炎症の治療法
【課題】有害な副作用を起こすことなく炎症を緩和する新規の治療薬を提供することを課題とする。
【解決手段】マイコバクテリウム・フレイ（Mycobacterium phlei）細胞壁上に保持され複合体化されたマイコバクテリウム・フレイ−ＤＮＡ及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、動物における炎症の治療又は予防のための組成物。
【解決手段】マイコバクテリウム・フレイ（Mycobacterium phlei）細胞壁上に保持され複合体化されたマイコバクテリウム・フレイ−ＤＮＡ及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、動物における炎症の治療又は予防のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願についてのクロスリファレンス）
本出願は、１９９８年１２月４日に提出された、米国仮出願第６０／１１０，９４３号に対して優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、動物の炎症治療に有効であるマイコバクテリア細胞壁（ＢＣＣ）上に保持及び複合体化されたマイコバクテリアデオキシリボ核酸（Ｂ−ＤＮＡ）に関する。より詳細には、本発明は、動物の炎症治療に有効であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ細胞壁（ＭＣＣ）上に保持及び複合体化されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）デオキシリボ核酸（Ｍ−ＤＮＡ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
炎症は、組織損傷によって引き起こされる複雑な過程である。炎症は損傷および感染に対する防御反応として発症するが、一定の症例（免疫媒介性炎症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、糸球体腎炎、膀胱炎、および大腸炎などが含まれるが、これらに限定されない）ではその炎症自体が問題となる。これらの症例では、炎症反応は持続し、抗炎症剤（アスピリン、非ステロイド性抗炎症薬、およびコルチゾンなど）、の投与によって一時的に緩和することしかできない。これらの薬物は、炎症の薬理学的メディエーターの同化作用および活性化に関連する代謝経路に対して作用する。しかし、これらの抗炎症剤は、多数の望ましくない副作用を有し、一定の個体では耐容性を示すことができない。
【０００４】
したがって、有害な副作用を起こすことなく炎症を緩和する新規の治療薬がなお必要とされている。さらに、このような治療薬は、調製が簡単で比較的安価であるべきであり、その活性は調製物に共通して再現性があるべきであり、その活性は長期間安定であるべきであり、その抗炎症効果は最小中毒量で行われるべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、炎症を有する動物の炎症治療に有効であるマイコバクテリア細胞壁（ＢＣＣ）上に保持及び複合体化されたマイコバクテリアデオキシリボ核酸（Ｂ−ＤＮＡ）を提供することによって前述の必要性を満たす。より詳細には、本発明は、炎症を有する動物の炎症治療に有効であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ細胞壁（ＭＣＣ）上に保持及び複合体化されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ（Ｍ．ｐｈｅｌｉ）デオキシリボ核酸（Ｍ−ＤＮＡ）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＭＣＣは、調製が簡単で比較的安価であり、その活性は調製物に共通して再現性があり、治療において長期間安定しており、反復投与の場合にも副作用を最小にする投薬計画で有効である。
【０００７】
ＭＣＣを調製するために、Ｍ．ｐｈｌｅｉを液体培地で増殖させて回収する。Ｍ．ｐｈｌｅｉを破壊し、破壊したＭ．ｐｈｌｅｉの固体成分を遠心沈降で回収する。固体成分を脱タンパク、脱脂、および洗浄する。無ＤＮアーゼ試薬を使用して調製の際のＭ−ＤＮＡの分解を最小にする。
【０００８】
ＭＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を、ヒトを含む動物の炎症の予防、緩和、および排除有効量で投与する。予想外で驚くべきＭＣＣの炎症緩和能力は、ＭＣＣ自体の副作用が最小である上に、医学分野に長い間存在する実現されていない切実な必要性に対応し、ヒトを含む動物に重要な利点を与える。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、炎症を有する動物の炎症の治療に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、炎症を有する動物の炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、動物の炎症の予防に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、炎症を有する動物の炎症の排除に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、動物のＩＬ−１０合成の刺激に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、免疫媒介性炎症を有する動物の免疫媒介性炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、変形性関節症を有する動物の変形性関節症による炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、慢性関節リウマチを有する動物の慢性関節リウマチによる炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、糸球体腎炎を有する動物の糸球体腎炎による炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、大腸炎を有する動物の大腸炎による炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の別の目的は、膀胱炎を有する動物の膀胱炎による炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の別の目的は、大量に調製することができる組成物を提供することにある。
