に構成されており、前記液滴形成工程の後、前記液滴形成部材から前記分注細管部材を分離する分離工程を含み、前記増幅工程では、前記基板を前記液滴形成部材が連結された状態で増幅装置に設置することを特徴とする。
【００２１】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、前記液滴形成工程の後であって前記分離工程の前に、前記注入口からオイルを注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に形成された液滴を前記オイルで被膜する被膜形成工程を含むことを特徴とする。
【００２２】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、前記分離工程の後、前記分注細管部材が分離された前記液滴形成部材の分離面を密封する密封工程を含むことを特徴とする。
【００２３】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、核酸分析の増幅工程で用いられる基板上の複数の液滴形成位置にそれぞれ検体を分注する検体分注工程と、前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、前記注入口からオイルを注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に形成された前記核酸増幅用溶液の液滴を前記オイルで被膜する被膜形成工程と、前記基板から前記液滴形成器具を取り外す取外工程と、前記基板を増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、注入口から核酸増幅用溶液を注入することによって基板の各液滴形成位置と対応する位置に形成された各開口に核酸増幅用溶液を供給し、基板の各液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成することができる。またこのとき、基板を気密に連結した状態で各開口に核酸増幅用溶液を供給し、基板の各液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成することができるので、隣接する液滴形成位置にそれぞれ分注された核酸増幅用溶液が混合してしまうといった事態を防止できる。したがって、基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を同時かつ確実に形成することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、図面を参照し、本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、この実施の形態によって本発明が限定されるものではない。
【００２６】
（実施の形態）
図１は、本実施の形態における液滴形成器具１の構成を説明する模式図である。この液滴形成器具１は、分注細管部材１１と、液滴形成部材１３とを備え、基板３の上面に着脱自在に取り付けられて基板３上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成する。また、液滴形成器具１は、蓋部材１５を備えている。この蓋部材１５は、分注細管部材１１および液滴形成部材１３を用いて核酸増幅用溶液の液滴を形成した後の増幅処理時に用いられるものであり、図１では破線で示している。ここで、基板３は、大きさが約７５０×２５０ｍｍのスライドガラスで構成され、その上面の複数の液滴形成位置に液滴形成部である複数のスポット３１が配列されて形成される。各スポット３１は、１．５ｍｍ〜２．０ｍｍ程度の径を有し、例えば親水−撥水パターンによって形成される。図２は、基板３上面のスポット３１の構成を説明する図である。図２に示すように、基板３上面には、親水性領域３３１，３３５と撥水性領域３３３，３３７とが交互に形成されており、核酸増幅用溶液Ｌ１が供給される親水性領域３３１および核酸増幅用溶液Ｌ１を被膜するオイルＬ３が供給される親水性領域３３５と、これら親水性領域３３１，３３５の間に介在する撥水性領域３３３とによってスポット３１が形成される。
【００２７】
分注細管部材１１は、図１に示すように、上面に注入口１１１が形成され、下面に複数の分注口１１３が形成されて構成されている。この分注細管部材１１は、例えばガラス基板やプラスチック基板等で形成される。ガラス基板は、公知のガラス材料を用いて形成することができる。また、プラスチック基板の材料としては、例えばポリプロピレンやアクリル、ポリカーボネート等を用いることができる。
【００２８】
注入口１１１には、例えばシリンジが接続され、このシリンジによって核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３が順次注入される。図３は、注入口１１１に接続されるシリンジ５の構成を説明する図である。図３に示すように、シリンジ５は、先端に吐出口５２が設けられ、内部に核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３が充填されたシリンダ５１と、シリンダ５１の後端にスライド自在に挿入されるピストン５３とで構成される。シリンダ５１先端の吐出口５２は、分注細管部材１１の注入口１１１と接続され、ピストン５３を押圧することによって注入口１１１から核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３が注入される。ここで、核酸増幅用溶液Ｌ１は、例えばプライマーや核酸の伸長反応のための基質であるｄＮＴＰ、増幅用酵素、酵素を活性化させるためのマグネシウム塩等を緩衝液中に添加したものである。また、シリンジ５内に充填されるオイルＬ３は、実際に注入口１１１から注入する量よりも多く充填される。これは、核酸増幅用溶液Ｌ１やオイルＬ３を各分注口１１３に押し出して所定量ずつ分注し、基板３上の各スポット３１にこれらを供給するためであり、シリンダ５１にはオイルＬ３の注入量を規定するための注入量マーカＭＫが付されている。このシリンジ５によって核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３を注入する際には、シリンダ５１内に残存するオイルＬ３の上面が注入量マーカＭＫの位置と一致するまでピストン５３を押圧して核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３を順次注入する。
【００２９】
一方、分注細管部材１１の下面に形成された各分注口１１３は、この基板３上面の各スポット３１と対応する位置にそれぞれ形成される。図４は、分注細管部材１１の内部構成を説明する図である。また、図５は、分注細管部材１１の側面図である。図４に示すように、分注細管部材１１の内部には、注入口１１１と各分注口１１３との間をそれぞれ接続する流路１１２が形成されている。この流路１１２は、注入口１１１と各分注口１１３との間の流路長がそれぞれ等しくなるように、段階的に分流されて形成される。これにより、図５に示すように、各分注口１１３からそれぞれほぼ同量の液体Ｌ（具体的には核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３）を分注することが可能である。
【００３０】
液滴形成部材１３は、基板３とほぼ同様の大きさに形成された平面部１３１と、この平面部１３１の下面に一体形成された複数の筒状部１３３とを備える。この液滴形成部材１３の材料としては、基板３を気密状態で着脱自在に連結可能であり、耐熱性や耐油性を有する例えばシリコンゴムやフッ素ゴム、アクリルゴム等を用いることができる。図６は、液滴形成部材１３の側面図であり、図７は液滴形成部材１３の下面図である。図６に示すように、平面部１３１には、上下方向に貫通する複数の貫通孔１３２が形成されている。各貫通孔１３２は、基板３上面の各スポット３１と対向する位置に形成され、スポット３１と同程度の径を有する。一方、図７に示すように、各筒状部１３３は、その内径が貫通孔１３２と同程度の径に形成され、それぞれ各貫通孔１３２の下端開口に設けられる。液滴形成部材１３は、この貫通孔１３２および筒状部１３３によって分注細管部材１１の各分注口１１３から同量ずつ分注された核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３を案内し、隣接するスポット３１間が仕切られた状態で基板３上面の各スポット３１に液滴を形成する。
【００３１】
蓋部材１５は、液滴形成部材１３の平面部１３１上面に形成された各貫通孔１３２の上端開口を密封するためのものであり、分注細管部材１１の注入口１１１から核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３を注入して基板３上面の各スポット３１に分注した後、分注細管部材１１を分離した液滴形成部材１３の平面部１３１上面に装着される。例えば、基板３上面の全域を被覆可能なサイズに形成され、平面部１３１上面をシールするシール部材で形成される。あるいは、液滴形成部材１３の平面部１３１上面に装着されたときに、各貫通孔１３２の上端開口とそれぞれ対向する位置に、この貫通孔１３２の上端開口と嵌合する凸部が形成された板状の部材を蓋部材１５としてもよい。材料としては、例えばシリコンゴムやフッ素ゴム、アクリルゴムといった液滴形成部と同一の材料を用いることができる。
