無血管組織の修復を促進するための方法及び組成物
椎間板を含む損傷無血管領域の修復を必要とする患者における椎間板を含む損傷無血管領域を修復するための組成物及び方法を提供する。本発明は、１つ若しくは複数の不良な栄養領域又は不利な環境、すなわち無血管領域を有する損傷組織の修復に使用される組成物及び方法を提供する。不良な栄養領域又は不利な環境は、一般的に、組織が限られた血管血液供給を受ける又は血管血液供給を欠く部位、すなわち、本明細書で無血管移行領域又は無血管領域と呼ばれる部位にある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、損傷した無血管部位、例えば、椎間板の修復を促進するための組成物及び方法を提供し、より具体的には、本発明は、それを必要とする患者における無血管部位内又は無血管部位に隣接する最適化位置に環境に適応させた自己幹細胞を適用することを提供する。
【背景技術】
【０００２】
無血管移行領域及び他の修復困難部位は、身体の多くの重要な組織に存在する。これらの領域は、組織、例えば、椎間板への血液供給が限られている若しくは欠如している部位又は組織の損傷が修復処置に抵抗する過酷な環境をもたらした部位に存在する。例えば、無血管組織が損傷を受けた場合、当組織への血液供給の欠如又は制限は、修復過程に対する重大な障害となる。これは、通常の負荷の問題が修復及び治癒を促進することを困難にする、椎間板、膝及び股関節部に特に当てはまる。
【０００３】
１つの特に重要な体内の無血管移行領域は、直接的な血液供給が存在しない椎間板内にある。椎間板への栄養素は、軟骨下骨中の小毛細血管床を経て一般的に到達し、時間の経過とともに椎間板全体に広がる。さらに、椎間板は、歩行、走行などの軸方向負荷活動中に周囲組織から栄養素を吸引、言い換えれば、吸収することにより栄養素を受け入れる。
【０００４】
椎間板は、脊柱の２つの椎骨を互いに分離させる衝撃吸収パッドである。これらの円板は、脊柱に３つの機能を本質的に与え、第１に直立位であるときに身体の軸方向負荷を支える衝撃吸収材としての役割を果たし、第２に２つの隣接する椎骨を一緒に保持する靭帯としての役割を果たし、第３に脊柱の曲げ及び回転の促進のための回転軸としての役割を果たす。
【０００５】
ヒトは、脊柱に２３個の円板、すなわち、頸部に６個、胸部に１２個、腰部に５個を有する。各円板は、髄核、線維輪及び椎骨終板からなっている。髄核は、水に富み、ゼラチン様であり、円板の中心領域を含む。線維輪は、本質的に線維性であり、コラーゲンからなり、（髄核と比較して）水をほとんど含まず、髄核を取り囲んでいる。加圧髄核を含むために一連の薄層が線維輪に配置されている。さらに、椎骨終板は、各円板を隣接する椎体に付着させる役割を果たす。
【０００６】
上述のように、円板の環境上の過酷な側面（無血管性、高圧、有害なｐＨ等）及び修復中に円盤に置かれる困難な機械的要件（二足歩行運動に伴う応力及び歪み）のため、組織の修復及び再生は、損傷円板においては困難であることが証明された。幹細胞技術を利用する従来の修復方法論は、一般的にキャリア物質の存在下で髄核内への幹細胞（一般的に先在性非自己細胞系から得られる）の直接的な移植に焦点を合わせたものであった。これらの方法論は動物モデルにおけるいくつかの希望のもてる結果をもたらしたが、これらの修復は、変性椎間板疾患（ＤＤＤ）又は他の同様な状態を有するヒトにおいてまだ実証されていない。これらの動物モデルにおける有望な結果は、動物に関する研究に用いられた椎間板変性モデルの急性性質に起因する可能性がある。例えば、これらの動物モデルにおける椎間板は、ヒトにおける長期にわたる変性椎間板より良好な血液供給状態で新たに変性させたものである。さらに、これらのモデルに用いられた動物は、二足性であるヒトに対して一般的に四足性であり、したがって、椎間板に対する負荷が異なる。最後に、これらのＤＤＤモデルに用いられた動物は、若く、健康である傾向があり、ＤＤＤについて一般的に臨床で認められるコホートよりはるかに若い患者と年齢が同等である。したがって一般的に、従来の方法論は、幹細胞療法を必要とするヒト患者に認められるものと潜在的に非常に異なる損傷椎間板環境の修復及び再生に基づいている。
【０００７】
