測定装置
【課題】試料液を流通させる微小流路を備えたセンサチップを用いて光学的測定を行う測定装置において、溶血を生じずに全血から簡単に血球を除去してセンサ部に供給可能とする。
【解決手段】流路部材１２内に試料液を流通させる微小流路１１が設けられ、この微小流路１１内の一部にセンサ部１４が配設されてなるセンサチップ１０を用いて、試料液中に含まれ得る被検出物質に関する測定を行う測定装置において、流路部材１２に、センサ部１４よりも流路上流側において、流路壁が凹んだ状態とされた凹部１１ａを設けるとともに、この凹部１１ａの底と対向する位置に圧電素子４０を配し、圧電素子４０の超音波照射面と凹部１１ａの底との間で定在超音波Ｓを発生させ、試料液中の血球Ｈを定在超音波Ｓの節の部分に集積する。
【解決手段】流路部材１２内に試料液を流通させる微小流路１１が設けられ、この微小流路１１内の一部にセンサ部１４が配設されてなるセンサチップ１０を用いて、試料液中に含まれ得る被検出物質に関する測定を行う測定装置において、流路部材１２に、センサ部１４よりも流路上流側において、流路壁が凹んだ状態とされた凹部１１ａを設けるとともに、この凹部１１ａの底と対向する位置に圧電素子４０を配し、圧電素子４０の超音波照射面と凹部１１ａの底との間で定在超音波Ｓを発生させ、試料液中の血球Ｈを定在超音波Ｓの節の部分に集積する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料液中に含まれる可能性が有る被検出物質について測定を行う装置、特に詳細には、試料液を流通させる微小流路を備えたセンサチップを用いて光学的測定を行う測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定においては、抗原抗体反応などの生体分子反応を検出することにより、被検出物質である抗原（あるいは抗体）などの存在の有無、量を測定している。
【０００３】
例えば、互いに特異的に結合する２つの物質の一方（抗原、抗体、各種酵素、受容体など）を基板上に固定化し、他方の物質（これは被検出物質そのものであってもよいし、あるいは試料中で被検出物質と競合する競合物質であってもよい）を基板上に固定された固定層に結合させ、この結合反応を検出することにより、試料中における被検出物質の有無、量を測定することができる。具体的には、試料に含まれる被検出物質である抗原を検出するため、基板上にその抗原と特異的に結合する抗体を固定しておき、基板上に試料を供給することにより抗体に抗原を特異的に結合させ、次いで、抗原と特異的に結合する、標識が付与された標識抗体を添加し、抗原と結合させることにより、抗体―抗原―標識抗体の、所謂サンドイッチを形成し、標識からの信号を検出するサンドイッチ法や、標識された競合抗原を被検出物質である抗原と競合的に固定化抗体と結合させ、固定化抗体と結合した競合抗原に付与されている標識からの信号を検出する競合法などのイムノアッセイが知られている。
【０００４】
なお上記サンドイッチ法においては、被検出物質である抗原が上記「他方の物質」に相当し、競合法においては競合抗原が上記「他方の物質」に相当する。後者の競合法においては、固定化抗体と結合した競合抗原の量が多いほど、被検出物質である抗原の量が少ないという関係があるので、この関係に基づいて、競合抗原の量に対応する標識からの信号レベルにより抗原の量を求めることができる。
【０００５】
また、上述のようなバイオ測定に適用可能で、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識されて被検出物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち被検出物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００６】
以上述べたような光学的手法を用いるバイオ測定においては測定時間の短縮化が望まれており、そこで、センサ部における反応を効率良く生じさせて、測定時間の短縮を図る方法が種々提案されている。例えば特許文献１には、微小流路（マイクロ流路）型のセンサチップを用い、試料液を一定の高速で流下させることにより測定の高速化を図ることが提案されている。この種のセンサチップは、上述した蛍光検出による被検出物質の検出や定量分析を行うために適用することも可能である。
【０００７】
さらに、このような蛍光検出法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献２等に提案されている。この方法は、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを用い、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の入射角で励起光を入射させ、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって蛍光を増強させることにより、Ｓ／Ｎを向上させるものである。
【０００８】
ところで、上記のようなバイオ測定に供される試料液の代表的なものとして、人血等の血液が挙げられるが、流路を備えたセンサチップを用いる測定装置は、血液中に含まれ得る被検出物質の検出や定量分析にも適用可能とされている。このように、血液を対象として光学的手法により各種測定を行う場合は、血液中に血球が存在すると、その血球が励起光や被検出光を散乱あるいは吸収するので、測定の感度や精度が損なわれる。また、免疫反応に関わる事象について測定を行う場合は、血球が免疫反応を阻害して、それにより測定の精度が損なわれることもある。そこで多くの場合は、全血から血球を除去した後の血漿を測定にかけるようにしている。したがって、上記のセンサチップを利用する際には、その流路中に設定されたセンサ部よりも流路上流側で、全血から血球を除去しておくことが求められる。
【０００９】
全血から血球を除去する方法としては、センサチップのセンサ部よりも流路上流側に血球分離フィルタを設けることが考えられるが、この場合には血球分離に時間がかかる、目詰まりを防止するためには真空ポンプによって流路に大きな吸引負圧を作用させる必要がある、フィルタが目詰まりして測定に供される血漿量が足りなくなる、といった問題が認められる。特に最後の問題は、いわゆるレート測定法によって測定を行う場合に発生すると、深刻な事態を招くことになる。すなわち、レート測定法とは、単位時間に対する反応量の変化量を測定するものであるが、上記のフィルタに目詰まりが生じてそれが時々刻々進行すると、流路中の血液の流速が次第に低下するために被検出物質が供給不足となって、正確な測定値を求めることが困難になるのである。
【００１０】
このような問題を生じない血球除去の手法として、例えば特許文献３には、流路を流れる全血に対して流れを横切る方向に進行超音波を当て、その放射圧によって血球を押圧することにより、血液を、血球を含むものと含まないもの（血漿）とに分離し、そうして分離された各血液を互いに分岐した別々の流路に導入することが記載されている。この構成によれば、血漿だけをセンサ部に供給することも可能と考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−１０１２２１号公報
【特許文献２】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献３】特開２００５−３１９４０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、特許文献３に示された血球除去の手法を、前述のセンサチップを用いて光学的測定を行う装置に適用した場合、進行超音波により血球が溶血（損傷）するおそれがある。血球の溶血が発生すると、血球内のタンパク質が検体に暴露されるために、その後の免疫アッセイや化学分析に影響を与えるおそれがある。
【００１３】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、試料液を流通させる微小流路を備えたセンサチップを用いて光学的測定を行う測定装置において、溶血を生じずに全血から簡単に血球を除去してセンサ部に供給可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明による測定装置は、流路部材内に試料液を流通させる微小流路が設けられ、この微小流路内の一部にセンサ部が配設されてなるセンサチップを用いて、試料液中に含まれ得る被検出物質に関する測定を行う測定装置において、流路部材のセンサ部よりも流路上流側において微小流路を横断する定在超音波を発生させる超音波照射手段と、定在超音波の節に集積された微小粒子を捕捉する粒子捕捉部とを備えていることを特徴とするものである。
【００１５】
本発明の測定装置においては、粒子捕捉部を、流路部材の流路壁の超音波被照射部（流路壁において超音波が照射される部分）に形成された凹部とするとともに、超音波照射手段を、定在超音波の節を凹部内に位置させるように超音波を照射するものとしてもよい。また、粒子捕捉部を、定在超音波の節の位置よりも流路下流側において微小粒子を捕捉する構造物としてもよい。