【００３２】
次に、液滴形成器具１を用いた核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３の分注手順について、図８〜図１１を参照して説明する。なお、液滴形成器具１を用いた核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３の分注に先立って、基板３上面の各スポット３１に、例えば血液検体から作成したＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料等の核酸試料を所定量ずつ分注し、乾燥させてはり付けておく。各スポット３１に分注する核酸試料は、同一の検体から作成したものであってもよいし、異なる検体から作成したものであってもよい。
【００３３】
先ず、図８に示すように、基板３上面に液滴形成部材１３を対向配置し、各筒状部１３３の下端開口と基板３上面の各スポット３１との間がそれぞれ連通するようにこれらを連結するとともに、液滴形成部材１３の平面部１３１上面に分注細管部材１１を対向配置し、各貫通孔１３２の上端開口と分注細管部材１１下面の各分注口１１３との間がそれぞれ連通するようにこれらを連結する。また、分注細管部材１１の注入口１１１に、図３に示して説明したように核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３が充填されたシリンジ５を接続する。
【００３４】
続いて、シリンジ５のピストン５３を押圧し、図９に示すように、分注細管部材１１の注入口１１１から先ず核酸増幅用溶液Ｌ１を注入する。これにより、注入された核酸増幅用溶液Ｌ１が分注細管部材１１によって各分注口１１３から所定量ずつ分注され、分注された核酸増幅用溶液Ｌ１が液滴形成部材１３の平面部１３１に形成された各貫通孔１３２およびこの貫通孔１３２の下端開口と連通する筒状部１３３に案内されて基板３上面の各スポット３１に液滴を形成する。続いて、図１０に示すように、注入口１１１からオイルＬ３を注入する。これにより、注入されたオイルＬ３が分注細管部材１１によって各分注口１１３から所定量ずつ分注され、分注されたオイルＬ３が液滴形成部材１３を構成する貫通孔１３２および筒状部１３３によって案内されて基板３上面の各スポット３１に形成された核酸増幅用溶液Ｌ１の液滴を被膜する。
【００３５】
そして、図１１に示すように、液滴形成部材１３の平面部１３１上面の分注細管部材１１を分離するとともに、蓋部材１５を装着して平面部１３１上面に露出した貫通孔１３２の上端開口を密封し、増幅装置であるＰＣＲ増幅装置に設置して増幅処理を行う。ここで、ＰＣＲ増幅装置は、ＰＣＲ法による核酸試料の増幅を行う装置であり、例えば基板３上の温度制御が可能なスライドサイクラー等を用いることができる。ＰＣＲ法は、核酸試料中に含まれるＤＮＡやＲＮＡのうち、所定の塩基配列を有するＤＮＡやＲＮＡの一部（特定部分）を繰り返し合成・増幅する手法であり、高温下での熱変性と低温下でのアニーリングを繰り返し行うことによって、核酸中の特定部分を合成・増幅させる。
【００３６】
増幅処理後、液滴形成部材１３は廃棄され、分注細管部材１１は洗浄されて再利用される。このとき、再利用時に異なる組成の核酸増幅用溶液を用いる場合等、必要に応じてオートクレーブ滅菌（高温高圧蒸気滅菌）による消毒を行うこととしてもよい。
【００３７】
（実験例１）
事前に、核酸試料として、６人の被検者からそれぞれ採取した２ｎｇの血液検体をもとに２ｎｇ／ｕｌのＤＮＡ試料を作成する。また、核酸増幅用溶液を、例えば次のようにして調整する。すなわち、一の塩基配列を有する第１のプライマーおよび一の塩基配列とは異なる他の塩基配列を有する第２のプライマーを、それぞれその濃度が０．２５Ｍとなるように、ｄＮＴＰの濃度が０．２ｍＭとなるように緩衝液と混合し、混合溶液を５０ｕｌ作成する。そして、この混合溶液に例えばＴａｑポリメラーゼを１．２５ｕｎｉｔｓ添加して核酸増幅用溶液を調整する。
【００３８】
先ず、基板３上の各スポット３１にＤＮＡ試料を１ｕｌずつ手作業で分注する。続いて、この基板３を例えば３７℃に温度制御されたＰＣＲ増幅装置に設置し、ＤＮＡ試料を乾燥させる。なお、室温で乾燥させることとしても構わない。ＤＮＡ試料を乾燥させたならば、基板３上面に液滴形成部材１３を連結するとともに、液滴形成部材１３の平面部１３１上面に分注細管部材１１を連結し、核酸増幅用溶液およびオイルを順番に分注して基板３上面の各スポット３１に核酸増幅用溶液の液滴を形成してオイルで被膜する。そして、ＰＣＲ増幅装置に設置して基板３上面の各スポット３１上に貼り付けられたＤＮＡ試料の増幅処理を行う。このＰＣＲ増幅の反応条件は、例えば、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で３０秒間を１サイクルとして３０サイクル行う。
【００３９】
そして、増幅処理を終えた基板３上面の各スポット３１のＤＮＡ増幅液を被検体毎に回収し、得られた６人の被検体毎のＤＮＡ増幅液をマーカー試料とともに電気泳動させ、ＤＮＡをサイズ毎に分離することによってＤＮＡ増幅液を分析する。図１２は、分析結果を示す図である。図１２に示す分析結果では、各被検体のバンドＢ１１〜Ｂ１６は、それぞれマーカーＭ１０の２００（ｂｐ）のバンド位置に近傍に分離されている。
【００４０】
（実験例２）
事前に、核酸試料として、ある被検者から採取した血液検体をもとに、２ｎｇ／ｕｌのＤＮＡ試料を基板３上での増幅用と従来のマイクロチューブ内での増幅用にそれぞれ作成する。また、核酸増幅用溶液についても同様に、実験例１と同様にして基板３上での増幅用と従来のマイクロチューブ内での増幅用にそれぞれ調整する。
【００４１】
そして、基板３上の各スポット３１に基板３上での増幅用に作成したＤＮＡ試料を分注して貼り付け、液滴形成器具１を用いて各スポット３１に基板３上での増幅用に作成した核酸増幅用溶液の液滴を形成し、ＰＣＲ増幅装置に設置して増幅処理を行う。また、従来のマイクロチューブに、このマイクロチューブ内での増幅用に作成したＤＮＡ試料および核酸増幅用溶液を収容して混合し、このマイクロチューブを設置可能な例えばサーマルサイクラー等のＰＣＲ増幅装置に設置して増幅処理する。増幅処理は同一の反応条件で行い、例えば、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で３０秒間を１サイクルとして３０サイクル行う。
【００４２】
そして、増幅処理を終えた基板３上面の各スポット３１のＤＮＡ増幅液を回収し、得られたＤＮＡ増幅液およびマイクロチューブ内のＤＮＡ増幅液をマーカー試料とともに電気泳動させ、ＤＮＡをサイズ毎に分離することによってＤＮＡ増幅液を分析する。図１３は、分析結果を示す図である。図１３に示す分析結果では、各ＤＮＡ増幅液のバンドＢ２１，Ｂ２３は、マーカーＭ２０に対してそれぞれほぼ同一のバンド位置に分離されているが、マイクロチューブ内のＤＮＡ増幅液のバンドＢ２３はその濃さ（太さ）にムラがある。これに対し、基板３上で増幅させたＤＮＡ増幅液のバンドＢ２１はその濃さ（太さ）が均一に得られ、複数のスポット３１に分散させて増幅処理を行った場合の方が、１つのマイクロチューブ内で増幅処理を行った場合よりも濃くはっきりとバンドが検出される。
【００４３】
以上説明したように、本実施の形態によれば、分注細管部材１１によって各分注口１１３から核酸増幅用溶液を同量ずつ分注するとともに、核酸増幅用溶液を液滴形成部材１３によって基板３上面の各スポット３１に供給し、その液滴を形成することができる。またこのとき、液滴形成部材１３は基板３を気密状態で連結しており、基板３上面の隣接するスポット３１間が仕切られた状態で核酸増幅用溶液を供給することができるので、隣接するスポット３１間でのコンタミネーションを防止できる。したがって、基板３上面の複数のスポット３１に核酸増幅用溶液の液滴を同時かつ確実に形成することができ、核酸試料が微量であっても増幅処理が可能である。また、基板３としてスライドガラスを加工して用いることができるので、核酸試料として細胞等を用いる場合には、顕微鏡下で細胞の観察を行いながら各スポット３１に核酸試料を確実に固定することが可能である。
【００４４】
なお、上記した実施の形態では、分注細管部材１１の内部に段階的に分流された流路が形成される場合について説明したが、注入口と各分注口との間をそれぞれ個別に接続する流路を形成することとしてもよい。例えば、分注口および流路を、注入口との距離が遠い分注口およびこの分注口までの流路ほど大きい径で形成することとしてもよい。このとき、各分注口およびこの分注口までの流路の径を、０．０５ｍｍ〜５ｍｍの範囲で形成すると好ましい。このように構成した場合も上記した実施の形態と同様に、各分注口からそれぞれほぼ同量の核酸増幅用溶液およびオイルを分注することができる。
【００４５】
また、液滴形成部材１３の構成は、上記した実施の形態の構成に限定されるものではない。図１４は、液滴形成部材１３の構成の変形例を示す図である。図１４に示すように、液滴形成部材１４を板状の部材で形成し、基板３上の各スポット３１の位置と対する位置に貫通孔１４１を形成した構成としてもよい。
