点変異およびＳＮＰの検出のための高感度迅速等温法、そのプライマーのセットおよびキット
本発明は、ＬＡＭＰ（ループ増幅媒介性重合）増幅法の改善によって、ヌクレオチド配列の点変異を検出する方法ならびにそのプライマーのセットおよびキットに関する。非制限的実施形態として、本発明は、ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善されたＬＡＭＰ（ループ増幅媒介性重合）増幅法によってヌクレオチド配列中の点変異またはＳＮＰを検出する方法ならびに本発明の方法を実施するためのプライマーのセットおよびキットに関する。限定されない実施形態によれば、本方法、プライマーのセットおよびキットは、ＪＡＫ２遺伝子におけるＧ１８４９Ｔ（Ｖ６１７Ｆ）変異を検出するのに適している。
【背景技術】
【０００２】
骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）は、造血前駆細胞のクローン性障害であり、古典的ＭＰＤ慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、真性多血症（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）および原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）ならびに慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）および全身性肥満細胞症（ＳＭ）およびその他のものを含む。過去２０年において、ＣＭＬ、ＣＭＭＬ、ＣＥＬおよびＳＭ２−５において変異体対立遺伝子が同定されており、各場合において、原因である変異は、チロシンキナーゼシグナル伝達の構成的活性化をもたらす。最もよく見られるＭＰＤの遺伝子的原因は、ＰＶ、ＥＴまたはＰＭＦのほとんどの患者においてヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）シグナル伝達を活性化する変異が同定されるまでは、わからないままであった（１、２、３、４）。ＪＡＫ２は、細胞質非受容体チロシンキナーゼのヤヌスファミリーのメンバーであり、これはまた、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２も含む。該変異は、ＡＴＧ開始コドンで出発して番号をつけ、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２、配列番号１）中の位置１８４９でのグアニンからチミジンへの置換であり、配列番号１の位置２３４３に対応する。このような変異は、ＪＨ２偽キナーゼ（ｐｓｅｕｄｏｋｉｎａｓｅ）ドメイン内のＪＡＫ２タンパク質のアミノ酸６１７でのバリンのフェニルアラニンとの置換（ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ）をもたらす（５）。ＪＡＫ２自己抑制の喪失は、チロシンキナーゼを異常に活性化する、ＭＰＤおよび白血病におけるその他の変異と類似しているキナーゼの構成的活性化をもたらす（６、７、８）。
【０００３】
直接配列決定は、野生型バックグラウンドにおける約２０％の変異体ＤＮＡまでしか感知できない（９、１０）。この問題は、血液および骨髄がしばしば、腫瘍性造血要素と残存する正常な造血要素の混合物からなる慢性骨髄性障害と相当に関連している。これは、表現型的に明らかな遺伝子変異が、全骨髄細胞集団を１０％未満含む小さいクローン中に存在し得るＥＴおよびＭＤＳの場合は特にそうである。James et al.（１１）では、この問題が、ＪＡＫ２変異を有さないＴＦ−１赤白血病細胞と混合された、ＪＡＫ２変異を有するＨＥＬ赤白血病細胞を用いて一連の混合実験を実施することによって、ＪＡＫ２ １８４９ Ｇ−Ｔに関して具体的に研究されている。彼らは、変異した対立遺伝子が全ＤＮＡの＜５％で存在した場合には、それを検出できなかった。健常な人から得たＤＮＡで希釈したホモ接合性変異体患者のＤＮＡを用いた場合は、配列決定は、細胞株を用いたものよりも感度がさらに低かった（１０％）（１２）。
【０００４】
核酸変異の検出に使用される一般的な方法として、増幅不応性変異系（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＲＭＳ）がある。それは、オリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲの際にこれらのプライマーを伸長するには、その３’末端でＤＮＡポリメラーゼに対して完全にアニーリングされなくてはならないという事実を利用する（１２）。ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆをコードするものなどの特定のＤＮＡ点変異にのみ合致するオリゴヌクレオチドプライマーを設計することによって、ＡＲＭＳは、多型対立遺伝子間を区別することができる。したがって、これらの技術は、「対立遺伝子特異的ＰＣＲ」（ＡＳ−ＰＣＲ）または「配列特異的プライマーＰＣＲ」の別名で通っている。ＡＲＭＳ感度は、野生型バックグラウンド中、最大１〜２％（１３）変異体ＤＮＡである。
【０００５】
サーモサイクリングの間のＰＣＲ産物蓄積のリアルタイムモニタリングは、半定量的方法として価値のあるものであり、リアルタイムＰＣＲととともにＤＮＡ融解曲線アッセイを使用することができる。同様に、James et al.（１４）では、蛍光色素化学配列決定を、２種の異なるリアルタイムＰＣＲをベースとする変異検出システム（一方はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ機器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、もう一方は、Ｔａｑｍａｎ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する）と比較した。これらのリアルタイムＰＣＲ技術は、ＴＦ−１細胞株ＤＮＡで希釈した０．５〜１％のＨＥＬ細胞株ＤＮＡおよび健常なヒトから得たＤＮＡで希釈した２〜４％のホモ接合性変異患者ＤＮＡを検出した。
【０００６】
ＪＡＫ２ １８４９ Ｇ−Ｔ変異は、制限酵素ＢｓａＸＩによって認識される野生型ＪＡＫ２配列中のモチーフを消滅させるので、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析が可能である。負の酵素切断反応は、変異の不在または消化手順の失敗のいずれかによる場合があるので、制限部位の消滅は、新規部位の作製と同程度には満足できるものではないが、初回パス解析として有用であり得る。報告された比例する感度は、断片を検出するために使用される方法に応じて幾分か変わるが、野生型バックグラウンド中、約２０％の変異体ＤＮＡである（１５、１６）。
【０００７】
ピロシーケンスは、ｄＮＴＰが、鋳型駆動性ＤＮＡ重合の際に増大するＤＮＡ鎖中に組み込まれる度に、ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の遊離に依存する迅速遺伝子型判定の方法である（１７）。自動化ＰＳＱ ＨＳ ９６系（Ｂｉｏｔａｇｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するＪＡＫ２のピロシーケンスが、いくつかのグループによって試みられ（１７、１８）、上記のものと同様の希釈実験が、野生型バックグラウンド中、５〜１０％の変異体対立遺伝子の報告されたアッセイ感度を示した。
【０００８】
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、変性高性能液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）、単一ヌクレオチドプライマー伸長アッセイ（Ｐｒｏｎｔｏ）などを含め、いくつかのその他の変異検出技術が記載されている。実際、ＤＨＰＬＣは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの根底にあるゲノムＤＮＡ変異を確実に検出でき、＜１〜２％の割合で変異を検出できる。しかし、ＤＨＰＬＣおよびその他の技術は、技術的に困難であるか、労働集約的であるか、またはその両方である。それらは、臨床検査室に適した費用ではハイスループットを可能にしない（ＳＳＣＰおよびＤＧＧＥ）か、または装置のために相当な初期投資を必要とする（ＤＨＰＬＣ）。
【０００９】
理論的には、タンパク質ベースの技術も、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異を検出するために使用できるが、これらは、一般に、扱いにくいものであり、このような供給源を入手する機会も限られている。したがって、タンパク質ベースのアッセイは、ＤＮＡまたはＲＮＡをベースとする試験が実現可能な場合には、通常好まれない。
【００１０】
欧州特許出願ＥＰ１６９２２８１Ａには、ＰＣＲ増幅に基づいてＧ１８４９Ｔ ＪＡＫ２変異を検出するための方法が開示されている。
【００１１】
先行技術の方法は、いくつかの制限を示す。まず第一に、最良の場合において、１％のサンプルまでの変異体ＪＡＫ２配列の検出を可能にする低レベルの感度。このような感度は、抽出の前の顆粒球単離による変異体の濃縮を必要とする。これは、多大な時間を必要とする労働集約的な工程であり、診断に必要とされるすでに長い手順（２〜５時間）にさらに約２時間をもたらす。さらに、これまでに示されたすべての方法は、比較的、労働集約的であり、費用がかかり、常に容易に入手可能とは限らない特別な装置を必要とすることが多い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、特に選択的で、迅速な核酸分子中の点変異またはＳＮＰを検出する新規ＬＡＭＰ法を提示した。本発明者らはまた、本発明の方法を実施するための新規プライマーのセットおよびキットも提示した。核酸点変異またはＳＮＰを検出する方法ならびにそのプライマーのセットおよびキットは、記載の不可欠な部分を形成する添付の特許請求の範囲に定義される特徴を有する。
【００１３】
本発明の方法は、欧州特許出願ＥＰ１０２０５３４Ａに開示され、本願の図１において表される従来のＬＡＭＰ技術とは異なる。本発明の方法によって、核酸サンプル中の単一塩基置換の同時選択的増幅および検出が可能になる。さらに、本発明の方法は、簡単な計測手段を必要とするだけであって、結果は単一の試験管反応で得ることができるので、実施が容易である。これらの理由から、先行技術の方法と比較してあまり費用がかからない。
【００１４】
本発明の方法は、先行技術の技術の限界および欠点を克服し、その結果、高い感度（野生型バックグラウンド中０．０１％の変異体配列にまで）をもたらし、等温かつ迅速であり、診断を１時間の反応で完了する。さらに、本発明の方法によって、試験されたサンプル中に存在する変異体対立遺伝子、例えば、変異体ＪＡＫ２対立遺伝子などの量が、５０％よりも高いか低いかを評価し、被験体が、目的の核酸単一点変異またはＳＮＰについてヘテロ接合性であるかまたはホモ接合性であるかについての指標として提供することが可能となる。
【００１５】
したがって、本発明の第１の態様は、野生型核酸分子のバックグラウンド内の標的核酸分子中の点変異の存在を検出する方法であって、該方法は、
１）核酸サンプルを提供する工程、
２）適当な反応条件下で、前記核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドの混合物とおよびハイブリダイゼーション条件下で鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む溶液と接触させる工程であって、前記のオリゴヌクレオチドの混合物が、検出されるべき点変異の核酸位置を含む標的核酸分子の領域のループ媒介性等温増幅に適したプライマーからなり、前記プライマーが、
ｉ．第１の外側プライマーＦ３および第２の外側プライマーＢ３と、
ｉｉ．第１の内側プライマーＦＩＰおよび第２の内側プライマーＢＩＰと、
ｉｉｉ．ステムループ変異体伸長性プライマーと、
ｉｖ．野生型核酸分子を選択的に認識し、ハイブリダイズできる非伸長性部分と
を含み、
ＦＩＰが、３’核酸配列Ｆ２および５’核酸配列Ｆ１ｃからなり、ＢＩＰが、３’核酸配列Ｂ２および５’核酸配列Ｂ１ｃからなり、
Ｆ２が、Ｆ２ｃと呼ばれる標的核酸分子の領域を認識およびハイブリダイズでき、Ｂ２が、Ｂ２ｃと呼ばれる標的核酸分子の領域を認識およびハイブリダイズでき、
Ｆ２ｃおよびＢ２ｃが、標的核酸分子の反対側の鎖に位置する異なる領域であり、
Ｂ２ｃが、点変異の下流にあるか、またはＦ２ｃが点変異の上流にあるかのいずれかであり、
Ｂ２ｃが点変異の下流にある場合には、前記の点変異は、Ｆ２ｃ配列中に位置するか、またはＦ２ｃ配列の下流であってＦ１ｃ配列の上流に位置し、またはＦ２ｃが点変異の上流にある場合には、前記の点変異は、Ｂ２ｃ配列中に位置するか、またはＢ２ｃ配列の上流であってＢ１ｃ配列の下流に位置し、
前記ステムループ変異体伸長性プライマーが、
−中央ループ配列が、点変異が存在する場合にのみ、標的核酸分子を認識し、ハイブリダイズできるように、点変異を含む標的核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズすることができる中央ループ配列と、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するように互いに相補的である、５’末端配列および３’末端配列と
を含み、
点変異を含む標的核酸分子の領域に対する中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、３’配列に対する５’配列の分子内ハイブリダイゼーション親和性より高く、その結果、点変異が存在する場合に、中央ループ配列が、点変異を含む標的核酸分子の領域とアニールし、増幅する、工程、
３）得られた混合物を一定温度でインキュベートする工程、ならびに
４）点変異を含む標的核酸分子の領域の増幅を示すシグナルを検出する工程
を含む。
【００１６】
本方法の第１の工程は、例えば、ヘテロ接合型または、ホモ接合型のいずれかで目的の点変異を保有する疑いのある患者から、試験されるべき核酸サンプルを得ることを意味する。
【００１７】
好ましい実施形態では、２種の内側プライマーＦＩＰおよびＢＩＰは、検出されるべき点変異の核酸位置を含む標的核酸分子の領域上で設計され、その結果、該点変異は、Ｆ２ｃ配列とＦ１ｃ配列の間またはＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列の間の領域中に位置する。代替実施形態では、点変異は、Ｂ２またはＦ２によってプローブされる領域中、すなわち、Ｆ２ｃ配列内またはＢ２ｃ配列内に位置する。
【００１８】
別の好ましい実施形態では、ステムループ変異体伸長性プライマーの５’末端の配列および３’末端の配列は、少なくとも３ヌクレオチドの長さである。あるいは、ステムループ変異体伸長性プライマーは、「自己アニーリング型変異体伸長性プライマー」、またはより簡単に「自己アニーリング型伸長性プライマー」（ＬＢまたはＬＦ）と呼ばれることもある。
【００１９】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、非伸長性部分は、好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さのペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＤＮＡおよびＲＮＡは、それぞれ、デオキシリボースおよびリボース糖骨格からなるのに対し、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結している反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位からできている。プリンおよびピリミジン塩基は、メチレンカルボニル結合によって骨格と連結している。ＰＮＡは、ペプチドのように表され、最初の（左の）位置にＮ末端および右にＣ末端がある。ＰＮＡの骨格は、リン酸基を全く含有しないので、ＰＮＡ／ＤＮＡ鎖間の結合は、静電反発力がないためにＤＮＡ／ＤＮＡ鎖間よりも強い。
【００２０】
本発明の最も好ましい実施形態では、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、推定点変異を含む（すなわち、検出されるべき点変異の核酸位置を含む）核酸分子の領域とハイブリダイズでき、それによって、野生型標的核酸分子を有する一本と、変異標的核酸分子を有するもう一本との２つの二本鎖構造の形成をもたらす塩基の配列を含む。ＰＮＡの、点変異の不在下における標的核酸分子との（すなわち、野生型配列との）ハイブリダイゼーションに起因する二本鎖構造の融解温度は、（Ｔｍ）＝Ｘと表され、ＰＮＡの、点変異の存在下における標的核酸分子との（すなわち、変異配列との）ハイブリダイゼーションに起因する二本鎖構造の融解温度は、（Ｔｍ）＝Ｙと表される。好ましい実施形態によれば、Ｙ＜インキュベーション温度≦Ｘであり、Ｘは、Ｙよりも少なくとも５℃高い。
【００２１】
本発明の代替実施形態では、非伸長性部分は、
−検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズできる中央ループ配列と、
−５’末端配列および３’末端配列と
を含むステムループ野生型非伸長性プライマーであり、前記５’末端および前記３’末端配列は、ステムを形成するよう互いに相補的であり、その結果、前記中央ループ配列が、核酸分子の野生型配列を含む領域に対して、５’末端配列の、３’末端配列に対するハイブリダイゼーション親和性よりも高いハイブリダイゼーション親和性を有し、その結果、ＷＴ配列とのアニーリングおよびＷＴ配列の増幅の阻止をもたらす。当業者ならば、５’末端配列と３’末端配列間のハイブリダイゼーションは、分子内ハイブリダイゼーションであるという事実は、承知している。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、反応条件下で鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ大断片（ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）ポリメラーゼであるか、あるいは、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Φ２９ファージ、ＭＳ−２ファージ、Ｚ−Ｔａｑ、ＫＯＤ、クレノウ断片のうちの１種またはそれらの組合せである。
【００２３】
好ましい実施形態では、一定反応温度は、６２℃〜６７℃の間からなる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、点変異を含むヌクレオチド分子の増幅を示すシグナルは、比濁法によって検出される。あるいは、点変異を含むヌクレオチド分子の増幅を示すシグナルは、蛍光または任意のその他の適した検出のための手段によって検出される。
【００２５】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、標的核酸分子は、配列番号２の塩基９３５２６で推定グアニン−チミジン置換を含有するヒトＪＡＫ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ ００９９０４、配列番号２）の領域を含み、これは、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２、配列番号１）中の開始コドンからヌクレオチド位置１８４９に対応し、次いで、配列番号１の位置２３４３に対応する。
【００２６】
第１および第２の外側プライマーＦ３およびＢ３は、位置９３５２６に推定Ｇ→Ｔ塩基置換を含有するヒトＪＡＫ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ ００９９０４、配列番号２）のエキソン１４の側面に位置するイントロン領域中にそれぞれ位置することが好ましい。Ｆ３は、配列番号２の位置９３３６７〜９３３８８に及ぶヌクレオチド配列からなり、Ｂ３は、配列番号２の位置９３５６１〜９３５８２間のヌクレオチド領域と相補的であるヌクレオチド配列からなることがより好ましい。第１および第２の内側プライマーＦＩＰおよびＢＩＰは、以下の通りに設計されることが好ましい。ＦＩＰプライマーは、ＪＡＫ２エキソン１４の上流のイントロン領域中（好ましくは、配列番号２の位置９３４０８〜９３４２５の間）に位置するＦ２配列と、配列番号２のヌクレオチド９３４４５〜９３４７０と相補的であるＦ１ｃ配列とからなり、ＢＩＰプライマーは、下流イントロンの最初の１８個の塩基を含む、配列番号２のヌクレオチド９３５３８〜９３５５９を含む領域と相補的であるＢ２配列と、配列番号２の位置９３４８６〜９３５１５に位置するＢ１ｃ配列とからなる。ステムループ変異体伸長性プライマーの中央ループ配列は、配列番号２のヌクレオチド９３５１６〜９３５２９からなることが好ましい。ＰＮＡ塩基配列は、配列番号２のヌクレオチド９３５１８〜９３５３４からなることが好ましい。
【００２７】
本発明の方法を実施するために使用される、ループ媒介性等温増幅に適したプライマーは、以下の配列からなることが最も好ましい。
Ｆ３ ５’−ＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号３）、
Ｂ３ ５’−ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡ−３’（配列番号４）、
ＦＩＰ ５’−ＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号５）、
ＢＩＰ ５’−ＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣ−３’（配列番号６）、
ステムループ変異体伸長性プライマー：５’−ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣ−３’（配列番号８）。
【００２８】
より好ましい実施形態では、非伸長性部分は、好ましくは、構造：ＮＨ２ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＣＯＮＨ２（配列番号９）を有するＰＮＡ分子である。
【００２９】
本発明の方法はまた、例えば、点変異が、ホモ接合型であるかまたはヘテロ接合型であるかを評価するために、核酸サンプル中の変異体対立遺伝子の（例えば、存在するＪＡＫ２変異体対立遺伝子の）量を定量的に評価するのにも適している。これは、サンプルから得られた点変異を含む標的核酸分子の領域の増幅を示すシグナルを、少なくとも１種の標準物質から得られた前記シグナルと定量的に比較することによって達成される。好ましい実施形態では、少なくとも１種の標準物質は、野生型核酸分子のバックグラウンド中、所定のパーセンテージ（％）の変異体標的核酸分子からなり、前記の所定のパーセンテージ（％）は、好ましくは、約１０％である。例えば、３種の標準物質（例えば、野生型プラスミドバックグラウンド中、１００％、１０％および１％変異体Ｇ１８４９Ｔ ＪＡＫプラスミド）と比較した、非希釈および１：５希釈サンプルの増幅効率を分析することによって、試験サンプル中の変異体対立遺伝子の量が、５０％より高いか低いか決定することが可能であり、これは、ホモ接合性またはヘテロ接合性を示すものである。
【００３０】
本発明の方法はまた、ｋＲＡＳ、ＥＧＦＲなどの異なる病態に関与するその他の遺伝子変異を検出するのに、ならびにＳＮＰを検出するのにも適している。
【００３１】
本発明の別の態様は、ループ媒介性等温増幅によって、野生型核酸分子のバックグラウンドにおいて標的核酸分子における点変異の存在を検出するためのプライマーのセットであり、該プライマーのセットは、第１の外側プライマーＦ３と、第２の外側プライマーＢ３と、第１の内側プライマーＦＩＰと、第２の内側プライマーＢＩＰと、ステムループ変異体伸長性プライマーとを含み、すべて本発明の方法に関して上記で定義されるとおりである。
【００３２】
好ましい実施形態によれば、プライマーのセットは、配列番号３からなる第１の外側プライマーＦ３、配列番号４からなる第２の外側プライマーＢ３、配列番号５からなる第１の内側プライマーＦＩＰ、配列番号６からなる第２の内側プライマーＢＩＰ、および配列番号８からなるステムループ変異体伸長性プライマーを含む。
【００３３】
本発明のさらに好ましい実施形態は、野生型核酸分子とハイブリダイズできる非伸長性部分をさらに含む上記で定義されるプライマーのセットである。非伸長性部分は、例えば、添付の特許請求の範囲において定義される、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはステムループ非伸長性プライマーである。少なくとも１０塩基の長さであるＰＮＡが、より好ましい。配列表において配列番号９として示されるＰＮＡが、非伸長性部分の最も好ましい実施形態である。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、ループ媒介性等温増幅によって、野生型核酸分子のバックグラウンドにおける標的核酸分子における点変異の存在を検出するためのキットであり、該キットは、上記で定義されるプライマーのセットならびに鎖置換活性を有する１種または複数のＤＮＡポリメラーゼを含む。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Φ２９ファージ、ＭＳ−２ファージ、Ｚ−Ｔａｑ、ＫＯＤ、クレノウ断片およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されることが好ましい。最も好ましいＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼである。
【００３５】
本発明のキットは、例えば、１種または複数の標準物質、標的核酸分子の増幅を検出および／または定量するための手段ならびにアッセイを実施するための説明書などのさらなる従来の構成要素を含有し得る。このようなさらなる構成要素の選択および使用は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００３６】
本発明の範囲は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号８ならびに配列番号２の位置９３５２６を含むＪＡＫ２ゲノムＤＮＡ（配列番号２）の領域、または配列番号１の位置２３４３を含むＪＡＫ２ｃＤＮＡ（配列番号１）の領域とハイブリダイズできる塩基配列を含む６〜２４塩基の長さのペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群から選択される単離オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む。本発明のＰＮＡの好ましい実施形態は、以下の塩基配列：
ＮＨ２−ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡ−ＣＯＯＨ（配列番号９）（ここで、Ｇはグアニンであり、Ａはアデニンであり、Ｔはチミンであり、Ｃはシトシンである）を含む。
【００３７】
本発明を本明細書において、以下の図面を参照し、以下の特定の限定しない実施例によってさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＬＡＭＰ原理（先行技術）。 増幅反応は、標的ゲノム配列の６種の異なる領域にとって特異的な４種のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって実施する。内部プライマーは、標的核酸分子上の相補的な配列とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、増幅生成物は、外部プライマー（Ｆ３、Ｂ３）によって２工程で置換され、二重ステムループ構造（出発構造）（パネルＡ）として形作られる。出発構造は、遊離３’末端から、別の内部プライマーによって同時に増幅される（パネルＢ）。最初のモジュールの逆方向反復によって構築されたＤＮＡコンカテマーは、指数関数的に徐々に合成される（パネルＣ）。