椎間板における組織の修復及び再生に関連する問題は、股関節部、膝及び肩（回旋腱板を含む）においても一般的に見られる。これらの組織のそれぞれにおいて、過酷な環境上の側面が損傷又は老化によりしばしば確立され、この場合、無血管移行領域と困難な機械的必要条件とが相まって、低い幹細胞修復の成功のシナリオを構築する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述の１つ又は複数の問題を克服することを対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、１つ若しくは複数の不良な栄養領域又は不利な環境、すなわち無血管領域を有する損傷組織の修復に使用される組成物及び方法を提供する。不良な栄養領域又は不利な環境は、一般的に、組織が限られた血管血液供給を受ける又は血管血液供給を欠く部位、すなわち、本明細書で無血管移行領域又は無血管領域と呼ばれる部位にある。この点における領域又は環境としては、椎間板、股関節部（関節唇）、肩（回旋腱板を含む）及び他の同様な部位が挙げられる。本明細書における実施形態は、無血管領域の修復を必要とする患者からの幹細胞、例えば、間葉幹細胞の入手を含む。次に、入手した細胞を、患者の無血管領域の修復に使用される細胞の能力の最適化を可能にする環境にｉｎ ｖｉｔｒｏで条件づける。十分な数の最適化され、条件づけられた細胞が存在する場合、修復を必要とする無血管領域の標的部位に細胞を入れる。いくつかの実施形態において、該部位への血液の流れ／栄養素の流れを増大させるために血小板若しくは血小板溶解物（一般的に自己由来）及び／又は補給物処理を条件づけ細胞と併用して行う。血小板及び／又は補給物処理の時期は、一般的に条件づけ細胞の挿入の直前、挿入時又は挿入直後であるが、他の時期も考えられる。部位の修復を保証するために条件づけ細胞の挿入又は血小板／血小板溶解物／補給物処理（単数又は複数）のみの繰返しを含む処置を繰り返すことができる。
【００１０】
一実施形態において、それを必要とする患者における損傷椎間板の修復に使用される組成物及び方法を提供する。一態様において、損傷椎間板の修復及び／又は再生に使用される細胞の能力を最適化する条件下での幹細胞の入手及び培養の方法を提供する。他の態様において、損傷椎間板組織の増殖及び再生を最適化するための損傷椎間板の標的部位へのこれらの条件づけ幹細胞の挿入の方法を提供する。他の態様において、損傷椎間板組織への、かつそれを通しての血流を増大させるための硬膜外補給物処理（ｅｐｉｄｕｒａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）と併用した患者体内の標的部位への条件づけ幹細胞の挿入の方法を提供する。さらに、本発明は、損傷椎間板を修復及び／又は再生することができる細胞の選択に専用の幹細胞の培養のための改良組成物を提供する。個別に、かつ／又は併用で、本発明の方法及び組成物は、（他の従来の技術と比べて）椎間板の修復及び再生の分野の驚くべき、かつ予期しない発展をもたらす。
【００１１】
他の実施形態において、幹細胞（例えば、間葉幹細胞）は、椎間板の修復を必要とする患者から採取し、不良な栄養環境、他の点で不利な環境（例えば、ｐＨが健常な細胞の増殖を促進することに通常調和する範囲内にない環境）、低酸素環境及び／又は損傷椎間板内の高い二酸化炭素レベルを示す環境に耐えることができる細胞を選択し、増殖することに基づく条件下で培養する。次いで、これらの条件づけ細胞を椎間板輪後部（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｄｉｓｃ ａｎｎｕｌｕｓ）に移植する（髄核における移植を一般的に必要とする従来の方法論と比較）。場合によって、次いで椎間板輪後部への血流を促進するために硬膜外補給（増殖因子、サイトカイン、インテグリン、カドヘリン等）により患者を治療する。実施形態の各態様は、椎間板環境が移植細胞への栄養素及び酸素の増加をもたらすことを促進することに加えて、損傷椎間板環境において生存及び増殖することができる幹細胞も増加させ、選択する。さらに、損傷椎間板内の幹細胞の生存及び増殖を促進するために、自己血小板又は血小板溶解物組成物を選択される幹細胞と別個に又は併用投与することができる。別個又は併用で、本明細書におけるアプローチは、自己幹細胞に基づく椎間板修復の修復過程及び結果を向上させる。
【００１２】
いくつかの事例において、椎間板の修復を必要とする患者から採取した幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで１〜１０％酸素中で、より一般的には３〜７％酸素中で１〜２８日間の期間中培養する。これは、患者の体内移植の前に細胞を培養する時間の約１／３からすべてに相当しうる。生存細胞、すなわち、低酸素条件下で増殖することができる細胞を生存能力について選択し、損傷椎間板内への移植のための十分な細胞を入手するためにこれらの低酸素条件下で増殖させる。選択される細胞は、損傷椎間板の酸素欠乏環境中で生存し、増殖し、最終的に修復する高い能力を有する。
