潰瘍性大腸炎を診断するための方法およびキット
【課題】潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別する方法を提供する。
【解決手段】多重遺伝子法で、患者の腸の炎症を起こした、および場合により炎症を起こしていない領域から得られた生検サンプルにおける多数のマーカー遺伝子を用いた発現レベルを測定し、遺伝子発現プロファイルの分析よって、潰瘍性大腸炎を予想および／または診断する方法およびキット、更には潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別する方法であり、病気のタイプに関する迅速で正確な診断テストおよび治療計画の効果の評価を可能にするＤＮＡ関連方法。
【解決手段】多重遺伝子法で、患者の腸の炎症を起こした、および場合により炎症を起こしていない領域から得られた生検サンプルにおける多数のマーカー遺伝子を用いた発現レベルを測定し、遺伝子発現プロファイルの分析よって、潰瘍性大腸炎を予想および／または診断する方法およびキット、更には潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別する方法であり、病気のタイプに関する迅速で正確な診断テストおよび治療計画の効果の評価を可能にするＤＮＡ関連方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患の診断に関し、特に、潰瘍性大腸炎を予想および／または診断する方法およびキットに関する。本発明は、全体的または部分群的いずれかの発現状態の変化が潰瘍性大腸炎を示すような特定のマーカー遺伝子を開示する。本発明はさらに、前記病気に関連するマーカー遺伝子の発現レベルを直接生検から定量化することにより、病気のタイプに関する迅速で正確な診断テストおよび／または特定の治療計画の効果の評価を可能にするＤＮＡ関連方法に関する。本発明はさらに、前記遺伝子の発現レベルを検出するための診断キットを開示する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、消化管における慢性炎症に関与する数種の状態をを含む用語である。最も衰弱性のＩＢＤの形態のうち２種は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）と、クローン病（ＣＤ）である。これらの病気は、若年層に影響を及ぼし、その典型的な発症は２０〜３０歳代であり、現在のところいずれの状態に対しても治療法がないため、病気の管理は患者と医師両方にとって長期にわたる献身である。約３０％のＩＢＤ患者が、一生のうちに外科処置を受け、長期にわたりＩＢＤに罹っている患者は、結腸直腸のガンを発症させる危険がかなりある。今日、１０人のＩＢＤ患者うち３人は、利用可能な最善の薬物療法を高用量で用いたとしても反応せず、かなりの副作用を引き起こす。
【０００３】
活動性ＵＣに罹った患者の治療は、炎症を減少させ、結腸の治癒と粘膜の回復を促進することを目的としている。ＵＣの根本的な原因が不明であるだけでなく、何がこの病気にその非活動性型と活動性型とを繰り返させるきっかけになっているのかもわかっていない。しかしながら、この病気の活動性期は、粘膜の顕著な炎症を特徴とし、細胞の透過性、タンパク質と体液の損失を高める。重症期では、腹部の圧痛、頻脈、発熱および腸穿孔の危険を伴い、腸壁の深い炎症が生じる可能性がある。
【０００４】
潰瘍性大腸炎の初期症状の１つは、便に血液または粘液の排出を伴う便秘である。腹部痛を伴う下痢を発症するまでに、数ヶ月または数年が経過する場合がある。後期の症状としては、重度の疲労，体重の減少、食欲の減退、発熱、場合によっては関節痛が挙げられる。
【０００５】
潰瘍性大腸炎の確立された診断への道はしばしば、患者の病歴の徹底的な研究、その他の状態の排除、および、数種の試験、例えば血液試験、検便、バリウム注腸Ｘ線、Ｓ状結腸鏡検査、結腸鏡検査、および、生検を含む。生検は、Ｓ状結腸鏡検査または結腸鏡検査試験の一環として行ってもよい。
【０００６】
初期段階でＵＣと結腸のＣＤとを臨床的に識別する可能性は、患者と医師の両方に多大な利点を提供し得ることは明らかである。この可能性により、正確な治療計画の設計を可能にし、不必要な薬物療法を防ぎ、治療コストを減少させることができる。総合的なＩＢＤ患者の臨床像において主要なＵＣ患者群とＣＤ患者群との間で臨床的に重要ないくつかの差が示されたとしても、実質的に類似しているため、ヘルスケア系の従事者にとって正しい診断を確立することを難しくしている。
【０００７】
従来技術
従来技術によれば、ＩＢＤの型を識別する、特にＵＣとＣＤとを識別する利用可能な方法は、上述の様々な試験方法の例を除いて、抗体に基づく方法に焦点を合わせていることが示されている。
【０００８】
例えば、ＷＯ０３／０３６２６２では、クローン病のマーカーとして糞便の抗サッカロミセス・セレビジエ抗体（ＡＳＣＡ）の存在を用いた、クローン病を潰瘍性大腸炎や過敏性腸症候群のようなその他の胃腸疾患と識別するための方法および装置が提供されること、を説明している。この装置は、ヒト糞便サンプル中の総内因性ＡＳＣＡを測定するための、ヒトイムノグロブリンに特異的な抗体を利用する酵素結合免疫検査法またはその他の免疫検査法を含む。この方法および装置は、ヘルスケア供給者によって、クローン病を潰瘍性大腸炎および過敏性腸症候群のようなその他の胃腸疾患と識別するのに使用可能である。
【０００９】
ＷＯ０１／５８９２７では、罹患した組織のｈＴＭに対する自己抗原反応に関する病気、特に潰瘍性大腸炎を検出するための診断方法を説明している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
正確で迅速で信頼できる潰瘍性大腸炎の診断のための、特にＩＢＤ患者において潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別するという観点で改善された方法の必要性が未だにある。
【００１１】
本発明の目的の１つは、この目的のためのこのような方法およびキットを利用可能にすることである。１つの特定の目的は、病気の初期段階において信頼できる診断に到達できるような方法およびキットを利用可能にすることである。その他の目的は、臨床像が極めて類似し得るような困難なケースにおいても、ＣＤとＵＣとの識別を可能にすることである。
【００１２】
本発明の基礎となるさらなる目的、同様に、本発明が提供する解決方法、および、関連する利点は、本発明の説明、実施例および請求項を研究すれば当業者にとって明白となり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、驚くべきことに、潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別することは、患者の腸の炎症を起こした領域、または場合により炎症を起こしていない領域から得られた生検サンプルの遺伝子発現プロファイルを研究する多重遺伝子法によって可能になることを見出した。
【００１４】
本発明は、全体的または部分群的いずれかでヒトの潰瘍性大腸炎（ＵＣ）状態を示す可能性のあるマーカー遺伝子の発見に基づく。本発明者等は、驚くべきことに、多数の特定の遺伝子の発現レベルの定量化が、患者がＵＣまたは例えばクローン病の状態に罹っているかどうかを生検から正確かつ簡便に診断することに利用可能であることを見出した。
【００１５】
より特定には、前記遺伝子マーカーの発現レベルを半定量化することが可能な予め選択された遺伝子特異的プライマーを用いて、７種の異なる遺伝子マーカーまたはそれらのサブセットの核酸の増幅を可能にする方法を提供する。遺伝子特異的プライマーは、所定の遺伝子マーカーをコードするＤＮＡの対となる鎖にハイブリダイズし、ＰＣＲ増幅によって遺伝子マーカー遺伝子のコードＤＮＡの定義された領域が生産されるように設計される。生物学的サンプル中の、前記７種のマーカー遺伝子またはそれらのサブセットの発現状態を検出およびモニターするための分析およびキットを提供する。この分析は、前記マーカー遺伝子を検出するための、培養ではなくＰＣＲに基づいた分析である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病（ＣＤ）のいずれかに罹った患者からの生検サンプルにおける、７種のマーカー遺伝子の発現状態のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【００１７】
図面の説明
本発明は、添付の図面を参照しながら、以下の詳細な説明および実施例でより詳細に説明される；
図１は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病（ＣＤ）のいずれかに罹った患者からの生検サンプルにおける、７種のマーカー遺伝子の発現状態のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。実験プロトコールを実施例６で概説する。（記号：Ｍは、塩基対マーカー、Ｈは、全体的に正常で健康な個体からの生検を示し、Ｉは、炎症を起こした領域から採取した生検サンプルを示し、Ｎは、同じ患者の炎症を起こしていない領域から採取した生検を示す。図の下部の数字は患者数を示し、縦の黒い線は、同じ患者から得られたＮおよびＩの生検サンプルを示す）。ガンマアクチンをローディングコントロールとして用いたが、これは、全てのＲＴ−ＰＣＲ反応で等しいｍＲＮＡ投入量を実証するのに一般的に用いられるハウスキーピング遺伝子の発現状態を示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明を開示および説明する前に、当業者であれば、本発明は、目的を実行し、上述の結果および利点が得られるように、同様に、本発明に固有の目的を実行し、その結果および利点が得られるようにうまく改変されることは容易に理解し得る。本発明の実施例、同様に、本発明で説明される方法、手順、治療、分子、および、特定の化合物は、現状での好ましい実施形態の典型であり、代表であって、本発明の範囲を限定するような意図はない。当業者が考慮し得るそれらへの変化およびその他の用途は、特許請求の範囲で定義された本発明の本質に包含される。
【００１９】
本発明で用いられる用語「相補ＤＮＡプライマー」は、本発明で説明される条件下で、生物学的サンプル中で、ＲＮＡテンプレートに特定の方向でアニールし、逆転写酵素の存在下で新生ＤＮＡ鎖の合成を可能にするオリゴヌクレオチドを意味する。
【００２０】
また、本発明で用いられる、ＤＮＡ鎖が合成される「条件」とは、逆転写酵素が逆転写酵素阻害剤によって阻害されない場合、ＲＮＡテンプレートとＤＮＡプライマーとがアニールし、オリゴヌクレオチドが合成されたＤＮＡ鎖に取り込まれるような量および温度で、ヌクレオチド、カチオンおよび適切な緩衝剤が存在することを含む。典型的な条件を下記の実施例に示す。説明された条件は、その他の既知のＲＴ／ｃＤＮＡ合成プロトコールから最適化したものである。一般的に、当業者周知のプロトコールに基づき特定の逆転写酵素反応を最適化するためにその他の条件を確立することができることがわかっている。
【００２１】
本発明で用いられる用語「プライマー対」は、２種のプライマーを意味し、センス配列とアンチセンス配列とからなる二本鎖ＤＮＡ分子におけるそれぞれの方向に対して、一方はフォワードに設計されており、他方はリバースに設計されており、それにより、本発明で説明される増幅条件下で、フォワードプライマーはセンス配列にアニールし増幅を開始し、リバースプライマーはアンチセンス配列にアニールし増幅を開始することができる。プライマーは、増幅反応で用いるために、反応の際に他方のプライマーと最小限の相補性を有し（プライマーダイマー形成を最小化するため）、Ｔｍ値が増幅方法（好ましくはＰＣＲ）に適した反応温度の範囲内にあることに基づき選択することができる。加えて、プライマーは、生じたＤＮＡ増幅産物のサイズ範囲が、１００〜５００塩基対の長さ、最も好ましくは約３００塩基対の長さになるように、ＲＮＡテンプレートの特定の領域とアニールするように選択することができる。
【００２２】
例えば、上述の条件下で、プライマー対は、配列番号１３のオリゴヌクレオチド（フォワードプライマーとして）と、配列番号１４のオリゴヌクレオチド（リバースプライマーとして）で構成されていてもよい。
【００２３】
本発明で用いられる用語である、増幅ＤＮＡを「検出すること」または増幅ＤＮＡの「検出」は、逆転写酵素が分析混合物に添加された逆転写酵素阻害剤に耐性である場合にのみ合成された増幅ＤＮＡ鎖の存在を、定性的または定量的に測定することを意味する。合成ＤＮＡの増幅は、当業界既知のあらゆるＤＮＡ検出方法で検出することができる。例えば、増幅ＤＮＡの検出は、サザンブロットハイブリダイゼーション分析、エチジウムブロマイド染色されたアガロースゲル上で特定の分子量のＤＮＡ増幅産物を可視化すること、放射標識されたヌクレオチドの合成ＤＮＡ鎖への取り込みのオートラジオグラフィまたはシンチレーション測定による測定によって可能である。
【００２４】
好ましい検出方法は、エチジウムブロマイド染色とＵＶ光下での可視化を用いたアガロースゲル電気泳動による検出方法である。
【００２５】
ＰＣＲの原理と、標的核酸の増幅および検出条件は、当業界周知であり、当業者既知の数多くの参考文献で見出すことができ、例えば、米国特許第４,６８３,１９５号；米国特許第４,６８３,２０２号、および、米国特許第４,９６５,１８８号が挙げられる（いずれもMullis等）。簡単に言えば、増幅され得る領域の両端にある標的配列に相補的な２種のオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で、標的核酸を含むと推測されるサンプルを加熱して、二本鎖核酸を変性させる。プライマーは、分離した標的鎖にアニールし、熱安定性ポリメラーゼのような重合剤によって各３’ヒドロキシル末端から伸長が起こる。二本鎖または一本鎖ＤＮＡはＰＣＲで増幅することができる。ＲＮＡはまた、ｃＤＮＡへの逆転写ＲＮＡによって標的として役立たせることもできる。
【００２６】
変性、プライマーアニーリングおよびＤＮＡ合成の工程はそれぞれ別個の温度で行われ、サイクルを繰り返すことにより、指数関数的な標的核酸の蓄積が起こる。一般的にＰＣＲ容器は、栓付きプラスチック容器、または、キュベット、または、ポーチ（米国特許第５,２２９,２９７号で説明される）である。典型的には、ＰＣＲ増幅用試薬は１つの容器中で混合され、一般的に、プライマー、ヌクレオシド三リン酸（一般的に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム含有緩衝液、および、標的核酸を含む。ＰＣＲ用試薬および条件は当業者周知であり、例えば、Guatelli等（1989年）Clin．Microbiol．Reｖ．2：217で見出すこと
ができる。ＲＮＡ標的を増幅するために、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに加えて、または、その代わりに、逆転写酵素を利用してもよい。熱安定性の逆転写酵素、および逆転写酵素活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、特に有用である。ＲＮＡ標的のＰＣＲ増幅方法は当業者既知であり、例えば、米国特許第５,１７６,９９５号、第５,３１０,６５２号、および、第５,３２２,７７０号で説明される。
【００２７】