【００１６】
ここで、定在超音波が微小粒子に及ぼす力について説明する。この力は下記式のように表せられる。
【数１】
ただし、
Ｆ：捕捉力
ρ０：媒質の密度
ｃ０：媒質での音速
λ：超音波の波長
ｚ：位置座標（音波の伝搬方向の位置座標）
ｐ０：超音波の振幅（音圧）
【００１７】
ｚ＝０（すなわち節の位置）ではｓｉｎが０になるので定在超音波が微小粒子に及ぼす力はゼロになる。ｚ＝０を基準に正側は定在超音波が微小粒子に及ぼす力の方向が正側になり、負側ではこの力の方向が負側になり、両者ともに微小粒子をｚ＝０（すなわち節の位置）の位置に近づける方向に力が発生する。
【００１８】
また、ｚ＝λ／４（すなわち腹の位置）では定在超音波が微小粒子に及ぼす力がピークとなる。ｚ＝λ／４より大きい側は定在超音波が微小粒子に及ぼす力の方向が負側になり、小さい側はこの力の方向が正側になり、両者ともに微小粒子をｚ＝λ／４（すなわち腹の位置）の位置から遠ざける方向に力が発生する。
【００１９】
なお、ここで発生する力はｓｉｎ関数に比例するために、ｚ＝０ではゼロの力が、ｚ＝０から離れるに従い緩やかに大きくなる力が働く。
【００２０】
つまり、定在超音波の節（ｚ＝０）に集積された微小粒子の大きさがλ／４を超えると、微小粒子内に逆方向の力が同時に加えられることになり、物質損傷の可能性が表れる。
【００２１】
従って、微小粒子を損傷させずに定在超音波の節に集積させるためには、超音波照射手段が発生させる超音波の波長は、捕捉対象となる微小粒子の粒径の４倍以上とすることが好ましい。
【００２２】
また、微小流路の流路壁の超音波被照射部に、流路部材よりも超音波の反射率が高い超音波反射部材を設けることが好ましい。
【００２３】
また、微小流路の流路壁の超音波被照射部から定在超音波の節までの領域に、試料液と流路部材との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層を設けることが好ましい。
【００２４】
また、超音波照射手段は、微小流路の流路壁の一部を構成するように配置してもよく、その場合には、超音波照射手段の表面に、超音波照射手段と試料液との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層を設けてもよい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の測定装置においては、流路部材内に試料液を流通させる微小流路が設けられ、この微小流路内の一部にセンサ部が配設されてなるセンサチップを用いて、試料液中に含まれ得る被検出物質に関する測定を行う測定装置において、超音波照射手段により流路部材のセンサ部よりも流路上流側において微小流路を横断する定在超音波を発生させて、この定在超音波の節の部分に微小粒子を集積し、集積された微小粒子を粒子捕捉部で捕捉するようにしている。上述の通り、定在超音波の節の部分では、定在超音波が微小粒子に及ぼす力がゼロになるので、進行超音波で微小流路を集積する場合と比較して微小粒子の損傷を小さくすることができる。
【００２６】
そのため、特に全血から血球を除去する場合には、溶血を生じずに全血から簡単に血球を除去してセンサ部に供給できるため、検体等の他の物質に影響を及ぼすことがなくなり、免疫アッセイや化学分析を正確行うことが可能となる。
【００２７】
また、粒子捕捉部を、流路部材の流路壁の超音波被照射部に形成された凹部とするとともに、超音波照射手段を、定在超音波の節を凹部内に位置させるように超音波を照射するものとするか、粒子捕捉部を、定在超音波の節の位置よりも流路下流側において微小粒子を捕捉する構造物とすれば、簡単な構成で粒子捕捉部を構成することが可能となる。
【００２８】
また、超音波照射手段が発生させる超音波の波長を、捕捉対象となる微小粒子の粒径の４倍以上とすれば、より微小粒子の損傷を小さくすることができる。
【００２９】
また、微小流路の流路壁の超音波被照射部に、流路部材よりも超音波の反射率が高い超音波反射部材を設ければ、より確実に定在超音波を発生させることができる。
【００３０】
また、微小流路の流路壁の超音波被照射部から定在超音波の節までの領域に、試料液と流路部材との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層を設ければ、音響整合層の表面付近に微小粒子を保持できるようになるので、微小粒子の捕捉や回収を容易にすることができる。
【００３１】
また、超音波照射手段を、微小流路の流路壁の一部を構成するように配置してもよく、その場合に、超音波照射手段の表面に、超音波照射手段と試料液との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層を設ければ、超音波が試料液で反射することが抑えられるので、定在超音波を効率的に発生させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の第１実施形態による測定装置を示す概略側面図
【図２】上記測定装置に用いられるセンサチップの外形形状を示す斜視図
【図３】上記測定装置に用いられるセンサチップの要部を示す概略側面図
【図４】本発明の第２実施形態の測定装置におけるセンサチップの要部を示す概略側面図
【図５】本発明の第３実施形態の測定装置におけるセンサチップの要部を示す概略側面図
【図６】本発明の第４実施形態の測定装置におけるセンサチップの要部を示す概略側面図
【図７】本発明の第５実施形態の測定装置におけるセンサチップの要部を示す概略側面図
【図８】本発明の第６実施形態の測定装置におけるセンサチップの要部を示す概略側面図
【図９】上記測定装置におけるセンサチップの要部のその他の例を示す概略側面図
【図１０】本発明の第７実施形態による測定装置を示す概略側面図
【図１１】本発明の第８実施形態による測定装置を示す概略側面図
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。図１は、本発明の第１の実施形態による測定装置の概略構成を示すものである。本実施形態の測定装置は、先に述べた微小流路型センサチップ（以下、単にセンサチップという）１０を用いて生体由来物質を検出する装置として構成されたものである。まず図２および図３も参照して、このセンサチップ１０について説明する。
【００３４】
センサチップ１０は測定装置本体に対して着脱自在とされたものであり、図１および図２に示される通り、試料液が流される微小流路１１を有する流路部材１２と、微小流路１１の一部を構成して、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質１３を壁面に固定しているセンサ部１４と、流路部材１２の上に固着された上板部材１７とを備えている。なおセンサ部１４の上流側つまり図中の左側において流路部材１２には、微小流路１１から下方に凹んだ状態とされた凹部１１ａが形成されている。この凹部１１ａは後述するように、粒子捕捉部として機能するものである。
【００３５】
本実施形態では、抗原抗体反応においてサンドイッチ法によるアッセイを行う場合を例とし、そこで上記物質１３が、被検出物質である抗原Ａと特異的に結合する抗体であるとして説明する。なお、抗体１３は直接微小流路１１の壁面に固定されてもよいが、後述するように表面プラズモンによる電場増強により蛍光を増強する場合は、この壁面の上に金属薄膜が形成され、その上に抗体１３が固定される。
【００３６】
上記上板部材１７は、図２に示されるように、上表面に開口した試料液流入口１６ａおよび試料液流出口１６ｂと、試料液流入口１６ａと微小流路１１の上流端とを連通させる開口１５ａと、試料液流出口１６ｂと微小流路１１の下流端とを連通させる開口１５ｂとを有している。この上板部材１７と流路部材１２は、例えば超音波溶接により接合されている。
【００３７】
流路部材１２および上板部材１７はポリスチレン等の透明な誘電体材料からなり、射出成型によりそれぞれ成型されている。
【００３８】
また本例のセンサチップ１０においては、図３にも示すように、抗体１３が固定されている領域の上流側において微小流路１１の内面に、標識抗体２０が付着されている。標識抗体２０は、被検出物質に対して、前述の抗体１３とは異なるエピトープに特異的に結合する抗体２３と蛍光標識２２とから構成されたものである。ここでは蛍光標識２２として、多数の蛍光色素分子ｆと該蛍光色素分子ｆを内包する光透過材料２１とからなる蛍光微粒子が用いられている。
【００３９】
上記蛍光微粒子の大きさには特に制限はないが、直径数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度が好ましく、ここでは一例として直径１００ｎｍ程度のものが用いられている。光透過材料２１としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられるが、蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ該蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。本例における標識抗体２０は、蛍光標識２２を、それよりも小さい抗体２３により表面修飾して構成されている。