【００４６】
また、上記した実施の形態では、基板３上面の各スポット３１に核酸増幅用溶液の液滴を形成し、この液滴をオイルで被膜した後、分注細管部材１１を分離して蓋部材１５を装着し、ＰＣＲ増幅装置に設置して増幅処理を行う場合について説明したが、分注細管部材１１だけでなく液滴形成部材１３も取り外し、基板３のみをＰＣＲ増幅装置に設置する構成としてもよい。
【００４７】
また、基板３上面の各スポット３１に形成した核酸増幅用溶液の液滴をオイルで被膜することとしたが、オイルによる被膜を行わないこととしてもよい。この場合には、基板３上面の各スポット３１に核酸増幅用溶液を分注して基板３上面の各スポット３１に液滴を形成した後、分注細管部材１１を分離して蓋部材１５を装着し、ＰＣＲ増幅装置に設置して増幅処理を行う。
【００４８】
また、上記した実施の形態では、分注細管部材１１の上面の１箇所に注入口１１１を設けた場合について説明したが、注入口を複数個所設ける構成としてもよい。この場合には、分注細管部材の下面に形成された各分注口がいずれかの注入口と接続されるように、分注細管部材の内部に流路を形成する。そして、各注入口にシリンジを接続して各分注口にそれぞれ核酸増幅用溶液やオイルを分注する。
【００４９】
また、基板３上面の各スポット３１に分注する検体は、それぞれ異なる被検体から採取した検体であってもよい。また、各スポット３１に予め別のプライマーを分注し、乾燥させてはり付けておくこととしてもよい。この場合には、核酸増幅用溶液としてプライマーを含有しない溶液を調整し、液滴形成器具１によって基板３上面の各スポット３１に分注すればよい。また、基板３上面の各スポット３１で同一のＤＮＡ試料についてＰＣＲ増幅を行う場合には、ＤＮＡ試料を核酸増幅用溶液と混合し、この混合溶液を液滴形成器具１を用いて基板３上面の各スポット３１に分注することも可能である。この場合には、ＤＮＡ試料を基板３上面の各スポット３１に予め分注しておく必要がない。
【００５０】
また、上記した実施の形態では、液滴形成器具１を用いた核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３の分注に先立って、予め基板３上面の各スポット３１に検体（ＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料等の核酸試料）を分注しておく場合について説明したが、検体についても液滴形成器具１を用いて分注してもよい。例えば、液滴形成器具１を用いて基板３上面の各スポット３１に先ず検体を分注し、次いで、液滴形成器具１を用いて各スポット３１に核酸増幅用溶液を分注することとしてもよい。この場合、ＤＮＡ試料を基板３上面の各スポット３１に予め分注しておく必要がない。なおこのとき、検体の分注および核酸増幅用溶液の分注に同一の液滴形成器具１を用いてもよいし、検体を分注した後で液滴形成器具１を別の液滴形成器具１と取り替えて用いることとしてもよい。
【００５１】
また、上記した実施の形態では、基板３に液滴形成部材１３と分注細管部材１１とを装着して基板３上の各スポット３１に液滴を形成することとしたが、これらを一体的に形成して液滴形成器具を構成してもよい。また、液滴形成器具を分注細管部材のみで構成してもよい。この場合には、分注細管部材１１の各分注口１１３と基板３上面の各スポット３１との間が連通するようにこれらを連結し、核酸増幅用溶液の分注・液滴の形成を行う。あるいは、分注細管部材１１の各分注口１１３と基板３上面の各スポット３１との間が連通するようにこれらを連結した後、先ず検体の分注・液滴の形成を行い、次いで核酸増幅用溶液の分注・液滴の形成を行う。この後、オイルの分注を必要に応じて行い、各スポット３１の液滴を被膜する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】液滴形成器具の構成を説明する模式図である。
【図２】基板上面のスポットの構成を説明する図である。
【図３】注入口に接続されるシリンジの構成を説明する図である。
【図４】分注細管部材の内部構成を説明する図である。
【図５】分注細管部材の側面図である。
【図６】液滴形成部材の側面図である。
【図７】液滴形成部材の下面図である。
【図８】液滴形成器具を用いた核酸増幅用溶液およびオイルの分注手順を説明する図である。
【図９】液滴形成器具を用いた核酸増幅用溶液およびオイルの分注手順を説明する図である。
【図１０】液滴形成器具を用いた核酸増幅用溶液およびオイルの分注手順を説明する図である。
【図１１】液滴形成器具を用いた核酸増幅用溶液およびオイルの分注手順を説明する図である。
【図１２】実験例１の分析結果を示す図である。
【図１３】実験例２の分析結果を示す図である。
【図１４】液滴形成部材の構成の変形例を示す図である。
【符号の説明】
【００５３】
１ 液滴形成器具
１１ 分注細管部材
１１１ 注入口
１１３ 分注口
１３ 液滴形成部材
１３１ 平面部
１３３ 筒状部
１５ 蓋部材
３ 基板
３１ スポット
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成器具、この液滴形成器具を用いた液滴形成方法および核酸増幅方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学分野において、ＤＮＡやＲＮＡを活用した診断が注目を集めている。また、農業分野では、品種の判定や遺伝子組み換え作物の判定にＤＮＡ鑑定が活用されている。このような診断や品種の判定では、血液や組織、細胞等の生体試料や作物試料中に検出対象のＤＮＡまたはＲＮＡが存在するか否か、あるいはその塩基配列の変異等の判別を行うが、試料中に含まれる核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）は微量である場合が多い。このため、事前に試料を増幅処理し、例えばＰＣＲ法によって検出対象の核酸をＰＣＲ増幅している。検出対象の核酸がＲＮＡの場合には、試料を高温下で熱変性させ、逆転写酵素を用いてＤＮＡに逆転写した後で、ＰＣＲ増幅している。
【０００３】
また、試料の微量化に伴い、増幅処理を基板上で行う方法が提案されている。例えば、基板上面の複数の液滴形成位置に微細な加工を施してスポットを形成し、各スポットに微量の試料や増幅用の試薬を分注して増幅処理するようにしたものが知られている。また、基板に核酸の抽出や増幅、電気泳動による検出等を行う機能部を設け、この基板上で一連の工程を行えるようにしたものも知られている（特許文献１，２参照）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−９５１３４号公報
【特許文献２】特許第３５４５１５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、基板上面の複数の液滴形成位置にスポットを形成し、各スポットに試料や増幅用の試薬を分注して増幅処理する場合、各スポットそれぞれに対して個別に手作業で分注を行わなければならず、手間であった。また、多連のピペットを用いれば、複数のスポットに同時に試料や増幅用の試薬を分注することができるが、各スポットは密集して形成されており、分注時に隣接するスポットとの間で試料や試薬が混合してしまい、コンタミネーションが生じるという問題もあった。
【０００６】
本発明は、上記に鑑みなされたものであって、基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を同時かつ確実に形成することができる液滴形成器具、液滴形成方法および核酸増幅方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した課題を解決し、目的を達成するため、本発明にかかる液滴形成器具は、核酸分析の増幅工程で用いられる基板を気密状態で着脱自在に連結し、前記基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成器具であって、前記基板を連結したときに前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、前記核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成されることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明にかかる液滴形成器具は、上記の発明において、前記流路は同一径で形成され、前記注入口と前記各開口との間の流路長がそれぞれ等しくなるように形成されることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明にかかる液滴形成器具は、上記の発明において、前記流路は、前記注入口から注入される前記核酸増幅用溶液が前記各開口に同量ずつ供給されるように、前記注入口と開口との間の流路長に応じた径で形成されることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明にかかる液滴形成器具は、上記の発明において、前記基板の各液滴形成位置には、親水性領域と撥水性領域のパターンによって形成された液滴形成部が形成されており、前記各開口は、前記液滴形成部と同じまたは前記液滴形成部より小さな径で形成されることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明にかかる液滴形成器具は、上記の発明において、前記各開口の径は、０．