【００２１】
本発明の別の目的は、比較的安価で調製される組成物を提供することにある。
【００２２】
本発明の別の目的は、長期間安定である組成物を提供することにある。
【００２３】
本発明の別の目的は、長期間その効力が持続する組成物を提供することにある。
【００２４】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴、および利点は、以下に開示される実施形態の詳細な説明および添付の特許請求の範囲を検討することによって明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】カラゲナンの注射から０、２４、４８、７２、および９６時間後のマウス足蹠体積に対する、ＭＣＣの静脈内、腹腔内、経口、および皮下投与の効果を示す図である。結果は、群あたり８匹のマウスについての平均±ＳＤ（垂直の線）である。
【図２】カラゲナン注射から４８時間後のマウス足蹠体積に対する、ＭＣＣの静脈内、腹腔内、経口、および皮下投与の効果を示す図である。結果は、群あたり８匹のマウスについての平均±ＳＤ（垂直の線）である。
【図３】投与から０、３、６、および２４時間後のＴＮＦαおよびＩＬ−１０合成に対する、ＭＣＣの腹腔内投与の効果を示す図である。結果は、群あたり４匹のマウスについての平均±ＳＤ（垂直の線）である。
【図４】投与から６時間後のＩＬ−１０合成に対する、ＭＣＣの腹腔内、静脈内、および経口投与の効果を示す図である。結果は、群あたり４匹のマウスについての平均±ＳＤ（垂直の線）である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、炎症を有する動物の炎症治療に有効であるマイコバクテリア細胞壁（ＢＣＣ）上に保持及び複合体化されたマイコバクテリアＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡ）を含む。より詳細には、本発明は、炎症を有する動物の炎症治療に有効であるＭ．ｐｈｌｅｉ細胞壁（ＭＣＣ）上に保持及び複合体化されたＭ．ｐｈｌｅｉＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）を含む。本発明は、さらに、動物の炎症の予防法および炎症を有する動物の炎症の治療法を含む。
【００２７】
本明細書中で使用される、「治療する」は、炎症の体積、痛み、または拡大の減少をいう。ＭＣＣの抗炎症活性の増加法には、Ｍ．ｐｈｌｅｉ細胞壁（ＭＣＣ）上に保持及び複合体化されたＭ−ＤＮＡの化学的に付加されるか生物工学的に増幅された刺激配列または高次構造、およびＭＣＣの天然または合成キャリアへの複合体化が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
薬学的に許容可能なキャリア（液体キャリアおよび固体キャリアが含まれるが、これらに限定されない）中にＭＣＣを投与する。液体キャリアは、水性キャリア、非水性キャリアまたはその両方であって、水性懸濁液、油乳濁液、水入り油乳濁液（water in oil emulsions）、水入り油入り水乳濁液（water-in-oil-in-water emulsions）、部位特異的乳濁液、長期耐性乳濁液、粘着性乳濁液、マイクロエマルション、ナノエマルション、およびリポソームが含まれるが、これらに限定されない。固体キャリアは、生物学的キャリア、化学的キャリア、またはその両方であって、マイクロ粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ミニポンプ、微生物細胞壁抽出物、およびＭＣＣの徐放が可能な生分解性または非生分解性の天然または合成ポリマーを含むがこれらに限定されない。このようなポリマーを、送達を必要とする付近に移植することができる。ポリマーおよびその使用は、例えば、Ｂｒｅｍ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：４４１〜４４６、１９９１）に記載されている。
【００２９】
好ましい水性キャリアには、無ＤＮアーゼ水、無ＤＮアーゼ生理食塩水、および生理学的に許容可能な無ＤＮアーゼ緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。好ましい非水性キャリアには、鉱物油または中性油（ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂質、油（多価不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸との適切な混合物を含む）、およびその混合物が含まれるがこれらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。例として、大豆油、カノーラ油、パーム油、オリーブ油、およびマイグリオール（脂肪酸の炭素数が１２個と２２個との間であり、脂肪酸は飽和でも不飽和でもよい）が含まれるが、これらに限定されない。任意選択的に、荷電脂質またはリン脂質を中性油に懸濁させることができる。
【００３０】
例として、ＭＣＣを無ＤＮアーゼ滅菌水に懸濁させ、２０％出力で５分間超音波処理する（Ｍｏｄｅｌ Ｗ−３８５ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．）。任意選択的に、超音波処理したＭ−ＤＮＡを、１流動あたり１５，０００〜３０，０００ｐｓｉでの微量流動化（microfluidization）によって均質化し（Ｍｏｄｅｌ Ｍ−１１０Ｙ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）、オートクレーブ済み蓋付きボトルに移して４℃で保存する。任意選択的に、ＭＣＣ懸濁液またはＭ−ＤＮＡを、非イオン性またはイオン性ポリマー（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ）またはヒアルロン酸など）の添加によって安定化させることができる。