【００４０】
次に図１に戻って測定装置について説明する。この測定装置は、上記センサチップ１０が例えば屈折率マッチングオイルを介して載置されるプリズム３０と、微小流路１１の底面（センサチップ１０と試料液との界面）に対して、全反射条件となる入射角で励起光Ｌ0を入射させる半導体レーザ等からなる光源３１と、センサチップ１０の試料液流出口１６ｂにノズル３２を介して一端が連通される連通管３３と、この連通管３３の他端に吸込口が接続された試料吸引ポンプ３４と、連通管３３に介設された開放弁３５と、センサチップ１０のセンサ部１４の近傍部分から後述するようにして発せられる蛍光Ｌｆを検出する光検出器３６とを備えている。
【００４１】
さらにこの測定装置は、微小流路１１の前記凹部１１ａに対向するようにして流路部材１２の上方に配置された、超音波照射手段としての圧電素子（本例ではピエゾ素子）４０と、この圧電素子４０を励振させる駆動電圧を該圧電素子４０に印加するピエゾドライバ４１と、上記駆動電圧の波形を規定する波形信号を生成してピエゾドライバ４１に入力する波形発生器４２とを有している。なお超音波照射手段としては、ピエゾ素子に限らず、それ以外の圧電セラミック等を適用することも可能である。
【００４２】
この圧電素子４０から凹部１１ａの底（超音波被照射部）に向けて超音波が照射され、圧電素子４０の超音波照射面と凹部１１ａの底との間で定在超音波Ｓを発生させ、試料液中の微小粒子を定在超音波Ｓの節の部分に集積する。
【００４３】
この定在超音波Ｓの波長は、捕捉対象となる微小粒子の粒径の４倍以上とすることにより、より微小粒子の損傷を小さくすることができる。本実施形態においては、後述するように、全血Ｂ中の血球Ｈを集積することを想定している。血球Ｈの粒径は最大で２０μｍ程度あるため、定在超音波Ｓの波長は少なくとも８０μｍ以上とすることが好ましい。
【００４４】
本実施形態においては、圧電素子４０の超音波照射面と凹部１１ａの底との間の距離を７５０μｍ、発生させる定在超音波Ｓの周波数を１ＭＨｚ、波長を１５００μｍとする。
【００４５】
次に、この測定装置による被検出物質の検出について説明する。ここでは一例として、試料液としての血液（全血）Ｂに含まれる可能性のある抗原Ａを検出する場合について説明する。まず、図１に示す試料液流入口１６ａに全血Ｂが注入され、それとともに試料吸引ポンプ３４が駆動され、開放弁３５は連通管３３を開く状態に設定され、全血Ｂがセンサチップ１０の微小流路１１内に導入される。またこのとき、ピエゾドライバ４１により圧電素子４０が駆動され、微小流路１１を横切るように、圧電素子４０の超音波照射面と凹部１１ａの底との間で定在超音波Ｓが発生させられる。
【００４６】
微小流路１１に導入された全血Ｂは、図３に模式的に示すように血球（赤血球、白血球および血小板）Ｈを含み、また抗原Ａを含み得るものである。この全血Ｂが、微小流路１１の上記凹部１１ａが設けられている部分に到達すると、全血Ｂ中において比較的粒径が大きい血球Ｈが、定在超音波Ｓの影響を受けて定在超音波Ｓの節の部分に集積される。定在超音波Ｓの節は、凹部１１ａ内に位置するように設定されているため、血球Ｈがこの凹部１１ａ内に捕捉される。こうして全血Ｂから血球Ｈが分離されるので、微小流路１１の凹部１１ａよりも下流側の部分では、ほぼ血漿のみが流れるようになる。
【００４７】
上記の血漿は、微小流路１１に吸着固定されている標識抗体２０と混ぜ合わされる。それにより、抗原Ａが標識抗体２０の抗体２３と結合し、さらに抗体２３と結合した抗原Ａが、センサ部１４の抗体１３と結合し、抗原Ａが抗体１３と抗体２３で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００４８】
このようにしてセンサ部１４に吸着した抗原Ａは、以下の通りにして検出される。光源３１から発せられた励起光Ｌ0は、微小流路１１の底面（センサチップ１０と試料液との界面）に対して、全反射条件となる入射角で入射する。こうして励起光Ｌ0が全反射すると、抗体１３を固定している微小流路１１の内壁面から試料液Ｂ中にエバネッセント光が滲み出す。このとき、エバネッセント光の滲み出し領域内に蛍光標識２２が存在すると、その蛍光標識２２が励起されて蛍光Ｌｆが発生する。こうして発生した蛍光Ｌｆは、光検出器３６によって検出される。以上のようにして蛍光標識２２の存在を検出することは、すなわち、抗体１３と結合した抗原Ａの存在を検出することになる。そこで光検出器３６の蛍光検出信号に基づいて、抗原Ａの存在の有無や、その量を検出可能となる。
【００４９】
本実施形態においては、前述した通り血球Ｈが凹部１１ａに捕捉されるので、基本的にセンサ部１４には血漿だけが到達する。そこで蛍光Ｌｆは、血球Ｈによる散乱や吸収の影響を受けることなく良好に検出されるようになり、精度良い測定が可能となる。また、血球によって免疫反応が阻害されるようなこともない。さらに、進行超音波ではなく定在超音波により血球Ｈを集積しているため、血球除去の際に溶血を生じないようにできるため、検体等の他の物質に影響を及ぼすことがなくなり、免疫アッセイや化学分析を正確行うことが可能となる。
【００５０】
さらに本実施形態の測定装置では、血球Ｈを捕捉するために微小流路１１にフィルタを配置するようなことはしていないので、フィルタが目詰まりして測定に供される血漿量が足りなくなる、そのために正確な測定値を求めることが困難になる、さらには、目詰まりを防止するために試料吸引ポンプ３４によって微小流路１１に大きな吸引負圧を作用させる必要がある、といった問題が発生することもない。
【００５１】
なお微小流路１１中には、固定されている抗体１３と結合していない抗原Ａや標識抗体２０が浮遊しており、またセンサ部１４には標識抗体２０が非特異吸着している。これらを除去するため、蛍光Ｌｆの検出前に、適宜洗浄液を流路に導入するようにしてもよい。
【００５２】
また、例えば励起光Ｌ0として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、前述の金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属薄膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００５３】
次に図４を参照して、本発明の第２の実施形態について説明する。なおこの図４において、図１〜３中の要素と同等の要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する（以下、同様）。また、以下で説明する図４〜９の構成は、すべて圧電素子４０周辺の部分に特徴が有るものなので、それらの部分のみの概略断面形状を図示してある。
【００５４】
図４は、本発明の第２の実施形態による測定装置に適用されたセンサチップの圧電素子４０周辺の部分概略断面形状を示すものである。
【００５５】
このセンサチップは図３に示されたセンサチップと比べると、流路部材１２の凹部１１ａの底面に流路部材１２よりも超音波の反射率が高い超音波反射部材５０を設けている点が異なるものである。この超音波反射部材５０は、例えばアルミニウムやクラウンガラス等を用いることができる。このような超音波反射部材５０を設ければ、より確実に定在超音波を発生させることができる。
【００５６】
次に図５は、本発明の第３の実施形態による測定装置に適用されたセンサチップを示すものである。このセンサチップは図４に示されたセンサチップと比べると、微小流路の流路壁の超音波被照射部（ここでは超音波反射部材５０表面）から定在超音波Ｓの節までの領域に、試料液と流路部材１２との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層５１を設けている点が異なるものである。この音響整合層５１は、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：Polydimethylsiloxane）等を用いることができる。このような音響整合層５１を設ければ、音響整合層５１の表面付近に血球Ｈを保持できるようになるので、血球Ｈの捕捉や回収を容易にすることができる。
【００５７】
ここで、音響整合層５１の表面を疎水的にしておけば、血球Ｈを疎水性相互作用で吸着させることも可能になる。また、音響整合層５１の表面の位置を定在超音波Ｓの節の位置よりもわずかに下げておけば、血球Ｈは音響整合層５１表面に押しつけられないので、進行超音波のように壁面との間の圧力で溶血させてしまうことを防ぐことも可能である。
【００５８】