０５ｍｍから５ｍｍの範囲で形成されることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明にかかる液滴形成器具は、上記の発明において、前記各開口が形成され、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成部材と、前記注入口が形成され、前記液滴形成部材を介して前記核酸増幅用溶液を前記基板の各液滴形成位置に分注する分注細管部材とに分離可能に構成されることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明にかかる液滴形成器具は、上記の発明において、前記液滴形成部材は、シリコンゴム、フッ素ゴムまたはアクリルゴムで形成されることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明にかかる液滴形成方法は、核酸分析の増幅工程で用いられる基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成器具であって、前記基板を連結したときに前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、前記核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具を用いた液滴形成方法であって、前記液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、を含むことを特徴とする。
【００１５】
また、本発明にかかる液滴形成方法は、上記の発明において、前記液滴形成工程の後、前記注入口からオイルを注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に形成された前記核酸増幅用溶液の液滴を前記オイルで被膜する被膜形成工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、核酸分析の増幅工程で用いられる基板上の複数の液滴形成位置にそれぞれ検体を分注する検体分注工程と、前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、前記基板を前記液滴形成器具が連結された状態で増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、を含むことを特徴とする。
【００１７】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、前記検体分注工程は、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ同一の検体を分注することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、核酸分析の増幅工程で用いられる基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、検体および核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、前記注入口から前記検体を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記検体の液滴を形成するとともに、前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、前記基板を増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、を含むことを特徴とする。
【００１９】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、核酸分析の増幅工程で用いられる基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、検体と混合された核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、前記注入口から前記検体と混合された核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記検体と混合された核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、前記基板を増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、を含むことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、前記液滴形成器具は、前記各開口が形成され、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成部材と、前記注入口が形成され、前記液滴形成部材を介して前記核酸増幅用溶液、前記検体または前記検体と混合された核酸増幅用溶液を前記基板の各液滴形成位置に分注する分注細管部材とに分離可能に構成されており、前記液滴形成工程の後、前記液滴形成部材から前記分注細管部材を分離する分離工程を含み、前記増幅工程では、前記基板を前記液滴形成部材が連結された状態で増幅装置に設置することを特徴とする。
【００２１】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、前記液滴形成工程の後であって前記分離工程の前に、前記注入口からオイルを注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に形成された液滴を前記オイルで被膜する被膜形成工程を含むことを特徴とする。
【００２２】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、前記分離工程の後、前記分注細管部材が分離された前記液滴形成部材の分離面を密封する密封工程を含むことを特徴とする。
【００２３】
また、本発明にかかる核酸増幅方法は、上記の発明において、核酸分析の増幅工程で用いられる基板上の複数の液滴形成位置にそれぞれ検体を分注する検体分注工程と、前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、前記注入口からオイルを注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に形成された前記核酸増幅用溶液の液滴を前記オイルで被膜する被膜形成工程と、前記基板から前記液滴形成器具を取り外す取外工程と、前記基板を増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、注入口から核酸増幅用溶液を注入することによって基板の各液滴形成位置と対応する位置に形成された各開口に核酸増幅用溶液を供給し、基板の各液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成することができる。またこのとき、基板を気密に連結した状態で各開口に核酸増幅用溶液を供給し、基板の各液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成することができるので、隣接する液滴形成位置にそれぞれ分注された核酸増幅用溶液が混合してしまうといった事態を防止できる。したがって、基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を同時かつ確実に形成することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、図面を参照し、本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、この実施の形態によって本発明が限定されるものではない。
【００２６】
（実施の形態）
図１は、本実施の形態における液滴形成器具１の構成を説明する模式図である。この液滴形成器具１は、分注細管部材１１と、液滴形成部材１３とを備え、基板３の上面に着脱自在に取り付けられて基板３上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成する。また、液滴形成器具１は、蓋部材１５を備えている。この蓋部材１５は、分注細管部材１１および液滴形成部材１３を用いて核酸増幅用溶液の液滴を形成した後の増幅処理時に用いられるものであり、図１では破線で示している。ここで、基板３は、大きさが約７５０×２５０ｍｍのスライドガラスで構成され、その上面の複数の液滴形成位置に液滴形成部である複数のスポット３１が配列されて形成される。各スポット３１は、１．５ｍｍ〜２．０ｍｍ程度の径を有し、例えば親水−撥水パターンによって形成される。図２は、基板３上面のスポット３１の構成を説明する図である。図２に示すように、基板３上面には、親水性領域３３１，３３５と撥水性領域３３３，３３７とが交互に形成されており、核酸増幅用溶液Ｌ１が供給される親水性領域３３１および核酸増幅用溶液Ｌ１を被膜するオイルＬ３が供給される親水性領域３３５と、これら親水性領域３３１，３３５の間に介在する撥水性領域３３３とによってスポット３１が形成される。