【００３１】
例として、無ＤＮアーゼホスファチジルコリンを２０ｍｌのトリグリセリドに対して１ｇのリン脂質の比で無ＤＮアーゼトリグリセリド大豆油に添加し、５０〜６０℃に穏やかに加熱して溶解させる。数グラムのＭＣＣを乾燥したオートクレーブ済みコンテナに加え、リン脂質−トリグリセリド溶液を２０ｍｌ／ｇのＭＣＣ濃度で添加する。懸濁液を、２０℃で６０分間インキュベートし、１Ｌの無ＤＮアーゼＰＢＳあたり２０ｍｌのＭＣＣ懸濁液の比で、無ＤＮアーゼＰＢＳと混合する。混合物を、２０％出力で５分間超音波処理する（Ｍｏｄｅｌ Ｗ−３８５ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．）。任意選択的に、超音波処理したＭＣＣ混合物を、１流動あたり１５，０００〜３０，０００ｐｓｉでの微量流動化によって均質化し（Ｍｏｄｅｌ Ｍ−１１０Ｙ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、オートクレーブ済み蓋付きボトルに移して４℃で保存する。
【００３２】
投与あたりのＭＣＣの投与量、投与回数、および投薬計画は、炎症の型、炎症の重症度、炎症の位置、および他の臨床因子（患者の体格、重量および体調ならびに投与経路など）に依存し、これらを、過度の実験を行わずに標準的な臨床技術を使用して医師が決定することができる。さらに、任意選択的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いてＭＣＣ投与の至適範囲の同定を援助することができる。
【００３３】
好ましくは、ＭＣＣの投与量は、約０．００００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／投与、より好ましくは約０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇ／投与、最も好ましくは約０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ／投与である。好ましくは、ＭＣＣ中のＭ−ＤＮＡ含有量は、約０．００１と９０ｍｇ／１００ｍｇ乾燥ＭＣＣとの間、より好ましくは約０．０１と４０ｍｇ／１００ｍｇ乾燥ＭＣＣとの間、最も好ましくは約０．１と３０ｍｇ／１００ｍｇ乾燥ＭＣＣとの間である。また、ＭＣＣ中のタンパク質含有量は、約２０ｍｇ／１００ｍｇ乾燥ＭＣＣ未満であり、抽出可能なＭ−ＤＮＡは少なくともＭＣＣ乾燥重量の約４．５％であることが好ましい。
【００３４】
投与経路には、経口、局所、皮下（subcutaneous）、経皮、皮下（subdermal）、筋肉内、腹腔内、膀胱内、動脈内、関節内、静脈内、皮内、頭蓋内、炎症内、眼内、肺内、脊髄内、体腔内の位置、鼻吸入、肺吸入、皮膚への圧痕、およびエレクトロコーポレーション（electrocorporation）が含まれるが、これらに限定されない。投与経路に依存して、投与あたりの体積は、好ましくは約０．０００１ｍｌ〜約１００ｍｌ／投与、より好ましくは約０．００１ｍｌ〜約６０ｍｌ／投与、最も好ましくは約０．０１ｍｌ〜約４０ｍｌ／投与である。
【００３５】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために役立つが、しかし同時に本発明を限定しない。それに対して、本手段は本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲の範囲を逸脱することなく他の実施形態、修正形態、およびその等価物に変更することができ、これらは本明細書中の説明を通読後に当業者が示唆されるであろうことが明確に理解される。
【実施例】
【００３６】
実施例１
ＭＣＣの調製
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９８／００７４４（本明細書中で参考として援用される）に記載のように、ＭＣＣをＭ．ｐｈｌｅｉから調製した。
【００３７】
簡単に述べれば、ＭＣＣを調製するために、Ｍ．ｐｈｌｅｉを液体培地中で増殖させて回収した。Ｍ．ｐｈｌｅｉを破壊し、破壊したＭ．ｐｈｌｅｉの固体成分を遠心沈降で回収する。固体成分を、無ＤＮアーゼトリプシンおよび無ＤＮアーゼプロナーゼでの脱タンパク、無ＤＮアーゼ尿素および無ＤＮアーゼフェノールでの脱脂、および無ＤＮアーゼ水での洗浄によって改変する。
【００３８】
ＭＣＣ調製で使用した全ての試薬は、ＤＮＡの保存を向上させるものを選択した。別記しない限り、ＭＣＣを無ＤＮアーゼ水または薬学的に許容可能な無ＤＮアーゼ緩衝液中に再懸濁し、超音波処理によって乳化した。Ｌｉｍｕｌｕｓ変形細胞溶菌液ＱＣＬ−１０００キット（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて同定したところ、ＭＣＣはエンドトキシンを含まなかった。
【００３９】
実施例２
Ｍ．ｐｈｌｅｉ以外のマイコバクテリア種由来のＢＣＣの調製
実施例１のように、ＢＣＣを、マイコバクテリア種（Ｍ．ｖａｃｃａｅ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎｅｉ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｔｅｒｒａｅ、Ｍ．ｄｕｖａｌｉｉ、Ｍ．ｔｕｂｅｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．Ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇａｓｔｒ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｏｕｓ、およびＭ．ａｓｉａｔｉｃｕｍが含まれるが、これらに限定されない）から調製した。
【００４０】
実施例３
ＭＣＣの投与および炎症の誘導