【００１３】
他の事例において、椎間板の修復を必要とする患者から採取した幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで高濃度二酸化炭素中で、より一般的には２〜１０％二酸化炭素中で１〜２８日間の期間にわたり培養する。これは、患者の体内移植の前に細胞を培養する時間の約１／３からすべてに相当しうる。生存細胞、すなわち、高二酸化炭素条件下で増殖することができる細胞を生存能力について選択し、損傷椎間板内への移植のための十分な細胞を入手するためにこれらの条件下で増殖させる。選択される細胞は、損傷椎間板のより高い二酸化炭素条件の環境中で生存し、増殖し、最終的に修復する高い能力を有する。この同じアプローチは、（傷害又は老化による）損傷股関節部及び／又は肩の無血管部位を修復／再生するために用いる幹細胞を選択するのに用いることができる。
【００１４】
他の事例において、椎間板の修復を必要とする患者から採取した幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで低酸素及び高二酸化炭素条件下で培養する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件は、細胞の総培養時間の１／３からすべての期間にわたって維持することができる。選択される細胞は、損傷椎間板で一般的に認められるより低酸素及びより高い二酸化炭素条件下で生存し、増殖し、修復する高い能力を有する。この同じアプローチは、（傷害又は老化による）損傷股関節部及び／又は肩の無血管部位を修復／再生するために用いる幹細胞を選択するのに用いることができる。
【００１５】
他の事例において、椎間板の修復を必要とする患者から採取した幹細胞を栄養不良条件下で培養して、生存能力について選択し、これらの不良な栄養環境中で増殖させる。培養条件は、糖、アミノ酸、脂質、鉱物、タンパク質又は幹細胞の増殖を促進することを目的とする他の物質を添加したダルベッコ変法必須培地（ＤＭＥＭ）から調製した基礎細胞培養培地（又は他の同様な基礎培地）の使用を含む。増殖培地は、ウシ胎児血清、ヒト全血清、多血小板血漿、血小板溶解物等を含んでいても含んでいなくてもよい。しかし、これらの調製物は、低酸素、ｐＨの変化又はある制限された栄養利用性などのヒト変性椎間板の局所環境を模倣するように特別に設計されている。この同じアプローチは、（傷害又は老化による）損傷股関節部（例えば、関節唇）及び／又は肩の無血管部位を修復／再生するために用いる幹細胞を選択するのに用いることができる。
【００１６】
ｐＨ、使用済み培地の使用、標的部位が損傷椎間板に存在する場合に髄核細胞との共培養（それにより、培養細胞の送達の最終的な標的部位に近接して存在する環境因子を供給する）及び類似のものを含む、他の選択条件を用いて採取幹細胞を増殖することができる。いくつかの事例において本明細書で述べた２つ又はそれ以上の選択条件を用いて無血管部位の修復に用いる幹細胞を同定し、増殖させることができることも留意されたい。したがって例えば、不十分な栄養培地及び低酸素条件は、第１の患者に用いる幹細胞を選択するのに用いることができるが、ｐＨ及び二酸化炭素条件は、第２の患者における選択に用いることができる。これは、所定の患者における局所微小環境の実際の測定に基づいていてよい。
【００１７】
さらなる事例において、損傷部位を有する同じ患者から血小板を入手し（採取し）、トロンビン及び塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）で処理する。処理済み血小板は、損傷部位内への移植のために培養され、選択される幹細胞と併用する。血小板の処理は、損傷部位内への移植の前に１日から７日に、特に５日から７日に延長してもよいことに留意されたい。さらに、血小板は、選択される幹細胞の移植の直前、移植時又は移植後に移植することができる。そのような前条件づけ血小板は、損傷部位内の幹細胞の生存及び増殖の促進に有用な無血管領域環境中に標的増殖因子を放出することができる。或いは、又は併用で、増殖因子、サイトカイン、インテグリン等を選択される幹細胞とともに損傷部位内に直接投与することができる。一実施形態において、これらの増殖因子は、硬膜外腔に入るような例えば損傷椎間板の外側の周りに投与する。
【００１８】
本発明のこれら及び様々な他の特徴並びに利点は、以下の詳細な説明を読むこと及び添付の特許請求の範囲を再検討することにより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本明細書で述べた実施形態を用いた椎間板輪後部の血管及び移行血管領域への幹細胞の針による挿入の重ね合わせ経路の軸方向腰部像である。