【００２７】
分注細管部材１１は、図１に示すように、上面に注入口１１１が形成され、下面に複数の分注口１１３が形成されて構成されている。この分注細管部材１１は、例えばガラス基板やプラスチック基板等で形成される。ガラス基板は、公知のガラス材料を用いて形成することができる。また、プラスチック基板の材料としては、例えばポリプロピレンやアクリル、ポリカーボネート等を用いることができる。
【００２８】
注入口１１１には、例えばシリンジが接続され、このシリンジによって核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３が順次注入される。図３は、注入口１１１に接続されるシリンジ５の構成を説明する図である。図３に示すように、シリンジ５は、先端に吐出口５２が設けられ、内部に核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３が充填されたシリンダ５１と、シリンダ５１の後端にスライド自在に挿入されるピストン５３とで構成される。シリンダ５１先端の吐出口５２は、分注細管部材１１の注入口１１１と接続され、ピストン５３を押圧することによって注入口１１１から核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３が注入される。ここで、核酸増幅用溶液Ｌ１は、例えばプライマーや核酸の伸長反応のための基質であるｄＮＴＰ、増幅用酵素、酵素を活性化させるためのマグネシウム塩等を緩衝液中に添加したものである。また、シリンジ５内に充填されるオイルＬ３は、実際に注入口１１１から注入する量よりも多く充填される。これは、核酸増幅用溶液Ｌ１やオイルＬ３を各分注口１１３に押し出して所定量ずつ分注し、基板３上の各スポット３１にこれらを供給するためであり、シリンダ５１にはオイルＬ３の注入量を規定するための注入量マーカＭＫが付されている。このシリンジ５によって核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３を注入する際には、シリンダ５１内に残存するオイルＬ３の上面が注入量マーカＭＫの位置と一致するまでピストン５３を押圧して核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３を順次注入する。
【００２９】
一方、分注細管部材１１の下面に形成された各分注口１１３は、この基板３上面の各スポット３１と対応する位置にそれぞれ形成される。図４は、分注細管部材１１の内部構成を説明する図である。また、図５は、分注細管部材１１の側面図である。図４に示すように、分注細管部材１１の内部には、注入口１１１と各分注口１１３との間をそれぞれ接続する流路１１２が形成されている。この流路１１２は、注入口１１１と各分注口１１３との間の流路長がそれぞれ等しくなるように、段階的に分流されて形成される。これにより、図５に示すように、各分注口１１３からそれぞれほぼ同量の液体Ｌ（具体的には核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３）を分注することが可能である。
【００３０】
液滴形成部材１３は、基板３とほぼ同様の大きさに形成された平面部１３１と、この平面部１３１の下面に一体形成された複数の筒状部１３３とを備える。この液滴形成部材１３の材料としては、基板３を気密状態で着脱自在に連結可能であり、耐熱性や耐油性を有する例えばシリコンゴムやフッ素ゴム、アクリルゴム等を用いることができる。図６は、液滴形成部材１３の側面図であり、図７は液滴形成部材１３の下面図である。図６に示すように、平面部１３１には、上下方向に貫通する複数の貫通孔１３２が形成されている。各貫通孔１３２は、基板３上面の各スポット３１と対向する位置に形成され、スポット３１と同程度の径を有する。一方、図７に示すように、各筒状部１３３は、その内径が貫通孔１３２と同程度の径に形成され、それぞれ各貫通孔１３２の下端開口に設けられる。液滴形成部材１３は、この貫通孔１３２および筒状部１３３によって分注細管部材１１の各分注口１１３から同量ずつ分注された核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３を案内し、隣接するスポット３１間が仕切られた状態で基板３上面の各スポット３１に液滴を形成する。
【００３１】
蓋部材１５は、液滴形成部材１３の平面部１３１上面に形成された各貫通孔１３２の上端開口を密封するためのものであり、分注細管部材１１の注入口１１１から核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３を注入して基板３上面の各スポット３１に分注した後、分注細管部材１１を分離した液滴形成部材１３の平面部１３１上面に装着される。例えば、基板３上面の全域を被覆可能なサイズに形成され、平面部１３１上面をシールするシール部材で形成される。あるいは、液滴形成部材１３の平面部１３１上面に装着されたときに、各貫通孔１３２の上端開口とそれぞれ対向する位置に、この貫通孔１３２の上端開口と嵌合する凸部が形成された板状の部材を蓋部材１５としてもよい。材料としては、例えばシリコンゴムやフッ素ゴム、アクリルゴムといった液滴形成部と同一の材料を用いることができる。
【００３２】
次に、液滴形成器具１を用いた核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３の分注手順について、図８〜図１１を参照して説明する。なお、液滴形成器具１を用いた核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３の分注に先立って、基板３上面の各スポット３１に、例えば血液検体から作成したＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料等の核酸試料を所定量ずつ分注し、乾燥させてはり付けておく。各スポット３１に分注する核酸試料は、同一の検体から作成したものであってもよいし、異なる検体から作成したものであってもよい。
【００３３】
先ず、図８に示すように、基板３上面に液滴形成部材１３を対向配置し、各筒状部１３３の下端開口と基板３上面の各スポット３１との間がそれぞれ連通するようにこれらを連結するとともに、液滴形成部材１３の平面部１３１上面に分注細管部材１１を対向配置し、各貫通孔１３２の上端開口と分注細管部材１１下面の各分注口１１３との間がそれぞれ連通するようにこれらを連結する。また、分注細管部材１１の注入口１１１に、図３に示して説明したように核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３が充填されたシリンジ５を接続する。
【００３４】
続いて、シリンジ５のピストン５３を押圧し、図９に示すように、分注細管部材１１の注入口１１１から先ず核酸増幅用溶液Ｌ１を注入する。これにより、注入された核酸増幅用溶液Ｌ１が分注細管部材１１によって各分注口１１３から所定量ずつ分注され、分注された核酸増幅用溶液Ｌ１が液滴形成部材１３の平面部１３１に形成された各貫通孔１３２およびこの貫通孔１３２の下端開口と連通する筒状部１３３に案内されて基板３上面の各スポット３１に液滴を形成する。続いて、図１０に示すように、注入口１１１からオイルＬ３を注入する。これにより、注入されたオイルＬ３が分注細管部材１１によって各分注口１１３から所定量ずつ分注され、分注されたオイルＬ３が液滴形成部材１３を構成する貫通孔１３２および筒状部１３３によって案内されて基板３上面の各スポット３１に形成された核酸増幅用溶液Ｌ１の液滴を被膜する。
【００３５】
そして、図１１に示すように、液滴形成部材１３の平面部１３１上面の分注細管部材１１を分離するとともに、蓋部材１５を装着して平面部１３１上面に露出した貫通孔１３２の上端開口を密封し、増幅装置であるＰＣＲ増幅装置に設置して増幅処理を行う。ここで、ＰＣＲ増幅装置は、ＰＣＲ法による核酸試料の増幅を行う装置であり、例えば基板３上の温度制御が可能なスライドサイクラー等を用いることができる。ＰＣＲ法は、核酸試料中に含まれるＤＮＡやＲＮＡのうち、所定の塩基配列を有するＤＮＡやＲＮＡの一部（特定部分）を繰り返し合成・増幅する手法であり、高温下での熱変性と低温下でのアニーリングを繰り返し行うことによって、核酸中の特定部分を合成・増幅させる。
【００３６】
増幅処理後、液滴形成部材１３は廃棄され、分注細管部材１１は洗浄されて再利用される。このとき、再利用時に異なる組成の核酸増幅用溶液を用いる場合等、必要に応じてオートクレーブ滅菌（高温高圧蒸気滅菌）による消毒を行うこととしてもよい。
【００３７】
（実験例１）