次に図６は、本発明の第４の実施形態による測定装置に適用されたセンサチップを示すものである。このセンサチップは図３に示されたセンサチップと比べると、圧電素子４０の超音波照射面と凹部１１ａの底との間の距離を２倍の１５００μｍとし、定在超音波Ｓの節を凹部１１ａ内に２つ発生させるようにした点が異なるものである。これにより血球Ｈの回収効率を向上させることができる。
【００５９】
次に図７は、本発明の第５の実施形態による測定装置に適用されたセンサチップを示すものである。このセンサチップは図３に示されたセンサチップと比べると、粒子捕捉部を、凹部の代わりに、定在超音波Ｓの節の位置よりも流路下流側において血球Ｈを捕捉する隔壁１１ｂとした点が異なるものである。
【００６０】
隔壁１１ｂは、上流側が開口したコ字断面形状であり、コ字部の内側に血球Ｈを捕捉するように構成されている。また隔壁１１ｂの下流側の壁面には開口１１ｃが設けられており、血球Ｈ以外は隔壁１１ｂを通過できるようにしている。この隔壁１１ｂは、流路部材１２と一体的に構成されている。このような態様としても血球Ｈを回収することができる。
【００６１】
次に図８は、本発明の第６の実施形態による測定装置に適用されたセンサチップを示すものである。このセンサチップは図３に示されたセンサチップと比べると、流路部材１２の一部が圧電素子４０によって構成されている点が異なるものである。すなわちこの場合、圧電素子４０はセンサチップ１０と共に使い捨てされることになる。そしてセンサチップ１０が測定装置本体にセットされると、ピエゾドライバ４１（図１参照）と圧電素子４０との間で、公知の機構を用いて電気的接続が取られるようになっている。
【００６２】
上述のように圧電素子４０をセンサチップ１０と共に使い捨てとする場合、圧電素子４０は、例えばMeasurement Specialties社製の厚さ数十μｍのピエゾフィルム等から構成することが好ましい。
【００６３】
このような態様とした場合、図９に示すように、圧電素子４０の微小流路１１側の表面に、圧電素子４０と微小流路１１内の試料液との間で音響インピーダンス整合を図る、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：Polydimethylsiloxane）等からなる音響整合層５２を設けることが好ましい。このような音響整合層５２を設けることにより、圧電素子４０から発せられた超音波が試料液で反射することが抑制され、良好に凹部１１ａまで到達できるようになるため、定在超音波Ｓを効率的に発生させることができる。
【００６４】
次に図１０を参照して、本発明の第７の実施形態による測定装置について説明する。本実施形態の測定装置は、図１に示した測定装置と比べると基本的に、センサ部１４において流路部材１２の流路壁に金属薄膜６０が形成され、抗体１３はその金属薄膜６０の上に形成されている点が異なるものである。
【００６５】
上記の構成において、光源３１から発せられた励起光Ｌ0を、微小流路１１の底面（センサチップ１０と金属薄膜６０との界面）に対して全反射条件となる入射角で、かつｐ偏光として入射させると、金属薄膜６０上の試料液中にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光によって金属薄膜６０中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜表面に電界分布が生じ、電場増強領域が形成される。
【００６６】
このとき、エバネッセント光の滲み出し領域内に蛍光標識２２が存在すると、その蛍光標識２２が励起されて蛍光Ｌｆが発生する。ここで、エバネッセント光の染み出し領域とほぼ同等の領域に存在する表面プラズモンによる電場増強効果により、蛍光Ｌｆは増強されたものとなる。光検出器３６は、この増強された蛍光Ｌｆを検出する。この光検出器３６が出力する蛍光検出信号に基づいて、抗原Ａの存在の有無や、その量を検出可能であることは、既述の実施形態におけるのと同様である。
【００６７】
次に図１１を参照して、本発明の第８の実施形態による測定装置について説明する。本実施形態の測定装置は、図１に示した測定装置と比べると基本的に、エバネッセント光を発生させる全反射光学系に代えて落射光学系が採用されている点が異なるものである。
【００６８】
すなわち本実施形態においては、光源３１が光検出器３６と同様にセンサチップ１０の上方側に配置され、そこからセンサチップ１０のセンサ部１４に向けて励起光Ｌ0が照射される。したがってこの場合は、伝搬光である励起光Ｌ0によって直接的に前記蛍光標識２２が励起されて蛍光Ｌｆが発生する。この蛍光Ｌｆを検出した信号に基づいて、抗原Ａの存在の有無や、その量を検出可能であることは、既述の実施形態におけるのと同様である。
【００６９】
なお、以上説明した図１０や図１１の構成を採用する場合においても、図４〜９に示したセンサチップの構成を適宜採用可能であることは勿論である。
【００７０】
ここで、本発明の測定装置が対象とする被検出物質は、抗原や抗体の他、遺伝子、細胞などの固層化して観察できる物質であれば、特に制限がない。遺伝子、細胞を検出する場合は、それらに特異的に吸着する物質を微小流路の内壁に固定しておけばよい。反対に、遺伝子、細胞に特異的に吸着する物質を本発明の測定装置によって検出することも可能であり、その場合は遺伝子、細胞を微小流路の内壁に固定しておけばよい。
【００７１】
また、被検出物質、あるいは試料中で被検出物質と競合する競合物質と特異的に結合する物質は、センサ表面に直接固定されている必要はなく、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）、ＳｉＯ２等の誘電体膜、カルボキシメチルデキストラン等の高分子膜などを介して固定されていてもよい。
【００７２】
また、被検出物質、あるいはこの被検出物質と試料液中で競合する競合物質と、それと特異的に結合する物質との組合せも、上述した抗原と抗体に限られるものではなく、その他、アビジン・ビオチン反応、酵素・基質反応など、バイオアッセイに使われる反応により結合する物質の組合せが用いられる場合にも、本発明は同様に適用可能である。
【００７３】
さらに、免疫アッセイを適用する場合は、先に説明したサンドイッチアッセイだけではなく、競合法を適用することも可能である。
【００７４】
また標識物質は蛍光分子に限らず、蛍光ビーズ、金属微粒子など光応答性があるその他の物質からなるものも適用可能である。
【符号の説明】
【００７５】
１０ 微小流路型センサチップ
１１ 微小流路
１１ａ 凹部（血球捕捉部）
１２ 流路部材
１３ 抗体
１４ センサ部
２０ 標識抗体
２２ 標識
２３ 抗体
３０ プリズム
３１ 光源
３３ 連通管
３４ 試料吸引ポンプ
４０ 圧電素子
４１ ピエゾドライバ
４２ 波形発生器
５０ 超音波反射部材
５１、５２ 音響整合層
６０ 金属薄膜
Ａ 抗原
Ｌ0 励起光
Ｌｆ 蛍光
Ｓ 定在超音波
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料液中に含まれる可能性が有る被検出物質について測定を行う装置、特に詳細には、試料液を流通させる微小流路を備えたセンサチップを用いて光学的測定を行う測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定においては、抗原抗体反応などの生体分子反応を検出することにより、被検出物質である抗原（あるいは抗体）などの存在の有無、量を測定している。
【０００３】
例えば、互いに特異的に結合する２つの物質の一方（抗原、抗体、各種酵素、受容体など）を基板上に固定化し、他方の物質（これは被検出物質そのものであってもよいし、あるいは試料中で被検出物質と競合する競合物質であってもよい）を基板上に固定された固定層に結合させ、この結合反応を検出することにより、試料中における被検出物質の有無、量を測定することができる。具体的には、試料に含まれる被検出物質である抗原を検出するため、基板上にその抗原と特異的に結合する抗体を固定しておき、基板上に試料を供給することにより抗体に抗原を特異的に結合させ、次いで、抗原と特異的に結合する、標識が付与された標識抗体を添加し、抗原と結合させることにより、抗体―抗原―標識抗体の、所謂サンドイッチを形成し、標識からの信号を検出するサンドイッチ法や、標識された競合抗原を被検出物質である抗原と競合的に固定化抗体と結合させ、固定化抗体と結合した競合抗原に付与されている標識からの信号を検出する競合法などのイムノアッセイが知られている。
【０００４】
なお上記サンドイッチ法においては、被検出物質である抗原が上記「他方の物質」に相当し、競合法においては競合抗原が上記「他方の物質」に相当する。後者の競合法においては、固定化抗体と結合した競合抗原の量が多いほど、被検出物質である抗原の量が少ないという関係があるので、この関係に基づいて、競合抗原の量に対応する標識からの信号レベルにより抗原の量を求めることができる。
【０００５】
また、上述のようなバイオ測定に適用可能で、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識されて被検出物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち被検出物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００６】