【図２】ＬＡＭＰ「ダンベル（ＤＵＭＢ−ＢＥＬＬ）」戦略。 図２に示される本アッセイ設定では、ＦＩＰおよびＢＩＰ内側プライマー中に含有されるＦ１ｃおよびＢ１ｃオリゴヌクレオチドは、ＪＡＫ２コード配列中の開始コドンから位置１８４９の目的のヌクレオチドのそれぞれ一塩基上流および一塩基下流で終了および開始するＪＡＫ２遺伝子の非重複領域に対して相補的である。さらに、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの５’末端塩基は、ＪＡＫ２配列中の変異ヌクレオチドに対して特異的であり、両内側プライマーは、３’末端から３番目の塩基でミスマッチした塩基を有する。反応が野生型標的対立遺伝子を含有し、ダンベル構造が形成される場合には、変異体特異的Ｆ１ｃおよびＢ１ｃ配列は、３’末端でアニールせず、あらゆるさらなる標的増幅を阻止する。そうではなく、変異体標的対立遺伝子が溶液中に存在する場合には、変異体特異的Ｆ１ｃおよびＢ１ｃ配列は、相補的核酸標的領域と完全にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【図３】ＬＡＭＰ「対立遺伝子特異的ループプライマー伸長」戦略。 変異体特異的ループプライマーの３’末端のヌクレオチドは、ＪＡＫ２コード配列中の位置１８４９の変異Ｔヌクレオチドと相補的である。さらに、このループプライマーは、３’末端から３番目の塩基においてミスマッチした塩基を含有する。反応がＷＴ ＪＡＫ２配列を含有する場合には、３’末端変異体特異的ループプライマーは、標的配列とアニールせず、増幅をもたらさない。そうではなく、変異体ＪＡＫ２配列が溶液中に存在する場合には、変異体特異的ループプライマーは、相補的標的配列と完全にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【図４】ＬＡＭＰ「ステムループプライマー」戦略。 ループ領域中に推定変異Ｔヌクレオチドを提示するダンベルを得るようＦ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセット。第１のステムループプライマーは、一本鎖ダンベル構造中に変異された塩基を認識するよう設計され、ＪＡＫ２野生型配列と相補的であり、非伸長性３’末端を含有する第２の改変されたステムループプライマーと一緒に含まれる。変異したＪＡＫ２配列が、核酸サンプル中に存在する場合（パネルＡ）に、変異体特異的ステムループプライマーが、その内部構造を破壊して標的配列とアニールし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。逆に、ＷＴ標的配列がサンプル中に存在する場合（パネルＢ）には、改変された非伸長性ステムループプライマーは、ＷＴ標的配列とハイブリダイズして、この配列の増幅を阻止する（「サイレンシング」効果）。
【図５】ＬＡＭＰ「ＰＮＡを伴う変異体特異的ステムループプライマー」戦略。 ループ領域中に推定変異Ｔヌクレオチドを提示するダンベルを得るようＦ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセット。第１のステムループプライマーは、一本鎖ダンベル構造中に変異塩基を認識するよう設計され、ＰＮＡ分子と一緒に含まれる。ＰＮＡは、Ｂ２およびＢ１ｃ間に含まれるループ領域と相補的であり、検出されるべき点変異の核酸位置を包含するよう設計される。ＪＡＫ２ ＷＴ配列と安定な二本鎖を形成し、ひいては、ハイブリダイゼーションおよび変異体特異的ステムループプライマーの伸長を妨げ、野生型配列の非特異的増幅を抑制する（パネルＢ）。ＰＮＡは、低い親和性のために、変異したＪＡＫ２配列とハイブリダイズしない（パネルＡ）。
【図６】ＬＡＭＰ「ダンベル」アッセイの感度。 増幅反応を、７ｅ３ｃｐｓ／μｌのＪＡＫ２野生型プラスミドを含有するサンプルで（正方形の点）、標的なし対照で、水中のＪＡＫ２変異体プラスミドの段階希釈で（７ｅ３〜７ｅ１ｃｐｓ／μｌ、菱形の点、７ｅ０ｃｐｓ／μｌ、丸の点）実施した。各サンプルを３連で試験した。エラーバーは、１標準偏差を表す。野生型プラスミドと比較して、変異体標的配列は、最大７ｅ１ｃｐｓ／μｌのサンプル濃度まで高効率で増幅される。本アッセイは、７ｅ３から７ｅ１ｃｐｓ／μｌ変異体プラスミドサンプルの間で直線性を示す。
【図７】ＬＡＭＰ「対立遺伝子特異的変異体ループプライマー」アッセイの感度。 増幅反応を、７ｅ３ｃｐｓ／μｌのＪＡＫ２野生型プラスミドを含有するサンプルで（正方形の点）、標的なし対照で、水中のＪＡＫ２変異体プラスミドの段階希釈で（７ｅ３〜７ｅ１ｃｐｓ／μｌ、菱形の点）実施した。各サンプルを３連で試験した。エラーバーは、１標準偏差を表す。野生型プラスミドと比較して、変異体標的配列は、最大７ｅ２ｃｐｓ／μｌのサンプル濃度まで高効率で増幅される。本アッセイは、７ｅ３から７ｅ１ｃｐｓ／μｌ変異体プラスミドサンプルの間で直線性を示す。
【図８】ＬＡＭＰ「ステムループプライマー」アッセイの選択性。 増幅反応を、７ｅ３ｃｐｓ／μｌのＪＡＫ２野生型プラスミドを含有するサンプルで（正方形の点）、標的なし対照で、７５％〜１％の範囲、反応あたり全量３５０００ｃｐｓのＤＮＡの野生型プラスミド中のＪＡＫ２変異体プラスミドの段階希釈で実施した。各サンプルを３連で試験した。エラーバーは、１標準偏差を表す。野生型プラスミドと比較して、変異体標的配列は、最大１％の用量サンプル（３４６５０コピーの元の親プラスミド中、３５０コピーの変異体プラスミド）まで高効率で増幅される。アッセイは、野生型バックグラウンド中、１００％〜１％の間の変異体プラスミドサンプルで、直線性を示す。
【図９】ＬＡＭＰ「ＰＮＡを伴うステムループプライマー」。 ＰＮＡを用いて、用いずに、変異体および野生型プラスミドサンプル（各３５０００ｃｐｓ）でのアッセイ性能。ＰＮＡの不在下で、ＪＡＫ２ ＷＴプラスミドは、変異体特異的ステムループプライマーによって非特異的に増幅され、変異した標的配列に関して５分遅れる。対照的に、反応混合物にＰＮＡが加えられると、ＷＴプラスミドは、変異体特異的ステムループプライマーによって１時間遅れて増幅され、ＪＡＫ２変異体プラスミドの特異的増幅については、５分遅れしか測定されない。ＰＮＡは、ＷＴ相補配列とのみ安定な二本鎖を形成し、変異体特異的ステムループプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を妨げ、それによって、野生型配列の増幅時間の１時間のずれを引き起こす。
【図１０】ＬＡＭＰ「ＰＮＡを伴うステムループプライマー」アッセイの選択性。 ＪＡＫ２変異体プラスミドサンプル（３５００００ｃｐｓ）、ＪＡＫ２野生型プラスミドサンプル（３５００００ｃｐｓ）および野生型バックグラウンドで、以下の割合１、０．５、０．１、０．０５および０．０１％に段階希釈した変異体プラスミドでのアッセイ性能。エラーバーは、１標準偏差に対応する。ＷＴサンプル（３５００００ｃｐｓ ＷＴプラスミド）については、１時間の反応内では増幅は検出されなかった。変異体標的配列の特異的増幅は、野生型バックグラウンド中、０．０１％の変異体配列まで検出される（３４９６５０コピーのＷＴプラスミド中全３５コピーの変異体プラスミド）。アッセイは、０．１％変異体プラスミドの濃度（３４９６５０コピーのＷＴプラスミド中全３５０コピーの変異体プラスミド）まで直線である。
【図１１】ＬＡＭＰ対照反応。 Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセット。この方法は、特定の変異の存在とは独立したゲノムＤＮＡ標的配列を増幅するよう設計されている。このような対照アッセイによって、プライマーの増幅効率および反応管中の阻害剤の存在を評価することが可能となる。
【図１２】ＪＡＫ２野生型および変異体核酸サンプルでのＬＡＭＰ対照反応。 Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセットの増幅効率は、分析されたサンプルすべて：１００％のＪＡＫ２野生型プラスミド、１００％、１０％および１％のＪＡＫ２変異体プラスミドについて同程度である。標的配列増幅の遅れまたは標的配列増幅がないことは、反応阻害剤の存在または反応条件における問題を示す。
【図１３】核酸サンプル中の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーの推定の原理。 核酸サンプル中のＪＡＫ２対立遺伝子コピーの量が、５０％よりも高いか低いかを推定するために、変異体特異的ステムループプライマーおよびＰＮＡを用いる改変ＬＡＭＰを、非希釈サンプルおよび１：５希釈したサンプルで実施する。サンプルが、５０％超の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーを含有する場合には、標的配列の閾値増幅分は、非希釈（パネルＡ）および希釈（パネルＢ）サンプル両方の標準物質１００％と標準物質１０％の（分）ｔの間に含まれる。サンプルが、５０％未満の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーを含有する場合には、標的配列の閾値増幅分は、非希釈サンプル（パネルＡ）の標準物質１００％と標準物質１０％のｔ（分）の間および希釈サンプル（パネルＢ）の標準物質１０％と標準物質１％の分（ｔ）の間に含まれる。
【図１４】５０％超の変異標的配列を含有する核酸サンプル中の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーの推定。 野生型バックグラウンド中、５０％超の変異体ＪＡＫ２プラスミドを含有する４種の核酸サンプル（それぞれ、６０％、７０％、８０％および９０％）を、１：５希釈し、野生型バックグラウンドにおける１００％、１０％および１％のＪＡＫ２変異体プラスミドからなる３種の標準物質と一緒に、「ＰＮＡを伴うＬＡＭＰステムループプライマー」アッセイを使用して分析した。４種のサンプルすべてについて、閾値増幅分は、標準物質１００％の分（ｔ）から標準物質１０％の分（ｔ）の間に含まれていた。
【図１５】５０％未満の変異標的配列を含有する核酸サンプル中の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーの推定。 野生型バックグラウンド中、５０％以下の変異体ＪＡＫ２プラスミドを含有する４種の核酸サンプル（それぞれ、４０％、３０％および２０％）を１：５希釈し、野生型バックグラウンド中、１００％、１０％および１％のＪＡＫ２変異体プラスミドからなる３種の標準物質と一緒に、「ＰＮＡを伴うＬＡＭＰステムループプライマー」アッセイを使用して分析した。１：５希釈した５０％サンプルの増幅は、１０％標準物質サンプルの同一閾値分で生じた。残りの３種のサンプルについては、閾値増幅分は、標準物質１０％の分（ｔ）から標準物質１％の分（ｔ）の間に含まれていた。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下の実施例は、単に例示として提供するものであって、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【実施例１】
【００４０】
ＪＡＫ２−改変ＬＡＭＰ「ダンベル戦略」の材料、方法および結果
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供され、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有していた。詳細には、
−「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、供給業者Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。
−ＧＡ２１１（Ｆ３） ５’ＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＴＴＣＴＴＴＧＴＡＣＴ３’（配列番号１０）
−ＧＡ２１２（Ｂ３） ５’ＡＧＣＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧ３’（配列番号１１）
−ＧＡ２１６（ＦＩＰ） ５’ＡＡＴＡＴＡＣＴＣＣＡＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴ ３’（配列番号１２）
−ＧＡ２２０（ＢＩＰ） ５’ＴＴＴＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＡＡＡＣＴＡＣＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣＴＧＡ３’（配列番号１３）
−ＧＡ２２１（ＬＦ） ５’ＧＴＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴ３’（配列番号１４）
−ＧＡ２２２（ＬＢ） ５’ＡＧＧＣＴＴＴＣＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＣ３’（配列番号１５）
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、 ５％ＤＭＳＯ「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ａｐｙｒｏｇｅｎ ｗａｔｅｒ）（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【００４１】
手順
サンプル調製
以下のとおりの反応混合物を調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、０．８μＭループプライマー（ＬＦおよびＬＢ）、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（７ｅ３ｃｐｓ／ｕｌの野生型プラスミド）、１２種の陽性対照（３サンプルの７ｅ３ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド、３サンプルの７ｅ２ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド、３サンプルの７ｅ１ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド、３サンプルの７ｅ０ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド）、１種の標的なし対照を含む少なくとも１７サンプルのために混合物を調製する。
【００４２】
表１サンプル混合物組成
【表１】
【００４３】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【００４４】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、Ｔｒｉｓ １０ｍＭで、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ、７ｅ２ｃｐｓ／μｌ、７ｅ１ｃｐｓ／μｌおよび７ｅ０ｃｐｓ／μｌに段階希釈する。ＷＴプラスミドを、Ｔｒｉｓ １０ｍＭで７×１０３コピー／μｌに希釈する。
【００４５】
３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【００４６】
反応
反応は、図１および２の方法スキームにしたがう。
【００４７】
６６℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションおよび濁度のリアルタイムモニタリングのために濁度計（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）をプログラムする。
【００４８】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【００４９】
データ解析
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、ａ．ｕ．（吸光度の任意の単位）を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値（この場合には、０．１ａ．ｕ．）に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【００５０】
結果
「ＬＡＭＰ ＪＡＫ２ダンベル」戦略は、ＳＮＰ検出のためのＥｉｋｅｎ ＬＡＭＰ法に基づいている（ＥＰ１２３１２８１、２０、２１、２２ならびにhttp://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/snps_anim.htmlに記載されている）。
【００５１】
図２に示される本アッセイ設定では、ＦＩＰおよびＢＩＰ内側プライマー中に含有されるＦ１ｃおよびＢ１ｃオリゴヌクレオチドは、ＪＡＫ２コード配列中の開始コドンから位置１８４９の目的のヌクレオチドのそれぞれ一塩基上流および一塩基下流で終了および開始するＪＡＫ２遺伝子の非重複領域に対して相補的である。さらに、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの５’末端塩基は、ＪＡＫ２配列中の変異Ｔヌクレオチドに対して特異的であり、両内側プライマーは、３’末端から３番目の塩基でミスマッチした塩基を有する。反応が、野生型標的対立遺伝子を含有し、ダンベル構造が形成される場合には、変異体特異的Ｆ１ｃおよびＢ１ｃ配列は、３’末端でアニールせず、あらゆるさらなる増幅を阻止する。そうではなく、変異体標的対立遺伝子が溶液中に存在する場合には、変異体特異的Ｆ１ｃおよびＢ１ｃ配列は、相補的核酸標的領域と完全にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【００５２】
図６に示されるように、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ〜７ｅ０ｃｐｓ／μｌ（全３５コピーの変異体プラスミド）の範囲のＬＡＭＰアッセイによって、変異体プラスミド濃度の低下が検出された。低濃度の標的核酸配列では、このＬＡＭＰアッセイ設定では、変異体と野生型プラスミドとを区別できなかった。実際には、これらは、７ｅ３ｃｐｓ／μｌの濃度で増幅される。文献においてこれまでに記載されたアッセイ法の限界を克服するには、１％より低い選択性の値が必要とされるので、本アプローチを用いても明確な利点は得られなかった。
【実施例２】
【００５３】
ＪＡＫ２−改変ＬＡＭＰ「対立遺伝子特異的ループプライマー伸長」戦略の材料、方法および結果
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有するように合成された。詳細には、
−「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。
下線を引いた塩基は、ミスマッチしたヌクレオチドに相当する。太字の塩基は、ＪＡＫ２コード配列のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の変異ヌクレオチドに相当する。
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【００５４】
手順
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−２０℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は４℃で保存されるべきである。
【００５５】
以下のとおりの反応混合物を調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、０．８μＭループプライマー（ＬＢ）、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（７ｅ３ｃｐｓ／ｕｌの野生型プラスミド）、９種の陽性対照（３サンプルの７ｅ３ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド、３サンプルの７ｅ２ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド、３サンプルの７ｅ１ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド）、１種の標的なし対照を含む少なくとも１４種のサンプルのために混合物を調製する。
【００５６】
表２サンプル混合物組成
【表２】
【００５７】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【００５８】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、Ｔｒｉｓ １０ｍＭで、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ、７ｅ２ｃｐｓ／μｌ、７ｅ１ｃｐｓ／μｌに段階希釈する。ＷＴプラスミドを、Ｔｒｉｓ １０ｍＭで７×１０３コピー／μｌに希釈する。３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【００５９】
反応
反応は、図３の方法スキームにしたがう。
【００６０】
６５℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションおよび濁度のリアルタイムモニタリングのために濁度計（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）をプログラムする。
【００６１】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【００６２】
データ解析
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、ａ．ｕ．を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値（この場合には、０．１ａ．ｕ．）に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【００６３】
結果
本アプローチは、変異体特異的ループプライマーを使用することによる変異体配列の選択的増幅からなる（図３）。本発明者らは、Ｂ２とＢ１ｃとの間に含まれるループ領域中に推定変異を提示するダンベル構造を得るよう、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセットを設計した。さらに、本発明者らは、ＪＡＫ２コード配列の位置１８４９の変異ヌクレオチドＴと相補的な３’末端の最後の塩基および３’末端から３番目の塩基においてミスマッチした塩基を提示するループプライマーを設計した。
【００６４】
反応が、ＷＴ標的配列を含有する場合には、変異体特異的ループプライマーの３’末端は、相補的ヌクレオチドとアニールせず、ひいては、増幅をもたらさない。そうではなく、ＪＡＫ２変異体配列が溶液中に存在する場合には、変異体特異的ループプライマーは、相補的配列と完全にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【００６５】
７ｅ３ｃｐｓ／μｌ〜７ｅ１ｃｐｓ／μｌ（全３５０００および３５０コピーの変異体プラスミド）の範囲の濃度の変異体プラスミドサンプルで、７ｅ３プラスミドｃｐｓ／μｌを含有するＷＴサンプルでアッセイ評価を実施し、すべて、サンプルは３連で試験した。本方法を用いて、７ｅ３ｃｐｓ／μｌのＷＴプラスミドサンプルの非特異的増幅を検出し、７ｅ１ｃｐｓ／μｌ濃度の変異体および野生型サンプルは、区別できなかった。文献においてこれまでに記載されたアッセイ法の限界を克服するには、１％より低い選択性の値が必要とされるので、本アプローチを用いても明確な利点は得られなかった（図７）。
【実施例３】
【００６６】
ＪＡＫ２−改変ＬＡＭＰ「ステムループプライマー戦略」の材料、方法および結果
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有するように合成された。詳細には、
−「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。
−ＧＡ２３１（Ｆ３） ５’ＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧ３’（配列番号３）
−ＧＡ２３２（Ｂ３） ５’ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡ３’（配列番号４）
−ＧＡ２３３（ＦＩＰ） ５’ＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣ３’（配列番号５）
−ＧＡ２３４（ＢＩＰ） ５’ＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣ３’（配列番号６）
−ＧＡ２３５（ＬＦ） ５’ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡｄｄＣ３’（配列番号７）
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）中のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の野生型ヌクレオチドに相当する。
−ｄｄＣは、非伸長性ジデオキシシトシンを表す。
−ＧＡ２３６（ＬＢ） ５’ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣ３’（配列番号８）
−下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）中のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の変異したヌクレオチドに相当する。
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【００６７】
手順
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−２０℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は４℃で保存されるべきである。
【００６８】
以下のとおりの反応混合物を調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、０．８μＭ両方の自己アニーリング型ループプライマー（非伸長性ＬＦおよびＬＢ）、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（１００％野生型プラスミド、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）、２１種の陽性対照（３サンプルの１００％変異体プラスミド（７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した７５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した５０％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した２５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１０％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１％変異体プラスミド）および１種の標的なし対照を含む、少なくとも２６サンプルのために混合物を調製する。
【００６９】
表３サンプル混合物組成
【表３】
【００７０】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【００７１】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、変異体プラスミドをＷＴプラスミドで段階希釈して、以下の野生型バックグラウンドにおける変異体配列の濃度を得る。７５％、５０％、２５％、１０％、５％、１％（試験管あたりの総量、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）。
【００７２】
３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【００７３】
反応
反応は、図４の方法スキームにしたがう。
【００７４】
６５℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションおよび濁度のリアルタイムモニタリングのために濁度計（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）をプログラムする。
【００７５】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【００７６】
データ解析
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、ａ．ｕ．を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値（この場合には、０．１ａ．ｕ．）に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【００７７】
結果
本アプローチは、特定のループプライマーの、変異体配列から形成されるダンベルとの選択的ハイブリダイゼーションをもたらす、このようなループプライマー設計に基づく変異体配列の選択的増幅からなる（図４）。本発明者らは、Ｂ１とＢ２の間に含まれるループ領域中に推定変異を提示するダンベル構造を得るよう、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセットを設計した。Ｂ２内またはＢ２とＢ１ｃとの間のループ領域中に推定変異ヌクレオチドを含有する代替配列でこのような実験を実施した際には、大きな相違は検出されなかった。本発明者らは、プライマーセット中に、その自身の３’末端の配列と相補的であるその５’末端に、８塩基の配列領域を提示する特定のループプライマーを含めた。その結果として、この特別のループプライマーは、反応温度（６５℃）でそのオープン型と平衡にある分子内ヘアピン構造を形成する。