一般的に、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの検出は、ＤＮＡをアガロースゲル、アクリルアミドゲルなどを用いた電気泳動で処理し、続いて核酸特異的な染色試薬で染色処理する方式で行われる。二本鎖ＤＮＡを検出する場合、通常は、エチジウムブロマイドのような蛍光試薬をＤＮＡの２つの鎖の間に侵入させ、続いて蛍光試薬を紫外線光源で励起させる。ＤＮＡの２つの鎖の間に侵入したエチジウムブロマイドは蛍光を放出するので、ＣＣＤカメラなどで蛍光を捕らえることによって検出が行われる。
【００２８】
本発明の目的は、７種の特定のマーカー遺伝子またはそれらのサブセットのＰＣＲによる増幅、および、この増幅産物を電気泳動することによるラダー分離（latter separation）、続いて、ゲル中でＤＮＡが十分に可視化される適切な染色技術によって達成され、このような染色技術としては、これらに限定されないが、銀塩、放射性同位体、および検出を可能にする基質を共に用いた酵素による染色が挙げられる。
【００２９】
本発明の特定の実施形態の目的は、単一の反応チャンバーで核酸の増幅反応が行われ、そこで内部プライマー対が前記標的遺伝子マーカー遺伝子の対となる領域にハイブリダイズし、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅が起こる方法を提供することである。
【００３０】
内部コントロールプライマー対は、半定量的な対照が作成できるように、適切なコントロールハウスキーピング遺伝子の対となる鎖にハイブリダイズするように設計される。このような好ましいハウスキーピング遺伝子としては、アクチン、ＧＡＤＰＨ、または、延長因子が可能である。内部コントロールシグナルの強度を測定し、それと前記遺伝子マーカー遺伝子により生じたシグナルとを比較することにより、前記遺伝子マーカー遺伝子の発現の変化の度合いを、正常な発現レベル（すなわち病気の症状がない場合のレベル）から決定することができる。
【００３１】
本発明の方法において、ＰＣＲ増幅は、適切な遺伝子特異的プライマーと熱安定性ポリメラーゼ酵素との存在下で、全ＰＣＲ試薬と標的核酸を含むサンプルをプレインキュベートすることによって達成される。得られた反応混合物を、プライマー伸長産物の形成と増幅を可能にする条件下で周期的に加熱する。
【００３２】
ＰＣＲに必要な試薬は当業者既知であり、一般的に、標的核酸の保存された領域に十分相補的でそれらにハイブリダイズすることができる少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー、４種の異なるヌクレオシド三リン酸、熱安定性の重合剤、および、重合剤に必要なあらゆる補因子が挙げられる。好ましいヌクレオシド三リン酸は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰであり、集合的にｄＮＴＰという。ヌクレオシド三リン酸は市販されている。
【００３３】
プライマーは、標的核酸へのアニーリングが可能であり、適切な条件下で、すなわちヌクレオシド三リン酸、重合剤、適切な温度、ｐＨおよび緩衝液の存在下で核酸合成の開始点として作用する天然に存在する、または、合成で生産されたオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、それらにハイブリダイズする標的核酸に十分に相補な配列を有し、重合剤の存在下で伸長産物の合成を開始させるのに十分な長さ、典型的には１０〜６０個のヌクレオチドからなる。プライマーは、当業者周知の方法で自動合成により合成的に製造可能である。
【００３４】
プライマーの設計に考慮すべき事柄は当業界周知である。プライマーは、１種のプライマーから合成された伸長産物が、その相補物から分離した際に、他方のプライマーの伸長産物のためのテンプレートとして役立ち得るように、増幅しようとする特定の核酸の鎖の配列に実質的に相補であるように選択される。好ましくは、プライマーは、標的領域と正確に相補的である。本発明の明細書、実施例および請求項で提供されたプライマー対は、本発明の範囲を逸脱することなくマーカー遺伝子への特異性を示す機能的に同等なプライマーと置き換え可能であることを特記する。
【００３５】
本発明者等は、予期せずして、全体的または部分群的な発現状態におけるその特定の変化が、炎症性腸疾患状態（ＵＣ）を示すような７種のマーカー遺伝子を同定した。これは、病気のタイプを正しく予測することにおいて検査医師の補助となるように設計された、分子レベルでの迅速な検出プロトコールの可能性を開くものである。
【００３６】
図１と下記の表１に、炎症を起こした組織、および、炎症を起こしていない組織での発現プロファイルを例示する。
【００３７】
【表１】
【００３８】
遺伝子マーカーは、溶質（solute）キャリアーファミリー６メンバー１４（ＳＬＣ６Ａ１４）、溶質キャリアーファミリー２６メンバー２（ＳＬＣ２６Ａ２）、ＣＸＣケモカイン成長関連腫瘍遺伝子−α（Ｇｒｏ−α）または（ＣＸＣＬ−１）、マトリライシン（または、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）としても知られている）、胃腸で分泌されるタンパク質（ＧＩＳＰ）（または、再生遺伝子IV型（Ｒｅｇ IV）としても知られている）、膜結合型タンパク質１７（ＭＡＰ−１７）、および、バニン（Ｖａｎｉｎ）−１である。表２を参照。
【００３９】
【表２】
【００４０】
重合剤は、プライマー伸長産物の合成が達成されるように機能する化合物である。重合剤は、熱安定性であり、すなわち、典型的にはＰＣＲでＤＮＡ鎖を変性させるのに用いられる温度（例えば９３〜９５℃）に短時間で加熱する際に一時的に不活性化され、高温で優先的に活性化される。好ましい実施形態において、重合剤は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、例えば、高温細菌、例えばサーモコッカス−リトラリス（Thermococcus litoralis）、バチルス−ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、メタノテルムス−フェルビダス（Methanothermus fervidus）、サーマス−アクアティカス（Thermus aquaticus）、Ｔ．フィリフォルミス（T．filiformis）、Ｔ．フラーブス（T．flavus）、Ｔ．ラクテウス（T．lacteus）、Ｔ．ルーベンス（T．rubens）、Ｔ．ルーベル（T．ruber）、および、Ｔ．サーモフィルス（T．thermophilus）から得られたＤＮＡポリメラーゼ；または、好熱古細菌、例えばデスルフロコッカス−モビリス（Desulfurococcus mobilis）、メタノバクテリウム−サーモオートトロフィルカム（Methanobacterium thermoautotrophilcum）、サルホロバス−ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、Ｓ．アシドカルダリウス（S．acidocaldarius）、および、サーモプラズマ−アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）から得られたＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。最も好ましい実施形態において、重合剤は、サーマス−アクアティカス（Ｔａｑ）ポリメラーゼ、サーマス・サーモフィルス（Ｔｔｈ）ポリメラーゼ、または、サーモコッカス−リトラリスポリメラーゼである。熱安定性の逆転写酵素、および、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼもまた、重合剤として考慮される。
【００４１】
熱安定性ポリメラーゼは、市販のものを入手してもよいし、または、当業界既知の方法で得てもよい。特に、Ｔａｑポリメラーゼは、組換え型と野生型で市販されており（パーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer-Cetus））、または、は、Lawyer等（1989年）、または、米国特許第４,８８９,８１８号で説明されている方法で製造することもできる。Ｔｔｈポリメラーゼは、フィンザイム社（Finnzyme Co.，フィンランド）、および、株式会社東洋紡（日本）から市販されている。サーモコッカス−リトラリスポリメラーゼは、ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）から市販されており、また米国特許第５,３２２,７８５号で説明されている方法で製造してもよい。
【００４２】
熱安定性の重合剤に特異的な抗体を、増幅の前に重合剤を阻害するための予備増幅工程に含ませてもよい。抗体は、当業者既知の方法、および、例えばHarlowe等（1988年）Antibodies：A Laboratory Manual（コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor），ニューヨーク）で見出される方法で製造することができる。本発明において、用語「抗体」は、従来の方法論でで製造されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、組換えで製造された抗体、および、化学的または組換えで製造された抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントを含む。好ましい実施形態において、抗体は、モノクローナルである。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態において、抗体は、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、または、サーモコッカス−リトラリスポリメラーゼに対するモノクローナル抗体である。より好ましい実施形態において、抗体は、Ｔａｑポリメラーゼに対するモノクローナル抗体である。Ｔａｑポリメラーゼに対するモノクローナル抗体は、当業界既知であり、例えば、米国特許第５,３３８,６７１号で説明されている。本発明において、重合剤に特異的と定義された抗体は、温度約２０〜４０℃で重合剤の酵素活性を阻害することができる抗体である。本発明の抗体は、ＰＣＲの熱サイクルの際に使用される高温により不活性化される。ポリメラーゼの酵素活性を阻害する抗体の能力は、例えばSharkey等（1994年
）により説明されているような当業者既知の分析によって測定することができる。
【００４４】
本発明は、標的核酸の増幅方法、および、場合によりそれに続く標的核酸を含むと推測されるサンプル中での核酸の検出方法を提供する。このサンプルは、標的核酸を含むと推測されるあらゆるサンプルが可能であり、例えば、組織サンプル、血液、毛髪、体液、細菌、ウイルス、真菌、細菌感染細胞、ウイルス感染細胞などである。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＰＣＲ増幅に適した位置で標的核酸の異なる鎖にハイブリダイズ可能なプライマーを設計するために、増幅され得る配列の両末端における十分な数の塩基が予めわかっていなければならない。標的核酸は、ＰＣＲの前に組織サンプルから、例えばサンプルからタンパク質または細胞形質成分を除去することによって、抽出してもよいし、または、部分的に抽出してもよい。核酸をサンプルから抽出する方法は当業者既知であり、例えば Sambrook等（1989年）、および、Saiki等（1985年）で見出すことが出来る。
【００４５】
好ましい実施形態において、材料源として、胃腸管および病気の徴候を示すと考えられている領域から切除された生検が特に好ましい。
【００４６】
本発明の増幅方法において、サンプルまたはサンプルから抽出された核酸の調製物を、一般的にＰＣＲで用いられる試薬（少なくとも１種のホスホロチオエート結合を含むように改変された少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、４種の異なるヌクレオシド三リン酸、熱安定性の重合剤、および、適切な緩衝液を含む）と接触させ、さらにエキソヌクレアーゼと接触させて反応混合物を形成する。他の実施形態において、重合剤に特異的な抗体が混合物に含まれる。
【００４７】
プライマー、ヌクレオシド三リン酸、重合剤、および、適切な緩衝液を含む従来のＰＣＲ試薬は、一般的に、ＰＣＲに適した濃度で利用され、当業者に既知である。好ましい実施形態において、ヌクレオシド三リン酸は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰである。好ましい実施形態において、重合剤は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。好ましいＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、および、サーモコッカス−リトラリスポリメラーゼである。Ｔａｑポリメラーゼが特に好ましい。
【００４８】
好ましくは、増幅方法は、連続的な自動方式で行われる。自動ＰＣＲに適した機器は当業者既知であり、例えば、米国特許第４,９６５,１８８号、第５,０８９,２３３号、および、第５,２２９,２９７号で説明されている。当業者は、容易に増幅産物を検出することができ、例えば、アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の分離、および、エチジウムブロマイド染色での可視化、または、増幅された核酸とハイブリダイズ可能な標識されたプローブを用いたハイブリダイゼーションによる検出、または、多種多様な当業者周知のその他の検出方法により検出することができる。
【００４９】
従って、本発明の一実施形態は、患者の腸の炎症を起こした領域、および、炎症を起こしていない領域から得られた生検サンプル中での遺伝子発現プロファイルの分析に基づく潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別する方法であって、本方法において、多数のマーカー遺伝子のうち少なくとも２種の発現レベルが測定され、前記少なくとも２つのマーカー遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７から選択される。
【００５０】
本発明の他の実施形態は、配列番号１と配列番号２との発現レベルを測定し、配列番号１の炎症を起こした組織での発現、および、炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う方法である。
【００５１】
本発明の第３の実施形態は、配列番号１、配列番号２および配列番号３の発現レベルを測定し、配列番号１の炎症を起こした組織での発現、および、炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如、および、配列番号３の炎症を起こした組織での発現、および、炎症を起こしていない組織での発現の欠如と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う方法である。
【００５２】
第４の実施形態は、配列番号１、配列番号２および配列番号４の発現レベルを測定し、配列番号１の炎症を起こした組織での発現、および、炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如、および、配列番号４の炎症を起こした組織での発現、および、炎症を起こしていない組織での発現の欠如と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う方法である。