事前に、核酸試料として、６人の被検者からそれぞれ採取した２ｎｇの血液検体をもとに２ｎｇ／ｕｌのＤＮＡ試料を作成する。また、核酸増幅用溶液を、例えば次のようにして調整する。すなわち、一の塩基配列を有する第１のプライマーおよび一の塩基配列とは異なる他の塩基配列を有する第２のプライマーを、それぞれその濃度が０．２５Ｍとなるように、ｄＮＴＰの濃度が０．２ｍＭとなるように緩衝液と混合し、混合溶液を５０ｕｌ作成する。そして、この混合溶液に例えばＴａｑポリメラーゼを１．２５ｕｎｉｔｓ添加して核酸増幅用溶液を調整する。
【００３８】
先ず、基板３上の各スポット３１にＤＮＡ試料を１ｕｌずつ手作業で分注する。続いて、この基板３を例えば３７℃に温度制御されたＰＣＲ増幅装置に設置し、ＤＮＡ試料を乾燥させる。なお、室温で乾燥させることとしても構わない。ＤＮＡ試料を乾燥させたならば、基板３上面に液滴形成部材１３を連結するとともに、液滴形成部材１３の平面部１３１上面に分注細管部材１１を連結し、核酸増幅用溶液およびオイルを順番に分注して基板３上面の各スポット３１に核酸増幅用溶液の液滴を形成してオイルで被膜する。そして、ＰＣＲ増幅装置に設置して基板３上面の各スポット３１上に貼り付けられたＤＮＡ試料の増幅処理を行う。このＰＣＲ増幅の反応条件は、例えば、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で３０秒間を１サイクルとして３０サイクル行う。
【００３９】
そして、増幅処理を終えた基板３上面の各スポット３１のＤＮＡ増幅液を被検体毎に回収し、得られた６人の被検体毎のＤＮＡ増幅液をマーカー試料とともに電気泳動させ、ＤＮＡをサイズ毎に分離することによってＤＮＡ増幅液を分析する。図１２は、分析結果を示す図である。図１２に示す分析結果では、各被検体のバンドＢ１１〜Ｂ１６は、それぞれマーカーＭ１０の２００（ｂｐ）のバンド位置に近傍に分離されている。
【００４０】
（実験例２）
事前に、核酸試料として、ある被検者から採取した血液検体をもとに、２ｎｇ／ｕｌのＤＮＡ試料を基板３上での増幅用と従来のマイクロチューブ内での増幅用にそれぞれ作成する。また、核酸増幅用溶液についても同様に、実験例１と同様にして基板３上での増幅用と従来のマイクロチューブ内での増幅用にそれぞれ調整する。
【００４１】
そして、基板３上の各スポット３１に基板３上での増幅用に作成したＤＮＡ試料を分注して貼り付け、液滴形成器具１を用いて各スポット３１に基板３上での増幅用に作成した核酸増幅用溶液の液滴を形成し、ＰＣＲ増幅装置に設置して増幅処理を行う。また、従来のマイクロチューブに、このマイクロチューブ内での増幅用に作成したＤＮＡ試料および核酸増幅用溶液を収容して混合し、このマイクロチューブを設置可能な例えばサーマルサイクラー等のＰＣＲ増幅装置に設置して増幅処理する。増幅処理は同一の反応条件で行い、例えば、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で３０秒間を１サイクルとして３０サイクル行う。
【００４２】
そして、増幅処理を終えた基板３上面の各スポット３１のＤＮＡ増幅液を回収し、得られたＤＮＡ増幅液およびマイクロチューブ内のＤＮＡ増幅液をマーカー試料とともに電気泳動させ、ＤＮＡをサイズ毎に分離することによってＤＮＡ増幅液を分析する。図１３は、分析結果を示す図である。図１３に示す分析結果では、各ＤＮＡ増幅液のバンドＢ２１，Ｂ２３は、マーカーＭ２０に対してそれぞれほぼ同一のバンド位置に分離されているが、マイクロチューブ内のＤＮＡ増幅液のバンドＢ２３はその濃さ（太さ）にムラがある。これに対し、基板３上で増幅させたＤＮＡ増幅液のバンドＢ２１はその濃さ（太さ）が均一に得られ、複数のスポット３１に分散させて増幅処理を行った場合の方が、１つのマイクロチューブ内で増幅処理を行った場合よりも濃くはっきりとバンドが検出される。
【００４３】
以上説明したように、本実施の形態によれば、分注細管部材１１によって各分注口１１３から核酸増幅用溶液を同量ずつ分注するとともに、核酸増幅用溶液を液滴形成部材１３によって基板３上面の各スポット３１に供給し、その液滴を形成することができる。またこのとき、液滴形成部材１３は基板３を気密状態で連結しており、基板３上面の隣接するスポット３１間が仕切られた状態で核酸増幅用溶液を供給することができるので、隣接するスポット３１間でのコンタミネーションを防止できる。したがって、基板３上面の複数のスポット３１に核酸増幅用溶液の液滴を同時かつ確実に形成することができ、核酸試料が微量であっても増幅処理が可能である。また、基板３としてスライドガラスを加工して用いることができるので、核酸試料として細胞等を用いる場合には、顕微鏡下で細胞の観察を行いながら各スポット３１に核酸試料を確実に固定することが可能である。
【００４４】
なお、上記した実施の形態では、分注細管部材１１の内部に段階的に分流された流路が形成される場合について説明したが、注入口と各分注口との間をそれぞれ個別に接続する流路を形成することとしてもよい。例えば、分注口および流路を、注入口との距離が遠い分注口およびこの分注口までの流路ほど大きい径で形成することとしてもよい。このとき、各分注口およびこの分注口までの流路の径を、０．０５ｍｍ〜５ｍｍの範囲で形成すると好ましい。このように構成した場合も上記した実施の形態と同様に、各分注口からそれぞれほぼ同量の核酸増幅用溶液およびオイルを分注することができる。
【００４５】
また、液滴形成部材１３の構成は、上記した実施の形態の構成に限定されるものではない。図１４は、液滴形成部材１３の構成の変形例を示す図である。図１４に示すように、液滴形成部材１４を板状の部材で形成し、基板３上の各スポット３１の位置と対する位置に貫通孔１４１を形成した構成としてもよい。
【００４６】
また、上記した実施の形態では、基板３上面の各スポット３１に核酸増幅用溶液の液滴を形成し、この液滴をオイルで被膜した後、分注細管部材１１を分離して蓋部材１５を装着し、ＰＣＲ増幅装置に設置して増幅処理を行う場合について説明したが、分注細管部材１１だけでなく液滴形成部材１３も取り外し、基板３のみをＰＣＲ増幅装置に設置する構成としてもよい。
【００４７】
また、基板３上面の各スポット３１に形成した核酸増幅用溶液の液滴をオイルで被膜することとしたが、オイルによる被膜を行わないこととしてもよい。この場合には、基板３上面の各スポット３１に核酸増幅用溶液を分注して基板３上面の各スポット３１に液滴を形成した後、分注細管部材１１を分離して蓋部材１５を装着し、ＰＣＲ増幅装置に設置して増幅処理を行う。
【００４８】
また、上記した実施の形態では、分注細管部材１１の上面の１箇所に注入口１１１を設けた場合について説明したが、注入口を複数個所設ける構成としてもよい。この場合には、分注細管部材の下面に形成された各分注口がいずれかの注入口と接続されるように、分注細管部材の内部に流路を形成する。そして、各注入口にシリンジを接続して各分注口にそれぞれ核酸増幅用溶液やオイルを分注する。
【００４９】
また、基板３上面の各スポット３１に分注する検体は、それぞれ異なる被検体から採取した検体であってもよい。また、各スポット３１に予め別のプライマーを分注し、乾燥させてはり付けておくこととしてもよい。この場合には、核酸増幅用溶液としてプライマーを含有しない溶液を調整し、液滴形成器具１によって基板３上面の各スポット３１に分注すればよい。また、基板３上面の各スポット３１で同一のＤＮＡ試料についてＰＣＲ増幅を行う場合には、ＤＮＡ試料を核酸増幅用溶液と混合し、この混合溶液を液滴形成器具１を用いて基板３上面の各スポット３１に分注することも可能である。この場合には、ＤＮＡ試料を基板３上面の各スポット３１に予め分注しておく必要がない。
【００５０】
また、上記した実施の形態では、液滴形成器具１を用いた核酸増幅用溶液Ｌ１およびオイルＬ３の分注に先立って、予め基板３上面の各スポット３１に検体（ＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料等の核酸試料）を分注しておく場合について説明したが、検体についても液滴形成器具１を用いて分注してもよい。例えば、液滴形成器具１を用いて基板３上面の各スポット３１に先ず検体を分注し、次いで、液滴形成器具１を用いて各スポット３１に核酸増幅用溶液を分注することとしてもよい。この場合、ＤＮＡ試料を基板３上面の各スポット３１に予め分注しておく必要がない。なおこのとき、検体の分注および核酸増幅用溶液の分注に同一の液滴形成器具１を用いてもよいし、検体を分注した後で液滴形成器具１を別の液滴形成器具１と取り替えて用いることとしてもよい。
【００５１】
また、上記した実施の形態では、基板３に液滴形成部材１３と分注細管部材１１とを装着して基板３上の各スポット３１に液滴を形成することとしたが、これらを一体的に形成して液滴形成器具を構成してもよい。また、液滴形成器具を分注細管部材のみで構成してもよい。この場合には、分注細管部材１１の各分注口１１３と基板３上面の各スポット３１との間が連通するようにこれらを連結し、核酸増幅用溶液の分注・液滴の形成を行う。あるいは、分注細管部材１１の各分注口１１３と基板３上面の各スポット３１との間が連通するようにこれらを連結した後、先ず検体の分注・液滴の形成を行い、次いで核酸増幅用溶液の分注・液滴の形成を行う。この後、オイルの分注を必要に応じて行い、各スポット３１の液滴を被膜する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】液滴形成器具の構成を説明する模式図である。