【００７８】
変異体ＪＡＫ２配列がサンプル中に存在する場合には、このような改変されたループプライマーは、熱力学的平衡に従って、その内部構造を破壊して、相補的標的配列とハイブリダイズする（プライマーおよび特異的標的間のＴｍ＝６５℃）。次いで、特異的な変異標的とハイブリダイズされたループプライマーがポリメラーゼによって伸長され、増幅がさらに進行することができる。さらなる特徴として、ＪＡＫ２ Ｇ→Ｔ変異に対して特異的なループプライマーは、分子内ヘアピン構造（６５℃）よりも低い野生型標的配列とのＴｍ（５９℃）を示す。したがって、ＪＡＫ２ ＷＴ配列を含有するサンプルでは、Ｔｍ値のこのような相違は、分子内力が分子間のものよりも高いので、非特異的標的と二本鎖を形成するよりもヘアピン構造にフォールディングすることを好む改変されたループプライマーの自己隔離をもたらす。
【００７９】
本発明者らは、臨床サンプル中に大過剰で存在している可能性が高い野生型配列に対するこのループプライマーの競合を制限するために、反応設定に、類似の構造を有し、ＪＡＫ２野生型配列と相補的である核酸配列を含有する、すなわち、開始コドン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）から位置１８４９にＧ塩基を有する第２のループプライマーを含めた。
【００８０】
この「競合者」ループプライマーの３’末端は、改変によって非伸長性にされる（３’ジデオキシ）。この競合者の役割は、ＷＴ配列を「サイレントにし」、ひいては、特異的変異体プライマーがその標的を見出すことを可能にすることである。
【００８１】
「競合者」プライマーが、相補的野生型配列を認識する場合には、より高い親和性に従って、その分子内構造を破壊して、ＷＴ標的とハイブリダイズする（ＷＴ標的およびＷＴ改変されたループプライマーによって形成される二本鎖のＴｍ＝６７℃）。ＷＴ標的とハイブリダイズされたループプライマーは、非伸長性であり、野生型配列の増幅をもたらさない。反応は、一定温度で実施されるので、ＷＴ特異的ステムループプライマーは、野生型配列と結合しているままであり、ひいては、ＭＵＴループプライマーの非特異的ハイブリダイゼーションを妨げる。
【００８２】
変異体特異的ループプライマーとは対照的に、「競合者」プライマーは、それ自体によって形成される分子内ヘアピン構造（６５℃）よりも低い、変異体標的配列とのＴｍ（６２℃）を示す。したがって、分子間のものと比較して高い分子内力が、変異体標的配列と二本鎖を形成するよりもヘアピン構造にフォールディングすることを好む、改変されたステムループプライマーの自己隔離を引き起こす。
【００８３】
本アッセイの選択性を、野生型バックグラウンドにおける変異体プラスミドの段階希釈で標的配列増幅を実施することによって評価した（図８）。達成された選択性は、有意に１％（３４６５０コピーのＷＴプラスミド中、全３５０コピーの変異体プラスミド）未満であり、文献においてこれまでに記載されたアッセイよりも高い性能を示す。
【００８４】
アッセイ直線性は、１００％変異体プラスミド（３５０００ｃｐｓ）から９９％野生型プラスミド中の１％変異体（３４６５０コピーのＷＴプラスミド中の３５０コピーの変異体プラスミド）の間で検出され、したがって、多量のＷＴプラスミド中の低いパーセンテージの変異体配列の検出および定量化が可能となる。したがって、このように実施されたＬＡＭＰアプローチを用いて有意な改善が達成された。
【実施例４】
【００８５】
ＪＡＫ２−改変ＬＡＭＰ「ＰＮＡを伴うステムループプライマー戦略」の材料、方法および結果
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有するように合成された。詳細には、
−「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。
−ＧＡ２３１（Ｆ３） ５’ＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧ３’（配列番号３）
−ＧＡ２３２（Ｂ３） ５’ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡ３’（配列番号４）
−ＧＡ２３３（ＦＩＰ） ５’ＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣ３’（配列番号５）
−ＧＡ２３４（ＢＩＰ） ５’ＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣ３’（配列番号６）
−ＧＡ２３６（ＬＢ） ５’ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣ３’（配列番号８）
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）中のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の変異ヌクレオチドに対応する。
ＰＮＡ：Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃによって合成された、「ＰＮＡ」と呼ばれる、ＧＭ４３ ＮＨ２ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＣＯＯＨ（配列番号９）。
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）中のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の野生型ヌクレオチドに対応する。
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【００８６】
手順
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−２０℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は４℃で保存されるべきである。
【００８７】
以下のとおりの反応混合物を調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、０．８μＭ変異体ＪＡＫ２（ＬＢ）に特異的な自己アニーリング型ループプライマー、０．８μＭ ＰＮＡ、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（１００％野生型プラスミド、７ｅ４ｃｐｓ／μｌ）、１８種の陽性対照（３サンプルの１００％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．１％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．０５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．０１％変異体プラスミド（ＤＮＡの総量７ｅ４ｃｐｓ／μｌ））および１種の標的なし対照を含む、少なくとも２３サンプルのために混合物を調製する。
【００８８】
表４サンプル混合物組成
【表４】
【００８９】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【００９０】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、変異体プラスミドをＷＴプラスミドで段階希釈して、以下の野生型バックグラウンドにおける変異体配列の濃度を得る。１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％（試験管あたりの総量、７ｅ４ｃｐｓ／μｌ）。
【００９１】
３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【００９２】
反応
反応は、図５の方法スキームにしたがう。
【００９３】
６５℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションおよび濁度のリアルタイムモニタリングのために濁度計（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）をプログラムする。
【００９４】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【００９５】
データ解析
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、ａ．ｕ．を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値（この場合には、０．１ａ．ｕ．）に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【００９６】
結果
このアプローチは、特定のループプライマーの、変異体配列から形成されるダンベルとの選択的ハイブリダイゼーションをもたらす、このようなループプライマー設計に基づいた変異体配列の選択的増幅からなる（図５）。本発明者らは、Ｂ１とＢ２の間に含まれるループ領域中に推定される変異ヌクレオチドを提示するダンベルを得るよう、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセットを設計した。Ｂ２内またはＢ２とＢ１ｃとの間のループ領域中に推定変異ヌクレオチドを含有する代替配列でこのような実験を実施した際には、大きな相違は検出されなかった。本発明者らは、プライマーセット中に、その自身の３’末端の配列と相補的であるその５’末端に、８塩基の配列領域を提示する特定のループプライマーを含めた。その結果として、この特別のループプライマーは、反応温度（６５℃）でそのオープン型と平衡にある分子内ヘアピン構造を形成する。
【００９７】
変異体ＪＡＫ２配列がサンプル中に存在する場合には、このような改変されたループプライマーは、熱力学的平衡に従って、その内部構造を破壊して、相補的標的配列とハイブリダイズする（プライマーおよび特異的標的間のＴｍ＝６５℃）。次いで、特異的な変異した標的とハイブリダイズされたループプライマーが、ポリメラーゼによって伸長され、増幅がさらに進行することができる。さらなる特徴として、ＪＡＫ２ Ｇ→Ｔ変異に特異的なループプライマーは、分子内ヘアピン構造（６５℃）よりも低い、野生型標的配列とのＴｍ（５９℃）を示す。したがって、ＪＡＫ２ ＷＴ配列を含有するサンプルでは、Ｔｍ値のこのような相違は、分子内力が分子間のものよりも高いので、非特異的標的と二本鎖を形成するよりもヘアピン構造にフォールディングすることを好む改変されたループプライマーの自己隔離をもたらす。
【００９８】
本発明者らは、選択的ステムループプライマーに基づくＬＡＭＰシステムの区別能力をさらに増大するために、反応混合物にペプチド核酸（ＰＮＡ）を加えた。
【００９９】
ＰＮＡは、リボース−リン酸骨格が、アミド結合によって連結されている（２−アミノエチル）−グリシン単位によって置換されている、非伸長性であり、置換可能でないオリゴヌクレオチドである。各塩基対形成ＤＮＡ／ＰＮＡは、通常の塩基対形成ＤＮＡ／ＤＮＡよりも、二本鎖構造の安定性に寄与する。したがって、ＰＮＡ／ＤＮＡ二本鎖中の単一のミスマッチは、Ｔｍの有意な相違をもたらす。ＰＮＡプローブは、ＪＡＫ２遺伝子のＷＴ配列と十分に相補的であり、変異体特異的ステムループプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を妨げ、野生型配列の非特異的増幅を抑制する。単一のミスマッチの存在下では、ＰＮＡは、ループプライマーハイブリダイゼーションを阻害せず、増幅につながる。したがって、ＰＮＡを使用して、サンプル中に存在するＷＴ配列を選択的に阻止することができる。
【０１００】
ＰＮＡは、野生型Ｇヌクレオチドを提示するＢ２とＢ１ｃとの間に含まれるループ領域と相補的であるよう設計される。ＷＴ相補的配列とのみ安定な二本鎖を形成し（Ｔｍ６５．７℃）、変異体特異的ステムループプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を妨げ、したがって、野生型配列の増幅を抑制する。ＰＮＡは、低い親和性のために（Ｔｍ＝５６℃）変異体ＪＡＫ２配列とハイブリダイズしない。
【０１０１】
７ｅ３ｃｐｓ／ｕｌの野生型および変異体プラスミドサンプルで、ＰＮＡを用いて実施した、および用いずに実施した増幅反応の性能を比較することによって、野生型増幅クランプとしてのＰＮＡの効率を評価した（図９）。増幅曲線分析は、ＰＮＡの存在は、変異体特異的ステムループプライマーによるＷＴプラスミドの非特異的増幅において１時間の遅れに、変異体プラスミドの特異的増幅において５分の遅れにつながることを示した。逆に、ＰＮＡの不在下では、変異体特異的ステムループプライマーによるＷＴプラスミドの非特異的増幅は、特異的変異標的配列と比較して５分の遅れのみで生じた。野生型増幅において観察された遅れは、ＰＮＡおよびＷＴ相補配列間の安定な二本鎖の形成によって説明され、ひいては、変異体特異的ステムループプライマーの非特異的ハイブリダイゼーションおよび伸長を妨げる。
【０１０２】
このＬＡＭＰアッセイ形式の選択性を決定するために、野生型バックグラウンドにおける変異体プラスミドの段階希釈で増幅反応を実施した（図１０）。達成された選択性は、０．０１％未満（３４９６５コピーのＷＴプラスミド中、全３５コピーの変異体プラスミド）であるため、本アプローチは、先行技術において記載されたアッセイよりも高い選択性を示し、直接配列決定、ＲＦＬＰおよびピロシーケンスに関して、対数で約３高く、ＡＲＭＳ、リアルタイム技術およびＤＮＡ融解曲線分析に関して、対数で約２高い。
【０１０３】
要約すると、本ＬＡＭＰアッセイ形式は、この文書において先に記載された戦略および文献に示された検出法に関して有意な改善を表す。ｉ）ＷＴサンプル（３５００００ｃｐｓ ＷＴプラスミド）の非特異的増幅は、約１時間遅延される、ｉｉ）変異体標的の特異的増幅は、野生型中、０．０１％の変異体配列まで検出される（３４９９６５コピーのＷＴプラスミド中、全３５コピーの変異体プラスミド）、ｉｉｉ）アッセイ選択性は、文献に記載されるその他のアプローチの選択性よりも対数で約２高い、ｉｖ）アッセイ直線性は、０．１％変異体配列（３４９６５０コピーのＷＴプラスミド中、全３５０コピーの変異体プラスミド）までであり、したがって、大過剰の野生型ＤＮＡ中の低いパーセンテージの変異体対立遺伝子の検出および定量化が可能となる。
【実施例５】
【０１０４】
臨床サンプルでのＬＡＭＰ「ＰＮＡを伴うステムループプライマー」：ＡＲＭとの比較
合計２９サンプルの、Ｏｓｐｅｄａｌｉ Ｒｉｕｎｉｔｉ ｄｉ Ｂｅｒｇａｍｏで患者から抽出したＤＮＡを、実施例４に記載される、ＪＡＫ２ ＬＡＭＰ「ＰＮＡを伴うステムループプライマー」戦略を使用して分析した。得られた結果を、ＡＲＭ技術を使用して病院で得られたデータと比較した。ＡＲＭＳは、オリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲの際にこれらのプライマーを伸長するためには、ＤＮＡポリメラーゼに対してその３’末端で完全にアニーリングされなければならないという事実を利用する。３’末端で特定のＪＡＫ２点変異に合致するオリゴヌクレオチドプライマーを設計することによって、ＡＲＭＳは、野生型および変異体対立遺伝子を区別できる。
【０１０５】
表５に示されるように、ＬＡＭＰアッセイは、ＡＲＭＳによってそのように以前に診断されたすべてのサンプルを陽性と検出した。ＡＲＭＳによって陰性となった１５サンプルのうち、１１はＬＡＭＰによって陰性と診断され、４は低陽性と診断された。本発明者らは、これらの４種の一致しないサンプルが、ＬＡＭＰアッセイにおいて偽陽性であったことを排除し、また、変異診断は、実施されたＬＡＭＰ法の高い選択性によるものであったことを確認するために、第３のアッセイを使用して一致しないサンプルを試験した。このようなアッセイは、存在する場合には、変異した塩基を、ＰＮＡクランピングによる野生型配列増幅の抑制によって濃縮することを目的とした、野生型標的と相補的であるＰＮＡ分子の存在下におけるＰＣＲによる目的のＪＡＫ２領域の増幅に基づくものであった。変異体対立遺伝子の２０％サンプル濃縮が達成される場合には、変更された配列は、直接配列決定アプローチによって検出されることができる。プライマー（ＧＡ２３１フォワードおよびＧＡ２３２リバース）およびＰＮＡは、先に記載したとおりとした（実施例４）。増幅は、最終容量４５μｌ中、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ、５００ｎＭフォワードおよびリバースプライマー、１．５Ｍ ＰＮＡおよび０．０２５Ｕ Ｔａｑ Ｇｏｌｄを含有する１×反応バッファーで実施した。反応混合物に、５μｌの容量の標的配列（２０ｎｇ／μｌ）を加え、溶液をサーモサイクラー中で、９５℃で１０分間、続いて、９４℃で３０秒、６２℃で４０秒、５８℃で３０秒および７２℃で３０秒の３５サイクルならびに最終伸長のための７２℃で１０分の仕上げからなるサーマルプログラムに従ってインキュベートした。４種の一致しない臨床サンプル、１種の標的なし対照サンプルならびに変異体および野生型プラスミド標的をそれぞれ含有する陽性対照および陰性対照を、２連で試験した。反応後、増幅生成物をアガロースゲル上で分離し、ＥｔＢｒを使用して可視化した。標的なし対照については増幅は検出されなかった。陰性対照については、アガロースゲル上に弱いバンドが見られ、陽性対照については、強いバンドが見られた。その後、４種の臨床サンプルのＰＣＲ産物を、自動配列決定によって分析し、すべてが、ＡＴＧ開始コドン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）から位置１８４９に、それぞれ、グアニン（野生型）塩基およびチミン（変異した）塩基に対応するダブルピークを示した。これらの結果から、４種の一致しないサンプルは、ＬＡＭＰによって、Ｇ→Ｔ塩基置換を保持すると正しく診断されたことが確認されたが、ＡＲＭＳは、それらを偽陰性と検出した。
【０１０６】
【表５】
【実施例６】
【０１０７】
蛍光ＪＡＫ２−改変ＬＡＭＰ「ステムループプライマー戦略」
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有するように合成された。詳細には、
−「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の変異ヌクレオチドに相当する。５’末端の太字のチミン塩基は、標的配列中に相補的な塩基を有さない。それは、クエンチング効果を有する下流のグアニン塩基からフルオロフォアを分離するために加えられた。
−ＧＡ２３５（ＬＦ） ５’−５’ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡｄｄＣ３’（配列番号７）
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９における野生型ヌクレオチドに相当し、ｄｄＣは、非伸長性ジデオキシシトシンを表す。
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【０１０８】
手順
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−２０℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は４℃で保存されるべきである。
【０１０９】
以下のとおりの反応混合物を調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、０．８μＭ変異体ＪＡＫ２に対する特異的な蛍光自己アニーリング型ループプライマー（ＬＢ）、０．８μＭ野生型ＪＡＫ２に対する自己アニーリング型非伸長性ループプライマー（ＬＦ）、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（１００％の野生型プラスミド、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）、１８種の陽性対照（３サンプルの１００％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．１％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．０５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．０１％変異体プラスミド、ＤＮＡの総量７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）および１種の標的なし対照を含む少なくとも２３種のサンプルのために混合物を調製する。
【０１１０】
表６サンプル混合物組成
【表６】
【０１１１】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【０１１２】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、変異体プラスミドをＷＴプラスミドで段階希釈して、以下の野生型バックグラウンドにおける変異体配列の濃度を得る。１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％（試験管あたりの総量、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）。
【０１１３】
３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、最低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【０１１４】
反応
反応は、図４の方法スキームにしたがう。
【０１１５】
６５℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションのためにリアルタイム機器をプログラムする。分あたりの蛍光読み取り値を得るようリアルタイム機器をプログラムする。
【０１１６】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【０１１７】
データ解析
反応物中の蛍光自己アニーリング型ループプライマーは、適切な波長発光によって励起されると蛍光シグナルを生じる。ＬＡＭＰ反応が進行すると、蛍光自己アニーリング型ループプライマーは、相補的標的配列とハイブリダイズし、その結果として、増幅生成物中に組み込まれる。蛍光自己アニーリング型ループプライマーは、５’末端に近接して少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含有する配列に対して相補的であるように設計される。グアニン塩基は、フルオロフォア（本発明者らの場合には、ＴＡＭＲＡ）によって発光された波長を吸収でき、蛍光シグナルのクエンチングを引き起こす。この場合には、ＬＡＭＰ反応の際の標的配列増幅の検出は、分析中の各サンプルの閾値時間を見出すために、蛍光シグナルの減少を測定することに基づく。閾値時間は、反応蛍光シグナルが、５０％のクエンチングに達する分である。各サンプルについて、閾値時間は、ＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【０１１８】
結果
本アプローチは、特定のループプライマーの、変異体配列から形成されるダンベルとの選択的ハイブリダイゼーションをもたらす、このようなループプライマー設計に基づく変異体配列の選択的増幅からなる（図４）。本発明者らは、Ｂ１とＢ２との間に含まれるループ領域中に推定変異を提示するダンベル構造を得るよう、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセットを設計した。Ｂ２内またはＢ２とＢ１ｃの間のループ領域中に推定変異ヌクレオチドを含有する代替配列でこのような実験を実施した際には大きな相違は検出されなかった。本発明者らは、該プライマーセット中に、その自身の３’末端の配列と相補的であるその５’末端に、８塩基の配列領域を提示する特定のループプライマーを含めた。その結果として、この特別のループプライマーは、反応温度（６５℃）でそのオープン型と平衡にある分子内ヘアピン構造を形成する。
【０１１９】
変異体ＪＡＫ２配列がサンプル中に存在する場合には、このような改変されたループプライマーは、熱力学的平衡に従って、その内部構造を破壊して、相補的標的配列とハイブリダイズする（プライマーおよび特異的標的間のＴｍ＝６５℃）。次いで、特異的な変異した標的とハイブリダイズされたループプライマーがポリメラーゼによって伸長され、増幅がさらに進行することができる。さらなる特徴として、ＪＡＫ２ Ｇ→Ｔ変異に対して特異的なループプライマーは、分子内ヘアピン構造（６５℃）よりも低い野生型標的配列とのＴｍ（５９℃）を示す。したがって、ＪＡＫ２ ＷＴ配列を含有するサンプルでは、Ｔｍ値のこのような相違は、分子内力が分子間のものよりも高いので、非特異的標的と二本鎖を形成するよりもヘアピン構造にフォールディングすることを好む変異体特異的ステムループプライマーの自己隔離をもたらす。
【０１２０】
本発明者らは、臨床サンプル中に大過剰で存在している可能性が高い野生型配列に対するこのループプライマーの競合を制限するために、反応設定に、類似の構造を有し、ＪＡＫ２野生型配列と相補的である核酸配列を含有する、すなわち、開始コドンから位置１８４９にＧ塩基を有する（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）第２のループプライマーを含めた。
【０１２１】
この「競合者」ループプライマーの３’末端は、改変によって非伸長性にされる（３’ジデオキシ）。この競合者の役割は、野生型配列を「サイレントにし」、ひいては、特異的変異体プライマーがその標的を見出すことを可能にすることである。
【０１２２】
「競合者」プライマーが、特異的野生型配列を認識する場合には、より高い親和性に従って、その分子内構造を破壊して、ＷＴ標的とハイブリダイズする（ＷＴ標的およびＷＴ特異的ステムループプライマーによって形成される二本鎖のＴｍ＝６７℃）。ＷＴ標的とハイブリダイズされたステムループプライマーは、非伸長性であり、野生型配列の増幅をもたらさない。反応は、一定温度で実施されるので、ＷＴ特異的ステムループプライマーは、野生型対立遺伝子配列と結合しているままであり、ひいては、ＭＵＴループプライマーの非特異的ハイブリダイゼーションを妨げる。
【０１２３】
変異体特異的ステムループプライマーとは対照的に、「競合者」プライマーは、それ自体によって形成される分子内ヘアピン構造（６５℃）よりも低い、変異体標的配列とのＴｍ（６２℃）を示す。したがって、分子間のものと比較して高い分子内力が、変異体標的配列と二本鎖を形成するよりもヘアピン構造にフォールディングすることを好む改変されたループプライマーの自己隔離を引き起こす。
【０１２４】
本発明者らは、リアルタイム機器で反応を追跡するために、変異体特異的ステムループプライマーの５’末端をＦＡＭ色素で標識した。本発明者らは、クエンチング効果を有する改変されたループプライマーの５’末端に存在するグアニン塩基に対するフルオロフォアの結合を回避するために、オリゴヌクレオチドの末端にチミン塩基を加えた。改変された標識されたプライマーは、溶液中に存在する場合には、適当な波長光で励起されると蛍光シグナルを発する。ＬＡＭＰ反応が始まり、進行する場合には、蛍光ステムループプライマーは、増幅生成物に組み込まれる。相補的核酸配列中に存在するグアニン塩基は、フルオロフォアによって発光される波長を吸収し、リアルタイムで蛍光シグナルの検出可能なクエンチングを引き起こすことができる。したがって、この「クエンチング効果」によって引き起こされる蛍光シグナルの減少を測定することによって、ＬＡＭＰ反応を介して増幅生成物の蓄積をモニタリングできる。
【実施例７】
【０１２５】
対照ＬＡＭＰ反応
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有するように合成された。詳細には、
「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。
−ＧＡ２３１（Ｆ３） ５’ＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧ３’（配列番号３）
−ＧＡ２３２（Ｂ３） ５’ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡ３’（配列番号４）
−ＧＡ２３３（ＦＩＰ） ５’ＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣ３’（配列番号５）