以上述べたような光学的手法を用いるバイオ測定においては測定時間の短縮化が望まれており、そこで、センサ部における反応を効率良く生じさせて、測定時間の短縮を図る方法が種々提案されている。例えば特許文献１には、微小流路（マイクロ流路）型のセンサチップを用い、試料液を一定の高速で流下させることにより測定の高速化を図ることが提案されている。この種のセンサチップは、上述した蛍光検出による被検出物質の検出や定量分析を行うために適用することも可能である。
【０００７】
さらに、このような蛍光検出法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献２等に提案されている。この方法は、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを用い、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の入射角で励起光を入射させ、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって蛍光を増強させることにより、Ｓ／Ｎを向上させるものである。
【０００８】
ところで、上記のようなバイオ測定に供される試料液の代表的なものとして、人血等の血液が挙げられるが、流路を備えたセンサチップを用いる測定装置は、血液中に含まれ得る被検出物質の検出や定量分析にも適用可能とされている。このように、血液を対象として光学的手法により各種測定を行う場合は、血液中に血球が存在すると、その血球が励起光や被検出光を散乱あるいは吸収するので、測定の感度や精度が損なわれる。また、免疫反応に関わる事象について測定を行う場合は、血球が免疫反応を阻害して、それにより測定の精度が損なわれることもある。そこで多くの場合は、全血から血球を除去した後の血漿を測定にかけるようにしている。したがって、上記のセンサチップを利用する際には、その流路中に設定されたセンサ部よりも流路上流側で、全血から血球を除去しておくことが求められる。
【０００９】
全血から血球を除去する方法としては、センサチップのセンサ部よりも流路上流側に血球分離フィルタを設けることが考えられるが、この場合には血球分離に時間がかかる、目詰まりを防止するためには真空ポンプによって流路に大きな吸引負圧を作用させる必要がある、フィルタが目詰まりして測定に供される血漿量が足りなくなる、といった問題が認められる。特に最後の問題は、いわゆるレート測定法によって測定を行う場合に発生すると、深刻な事態を招くことになる。すなわち、レート測定法とは、単位時間に対する反応量の変化量を測定するものであるが、上記のフィルタに目詰まりが生じてそれが時々刻々進行すると、流路中の血液の流速が次第に低下するために被検出物質が供給不足となって、正確な測定値を求めることが困難になるのである。
【００１０】
このような問題を生じない血球除去の手法として、例えば特許文献３には、流路を流れる全血に対して流れを横切る方向に進行超音波を当て、その放射圧によって血球を押圧することにより、血液を、血球を含むものと含まないもの（血漿）とに分離し、そうして分離された各血液を互いに分岐した別々の流路に導入することが記載されている。この構成によれば、血漿だけをセンサ部に供給することも可能と考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−１０１２２１号公報
【特許文献２】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献３】特開２００５−３１９４０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、特許文献３に示された血球除去の手法を、前述のセンサチップを用いて光学的測定を行う装置に適用した場合、進行超音波により血球が溶血（損傷）するおそれがある。血球の溶血が発生すると、血球内のタンパク質が検体に暴露されるために、その後の免疫アッセイや化学分析に影響を与えるおそれがある。
【００１３】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、試料液を流通させる微小流路を備えたセンサチップを用いて光学的測定を行う測定装置において、溶血を生じずに全血から簡単に血球を除去してセンサ部に供給可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明による測定装置は、流路部材内に試料液を流通させる微小流路が設けられ、この微小流路内の一部にセンサ部が配設されてなるセンサチップを用いて、試料液中に含まれ得る被検出物質に関する測定を行う測定装置において、流路部材のセンサ部よりも流路上流側において微小流路を横断する定在超音波を発生させる超音波照射手段と、定在超音波の節に集積された微小粒子を捕捉する粒子捕捉部とを備えていることを特徴とするものである。
【００１５】
本発明の測定装置においては、粒子捕捉部を、流路部材の流路壁の超音波被照射部（流路壁において超音波が照射される部分）に形成された凹部とするとともに、超音波照射手段を、定在超音波の節を凹部内に位置させるように超音波を照射するものとしてもよい。また、粒子捕捉部を、定在超音波の節の位置よりも流路下流側において微小粒子を捕捉する構造物としてもよい。
【００１６】
ここで、定在超音波が微小粒子に及ぼす力について説明する。この力は下記式のように表せられる。
【数１】
ただし、
Ｆ：捕捉力
ρ０：媒質の密度
ｃ０：媒質での音速
λ：超音波の波長
ｚ：位置座標（音波の伝搬方向の位置座標）
ｐ０：超音波の振幅（音圧）
【００１７】
ｚ＝０（すなわち節の位置）ではｓｉｎが０になるので定在超音波が微小粒子に及ぼす力はゼロになる。ｚ＝０を基準に正側は定在超音波が微小粒子に及ぼす力の方向が正側になり、負側ではこの力の方向が負側になり、両者ともに微小粒子をｚ＝０（すなわち節の位置）の位置に近づける方向に力が発生する。
【００１８】
また、ｚ＝λ／４（すなわち腹の位置）では定在超音波が微小粒子に及ぼす力がピークとなる。ｚ＝λ／４より大きい側は定在超音波が微小粒子に及ぼす力の方向が負側になり、小さい側はこの力の方向が正側になり、両者ともに微小粒子をｚ＝λ／４（すなわち腹の位置）の位置から遠ざける方向に力が発生する。
【００１９】
なお、ここで発生する力はｓｉｎ関数に比例するために、ｚ＝０ではゼロの力が、ｚ＝０から離れるに従い緩やかに大きくなる力が働く。
【００２０】
つまり、定在超音波の節（ｚ＝０）に集積された微小粒子の大きさがλ／４を超えると、微小粒子内に逆方向の力が同時に加えられることになり、物質損傷の可能性が表れる。
【００２１】
従って、微小粒子を損傷させずに定在超音波の節に集積させるためには、超音波照射手段が発生させる超音波の波長は、捕捉対象となる微小粒子の粒径の４倍以上とすることが好ましい。
【００２２】
また、微小流路の流路壁の超音波被照射部に、流路部材よりも超音波の反射率が高い超音波反射部材を設けることが好ましい。
【００２３】
また、微小流路の流路壁の超音波被照射部から定在超音波の節までの領域に、試料液と流路部材との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層を設けることが好ましい。
【００２４】
また、超音波照射手段は、微小流路の流路壁の一部を構成するように配置してもよく、その場合には、超音波照射手段の表面に、超音波照射手段と試料液との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層を設けてもよい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の測定装置においては、流路部材内に試料液を流通させる微小流路が設けられ、この微小流路内の一部にセンサ部が配設されてなるセンサチップを用いて、試料液中に含まれ得る被検出物質に関する測定を行う測定装置において、超音波照射手段により流路部材のセンサ部よりも流路上流側において微小流路を横断する定在超音波を発生させて、この定在超音波の節の部分に微小粒子を集積し、集積された微小粒子を粒子捕捉部で捕捉するようにしている。上述の通り、定在超音波の節の部分では、定在超音波が微小粒子に及ぼす力がゼロになるので、進行超音波で微小流路を集積する場合と比較して微小粒子の損傷を小さくすることができる。
【００２６】
そのため、特に全血から血球を除去する場合には、溶血を生じずに全血から簡単に血球を除去してセンサ部に供給できるため、検体等の他の物質に影響を及ぼすことがなくなり、免疫アッセイや化学分析を正確行うことが可能となる。
【００２７】
また、粒子捕捉部を、流路部材の流路壁の超音波被照射部に形成された凹部とするとともに、超音波照射手段を、定在超音波の節を凹部内に位置させるように超音波を照射するものとするか、粒子捕捉部を、定在超音波の節の位置よりも流路下流側において微小粒子を捕捉する構造物とすれば、簡単な構成で粒子捕捉部を構成することが可能となる。