【図２】図２は、本明細書で示した技術により単層培養中で増殖させたＭＳＣを示す図である。
【図３】図３は、Ｌ５−Ｓ１椎間板（被験体ＭＬ）の椎間板輪後部へのＭＳＣ及び血小板由来ＶＥＧＦ上清の注射位置の例示的な蛍光顕微鏡像である。椎間板輪後部における造影剤の濃度に留意されたい（造影剤の流れを青により強調）。
【図４】図４は、幹細胞移植後に実施した血小板由来ＶＥＧＦ上清の注射により達成された例示的な硬膜外流を示す図である。
【図５】図５は、手技の１ヵ月未満前に撮影したＭＬショートタウ反転回復（ＳＴＩＲ）画像を示す図である。この矢状スライスは、含まれる最大の程度のＬ５−Ｓ１椎間板脱出を示すように選択されている。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．１で、撮像時刻は午後１：０１であった。この画像は、Ｌ５−Ｓ１における０．７ｃｍの椎間板脱出を示している。椎間板中央部で測定されるＬ５−Ｓ１椎間板高さは、０．５ｃｍであり、Ｌ４−Ｌ５では０．７ｃｍと測定される。
【図６】図６は、同じＳＴＩＲパラメーターを用いたＭＬの手技後１ヵ月目の対応する矢状スライスを示す図である。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．１。撮像時刻は午前１１：０１であった。この画像は、Ｌ５−Ｓ１における０．３ｃｍの椎間板脱出を示している。椎間板高さはＬ５−Ｓ１で０．５ｃｍであり、Ｌ４−Ｌ５では０．７ｃｍであることに留意されたい。
【図７】図７は、同じＳＴＩＲパラメーターを用いたＭＬの手技後５ヵ月目の対応する矢状スライスを示す図である。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．３。撮像時刻は午前１０：２３であった。この画像は、Ｌ５−Ｓ１における０．３ｃｍの椎間板脱出を示している。椎間板高さはＬ５−Ｓ１で０．５ｃｍであり、Ｌ４−Ｌ５では０．７ｃｍであることに留意されたい。
【図８】図８は、含まれる最大の程度のＬ４−Ｌ５椎間板脱出部を通るＭＪＭの手技前矢状スライスを示す図である。画像は、午後１２：１５に撮影した。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．１。Ｌ４−Ｌ５椎間板脱出は６ｍｍと測定される。スライスの中央部で測定された椎間板高さは、Ｌ４−Ｌ５＝８ｍｍ、Ｌ５−Ｓ１＝７ｍｍ、Ｓ１−Ｓ２＝５ｍｍであった。
【図９】図９は、同じＳＴＩＲパラメーターを用いたＭＪＭの手技後２ヵ月目の対応する矢状スライスを示す図である。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．１。画像は、午後１２：３５に撮影した。Ｌ４−Ｌ５椎間板脱出は３ｍｍと測定される。椎間板高さは、手技前と同じと測定される：Ｌ４−Ｌ５＝８ｍｍ、Ｌ５−Ｓ１＝７ｍｍ、Ｓ１−Ｓ２＝５ｍｍ。
【図１０】図１０は、ＭＪＭの手技後４．５ヵ月目を示す図である。これは、同じ撮像パラメーターを用いた対応する矢状ＳＴＩＲスライスである。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８３３．３、ＴＥ＝４８．２。画像は、午後１２：２７に撮影した。Ｌ４−Ｌ５椎間板脱出は３ｍｍと測定される。椎間板高さは、手技前と同じと測定される：Ｌ４−Ｌ５＝８ｍｍ、Ｌ５−Ｓ１＝７ｍｍ、Ｓ１−Ｓ２＝５ｍｍ。
【図１１】図１１は、最大の程度のＬ５−Ｓ１椎間板脱出部を通るＨＯの手技前矢状ＳＴＩＲスライスを示す図である。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．３。画像の時刻は、午前１１：２６であった。Ｌ５−Ｓ１椎間板脱出は、９ｍｍと測定される。椎間板高さの測定：Ｌ４−Ｌ５＝６ｍｍ、Ｌ５−Ｓ１＝８ｍｍ。
【図１２】図１２は、ＨＯの手技後６週目の対応する矢状ＳＴＩＲスライスを示す図である。撮像パラメーターは、ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．３に一定に維持した。画像の時刻は、午前１１：２５であった。Ｌ５−Ｓ１椎間板脱出は、８ｍｍと測定される。椎間板高さの測定：Ｌ４−Ｌ５＝６ｍｍ、Ｌ５−Ｓ１＝８ｍｍ。
【図１３】図１３は、ＨＯの手技後３．５ヵ月目の対応する矢状ＳＴＩＲスライスを示す図である。撮像パラメーターは、ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．３に一定に維持した。画像の時刻は、午後１：１０であった。Ｌ５−Ｓ１椎間板脱出は、９ｍｍと測定される。椎間板高さの測定：Ｌ４−Ｌ５＝６ｍｍ、Ｌ５−Ｓ１＝８ｍｍ。