−ＧＡ２３４（ＢＩＰ） ５’ＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣ３’（配列番号６）
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【０１２６】
手順
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−２０℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は４℃で保存されるべきである。
【０１２７】
以下のとおりの反応混合物を調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（１００％の野生型プラスミド、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）、９種の陽性対照（３サンプルの１００％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１０％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１％変異体プラスミド）および１種の標的なし対照を含む少なくとも２３種のサンプルのために混合物を調製する。
【０１２８】
表７サンプル混合物組成
【表７】
【０１２９】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【０１３０】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、変異体プラスミドをＷＴプラスミドで段階希釈して、以下の野生型バックグラウンドにおける変異体配列の濃度を得る。１０％、１％（試験管あたりの総量、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）。
【０１３１】
３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、最低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【０１３２】
反応
反応は、図１１の方法スキームにしたがう。
【０１３３】
６５℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションおよび濁度のリアルタイムモニタリングのために濁度計（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）をプログラムする。
【０１３４】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【０１３５】
データ解析
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、ａ．ｕ．を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値（この場合には、０．１ａ．ｕ．）に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【０１３６】
結果
本アプローチは、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーを使用することによるＪＡＫ２遺伝子配列の変異体−非感受性増幅からなる（図１１）。本発明者らは、反応混合物からＰＮＡおよび変異体特異的ステムループプライマーを除いて、「実施例４」において記載される同じプライマーセットを使用した。「ＬＡＭＰ対照アッセイ」における標的配列増幅の検出は、鋳型に対するプライマーの正しい塩基マッチング、効率的な伸長条件および反応溶液中の阻害剤の不在などの種々の品質パラメータを示す。逆に、「ＬＡＭＰ対照アッセイ」における核酸サンプル増幅の不在または遅延は、反応設定（すなわち、バッファー組成、温度、プライマーの品質、．．）における問題または反応混合物中の阻害剤の存在を強調する。
【０１３７】
このようなアッセイ対照法を評価するために、臨床サンプルパネルを、Ｇ→Ｔ変異の検出に特異的なＬＡＭＰアッセイ（実施例４）および「ＬＡＭＰ対照アッセイ」の両方を使用して２連で分析した。標的核酸配列が、両アッセイにおいて増幅される場合には、有効な結果が得られ、サンプルは、Ｖ６１７Ｆ変異を保有すると考えられる。標的核酸配列が、「ＰＮＡを伴うＪＡＫ２−改変ＬＡＭＰステムループプライマー戦略」によってではなく「ＬＡＭＰ対照アッセイ」によって増幅される場合には、やはり有効な結果が得られ、サンプルは野生型ＪＡＫ２サンプルとして診断される。「ＬＡＭＰ対照アッセイ」において標的配列増幅がない場合には、分析は、有効でないと考えられるべきである。
【０１３８】
「ＬＡＭＰ対照アッセイ」の評価を、それぞれ７ｅ３ｃｐｓ／μｌ野生型および変異体プラスミドを含有するＤＮＡプラスミドサンプルで、および野生型バックグラウンド中１０％および１％変異体プラスミド、全３５０００コピーを含有するサンプルで実施した（図１２）。すべての試験した核酸サンプルが、同程度の増幅効率を示し、したがって、反応阻害剤の不在を示した。
【実施例８】
【０１３９】
「ＰＮＡを伴うＬＡＭＰステムループプライマー」アッセイを使用するサンプル中の変異体ＪＡＫ２配列の量の推定
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有するように合成された。詳細には、
−「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。
−ＧＡ２３１（Ｆ３） ５’ＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧ３’（配列番号３）
−ＧＡ２３２（Ｂ３） ５’ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡ３’（配列番号４）
−ＧＡ２３３（ＦＩＰ） ５’ＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣ３’（配列番号５）
−ＧＡ２３４（ＢＩＰ）５’ＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣ３’（配列番号６）
−ＧＡ２３６（ＬＢ） ５’ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣ３’（配列番号８）
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の変異したヌクレオチドに相当する。
ＰＮＡ：Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、「ＰＮＡ」と呼ばれる、ＧＭ４３ ＮＨ２ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＣＯＯＨ（配列番号９）
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）中のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の野生型ヌクレオチドに対応する。
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【０１４０】
手順
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−２０℃で保存することが良好であるであるが、作業中の希釈液は４℃で保存されるべきである。
【０１４１】
反応混合物は以下のとおりに調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、０．８μＭ変異体ＪＡＫ２に対して特異的な自己アニーリング型ループプライマー（ＬＢ）、０．８ｕＭ ＰＮＡ、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（１００％野生型プラスミド、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）、９種の陽性標準物質対照（３サンプルの１００％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１０％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１％変異体プラスミド）および１種の標的なし対照を含む少なくとも２３種のサンプルのために混合物を調製する。
【０１４２】
表８サンプル混合物組成
【表８】
【０１４３】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【０１４４】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、変異体プラスミドをＷＴプラスミドで段階希釈して、以下の野生型バックグラウンドにおける変異体配列の濃度を得る。１０％、１％（試験管あたりの総量、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）。
【０１４５】
３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【０１４６】
反応
反応は、図５の方法スキームにしたがう。
【０１４７】
６５℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションおよび濁度のリアルタイムモニタリングのために濁度計（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）をプログラムする。
【０１４８】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【０１４９】
データ解析
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、ａ．ｕ．を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値（この場合には、０．１ａ．ｕ．）に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【０１５０】
結果
患者のサブセットは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ対立遺伝子についてホモ接合性である１。ホモ接合性の機序は、有糸分裂組換えおよび後天性片親性ダイソミーとして知られる変異体対立遺伝子の複製に起因する１。ＪＡＫ２変異体対立遺伝子のヘテロ接合性またはホモ接合性は、予後と相関し、ひいては、サンプル中のＪＡＫ２変異体対立遺伝子コピーの量が、５０％よりも高いか低いかを決定することの重要性をもたらす。
【０１５１】
本アプローチに従って、未知サンプルは、実施例４に先に記載される「ＰＮＡを伴うＬＡＭＰステムループプライマー」アッセイを使用して、非希釈および１：５希釈として分析される。さらに、アッセイ設定は、それぞれ、野生型バックグラウンド中１００％、１０％および１％変異体ＪＡＫ２プラスミドコピーを含有する３種の標準物質サンプルを含む。核酸サンプル中の変異体ＪＡＫ２標的配列の量が５０％よりも高い場合には、前記標的配列のリアルタイム増幅は、非希釈サンプル（図１３、パネルＡ）および１：５希釈されたサンプル（図１３、パネルＢ）の両場合において、１００％標準物質から１０％標準物質の増幅閾値分の間の時間で検出される。非希釈サンプル中の標的アンプリコンは、標準物質１０％においてよりも早く検出される（図１３、パネルＡ）が、対応する１：５希釈サンプルにおける増幅閾値分は、標準物質１０％の分（ｔ）から標準物質１％の分（ｔ）間の時間で測定される（図１３、パネルＢ）ので、５０％未満の変異体ＪＡＫ２配列量を含有する核酸サンプルについては、異なる増幅性能が検出される。
【０１５２】
本アプローチは、対照サンプル（７ｅ３ｃｐｓ／μｌ野生型プラスミド、６．３ｅ３ｃｐｓ／μｌ野生型プラスミド中の７ｅ２ｃｐｓ／μｌ変異体プラスミド、６．９３ｅ３ｃｐｓ／μｌ野生型プラスミド中の７ｅ１ｃｐｓ／μｌ変異体プラスミド）で、５０％より高い割合の野生型バックグラウンドにおける変異体ＪＡＫ２プラスミドの混合物（それぞれ６０％、７０％、８０％、９０％）からなる４種のサンプルで、および５０％以下の割合の野生型バックグラウンドにおける変異体ＪＡＫ２プラスミドの混合物（それぞれ４０％、３０％、２０％）からなる４種のサンプルで、「ＰＮＡを伴うＬＡＭＰステムループプライマー」反応を実施することによって試験された。対照を除いて、すべてのサンプルを、非希釈（各反応に対して５μｌの７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭで１：５希釈したものとして分析した。
【０１５３】
５０％超の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーを含有し、１：５希釈した試験サンプルについて、標的配列増幅を、１００％標準物質における対応する配列の増幅の後および１０％標準物質の前に検出した（図１４）。
【０１５４】
５０％量の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーを提示し、１：５希釈した試験サンプルについて、標的配列増幅が１０％標準物質サンプルに関する同一閾値分で示された（図１５）。
【０１５５】
５０％未満の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーを含有し、１：５希釈された試験サンプルについて、標的配列増幅を、標準物質１０％および１％の増幅時間の間の中間閾値分で検出した（図１５）。
【０１５６】
したがって、本アプローチを使用して、核酸サンプル中のＪＡＫ２変異体対立遺伝子コピーの量が、５０％よりも高いか低いかを推定することが可能である。このような情報は、サンプルにおける「ヘテロ接合性またはホモ接合性」についての指標を提供し、これが、次には、疾患予後と相関するので、臨床上極めて関連がある。
【０１５７】
参考文献
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善されたＬＡＭＰ（ループ増幅媒介性重合）増幅法によってヌクレオチド配列中の点変異またはＳＮＰを検出する方法ならびに本発明の方法を実施するためのプライマーのセットおよびキットに関する。限定されない実施形態によれば、本方法、プライマーのセットおよびキットは、ＪＡＫ２遺伝子におけるＧ１８４９Ｔ（Ｖ６１７Ｆ）変異を検出するのに適している。
【背景技術】
【０００２】
骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）は、造血前駆細胞のクローン性障害であり、古典的ＭＰＤ慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、真性多血症（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）および原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）ならびに慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）および全身性肥満細胞症（ＳＭ）およびその他のものを含む。過去２０年において、ＣＭＬ、ＣＭＭＬ、ＣＥＬおよびＳＭ２−５において変異体対立遺伝子が同定されており、各場合において、原因である変異は、チロシンキナーゼシグナル伝達の構成的活性化をもたらす。最もよく見られるＭＰＤの遺伝子的原因は、ＰＶ、ＥＴまたはＰＭＦのほとんどの患者においてヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）シグナル伝達を活性化する変異が同定されるまでは、わからないままであった（１、２、３、４）。ＪＡＫ２は、細胞質非受容体チロシンキナーゼのヤヌスファミリーのメンバーであり、これはまた、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２も含む。該変異は、ＡＴＧ開始コドンで出発して番号をつけ、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２、配列番号１）中の位置１８４９でのグアニンからチミジンへの置換であり、配列番号１の位置２３４３に対応する。このような変異は、ＪＨ２偽キナーゼ（ｐｓｅｕｄｏｋｉｎａｓｅ）ドメイン内のＪＡＫ２タンパク質のアミノ酸６１７でのバリンのフェニルアラニンとの置換（ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ）をもたらす（５）。ＪＡＫ２自己抑制の喪失は、チロシンキナーゼを異常に活性化する、ＭＰＤおよび白血病におけるその他の変異と類似しているキナーゼの構成的活性化をもたらす（６、７、８）。
【０００３】
直接配列決定は、野生型バックグラウンドにおける約２０％の変異体ＤＮＡまでしか感知できない（９、１０）。この問題は、血液および骨髄がしばしば、腫瘍性造血要素と残存する正常な造血要素の混合物からなる慢性骨髄性障害と相当に関連している。これは、表現型的に明らかな遺伝子変異が、全骨髄細胞集団を１０％未満含む小さいクローン中に存在し得るＥＴおよびＭＤＳの場合は特にそうである。James et al.（１１）では、この問題が、ＪＡＫ２変異を有さないＴＦ−１赤白血病細胞と混合された、ＪＡＫ２変異を有するＨＥＬ赤白血病細胞を用いて一連の混合実験を実施することによって、ＪＡＫ２ １８４９ Ｇ−Ｔに関して具体的に研究されている。彼らは、変異した対立遺伝子が全ＤＮＡの＜５％で存在した場合には、それを検出できなかった。健常な人から得たＤＮＡで希釈したホモ接合性変異体患者のＤＮＡを用いた場合は、配列決定は、細胞株を用いたものよりも感度がさらに低かった（１０％）（１２）。
【０００４】
核酸変異の検出に使用される一般的な方法として、増幅不応性変異系（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＲＭＳ）がある。それは、オリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲの際にこれらのプライマーを伸長するには、その３’末端でＤＮＡポリメラーゼに対して完全にアニーリングされなくてはならないという事実を利用する（１２）。ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆをコードするものなどの特定のＤＮＡ点変異にのみ合致するオリゴヌクレオチドプライマーを設計することによって、ＡＲＭＳは、多型対立遺伝子間を区別することができる。したがって、これらの技術は、「対立遺伝子特異的ＰＣＲ」（ＡＳ−ＰＣＲ）または「配列特異的プライマーＰＣＲ」の別名で通っている。ＡＲＭＳ感度は、野生型バックグラウンド中、最大１〜２％（１３）変異体ＤＮＡである。
【０００５】
サーモサイクリングの間のＰＣＲ産物蓄積のリアルタイムモニタリングは、半定量的方法として価値のあるものであり、リアルタイムＰＣＲととともにＤＮＡ融解曲線アッセイを使用することができる。同様に、James et al.（１４）では、蛍光色素化学配列決定を、２種の異なるリアルタイムＰＣＲをベースとする変異検出システム（一方はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ機器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、もう一方は、Ｔａｑｍａｎ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する）と比較した。これらのリアルタイムＰＣＲ技術は、ＴＦ−１細胞株ＤＮＡで希釈した０．５〜１％のＨＥＬ細胞株ＤＮＡおよび健常なヒトから得たＤＮＡで希釈した２〜４％のホモ接合性変異患者ＤＮＡを検出した。
【０００６】
ＪＡＫ２ １８４９ Ｇ−Ｔ変異は、制限酵素ＢｓａＸＩによって認識される野生型ＪＡＫ２配列中のモチーフを消滅させるので、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析が可能である。負の酵素切断反応は、変異の不在または消化手順の失敗のいずれかによる場合があるので、制限部位の消滅は、新規部位の作製と同程度には満足できるものではないが、初回パス解析として有用であり得る。報告された比例する感度は、断片を検出するために使用される方法に応じて幾分か変わるが、野生型バックグラウンド中、約２０％の変異体ＤＮＡである（１５、１６）。
【０００７】
ピロシーケンスは、ｄＮＴＰが、鋳型駆動性ＤＮＡ重合の際に増大するＤＮＡ鎖中に組み込まれる度に、ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の遊離に依存する迅速遺伝子型判定の方法である（１７）。自動化ＰＳＱ ＨＳ ９６系（Ｂｉｏｔａｇｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するＪＡＫ２のピロシーケンスが、いくつかのグループによって試みられ（１７、１８）、上記のものと同様の希釈実験が、野生型バックグラウンド中、５〜１０％の変異体対立遺伝子の報告されたアッセイ感度を示した。
【０００８】
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、変性高性能液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）、単一ヌクレオチドプライマー伸長アッセイ（Ｐｒｏｎｔｏ）などを含め、いくつかのその他の変異検出技術が記載されている。実際、ＤＨＰＬＣは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの根底にあるゲノムＤＮＡ変異を確実に検出でき、＜１〜２％の割合で変異を検出できる。しかし、ＤＨＰＬＣおよびその他の技術は、技術的に困難であるか、労働集約的であるか、またはその両方である。それらは、臨床検査室に適した費用ではハイスループットを可能にしない（ＳＳＣＰおよびＤＧＧＥ）か、または装置のために相当な初期投資を必要とする（ＤＨＰＬＣ）。
【０００９】
理論的には、タンパク質ベースの技術も、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異を検出するために使用できるが、これらは、一般に、扱いにくいものであり、このような供給源を入手する機会も限られている。したがって、タンパク質ベースのアッセイは、ＤＮＡまたはＲＮＡをベースとする試験が実現可能な場合には、通常好まれない。
【００１０】
欧州特許出願ＥＰ１６９２２８１Ａには、ＰＣＲ増幅に基づいてＧ１８４９Ｔ ＪＡＫ２変異を検出するための方法が開示されている。
【００１１】
先行技術の方法は、いくつかの制限を示す。まず第一に、最良の場合において、１％のサンプルまでの変異体ＪＡＫ２配列の検出を可能にする低レベルの感度。このような感度は、抽出の前の顆粒球単離による変異体の濃縮を必要とする。これは、多大な時間を必要とする労働集約的な工程であり、診断に必要とされるすでに長い手順（２〜５時間）にさらに約２時間をもたらす。さらに、これまでに示されたすべての方法は、比較的、労働集約的であり、費用がかかり、常に容易に入手可能とは限らない特別な装置を必要とすることが多い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、特に選択的で、迅速な核酸分子中の点変異またはＳＮＰを検出する新規ＬＡＭＰ法を提示した。本発明者らはまた、本発明の方法を実施するための新規プライマーのセットおよびキットも提示した。核酸点変異またはＳＮＰを検出する方法ならびにそのプライマーのセットおよびキットは、記載の不可欠な部分を形成する添付の特許請求の範囲に定義される特徴を有する。
【００１３】
本発明の方法は、欧州特許出願ＥＰ１０２０５３４Ａに開示され、本願の図１において表される従来のＬＡＭＰ技術とは異なる。本発明の方法によって、核酸サンプル中の単一塩基置換の同時選択的増幅および検出が可能になる。さらに、本発明の方法は、簡単な計測手段を必要とするだけであって、結果は単一の試験管反応で得ることができるので、実施が容易である。これらの理由から、先行技術の方法と比較してあまり費用がかからない。
【００１４】
本発明の方法は、先行技術の技術の限界および欠点を克服し、その結果、高い感度（野生型バックグラウンド中０．０１％の変異体配列にまで）をもたらし、等温かつ迅速であり、診断を１時間の反応で完了する。さらに、本発明の方法によって、試験されたサンプル中に存在する変異体対立遺伝子、例えば、変異体ＪＡＫ２対立遺伝子などの量が、５０％よりも高いか低いかを評価し、被験体が、目的の核酸単一点変異またはＳＮＰについてヘテロ接合性であるかまたはホモ接合性であるかについての指標として提供することが可能となる。
【００１５】
したがって、本発明の第１の態様は、野生型核酸分子のバックグラウンド内の標的核酸分子中の点変異の存在を検出する方法であって、該方法は、
１）核酸サンプルを提供する工程、
２）適当な反応条件下で、前記核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドの混合物とおよびハイブリダイゼーション条件下で鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む溶液と接触させる工程であって、前記のオリゴヌクレオチドの混合物が、検出されるべき点変異の核酸位置を含む標的核酸分子の領域のループ媒介性等温増幅に適したプライマーからなり、前記プライマーが、
ｉ．第１の外側プライマーＦ３および第２の外側プライマーＢ３と、
ｉｉ．第１の内側プライマーＦＩＰおよび第２の内側プライマーＢＩＰと、
ｉｉｉ．ステムループ変異体伸長性プライマーと、
ｉｖ．野生型核酸分子を選択的に認識し、ハイブリダイズできる非伸長性部分と
を含み、
ＦＩＰが、３’核酸配列Ｆ２および５’核酸配列Ｆ１ｃからなり、ＢＩＰが、３’核酸配列Ｂ２および５’核酸配列Ｂ１ｃからなり、
Ｆ２が、Ｆ２ｃと呼ばれる標的核酸分子の領域を認識およびハイブリダイズでき、Ｂ２が、Ｂ２ｃと呼ばれる標的核酸分子の領域を認識およびハイブリダイズでき、
Ｆ２ｃおよびＢ２ｃが、標的核酸分子の反対側の鎖に位置する異なる領域であり、
Ｂ２ｃが、点変異の下流にあるか、またはＦ２ｃが点変異の上流にあるかのいずれかであり、
Ｂ２ｃが点変異の下流にある場合には、前記の点変異は、Ｆ２ｃ配列中に位置するか、またはＦ２ｃ配列の下流であってＦ１ｃ配列の上流に位置し、またはＦ２ｃが点変異の上流にある場合には、前記の点変異は、Ｂ２ｃ配列中に位置するか、またはＢ２ｃ配列の上流であってＢ１ｃ配列の下流に位置し、
前記ステムループ変異体伸長性プライマーが、
−中央ループ配列が、点変異が存在する場合にのみ、標的核酸分子を認識し、ハイブリダイズできるように、点変異を含む標的核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズすることができる中央ループ配列と、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するように互いに相補的である、５’末端配列および３’末端配列と
を含み、
点変異を含む標的核酸分子の領域に対する中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、３’配列に対する５’配列の分子内ハイブリダイゼーション親和性より高く、その結果、点変異が存在する場合に、中央ループ配列が、点変異を含む標的核酸分子の領域とアニールし、増幅する、工程、
３）得られた混合物を一定温度でインキュベートする工程、ならびに
４）点変異を含む標的核酸分子の領域の増幅を示すシグナルを検出する工程
を含む。
【００１６】
本方法の第１の工程は、例えば、ヘテロ接合型または、ホモ接合型のいずれかで目的の点変異を保有する疑いのある患者から、試験されるべき核酸サンプルを得ることを意味する。
【００１７】
好ましい実施形態では、２種の内側プライマーＦＩＰおよびＢＩＰは、検出されるべき点変異の核酸位置を含む標的核酸分子の領域上で設計され、その結果、該点変異は、Ｆ２ｃ配列とＦ１ｃ配列の間またはＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列の間の領域中に位置する。代替実施形態では、点変異は、Ｂ２またはＦ２によってプローブされる領域中、すなわち、Ｆ２ｃ配列内またはＢ２ｃ配列内に位置する。
【００１８】
別の好ましい実施形態では、ステムループ変異体伸長性プライマーの５’末端の配列および３’末端の配列は、少なくとも３ヌクレオチドの長さである。あるいは、ステムループ変異体伸長性プライマーは、「自己アニーリング型変異体伸長性プライマー」、またはより簡単に「自己アニーリング型伸長性プライマー」（ＬＢまたはＬＦ）と呼ばれることもある。