【００２８】
また、超音波照射手段が発生させる超音波の波長を、捕捉対象となる微小粒子の粒径の４倍以上とすれば、より微小粒子の損傷を小さくすることができる。
【００２９】
また、微小流路の流路壁の超音波被照射部に、流路部材よりも超音波の反射率が高い超音波反射部材を設ければ、より確実に定在超音波を発生させることができる。
【００３０】
また、微小流路の流路壁の超音波被照射部から定在超音波の節までの領域に、試料液と流路部材との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層を設ければ、音響整合層の表面付近に微小粒子を保持できるようになるので、微小粒子の捕捉や回収を容易にすることができる。
【００３１】
また、超音波照射手段を、微小流路の流路壁の一部を構成するように配置してもよく、その場合に、超音波照射手段の表面に、超音波照射手段と試料液との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層を設ければ、超音波が試料液で反射することが抑えられるので、定在超音波を効率的に発生させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の第１実施形態による測定装置を示す概略側面図
【図２】上記測定装置に用いられるセンサチップの外形形状を示す斜視図
【図３】上記測定装置に用いられるセンサチップの要部を示す概略側面図
【図４】本発明の第２実施形態の測定装置におけるセンサチップの要部を示す概略側面図
【図５】本発明の第３実施形態の測定装置におけるセンサチップの要部を示す概略側面図
【図６】本発明の第４実施形態の測定装置におけるセンサチップの要部を示す概略側面図
【図７】本発明の第５実施形態の測定装置におけるセンサチップの要部を示す概略側面図
【図８】本発明の第６実施形態の測定装置におけるセンサチップの要部を示す概略側面図
【図９】上記測定装置におけるセンサチップの要部のその他の例を示す概略側面図
【図１０】本発明の第７実施形態による測定装置を示す概略側面図
【図１１】本発明の第８実施形態による測定装置を示す概略側面図
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。図１は、本発明の第１の実施形態による測定装置の概略構成を示すものである。本実施形態の測定装置は、先に述べた微小流路型センサチップ（以下、単にセンサチップという）１０を用いて生体由来物質を検出する装置として構成されたものである。まず図２および図３も参照して、このセンサチップ１０について説明する。
【００３４】
センサチップ１０は測定装置本体に対して着脱自在とされたものであり、図１および図２に示される通り、試料液が流される微小流路１１を有する流路部材１２と、微小流路１１の一部を構成して、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質１３を壁面に固定しているセンサ部１４と、流路部材１２の上に固着された上板部材１７とを備えている。なおセンサ部１４の上流側つまり図中の左側において流路部材１２には、微小流路１１から下方に凹んだ状態とされた凹部１１ａが形成されている。この凹部１１ａは後述するように、粒子捕捉部として機能するものである。
【００３５】
本実施形態では、抗原抗体反応においてサンドイッチ法によるアッセイを行う場合を例とし、そこで上記物質１３が、被検出物質である抗原Ａと特異的に結合する抗体であるとして説明する。なお、抗体１３は直接微小流路１１の壁面に固定されてもよいが、後述するように表面プラズモンによる電場増強により蛍光を増強する場合は、この壁面の上に金属薄膜が形成され、その上に抗体１３が固定される。
【００３６】
上記上板部材１７は、図２に示されるように、上表面に開口した試料液流入口１６ａおよび試料液流出口１６ｂと、試料液流入口１６ａと微小流路１１の上流端とを連通させる開口１５ａと、試料液流出口１６ｂと微小流路１１の下流端とを連通させる開口１５ｂとを有している。この上板部材１７と流路部材１２は、例えば超音波溶接により接合されている。
【００３７】
流路部材１２および上板部材１７はポリスチレン等の透明な誘電体材料からなり、射出成型によりそれぞれ成型されている。
【００３８】
また本例のセンサチップ１０においては、図３にも示すように、抗体１３が固定されている領域の上流側において微小流路１１の内面に、標識抗体２０が付着されている。標識抗体２０は、被検出物質に対して、前述の抗体１３とは異なるエピトープに特異的に結合する抗体２３と蛍光標識２２とから構成されたものである。ここでは蛍光標識２２として、多数の蛍光色素分子ｆと該蛍光色素分子ｆを内包する光透過材料２１とからなる蛍光微粒子が用いられている。
【００３９】
上記蛍光微粒子の大きさには特に制限はないが、直径数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度が好ましく、ここでは一例として直径１００ｎｍ程度のものが用いられている。光透過材料２１としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられるが、蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ該蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。本例における標識抗体２０は、蛍光標識２２を、それよりも小さい抗体２３により表面修飾して構成されている。
【００４０】
次に図１に戻って測定装置について説明する。この測定装置は、上記センサチップ１０が例えば屈折率マッチングオイルを介して載置されるプリズム３０と、微小流路１１の底面（センサチップ１０と試料液との界面）に対して、全反射条件となる入射角で励起光Ｌ0を入射させる半導体レーザ等からなる光源３１と、センサチップ１０の試料液流出口１６ｂにノズル３２を介して一端が連通される連通管３３と、この連通管３３の他端に吸込口が接続された試料吸引ポンプ３４と、連通管３３に介設された開放弁３５と、センサチップ１０のセンサ部１４の近傍部分から後述するようにして発せられる蛍光Ｌｆを検出する光検出器３６とを備えている。
【００４１】
さらにこの測定装置は、微小流路１１の前記凹部１１ａに対向するようにして流路部材１２の上方に配置された、超音波照射手段としての圧電素子（本例ではピエゾ素子）４０と、この圧電素子４０を励振させる駆動電圧を該圧電素子４０に印加するピエゾドライバ４１と、上記駆動電圧の波形を規定する波形信号を生成してピエゾドライバ４１に入力する波形発生器４２とを有している。なお超音波照射手段としては、ピエゾ素子に限らず、それ以外の圧電セラミック等を適用することも可能である。
【００４２】
この圧電素子４０から凹部１１ａの底（超音波被照射部）に向けて超音波が照射され、圧電素子４０の超音波照射面と凹部１１ａの底との間で定在超音波Ｓを発生させ、試料液中の微小粒子を定在超音波Ｓの節の部分に集積する。
【００４３】
この定在超音波Ｓの波長は、捕捉対象となる微小粒子の粒径の４倍以上とすることにより、より微小粒子の損傷を小さくすることができる。本実施形態においては、後述するように、全血Ｂ中の血球Ｈを集積することを想定している。血球Ｈの粒径は最大で２０μｍ程度あるため、定在超音波Ｓの波長は少なくとも８０μｍ以上とすることが好ましい。
【００４４】
本実施形態においては、圧電素子４０の超音波照射面と凹部１１ａの底との間の距離を７５０μｍ、発生させる定在超音波Ｓの周波数を１ＭＨｚ、波長を１５００μｍとする。
【００４５】
次に、この測定装置による被検出物質の検出について説明する。ここでは一例として、試料液としての血液（全血）Ｂに含まれる可能性のある抗原Ａを検出する場合について説明する。まず、図１に示す試料液流入口１６ａに全血Ｂが注入され、それとともに試料吸引ポンプ３４が駆動され、開放弁３５は連通管３３を開く状態に設定され、全血Ｂがセンサチップ１０の微小流路１１内に導入される。またこのとき、ピエゾドライバ４１により圧電素子４０が駆動され、微小流路１１を横切るように、圧電素子４０の超音波照射面と凹部１１ａの底との間で定在超音波Ｓが発生させられる。
【００４６】
微小流路１１に導入された全血Ｂは、図３に模式的に示すように血球（赤血球、白血球および血小板）Ｈを含み、また抗原Ａを含み得るものである。この全血Ｂが、微小流路１１の上記凹部１１ａが設けられている部分に到達すると、全血Ｂ中において比較的粒径が大きい血球Ｈが、定在超音波Ｓの影響を受けて定在超音波Ｓの節の部分に集積される。定在超音波Ｓの節は、凹部１１ａ内に位置するように設定されているため、血球Ｈがこの凹部１１ａ内に捕捉される。こうして全血Ｂから血球Ｈが分離されるので、微小流路１１の凹部１１ａよりも下流側の部分では、ほぼ血漿のみが流れるようになる。
【００４７】