【００５３】
第５の実施形態は、配列番号１〜７の発現レベルを測定し、配列番号１、３、４、５、６および７の炎症を起こした組織での発現、および、炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う方法である。
【００５４】
好ましい実施形態において、上記実施形態のいずれか１つの方法は、遺伝子特異的プライマーを用いた前記遺伝子の核酸の増幅、および、増幅結果の決定により、各マーカー遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む。核酸の増幅は、好ましくは、ＰＣＲを用いて、および、好ましくは配列番号１３〜２６から選択される遺伝子特異的プライマーを用いて行われる。
【００５５】
増幅結果の決定は、好ましくは、エチジウムブロマイド染色とＵＶ光下での可視化を用いて行われる。
【００５６】
本発明はさらに、同一または別個のコンテナーに、熱安定性の重合剤、および、前記標的遺伝子がＰＣＲで増幅可能なように設計されたプライマー対を含むＰＣＲ用キットを提供する。例えば、ＰＣＲ重合剤およびＰＣＲ用試薬（例えばヌクレオシド三リン酸、プライマーおよび緩衝液）に特異的な追加の抗体を含めるために、追加のコンテナーが提供されてもよい。
【００５７】
その結果として、本発明は、患者の腸の炎症を起こした領域、および、炎症を起こしていない領域から得られた生検サンプル中での遺伝子発現プロファイルの分析に基づく潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別するためのキットを利用可能にし、前記キットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７から選択される少なくとも２つのマーカー遺伝子に向けられた遺伝子特異的プライマー対を含む。
【００５８】
前記遺伝子特異的プライマー対は、好ましくは、配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；配列番号１７および配列番号１８；配列番号１９および配列番号２０；配列番号２１および配列番号２２；配列番号２３および配列番号２４；および、配列番号２５および配列番号２６から選択される。
【００５９】
本発明の一実施形態において、前記特異的プライマーは、配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；ならびに、配列番号１７および配列番号１８である。
【００６０】
本発明の他の実施形態において、前記特異的プライマーは、配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；ならびに、配列番号１９および配列番号２０である。
【００６１】
本発明に係るキットは、好ましくは、熱安定性の重合剤および必要な補因子をさらに含む。好ましい実施形態において、重合剤は、ＤＮＡポリメラーゼである。より好ましい実施形態において、ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、または、サーモコッカス−リトラリスポリメラーゼである。Ｔａｑポリメラーゼが特に好ましい。好ましい抗体は、Ｔａｑポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体である。
【００６２】
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、１９〜２５個のヌクレオチドの長さであり、標準的な条件下で、前記遺伝子マーカー遺伝子の標的ＤＮＡにアニールし得るプライマー対として設計される。この場合、７種の前記遺伝子マーカー遺伝子がうまく増幅されるような７種のプライマー対が提供される。用いられた特異的プライマーを表３に示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】
開示された遺伝子マーカーは、溶質キャリアーファミリー６メンバー１４（ＳＬＣ６Ａ１４）（配列番号１で示される）、溶質キャリアーファミリー２６メンバー２（ＳＬＣ２６Ａ２）（配列番号２で示される）、ＣＸＣケモカイン成長関連腫瘍遺伝子−α（Ｇｒｏ−α）または（ＣＸＣＬ−１）（配列番号３で示される）、マトリライシン（または、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）として知られており、配列番号４で示される）、胃腸で分泌されるタンパク質（ＧＩＳＰ）（または、再生遺伝子IV型（Ｒｅｇ IV）としても知られている）（配列番号５で示される）、膜結合型タンパク質１７（ＭＡＰ−１７）（配列番号６で示される）、および、バニン−１（配列番号７で示される）である。上記の表２を参照。
【００６５】
実施例で説明される方法において、多数の方法に基づく配列を用いた。これらを表４に示す。
【表４】
【００６６】
溶質キャリアー（ＳＬＣ）タンパク質は、エネルギー依存性の輸送分子の極めて大きいファミリーを構成しており、栄養素の輸送において重要な生理学的な役割を有し、薬物吸収を増加させるメカニズムとして利用されることもある。しかしながら、これらタンパク質の分子レベルでの理解は、高解像度の結晶構造がないために限定的である。
【００６７】
総じて、腎結石に罹っている成人の１〜２％、および、子供の６〜８％は、シスチン尿症、アミノ酸輸送の異常があり、それによって尿中にシスチンが高濃度になる。２種の遺伝子、すなわち、アミノ酸輸送体系に関連するタンパク質をコードする、溶質キャリアーファミリー３（シスチン、塩基性および）中性アミノ酸輸送体、メンバー１（ＳＬＣ３Ａ１）、および、溶質キャリアーファミリー７、メンバー９（ＳＬＣ７Ａ９）が関係している。これら溶質キャリアーはいずれも、尿路感染を引き起こし最終的には腎不全を引き起こす石形成に関与すると考えられている。
【００６８】
本発明者等は、２種の既知の溶質キャリアー（ＳＬＣ６Ａ１４およびＳＬＣ２６Ａ２）の発現がＩＢＤで有意に変化することを同定した。これは、本発明者等の知る限り、炎症性腸疾患に溶質キャリアーが関与する可能性があることについて最初の報告である。それゆえに、溶質キャリアーがＩＢＤの病因の一因であり得るということは、新規の発見である。
【００６９】
ＣＸＣケモカイン成長関連腫瘍遺伝子−α（Ｇｒｏ−α、または、ＧＲＯ１として知られている）は、サイトカインと説明されており、そのようなものとして、炎症の局所的領域において数多くの細胞型の移動性の反応を改変させることができる。さらに、ヒトの炎症を起こした角膜において過剰発現されることも説明されており（Spandau等，2003年）
、加えて、消化管の炎症を示すように化学的に誘導されたラットは、ＧＲＯ１レベルのアップレギュレートを示すことも示されている（Hirata等，2001年）。ｃＤＮＡマイクロアレイアプローチを用いて、ケモカインＧｒｏαのリウマチ様関節炎および炎症性腸疾患における新たな関与が説明されているが（Heller等，1997年）、本明細書において示される本発明は、ＧＲＯ１は、ＵＣ状態においては過剰発現されるが、ＣＤ状態ではダウンレギュレートされることを、本発明者等の知る限りにおいて、初めて説明する。Isaacs等，１９９２年では、ＵＣにおけるＧＲＯ１の発現はＣＤでみられるよりも高いことが説明されているが、本発明では、ＧＲＯ１発現レベルに関し、ＵＣとＣＤとに逆の相間性があることを実証した。最後に、Lawrence等，２００１年では、ＵＣにおいてアップレギュレートされるＧＲＯ１を同定することを説明しているが、この研究の設計では、生検サンプルが分析前にプールされるために、２人以上の患者においてＧＲＯ１がアップレギュレートされるのかどうかを知ることは不可能である。
【００７０】
マトリライシン（または、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７）は、内巻きのラットの子宮で最初に発見され、これは、子宮メタロプロテイナーゼ、推定のメタロプロテイナーゼ（Ｐｕｍｐ−１）、および、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ−７）としても知られている。これは、いずれも細胞外マトリックスの高分子のほとんどを分解することができる１５種のＭＭＰファミリーの最小のメンバー（２８ｋＤａ）である。このファミリーは、簡単には以下のように総論される；全てのメンバーは、システインでブロックされた活性部位の亜鉛を有する酵素原の形態で生じる亜鉛メタロプロテイナーゼである。マトリライシンは、マトリックスの多種多様なゼラチン、プロテオグリカンおよび糖タンパク質を分解させることができ、コラゲナーゼなどの数種のその他のＭＭＰを活性化することができる（Woessner，1996年に総論されている）。
【００７１】
これは、様々なタイプのガン、例えば結腸、胃、前立腺および脳のガンにおいて頻繁に発現される。これまでの研究によれば、マトリライシンは、結腸ガンの進行および転移において重要な役割を果たすことが示されている。近年、Newell等，２００２年により、ＵＣ関連の異常増殖の様々な期でマトリライシン発現の増加が起こることが説明されている。しかしながら、この研究は、このような発現の増加は、ＵＣの結果なのか、または、むしろ異常増殖の存在によるものなのかを決定してはいない。
【００７２】
膜結合型タンパク質１７（ＭＡＰ−１７）（またはＤＤ９６としても知られている）は、小さいタンパク質であるが、これまでその機能は説明されていない。ＧＩＳＰに関して、これもまたほとんどわかっていない。いずれにおいても、炎症に関与する可能性があることは説明されていない。
【００７３】
パントテイナーゼ（Pantetheinase）（ＥＣ３.５.１.）は、遍在的な酵素であり、インビトロで、パントテン酸（ビタミンＢ５）をリサイクルし、システアミン、有効な抗酸化剤を生産することが示されている。この酵素は、バニン−１遺伝子でコードされており、マウス組織で広く発現される。バニン−１は、ＧＰＩアンカーパントテイナーゼであり、従って細胞外酵素である。バニン／パントテイナーゼは、恐らくは酸化的ストレス応答の観点で、いくつかの免疫機能の調節に関与する可能性があることが示唆されている（Pitari等，2000年）。
【００７４】
本発明者等の知る限り、これは、ＩＢＤにおけるバニン−１の可能性のある役割を初めて説明するものである。
【００７５】
本発明を特定の好ましい実施形態に従って特に説明したが、以下の実施例は、単に本発明を説明することを意図したものであって、本発明を限定するものではない。これらは使用可能な方法および方法の工程の典型であって、当業者既知のその他の方法および方法の工程を、不適当な実験を行わうことなく取り入れることが可能である。
【実施例】
【００７６】
実施例１．生検材料の収集
ＣＤまたはＵＣの炎症状態を有する臨床的および病理学的な証拠に基づき選択された患者から生検を採取した。一人の患者の結腸の炎症を起こした部位から、トータルで３つの生検を、炎症を起こしていない領域からの３つの生検サンプルと共に収集した。これをトータルで１６人の異なる患者に行い、ここで、１６人のうち８人はＣＤと診断されており（患者１〜８）、残りの８人はＵＣと診断されている（患者９〜１６）。ＵＣ患者群は、女性２人および男性６人からなり、年齢の範囲は２９〜７７歳であった。同様に、ＣＤ患者群は、女性３人および男性５人からなり、年齢の範囲は２７〜５９であった。
【００７７】
１人の患者の各解剖部位からの生検をプールし、キアゲン（Quiagen）Rneasyキットと
、ペレット・ペステル（Pellet Pestel）のモーターホモジナイザーを製造元のプロトコ
ールに従って用いてトータルＲＮＡを単離した。この方法で、トータルＲＮＡを、患者１人あたり２サンプル（炎症を起こした（標的）、および、炎症を起こしていない（コントロール））で、計３２サンプルを単離した。
【００７８】
実施例２．ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成の実行
各ＲＮＡサンプル（トータルで３２）の２μｇを、第一の鎖のｃＤＮＡ合成で用いて、１０ｐＭのオリゴ−ｄＴ−プライマーｄＴ−ジョイント（５’−ＴＡＧ ＴＣＴ ＡＴＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＧＣ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＧＧ ＡＧＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＶ−３’（配列番号８）を用いて、各合成ｃＤＮＡ分子に３種の制限酵素切断部位：ＳａｌＩ、ＮｏｔＩおよびＢｐｍＩを導入した。緩衝液、デゾキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、および、酵素の逆転写酵素（スーパースクリプト（Superscript）II）は、ギブコ・ＢＲＬ（Gibco BRL）から購入し、製造元のガイドラインに従って反応を行った。酵素を除く第一の鎖の合成のための反応混合物を、ＰＣＲ機（ＰＣＲスプリント（PCR sprint），Hybaid製）で、６５℃で５分間プレインキュベートし、氷上で冷却し、次に、４２℃に予備加熱し、その後、酵素スーパースクリプトIIを加え、ＰＣＲ機（ＰＣＲスプリント，Hybaid製）で、４２℃で１時間インキュベートした。
【００７９】
第二の鎖の合成のために、提供されたプロトコール（ギブコ・ＢＲＬ）に従って、第二の鎖の緩衝液ミックス（４１μｌ）を反応液に加え、４μｌのＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ（ニューイングランドバイオラボ）、１.５μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ）、および、０.７μｌのＲＮアーゼＨ（ギブコ・ＢＲＬ）で総体積を１６０μｌにした。ＰＣＲ機ＰＣＲスプリントで、１６℃で２.５時間反応液をインキュベートし、次に、提供されたプロトコールに従ってキアゲンＰＣＲ精製キットを用いて精製した。各サンプル（トータルで３２）を溶出緩衝液（３２μｌ）で溶出させ、各サンプル（２６μｌ）を以下の工程で用いた。
【００８０】
実施例３．ｃＤＮＡの３’末端の増幅
このような生検から得られた材料の量は限定されているため、予備増幅工程が必要であった。ｃＤＮＡの３’末端をインビトロで増幅するため、各サンプルからのｃＤＮＡ（２６μｌ）を、体積３０μｌで、制限酵素Ｄｐｎ II（１０Ｕ）で、３７℃で３時間消化した。切断されたｃＤＮＡを、キアゲンＰＣＲ精製キットを用いて１回以上精製し、ｃＤＮＡを溶出緩衝液（４７μｌ）中で溶出させた。以下の環化ライゲーション工程を、Ｄｐｎ IIで切断したｃＤＮＡ（４４μｌ）と、２０００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ）を含む体積５０μｌで行った。これら反応混合物を２２℃で１時間インキュベートし、６５℃で１０分間加熱して不活性化し、各反応混合物の２５μｌを増幅工程で用いた。１サンプルあたり５回の反応混合物を一つに合わせ（５×５０μｌ＝トータルで２５０μｌ）、これには、２５μｌのｃＤＮＡ（Ｄｐｎ IIで切断し環状にライゲートした）、２５μｌの１０×アドバンテージ（Advantage）２ＰＣＲ緩衝液（クロンテック（Clontech））、５μｌのジョイント−Ｎｏｔプライマー（１０ｐモル／μｌ；５’−ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＧＧ−３’（配列番号９））、５μｌのジョイント−Ｓａｌプライマー（１０ｐモル／μｌ；５’−ＴＴＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＧＡ ＴＣ−３’（配列番号１０）、５ｐｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、および、５μｌの５０×アドバンテージ２Ｔａｑ−ポリメラーゼ（クロンテック）が含まれる。各サンプルに、このミックスを５個のＰＣＲ反応チューブに分配し、以下の条件下でＰＣＲを行った：９４℃で１分間、次に、１６×（９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で１分間）。