【図１４】図１４は、椎間板輪後部であった意図した標的より髄核造影に特有の、ＨＯにおける造影剤の流れ（青で強調）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、１つ若しくは複数の不良な栄養領域又は不利な環境、すなわち無血管領域を有する損傷組織の修復に使用される組成物及び方法を提供する。不良な栄養領域又は不利な環境は、一般的に、組織が限られた血管血液供給を受ける又は血管血液供給を欠く部位、すなわち、本明細書で無血管移行領域と呼ばれる部位にある。この点における領域又は環境としては、椎間板、股関節部、肩（回旋腱板を含む）及び他の同様な部位が挙げられる。本明細書における実施形態は、無血管領域の修復を必要とする患者からの幹細胞、例えば、間葉幹細胞の入手を含む。次に、入手した細胞を、患者の無血管領域の修復に使用される細胞の能力の最適化を可能にする環境にｉｎ ｖｉｔｒｏで条件づける。十分な数の最適化され、条件づけられた細胞が存在する場合、修復を必要とする無血管領域の標的部位に細胞を入れる。いくつかの実施形態において、該部位への血液の流れ／栄養素の流れを増大させるために補給物処理を条件づけ細胞と併用して行う。補給物処理の時期は、一般的に条件づけ細胞の挿入の直前、挿入時又は挿入直後であるが、他の時期も考えられる。部位の修復を保証するために条件づけ細胞の挿入又は補給物処理のみの繰返しを含む処置を繰り返すことができる。
【００２１】
本明細書における幹細胞の選択のための無血管領域の条件としては、１〜１０％酸素、２〜１０％二酸化炭素、ｐＨの変化、栄養の変化及び同類のものの組合せが挙げられる。選択される細胞は、補給物、例えば、増殖因子、サイトカイン、インテグリン、カドヘリン及び同類のものと、かつ／又は処理済み自己血小板とともに修復部位に入れることができる。
【００２２】
定義
以下の定義は、本明細書で頻繁に用いる特定の用語の理解を促進するために示すものであり、本開示の範囲を制限することを意味するものでない。
【００２３】
「幹細胞（単数又は複数）」は、本明細書では、自己再生の特性及び潜在力を有する細胞を意味する。間葉幹細胞に関しては、これらの細胞は、多能性であり、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞及び他の同様な細胞に分化する能力を有する。
【００２４】
膨隆は、本明細書では、椎間板の線維輪内への髄核の突出を意味する。
【００２５】
椎間板ヘルニアは、本明細書では、線維輪の境界を越えた髄核の脱出を意味する。
【００２６】
内包性椎間板ヘルニアは、本明細書では、線維輪の境界を越え、後部縦靭帯により閉じ込められている髄核の脱出を意味する。
【００２７】
「患者」は、本明細書では、１つ又は複数の損傷又は老化無血管部位、例えば、損傷椎間板を有する哺乳動物、より一般的にはヒトを意味する。損傷椎間板に関して、損傷は、椎間板ヘルニア、膨隆椎間板、椎間板破壊、椎間板突出、椎間板脱出、椎間板腐骨化及び他の同様な椎間板の病気を含みうる。
【００２８】
「血小板及び血小板溶解物」は、本明細書では同義で用いられ、血小板の溶解により放出された血小板に含まれる天然増殖因子の組合せを含む。これは、化学的手段（すなわちＣａＣｌ２）、浸透圧による手段（蒸留Ｈ２Ｏの使用）、又は凍結／解凍処置により達成することができる。本発明の血小板溶解物は、全血から得ることもでき、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１９８，３５７号に記載の通り調製することができる。
【００２９】
「修復」又は「再生」は、同義で用いられ、標的無血管領域又は無血管領域に隣接する領域内の損傷部位の部分的又は完全な置換を意味する。例えば、椎間板の修復は、椎間板内の組織の部分的又は完全な修復又は置換を含む。修復又は再生は、通常は高齢化した患者における無血管領域の修復又は再生、すなわち、年齢により誘発された領域の損傷の修復も意味しうる。
【００３０】
「環境」は、本明細書では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで細胞に作用又は影響を及ぼす一連のすべての条件を意味する。
【００３１】
「低酸素症又は低酸素」は、本明細書では、環境において１０％以下の酸素を有するｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ状態を意味する。
【００３２】