上記の血漿は、微小流路１１に吸着固定されている標識抗体２０と混ぜ合わされる。それにより、抗原Ａが標識抗体２０の抗体２３と結合し、さらに抗体２３と結合した抗原Ａが、センサ部１４の抗体１３と結合し、抗原Ａが抗体１３と抗体２３で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００４８】
このようにしてセンサ部１４に吸着した抗原Ａは、以下の通りにして検出される。光源３１から発せられた励起光Ｌ0は、微小流路１１の底面（センサチップ１０と試料液との界面）に対して、全反射条件となる入射角で入射する。こうして励起光Ｌ0が全反射すると、抗体１３を固定している微小流路１１の内壁面から試料液Ｂ中にエバネッセント光が滲み出す。このとき、エバネッセント光の滲み出し領域内に蛍光標識２２が存在すると、その蛍光標識２２が励起されて蛍光Ｌｆが発生する。こうして発生した蛍光Ｌｆは、光検出器３６によって検出される。以上のようにして蛍光標識２２の存在を検出することは、すなわち、抗体１３と結合した抗原Ａの存在を検出することになる。そこで光検出器３６の蛍光検出信号に基づいて、抗原Ａの存在の有無や、その量を検出可能となる。
【００４９】
本実施形態においては、前述した通り血球Ｈが凹部１１ａに捕捉されるので、基本的にセンサ部１４には血漿だけが到達する。そこで蛍光Ｌｆは、血球Ｈによる散乱や吸収の影響を受けることなく良好に検出されるようになり、精度良い測定が可能となる。また、血球によって免疫反応が阻害されるようなこともない。さらに、進行超音波ではなく定在超音波により血球Ｈを集積しているため、血球除去の際に溶血を生じないようにできるため、検体等の他の物質に影響を及ぼすことがなくなり、免疫アッセイや化学分析を正確行うことが可能となる。
【００５０】
さらに本実施形態の測定装置では、血球Ｈを捕捉するために微小流路１１にフィルタを配置するようなことはしていないので、フィルタが目詰まりして測定に供される血漿量が足りなくなる、そのために正確な測定値を求めることが困難になる、さらには、目詰まりを防止するために試料吸引ポンプ３４によって微小流路１１に大きな吸引負圧を作用させる必要がある、といった問題が発生することもない。
【００５１】
なお微小流路１１中には、固定されている抗体１３と結合していない抗原Ａや標識抗体２０が浮遊しており、またセンサ部１４には標識抗体２０が非特異吸着している。これらを除去するため、蛍光Ｌｆの検出前に、適宜洗浄液を流路に導入するようにしてもよい。
【００５２】
また、例えば励起光Ｌ0として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、前述の金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属薄膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００５３】
次に図４を参照して、本発明の第２の実施形態について説明する。なおこの図４において、図１〜３中の要素と同等の要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する（以下、同様）。また、以下で説明する図４〜９の構成は、すべて圧電素子４０周辺の部分に特徴が有るものなので、それらの部分のみの概略断面形状を図示してある。
【００５４】
図４は、本発明の第２の実施形態による測定装置に適用されたセンサチップの圧電素子４０周辺の部分概略断面形状を示すものである。
【００５５】
このセンサチップは図３に示されたセンサチップと比べると、流路部材１２の凹部１１ａの底面に流路部材１２よりも超音波の反射率が高い超音波反射部材５０を設けている点が異なるものである。この超音波反射部材５０は、例えばアルミニウムやクラウンガラス等を用いることができる。このような超音波反射部材５０を設ければ、より確実に定在超音波を発生させることができる。
【００５６】
次に図５は、本発明の第３の実施形態による測定装置に適用されたセンサチップを示すものである。このセンサチップは図４に示されたセンサチップと比べると、微小流路の流路壁の超音波被照射部（ここでは超音波反射部材５０表面）から定在超音波Ｓの節までの領域に、試料液と流路部材１２との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層５１を設けている点が異なるものである。この音響整合層５１は、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：Polydimethylsiloxane）等を用いることができる。このような音響整合層５１を設ければ、音響整合層５１の表面付近に血球Ｈを保持できるようになるので、血球Ｈの捕捉や回収を容易にすることができる。
【００５７】
ここで、音響整合層５１の表面を疎水的にしておけば、血球Ｈを疎水性相互作用で吸着させることも可能になる。また、音響整合層５１の表面の位置を定在超音波Ｓの節の位置よりもわずかに下げておけば、血球Ｈは音響整合層５１表面に押しつけられないので、進行超音波のように壁面との間の圧力で溶血させてしまうことを防ぐことも可能である。
【００５８】
次に図６は、本発明の第４の実施形態による測定装置に適用されたセンサチップを示すものである。このセンサチップは図３に示されたセンサチップと比べると、圧電素子４０の超音波照射面と凹部１１ａの底との間の距離を２倍の１５００μｍとし、定在超音波Ｓの節を凹部１１ａ内に２つ発生させるようにした点が異なるものである。これにより血球Ｈの回収効率を向上させることができる。
【００５９】
次に図７は、本発明の第５の実施形態による測定装置に適用されたセンサチップを示すものである。このセンサチップは図３に示されたセンサチップと比べると、粒子捕捉部を、凹部の代わりに、定在超音波Ｓの節の位置よりも流路下流側において血球Ｈを捕捉する隔壁１１ｂとした点が異なるものである。
【００６０】
隔壁１１ｂは、上流側が開口したコ字断面形状であり、コ字部の内側に血球Ｈを捕捉するように構成されている。また隔壁１１ｂの下流側の壁面には開口１１ｃが設けられており、血球Ｈ以外は隔壁１１ｂを通過できるようにしている。この隔壁１１ｂは、流路部材１２と一体的に構成されている。このような態様としても血球Ｈを回収することができる。
【００６１】
次に図８は、本発明の第６の実施形態による測定装置に適用されたセンサチップを示すものである。このセンサチップは図３に示されたセンサチップと比べると、流路部材１２の一部が圧電素子４０によって構成されている点が異なるものである。すなわちこの場合、圧電素子４０はセンサチップ１０と共に使い捨てされることになる。そしてセンサチップ１０が測定装置本体にセットされると、ピエゾドライバ４１（図１参照）と圧電素子４０との間で、公知の機構を用いて電気的接続が取られるようになっている。
【００６２】
上述のように圧電素子４０をセンサチップ１０と共に使い捨てとする場合、圧電素子４０は、例えばMeasurement Specialties社製の厚さ数十μｍのピエゾフィルム等から構成することが好ましい。
【００６３】
このような態様とした場合、図９に示すように、圧電素子４０の微小流路１１側の表面に、圧電素子４０と微小流路１１内の試料液との間で音響インピーダンス整合を図る、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：Polydimethylsiloxane）等からなる音響整合層５２を設けることが好ましい。このような音響整合層５２を設けることにより、圧電素子４０から発せられた超音波が試料液で反射することが抑制され、良好に凹部１１ａまで到達できるようになるため、定在超音波Ｓを効率的に発生させることができる。
【００６４】
次に図１０を参照して、本発明の第７の実施形態による測定装置について説明する。本実施形態の測定装置は、図１に示した測定装置と比べると基本的に、センサ部１４において流路部材１２の流路壁に金属薄膜６０が形成され、抗体１３はその金属薄膜６０の上に形成されている点が異なるものである。
【００６５】
上記の構成において、光源３１から発せられた励起光Ｌ0を、微小流路１１の底面（センサチップ１０と金属薄膜６０との界面）に対して全反射条件となる入射角で、かつｐ偏光として入射させると、金属薄膜６０上の試料液中にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光によって金属薄膜６０中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜表面に電界分布が生じ、電場増強領域が形成される。
【００６６】
このとき、エバネッセント光の滲み出し領域内に蛍光標識２２が存在すると、その蛍光標識２２が励起されて蛍光Ｌｆが発生する。ここで、エバネッセント光の染み出し領域とほぼ同等の領域に存在する表面プラズモンによる電場増強効果により、蛍光Ｌｆは増強されたものとなる。光検出器３６は、この増強された蛍光Ｌｆを検出する。この光検出器３６が出力する蛍光検出信号に基づいて、抗原Ａの存在の有無や、その量を検出可能であることは、既述の実施形態におけるのと同様である。