【図２】基板上面のスポットの構成を説明する図である。
【図３】注入口に接続されるシリンジの構成を説明する図である。
【図４】分注細管部材の内部構成を説明する図である。
【図５】分注細管部材の側面図である。
【図６】液滴形成部材の側面図である。
【図７】液滴形成部材の下面図である。
【図８】液滴形成器具を用いた核酸増幅用溶液およびオイルの分注手順を説明する図である。
【図９】液滴形成器具を用いた核酸増幅用溶液およびオイルの分注手順を説明する図である。
【図１０】液滴形成器具を用いた核酸増幅用溶液およびオイルの分注手順を説明する図である。
【図１１】液滴形成器具を用いた核酸増幅用溶液およびオイルの分注手順を説明する図である。
【図１２】実験例１の分析結果を示す図である。
【図１３】実験例２の分析結果を示す図である。
【図１４】液滴形成部材の構成の変形例を示す図である。
【符号の説明】
【００５３】
１ 液滴形成器具
１１ 分注細管部材
１１１ 注入口
１１３ 分注口
１３ 液滴形成部材
１３１ 平面部
１３３ 筒状部
１５ 蓋部材
３ 基板
３１ スポット
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分析の増幅工程で用いられる基板を気密状態で着脱自在に連結し、前記基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成器具であって、
前記基板を連結したときに前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、前記核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成されることを特徴とする液滴形成器具。
【請求項２】
前記流路は同一径で形成され、前記注入口と前記各開口との間の流路長がそれぞれ等しくなるように形成されることを特徴とする請求項１に記載の液滴形成器具。
【請求項３】
前記流路は、前記注入口から注入される前記核酸増幅用溶液が前記各開口に同量ずつ供給されるように、前記注入口と開口との間の流路長に応じた径で形成されることを特徴とする請求項１に記載の液滴形成器具。
【請求項４】
前記基板の各液滴形成位置には、親水性領域と撥水性領域のパターンによって形成された液滴形成部が形成されており、
前記各開口は、前記液滴形成部と同じまたは前記液滴形成部より小さな径で形成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の液滴形成器具。
【請求項５】
前記各開口の径は、０．０５ｍｍから５ｍｍの範囲で形成されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の液滴形成器具。
【請求項６】
前記各開口が形成され、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成部材と、前記注入口が形成され、前記液滴形成部材を介して前記核酸増幅用溶液を前記基板の各液滴形成位置に分注する分注細管部材とに分離可能に構成されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の液滴形成器具。
【請求項７】
前記液滴形成部材は、シリコンゴム、フッ素ゴムまたはアクリルゴムで形成されることを特徴とする請求項６に記載の液滴形成器具。
【請求項８】
核酸分析の増幅工程で用いられる基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成器具であって、前記基板を連結したときに前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、前記核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具を用いた液滴形成方法であって、
前記液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、
前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、
を含むことを特徴とする液滴形成方法。
【請求項９】
前記液滴形成工程の後、前記注入口からオイルを注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に形成された前記核酸増幅用溶液の液滴を前記オイルで被膜する被膜形成工程を含むことを特徴とする請求項８に記載の液滴形成方法。
【請求項１０】
核酸分析の増幅工程で用いられる基板上の複数の液滴形成位置にそれぞれ検体を分注する検体分注工程と、
前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、
前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、
前記基板を前記液滴形成器具が連結された状態で増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、
を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項１１】
前記検体分注工程は、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ同一の検体を分注することを特徴とする請求項１０に記載の核酸増幅方法。
【請求項１２】
核酸分析の増幅工程で用いられる基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、検体および核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、
前記注入口から前記検体を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記検体の液滴を形成するとともに、前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、
前記基板を増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、
を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項１３】
核酸分析の増幅工程で用いられる基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、検体と混合された核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、
前記注入口から前記検体と混合された核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記検体と混合された核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、
前記基板を増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、
を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項１４】
前記液滴形成器具は、前記各開口が形成され、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成部材と、前記注入口が形成され、前記液滴形成部材を介して前記核酸増幅用溶液、前記検体または前記検体と混合された核酸増幅用溶液を前記基板の各液滴形成位置に分注する分注細管部材とに分離可能に構成されており、
前記液滴形成工程の後、前記液滴形成部材から前記分注細管部材を分離する分離工程を含み、
前記増幅工程では、前記基板を前記液滴形成部材が連結された状態で増幅装置に設置することを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか一つに記載の核酸増幅方法。
【請求項１５】
前記液滴形成工程の後であって前記分離工程の前に、前記注入口からオイルを注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に形成された液滴を前記オイルで被膜する被膜形成工程を含むことを特徴とする請求項１４に記載の核酸増幅方法。
【請求項１６】
前記分離工程の後、前記分注細管部材が分離された前記液滴形成部材の分離面を密封する密封工程を含むことを特徴とする請求項１４または１５に記載の核酸増幅方法。
【請求項１７】
核酸分析の増幅工程で用いられる基板上の複数の液滴形成位置にそれぞれ検体を分注する検体分注工程と、
前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、
前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、
前記注入口からオイルを注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に形成された前記核酸増幅用溶液の液滴を前記オイルで被膜する被膜形成工程と、
前記基板から前記液滴形成器具を取り外す取外工程と、