【００８１】
１サンプルあたり４個の反応液を取り出して氷上に置き、１サンプルあたり１個の反応液を用いて最適なサイクル数を決定した。最適なサイクル数は、全３２サンプルにおいて１８サイクルと決定されたので、残りの１サンプルあたり４個の反応液には、２つの追加サイクル［２×（９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で１分間）］を行った。引き続き、１サンプルあたり４個のＰＣＲ反応液をキアゲンＰＣＲ精製キットを用いて精製した。精製のために、１サンプルあたり４個の反応液をプールし（トータルで２００μｌ）、次に、溶出緩衝液（３４μｌ）で溶出させた。精製した反応液を、差別的に発現された遺伝子の同定プロトコールのための出発材料とした。
【００８２】
実施例４．ヒト生検からの差別的に発現されたｃＤＮＡの単離（サブトラクションプロトコール）
差別的に発現されたｃＤＮＡの単離を、von Stein O.D.，２００１年で概説されたプロトコールに従って行った（多少のプロトコール改変を含む）。
【００８３】
実施例５．差別的に発現された遺伝子のスクリーニング
ｃＤＮＡライブラリー構築において、各サブトラクションから２.０００個のクローンを、１個の２２ｃｍ2寒天プレートにプレーティングした。これらプレートから、３８４個のコロニーをピックアップし、バイオロボティクス（バイオロボティクス）（ケンブリッジ，ＵＫ）のバイオピック（BioPick）機を用いて、ウェルあたり７０μｌのＬＢ培地を含む３８４ウェルのプレートに撒いた（Maniatis等，Molecular cloning laboratory book, Appendix A.1を参照）（＋アンピシリン１００ｍｇ／ｍｌ）。細菌クローンを３７℃で一晩インキュベートし、次に、コロニーＰＣＲで用いた。このＰＣＲは、３８４ＰＣＲウェルプレートで、１サンプルあたり体積２０μｌで行われた。１つのＰＣＲ反応は、１０×ＰＣＲ緩衝液（２μｌ）、０.４μｌのSport-Notプライマー（１０ｐモルの５’−ＣＧＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＴＡＧＡ ＧＣ−３’（配列番号１１）、０.４μｌのＳｐｏｒｔ−Ｓａｌプライマー（１０ｐモルの５’−ＴＧＣ ＡＧＧ ＴＡＣ ＣＧＧ ＴＣＣ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＣ−３’（配列番号１２））、１.６μｌのｄＮＴＰミックス（各２５ｍＭ）、０.４μｌの０.１％ブロモフェノールブルー、および、０.５μｌのＤｙｎＡｚｙｍｅ Ｔａｑ−ポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ；フィンザイム）を含む。全反応液のためのマスターミックスを製造し、分配し、次に、３８４個のプラスチック製レプリカで播種した。ＰＣＲサイクルパラメーターは、以下の通りである：９４℃で２分間、３７回（９４℃で３０秒間；５０℃で３０秒間、７２℃で１分間）、および、７２℃で５分間。
【００８４】
増幅の後、バイオロボティクスのマイクログリッド（Microgrid）ＴＡＳを用いて、ハイボンド（Hybond）Ｎ＋メンブレン（アマシャム（Amersham））上にＰＣＲ反応液をスポットした。全てのクローンを二連でスポットし、ガイド用ドットとしてゲノムＤＮＡを用いた。１つのフィルター上で、全ての４個のサブトラクションの３８４個の遺伝子を配置させた。異なる放射活性ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション分析のために、２４個の複製を作成した。
【００８５】
次に、これらフィルターを、全ての８人の患者のサブトラクションされた放射活性標識ｃＤＮＡとハイブリダイズした。１６の異なるハイブリダイゼーション実験で、１６個のフィルターを用いた。そのため、ｃＤＮＡ（１μｌ）をクレノーポリメラーゼでの標識に用いた。ハイブリダイゼーションプロトコールは、MaxamおよびGilbert，1984年で概説されているチャーチ（Church）−プロトコールであった。
【００８６】
ホスホイメージャー・フジフィルム（Fuji film）ＢＡＳ１８００ IIを、ＢＡＳ１８００ III Ｒプログラム、および、アレイ（Array）バージョン６.０（イメージング・リサーチ社（Imaging Research Inc））と共に用いて、差別的な発現の度合いを測定した。８人の患者のうち少なくとも３人において誘導率または減少率が３倍で差別的に発現された遺伝子を配列解析し、ＢＬＡＳＴ分析を行い、これらの単離された差別的に発現された遺伝子を同定した。
【００８７】
実施例６．適正な差別的な発現の確認
これらの分析で、数種の遺伝子が強い調節障害を示した。これらのデータを確認するために、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドと、同じ８人の患者から得られた非増幅ｃＤＮＡ材料を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。炎症を起こした組織、および、炎症を起こしていない組織（サブトラクションで用いらたものと同じ）の、およそ２μｇのトータルＲＮＡが、実施例５で説明された第一の鎖ｃＤＮＡ合成のために採取された。ｃＤＮＡ合成後、サンプルを９６℃で３分間インキュベートし、次に、蒸留水で１：１０に希釈した。
【００８８】
１０μｌのさらなる１：１０の希釈液を、１個のＰＣＲ反応液（５０μｌ）のために取った。このＰＣＲ反応液は、以下を含む：５μｌの１０×ＰＣＲ 緩衝液、１μｌのフォワードプライマー（１０ｐモル／μｌ）、および、１μｌの特異的遺伝子（配列番号１〜７）のリバースプライマー（１０ｐモル／μｌ）、０.５μｌのｄＮＴＰミックス（各２５ｍＭ）、および、０.５μｌのＤｙｎＡｚｙｍｅ Ｔａｑ−ポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ；フィンザイム）。反応のためのｃＤＮＡを除いたマスターミックスを製造し、分配し、次に、ｃＤＮＡを加えた。ＰＣＲサイクルパラメーターは以下の通りである：９４℃で１分間、２６〜３５回（９４℃で３０秒間；５５℃で３０秒間、７２℃で１分間）、および、７２℃で５分間。サイクル数は、遺伝子フラグメントが増幅されるかどうかによって変化させた。プライマー対は、表３で示したものであった。
【００８９】
これらの分析により、正常な組織と比較して全体的または部分群的な発現状態の変化により、ＵＣに関して９０％超の正しい予測率が考察できる７種の遺伝子マーカーが同定される。これらの発見を確認するために、これらマーカーを、より大規模な生検サンプル収集に対してさらにスクリーニングした。
【００９０】
実施例７．ハイスループットスクリーニング
８人のＵＣ患者と３人のＣＤ患者のｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの予備的な結果（実施例６を参照）を確認するために、全ての単離された遺伝子の発現を大規模に分析することを決定した。その目的のために、スクリーニングで単離され得る全ての遺伝子を、ハイボンドＮ＋メンブレン（アマシャム）に、マイクログリッドＴＡＳ（バイオロボティクス）を用いてスポットした。実施例５で説明したように、スポットのために、遺伝子をコロニーＰＣＲで増幅した。
【００９１】
次に、このマスターフィルターメンブレンを２４０回合成し、ＵＣ患者５０個体とＣＤ患者５０個体からの生検から得られた放射活性標識ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。生検は、患者の結腸の左側の炎症を起こした領域、および、炎症を起こしていない領域から採取された。基準のコントロールとして、５人の健康な人の結腸の左側から得られた生検をプールした。
【００９２】
実施例８．盲検試験による検証
より大きい統計学的な重要性を提供するために、その生検がＵＣまたはＣＤに罹った患者から得られたものかどうかがわかっていない「盲目」生検サンプルで７種の遺伝子マーカーの発現分析を行うことが必要であった。上述したように、前記遺伝子マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、前記遺伝子マーカーから得られた発現パターンの全画像を総合したところ、９０％超の確実性で正しいＩＢＤ型の決定が可能であった。
【００９３】
結果の分析（盲検試験）により、配列番号１および２の組み合わせでも信頼できる結果が得られたが、配列番号１、２および３の組み合わせ、または、配列番号１、２および４の組み合わせでさらに改善された結果が得られたことが示された。予備的な結果により、配列番号１，２，３および４の組み合わせを用いたところ約９０％の精度が達成されたことが示された。配列番号１〜７の完全なセットを用いたところ、９０％超の精度が得られたことが示された。
【００９４】
本発明を現在本発明者等が知る最良の形態を構成する好ましい実施形態の観点で説明したが、当業者に明白と思われる様々な変化および改変が、添付の請求項に記載の本発明の範囲を逸脱することなくなされ得ると理解されるべきである。
【００９５】
参考文献
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Woessner, J.F. Jr., Regulation of matrilysin in the rat uterus. Biochem Cell Biol. 1996;74(6):777-84.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患の診断に関し、特に、潰瘍性大腸炎を予想および／または診断する方法およびキットに関する。本発明は、全体的または部分群的いずれかの発現状態の変化が潰瘍性大腸炎を示すような特定のマーカー遺伝子を開示する。本発明はさらに、前記病気に関連するマーカー遺伝子の発現レベルを直接生検から定量化することにより、病気のタイプに関する迅速で正確な診断テストおよび／または特定の治療計画の効果の評価を可能にするＤＮＡ関連方法に関する。本発明はさらに、前記遺伝子の発現レベルを検出するための診断キットを開示する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、消化管における慢性炎症に関与する数種の状態をを含む用語である。最も衰弱性のＩＢＤの形態のうち２種は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）と、クローン病（ＣＤ）である。これらの病気は、若年層に影響を及ぼし、その典型的な発症は２０〜３０歳代であり、現在のところいずれの状態に対しても治療法がないため、病気の管理は患者と医師両方にとって長期にわたる献身である。約３０％のＩＢＤ患者が、一生のうちに外科処置を受け、長期にわたりＩＢＤに罹っている患者は、結腸直腸のガンを発症させる危険がかなりある。今日、１０人のＩＢＤ患者うち３人は、利用可能な最善の薬物療法を高用量で用いたとしても反応せず、かなりの副作用を引き起こす。
【０００３】
活動性ＵＣに罹った患者の治療は、炎症を減少させ、結腸の治癒と粘膜の回復を促進することを目的としている。ＵＣの根本的な原因が不明であるだけでなく、何がこの病気にその非活動性型と活動性型とを繰り返させるきっかけになっているのかもわかっていない。しかしながら、この病気の活動性期は、粘膜の顕著な炎症を特徴とし、細胞の透過性、タンパク質と体液の損失を高める。重症期では、腹部の圧痛、頻脈、発熱および腸穿孔の危険を伴い、腸壁の深い炎症が生じる可能性がある。
【０００４】
潰瘍性大腸炎の初期症状の１つは、便に血液または粘液の排出を伴う便秘である。腹部痛を伴う下痢を発症するまでに、数ヶ月または数年が経過する場合がある。後期の症状としては、重度の疲労，体重の減少、食欲の減退、発熱、場合によっては関節痛が挙げられる。
【０００５】
潰瘍性大腸炎の確立された診断への道はしばしば、患者の病歴の徹底的な研究、その他の状態の排除、および、数種の試験、例えば血液試験、検便、バリウム注腸Ｘ線、Ｓ状結腸鏡検査、結腸鏡検査、および、生検を含む。生検は、Ｓ状結腸鏡検査または結腸鏡検査試験の一環として行ってもよい。
【０００６】
初期段階でＵＣと結腸のＣＤとを臨床的に識別する可能性は、患者と医師の両方に多大な利点を提供し得ることは明らかである。この可能性により、正確な治療計画の設計を可能にし、不必要な薬物療法を防ぎ、治療コストを減少させることができる。総合的なＩＢＤ患者の臨床像において主要なＵＣ患者群とＣＤ患者群との間で臨床的に重要ないくつかの差が示されたとしても、実質的に類似しているため、ヘルスケア系の従事者にとって正しい診断を確立することを難しくしている。
【０００７】
従来技術
従来技術によれば、ＩＢＤの型を識別する、特にＵＣとＣＤとを識別する利用可能な方法は、上述の様々な試験方法の例を除いて、抗体に基づく方法に焦点を合わせていることが示されている。
【０００８】
例えば、ＷＯ０３／０３６２６２では、クローン病のマーカーとして糞便の抗サッカロミセス・セレビジエ抗体（ＡＳＣＡ）の存在を用いた、クローン病を潰瘍性大腸炎や過敏性腸症候群のようなその他の胃腸疾患と識別するための方法および装置が提供されること、を説明している。この装置は、ヒト糞便サンプル中の総内因性ＡＳＣＡを測定するための、ヒトイムノグロブリンに特異的な抗体を利用する酵素結合免疫検査法またはその他の免疫検査法を含む。この方法および装置は、ヘルスケア供給者によって、クローン病を潰瘍性大腸炎および過敏性腸症候群のようなその他の胃腸疾患と識別するのに使用可能である。
【０００９】
ＷＯ０１／５８９２７では、罹患した組織のｈＴＭに対する自己抗原反応に関する病気、特に潰瘍性大腸炎を検出するための診断方法を説明している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
正確で迅速で信頼できる潰瘍性大腸炎の診断のための、特にＩＢＤ患者において潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別するという観点で改善された方法の必要性が未だにある。
【００１１】
本発明の目的の１つは、この目的のためのこのような方法およびキットを利用可能にすることである。１つの特定の目的は、病気の初期段階において信頼できる診断に到達できるような方法およびキットを利用可能にすることである。その他の目的は、臨床像が極めて類似し得るような困難なケースにおいても、ＣＤとＵＣとの識別を可能にすることである。
【００１２】