【００１９】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、非伸長性部分は、好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さのペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＤＮＡおよびＲＮＡは、それぞれ、デオキシリボースおよびリボース糖骨格からなるのに対し、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結している反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位からできている。プリンおよびピリミジン塩基は、メチレンカルボニル結合によって骨格と連結している。ＰＮＡは、ペプチドのように表され、最初の（左の）位置にＮ末端および右にＣ末端がある。ＰＮＡの骨格は、リン酸基を全く含有しないので、ＰＮＡ／ＤＮＡ鎖間の結合は、静電反発力がないためにＤＮＡ／ＤＮＡ鎖間よりも強い。
【００２０】
本発明の最も好ましい実施形態では、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、推定点変異を含む（すなわち、検出されるべき点変異の核酸位置を含む）核酸分子の領域とハイブリダイズでき、それによって、野生型標的核酸分子を有する一本と、変異標的核酸分子を有するもう一本との２つの二本鎖構造の形成をもたらす塩基の配列を含む。ＰＮＡの、点変異の不在下における標的核酸分子との（すなわち、野生型配列との）ハイブリダイゼーションに起因する二本鎖構造の融解温度は、（Ｔｍ）＝Ｘと表され、ＰＮＡの、点変異の存在下における標的核酸分子との（すなわち、変異配列との）ハイブリダイゼーションに起因する二本鎖構造の融解温度は、（Ｔｍ）＝Ｙと表される。好ましい実施形態によれば、Ｙ＜インキュベーション温度≦Ｘであり、Ｘは、Ｙよりも少なくとも５℃高い。
【００２１】
本発明の代替実施形態では、非伸長性部分は、
−検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズできる中央ループ配列と、
−５’末端配列および３’末端配列と
を含むステムループ野生型非伸長性プライマーであり、前記５’末端および前記３’末端配列は、ステムを形成するよう互いに相補的であり、その結果、前記中央ループ配列が、核酸分子の野生型配列を含む領域に対して、５’末端配列の、３’末端配列に対するハイブリダイゼーション親和性よりも高いハイブリダイゼーション親和性を有し、その結果、ＷＴ配列とのアニーリングおよびＷＴ配列の増幅の阻止をもたらす。当業者ならば、５’末端配列と３’末端配列間のハイブリダイゼーションは、分子内ハイブリダイゼーションであるという事実は、承知している。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、反応条件下で鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ大断片（ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）ポリメラーゼであるか、あるいは、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Φ２９ファージ、ＭＳ−２ファージ、Ｚ−Ｔａｑ、ＫＯＤ、クレノウ断片のうちの１種またはそれらの組合せである。
【００２３】
好ましい実施形態では、一定反応温度は、６２℃〜６７℃の間からなる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、点変異を含むヌクレオチド分子の増幅を示すシグナルは、比濁法によって検出される。あるいは、点変異を含むヌクレオチド分子の増幅を示すシグナルは、蛍光または任意のその他の適した検出のための手段によって検出される。
【００２５】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、標的核酸分子は、配列番号２の塩基９３５２６で推定グアニン−チミジン置換を含有するヒトＪＡＫ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ ００９９０４、配列番号２）の領域を含み、これは、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２、配列番号１）中の開始コドンからヌクレオチド位置１８４９に対応し、次いで、配列番号１の位置２３４３に対応する。
【００２６】
第１および第２の外側プライマーＦ３およびＢ３は、位置９３５２６に推定Ｇ→Ｔ塩基置換を含有するヒトＪＡＫ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ ００９９０４、配列番号２）のエキソン１４の側面に位置するイントロン領域中にそれぞれ位置することが好ましい。Ｆ３は、配列番号２の位置９３３６７〜９３３８８に及ぶヌクレオチド配列からなり、Ｂ３は、配列番号２の位置９３５６１〜９３５８２間のヌクレオチド領域と相補的であるヌクレオチド配列からなることがより好ましい。第１および第２の内側プライマーＦＩＰおよびＢＩＰは、以下の通りに設計されることが好ましい。ＦＩＰプライマーは、ＪＡＫ２エキソン１４の上流のイントロン領域中（好ましくは、配列番号２の位置９３４０８〜９３４２５の間）に位置するＦ２配列と、配列番号２のヌクレオチド９３４４５〜９３４７０と相補的であるＦ１ｃ配列とからなり、ＢＩＰプライマーは、下流イントロンの最初の１８個の塩基を含む、配列番号２のヌクレオチド９３５３８〜９３５５９を含む領域と相補的であるＢ２配列と、配列番号２の位置９３４８６〜９３５１５に位置するＢ１ｃ配列とからなる。ステムループ変異体伸長性プライマーの中央ループ配列は、配列番号２のヌクレオチド９３５１６〜９３５２９からなることが好ましい。ＰＮＡ塩基配列は、配列番号２のヌクレオチド９３５１８〜９３５３４からなることが好ましい。
【００２７】
本発明の方法を実施するために使用される、ループ媒介性等温増幅に適したプライマーは、以下の配列からなることが最も好ましい。
Ｆ３ ５’−ＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号３）、
Ｂ３ ５’−ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡ−３’（配列番号４）、
ＦＩＰ ５’−ＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号５）、
ＢＩＰ ５’−ＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣ−３’（配列番号６）、
ステムループ変異体伸長性プライマー：５’−ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣ−３’（配列番号８）。
【００２８】
より好ましい実施形態では、非伸長性部分は、好ましくは、構造：ＮＨ２ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＣＯＮＨ２（配列番号９）を有するＰＮＡ分子である。
【００２９】
本発明の方法はまた、例えば、点変異が、ホモ接合型であるかまたはヘテロ接合型であるかを評価するために、核酸サンプル中の変異体対立遺伝子の（例えば、存在するＪＡＫ２変異体対立遺伝子の）量を定量的に評価するのにも適している。これは、サンプルから得られた点変異を含む標的核酸分子の領域の増幅を示すシグナルを、少なくとも１種の標準物質から得られた前記シグナルと定量的に比較することによって達成される。好ましい実施形態では、少なくとも１種の標準物質は、野生型核酸分子のバックグラウンド中、所定のパーセンテージ（％）の変異体標的核酸分子からなり、前記の所定のパーセンテージ（％）は、好ましくは、約１０％である。例えば、３種の標準物質（例えば、野生型プラスミドバックグラウンド中、１００％、１０％および１％変異体Ｇ１８４９Ｔ ＪＡＫプラスミド）と比較した、非希釈および１：５希釈サンプルの増幅効率を分析することによって、試験サンプル中の変異体対立遺伝子の量が、５０％より高いか低いか決定することが可能であり、これは、ホモ接合性またはヘテロ接合性を示すものである。
【００３０】
本発明の方法はまた、ｋＲＡＳ、ＥＧＦＲなどの異なる病態に関与するその他の遺伝子変異を検出するのに、ならびにＳＮＰを検出するのにも適している。
【００３１】
本発明の別の態様は、ループ媒介性等温増幅によって、野生型核酸分子のバックグラウンドにおいて標的核酸分子における点変異の存在を検出するためのプライマーのセットであり、該プライマーのセットは、第１の外側プライマーＦ３と、第２の外側プライマーＢ３と、第１の内側プライマーＦＩＰと、第２の内側プライマーＢＩＰと、ステムループ変異体伸長性プライマーとを含み、すべて本発明の方法に関して上記で定義されるとおりである。
【００３２】
好ましい実施形態によれば、プライマーのセットは、配列番号３からなる第１の外側プライマーＦ３、配列番号４からなる第２の外側プライマーＢ３、配列番号５からなる第１の内側プライマーＦＩＰ、配列番号６からなる第２の内側プライマーＢＩＰ、および配列番号８からなるステムループ変異体伸長性プライマーを含む。
【００３３】
本発明のさらに好ましい実施形態は、野生型核酸分子とハイブリダイズできる非伸長性部分をさらに含む上記で定義されるプライマーのセットである。非伸長性部分は、例えば、添付の特許請求の範囲において定義される、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはステムループ非伸長性プライマーである。少なくとも１０塩基の長さであるＰＮＡが、より好ましい。配列表において配列番号９として示されるＰＮＡが、非伸長性部分の最も好ましい実施形態である。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、ループ媒介性等温増幅によって、野生型核酸分子のバックグラウンドにおける標的核酸分子における点変異の存在を検出するためのキットであり、該キットは、上記で定義されるプライマーのセットならびに鎖置換活性を有する１種または複数のＤＮＡポリメラーゼを含む。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Φ２９ファージ、ＭＳ−２ファージ、Ｚ−Ｔａｑ、ＫＯＤ、クレノウ断片およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されることが好ましい。最も好ましいＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼである。
【００３５】
本発明のキットは、例えば、１種または複数の標準物質、標的核酸分子の増幅を検出および／または定量するための手段ならびにアッセイを実施するための説明書などのさらなる従来の構成要素を含有し得る。このようなさらなる構成要素の選択および使用は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００３６】
本発明の範囲は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号８ならびに配列番号２の位置９３５２６を含むＪＡＫ２ゲノムＤＮＡ（配列番号２）の領域、または配列番号１の位置２３４３を含むＪＡＫ２ｃＤＮＡ（配列番号１）の領域とハイブリダイズできる塩基配列を含む６〜２４塩基の長さのペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群から選択される単離オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む。本発明のＰＮＡの好ましい実施形態は、以下の塩基配列：
ＮＨ２−ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡ−ＣＯＯＨ（配列番号９）（ここで、Ｇはグアニンであり、Ａはアデニンであり、Ｔはチミンであり、Ｃはシトシンである）を含む。
【００３７】
本発明を本明細書において、以下の図面を参照し、以下の特定の限定しない実施例によってさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＬＡＭＰ原理（先行技術）。 増幅反応は、標的ゲノム配列の６種の異なる領域にとって特異的な４種のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって実施する。内部プライマーは、標的核酸分子上の相補的な配列とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、増幅生成物は、外部プライマー（Ｆ３、Ｂ３）によって２工程で置換され、二重ステムループ構造（出発構造）（パネルＡ）として形作られる。出発構造は、遊離３’末端から、別の内部プライマーによって同時に増幅される（パネルＢ）。最初のモジュールの逆方向反復によって構築されたＤＮＡコンカテマーは、指数関数的に徐々に合成される（パネルＣ）。
【図２】ＬＡＭＰ「ダンベル（ＤＵＭＢ−ＢＥＬＬ）」戦略。 図２に示される本アッセイ設定では、ＦＩＰおよびＢＩＰ内側プライマー中に含有されるＦ１ｃおよびＢ１ｃオリゴヌクレオチドは、ＪＡＫ２コード配列中の開始コドンから位置１８４９の目的のヌクレオチドのそれぞれ一塩基上流および一塩基下流で終了および開始するＪＡＫ２遺伝子の非重複領域に対して相補的である。さらに、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの５’末端塩基は、ＪＡＫ２配列中の変異ヌクレオチドに対して特異的であり、両内側プライマーは、３’末端から３番目の塩基でミスマッチした塩基を有する。反応が野生型標的対立遺伝子を含有し、ダンベル構造が形成される場合には、変異体特異的Ｆ１ｃおよびＢ１ｃ配列は、３’末端でアニールせず、あらゆるさらなる標的増幅を阻止する。そうではなく、変異体標的対立遺伝子が溶液中に存在する場合には、変異体特異的Ｆ１ｃおよびＢ１ｃ配列は、相補的核酸標的領域と完全にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【図３】ＬＡＭＰ「対立遺伝子特異的ループプライマー伸長」戦略。 変異体特異的ループプライマーの３’末端のヌクレオチドは、ＪＡＫ２コード配列中の位置１８４９の変異Ｔヌクレオチドと相補的である。さらに、このループプライマーは、３’末端から３番目の塩基においてミスマッチした塩基を含有する。反応がＷＴ ＪＡＫ２配列を含有する場合には、３’末端変異体特異的ループプライマーは、標的配列とアニールせず、増幅をもたらさない。そうではなく、変異体ＪＡＫ２配列が溶液中に存在する場合には、変異体特異的ループプライマーは、相補的標的配列と完全にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【図４】ＬＡＭＰ「ステムループプライマー」戦略。 ループ領域中に推定変異Ｔヌクレオチドを提示するダンベルを得るようＦ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセット。第１のステムループプライマーは、一本鎖ダンベル構造中に変異された塩基を認識するよう設計され、ＪＡＫ２野生型配列と相補的であり、非伸長性３’末端を含有する第２の改変されたステムループプライマーと一緒に含まれる。変異したＪＡＫ２配列が、核酸サンプル中に存在する場合（パネルＡ）に、変異体特異的ステムループプライマーが、その内部構造を破壊して標的配列とアニールし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。逆に、ＷＴ標的配列がサンプル中に存在する場合（パネルＢ）には、改変された非伸長性ステムループプライマーは、ＷＴ標的配列とハイブリダイズして、この配列の増幅を阻止する（「サイレンシング」効果）。
【図５】ＬＡＭＰ「ＰＮＡを伴う変異体特異的ステムループプライマー」戦略。 ループ領域中に推定変異Ｔヌクレオチドを提示するダンベルを得るようＦ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセット。第１のステムループプライマーは、一本鎖ダンベル構造中に変異塩基を認識するよう設計され、ＰＮＡ分子と一緒に含まれる。ＰＮＡは、Ｂ２およびＢ１ｃ間に含まれるループ領域と相補的であり、検出されるべき点変異の核酸位置を包含するよう設計される。ＪＡＫ２ ＷＴ配列と安定な二本鎖を形成し、ひいては、ハイブリダイゼーションおよび変異体特異的ステムループプライマーの伸長を妨げ、野生型配列の非特異的増幅を抑制する（パネルＢ）。ＰＮＡは、低い親和性のために、変異したＪＡＫ２配列とハイブリダイズしない（パネルＡ）。
【図６】ＬＡＭＰ「ダンベル」アッセイの感度。 増幅反応を、７ｅ３ｃｐｓ／μｌのＪＡＫ２野生型プラスミドを含有するサンプルで（正方形の点）、標的なし対照で、水中のＪＡＫ２変異体プラスミドの段階希釈で（７ｅ３〜７ｅ１ｃｐｓ／μｌ、菱形の点、７ｅ０ｃｐｓ／μｌ、丸の点）実施した。各サンプルを３連で試験した。エラーバーは、１標準偏差を表す。野生型プラスミドと比較して、変異体標的配列は、最大７ｅ１ｃｐｓ／μｌのサンプル濃度まで高効率で増幅される。本アッセイは、７ｅ３から７ｅ１ｃｐｓ／μｌ変異体プラスミドサンプルの間で直線性を示す。
【図７】ＬＡＭＰ「対立遺伝子特異的変異体ループプライマー」アッセイの感度。 増幅反応を、７ｅ３ｃｐｓ／μｌのＪＡＫ２野生型プラスミドを含有するサンプルで（正方形の点）、標的なし対照で、水中のＪＡＫ２変異体プラスミドの段階希釈で（７ｅ３〜７ｅ１ｃｐｓ／μｌ、菱形の点）実施した。各サンプルを３連で試験した。エラーバーは、１標準偏差を表す。野生型プラスミドと比較して、変異体標的配列は、最大７ｅ２ｃｐｓ／μｌのサンプル濃度まで高効率で増幅される。本アッセイは、７ｅ３から７ｅ１ｃｐｓ／μｌ変異体プラスミドサンプルの間で直線性を示す。
【図８】ＬＡＭＰ「ステムループプライマー」アッセイの選択性。 増幅反応を、７ｅ３ｃｐｓ／μｌのＪＡＫ２野生型プラスミドを含有するサンプルで（正方形の点）、標的なし対照で、７５％〜１％の範囲、反応あたり全量３５０００ｃｐｓのＤＮＡの野生型プラスミド中のＪＡＫ２変異体プラスミドの段階希釈で実施した。各サンプルを３連で試験した。エラーバーは、１標準偏差を表す。野生型プラスミドと比較して、変異体標的配列は、最大１％の用量サンプル（３４６５０コピーの元の親プラスミド中、３５０コピーの変異体プラスミド）まで高効率で増幅される。アッセイは、野生型バックグラウンド中、１００％〜１％の間の変異体プラスミドサンプルで、直線性を示す。
【図９】ＬＡＭＰ「ＰＮＡを伴うステムループプライマー」。 ＰＮＡを用いて、用いずに、変異体および野生型プラスミドサンプル（各３５０００ｃｐｓ）でのアッセイ性能。ＰＮＡの不在下で、ＪＡＫ２ ＷＴプラスミドは、変異体特異的ステムループプライマーによって非特異的に増幅され、変異した標的配列に関して５分遅れる。対照的に、反応混合物にＰＮＡが加えられると、ＷＴプラスミドは、変異体特異的ステムループプライマーによって１時間遅れて増幅され、ＪＡＫ２変異体プラスミドの特異的増幅については、５分遅れしか測定されない。ＰＮＡは、ＷＴ相補配列とのみ安定な二本鎖を形成し、変異体特異的ステムループプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を妨げ、それによって、野生型配列の増幅時間の１時間のずれを引き起こす。
【図１０】ＬＡＭＰ「ＰＮＡを伴うステムループプライマー」アッセイの選択性。 ＪＡＫ２変異体プラスミドサンプル（３５００００ｃｐｓ）、ＪＡＫ２野生型プラスミドサンプル（３５００００ｃｐｓ）および野生型バックグラウンドで、以下の割合１、０．５、０．１、０．０５および０．０１％に段階希釈した変異体プラスミドでのアッセイ性能。エラーバーは、１標準偏差に対応する。ＷＴサンプル（３５００００ｃｐｓ ＷＴプラスミド）については、１時間の反応内では増幅は検出されなかった。変異体標的配列の特異的増幅は、野生型バックグラウンド中、０．０１％の変異体配列まで検出される（３４９６５０コピーのＷＴプラスミド中全３５コピーの変異体プラスミド）。アッセイは、０．１％変異体プラスミドの濃度（３４９６５０コピーのＷＴプラスミド中全３５０コピーの変異体プラスミド）まで直線である。
【図１１】ＬＡＭＰ対照反応。 Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセット。この方法は、特定の変異の存在とは独立したゲノムＤＮＡ標的配列を増幅するよう設計されている。このような対照アッセイによって、プライマーの増幅効率および反応管中の阻害剤の存在を評価することが可能となる。
【図１２】ＪＡＫ２野生型および変異体核酸サンプルでのＬＡＭＰ対照反応。 Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセットの増幅効率は、分析されたサンプルすべて：１００％のＪＡＫ２野生型プラスミド、１００％、１０％および１％のＪＡＫ２変異体プラスミドについて同程度である。標的配列増幅の遅れまたは標的配列増幅がないことは、反応阻害剤の存在または反応条件における問題を示す。
【図１３】核酸サンプル中の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーの推定の原理。 核酸サンプル中のＪＡＫ２対立遺伝子コピーの量が、５０％よりも高いか低いかを推定するために、変異体特異的ステムループプライマーおよびＰＮＡを用いる改変ＬＡＭＰを、非希釈サンプルおよび１：５希釈したサンプルで実施する。サンプルが、５０％超の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーを含有する場合には、標的配列の閾値増幅分は、非希釈（パネルＡ）および希釈（パネルＢ）サンプル両方の標準物質１００％と標準物質１０％の（分）ｔの間に含まれる。サンプルが、５０％未満の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーを含有する場合には、標的配列の閾値増幅分は、非希釈サンプル（パネルＡ）の標準物質１００％と標準物質１０％のｔ（分）の間および希釈サンプル（パネルＢ）の標準物質１０％と標準物質１％の分（ｔ）の間に含まれる。
【図１４】５０％超の変異標的配列を含有する核酸サンプル中の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーの推定。 野生型バックグラウンド中、５０％超の変異体ＪＡＫ２プラスミドを含有する４種の核酸サンプル（それぞれ、６０％、７０％、８０％および９０％）を、１：５希釈し、野生型バックグラウンドにおける１００％、１０％および１％のＪＡＫ２変異体プラスミドからなる３種の標準物質と一緒に、「ＰＮＡを伴うＬＡＭＰステムループプライマー」アッセイを使用して分析した。４種のサンプルすべてについて、閾値増幅分は、標準物質１００％の分（ｔ）から標準物質１０％の分（ｔ）の間に含まれていた。
【図１５】５０％未満の変異標的配列を含有する核酸サンプル中の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーの推定。 野生型バックグラウンド中、５０％以下の変異体ＪＡＫ２プラスミドを含有する４種の核酸サンプル（それぞれ、４０％、３０％および２０％）を１：５希釈し、野生型バックグラウンド中、１００％、１０％および１％のＪＡＫ２変異体プラスミドからなる３種の標準物質と一緒に、「ＰＮＡを伴うＬＡＭＰステムループプライマー」アッセイを使用して分析した。１：５希釈した５０％サンプルの増幅は、１０％標準物質サンプルの同一閾値分で生じた。残りの３種のサンプルについては、閾値増幅分は、標準物質１０％の分（ｔ）から標準物質１％の分（ｔ）の間に含まれていた。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下の実施例は、単に例示として提供するものであって、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【実施例１】
【００４０】
ＪＡＫ２−改変ＬＡＭＰ「ダンベル戦略」の材料、方法および結果
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供され、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有していた。詳細には、
−「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、供給業者Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。
−ＧＡ２１１（Ｆ３） ５’ＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＴＴＣＴＴＴＧＴＡＣＴ３’（配列番号１０）
−ＧＡ２１２（Ｂ３） ５’ＡＧＣＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧ３’（配列番号１１）
−ＧＡ２１６（ＦＩＰ） ５’ＡＡＴＡＴＡＣＴＣＣＡＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴ ３’（配列番号１２）
−ＧＡ２２０（ＢＩＰ） ５’ＴＴＴＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＡＡＡＣＴＡＣＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣＴＧＡ３’（配列番号１３）
−ＧＡ２２１（ＬＦ） ５’ＧＴＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴ３’（配列番号１４）
−ＧＡ２２２（ＬＢ） ５’ＡＧＧＣＴＴＴＣＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＣ３’（配列番号１５）
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、 ５％ＤＭＳＯ「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ａｐｙｒｏｇｅｎ ｗａｔｅｒ）（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【００４１】
手順
サンプル調製
以下のとおりの反応混合物を調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、０．８μＭループプライマー（ＬＦおよびＬＢ）、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（７ｅ３ｃｐｓ／ｕｌの野生型プラスミド）、１２種の陽性対照（３サンプルの７ｅ３ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド、３サンプルの７ｅ２ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド、３サンプルの７ｅ１ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド、３サンプルの７ｅ０ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド）、１種の標的なし対照を含む少なくとも１７サンプルのために混合物を調製する。
【００４２】
表１サンプル混合物組成
【表１】
【００４３】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【００４４】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、Ｔｒｉｓ １０ｍＭで、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ、７ｅ２ｃｐｓ／μｌ、７ｅ１ｃｐｓ／μｌおよび７ｅ０ｃｐｓ／μｌに段階希釈する。ＷＴプラスミドを、Ｔｒｉｓ １０ｍＭで７×１０３コピー／μｌに希釈する。
【００４５】
３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【００４６】
反応
反応は、図１および２の方法スキームにしたがう。
【００４７】
６６℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションおよび濁度のリアルタイムモニタリングのために濁度計（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）をプログラムする。
【００４８】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【００４９】
データ解析