【００６７】
次に図１１を参照して、本発明の第８の実施形態による測定装置について説明する。本実施形態の測定装置は、図１に示した測定装置と比べると基本的に、エバネッセント光を発生させる全反射光学系に代えて落射光学系が採用されている点が異なるものである。
【００６８】
すなわち本実施形態においては、光源３１が光検出器３６と同様にセンサチップ１０の上方側に配置され、そこからセンサチップ１０のセンサ部１４に向けて励起光Ｌ0が照射される。したがってこの場合は、伝搬光である励起光Ｌ0によって直接的に前記蛍光標識２２が励起されて蛍光Ｌｆが発生する。この蛍光Ｌｆを検出した信号に基づいて、抗原Ａの存在の有無や、その量を検出可能であることは、既述の実施形態におけるのと同様である。
【００６９】
なお、以上説明した図１０や図１１の構成を採用する場合においても、図４〜９に示したセンサチップの構成を適宜採用可能であることは勿論である。
【００７０】
ここで、本発明の測定装置が対象とする被検出物質は、抗原や抗体の他、遺伝子、細胞などの固層化して観察できる物質であれば、特に制限がない。遺伝子、細胞を検出する場合は、それらに特異的に吸着する物質を微小流路の内壁に固定しておけばよい。反対に、遺伝子、細胞に特異的に吸着する物質を本発明の測定装置によって検出することも可能であり、その場合は遺伝子、細胞を微小流路の内壁に固定しておけばよい。
【００７１】
また、被検出物質、あるいは試料中で被検出物質と競合する競合物質と特異的に結合する物質は、センサ表面に直接固定されている必要はなく、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）、ＳｉＯ２等の誘電体膜、カルボキシメチルデキストラン等の高分子膜などを介して固定されていてもよい。
【００７２】
また、被検出物質、あるいはこの被検出物質と試料液中で競合する競合物質と、それと特異的に結合する物質との組合せも、上述した抗原と抗体に限られるものではなく、その他、アビジン・ビオチン反応、酵素・基質反応など、バイオアッセイに使われる反応により結合する物質の組合せが用いられる場合にも、本発明は同様に適用可能である。
【００７３】
さらに、免疫アッセイを適用する場合は、先に説明したサンドイッチアッセイだけではなく、競合法を適用することも可能である。
【００７４】
また標識物質は蛍光分子に限らず、蛍光ビーズ、金属微粒子など光応答性があるその他の物質からなるものも適用可能である。
【符号の説明】
【００７５】
１０ 微小流路型センサチップ
１１ 微小流路
１１ａ 凹部（血球捕捉部）
１２ 流路部材
１３ 抗体
１４ センサ部
２０ 標識抗体
２２ 標識
２３ 抗体
３０ プリズム
３１ 光源
３３ 連通管
３４ 試料吸引ポンプ
４０ 圧電素子
４１ ピエゾドライバ
４２ 波形発生器
５０ 超音波反射部材
５１、５２ 音響整合層
６０ 金属薄膜
Ａ 抗原
Ｌ0 励起光
Ｌｆ 蛍光
Ｓ 定在超音波
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路部材内に試料液を流通させる微小流路が設けられ、該微小流路内の一部にセンサ部が配設されてなるセンサチップを用いて、試料液中に含まれ得る被検出物質に関する測定を行う測定装置において、
前記流路部材のセンサ部よりも流路上流側において前記微小流路を横断する定在超音波を発生させる超音波照射手段と、
前記定在超音波の節に集積された微小粒子を捕捉する粒子捕捉部とを備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項２】
前記粒子捕捉部が、前記流路部材の流路壁の超音波被照射部に形成された凹部であり、
前記超音波照射手段が、前記定在超音波の節を前記凹部内に位置させるように超音波を照射するものであることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項３】
前記粒子捕捉部が、前記定在超音波の節の位置よりも流路下流側において前記微小粒子を捕捉する構造物であることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項４】
前記超音波照射手段が発生させる超音波の波長が、捕捉対象となる前記微小粒子の粒径の４倍以上であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の測定装置。
【請求項５】
前記微小流路の流路壁の超音波被照射部に、前記流路部材よりも超音波の反射率が高い超音波反射部材が設けられていることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の測定装置。
【請求項６】
前記微小流路の流路壁の超音波被照射部から前記定在超音波の節までの領域に、試料液と前記流路部材との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層が設けられていることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の測定装置。
【請求項７】
前記超音波照射手段が、前記微小流路の流路壁の一部を構成するように配置されていることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の測定装置。
【請求項８】
前記超音波照射手段の表面に、該超音波照射手段と試料液との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層が設けられていることを特徴とする請求項７記載の測定装置。
【請求項１】
流路部材内に試料液を流通させる微小流路が設けられ、該微小流路内の一部にセンサ部が配設されてなるセンサチップを用いて、試料液中に含まれ得る被検出物質に関する測定を行う測定装置において、
前記流路部材のセンサ部よりも流路上流側において前記微小流路を横断する定在超音波を発生させる超音波照射手段と、
前記定在超音波の節に集積された微小粒子を捕捉する粒子捕捉部とを備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項２】
前記粒子捕捉部が、前記流路部材の流路壁の超音波被照射部に形成された凹部であり、
前記超音波照射手段が、前記定在超音波の節を前記凹部内に位置させるように超音波を照射するものであることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項３】
前記粒子捕捉部が、前記定在超音波の節の位置よりも流路下流側において前記微小粒子を捕捉する構造物であることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項４】
前記超音波照射手段が発生させる超音波の波長が、捕捉対象となる前記微小粒子の粒径の４倍以上であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の測定装置。
【請求項５】
前記微小流路の流路壁の超音波被照射部に、前記流路部材よりも超音波の反射率が高い超音波反射部材が設けられていることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の測定装置。
【請求項６】
前記微小流路の流路壁の超音波被照射部から前記定在超音波の節までの領域に、試料液と前記流路部材との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層が設けられていることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の測定装置。
【請求項７】
前記超音波照射手段が、前記微小流路の流路壁の一部を構成するように配置されていることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の測定装置。
【請求項８】
前記超音波照射手段の表面に、該超音波照射手段と試料液との間で音響インピーダンス整合を図る音響整合層が設けられていることを特徴とする請求項７記載の測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−２０２７８９（Ｐ２０１２−２０２７８９Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６７０２１（Ｐ２０１１−６７０２１）
【出願日】平成２３年３月２５日（２０１１．３．２５）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２５日（２０１１．３．２５）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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