６．７ ｍｇ ｋｇ-1 ＭＣＣの生理食塩水溶液（実験区）または生理食塩水（コントロール）を、雌ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｓａｉｎｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）に以下のように投与した：静脈内投与（０．２ｍｌ）、腹腔内投与（１．０ｍｌ）、後足蹠への皮下投与（０．０５ｍｌ）、および摂食用ニードルでの経口投与（０．２ｍｌ）。２時間後、最終体積０．０５ｍｌの１％カラゲナン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を、各マウスの後足蹠に注射して炎症を起こさせた。足蹠の腫れをカラゲナン注射から０、３、２４、４８、７２、および９６時間後に水置換の測定によって定量した（Ｆｉｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１２２：５５１〜５５７、１９９７）。
【００４１】
実施例４
ＭＣＣの抗炎症効果
カラゲナンで誘導した炎症は、３時間後に検出され、４８時間後にピークとなり、７２時間後に減少した。ＭＣＣの静脈内投与および経口投与は共に、カラゲナン注射から３時間以内に足蹠の炎症（体積）を有意に緩和させた。ＭＣＣの静脈内投与（５８％緩和）および経口投与（５７％緩和）からどちらも４８時間後に炎症が最も緩和し、少なくとも７２時間持続した（図１および図２）。
【００４２】
後足蹠へのカラゲナン注射の２時間前の同後足蹠へのＭＣＣの皮下投与もまた炎症を緩和
させた。しかし、これは、カラゲナン注射から２４時間後までは明らかではなかった。最大炎症緩和は、４０％であり、これは４８時間後に認められた（図１および図２）。
【００４３】
ＭＣＣの腹腔内投与による４８時間後の炎症の緩和は最小であり、７２時間まで実験マウスとコントロールマウスとの間に足蹠体積の相違は認められなかった（図１および図２）。
【００４４】
実施例５
ＭＣＣによるＩＬ−１０誘導
ＭＣＣのＩＬ−１０およびＴＮＦα合成誘導能力を評価した。ＩＬ−１０は、抗炎症性サイトカインである（Ｉｓｏｍａｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２９：４９９〜５０７、１９９７）。ＴＮＦαは、炎症誘発性サイトカインである（Ｓｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ、１：４０〜４５、１９９５）。
【００４５】
４匹のマウスからなる群に、それぞれ、０．２ｍｌの６．７ｍｇ ｋｇ-1 ＭＣＣ生理食塩水溶液の静脈内投与（実験区）、１．０ｍｌの６．７ｍｇ ｋｇ-1または５０ｍｇ ｋｇ-1
ＭＣＣ生理食塩水溶液の腹腔内投与（実験区）、０．２ｍｌの６．７ｍｇ ｋｇ-1 ＭＣＣ生理食塩水溶液の経口投与（実験区）、または生理食塩水（コントロール）を行った。マウスの尾静脈から採血し、適切なＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）を用いて、ＭＣＣ投与から０、３、６、および／または２４時間後の血清中のＩＬ−１０およびＴＮＦαを定量した。
【００４６】
５０ｍｇ ｋｇ-1 ＭＣＣを腹腔内投与したマウスは、６時間後にピークとなる抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の有意な増加が認められたが、炎症誘発性サイトカインＴＮＦαの有意な増加は認められなかった（図３）。６．７ｍｇ ｋｇ-1 ＭＣＣを腹腔内投与または静脈内投与したマウスは、６時間後にＩＬ−１０合成の最小増加が認められたが、６．７ｍｇ ｋｇ-1 ＭＣＣを経口投与したマウスでは６時間後にＩＬ−１０合成の有意な増加が認められた（図４）。
【００４７】
実施例６
変形性関節症のＭＣＣ治療
衰弱した１０人の変形性関節症患者に、ＭＣＣを１週間に２回４週間静脈投与した。１０人中８人の患者に、痛みの有意な緩和および日常的な仕事を行う能力の有意な向上が認められた。
【００４８】
実施例７
大腸炎のＭＣＣ治療
１５人の大腸炎患者を、３つの群に分けた。群１の患者に生理食塩水、群２の患者にコルチゾン、群３患者にＭＣＣを１日に１回６０日間経口投与した。３０日後、群１の患者では、症状の緩和は報告されなかった。群２の患者では、大腸炎の症状の緩和が報告されたが、コルチゾンの副作用を訴えた。群３の患者では、いかなる副作用の訴えもなく大腸炎の症状の緩和が報告された。
【００４９】
勿論、上記は本発明の好ましい実施形態のみに関し、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲を逸脱することなくその多数の修正形態または変更形態を行うことができると理解されるべきである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願についてのクロスリファレンス）
本出願は、１９９８年１２月４日に提出された、米国仮出願第６０／１１０，９４３号に対して優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、動物の炎症治療に有効であるマイコバクテリア細胞壁（ＢＣＣ）上に保持及び複合体化されたマイコバクテリアデオキシリボ核酸（Ｂ−ＤＮＡ）に関する。より詳細には、本発明は、動物の炎症治療に有効であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ細胞壁（ＭＣＣ）上に保持及び複合体化されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）デオキシリボ核酸（Ｍ−ＤＮＡ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
炎症は、組織損傷によって引き起こされる複雑な過程である。炎症は損傷および感染に対する防御反応として発症するが、一定の症例（免疫媒介性炎症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、糸球体腎炎、膀胱炎、および大腸炎などが含まれるが、これらに限定されない）ではその炎症自体が問題となる。これらの症例では、炎症反応は持続し、抗炎症剤（アスピリン、非ステロイド性抗炎症薬、およびコルチゾンなど）、の投与によって一時的に緩和することしかできない。これらの薬物は、炎症の薬理学的メディエーターの同化作用および活性化に関連する代謝経路に対して作用する。しかし、これらの抗炎症剤は、多数の望ましくない副作用を有し、一定の個体では耐容性を示すことができない。