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、ａ．ｕ．（吸光度の任意の単位）を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値（この場合には、０．１ａ．ｕ．）に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【００５０】
結果
「ＬＡＭＰ ＪＡＫ２ダンベル」戦略は、ＳＮＰ検出のためのＥｉｋｅｎ ＬＡＭＰ法に基づいている（ＥＰ１２３１２８１、２０、２１、２２ならびにhttp://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/snps_anim.htmlに記載されている）。
【００５１】
図２に示される本アッセイ設定では、ＦＩＰおよびＢＩＰ内側プライマー中に含有されるＦ１ｃおよびＢ１ｃオリゴヌクレオチドは、ＪＡＫ２コード配列中の開始コドンから位置１８４９の目的のヌクレオチドのそれぞれ一塩基上流および一塩基下流で終了および開始するＪＡＫ２遺伝子の非重複領域に対して相補的である。さらに、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの５’末端塩基は、ＪＡＫ２配列中の変異Ｔヌクレオチドに対して特異的であり、両内側プライマーは、３’末端から３番目の塩基でミスマッチした塩基を有する。反応が、野生型標的対立遺伝子を含有し、ダンベル構造が形成される場合には、変異体特異的Ｆ１ｃおよびＢ１ｃ配列は、３’末端でアニールせず、あらゆるさらなる増幅を阻止する。そうではなく、変異体標的対立遺伝子が溶液中に存在する場合には、変異体特異的Ｆ１ｃおよびＢ１ｃ配列は、相補的核酸標的領域と完全にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【００５２】
図６に示されるように、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ〜７ｅ０ｃｐｓ／μｌ（全３５コピーの変異体プラスミド）の範囲のＬＡＭＰアッセイによって、変異体プラスミド濃度の低下が検出された。低濃度の標的核酸配列では、このＬＡＭＰアッセイ設定では、変異体と野生型プラスミドとを区別できなかった。実際には、これらは、７ｅ３ｃｐｓ／μｌの濃度で増幅される。文献においてこれまでに記載されたアッセイ法の限界を克服するには、１％より低い選択性の値が必要とされるので、本アプローチを用いても明確な利点は得られなかった。
【実施例２】
【００５３】
ＪＡＫ２−改変ＬＡＭＰ「対立遺伝子特異的ループプライマー伸長」戦略の材料、方法および結果
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有するように合成された。詳細には、
−「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。
下線を引いた塩基は、ミスマッチしたヌクレオチドに相当する。太字の塩基は、ＪＡＫ２コード配列のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の変異ヌクレオチドに相当する。
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【００５４】
手順
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−２０℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は４℃で保存されるべきである。
【００５５】
以下のとおりの反応混合物を調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、０．８μＭループプライマー（ＬＢ）、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（７ｅ３ｃｐｓ／ｕｌの野生型プラスミド）、９種の陽性対照（３サンプルの７ｅ３ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド、３サンプルの７ｅ２ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド、３サンプルの７ｅ１ｃｐｓ／ｕｌ変異体プラスミド）、１種の標的なし対照を含む少なくとも１４種のサンプルのために混合物を調製する。
【００５６】
表２サンプル混合物組成
【表２】
【００５７】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【００５８】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、Ｔｒｉｓ １０ｍＭで、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ、７ｅ２ｃｐｓ／μｌ、７ｅ１ｃｐｓ／μｌに段階希釈する。ＷＴプラスミドを、Ｔｒｉｓ １０ｍＭで７×１０３コピー／μｌに希釈する。３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【００５９】
反応
反応は、図３の方法スキームにしたがう。
【００６０】
６５℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションおよび濁度のリアルタイムモニタリングのために濁度計（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）をプログラムする。
【００６１】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【００６２】
データ解析
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、ａ．ｕ．を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値（この場合には、０．１ａ．ｕ．）に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【００６３】
結果
本アプローチは、変異体特異的ループプライマーを使用することによる変異体配列の選択的増幅からなる（図３）。本発明者らは、Ｂ２とＢ１ｃとの間に含まれるループ領域中に推定変異を提示するダンベル構造を得るよう、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセットを設計した。さらに、本発明者らは、ＪＡＫ２コード配列の位置１８４９の変異ヌクレオチドＴと相補的な３’末端の最後の塩基および３’末端から３番目の塩基においてミスマッチした塩基を提示するループプライマーを設計した。
【００６４】
反応が、ＷＴ標的配列を含有する場合には、変異体特異的ループプライマーの３’末端は、相補的ヌクレオチドとアニールせず、ひいては、増幅をもたらさない。そうではなく、ＪＡＫ２変異体配列が溶液中に存在する場合には、変異体特異的ループプライマーは、相補的配列と完全にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【００６５】
７ｅ３ｃｐｓ／μｌ〜７ｅ１ｃｐｓ／μｌ（全３５０００および３５０コピーの変異体プラスミド）の範囲の濃度の変異体プラスミドサンプルで、７ｅ３プラスミドｃｐｓ／μｌを含有するＷＴサンプルでアッセイ評価を実施し、すべて、サンプルは３連で試験した。本方法を用いて、７ｅ３ｃｐｓ／μｌのＷＴプラスミドサンプルの非特異的増幅を検出し、７ｅ１ｃｐｓ／μｌ濃度の変異体および野生型サンプルは、区別できなかった。文献においてこれまでに記載されたアッセイ法の限界を克服するには、１％より低い選択性の値が必要とされるので、本アプローチを用いても明確な利点は得られなかった（図７）。
【実施例３】
【００６６】
ＪＡＫ２−改変ＬＡＭＰ「ステムループプライマー戦略」の材料、方法および結果
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有するように合成された。詳細には、
−「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。
−ＧＡ２３１（Ｆ３） ５’ＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧ３’（配列番号３）
−ＧＡ２３２（Ｂ３） ５’ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡ３’（配列番号４）
−ＧＡ２３３（ＦＩＰ） ５’ＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣ３’（配列番号５）
−ＧＡ２３４（ＢＩＰ） ５’ＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣ３’（配列番号６）
−ＧＡ２３５（ＬＦ） ５’ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡｄｄＣ３’（配列番号７）
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）中のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の野生型ヌクレオチドに相当する。
−ｄｄＣは、非伸長性ジデオキシシトシンを表す。
−ＧＡ２３６（ＬＢ） ５’ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣ３’（配列番号８）
−下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）中のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の変異したヌクレオチドに相当する。
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【００６７】
手順
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−２０℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は４℃で保存されるべきである。
【００６８】
以下のとおりの反応混合物を調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、０．８μＭ両方の自己アニーリング型ループプライマー（非伸長性ＬＦおよびＬＢ）、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（１００％野生型プラスミド、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）、２１種の陽性対照（３サンプルの１００％変異体プラスミド（７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した７５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した５０％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した２５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１０％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１％変異体プラスミド）および１種の標的なし対照を含む、少なくとも２６サンプルのために混合物を調製する。
【００６９】
表３サンプル混合物組成
【表３】
【００７０】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【００７１】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、変異体プラスミドをＷＴプラスミドで段階希釈して、以下の野生型バックグラウンドにおける変異体配列の濃度を得る。７５％、５０％、２５％、１０％、５％、１％（試験管あたりの総量、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）。
【００７２】
３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【００７３】
反応
反応は、図４の方法スキームにしたがう。
【００７４】
６５℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションおよび濁度のリアルタイムモニタリングのために濁度計（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）をプログラムする。
【００７５】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【００７６】
データ解析
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、ａ．ｕ．を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値（この場合には、０．１ａ．ｕ．）に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【００７７】
結果
本アプローチは、特定のループプライマーの、変異体配列から形成されるダンベルとの選択的ハイブリダイゼーションをもたらす、このようなループプライマー設計に基づく変異体配列の選択的増幅からなる（図４）。本発明者らは、Ｂ１とＢ２の間に含まれるループ領域中に推定変異を提示するダンベル構造を得るよう、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセットを設計した。Ｂ２内またはＢ２とＢ１ｃとの間のループ領域中に推定変異ヌクレオチドを含有する代替配列でこのような実験を実施した際には、大きな相違は検出されなかった。本発明者らは、プライマーセット中に、その自身の３’末端の配列と相補的であるその５’末端に、８塩基の配列領域を提示する特定のループプライマーを含めた。その結果として、この特別のループプライマーは、反応温度（６５℃）でそのオープン型と平衡にある分子内ヘアピン構造を形成する。
【００７８】
変異体ＪＡＫ２配列がサンプル中に存在する場合には、このような改変されたループプライマーは、熱力学的平衡に従って、その内部構造を破壊して、相補的標的配列とハイブリダイズする（プライマーおよび特異的標的間のＴｍ＝６５℃）。次いで、特異的な変異標的とハイブリダイズされたループプライマーがポリメラーゼによって伸長され、増幅がさらに進行することができる。さらなる特徴として、ＪＡＫ２ Ｇ→Ｔ変異に対して特異的なループプライマーは、分子内ヘアピン構造（６５℃）よりも低い野生型標的配列とのＴｍ（５９℃）を示す。したがって、ＪＡＫ２ ＷＴ配列を含有するサンプルでは、Ｔｍ値のこのような相違は、分子内力が分子間のものよりも高いので、非特異的標的と二本鎖を形成するよりもヘアピン構造にフォールディングすることを好む改変されたループプライマーの自己隔離をもたらす。
【００７９】
本発明者らは、臨床サンプル中に大過剰で存在している可能性が高い野生型配列に対するこのループプライマーの競合を制限するために、反応設定に、類似の構造を有し、ＪＡＫ２野生型配列と相補的である核酸配列を含有する、すなわち、開始コドン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）から位置１８４９にＧ塩基を有する第２のループプライマーを含めた。
【００８０】
この「競合者」ループプライマーの３’末端は、改変によって非伸長性にされる（３’ジデオキシ）。この競合者の役割は、ＷＴ配列を「サイレントにし」、ひいては、特異的変異体プライマーがその標的を見出すことを可能にすることである。
【００８１】
「競合者」プライマーが、相補的野生型配列を認識する場合には、より高い親和性に従って、その分子内構造を破壊して、ＷＴ標的とハイブリダイズする（ＷＴ標的およびＷＴ改変されたループプライマーによって形成される二本鎖のＴｍ＝６７℃）。ＷＴ標的とハイブリダイズされたループプライマーは、非伸長性であり、野生型配列の増幅をもたらさない。反応は、一定温度で実施されるので、ＷＴ特異的ステムループプライマーは、野生型配列と結合しているままであり、ひいては、ＭＵＴループプライマーの非特異的ハイブリダイゼーションを妨げる。
【００８２】
変異体特異的ループプライマーとは対照的に、「競合者」プライマーは、それ自体によって形成される分子内ヘアピン構造（６５℃）よりも低い、変異体標的配列とのＴｍ（６２℃）を示す。したがって、分子間のものと比較して高い分子内力が、変異体標的配列と二本鎖を形成するよりもヘアピン構造にフォールディングすることを好む、改変されたステムループプライマーの自己隔離を引き起こす。
【００８３】
本アッセイの選択性を、野生型バックグラウンドにおける変異体プラスミドの段階希釈で標的配列増幅を実施することによって評価した（図８）。達成された選択性は、有意に１％（３４６５０コピーのＷＴプラスミド中、全３５０コピーの変異体プラスミド）未満であり、文献においてこれまでに記載されたアッセイよりも高い性能を示す。
【００８４】
アッセイ直線性は、１００％変異体プラスミド（３５０００ｃｐｓ）から９９％野生型プラスミド中の１％変異体（３４６５０コピーのＷＴプラスミド中の３５０コピーの変異体プラスミド）の間で検出され、したがって、多量のＷＴプラスミド中の低いパーセンテージの変異体配列の検出および定量化が可能となる。したがって、このように実施されたＬＡＭＰアプローチを用いて有意な改善が達成された。
【実施例４】
【００８５】
ＪＡＫ２−改変ＬＡＭＰ「ＰＮＡを伴うステムループプライマー戦略」の材料、方法および結果
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有するように合成された。詳細には、
−「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。
−ＧＡ２３１（Ｆ３） ５’ＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧ３’（配列番号３）
−ＧＡ２３２（Ｂ３） ５’ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡ３’（配列番号４）
−ＧＡ２３３（ＦＩＰ） ５’ＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣ３’（配列番号５）
−ＧＡ２３４（ＢＩＰ） ５’ＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣ３’（配列番号６）
−ＧＡ２３６（ＬＢ） ５’ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣ３’（配列番号８）
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）中のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の変異ヌクレオチドに対応する。
ＰＮＡ：Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃによって合成された、「ＰＮＡ」と呼ばれる、ＧＭ４３ ＮＨ２ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＣＯＯＨ（配列番号９）。
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）中のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の野生型ヌクレオチドに対応する。
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【００８６】
手順
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−２０℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は４℃で保存されるべきである。
【００８７】
以下のとおりの反応混合物を調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、０．８μＭ変異体ＪＡＫ２（ＬＢ）に特異的な自己アニーリング型ループプライマー、０．８μＭ ＰＮＡ、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（１００％野生型プラスミド、７ｅ４ｃｐｓ／μｌ）、１８種の陽性対照（３サンプルの１００％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．１％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．０５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．０１％変異体プラスミド（ＤＮＡの総量７ｅ４ｃｐｓ／μｌ））および１種の標的なし対照を含む、少なくとも２３サンプルのために混合物を調製する。
【００８８】
表４サンプル混合物組成
【表４】
【００８９】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【００９０】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、変異体プラスミドをＷＴプラスミドで段階希釈して、以下の野生型バックグラウンドにおける変異体配列の濃度を得る。１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％（試験管あたりの総量、７ｅ４ｃｐｓ／μｌ）。
【００９１】
３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【００９２】
反応
反応は、図５の方法スキームにしたがう。
【００９３】
６５℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションおよび濁度のリアルタイムモニタリングのために濁度計（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）をプログラムする。
【００９４】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【００９５】
データ解析
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、ａ．ｕ．を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値（この場合には、０．１ａ．ｕ．）に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【００９６】
結果
このアプローチは、特定のループプライマーの、変異体配列から形成されるダンベルとの選択的ハイブリダイゼーションをもたらす、このようなループプライマー設計に基づいた変異体配列の選択的増幅からなる（図５）。本発明者らは、Ｂ１とＢ２の間に含まれるループ領域中に推定される変異ヌクレオチドを提示するダンベルを得るよう、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセットを設計した。Ｂ２内またはＢ２とＢ１ｃとの間のループ領域中に推定変異ヌクレオチドを含有する代替配列でこのような実験を実施した際には、大きな相違は検出されなかった。本発明者らは、プライマーセット中に、その自身の３’末端の配列と相補的であるその５’末端に、８塩基の配列領域を提示する特定のループプライマーを含めた。その結果として、この特別のループプライマーは、反応温度（６５℃）でそのオープン型と平衡にある分子内ヘアピン構造を形成する。
【００９７】
変異体ＪＡＫ２配列がサンプル中に存在する場合には、このような改変されたループプライマーは、熱力学的平衡に従って、その内部構造を破壊して、相補的標的配列とハイブリダイズする（プライマーおよび特異的標的間のＴｍ＝６５℃）。次いで、特異的な変異した標的とハイブリダイズされたループプライマーが、ポリメラーゼによって伸長され、増幅がさらに進行することができる。さらなる特徴として、ＪＡＫ２ Ｇ→Ｔ変異に特異的なループプライマーは、分子内ヘアピン構造（６５℃）よりも低い、野生型標的配列とのＴｍ（５９℃）を示す。したがって、ＪＡＫ２ ＷＴ配列を含有するサンプルでは、Ｔｍ値のこのような相違は、分子内力が分子間のものよりも高いので、非特異的標的と二本鎖を形成するよりもヘアピン構造にフォールディングすることを好む改変されたループプライマーの自己隔離をもたらす。
【００９８】
本発明者らは、選択的ステムループプライマーに基づくＬＡＭＰシステムの区別能力をさらに増大するために、反応混合物にペプチド核酸（ＰＮＡ）を加えた。
【００９９】
ＰＮＡは、リボース−リン酸骨格が、アミド結合によって連結されている（２−アミノエチル）−グリシン単位によって置換されている、非伸長性であり、置換可能でないオリゴヌクレオチドである。各塩基対形成ＤＮＡ／ＰＮＡは、通常の塩基対形成ＤＮＡ／ＤＮＡよりも、二本鎖構造の安定性に寄与する。したがって、ＰＮＡ／ＤＮＡ二本鎖中の単一のミスマッチは、Ｔｍの有意な相違をもたらす。ＰＮＡプローブは、ＪＡＫ２遺伝子のＷＴ配列と十分に相補的であり、変異体特異的ステムループプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を妨げ、野生型配列の非特異的増幅を抑制する。単一のミスマッチの存在下では、ＰＮＡは、ループプライマーハイブリダイゼーションを阻害せず、増幅につながる。したがって、ＰＮＡを使用して、サンプル中に存在するＷＴ配列を選択的に阻止することができる。
【０１００】
ＰＮＡは、野生型Ｇヌクレオチドを提示するＢ２とＢ１ｃとの間に含まれるループ領域と相補的であるよう設計される。ＷＴ相補的配列とのみ安定な二本鎖を形成し（Ｔｍ６５．７℃）、変異体特異的ステムループプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を妨げ、したがって、野生型配列の増幅を抑制する。ＰＮＡは、低い親和性のために（Ｔｍ＝５６℃）変異体ＪＡＫ２配列とハイブリダイズしない。
【０１０１】
７ｅ３ｃｐｓ／ｕｌの野生型および変異体プラスミドサンプルで、ＰＮＡを用いて実施した、および用いずに実施した増幅反応の性能を比較することによって、野生型増幅クランプとしてのＰＮＡの効率を評価した（図９）。増幅曲線分析は、ＰＮＡの存在は、変異体特異的ステムループプライマーによるＷＴプラスミドの非特異的増幅において１時間の遅れに、変異体プラスミドの特異的増幅において５分の遅れにつながることを示した。逆に、ＰＮＡの不在下では、変異体特異的ステムループプライマーによるＷＴプラスミドの非特異的増幅は、特異的変異標的配列と比較して５分の遅れのみで生じた。野生型増幅において観察された遅れは、ＰＮＡおよびＷＴ相補配列間の安定な二本鎖の形成によって説明され、ひいては、変異体特異的ステムループプライマーの非特異的ハイブリダイゼーションおよび伸長を妨げる。
【０１０２】
このＬＡＭＰアッセイ形式の選択性を決定するために、野生型バックグラウンドにおける変異体プラスミドの段階希釈で増幅反応を実施した（図１０）。達成された選択性は、０．０１％未満（３４９６５コピーのＷＴプラスミド中、全３５コピーの変異体プラスミド）であるため、本アプローチは、先行技術において記載されたアッセイよりも高い選択性を示し、直接配列決定、ＲＦＬＰおよびピロシーケンスに関して、対数で約３高く、ＡＲＭＳ、リアルタイム技術およびＤＮＡ融解曲線分析に関して、対数で約２高い。
【０１０３】
要約すると、本ＬＡＭＰアッセイ形式は、この文書において先に記載された戦略および文献に示された検出法に関して有意な改善を表す。ｉ）ＷＴサンプル（３５００００ｃｐｓ ＷＴプラスミド）の非特異的増幅は、約１時間遅延される、ｉｉ）変異体標的の特異的増幅は、野生型中、０．０１％の変異体配列まで検出される（３４９９６５コピーのＷＴプラスミド中、全３５コピーの変異体プラスミド）、ｉｉｉ）アッセイ選択性は、文献に記載されるその他のアプローチの選択性よりも対数で約２高い、ｉｖ）アッセイ直線性は、０．１％変異体配列（３４９６５０コピーのＷＴプラスミド中、全３５０コピーの変異体プラスミド）までであり、したがって、大過剰の野生型ＤＮＡ中の低いパーセンテージの変異体対立遺伝子の検出および定量化が可能となる。
【実施例５】
【０１０４】
臨床サンプルでのＬＡＭＰ「ＰＮＡを伴うステムループプライマー」：ＡＲＭとの比較
合計２９サンプルの、Ｏｓｐｅｄａｌｉ Ｒｉｕｎｉｔｉ ｄｉ Ｂｅｒｇａｍｏで患者から抽出したＤＮＡを、実施例４に記載される、ＪＡＫ２ ＬＡＭＰ「ＰＮＡを伴うステムループプライマー」戦略を使用して分析した。得られた結果を、ＡＲＭ技術を使用して病院で得られたデータと比較した。ＡＲＭＳは、オリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲの際にこれらのプライマーを伸長するためには、ＤＮＡポリメラーゼに対してその３’末端で完全にアニーリングされなければならないという事実を利用する。３’末端で特定のＪＡＫ２点変異に合致するオリゴヌクレオチドプライマーを設計することによって、ＡＲＭＳは、野生型および変異体対立遺伝子を区別できる。