本発明の基礎となるさらなる目的、同様に、本発明が提供する解決方法、および、関連する利点は、本発明の説明、実施例および請求項を研究すれば当業者にとって明白となり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、驚くべきことに、潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別することは、患者の腸の炎症を起こした領域、または場合により炎症を起こしていない領域から得られた生検サンプルの遺伝子発現プロファイルを研究する多重遺伝子法によって可能になることを見出した。
【００１４】
本発明は、全体的または部分群的いずれかでヒトの潰瘍性大腸炎（ＵＣ）状態を示す可能性のあるマーカー遺伝子の発見に基づく。本発明者等は、驚くべきことに、多数の特定の遺伝子の発現レベルの定量化が、患者がＵＣまたは例えばクローン病の状態に罹っているかどうかを生検から正確かつ簡便に診断することに利用可能であることを見出した。
【００１５】
より特定には、前記遺伝子マーカーの発現レベルを半定量化することが可能な予め選択された遺伝子特異的プライマーを用いて、７種の異なる遺伝子マーカーまたはそれらのサブセットの核酸の増幅を可能にする方法を提供する。遺伝子特異的プライマーは、所定の遺伝子マーカーをコードするＤＮＡの対となる鎖にハイブリダイズし、ＰＣＲ増幅によって遺伝子マーカー遺伝子のコードＤＮＡの定義された領域が生産されるように設計される。生物学的サンプル中の、前記７種のマーカー遺伝子またはそれらのサブセットの発現状態を検出およびモニターするための分析およびキットを提供する。この分析は、前記マーカー遺伝子を検出するための、培養ではなくＰＣＲに基づいた分析である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病（ＣＤ）のいずれかに罹った患者からの生検サンプルにおける、７種のマーカー遺伝子の発現状態のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【００１７】
図面の説明
本発明は、添付の図面を参照しながら、以下の詳細な説明および実施例でより詳細に説明される；
図１は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病（ＣＤ）のいずれかに罹った患者からの生検サンプルにおける、７種のマーカー遺伝子の発現状態のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。実験プロトコールを実施例６で概説する。（記号：Ｍは、塩基対マーカー、Ｈは、全体的に正常で健康な個体からの生検を示し、Ｉは、炎症を起こした領域から採取した生検サンプルを示し、Ｎは、同じ患者の炎症を起こしていない領域から採取した生検を示す。図の下部の数字は患者数を示し、縦の黒い線は、同じ患者から得られたＮおよびＩの生検サンプルを示す）。ガンマアクチンをローディングコントロールとして用いたが、これは、全てのＲＴ−ＰＣＲ反応で等しいｍＲＮＡ投入量を実証するのに一般的に用いられるハウスキーピング遺伝子の発現状態を示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明を開示および説明する前に、当業者であれば、本発明は、目的を実行し、上述の結果および利点が得られるように、同様に、本発明に固有の目的を実行し、その結果および利点が得られるようにうまく改変されることは容易に理解し得る。本発明の実施例、同様に、本発明で説明される方法、手順、治療、分子、および、特定の化合物は、現状での好ましい実施形態の典型であり、代表であって、本発明の範囲を限定するような意図はない。当業者が考慮し得るそれらへの変化およびその他の用途は、特許請求の範囲で定義された本発明の本質に包含される。
【００１９】
本発明で用いられる用語「相補ＤＮＡプライマー」は、本発明で説明される条件下で、生物学的サンプル中で、ＲＮＡテンプレートに特定の方向でアニールし、逆転写酵素の存在下で新生ＤＮＡ鎖の合成を可能にするオリゴヌクレオチドを意味する。
【００２０】
また、本発明で用いられる、ＤＮＡ鎖が合成される「条件」とは、逆転写酵素が逆転写酵素阻害剤によって阻害されない場合、ＲＮＡテンプレートとＤＮＡプライマーとがアニールし、オリゴヌクレオチドが合成されたＤＮＡ鎖に取り込まれるような量および温度で、ヌクレオチド、カチオンおよび適切な緩衝剤が存在することを含む。典型的な条件を下記の実施例に示す。説明された条件は、その他の既知のＲＴ／ｃＤＮＡ合成プロトコールから最適化したものである。一般的に、当業者周知のプロトコールに基づき特定の逆転写酵素反応を最適化するためにその他の条件を確立することができることがわかっている。
【００２１】
本発明で用いられる用語「プライマー対」は、２種のプライマーを意味し、センス配列とアンチセンス配列とからなる二本鎖ＤＮＡ分子におけるそれぞれの方向に対して、一方はフォワードに設計されており、他方はリバースに設計されており、それにより、本発明で説明される増幅条件下で、フォワードプライマーはセンス配列にアニールし増幅を開始し、リバースプライマーはアンチセンス配列にアニールし増幅を開始することができる。プライマーは、増幅反応で用いるために、反応の際に他方のプライマーと最小限の相補性を有し（プライマーダイマー形成を最小化するため）、Ｔｍ値が増幅方法（好ましくはＰＣＲ）に適した反応温度の範囲内にあることに基づき選択することができる。加えて、プライマーは、生じたＤＮＡ増幅産物のサイズ範囲が、１００〜５００塩基対の長さ、最も好ましくは約３００塩基対の長さになるように、ＲＮＡテンプレートの特定の領域とアニールするように選択することができる。
【００２２】
例えば、上述の条件下で、プライマー対は、配列番号１３のオリゴヌクレオチド（フォワードプライマーとして）と、配列番号１４のオリゴヌクレオチド（リバースプライマーとして）で構成されていてもよい。
【００２３】
本発明で用いられる用語である、増幅ＤＮＡを「検出すること」または増幅ＤＮＡの「検出」は、逆転写酵素が分析混合物に添加された逆転写酵素阻害剤に耐性である場合にのみ合成された増幅ＤＮＡ鎖の存在を、定性的または定量的に測定することを意味する。合成ＤＮＡの増幅は、当業界既知のあらゆるＤＮＡ検出方法で検出することができる。例えば、増幅ＤＮＡの検出は、サザンブロットハイブリダイゼーション分析、エチジウムブロマイド染色されたアガロースゲル上で特定の分子量のＤＮＡ増幅産物を可視化すること、放射標識されたヌクレオチドの合成ＤＮＡ鎖への取り込みのオートラジオグラフィまたはシンチレーション測定による測定によって可能である。
【００２４】
好ましい検出方法は、エチジウムブロマイド染色とＵＶ光下での可視化を用いたアガロースゲル電気泳動による検出方法である。
【００２５】
ＰＣＲの原理と、標的核酸の増幅および検出条件は、当業界周知であり、当業者既知の数多くの参考文献で見出すことができ、例えば、米国特許第４,６８３,１９５号；米国特許第４,６８３,２０２号、および、米国特許第４,９６５,１８８号が挙げられる（いずれもMullis等）。簡単に言えば、増幅され得る領域の両端にある標的配列に相補的な２種のオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で、標的核酸を含むと推測されるサンプルを加熱して、二本鎖核酸を変性させる。プライマーは、分離した標的鎖にアニールし、熱安定性ポリメラーゼのような重合剤によって各３’ヒドロキシル末端から伸長が起こる。二本鎖または一本鎖ＤＮＡはＰＣＲで増幅することができる。ＲＮＡはまた、ｃＤＮＡへの逆転写ＲＮＡによって標的として役立たせることもできる。
【００２６】
変性、プライマーアニーリングおよびＤＮＡ合成の工程はそれぞれ別個の温度で行われ、サイクルを繰り返すことにより、指数関数的な標的核酸の蓄積が起こる。一般的にＰＣＲ容器は、栓付きプラスチック容器、または、キュベット、または、ポーチ（米国特許第５,２２９,２９７号で説明される）である。典型的には、ＰＣＲ増幅用試薬は１つの容器中で混合され、一般的に、プライマー、ヌクレオシド三リン酸（一般的に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム含有緩衝液、および、標的核酸を含む。ＰＣＲ用試薬および条件は当業者周知であり、例えば、Guatelli等（1989年）Clin．Microbiol．Reｖ．2：217で見出すこと
ができる。ＲＮＡ標的を増幅するために、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに加えて、または、その代わりに、逆転写酵素を利用してもよい。熱安定性の逆転写酵素、および逆転写酵素活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、特に有用である。ＲＮＡ標的のＰＣＲ増幅方法は当業者既知であり、例えば、米国特許第５,１７６,９９５号、第５,３１０,６５２号、および、第５,３２２,７７０号で説明される。
【００２７】
一般的に、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの検出は、ＤＮＡをアガロースゲル、アクリルアミドゲルなどを用いた電気泳動で処理し、続いて核酸特異的な染色試薬で染色処理する方式で行われる。二本鎖ＤＮＡを検出する場合、通常は、エチジウムブロマイドのような蛍光試薬をＤＮＡの２つの鎖の間に侵入させ、続いて蛍光試薬を紫外線光源で励起させる。ＤＮＡの２つの鎖の間に侵入したエチジウムブロマイドは蛍光を放出するので、ＣＣＤカメラなどで蛍光を捕らえることによって検出が行われる。
【００２８】
本発明の目的は、７種の特定のマーカー遺伝子またはそれらのサブセットのＰＣＲによる増幅、および、この増幅産物を電気泳動することによるラダー分離（latter separation）、続いて、ゲル中でＤＮＡが十分に可視化される適切な染色技術によって達成され、このような染色技術としては、これらに限定されないが、銀塩、放射性同位体、および検出を可能にする基質を共に用いた酵素による染色が挙げられる。
【００２９】
本発明の特定の実施形態の目的は、単一の反応チャンバーで核酸の増幅反応が行われ、そこで内部プライマー対が前記標的遺伝子マーカー遺伝子の対となる領域にハイブリダイズし、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅が起こる方法を提供することである。
【００３０】
内部コントロールプライマー対は、半定量的な対照が作成できるように、適切なコントロールハウスキーピング遺伝子の対となる鎖にハイブリダイズするように設計される。このような好ましいハウスキーピング遺伝子としては、アクチン、ＧＡＤＰＨ、または、延長因子が可能である。内部コントロールシグナルの強度を測定し、それと前記遺伝子マーカー遺伝子により生じたシグナルとを比較することにより、前記遺伝子マーカー遺伝子の発現の変化の度合いを、正常な発現レベル（すなわち病気の症状がない場合のレベル）から決定することができる。
【００３１】
本発明の方法において、ＰＣＲ増幅は、適切な遺伝子特異的プライマーと熱安定性ポリメラーゼ酵素との存在下で、全ＰＣＲ試薬と標的核酸を含むサンプルをプレインキュベートすることによって達成される。得られた反応混合物を、プライマー伸長産物の形成と増幅を可能にする条件下で周期的に加熱する。
【００３２】
ＰＣＲに必要な試薬は当業者既知であり、一般的に、標的核酸の保存された領域に十分相補的でそれらにハイブリダイズすることができる少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー、４種の異なるヌクレオシド三リン酸、熱安定性の重合剤、および、重合剤に必要なあらゆる補因子が挙げられる。好ましいヌクレオシド三リン酸は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰであり、集合的にｄＮＴＰという。ヌクレオシド三リン酸は市販されている。
【００３３】
プライマーは、標的核酸へのアニーリングが可能であり、適切な条件下で、すなわちヌクレオシド三リン酸、重合剤、適切な温度、ｐＨおよび緩衝液の存在下で核酸合成の開始点として作用する天然に存在する、または、合成で生産されたオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、それらにハイブリダイズする標的核酸に十分に相補な配列を有し、重合剤の存在下で伸長産物の合成を開始させるのに十分な長さ、典型的には１０〜６０個のヌクレオチドからなる。プライマーは、当業者周知の方法で自動合成により合成的に製造可能である。
【００３４】
プライマーの設計に考慮すべき事柄は当業界周知である。プライマーは、１種のプライマーから合成された伸長産物が、その相補物から分離した際に、他方のプライマーの伸長産物のためのテンプレートとして役立ち得るように、増幅しようとする特定の核酸の鎖の配列に実質的に相補であるように選択される。好ましくは、プライマーは、標的領域と正確に相補的である。本発明の明細書、実施例および請求項で提供されたプライマー対は、本発明の範囲を逸脱することなくマーカー遺伝子への特異性を示す機能的に同等なプライマーと置き換え可能であることを特記する。
【００３５】
本発明者等は、予期せずして、全体的または部分群的な発現状態におけるその特定の変化が、炎症性腸疾患状態（ＵＣ）を示すような７種のマーカー遺伝子を同定した。これは、病気のタイプを正しく予測することにおいて検査医師の補助となるように設計された、分子レベルでの迅速な検出プロトコールの可能性を開くものである。
【００３６】
図１と下記の表１に、炎症を起こした組織、および、炎症を起こしていない組織での発現プロファイルを例示する。
【００３７】
【表１】
【００３８】
遺伝子マーカーは、溶質（solute）キャリアーファミリー６メンバー１４（ＳＬＣ６Ａ１４）、溶質キャリアーファミリー２６メンバー２（ＳＬＣ２６Ａ２）、ＣＸＣケモカイン成長関連腫瘍遺伝子−α（Ｇｒｏ−α）または（ＣＸＣＬ−１）、マトリライシン（または、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）としても知られている）、胃腸で分泌されるタンパク質（ＧＩＳＰ）（または、再生遺伝子IV型（Ｒｅｇ IV）としても知られている）、膜結合型タンパク質１７（ＭＡＰ−１７）、および、バニン（Ｖａｎｉｎ）−１である。表２を参照。
【００３９】
【表２】
【００４０】