「補給物」又は補給物処理は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＩＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＦＧＦ、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、ＭＣＰ−１エンドグリン、ＴＧＦ−β、ＣＣＬ２、ＶＥ−カドヘリンを含む増殖因子、サイトカイン、インテグリンを含む。
【００３３】
本発明による実施形態は、損傷した無血管領域、例えば、椎間板の修復及び再生に有用な方法及び組成物を含む。本明細書における実施形態は、不良な栄養及び低酸素条件下での自己幹細胞の採取及び増殖により、無血管領域の修復により高い能力がある細胞が得られるという予期しない所見に基礎を置いている。さらに、条件づけ細胞と自己血小板の移植、並びに損傷部位への血流の促進により、修復の劇的な向上がもたらされる。移植は、１つ又は複数の補給物処理（血小板を含む又は含まない）も含みうる。最後に、本明細書における実施形態は、修復及び／又は再生をさらに促進するために損傷部位内の最適化部位へのこれらの条件づけ細胞及び補助物質の投与を含む。
【００３４】
幹細胞
間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、再生医療における治療薬として大いに有望である。Ａｌｈａｄｌａｑ， Ａ．及びＪ．Ｊ． Ｍａｏ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ、２００４年、１３巻（４号）、４３６〜４８頁。Ｂａｒｒｙ， Ｆ．Ｐ．、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｊｏｉｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ、２００３年、２４９巻、８６〜９６頁； ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ９６〜１０２、１７０〜４、２３９〜４１。Ｂｒｕｄｅｒ， Ｓ．Ｐ．、Ｄ．Ｊ． Ｆｉｎｋ及びＡ．Ｉ． Ｃａｐｌａｎ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ｂｏｎｅ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９４年、１９９４年、５６巻（３号）、２８３〜９４頁。Ｃｈａ， Ｊ．及びＶ． Ｆａｌａｎｇａ、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ、Ｃｌｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２００７年、２５巻（１号）、７３〜８頁。Ｇａｎｇｊｉ， Ｖ．、Ｍ． Ｔｏｕｎｇｏｕｚ及びＪ． Ｐ． Ｈａｕｚｅｕｒ、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｍｏｒａｌ ｈｅａｄ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ、２００５年、５巻（４号）、４３７〜４２頁。これらの成人幹細胞は、体内の多くの源から容易に分離することができる。Ａｌｈａｄｌａｑ， Ａ．及びＪ．Ｊ． Ｍａｏ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ、２００４年、１３巻（４号）、４３６〜４８頁。さらに、それらは、多くの動物試験において筋肉、骨、軟骨、神経、腱及び様々な内部器官細胞に分化する能力を示した。椎間板の変性及び病変は、重大な身体障害及び相当額の医療費の主な原因である。Ｄａｇｅｎａｉｓ， Ｓ．、Ｊ． Ｃａｒｏ及びＳ． Ｈａｌｄｅｒｍａｎ、Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｌｏｗ ｂａｃｋ ｐａｉｎ ｃｏｓｔ ｏｆ ｉｌｌｎｅｓｓ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｌｙ、Ｓｐｉｎｅ Ｊ、２００８年、８巻（１号）、８〜２０頁。椎間板切開術、固定術及び椎間板置換術などの外科的治療が臨床診療で用いられ、重大な病的状態を伴う可能性が大きい。ｄｅ Ｋｌｅｕｖｅｒ， Ｍ．、Ｆ．Ｃ． Ｏｎｅｒ及びＷ．