【０１０５】
表５に示されるように、ＬＡＭＰアッセイは、ＡＲＭＳによってそのように以前に診断されたすべてのサンプルを陽性と検出した。ＡＲＭＳによって陰性となった１５サンプルのうち、１１はＬＡＭＰによって陰性と診断され、４は低陽性と診断された。本発明者らは、これらの４種の一致しないサンプルが、ＬＡＭＰアッセイにおいて偽陽性であったことを排除し、また、変異診断は、実施されたＬＡＭＰ法の高い選択性によるものであったことを確認するために、第３のアッセイを使用して一致しないサンプルを試験した。このようなアッセイは、存在する場合には、変異した塩基を、ＰＮＡクランピングによる野生型配列増幅の抑制によって濃縮することを目的とした、野生型標的と相補的であるＰＮＡ分子の存在下におけるＰＣＲによる目的のＪＡＫ２領域の増幅に基づくものであった。変異体対立遺伝子の２０％サンプル濃縮が達成される場合には、変更された配列は、直接配列決定アプローチによって検出されることができる。プライマー（ＧＡ２３１フォワードおよびＧＡ２３２リバース）およびＰＮＡは、先に記載したとおりとした（実施例４）。増幅は、最終容量４５μｌ中、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ、５００ｎＭフォワードおよびリバースプライマー、１．５Ｍ ＰＮＡおよび０．０２５Ｕ Ｔａｑ Ｇｏｌｄを含有する１×反応バッファーで実施した。反応混合物に、５μｌの容量の標的配列（２０ｎｇ／μｌ）を加え、溶液をサーモサイクラー中で、９５℃で１０分間、続いて、９４℃で３０秒、６２℃で４０秒、５８℃で３０秒および７２℃で３０秒の３５サイクルならびに最終伸長のための７２℃で１０分の仕上げからなるサーマルプログラムに従ってインキュベートした。４種の一致しない臨床サンプル、１種の標的なし対照サンプルならびに変異体および野生型プラスミド標的をそれぞれ含有する陽性対照および陰性対照を、２連で試験した。反応後、増幅生成物をアガロースゲル上で分離し、ＥｔＢｒを使用して可視化した。標的なし対照については増幅は検出されなかった。陰性対照については、アガロースゲル上に弱いバンドが見られ、陽性対照については、強いバンドが見られた。その後、４種の臨床サンプルのＰＣＲ産物を、自動配列決定によって分析し、すべてが、ＡＴＧ開始コドン（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）から位置１８４９に、それぞれ、グアニン（野生型）塩基およびチミン（変異した）塩基に対応するダブルピークを示した。これらの結果から、４種の一致しないサンプルは、ＬＡＭＰによって、Ｇ→Ｔ塩基置換を保持すると正しく診断されたことが確認されたが、ＡＲＭＳは、それらを偽陰性と検出した。
【０１０６】
【表５】
【実施例６】
【０１０７】
蛍光ＪＡＫ２−改変ＬＡＭＰ「ステムループプライマー戦略」
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有するように合成された。詳細には、
−「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の変異ヌクレオチドに相当する。５’末端の太字のチミン塩基は、標的配列中に相補的な塩基を有さない。それは、クエンチング効果を有する下流のグアニン塩基からフルオロフォアを分離するために加えられた。
−ＧＡ２３５（ＬＦ） ５’−５’ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡｄｄＣ３’（配列番号７）
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９における野生型ヌクレオチドに相当し、ｄｄＣは、非伸長性ジデオキシシトシンを表す。
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【０１０８】
手順
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−２０℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は４℃で保存されるべきである。
【０１０９】
以下のとおりの反応混合物を調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、０．８μＭ変異体ＪＡＫ２に対する特異的な蛍光自己アニーリング型ループプライマー（ＬＢ）、０．８μＭ野生型ＪＡＫ２に対する自己アニーリング型非伸長性ループプライマー（ＬＦ）、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（１００％の野生型プラスミド、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）、１８種の陽性対照（３サンプルの１００％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．１％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．０５％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した０．０１％変異体プラスミド、ＤＮＡの総量７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）および１種の標的なし対照を含む少なくとも２３種のサンプルのために混合物を調製する。
【０１１０】
表６サンプル混合物組成
【表６】
【０１１１】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【０１１２】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、変異体プラスミドをＷＴプラスミドで段階希釈して、以下の野生型バックグラウンドにおける変異体配列の濃度を得る。１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％（試験管あたりの総量、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）。
【０１１３】
３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、最低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【０１１４】
反応
反応は、図４の方法スキームにしたがう。
【０１１５】
６５℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションのためにリアルタイム機器をプログラムする。分あたりの蛍光読み取り値を得るようリアルタイム機器をプログラムする。
【０１１６】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【０１１７】
データ解析
反応物中の蛍光自己アニーリング型ループプライマーは、適切な波長発光によって励起されると蛍光シグナルを生じる。ＬＡＭＰ反応が進行すると、蛍光自己アニーリング型ループプライマーは、相補的標的配列とハイブリダイズし、その結果として、増幅生成物中に組み込まれる。蛍光自己アニーリング型ループプライマーは、５’末端に近接して少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含有する配列に対して相補的であるように設計される。グアニン塩基は、フルオロフォア（本発明者らの場合には、ＴＡＭＲＡ）によって発光された波長を吸収でき、蛍光シグナルのクエンチングを引き起こす。この場合には、ＬＡＭＰ反応の際の標的配列増幅の検出は、分析中の各サンプルの閾値時間を見出すために、蛍光シグナルの減少を測定することに基づく。閾値時間は、反応蛍光シグナルが、５０％のクエンチングに達する分である。各サンプルについて、閾値時間は、ＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【０１１８】
結果
本アプローチは、特定のループプライマーの、変異体配列から形成されるダンベルとの選択的ハイブリダイゼーションをもたらす、このようなループプライマー設計に基づく変異体配列の選択的増幅からなる（図４）。本発明者らは、Ｂ１とＢ２との間に含まれるループ領域中に推定変異を提示するダンベル構造を得るよう、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル（変異体非感受性）プライマーのセットを設計した。Ｂ２内またはＢ２とＢ１ｃの間のループ領域中に推定変異ヌクレオチドを含有する代替配列でこのような実験を実施した際には大きな相違は検出されなかった。本発明者らは、該プライマーセット中に、その自身の３’末端の配列と相補的であるその５’末端に、８塩基の配列領域を提示する特定のループプライマーを含めた。その結果として、この特別のループプライマーは、反応温度（６５℃）でそのオープン型と平衡にある分子内ヘアピン構造を形成する。
【０１１９】
変異体ＪＡＫ２配列がサンプル中に存在する場合には、このような改変されたループプライマーは、熱力学的平衡に従って、その内部構造を破壊して、相補的標的配列とハイブリダイズする（プライマーおよび特異的標的間のＴｍ＝６５℃）。次いで、特異的な変異した標的とハイブリダイズされたループプライマーがポリメラーゼによって伸長され、増幅がさらに進行することができる。さらなる特徴として、ＪＡＫ２ Ｇ→Ｔ変異に対して特異的なループプライマーは、分子内ヘアピン構造（６５℃）よりも低い野生型標的配列とのＴｍ（５９℃）を示す。したがって、ＪＡＫ２ ＷＴ配列を含有するサンプルでは、Ｔｍ値のこのような相違は、分子内力が分子間のものよりも高いので、非特異的標的と二本鎖を形成するよりもヘアピン構造にフォールディングすることを好む変異体特異的ステムループプライマーの自己隔離をもたらす。
【０１２０】
本発明者らは、臨床サンプル中に大過剰で存在している可能性が高い野生型配列に対するこのループプライマーの競合を制限するために、反応設定に、類似の構造を有し、ＪＡＫ２野生型配列と相補的である核酸配列を含有する、すなわち、開始コドンから位置１８４９にＧ塩基を有する（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）第２のループプライマーを含めた。
【０１２１】
この「競合者」ループプライマーの３’末端は、改変によって非伸長性にされる（３’ジデオキシ）。この競合者の役割は、野生型配列を「サイレントにし」、ひいては、特異的変異体プライマーがその標的を見出すことを可能にすることである。
【０１２２】
「競合者」プライマーが、特異的野生型配列を認識する場合には、より高い親和性に従って、その分子内構造を破壊して、ＷＴ標的とハイブリダイズする（ＷＴ標的およびＷＴ特異的ステムループプライマーによって形成される二本鎖のＴｍ＝６７℃）。ＷＴ標的とハイブリダイズされたステムループプライマーは、非伸長性であり、野生型配列の増幅をもたらさない。反応は、一定温度で実施されるので、ＷＴ特異的ステムループプライマーは、野生型対立遺伝子配列と結合しているままであり、ひいては、ＭＵＴループプライマーの非特異的ハイブリダイゼーションを妨げる。
【０１２３】
変異体特異的ステムループプライマーとは対照的に、「競合者」プライマーは、それ自体によって形成される分子内ヘアピン構造（６５℃）よりも低い、変異体標的配列とのＴｍ（６２℃）を示す。したがって、分子間のものと比較して高い分子内力が、変異体標的配列と二本鎖を形成するよりもヘアピン構造にフォールディングすることを好む改変されたループプライマーの自己隔離を引き起こす。
【０１２４】
本発明者らは、リアルタイム機器で反応を追跡するために、変異体特異的ステムループプライマーの５’末端をＦＡＭ色素で標識した。本発明者らは、クエンチング効果を有する改変されたループプライマーの５’末端に存在するグアニン塩基に対するフルオロフォアの結合を回避するために、オリゴヌクレオチドの末端にチミン塩基を加えた。改変された標識されたプライマーは、溶液中に存在する場合には、適当な波長光で励起されると蛍光シグナルを発する。ＬＡＭＰ反応が始まり、進行する場合には、蛍光ステムループプライマーは、増幅生成物に組み込まれる。相補的核酸配列中に存在するグアニン塩基は、フルオロフォアによって発光される波長を吸収し、リアルタイムで蛍光シグナルの検出可能なクエンチングを引き起こすことができる。したがって、この「クエンチング効果」によって引き起こされる蛍光シグナルの減少を測定することによって、ＬＡＭＰ反応を介して増幅生成物の蓄積をモニタリングできる。
【実施例７】
【０１２５】
対照ＬＡＭＰ反応
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有するように合成された。詳細には、
「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。
−ＧＡ２３１（Ｆ３） ５’ＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧ３’（配列番号３）
−ＧＡ２３２（Ｂ３） ５’ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡ３’（配列番号４）
−ＧＡ２３３（ＦＩＰ） ５’ＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣ３’（配列番号５）
−ＧＡ２３４（ＢＩＰ） ５’ＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣ３’（配列番号６）
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【０１２６】
手順
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−２０℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は４℃で保存されるべきである。
【０１２７】
以下のとおりの反応混合物を調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（１００％の野生型プラスミド、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）、９種の陽性対照（３サンプルの１００％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１０％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１％変異体プラスミド）および１種の標的なし対照を含む少なくとも２３種のサンプルのために混合物を調製する。
【０１２８】
表７サンプル混合物組成
【表７】
【０１２９】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【０１３０】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、変異体プラスミドをＷＴプラスミドで段階希釈して、以下の野生型バックグラウンドにおける変異体配列の濃度を得る。１０％、１％（試験管あたりの総量、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）。
【０１３１】
３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、最低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【０１３２】
反応
反応は、図１１の方法スキームにしたがう。
【０１３３】
６５℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションおよび濁度のリアルタイムモニタリングのために濁度計（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）をプログラムする。
【０１３４】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【０１３５】
データ解析
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、ａ．ｕ．を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値（この場合には、０．１ａ．ｕ．）に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【０１３６】
結果
本アプローチは、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーを使用することによるＪＡＫ２遺伝子配列の変異体−非感受性増幅からなる（図１１）。本発明者らは、反応混合物からＰＮＡおよび変異体特異的ステムループプライマーを除いて、「実施例４」において記載される同じプライマーセットを使用した。「ＬＡＭＰ対照アッセイ」における標的配列増幅の検出は、鋳型に対するプライマーの正しい塩基マッチング、効率的な伸長条件および反応溶液中の阻害剤の不在などの種々の品質パラメータを示す。逆に、「ＬＡＭＰ対照アッセイ」における核酸サンプル増幅の不在または遅延は、反応設定（すなわち、バッファー組成、温度、プライマーの品質、．．）における問題または反応混合物中の阻害剤の存在を強調する。
【０１３７】
このようなアッセイ対照法を評価するために、臨床サンプルパネルを、Ｇ→Ｔ変異の検出に特異的なＬＡＭＰアッセイ（実施例４）および「ＬＡＭＰ対照アッセイ」の両方を使用して２連で分析した。標的核酸配列が、両アッセイにおいて増幅される場合には、有効な結果が得られ、サンプルは、Ｖ６１７Ｆ変異を保有すると考えられる。標的核酸配列が、「ＰＮＡを伴うＪＡＫ２−改変ＬＡＭＰステムループプライマー戦略」によってではなく「ＬＡＭＰ対照アッセイ」によって増幅される場合には、やはり有効な結果が得られ、サンプルは野生型ＪＡＫ２サンプルとして診断される。「ＬＡＭＰ対照アッセイ」において標的配列増幅がない場合には、分析は、有効でないと考えられるべきである。
【０１３８】
「ＬＡＭＰ対照アッセイ」の評価を、それぞれ７ｅ３ｃｐｓ／μｌ野生型および変異体プラスミドを含有するＤＮＡプラスミドサンプルで、および野生型バックグラウンド中１０％および１％変異体プラスミド、全３５０００コピーを含有するサンプルで実施した（図１２）。すべての試験した核酸サンプルが、同程度の増幅効率を示し、したがって、反応阻害剤の不在を示した。
【実施例８】
【０１３９】
「ＰＮＡを伴うＬＡＭＰステムループプライマー」アッセイを使用するサンプル中の変異体ＪＡＫ２配列の量の推定
試薬
ＪＡＫ２プラスミドは、供給業者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、野生型または変異体ＪＡＫ２配列を含有するように合成された。詳細には、
−「ｗｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＧ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
−「ｍｕｔプラスミド」と呼ばれるＪＡＫ２プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド９３５２６にＴ塩基を含む配列番号２の配列９３２４９〜９３７３１に対応する。
プライマー：「プライマー」と呼ばれる、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。
−ＧＡ２３１（Ｆ３） ５’ＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧ３’（配列番号３）
−ＧＡ２３２（Ｂ３） ５’ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡ３’（配列番号４）
−ＧＡ２３３（ＦＩＰ） ５’ＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣ３’（配列番号５）
−ＧＡ２３４（ＢＩＰ）５’ＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣ３’（配列番号６）
−ＧＡ２３６（ＬＢ） ５’ＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣ３’（配列番号８）
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の変異したヌクレオチドに相当する。
ＰＮＡ：Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、「ＰＮＡ」と呼ばれる、ＧＭ４３ ＮＨ２ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＣＯＯＨ（配列番号９）
下線を引いた塩基は、ＪＡＫ２コード配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００４９７２）中のＡＴＧ開始コドンから位置１８４９の野生型ヌクレオチドに対応する。
反応バッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５％ Ｔｗｅｅｎ、「バッファー５×」
ｄＮＴＰミックス２５ｍＭ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、「ｄＮＴＰ」
Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ ８Ｕ／μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水（ＳＡＬＦ Ｓｐａ）、「ｄｄｗ」
【０１４０】
手順
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−２０℃で保存することが良好であるであるが、作業中の希釈液は４℃で保存されるべきである。
【０１４１】
反応混合物は以下のとおりに調製する。０．２μＭ外側プライマー（Ｆ３およびＢ３）、１．６μＭ内側プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）、０．８μＭ変異体ＪＡＫ２に対して特異的な自己アニーリング型ループプライマー（ＬＢ）、０．８ｕＭ ＰＮＡ、１×バッファー溶液、１．４ｍＭ ｄＮＴＰミックス、８Ｕ Ｂｓｔポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の４／５でなくてはならない（すなわち、２０μｌの反応混合物＋５μｌサンプル）。試薬は常に氷上で維持する。３種の陰性対照（１００％野生型プラスミド、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）、９種の陽性標準物質対照（３サンプルの１００％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１０％変異体プラスミド、３サンプルのＷＴプラスミドで希釈した１％変異体プラスミド）および１種の標的なし対照を含む少なくとも２３種のサンプルのために混合物を調製する。
【０１４２】
表８サンプル混合物組成
【表８】
【０１４３】
２０μｌの反応混合物をストリップ中に分配する。ストリップを氷上で維持する。今後、反応混合物を常に氷上で維持する。
【０１４４】
送られてきた溶液（ＷＴプラスミドおよびＭＵＴプラスミド）から標的の段階希釈物（「標的希釈物」）を調製する。送られてきた溶液は、７×１０１０コピー／μｌである。変異体プラスミドを、まずＴｒｉｓ １０ｍＭで７×１０４コピー／μｌに希釈し、次いで、変異体プラスミドをＷＴプラスミドで段階希釈して、以下の野生型バックグラウンドにおける変異体配列の濃度を得る。１０％、１％（試験管あたりの総量、７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）。
【０１４５】
３連で、ストリップに５μｌの標的希釈物を加える。５μｌの標的希釈物を、低濃度のサンプルから出発して、最高濃度のサンプルへと加える。すべての試験管を閉じる。
【０１４６】
反応
反応は、図５の方法スキームにしたがう。
【０１４７】
６５℃、１時間の一定の反応温度を得るよう、一定温度でのインキュベーションおよび濁度のリアルタイムモニタリングのために濁度計（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）をプログラムする。
【０１４８】
プログラムを開始する直前にストリップを機器の中に入れる。プログラムを開始する。
【０１４９】
データ解析
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、ａ．ｕ．を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値（この場合には、０．１ａ．ｕ．）に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのＤＮＡコピー／μｌの対数と相関する。
【０１５０】
結果
患者のサブセットは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ対立遺伝子についてホモ接合性である１。ホモ接合性の機序は、有糸分裂組換えおよび後天性片親性ダイソミーとして知られる変異体対立遺伝子の複製に起因する１。ＪＡＫ２変異体対立遺伝子のヘテロ接合性またはホモ接合性は、予後と相関し、ひいては、サンプル中のＪＡＫ２変異体対立遺伝子コピーの量が、５０％よりも高いか低いかを決定することの重要性をもたらす。
【０１５１】
本アプローチに従って、未知サンプルは、実施例４に先に記載される「ＰＮＡを伴うＬＡＭＰステムループプライマー」アッセイを使用して、非希釈および１：５希釈として分析される。さらに、アッセイ設定は、それぞれ、野生型バックグラウンド中１００％、１０％および１％変異体ＪＡＫ２プラスミドコピーを含有する３種の標準物質サンプルを含む。核酸サンプル中の変異体ＪＡＫ２標的配列の量が５０％よりも高い場合には、前記標的配列のリアルタイム増幅は、非希釈サンプル（図１３、パネルＡ）および１：５希釈されたサンプル（図１３、パネルＢ）の両場合において、１００％標準物質から１０％標準物質の増幅閾値分の間の時間で検出される。非希釈サンプル中の標的アンプリコンは、標準物質１０％においてよりも早く検出される（図１３、パネルＡ）が、対応する１：５希釈サンプルにおける増幅閾値分は、標準物質１０％の分（ｔ）から標準物質１％の分（ｔ）間の時間で測定される（図１３、パネルＢ）ので、５０％未満の変異体ＪＡＫ２配列量を含有する核酸サンプルについては、異なる増幅性能が検出される。
【０１５２】
本アプローチは、対照サンプル（７ｅ３ｃｐｓ／μｌ野生型プラスミド、６．３ｅ３ｃｐｓ／μｌ野生型プラスミド中の７ｅ２ｃｐｓ／μｌ変異体プラスミド、６．９３ｅ３ｃｐｓ／μｌ野生型プラスミド中の７ｅ１ｃｐｓ／μｌ変異体プラスミド）で、５０％より高い割合の野生型バックグラウンドにおける変異体ＪＡＫ２プラスミドの混合物（それぞれ６０％、７０％、８０％、９０％）からなる４種のサンプルで、および５０％以下の割合の野生型バックグラウンドにおける変異体ＪＡＫ２プラスミドの混合物（それぞれ４０％、３０％、２０％）からなる４種のサンプルで、「ＰＮＡを伴うＬＡＭＰステムループプライマー」反応を実施することによって試験された。対照を除いて、すべてのサンプルを、非希釈（各反応に対して５μｌの７ｅ３ｃｐｓ／μｌ）およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭで１：５希釈したものとして分析した。
【０１５３】
５０％超の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーを含有し、１：５希釈した試験サンプルについて、標的配列増幅を、１００％標準物質における対応する配列の増幅の後および１０％標準物質の前に検出した（図１４）。
【０１５４】
５０％量の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーを提示し、１：５希釈した試験サンプルについて、標的配列増幅が１０％標準物質サンプルに関する同一閾値分で示された（図１５）。
【０１５５】
５０％未満の変異体ＪＡＫ２対立遺伝子コピーを含有し、１：５希釈された試験サンプルについて、標的配列増幅を、標準物質１０％および１％の増幅時間の間の中間閾値分で検出した（図１５）。
【０１５６】