重合剤は、プライマー伸長産物の合成が達成されるように機能する化合物である。重合剤は、熱安定性であり、すなわち、典型的にはＰＣＲでＤＮＡ鎖を変性させるのに用いられる温度（例えば９３〜９５℃）に短時間で加熱する際に一時的に不活性化され、高温で優先的に活性化される。好ましい実施形態において、重合剤は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、例えば、高温細菌、例えばサーモコッカス−リトラリス（Thermococcus litoralis）、バチルス−ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、メタノテルムス−フェルビダス（Methanothermus fervidus）、サーマス−アクアティカス（Thermus aquaticus）、Ｔ．フィリフォルミス（T．filiformis）、Ｔ．フラーブス（T．flavus）、Ｔ．ラクテウス（T．lacteus）、Ｔ．ルーベンス（T．rubens）、Ｔ．ルーベル（T．ruber）、および、Ｔ．サーモフィルス（T．thermophilus）から得られたＤＮＡポリメラーゼ；または、好熱古細菌、例えばデスルフロコッカス−モビリス（Desulfurococcus mobilis）、メタノバクテリウム−サーモオートトロフィルカム（Methanobacterium thermoautotrophilcum）、サルホロバス−ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、Ｓ．アシドカルダリウス（S．acidocaldarius）、および、サーモプラズマ−アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）から得られたＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。最も好ましい実施形態において、重合剤は、サーマス−アクアティカス（Ｔａｑ）ポリメラーゼ、サーマス・サーモフィルス（Ｔｔｈ）ポリメラーゼ、または、サーモコッカス−リトラリスポリメラーゼである。熱安定性の逆転写酵素、および、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼもまた、重合剤として考慮される。
【００４１】
熱安定性ポリメラーゼは、市販のものを入手してもよいし、または、当業界既知の方法で得てもよい。特に、Ｔａｑポリメラーゼは、組換え型と野生型で市販されており（パーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer-Cetus））、または、は、Lawyer等（1989年）、または、米国特許第４,８８９,８１８号で説明されている方法で製造することもできる。Ｔｔｈポリメラーゼは、フィンザイム社（Finnzyme Co.，フィンランド）、および、株式会社東洋紡（日本）から市販されている。サーモコッカス−リトラリスポリメラーゼは、ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）から市販されており、また米国特許第５,３２２,７８５号で説明されている方法で製造してもよい。
【００４２】
熱安定性の重合剤に特異的な抗体を、増幅の前に重合剤を阻害するための予備増幅工程に含ませてもよい。抗体は、当業者既知の方法、および、例えばHarlowe等（1988年）Antibodies：A Laboratory Manual（コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor），ニューヨーク）で見出される方法で製造することができる。本発明において、用語「抗体」は、従来の方法論でで製造されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、組換えで製造された抗体、および、化学的または組換えで製造された抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントを含む。好ましい実施形態において、抗体は、モノクローナルである。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態において、抗体は、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、または、サーモコッカス−リトラリスポリメラーゼに対するモノクローナル抗体である。より好ましい実施形態において、抗体は、Ｔａｑポリメラーゼに対するモノクローナル抗体である。Ｔａｑポリメラーゼに対するモノクローナル抗体は、当業界既知であり、例えば、米国特許第５,３３８,６７１号で説明されている。本発明において、重合剤に特異的と定義された抗体は、温度約２０〜４０℃で重合剤の酵素活性を阻害することができる抗体である。本発明の抗体は、ＰＣＲの熱サイクルの際に使用される高温により不活性化される。ポリメラーゼの酵素活性を阻害する抗体の能力は、例えばSharkey等（1994年
）により説明されているような当業者既知の分析によって測定することができる。
【００４４】
本発明は、標的核酸の増幅方法、および、場合によりそれに続く標的核酸を含むと推測されるサンプル中での核酸の検出方法を提供する。このサンプルは、標的核酸を含むと推測されるあらゆるサンプルが可能であり、例えば、組織サンプル、血液、毛髪、体液、細菌、ウイルス、真菌、細菌感染細胞、ウイルス感染細胞などである。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＰＣＲ増幅に適した位置で標的核酸の異なる鎖にハイブリダイズ可能なプライマーを設計するために、増幅され得る配列の両末端における十分な数の塩基が予めわかっていなければならない。標的核酸は、ＰＣＲの前に組織サンプルから、例えばサンプルからタンパク質または細胞形質成分を除去することによって、抽出してもよいし、または、部分的に抽出してもよい。核酸をサンプルから抽出する方法は当業者既知であり、例えば Sambrook等（1989年）、および、Saiki等（1985年）で見出すことが出来る。
【００４５】
好ましい実施形態において、材料源として、胃腸管および病気の徴候を示すと考えられている領域から切除された生検が特に好ましい。
【００４６】
本発明の増幅方法において、サンプルまたはサンプルから抽出された核酸の調製物を、一般的にＰＣＲで用いられる試薬（少なくとも１種のホスホロチオエート結合を含むように改変された少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー、４種の異なるヌクレオシド三リン酸、熱安定性の重合剤、および、適切な緩衝液を含む）と接触させ、さらにエキソヌクレアーゼと接触させて反応混合物を形成する。他の実施形態において、重合剤に特異的な抗体が混合物に含まれる。
【００４７】
プライマー、ヌクレオシド三リン酸、重合剤、および、適切な緩衝液を含む従来のＰＣＲ試薬は、一般的に、ＰＣＲに適した濃度で利用され、当業者に既知である。好ましい実施形態において、ヌクレオシド三リン酸は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰである。好ましい実施形態において、重合剤は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。好ましいＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、および、サーモコッカス−リトラリスポリメラーゼである。Ｔａｑポリメラーゼが特に好ましい。
【００４８】
好ましくは、増幅方法は、連続的な自動方式で行われる。自動ＰＣＲに適した機器は当業者既知であり、例えば、米国特許第４,９６５,１８８号、第５,０８９,２３３号、および、第５,２２９,２９７号で説明されている。当業者は、容易に増幅産物を検出することができ、例えば、アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の分離、および、エチジウムブロマイド染色での可視化、または、増幅された核酸とハイブリダイズ可能な標識されたプローブを用いたハイブリダイゼーションによる検出、または、多種多様な当業者周知のその他の検出方法により検出することができる。
【００４９】
従って、本発明の一実施形態は、患者の腸の炎症を起こした領域、および、炎症を起こしていない領域から得られた生検サンプル中での遺伝子発現プロファイルの分析に基づく潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別する方法であって、本方法において、多数のマーカー遺伝子のうち少なくとも２種の発現レベルが測定され、前記少なくとも２つのマーカー遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７から選択される。
【００５０】
本発明の他の実施形態は、配列番号１と配列番号２との発現レベルを測定し、配列番号１の炎症を起こした組織での発現、および、炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う方法である。
【００５１】
本発明の第３の実施形態は、配列番号１、配列番号２および配列番号３の発現レベルを測定し、配列番号１の炎症を起こした組織での発現、および、炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如、および、配列番号３の炎症を起こした組織での発現、および、炎症を起こしていない組織での発現の欠如と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う方法である。
【００５２】
第４の実施形態は、配列番号１、配列番号２および配列番号４の発現レベルを測定し、配列番号１の炎症を起こした組織での発現、および、炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如、および、配列番号４の炎症を起こした組織での発現、および、炎症を起こしていない組織での発現の欠如と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う方法である。
【００５３】
第５の実施形態は、配列番号１〜７の発現レベルを測定し、配列番号１、３、４、５、６および７の炎症を起こした組織での発現、および、炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う方法である。
【００５４】
好ましい実施形態において、上記実施形態のいずれか１つの方法は、遺伝子特異的プライマーを用いた前記遺伝子の核酸の増幅、および、増幅結果の決定により、各マーカー遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む。核酸の増幅は、好ましくは、ＰＣＲを用いて、および、好ましくは配列番号１３〜２６から選択される遺伝子特異的プライマーを用いて行われる。
【００５５】
増幅結果の決定は、好ましくは、エチジウムブロマイド染色とＵＶ光下での可視化を用いて行われる。
【００５６】
本発明はさらに、同一または別個のコンテナーに、熱安定性の重合剤、および、前記標的遺伝子がＰＣＲで増幅可能なように設計されたプライマー対を含むＰＣＲ用キットを提供する。例えば、ＰＣＲ重合剤およびＰＣＲ用試薬（例えばヌクレオシド三リン酸、プライマーおよび緩衝液）に特異的な追加の抗体を含めるために、追加のコンテナーが提供されてもよい。
【００５７】
その結果として、本発明は、患者の腸の炎症を起こした領域、および、炎症を起こしていない領域から得られた生検サンプル中での遺伝子発現プロファイルの分析に基づく潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別するためのキットを利用可能にし、前記キットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７から選択される少なくとも２つのマーカー遺伝子に向けられた遺伝子特異的プライマー対を含む。
【００５８】
前記遺伝子特異的プライマー対は、好ましくは、配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；配列番号１７および配列番号１８；配列番号１９および配列番号２０；配列番号２１および配列番号２２；配列番号２３および配列番号２４；および、配列番号２５および配列番号２６から選択される。
【００５９】
本発明の一実施形態において、前記特異的プライマーは、配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；ならびに、配列番号１７および配列番号１８である。
【００６０】
本発明の他の実施形態において、前記特異的プライマーは、配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；ならびに、配列番号１９および配列番号２０である。
【００６１】
本発明に係るキットは、好ましくは、熱安定性の重合剤および必要な補因子をさらに含む。好ましい実施形態において、重合剤は、ＤＮＡポリメラーゼである。より好ましい実施形態において、ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、または、サーモコッカス−リトラリスポリメラーゼである。Ｔａｑポリメラーゼが特に好ましい。好ましい抗体は、Ｔａｑポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体である。
【００６２】
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、１９〜２５個のヌクレオチドの長さであり、標準的な条件下で、前記遺伝子マーカー遺伝子の標的ＤＮＡにアニールし得るプライマー対として設計される。この場合、７種の前記遺伝子マーカー遺伝子がうまく増幅されるような７種のプライマー対が提供される。用いられた特異的プライマーを表３に示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】
開示された遺伝子マーカーは、溶質キャリアーファミリー６メンバー１４（ＳＬＣ６Ａ１４）（配列番号１で示される）、溶質キャリアーファミリー２６メンバー２（ＳＬＣ２６Ａ２）（配列番号２で示される）、ＣＸＣケモカイン成長関連腫瘍遺伝子−α（Ｇｒｏ−α）または（ＣＸＣＬ−１）（配列番号３で示される）、マトリライシン（または、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）として知られており、配列番号４で示される）、胃腸で分泌されるタンパク質（ＧＩＳＰ）（または、再生遺伝子IV型（Ｒｅｇ IV）としても知られている）（配列番号５で示される）、膜結合型タンパク質１７（ＭＡＰ−１７）（配列番号６で示される）、および、バニン−１（配列番号７で示される）である。上記の表２を参照。
【００６５】
実施例で説明される方法において、多数の方法に基づく配列を用いた。これらを表４に示す。
【表４】
【００６６】
溶質キャリアー（ＳＬＣ）タンパク質は、エネルギー依存性の輸送分子の極めて大きいファミリーを構成しており、栄養素の輸送において重要な生理学的な役割を有し、薬物吸収を増加させるメカニズムとして利用されることもある。しかしながら、これらタンパク質の分子レベルでの理解は、高解像度の結晶構造がないために限定的である。
【００６７】
総じて、腎結石に罹っている成人の１〜２％、および、子供の６〜８％は、シスチン尿症、アミノ酸輸送の異常があり、それによって尿中にシスチンが高濃度になる。２種の遺伝子、すなわち、アミノ酸輸送体系に関連するタンパク質をコードする、溶質キャリアーファミリー３（シスチン、塩基性および）中性アミノ酸輸送体、メンバー１（ＳＬＣ３Ａ１）、および、溶質キャリアーファミリー７、メンバー９（ＳＬＣ７Ａ９）が関係している。これら溶質キャリアーはいずれも、尿路感染を引き起こし最終的には腎不全を引き起こす石形成に関与すると考えられている。
【００６８】
本発明者等は、２種の既知の溶質キャリアー（ＳＬＣ６Ａ１４およびＳＬＣ２６Ａ２）の発現がＩＢＤで有意に変化することを同定した。これは、本発明者等の知る限り、炎症性腸疾患に溶質キャリアーが関与する可能性があることについて最初の報告である。それゆえに、溶質キャリアーがＩＢＤの病因の一因であり得るということは、新規の発見である。