【０００４】
したがって、有害な副作用を起こすことなく炎症を緩和する新規の治療薬がなお必要とされている。さらに、このような治療薬は、調製が簡単で比較的安価であるべきであり、その活性は調製物に共通して再現性があるべきであり、その活性は長期間安定であるべきであり、その抗炎症効果は最小中毒量で行われるべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、炎症を有する動物の炎症治療に有効であるマイコバクテリア細胞壁（ＢＣＣ）上に保持及び複合体化されたマイコバクテリアデオキシリボ核酸（Ｂ−ＤＮＡ）を提供することによって前述の必要性を満たす。より詳細には、本発明は、炎症を有する動物の炎症治療に有効であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ細胞壁（ＭＣＣ）上に保持及び複合体化されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ（Ｍ．ｐｈｅｌｉ）デオキシリボ核酸（Ｍ−ＤＮＡ）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＭＣＣは、調製が簡単で比較的安価であり、その活性は調製物に共通して再現性があり、治療において長期間安定しており、反復投与の場合にも副作用を最小にする投薬計画で有効である。
【０００７】
ＭＣＣを調製するために、Ｍ．ｐｈｌｅｉを液体培地で増殖させて回収する。Ｍ．ｐｈｌｅｉを破壊し、破壊したＭ．ｐｈｌｅｉの固体成分を遠心沈降で回収する。固体成分を脱タンパク、脱脂、および洗浄する。無ＤＮアーゼ試薬を使用して調製の際のＭ−ＤＮＡの分解を最小にする。
【０００８】
ＭＣＣおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を、ヒトを含む動物の炎症の予防、緩和、および排除有効量で投与する。予想外で驚くべきＭＣＣの炎症緩和能力は、ＭＣＣ自体の副作用が最小である上に、医学分野に長い間存在する実現されていない切実な必要性に対応し、ヒトを含む動物に重要な利点を与える。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、炎症を有する動物の炎症の治療に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、炎症を有する動物の炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、動物の炎症の予防に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、炎症を有する動物の炎症の排除に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、動物のＩＬ−１０合成の刺激に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、免疫媒介性炎症を有する動物の免疫媒介性炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、変形性関節症を有する動物の変形性関節症による炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、慢性関節リウマチを有する動物の慢性関節リウマチによる炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、糸球体腎炎を有する動物の糸球体腎炎による炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、大腸炎を有する動物の大腸炎による炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の別の目的は、膀胱炎を有する動物の膀胱炎による炎症の緩和に有効な組成物および方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の別の目的は、大量に調製することができる組成物を提供することにある。
【００２１】
本発明の別の目的は、比較的安価で調製される組成物を提供することにある。
【００２２】
本発明の別の目的は、長期間安定である組成物を提供することにある。
【００２３】
本発明の別の目的は、長期間その効力が持続する組成物を提供することにある。
【００２４】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴、および利点は、以下に開示される実施形態の詳細な説明および添付の特許請求の範囲を検討することによって明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】カラゲナンの注射から０、２４、４８、７２、および９６時間後のマウス足蹠体積に対する、ＭＣＣの静脈内、腹腔内、経口、および皮下投与の効果を示す図である。結果は、群あたり８匹のマウスについての平均±ＳＤ（垂直の線）である。
【図２】カラゲナン注射から４８時間後のマウス足蹠体積に対する、ＭＣＣの静脈内、腹腔内、経口、および皮下投与の効果を示す図である。結果は、群あたり８匹のマウスについての平均±ＳＤ（垂直の線）である。
【図３】投与から０、３、６、および２４時間後のＴＮＦαおよびＩＬ−１０合成に対する、ＭＣＣの腹腔内投与の効果を示す図である。結果は、群あたり４匹のマウスについての平均±ＳＤ（垂直の線）である。
【図４】投与から６時間後のＩＬ−１０合成に対する、ＭＣＣの腹腔内、静脈内、および経口投与の効果を示す図である。結果は、群あたり４匹のマウスについての平均±ＳＤ（垂直の線）である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、炎症を有する動物の炎症治療に有効であるマイコバクテリア細胞壁（ＢＣＣ）上に保持及び複合体化されたマイコバクテリアＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡ）を含む。より詳細には、本発明は、炎症を有する動物の炎症治療に有効であるＭ．ｐｈｌｅｉ細胞壁（ＭＣＣ）上に保持及び複合体化されたＭ．ｐｈｌｅｉＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）を含む。本発明は、さらに、動物の炎症の予防法および炎症を有する動物の炎症の治療法を含む。