Ｃ． Ｊａｃｏｂｓ、Ｔｏｔａｌ ｄｉｓｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｏｗ ｂａｃｋ ｐａｉｎ： ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｎｄ ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ、Ｅｕｒ Ｓｐｉｎｅ Ｊ、２００３年、１２巻（２号）、１０８〜１６頁。Ｇｏｔｆｒｙｄ， Ａ．及びＯ． Ａｖａｎｚｉ、Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｌｕｍｂｅｒ ｄｉｓｃ ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｔ Ｏｒｔｈｏｐ、２００８年。Ｋａｔｏｎｉｓ， Ｐ．ら、Ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｏｒａｃｉｃ ａｎｄ ｌｕｍｂａｒ ｓｐｉｎｅ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ １８ ｃａｓｅｓ、Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ、２００７年、４５４巻、１１４〜９頁。結果として、外科的修正又は除去ではなく、椎間板（ＩＶＤ）を修復する能力は、魅力的な治療選択肢である。Ｓａｋａｉらは、ＭＳＣが模擬椎間板変性の穿刺モデルを用いた動物試験において椎間板修復の能力があることを示した。Ｓａｋａｉ， Ｄ．ら、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｉｎ ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００６年、２７巻（３号）、３３５〜３４５頁。Ｓａｋａｉ， Ｄ．ら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｔｏ ａ ｒａｂｂｉｔ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｃ ｍｏｄｅｌ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｄｉｓｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｓｐｉｎｅ、２００５年、３０巻（２１号）、２３７９〜８７頁。Ｓａｋａｉ， Ｄ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｉｎ Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｌ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ： ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｄｉｓｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００３年、２４巻（２０号）、３５３１〜４１頁。発明者らは、動物ＩＶＤモデルとヒトＩＶＤモデルとの間に多くの生理学的差異があることを認識した。これらは、ヒトにおける二足力学と比べてヒツジ、ブタ及びマウス動物における四足により生じた異なる力を含む。さらに、多くの動物研究者らによって用いられている変性椎間板疾患（ＤＤＤ）のよく知られている穿刺モデルは、急性損傷椎間板の科学的同等物を生じさせる。ヒトＤＤＤは、患者が内科的又は外科的治療を求める前にしばしば数十年間存在する。本明細書における実施形態（実施例参照）は、ヒト被験体の椎間板輪後部にＶＥＧＦ強化血小板由来上清とともに経皮的に挿入したＭＳＣは、有意な椎間板修復をもたらすことを示している。椎間板輪後部に細胞を入れる決定は、髄核内の明確な無血管、低密度栄養環境と比べてこの部位の血管化が高いことに部分的に基づくものであった。
【００３５】
本発明の実施形態は、無血管部位の修復を必要とする患者からの幹細胞の採取を含む。本発明による幹細胞は、定義の項で上述した通りである。いくつかの実施形態において、幹細胞は、間葉幹細胞、すなわち、いくつかある細胞型の中で特に、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞及び膵島細胞に分化することができる多能性細胞である。本発明の目的のために、他の幹細胞型も用いることができ、本発明の範囲内にあるが、多くの実施形態を間葉幹細胞に関して述べることに留意されたい。
【００３６】