【００６９】
ＣＸＣケモカイン成長関連腫瘍遺伝子−α（Ｇｒｏ−α、または、ＧＲＯ１として知られている）は、サイトカインと説明されており、そのようなものとして、炎症の局所的領域において数多くの細胞型の移動性の反応を改変させることができる。さらに、ヒトの炎症を起こした角膜において過剰発現されることも説明されており（Spandau等，2003年）
、加えて、消化管の炎症を示すように化学的に誘導されたラットは、ＧＲＯ１レベルのアップレギュレートを示すことも示されている（Hirata等，2001年）。ｃＤＮＡマイクロアレイアプローチを用いて、ケモカインＧｒｏαのリウマチ様関節炎および炎症性腸疾患における新たな関与が説明されているが（Heller等，1997年）、本明細書において示される本発明は、ＧＲＯ１は、ＵＣ状態においては過剰発現されるが、ＣＤ状態ではダウンレギュレートされることを、本発明者等の知る限りにおいて、初めて説明する。Isaacs等，１９９２年では、ＵＣにおけるＧＲＯ１の発現はＣＤでみられるよりも高いことが説明されているが、本発明では、ＧＲＯ１発現レベルに関し、ＵＣとＣＤとに逆の相間性があることを実証した。最後に、Lawrence等，２００１年では、ＵＣにおいてアップレギュレートされるＧＲＯ１を同定することを説明しているが、この研究の設計では、生検サンプルが分析前にプールされるために、２人以上の患者においてＧＲＯ１がアップレギュレートされるのかどうかを知ることは不可能である。
【００７０】
マトリライシン（または、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７）は、内巻きのラットの子宮で最初に発見され、これは、子宮メタロプロテイナーゼ、推定のメタロプロテイナーゼ（Ｐｕｍｐ−１）、および、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ−７）としても知られている。これは、いずれも細胞外マトリックスの高分子のほとんどを分解することができる１５種のＭＭＰファミリーの最小のメンバー（２８ｋＤａ）である。このファミリーは、簡単には以下のように総論される；全てのメンバーは、システインでブロックされた活性部位の亜鉛を有する酵素原の形態で生じる亜鉛メタロプロテイナーゼである。マトリライシンは、マトリックスの多種多様なゼラチン、プロテオグリカンおよび糖タンパク質を分解させることができ、コラゲナーゼなどの数種のその他のＭＭＰを活性化することができる（Woessner，1996年に総論されている）。
【００７１】
これは、様々なタイプのガン、例えば結腸、胃、前立腺および脳のガンにおいて頻繁に発現される。これまでの研究によれば、マトリライシンは、結腸ガンの進行および転移において重要な役割を果たすことが示されている。近年、Newell等，２００２年により、ＵＣ関連の異常増殖の様々な期でマトリライシン発現の増加が起こることが説明されている。しかしながら、この研究は、このような発現の増加は、ＵＣの結果なのか、または、むしろ異常増殖の存在によるものなのかを決定してはいない。
【００７２】
膜結合型タンパク質１７（ＭＡＰ−１７）（またはＤＤ９６としても知られている）は、小さいタンパク質であるが、これまでその機能は説明されていない。ＧＩＳＰに関して、これもまたほとんどわかっていない。いずれにおいても、炎症に関与する可能性があることは説明されていない。
【００７３】
パントテイナーゼ（Pantetheinase）（ＥＣ３.５.１.）は、遍在的な酵素であり、インビトロで、パントテン酸（ビタミンＢ５）をリサイクルし、システアミン、有効な抗酸化剤を生産することが示されている。この酵素は、バニン−１遺伝子でコードされており、マウス組織で広く発現される。バニン−１は、ＧＰＩアンカーパントテイナーゼであり、従って細胞外酵素である。バニン／パントテイナーゼは、恐らくは酸化的ストレス応答の観点で、いくつかの免疫機能の調節に関与する可能性があることが示唆されている（Pitari等，2000年）。
【００７４】
本発明者等の知る限り、これは、ＩＢＤにおけるバニン−１の可能性のある役割を初めて説明するものである。
【００７５】
本発明を特定の好ましい実施形態に従って特に説明したが、以下の実施例は、単に本発明を説明することを意図したものであって、本発明を限定するものではない。これらは使用可能な方法および方法の工程の典型であって、当業者既知のその他の方法および方法の工程を、不適当な実験を行わうことなく取り入れることが可能である。
【実施例】
【００７６】
実施例１．生検材料の収集
ＣＤまたはＵＣの炎症状態を有する臨床的および病理学的な証拠に基づき選択された患者から生検を採取した。一人の患者の結腸の炎症を起こした部位から、トータルで３つの生検を、炎症を起こしていない領域からの３つの生検サンプルと共に収集した。これをトータルで１６人の異なる患者に行い、ここで、１６人のうち８人はＣＤと診断されており（患者１〜８）、残りの８人はＵＣと診断されている（患者９〜１６）。ＵＣ患者群は、女性２人および男性６人からなり、年齢の範囲は２９〜７７歳であった。同様に、ＣＤ患者群は、女性３人および男性５人からなり、年齢の範囲は２７〜５９であった。
【００７７】
１人の患者の各解剖部位からの生検をプールし、キアゲン（Quiagen）Rneasyキットと
、ペレット・ペステル（Pellet Pestel）のモーターホモジナイザーを製造元のプロトコ
ールに従って用いてトータルＲＮＡを単離した。この方法で、トータルＲＮＡを、患者１人あたり２サンプル（炎症を起こした（標的）、および、炎症を起こしていない（コントロール））で、計３２サンプルを単離した。
【００７８】
実施例２．ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成の実行
各ＲＮＡサンプル（トータルで３２）の２μｇを、第一の鎖のｃＤＮＡ合成で用いて、１０ｐＭのオリゴ−ｄＴ−プライマーｄＴ−ジョイント（５’−ＴＡＧ ＴＣＴ ＡＴＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＧＣ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＧＧ ＡＧＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＶ−３’（配列番号８）を用いて、各合成ｃＤＮＡ分子に３種の制限酵素切断部位：ＳａｌＩ、ＮｏｔＩおよびＢｐｍＩを導入した。緩衝液、デゾキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、および、酵素の逆転写酵素（スーパースクリプト（Superscript）II）は、ギブコ・ＢＲＬ（Gibco BRL）から購入し、製造元のガイドラインに従って反応を行った。酵素を除く第一の鎖の合成のための反応混合物を、ＰＣＲ機（ＰＣＲスプリント（PCR sprint），Hybaid製）で、６５℃で５分間プレインキュベートし、氷上で冷却し、次に、４２℃に予備加熱し、その後、酵素スーパースクリプトIIを加え、ＰＣＲ機（ＰＣＲスプリント，Hybaid製）で、４２℃で１時間インキュベートした。
【００７９】
第二の鎖の合成のために、提供されたプロトコール（ギブコ・ＢＲＬ）に従って、第二の鎖の緩衝液ミックス（４１μｌ）を反応液に加え、４μｌのＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ（ニューイングランドバイオラボ）、１.５μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ）、および、０.７μｌのＲＮアーゼＨ（ギブコ・ＢＲＬ）で総体積を１６０μｌにした。ＰＣＲ機ＰＣＲスプリントで、１６℃で２.５時間反応液をインキュベートし、次に、提供されたプロトコールに従ってキアゲンＰＣＲ精製キットを用いて精製した。各サンプル（トータルで３２）を溶出緩衝液（３２μｌ）で溶出させ、各サンプル（２６μｌ）を以下の工程で用いた。
【００８０】
実施例３．ｃＤＮＡの３’末端の増幅
このような生検から得られた材料の量は限定されているため、予備増幅工程が必要であった。ｃＤＮＡの３’末端をインビトロで増幅するため、各サンプルからのｃＤＮＡ（２６μｌ）を、体積３０μｌで、制限酵素Ｄｐｎ II（１０Ｕ）で、３７℃で３時間消化した。切断されたｃＤＮＡを、キアゲンＰＣＲ精製キットを用いて１回以上精製し、ｃＤＮＡを溶出緩衝液（４７μｌ）中で溶出させた。以下の環化ライゲーション工程を、Ｄｐｎ IIで切断したｃＤＮＡ（４４μｌ）と、２０００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ）を含む体積５０μｌで行った。これら反応混合物を２２℃で１時間インキュベートし、６５℃で１０分間加熱して不活性化し、各反応混合物の２５μｌを増幅工程で用いた。１サンプルあたり５回の反応混合物を一つに合わせ（５×５０μｌ＝トータルで２５０μｌ）、これには、２５μｌのｃＤＮＡ（Ｄｐｎ IIで切断し環状にライゲートした）、２５μｌの１０×アドバンテージ（Advantage）２ＰＣＲ緩衝液（クロンテック（Clontech））、５μｌのジョイント−Ｎｏｔプライマー（１０ｐモル／μｌ；５’−ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＧＧ−３’（配列番号９））、５μｌのジョイント−Ｓａｌプライマー（１０ｐモル／μｌ；５’−ＴＴＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＧＡ ＴＣ−３’（配列番号１０）、５ｐｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、および、５μｌの５０×アドバンテージ２Ｔａｑ−ポリメラーゼ（クロンテック）が含まれる。各サンプルに、このミックスを５個のＰＣＲ反応チューブに分配し、以下の条件下でＰＣＲを行った：９４℃で１分間、次に、１６×（９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で１分間）。
【００８１】
１サンプルあたり４個の反応液を取り出して氷上に置き、１サンプルあたり１個の反応液を用いて最適なサイクル数を決定した。最適なサイクル数は、全３２サンプルにおいて１８サイクルと決定されたので、残りの１サンプルあたり４個の反応液には、２つの追加サイクル［２×（９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で１分間）］を行った。引き続き、１サンプルあたり４個のＰＣＲ反応液をキアゲンＰＣＲ精製キットを用いて精製した。精製のために、１サンプルあたり４個の反応液をプールし（トータルで２００μｌ）、次に、溶出緩衝液（３４μｌ）で溶出させた。精製した反応液を、差別的に発現された遺伝子の同定プロトコールのための出発材料とした。
【００８２】
実施例４．ヒト生検からの差別的に発現されたｃＤＮＡの単離（サブトラクションプロトコール）
差別的に発現されたｃＤＮＡの単離を、von Stein O.D.，２００１年で概説されたプロトコールに従って行った（多少のプロトコール改変を含む）。
【００８３】
実施例５．差別的に発現された遺伝子のスクリーニング
ｃＤＮＡライブラリー構築において、各サブトラクションから２.０００個のクローンを、１個の２２ｃｍ2寒天プレートにプレーティングした。これらプレートから、３８４個のコロニーをピックアップし、バイオロボティクス（バイオロボティクス）（ケンブリッジ，ＵＫ）のバイオピック（BioPick）機を用いて、ウェルあたり７０μｌのＬＢ培地を含む３８４ウェルのプレートに撒いた（Maniatis等，Molecular cloning laboratory book, Appendix A.1を参照）（＋アンピシリン１００ｍｇ／ｍｌ）。細菌クローンを３７℃で一晩インキュベートし、次に、コロニーＰＣＲで用いた。このＰＣＲは、３８４ＰＣＲウェルプレートで、１サンプルあたり体積２０μｌで行われた。１つのＰＣＲ反応は、１０×ＰＣＲ緩衝液（２μｌ）、０.４μｌのSport-Notプライマー（１０ｐモルの５’−ＣＧＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＴＡＧＡ ＧＣ−３’（配列番号１１）、０.４μｌのＳｐｏｒｔ−Ｓａｌプライマー（１０ｐモルの５’−ＴＧＣ ＡＧＧ ＴＡＣ ＣＧＧ ＴＣＣ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＣ−３’（配列番号１２））、１.６μｌのｄＮＴＰミックス（各２５ｍＭ）、０.４μｌの０.１％ブロモフェノールブルー、および、０.５μｌのＤｙｎＡｚｙｍｅ Ｔａｑ−ポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ；フィンザイム）を含む。全反応液のためのマスターミックスを製造し、分配し、次に、３８４個のプラスチック製レプリカで播種した。ＰＣＲサイクルパラメーターは、以下の通りである：９４℃で２分間、３７回（９４℃で３０秒間；５０℃で３０秒間、７２℃で１分間）、および、７２℃で５分間。
【００８４】
増幅の後、バイオロボティクスのマイクログリッド（Microgrid）ＴＡＳを用いて、ハイボンド（Hybond）Ｎ＋メンブレン（アマシャム（Amersham））上にＰＣＲ反応液をスポットした。全てのクローンを二連でスポットし、ガイド用ドットとしてゲノムＤＮＡを用いた。１つのフィルター上で、全ての４個のサブトラクションの３８４個の遺伝子を配置させた。異なる放射活性ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション分析のために、２４個の複製を作成した。
【００８５】
次に、これらフィルターを、全ての８人の患者のサブトラクションされた放射活性標識ｃＤＮＡとハイブリダイズした。１６の異なるハイブリダイゼーション実験で、１６個のフィルターを用いた。そのため、ｃＤＮＡ（１μｌ）をクレノーポリメラーゼでの標識に用いた。ハイブリダイゼーションプロトコールは、MaxamおよびGilbert，1984年で概説されているチャーチ（Church）−プロトコールであった。
【００８６】
ホスホイメージャー・フジフィルム（Fuji film）ＢＡＳ１８００ IIを、ＢＡＳ１８００ III Ｒプログラム、および、アレイ（Array）バージョン６.０（イメージング・リサーチ社（Imaging Research Inc））と共に用いて、差別的な発現の度合いを測定した。８人の患者のうち少なくとも３人において誘導率または減少率が３倍で差別的に発現された遺伝子を配列解析し、ＢＬＡＳＴ分析を行い、これらの単離された差別的に発現された遺伝子を同定した。
【００８７】
実施例６．適正な差別的な発現の確認
これらの分析で、数種の遺伝子が強い調節障害を示した。これらのデータを確認するために、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドと、同じ８人の患者から得られた非増幅ｃＤＮＡ材料を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。炎症を起こした組織、および、炎症を起こしていない組織（サブトラクションで用いらたものと同じ）の、およそ２μｇのトータルＲＮＡが、実施例５で説明された第一の鎖ｃＤＮＡ合成のために採取された。ｃＤＮＡ合成後、サンプルを９６℃で３分間インキュベートし、次に、蒸留水で１：１０に希釈した。