【００２７】
本明細書中で使用される、「治療する」は、炎症の体積、痛み、または拡大の減少をいう。ＭＣＣの抗炎症活性の増加法には、Ｍ．ｐｈｌｅｉ細胞壁（ＭＣＣ）上に保持及び複合体化されたＭ−ＤＮＡの化学的に付加されるか生物工学的に増幅された刺激配列または高次構造、およびＭＣＣの天然または合成キャリアへの複合体化が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
薬学的に許容可能なキャリア（液体キャリアおよび固体キャリアが含まれるが、これらに限定されない）中にＭＣＣを投与する。液体キャリアは、水性キャリア、非水性キャリアまたはその両方であって、水性懸濁液、油乳濁液、水入り油乳濁液（water in oil emulsions）、水入り油入り水乳濁液（water-in-oil-in-water emulsions）、部位特異的乳濁液、長期耐性乳濁液、粘着性乳濁液、マイクロエマルション、ナノエマルション、およびリポソームが含まれるが、これらに限定されない。固体キャリアは、生物学的キャリア、化学的キャリア、またはその両方であって、マイクロ粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ミニポンプ、微生物細胞壁抽出物、およびＭＣＣの徐放が可能な生分解性または非生分解性の天然または合成ポリマーを含むがこれらに限定されない。このようなポリマーを、送達を必要とする付近に移植することができる。ポリマーおよびその使用は、例えば、Ｂｒｅｍ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：４４１〜４４６、１９９１）に記載されている。
【００２９】
好ましい水性キャリアには、無ＤＮアーゼ水、無ＤＮアーゼ生理食塩水、および生理学的に許容可能な無ＤＮアーゼ緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。好ましい非水性キャリアには、鉱物油または中性油（ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂質、油（多価不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸との適切な混合物を含む）、およびその混合物が含まれるがこれらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。例として、大豆油、カノーラ油、パーム油、オリーブ油、およびマイグリオール（脂肪酸の炭素数が１２個と２２個との間であり、脂肪酸は飽和でも不飽和でもよい）が含まれるが、これらに限定されない。任意選択的に、荷電脂質またはリン脂質を中性油に懸濁させることができる。
【００３０】
例として、ＭＣＣを無ＤＮアーゼ滅菌水に懸濁させ、２０％出力で５分間超音波処理する（Ｍｏｄｅｌ Ｗ−３８５ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．）。任意選択的に、超音波処理したＭ−ＤＮＡを、１流動あたり１５，０００〜３０，０００ｐｓｉでの微量流動化（microfluidization）によって均質化し（Ｍｏｄｅｌ Ｍ−１１０Ｙ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）、オートクレーブ済み蓋付きボトルに移して４℃で保存する。任意選択的に、ＭＣＣ懸濁液またはＭ−ＤＮＡを、非イオン性またはイオン性ポリマー（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ）またはヒアルロン酸など）の添加によって安定化させることができる。
【００３１】
例として、無ＤＮアーゼホスファチジルコリンを２０ｍｌのトリグリセリドに対して１ｇのリン脂質の比で無ＤＮアーゼトリグリセリド大豆油に添加し、５０〜６０℃に穏やかに加熱して溶解させる。数グラムのＭＣＣを乾燥したオートクレーブ済みコンテナに加え、リン脂質−トリグリセリド溶液を２０ｍｌ／ｇのＭＣＣ濃度で添加する。懸濁液を、２０℃で６０分間インキュベートし、１Ｌの無ＤＮアーゼＰＢＳあたり２０ｍｌのＭＣＣ懸濁液の比で、無ＤＮアーゼＰＢＳと混合する。混合物を、２０％出力で５分間超音波処理する（Ｍｏｄｅｌ Ｗ−３８５ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．）。任意選択的に、超音波処理したＭＣＣ混合物を、１流動あたり１５，０００〜３０，０００ｐｓｉでの微量流動化によって均質化し（Ｍｏｄｅｌ Ｍ−１１０Ｙ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、オートクレーブ済み蓋付きボトルに移して４℃で保存する。
【００３２】
投与あたりのＭＣＣの投与量、投与回数、および投薬計画は、炎症の型、炎症の重症度、炎症の位置、および他の臨床因子（患者の体格、重量および体調ならびに投与経路など）に依存し、これらを、過度の実験を行わずに標準的な臨床技術を使用して医師が決定することができる。さらに、任意選択的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いてＭＣＣ投与の至適範囲の同定を援助することができる。
【００３３】
好ましくは、ＭＣＣの投与量は、約０．００００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／投与、より好ましくは約０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇ／投与、最も好ましくは約０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ／投与である。好ましくは、ＭＣＣ中のＭ−ＤＮＡ含有量は、約０．００１と９０ｍｇ／１００ｍｇ乾燥ＭＣＣとの間、より好ましくは約０．０１と４０ｍｇ／１００ｍｇ乾燥ＭＣＣとの間、最も好ましくは約０．１と３０ｍｇ／１００ｍｇ乾燥ＭＣＣとの間である。また、ＭＣＣ中のタンパク質含有量は、約２０ｍｇ／１００ｍｇ乾燥ＭＣＣ未満であり、抽出可能なＭ−ＤＮＡは少なくともＭＣＣ乾燥重量の約４．５％であることが好ましい。