前記基板を増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、
を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項１】
核酸分析の増幅工程で用いられる基板を気密状態で着脱自在に連結し、前記基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成器具であって、
前記基板を連結したときに前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、前記核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成されることを特徴とする液滴形成器具。
【請求項２】
前記流路は同一径で形成され、前記注入口と前記各開口との間の流路長がそれぞれ等しくなるように形成されることを特徴とする請求項１に記載の液滴形成器具。
【請求項３】
前記流路は、前記注入口から注入される前記核酸増幅用溶液が前記各開口に同量ずつ供給されるように、前記注入口と開口との間の流路長に応じた径で形成されることを特徴とする請求項１に記載の液滴形成器具。
【請求項４】
前記基板の各液滴形成位置には、親水性領域と撥水性領域のパターンによって形成された液滴形成部が形成されており、
前記各開口は、前記液滴形成部と同じまたは前記液滴形成部より小さな径で形成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の液滴形成器具。
【請求項５】
前記各開口の径は、０．０５ｍｍから５ｍｍの範囲で形成されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の液滴形成器具。
【請求項６】
前記各開口が形成され、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成部材と、前記注入口が形成され、前記液滴形成部材を介して前記核酸増幅用溶液を前記基板の各液滴形成位置に分注する分注細管部材とに分離可能に構成されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の液滴形成器具。
【請求項７】
前記液滴形成部材は、シリコンゴム、フッ素ゴムまたはアクリルゴムで形成されることを特徴とする請求項６に記載の液滴形成器具。
【請求項８】
核酸分析の増幅工程で用いられる基板上の複数の液滴形成位置に核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成器具であって、前記基板を連結したときに前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、前記核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具を用いた液滴形成方法であって、
前記液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、
前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、
を含むことを特徴とする液滴形成方法。
【請求項９】
前記液滴形成工程の後、前記注入口からオイルを注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に形成された前記核酸増幅用溶液の液滴を前記オイルで被膜する被膜形成工程を含むことを特徴とする請求項８に記載の液滴形成方法。
【請求項１０】
核酸分析の増幅工程で用いられる基板上の複数の液滴形成位置にそれぞれ検体を分注する検体分注工程と、
前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、
前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、
前記基板を前記液滴形成器具が連結された状態で増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、
を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項１１】
前記検体分注工程は、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ同一の検体を分注することを特徴とする請求項１０に記載の核酸増幅方法。
【請求項１２】
核酸分析の増幅工程で用いられる基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、検体および核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、
前記注入口から前記検体を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記検体の液滴を形成するとともに、前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、
前記基板を増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、
を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項１３】
核酸分析の増幅工程で用いられる基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、検体と混合された核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、
前記注入口から前記検体と混合された核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記検体と混合された核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、
前記基板を増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、
を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項１４】
前記液滴形成器具は、前記各開口が形成され、前記基板の各液滴形成位置に前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成部材と、前記注入口が形成され、前記液滴形成部材を介して前記核酸増幅用溶液、前記検体または前記検体と混合された核酸増幅用溶液を前記基板の各液滴形成位置に分注する分注細管部材とに分離可能に構成されており、
前記液滴形成工程の後、前記液滴形成部材から前記分注細管部材を分離する分離工程を含み、
前記増幅工程では、前記基板を前記液滴形成部材が連結された状態で増幅装置に設置することを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか一つに記載の核酸増幅方法。
【請求項１５】
前記液滴形成工程の後であって前記分離工程の前に、前記注入口からオイルを注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に形成された液滴を前記オイルで被膜する被膜形成工程を含むことを特徴とする請求項１４に記載の核酸増幅方法。
【請求項１６】
前記分離工程の後、前記分注細管部材が分離された前記液滴形成部材の分離面を密封する密封工程を含むことを特徴とする請求項１４または１５に記載の核酸増幅方法。
【請求項１７】
核酸分析の増幅工程で用いられる基板上の複数の液滴形成位置にそれぞれ検体を分注する検体分注工程と、
前記基板の各液滴形成位置と対応する位置に開口が形成されるとともに、核酸増幅用溶液を注入する注入口が形成され、内部に前記各開口と前記注入口との間を接続する流路が形成された液滴形成器具に前記基板を気密状態で連結し、前記各開口と前記基板の各液滴形成位置との間を連通させる連結工程と、
前記注入口から前記核酸増幅用溶液を注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置にそれぞれ前記核酸増幅用溶液の液滴を形成する液滴形成工程と、
前記注入口からオイルを注入して前記各開口に供給し、前記基板の各液滴形成位置に形成された前記核酸増幅用溶液の液滴を前記オイルで被膜する被膜形成工程と、
前記基板から前記液滴形成器具を取り外す取外工程と、
前記基板を増幅装置に設置し、前記基板の各液滴形成位置の検体を増幅処理する増幅工程と、
を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００９−１３６２１９（Ｐ２００９−１３６２１９Ａ）
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１６３１２（Ｐ２００７−３１６３１２）
【出願日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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