【００８８】
１０μｌのさらなる１：１０の希釈液を、１個のＰＣＲ反応液（５０μｌ）のために取った。このＰＣＲ反応液は、以下を含む：５μｌの１０×ＰＣＲ 緩衝液、１μｌのフォワードプライマー（１０ｐモル／μｌ）、および、１μｌの特異的遺伝子（配列番号１〜７）のリバースプライマー（１０ｐモル／μｌ）、０.５μｌのｄＮＴＰミックス（各２５ｍＭ）、および、０.５μｌのＤｙｎＡｚｙｍｅ Ｔａｑ−ポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ；フィンザイム）。反応のためのｃＤＮＡを除いたマスターミックスを製造し、分配し、次に、ｃＤＮＡを加えた。ＰＣＲサイクルパラメーターは以下の通りである：９４℃で１分間、２６〜３５回（９４℃で３０秒間；５５℃で３０秒間、７２℃で１分間）、および、７２℃で５分間。サイクル数は、遺伝子フラグメントが増幅されるかどうかによって変化させた。プライマー対は、表３で示したものであった。
【００８９】
これらの分析により、正常な組織と比較して全体的または部分群的な発現状態の変化により、ＵＣに関して９０％超の正しい予測率が考察できる７種の遺伝子マーカーが同定される。これらの発見を確認するために、これらマーカーを、より大規模な生検サンプル収集に対してさらにスクリーニングした。
【００９０】
実施例７．ハイスループットスクリーニング
８人のＵＣ患者と３人のＣＤ患者のｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの予備的な結果（実施例６を参照）を確認するために、全ての単離された遺伝子の発現を大規模に分析することを決定した。その目的のために、スクリーニングで単離され得る全ての遺伝子を、ハイボンドＮ＋メンブレン（アマシャム）に、マイクログリッドＴＡＳ（バイオロボティクス）を用いてスポットした。実施例５で説明したように、スポットのために、遺伝子をコロニーＰＣＲで増幅した。
【００９１】
次に、このマスターフィルターメンブレンを２４０回合成し、ＵＣ患者５０個体とＣＤ患者５０個体からの生検から得られた放射活性標識ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。生検は、患者の結腸の左側の炎症を起こした領域、および、炎症を起こしていない領域から採取された。基準のコントロールとして、５人の健康な人の結腸の左側から得られた生検をプールした。
【００９２】
実施例８．盲検試験による検証
より大きい統計学的な重要性を提供するために、その生検がＵＣまたはＣＤに罹った患者から得られたものかどうかがわかっていない「盲目」生検サンプルで７種の遺伝子マーカーの発現分析を行うことが必要であった。上述したように、前記遺伝子マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、前記遺伝子マーカーから得られた発現パターンの全画像を総合したところ、９０％超の確実性で正しいＩＢＤ型の決定が可能であった。
【００９３】
結果の分析（盲検試験）により、配列番号１および２の組み合わせでも信頼できる結果が得られたが、配列番号１、２および３の組み合わせ、または、配列番号１、２および４の組み合わせでさらに改善された結果が得られたことが示された。予備的な結果により、配列番号１，２，３および４の組み合わせを用いたところ約９０％の精度が達成されたことが示された。配列番号１〜７の完全なセットを用いたところ、９０％超の精度が得られたことが示された。
【００９４】
本発明を現在本発明者等が知る最良の形態を構成する好ましい実施形態の観点で説明したが、当業者に明白と思われる様々な変化および改変が、添付の請求項に記載の本発明の範囲を逸脱することなくなされ得ると理解されるべきである。
【００９５】
参考文献
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の腸の炎症を起こした領域、および場合により炎症を起こしていない領域から得られた生検サンプルの遺伝子発現プロファイルの分析に基づく潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別する方法であって、多数のマーカー遺伝子のうち少なくとも２種の発現レベルが測定され、少なくとも２種の上記のマーカー遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７から選択されることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
配列番号１と配列番号２との発現レベルを測定し、配列番号１の炎症を起こした組織での発現、および場合により炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如、または場合により炎症を起こしていない組織での優先的な発現と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２および配列番号３の発現レベルを測定し、配列番号１の炎症を起こした組織での発現、および場合により炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如、または場合により炎症を起こしていない組織での優先的な発現、および、配列番号３の炎症を起こした組織での発現、および場合により炎症を起こしていない組織での発現の欠如と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２および配列番号４の発現レベルを測定し、配列番号１の炎症を起こした組織での発現、および場合により炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如、または場合により炎症を起こしていない組織での優先的な発現、および、配列番号４の炎症を起こした組織での発現、および場合により炎症を起こしていない組織での発現の欠如と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
配列番号１〜７の発現レベルを測定し、配列番号１、３、４、５、６および７の炎症を起こした組織での発現または炎症を起こした組織での優先的な発現、および場合により炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如、または場合により炎症を起こしていない組織での優先的な発現と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子特異的プライマーを用いて前記遺伝子の核酸を増幅させ、増幅結果を測定することにより、前記各マーカー遺伝子の発現レベルを測定する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
核酸の増幅は、ＰＣＲと、配列番号１３〜２６から選択される遺伝子特異的プライマーを用いて行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
増幅結果の測定は、エチジウムブロマイド染色とＵＶ光下での可視化を用いて行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
患者の腸の炎症を起こした領域、および場合により炎症を起こしていない領域から得られた生検サンプルの遺伝子発現プロファイルの分析に基づく潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別するためのキットであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７から選択される少なくとも２つのマーカー遺伝子に対して向けられた遺伝子特異的プライマー対を含むことを特徴とする、上記キット。
【請求項１０】
遺伝子特異的プライマー対は、配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；配列番号１７および配列番号１８；配列番号１９および配列番号２０；配列番号２１および配列番号２２；配列番号２３および配列番号２４；および、配列番号２５および配列番号２６、または、同じマーカー遺伝子に特異的な機能的に同等なプライマー対から選択される、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
特異的プライマーは、配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；および、配列番号１７および配列番号１８である、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
特異的プライマーは、配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；および、配列番号１９および配列番号２０である、請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
熱安定性の重合剤、および、必要な補因子をさらに含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１】
患者の腸の炎症を起こした領域、および場合により炎症を起こしていない領域から得られた生検サンプルの遺伝子発現プロファイルの分析に基づく潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別する方法であって、多数のマーカー遺伝子のうち少なくとも２種の発現レベルが測定され、少なくとも２種の上記のマーカー遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７から選択されることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
配列番号１と配列番号２との発現レベルを測定し、配列番号１の炎症を起こした組織での発現、および場合により炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如、または場合により炎症を起こしていない組織での優先的な発現と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２および配列番号３の発現レベルを測定し、配列番号１の炎症を起こした組織での発現、および場合により炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如、または場合により炎症を起こしていない組織での優先的な発現、および、配列番号３の炎症を起こした組織での発現、および場合により炎症を起こしていない組織での発現の欠如と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２および配列番号４の発現レベルを測定し、配列番号１の炎症を起こした組織での発現、および場合により炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如、または場合により炎症を起こしていない組織での優先的な発現、および、配列番号４の炎症を起こした組織での発現、および場合により炎症を起こしていない組織での発現の欠如と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
配列番号１〜７の発現レベルを測定し、配列番号１、３、４、５、６および７の炎症を起こした組織での発現または炎症を起こした組織での優先的な発現、および場合により炎症を起こしていない組織での発現の欠如を、配列番号２の炎症を起こした組織での発現の欠如、または場合により炎症を起こしていない組織での優先的な発現と共に、潰瘍性大腸炎の指標として扱う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子特異的プライマーを用いて前記遺伝子の核酸を増幅させ、増幅結果を測定することにより、前記各マーカー遺伝子の発現レベルを測定する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
核酸の増幅は、ＰＣＲと、配列番号１３〜２６から選択される遺伝子特異的プライマーを用いて行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
増幅結果の測定は、エチジウムブロマイド染色とＵＶ光下での可視化を用いて行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
患者の腸の炎症を起こした領域、および場合により炎症を起こしていない領域から得られた生検サンプルの遺伝子発現プロファイルの分析に基づく潰瘍性大腸炎とクローン病とを識別するためのキットであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７から選択される少なくとも２つのマーカー遺伝子に対して向けられた遺伝子特異的プライマー対を含むことを特徴とする、上記キット。
【請求項１０】
遺伝子特異的プライマー対は、配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；配列番号１７および配列番号１８；配列番号１９および配列番号２０；配列番号２１および配列番号２２；配列番号２３および配列番号２４；および、配列番号２５および配列番号２６、または、同じマーカー遺伝子に特異的な機能的に同等なプライマー対から選択される、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
特異的プライマーは、配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；および、配列番号１７および配列番号１８である、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
特異的プライマーは、配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；および、配列番号１９および配列番号２０である、請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
熱安定性の重合剤、および、必要な補因子をさらに含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【図１】
【公開番号】特開２００９−２７８９９５（Ｐ２００９−２７８９９５Ａ）
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７１０１２（Ｐ２００９−１７１０１２）
【出願日】平成２１年７月２２日（２００９．７．２２）
【分割の表示】特願２００４−５３０９３７（Ｐ２００４−５３０９３７）の分割
【原出願日】平成１５年６月２５日（２００３．６．２５）
【出願人】（５０４４７３０３８）インデックス・ダイアグノスティックス・アクチエボラーグ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２２日（２００９．７．２２）
【分割の表示】特願２００４−５３０９３７（Ｐ２００４−５３０９３７）の分割
【原出願日】平成１５年６月２５日（２００３．６．２５）
【出願人】（５０４４７３０３８）インデックス・ダイアグノスティックス・アクチエボラーグ (2)
【Ｆターム（参考）】
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