【００３４】
投与経路には、経口、局所、皮下（subcutaneous）、経皮、皮下（subdermal）、筋肉内、腹腔内、膀胱内、動脈内、関節内、静脈内、皮内、頭蓋内、炎症内、眼内、肺内、脊髄内、体腔内の位置、鼻吸入、肺吸入、皮膚への圧痕、およびエレクトロコーポレーション（electrocorporation）が含まれるが、これらに限定されない。投与経路に依存して、投与あたりの体積は、好ましくは約０．０００１ｍｌ〜約１００ｍｌ／投与、より好ましくは約０．００１ｍｌ〜約６０ｍｌ／投与、最も好ましくは約０．０１ｍｌ〜約４０ｍｌ／投与である。
【００３５】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために役立つが、しかし同時に本発明を限定しない。それに対して、本手段は本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲の範囲を逸脱することなく他の実施形態、修正形態、およびその等価物に変更することができ、これらは本明細書中の説明を通読後に当業者が示唆されるであろうことが明確に理解される。
【実施例】
【００３６】
実施例１
ＭＣＣの調製
国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９８／００７４４（本明細書中で参考として援用される）に記載のように、ＭＣＣをＭ．ｐｈｌｅｉから調製した。
【００３７】
簡単に述べれば、ＭＣＣを調製するために、Ｍ．ｐｈｌｅｉを液体培地中で増殖させて回収した。Ｍ．ｐｈｌｅｉを破壊し、破壊したＭ．ｐｈｌｅｉの固体成分を遠心沈降で回収する。固体成分を、無ＤＮアーゼトリプシンおよび無ＤＮアーゼプロナーゼでの脱タンパク、無ＤＮアーゼ尿素および無ＤＮアーゼフェノールでの脱脂、および無ＤＮアーゼ水での洗浄によって改変する。
【００３８】
ＭＣＣ調製で使用した全ての試薬は、ＤＮＡの保存を向上させるものを選択した。別記しない限り、ＭＣＣを無ＤＮアーゼ水または薬学的に許容可能な無ＤＮアーゼ緩衝液中に再懸濁し、超音波処理によって乳化した。Ｌｉｍｕｌｕｓ変形細胞溶菌液ＱＣＬ−１０００キット（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて同定したところ、ＭＣＣはエンドトキシンを含まなかった。
【００３９】
実施例２
Ｍ．ｐｈｌｅｉ以外のマイコバクテリア種由来のＢＣＣの調製
実施例１のように、ＢＣＣを、マイコバクテリア種（Ｍ．ｖａｃｃａｅ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎｅｉ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｔｅｒｒａｅ、Ｍ．ｄｕｖａｌｉｉ、Ｍ．ｔｕｂｅｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．Ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇａｓｔｒ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｏｕｓ、およびＭ．ａｓｉａｔｉｃｕｍが含まれるが、これらに限定されない）から調製した。
【００４０】
実施例３
ＭＣＣの投与および炎症の誘導
６．７ ｍｇ ｋｇ-1 ＭＣＣの生理食塩水溶液（実験区）または生理食塩水（コントロール）を、雌ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｓａｉｎｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）に以下のように投与した：静脈内投与（０．２ｍｌ）、腹腔内投与（１．０ｍｌ）、後足蹠への皮下投与（０．０５ｍｌ）、および摂食用ニードルでの経口投与（０．２ｍｌ）。２時間後、最終体積０．０５ｍｌの１％カラゲナン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を、各マウスの後足蹠に注射して炎症を起こさせた。足蹠の腫れをカラゲナン注射から０、３、２４、４８、７２、および９６時間後に水置換の測定によって定量した（Ｆｉｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１２２：５５１〜５５７、１９９７）。
【００４１】
実施例４
ＭＣＣの抗炎症効果
カラゲナンで誘導した炎症は、３時間後に検出され、４８時間後にピークとなり、７２時間後に減少した。ＭＣＣの静脈内投与および経口投与は共に、カラゲナン注射から３時間以内に足蹠の炎症（体積）を有意に緩和させた。ＭＣＣの静脈内投与（５８％緩和）および経口投与（５７％緩和）からどちらも４８時間後に炎症が最も緩和し、少なくとも７２時間持続した（図１および図２）。
【００４２】
後足蹠へのカラゲナン注射の２時間前の同後足蹠へのＭＣＣの皮下投与もまた炎症を緩和
させた。しかし、これは、カラゲナン注射から２４時間後までは明らかではなかった。最大炎症緩和は、４０％であり、これは４８時間後に認められた（図１および図２）。
【００４３】
ＭＣＣの腹腔内投与による４８時間後の炎症の緩和は最小であり、７２時間まで実験マウスとコントロールマウスとの間に足蹠体積の相違は認められなかった（図１および図２）。
【００４４】
実施例５
ＭＣＣによるＩＬ−１０誘導
ＭＣＣのＩＬ−１０およびＴＮＦα合成誘導能力を評価した。ＩＬ−１０は、抗炎症性サイトカインである（Ｉｓｏｍａｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２９：４９９〜５０７、１９９７）。ＴＮＦαは、炎症誘発性サイトカインである（Ｓｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ、１：４０〜４５、１９９５）。
【００４５】
４匹のマウスからなる群に、それぞれ、０．２ｍｌの６．７ｍｇ ｋｇ-1 ＭＣＣ生理食塩水溶液の静脈内投与（実験区）、１．０ｍｌの６．７ｍｇ ｋｇ-1または５０ｍｇ ｋｇ-1