したがって、本アプローチを使用して、核酸サンプル中のＪＡＫ２変異体対立遺伝子コピーの量が、５０％よりも高いか低いかを推定することが可能である。このような情報は、サンプルにおける「ヘテロ接合性またはホモ接合性」についての指標を提供し、これが、次には、疾患予後と相関するので、臨床上極めて関連がある。
【０１５７】
参考文献
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型核酸分子のバックグラウンドにおける標的核酸分子中の点変異の存在を検出する方法であって、
１）核酸サンプルを提供する工程、
２）適当な反応条件下で、前記核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドの混合物およびハイブリダイゼーション条件下で鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む溶液と接触させる工程であって、前記のオリゴヌクレオチドの混合物が、検出されるべき点変異の核酸位置を含む標的核酸分子の領域のループ媒介性等温増幅に適したプライマーからなり、前記プライマーが、
ｉ．第１の外側プライマーＦ３および第２の外側プライマーＢ３、
ｉｉ．第１の内側プライマーＦＩＰおよび第２の内側プライマーＢＩＰ、
ｉｉｉ．ステムループ変異体伸長性プライマー、
ｉｖ．野生型核酸分子を選択的に認識し、ハイブリダイズできる非伸長性部分
を含み、
ここに、ＦＩＰが、３’核酸配列Ｆ２および５’核酸配列Ｆ１ｃからなり、ＢＩＰが、３’核酸配列Ｂ２および５’核酸配列Ｂ１ｃからなり、
Ｆ２がＦ２ｃと呼ばれる標的核酸分子の領域を認識およびハイブリダイズでき、Ｂ２が、Ｂ２ｃと呼ばれる標的核酸分子の領域を認識およびハイブリダイズでき、
Ｆ２ｃおよびＢ２ｃが、標的核酸分子の反対側の鎖に位置する異なる領域であり、
Ｂ２ｃが点変異の下流にあるか、またはＦ２ｃが点変異の上流にあるかのいずれかであり、
Ｂ２ｃが点変異の下流にある場合には、前記点変異は、Ｆ２ｃ配列中に位置するか、またはＦ２ｃ配列の下流であってＦ１ｃ配列の上流に位置し、
Ｆ２ｃが点変異の上流にある場合には、前記点変異は、Ｂ２ｃ配列中に位置するか、またはＢ２ｃ配列の上流であってＢ１ｃ配列の下流に位置し、
前記ステムループ変異体伸長性プライマーが、
−中央ループ配列が、点変異が存在する場合にのみ、標的核酸分子を認識し、ハイブリダイズできるように、点変異を含む標的核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズすることができる中央ループ配列と、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するように互いに相補的である、５’末端配列および３’末端配列と
を含み、
点変異を含む標的核酸分子の領域に対する中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、３’配列に対する５’配列の分子内ハイブリダイゼーション親和性より高く、その結果、点変異が存在する場合に、中央ループ配列が、点変異を含む標的核酸分子の領域とアニールし、増幅する、工程、
３）得られた混合物を一定温度でインキュベートする工程、
４）点変異を含む標的核酸分子の領域の増幅を示すシグナルを検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
点変異が、Ｆ２ｃ配列とＦ１ｃ配列との間またはＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列との間の領域中に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
点変異が、Ｆ２ｃ配列中またはＢ２ｃ配列中に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステムループ変異体伸長性プライマーの５’末端配列および３’末端配列の各々が、少なくとも３ヌクレオチドの長さである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
非伸長性部分が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＰＮＡが、少なくとも１０塩基の長さである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＰＮＡ塩基配列は、点変異の不在下における標的核酸分子とのＰＮＡのハイブリダイゼーションに起因する二本鎖構造の融解温度（Ｔｍ＝Ｘ）がインキュベーション温度よりも高く、点変異の存在下における標的核酸分子とのＰＮＡのハイブリダイゼーションに起因する二本鎖構造の融解温度（Ｔｍ＝Ｙ）がインキュベーション温度よりも低いようなものであり、さらに、Ｘが、Ｙよりも少なくとも５℃高い、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
非伸長性部分が、
−検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズできる中央ループ配列、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するよう互いに相補的である５’末端配列および３’末端配列
を含むステムループ野生型非伸長性プライマーであり、
検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域に対する、中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、３’末端配列に対する５’末端配列の分子内ハイブリダイゼーション親和性より高く、その結果、中央ループ配列が、検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域とアニールし、それによって、増幅を阻止する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡポリメラーゼが、Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Φ２９ファージ、ＭＳ−２ファージ、Ｚ−Ｔａｑ、ＫＯＤ、クレノウ断片およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
検出されるべき点変異が、配列番号１の位置２３４３のｇ→ｔ変異である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第１の外側プライマーＦ３が、配列番号３からなり、第２の外側プライマーＢ３が、配列番号４からなり、第１の内側プライマーＦＩＰが、配列番号５からなり、第２の内側プライマーＢＩＰが、配列番号６からなり、ステムループ変異体伸長性プライマーが、配列番号８からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下の塩基配列
ＮＨ２−ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡ−ＣＯＯＨ（配列番号９）
を有するＰＮＡであり、ここで、Ｇがグアニンであり、Ａがアデニンであり、Ｔがチミンであり、Ｃがシトシンである、非伸長性部分をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルから得られた点変異を含む標的核酸分子の領域の増幅を示すシグナルを、少なくとも１種の標準物質から得られた前記シグナルと定量的に比較することによって、点変異が、ホモ接合型またはヘテロ接合型であるかを評価する工程をさらに含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種の標準物質が、野生型核酸分子のバックグラウンドにおける所定のパーセンテージ（％）の変異体標的核酸分子からなり、前記の所定のパーセンテージ（％）が、好ましくは、約１０％である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ループ媒介性等温増幅によって、野生型核酸分子のバックグラウンドにおける標的核酸分子中の点変異の存在を検出するためのプライマーのセットであって、
ｉ．第１の外側プライマーＦ３および第２の外側プライマーＢ３、
ｉｉ．第１の内側プライマーＦＩＰおよび第２の内側プライマーＢＩＰ、
ｉｉｉ．ステムループ変異体伸長性プライマー
を含み、
ここに、ＦＩＰが、３’核酸配列Ｆ２および５’核酸配列Ｆ１ｃからなり、ＢＩＰが、３’核酸配列Ｂ２および５’核酸配列Ｂ１ｃからなり、
Ｆ２がＦ２ｃと呼ばれる標的核酸分子の領域と相補的であり、Ｂ２が、Ｂ２ｃと呼ばれる標的核酸分子の領域と相補的であり、
Ｆ２ｃおよびＢ２ｃが、標的核酸分子の反対側の鎖に位置する非重複領域であり、
Ｂ２ｃが点変異の下流にあるか、またはＦ２ｃが点変異の上流にあるかのいずれかであり、
Ｂ２ｃが点変異の下流にある場合には、前記点変異は、Ｆ２ｃ配列中もしくはＦ２ｃ配列とＦ１ｃ配列の間に位置し、または
Ｆ２ｃが点変異の上流にある場合には、前記点変異は、Ｂ２ｃ配列中もしくはＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列の間に位置し、
前記ステムループ変異体伸長性プライマーが、
−点変異を含む標的核酸分子の領域と相補的である中央ループ配列、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するよう互いに相補的である５’末端配列および３’末端配列
を含み、
点変異を含む標的核酸分子の領域に対する中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、５’配列の３’配列に対する分子内ハイブリダイゼーション親和性よりも高い、プライマーのセット。
【請求項１６】
ステムループ変異体伸長性プライマーの５’末端配列および３’末端配列の各々が、少なくとも３ヌクレオチドの長さである、請求項１５に記載のプライマーのセット。
【請求項１７】
野生型核酸分子とハイブリダイズできる非伸長性部分をさらに含む、請求項１５または１６に記載のプライマーのセット。
【請求項１８】
非伸長性部分が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である、請求項１７に記載のプライマーのセット。
【請求項１９】
ＰＮＡが、少なくとも１０塩基の長さである、請求項１８に記載のプライマーのセット。
【請求項２０】
非伸長性部分が、
−検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域と相補的である中央ループ配列、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するよう互いに相補的である５’末端配列および３’末端配列
を含むステムループ非伸長性プライマーであり、
検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域に対する中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、３’末端配列に対する５’末端配列の分子内ハイブリダイゼーション親和性よりも高い、請求項１５または１６に記載のプライマーのセット。
【請求項２１】
第１の外側プライマーＦ３が、配列番号３からなり、第２の外側プライマーＢ３が、配列番号４からなり、第１の内側プライマーＦＩＰが、配列番号５からなり、第２の内側プライマーＢＩＰが、配列番号６からなり、ステムループ変異体伸長性プライマーが、配列番号８からなる、請求項１５から２０のいずれかに記載のプライマーのセット。
【請求項２２】
以下の塩基配列
ＮＨ２−ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡ−ＣＯＯＨ（配列番号９）を有するＰＮＡであり、ここで、Ｇがグアニンであり、Ａがアデニンであり、Ｔがチミンであり、Ｃがシトシンである非伸長性部分をさらに含む、請求項２１に記載のプライマーのセット。
【請求項２３】
ループ媒介性等温増幅によって、野生型核酸分子のバックグラウンドにおける標的核酸分子中の点変異の存在を検出するためのキットであって、請求項１５から２２のいずれかに記載のプライマーのセットと、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとを含む、キット。
【請求項２４】
ＤＮＡポリメラーゼが、Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Φ２９ファージ、ＭＳ−２ファージ、Ｚ−Ｔａｑ、ＫＯＤ、クレノウ断片およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
１種または複数の標準物質をさらに含む、請求項２３または２４に記載のキット。
【請求項２６】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号８からなる群から選択される単離オリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
配列番号２の位置９３５２６を含むＪＡＫ２ゲノムＤＮＡ（配列番号２）の領域、または配列番号１の位置２３４３を含むＪＡＫ２ｃＤＮＡ（配列番号１）の領域とハイブリダイズできる塩基配列を含む、６〜２４塩基の長さのペプチド核酸（ＰＮＡ）。
【請求項２８】
以下の塩基配列
ＮＨ２−ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡ−ＣＯＯＨ（配列番号９）を含み、ここで、Ｇがグアニンであり、Ａがアデニンであり、Ｔがチミンであり、Ｃがシトシンである、請求項２７に記載のペプチド核酸（ＰＮＡ）。
【請求項１】
野生型核酸分子のバックグラウンドにおける標的核酸分子中の点変異の存在を検出する方法であって、
１）核酸サンプルを提供する工程、
２）適当な反応条件下で、前記核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドの混合物およびハイブリダイゼーション条件下で鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む溶液と接触させる工程であって、前記のオリゴヌクレオチドの混合物が、検出されるべき点変異の核酸位置を含む標的核酸分子の領域のループ媒介性等温増幅に適したプライマーからなり、前記プライマーが、
ｉ．第１の外側プライマーＦ３および第２の外側プライマーＢ３、
ｉｉ．第１の内側プライマーＦＩＰおよび第２の内側プライマーＢＩＰ、
ｉｉｉ．ステムループ変異体伸長性プライマー、
ｉｖ．野生型核酸分子を選択的に認識し、ハイブリダイズできる非伸長性部分
を含み、
ここに、ＦＩＰが、３’核酸配列Ｆ２および５’核酸配列Ｆ１ｃからなり、ＢＩＰが、３’核酸配列Ｂ２および５’核酸配列Ｂ１ｃからなり、
Ｆ２がＦ２ｃと呼ばれる標的核酸分子の領域を認識およびハイブリダイズでき、Ｂ２が、Ｂ２ｃと呼ばれる標的核酸分子の領域を認識およびハイブリダイズでき、
Ｆ２ｃおよびＢ２ｃが、標的核酸分子の反対側の鎖に位置する異なる領域であり、
Ｂ２ｃが点変異の下流にあるか、またはＦ２ｃが点変異の上流にあるかのいずれかであり、
Ｂ２ｃが点変異の下流にある場合には、前記点変異は、Ｆ２ｃ配列中に位置するか、またはＦ２ｃ配列の下流であってＦ１ｃ配列の上流に位置し、
Ｆ２ｃが点変異の上流にある場合には、前記点変異は、Ｂ２ｃ配列中に位置するか、またはＢ２ｃ配列の上流であってＢ１ｃ配列の下流に位置し、
前記ステムループ変異体伸長性プライマーが、
−中央ループ配列が、点変異が存在する場合にのみ、標的核酸分子を認識し、ハイブリダイズできるように、点変異を含む標的核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズすることができる中央ループ配列と、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するように互いに相補的である、５’末端配列および３’末端配列と
を含み、
点変異を含む標的核酸分子の領域に対する中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、３’配列に対する５’配列の分子内ハイブリダイゼーション親和性より高く、その結果、点変異が存在する場合に、中央ループ配列が、点変異を含む標的核酸分子の領域とアニールし、増幅する、工程、
３）得られた混合物を一定温度でインキュベートする工程、
４）点変異を含む標的核酸分子の領域の増幅を示すシグナルを検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
点変異が、Ｆ２ｃ配列とＦ１ｃ配列との間またはＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列との間の領域中に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
点変異が、Ｆ２ｃ配列中またはＢ２ｃ配列中に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステムループ変異体伸長性プライマーの５’末端配列および３’末端配列の各々が、少なくとも３ヌクレオチドの長さである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
非伸長性部分が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＰＮＡが、少なくとも１０塩基の長さである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＰＮＡ塩基配列は、点変異の不在下における標的核酸分子とのＰＮＡのハイブリダイゼーションに起因する二本鎖構造の融解温度（Ｔｍ＝Ｘ）がインキュベーション温度よりも高く、点変異の存在下における標的核酸分子とのＰＮＡのハイブリダイゼーションに起因する二本鎖構造の融解温度（Ｔｍ＝Ｙ）がインキュベーション温度よりも低いようなものであり、さらに、Ｘが、Ｙよりも少なくとも５℃高い、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
非伸長性部分が、
−検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズできる中央ループ配列、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するよう互いに相補的である５’末端配列および３’末端配列
を含むステムループ野生型非伸長性プライマーであり、
検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域に対する、中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、３’末端配列に対する５’末端配列の分子内ハイブリダイゼーション親和性より高く、その結果、中央ループ配列が、検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域とアニールし、それによって、増幅を阻止する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡポリメラーゼが、Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Φ２９ファージ、ＭＳ−２ファージ、Ｚ−Ｔａｑ、ＫＯＤ、クレノウ断片およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
検出されるべき点変異が、配列番号１の位置２３４３のｇ→ｔ変異である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第１の外側プライマーＦ３が、配列番号３からなり、第２の外側プライマーＢ３が、配列番号４からなり、第１の内側プライマーＦＩＰが、配列番号５からなり、第２の内側プライマーＢＩＰが、配列番号６からなり、ステムループ変異体伸長性プライマーが、配列番号８からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下の塩基配列
ＮＨ２−ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡ−ＣＯＯＨ（配列番号９）
を有するＰＮＡであり、ここで、Ｇがグアニンであり、Ａがアデニンであり、Ｔがチミンであり、Ｃがシトシンである、非伸長性部分をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルから得られた点変異を含む標的核酸分子の領域の増幅を示すシグナルを、少なくとも１種の標準物質から得られた前記シグナルと定量的に比較することによって、点変異が、ホモ接合型またはヘテロ接合型であるかを評価する工程をさらに含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種の標準物質が、野生型核酸分子のバックグラウンドにおける所定のパーセンテージ（％）の変異体標的核酸分子からなり、前記の所定のパーセンテージ（％）が、好ましくは、約１０％である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ループ媒介性等温増幅によって、野生型核酸分子のバックグラウンドにおける標的核酸分子中の点変異の存在を検出するためのプライマーのセットであって、
ｉ．第１の外側プライマーＦ３および第２の外側プライマーＢ３、
ｉｉ．第１の内側プライマーＦＩＰおよび第２の内側プライマーＢＩＰ、
ｉｉｉ．ステムループ変異体伸長性プライマー
を含み、
ここに、ＦＩＰが、３’核酸配列Ｆ２および５’核酸配列Ｆ１ｃからなり、ＢＩＰが、３’核酸配列Ｂ２および５’核酸配列Ｂ１ｃからなり、
Ｆ２がＦ２ｃと呼ばれる標的核酸分子の領域と相補的であり、Ｂ２が、Ｂ２ｃと呼ばれる標的核酸分子の領域と相補的であり、
Ｆ２ｃおよびＢ２ｃが、標的核酸分子の反対側の鎖に位置する非重複領域であり、
Ｂ２ｃが点変異の下流にあるか、またはＦ２ｃが点変異の上流にあるかのいずれかであり、
Ｂ２ｃが点変異の下流にある場合には、前記点変異は、Ｆ２ｃ配列中もしくはＦ２ｃ配列とＦ１ｃ配列の間に位置し、または
Ｆ２ｃが点変異の上流にある場合には、前記点変異は、Ｂ２ｃ配列中もしくはＢ２ｃ配列とＢ１ｃ配列の間に位置し、
前記ステムループ変異体伸長性プライマーが、
−点変異を含む標的核酸分子の領域と相補的である中央ループ配列、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するよう互いに相補的である５’末端配列および３’末端配列
を含み、
点変異を含む標的核酸分子の領域に対する中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、５’配列の３’配列に対する分子内ハイブリダイゼーション親和性よりも高い、プライマーのセット。
【請求項１６】
ステムループ変異体伸長性プライマーの５’末端配列および３’末端配列の各々が、少なくとも３ヌクレオチドの長さである、請求項１５に記載のプライマーのセット。
【請求項１７】
野生型核酸分子とハイブリダイズできる非伸長性部分をさらに含む、請求項１５または１６に記載のプライマーのセット。
【請求項１８】
非伸長性部分が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である、請求項１７に記載のプライマーのセット。
【請求項１９】
ＰＮＡが、少なくとも１０塩基の長さである、請求項１８に記載のプライマーのセット。
【請求項２０】
非伸長性部分が、
−検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域と相補的である中央ループ配列、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するよう互いに相補的である５’末端配列および３’末端配列
を含むステムループ非伸長性プライマーであり、
検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域に対する中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、３’末端配列に対する５’末端配列の分子内ハイブリダイゼーション親和性よりも高い、請求項１５または１６に記載のプライマーのセット。
【請求項２１】
第１の外側プライマーＦ３が、配列番号３からなり、第２の外側プライマーＢ３が、配列番号４からなり、第１の内側プライマーＦＩＰが、配列番号５からなり、第２の内側プライマーＢＩＰが、配列番号６からなり、ステムループ変異体伸長性プライマーが、配列番号８からなる、請求項１５から２０のいずれかに記載のプライマーのセット。
【請求項２２】
以下の塩基配列
ＮＨ２−ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡ−ＣＯＯＨ（配列番号９）を有するＰＮＡであり、ここで、Ｇがグアニンであり、Ａがアデニンであり、Ｔがチミンであり、Ｃがシトシンである非伸長性部分をさらに含む、請求項２１に記載のプライマーのセット。
【請求項２３】
ループ媒介性等温増幅によって、野生型核酸分子のバックグラウンドにおける標的核酸分子中の点変異の存在を検出するためのキットであって、請求項１５から２２のいずれかに記載のプライマーのセットと、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとを含む、キット。
【請求項２４】
ＤＮＡポリメラーゼが、Ｂｓｔ大断片ポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Φ２９ファージ、ＭＳ−２ファージ、Ｚ−Ｔａｑ、ＫＯＤ、クレノウ断片およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
１種または複数の標準物質をさらに含む、請求項２３または２４に記載のキット。
【請求項２６】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号８からなる群から選択される単離オリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
配列番号２の位置９３５２６を含むＪＡＫ２ゲノムＤＮＡ（配列番号２）の領域、または配列番号１の位置２３４３を含むＪＡＫ２ｃＤＮＡ（配列番号１）の領域とハイブリダイズできる塩基配列を含む、６〜２４塩基の長さのペプチド核酸（ＰＮＡ）。
【請求項２８】
以下の塩基配列
ＮＨ２−ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡ−ＣＯＯＨ（配列番号９）を含み、ここで、Ｇがグアニンであり、Ａがアデニンであり、Ｔがチミンであり、Ｃがシトシンである、請求項２７に記載のペプチド核酸（ＰＮＡ）。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１２−５３１９１９（Ｐ２０１２−５３１９１９Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１８８５５（Ｐ２０１２−５１８８５５）
【出願日】平成２２年６月８日（２０１０．６．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５８０２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００３６９０
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（５１２００６４０２）バイオトリン・インターナショナル・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＴＲＩＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＡＮＬ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月８日（２０１０．６．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５８０２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００３６９０
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（５１２００６４０２）バイオトリン・インターナショナル・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＴＲＩＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＡＮＬ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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