ＭＣＣ生理食塩水溶液の腹腔内投与（実験区）、０．２ｍｌの６．７ｍｇ ｋｇ-1 ＭＣＣ生理食塩水溶液の経口投与（実験区）、または生理食塩水（コントロール）を行った。マウスの尾静脈から採血し、適切なＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）を用いて、ＭＣＣ投与から０、３、６、および／または２４時間後の血清中のＩＬ−１０およびＴＮＦαを定量した。
【００４６】
５０ｍｇ ｋｇ-1 ＭＣＣを腹腔内投与したマウスは、６時間後にピークとなる抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の有意な増加が認められたが、炎症誘発性サイトカインＴＮＦαの有意な増加は認められなかった（図３）。６．７ｍｇ ｋｇ-1 ＭＣＣを腹腔内投与または静脈内投与したマウスは、６時間後にＩＬ−１０合成の最小増加が認められたが、６．７ｍｇ ｋｇ-1 ＭＣＣを経口投与したマウスでは６時間後にＩＬ−１０合成の有意な増加が認められた（図４）。
【００４７】
実施例６
変形性関節症のＭＣＣ治療
衰弱した１０人の変形性関節症患者に、ＭＣＣを１週間に２回４週間静脈投与した。１０人中８人の患者に、痛みの有意な緩和および日常的な仕事を行う能力の有意な向上が認められた。
【００４８】
実施例７
大腸炎のＭＣＣ治療
１５人の大腸炎患者を、３つの群に分けた。群１の患者に生理食塩水、群２の患者にコルチゾン、群３患者にＭＣＣを１日に１回６０日間経口投与した。３０日後、群１の患者では、症状の緩和は報告されなかった。群２の患者では、大腸炎の症状の緩和が報告されたが、コルチゾンの副作用を訴えた。群３の患者では、いかなる副作用の訴えもなく大腸炎の症状の緩和が報告された。
【００４９】
勿論、上記は本発明の好ましい実施形態のみに関し、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲を逸脱することなくその多数の修正形態または変更形態を行うことができると理解されるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウム・フレイ（Mycobacterium phlei）細胞壁上に保持され複合体化されたマイコバクテリウム・フレイ−ＤＮＡ及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、動物における炎症の治療又は予防のための組成物。
【請求項２】
ＩＬ−１０を誘導することにより、動物における炎症の治療又は予防に効果を発揮することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記薬学的に許容可能なキャリアは液体キャリアおよび固体キャリアからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
マイコバクテリウム・フレイ細胞壁上に保持され複合体化されたマイコバクテリウム・フレイ−ＤＮＡ及び薬学的に許容可能なキャリアを用いることを特徴とする、動物において炎症を治療又は予防する薬剤の製造方法。
【請求項５】
前記薬剤は、ＩＬ−１０の合成を誘導することにより動物における炎症の治療又は予防に効果を発揮する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記薬学的に許容可能なキャリアは、液体キャリアおよび固体キャリアからなる群から選択される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項１】
マイコバクテリウム・フレイ（Mycobacterium phlei）細胞壁上に保持され複合体化されたマイコバクテリウム・フレイ−ＤＮＡ及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、動物における炎症の治療又は予防のための組成物。
【請求項２】
ＩＬ−１０を誘導することにより、動物における炎症の治療又は予防に効果を発揮することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記薬学的に許容可能なキャリアは液体キャリアおよび固体キャリアからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
マイコバクテリウム・フレイ細胞壁上に保持され複合体化されたマイコバクテリウム・フレイ−ＤＮＡ及び薬学的に許容可能なキャリアを用いることを特徴とする、動物において炎症を治療又は予防する薬剤の製造方法。
【請求項５】
前記薬剤は、ＩＬ−１０の合成を誘導することにより動物における炎症の治療又は予防に効果を発揮する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記薬学的に許容可能なキャリアは、液体キャリアおよび固体キャリアからなる群から選択される、請求項４又は５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１３１４（Ｐ２０１０−１３１４Ａ）
【公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３０７０８（Ｐ２００９−２３０７０８）
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【分割の表示】特願２０００−５８６３６９（Ｐ２０００−５８６３６９）の分割
【原出願日】平成１１年１２月３日（１９９９．１２．３）
【出願人】（５０３０８２７２３）バイオニケ ライフ サイエンシーズ インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【分割の表示】特願２０００−５８６３６９（Ｐ２０００−５８６３６９）の分割
【原出願日】平成１１年１２月３日（１９９９．１２．３）
【出願人】（５０３０８２７２３）バイオニケ ライフ サイエンシーズ インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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