本発明の態様による幹細胞の採取は、全体として参照により組み込まれる米国特許出願Ｓ／Ｎ ＰＣＴ／ｕｓ０８／６８２０２に記載されているものを含む。さらに、米国特許第５，４８６，３５９号、第６，３８７，３６７号及び第５，１９７，９８５号に記載されている方法及び組成物は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
より詳細には、間葉幹細胞は、骨髄、末梢血、脂肪組織及び他の同様な源に存在する多能性幹細胞である。ＭＳＣは、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞及びベータ膵島細胞を含む多くの細胞型に分化する能力を有する。
【００３８】
本発明の源ＭＳＣは、回復／置換療法（又は適切なドナー）を必要とする患者の腸骨稜（或いはＩＶＤ、骨膜、滑液又は椎体若しくは椎弓根（ｐｅｄｉｃｌｅ）などの他の源）から一般的に採取し、そのような患者は、本明細書で「必要とする患者又はそれを必要とする患者」と呼ぶ（脂肪組織、滑膜組織及び結合組織などの他の源が最近同定され、本発明の範囲内のＭＳＣ源ともみなされることに留意されたい）。一実施形態において、約１０〜１００ｃｃの骨髄を採取し、Ｃｅｎｔｅｎｏへの米国特許出願６０／７６１，４４１に記載されている方法を用いて又はＣａｐｌａｎらへの米国特許第５，４８６，３５９号に記載されているようにプラスチックへの付着により「分離する」。これらの参考文献のそれぞれは、すべての目的のためにそれらの全体として本明細書に組み込まれている。
【００３９】
以下でより詳細に述べるように、本発明の実施形態は、ある程度のレベル又は量の血小板も必要とすることがある。したがって、本発明は、血小板又は血小板溶解技法を用いるために適切な有核細胞数を得ることを可能にするための標準的骨髄吸引手順の変更を組み込んでいる。さらに、これらの血小板は、全血から得ることができる。大多数の公表研究が再び健常なヒト又は動物において実施されているので、様々な疾患状態を有するヒトへのこの技術の適用は、全く試験されていない。各側について３つのわずか２〜３ｃｃの骨髄分割試料（合計６つの分割試料）を吸引する変法を用いることにより、２０％血小板溶解物中で増殖させるのに成功した必要な有核細胞の収量が得られたことに留意されたい。
【００４０】
本明細書で用いる血小板及び血小板溶解物は、全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｕｃｅｔの方法（Ｄｏｕｃｅｔ、Ｅｒｎｏｕら、２００５年、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０５巻（２号）、２８８〜３６頁）を用いて骨髄採取物から調製する。一般的な溶解物は、約数千万個から数千億個の血小板を含む。Ｍａｒｔｉｎｅａｕら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４年２５巻（１８号）、４４８９〜５０３頁（その全体として参照により本明細書に組み込まれる）により示されたように、血小板溶解物は、一貫したＭＳＣの増殖を促進するのに必要な増殖因子を本質的に含む。一般的な実施形態において、血小板溶解物及びＭＳＣは、自己由来であり、ＭＳＣの有効かつ一貫した増殖に有用な量で存在する（以下でより十分に述べる）。特に、ＴＧＦ−ベータなどの増殖因子のレベルは、ＭＳＣを増殖するのに一般的に用いられるものより血小板溶解物中ではるかに低いが、血小板溶解物中に含まれている低レベルの増殖因子のすべてを一緒に用いる場合、著しい相乗効果が存在すると考えられていることに留意されたい。
【００４１】
幹細胞の選択（選択圧）
採取した幹細胞は、幹細胞（一般的に間葉幹細胞）及び最終的に修復を必要とする部位、例えば、修復を必要とする椎間板に認められる条件と同様な環境条件下で生存でき、増殖する幹細胞を選択するために培養する。選択圧は、椎間板修復に関連するので、以下でより詳細に述べるが、同様な条件は、股関節部、肩及び類似のものについて存在し、確認される。
【００４２】
Ｕｒｂａｎら、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ Ｄｉｓｃ、Ｓｐｉｎｅ、２００４年、２９巻（２３号）、２７００〜９頁（その全体として参照により本明細書に組み込まれる）に述べられているように、損傷を受け、変性している椎間板は、不良な栄養並びに酸素環境をもたらす。この環境は、健常椎間板の環境と異なる。実際、損傷椎間板における移植間葉幹細胞の生存率を測定するために実施された試験で、不十分な細胞生存率結果が示され、少数の細胞が椎間板の修復の促進に必要な必要数の細胞を供給するように増殖することができるにすぎない（Ｗｕｅｒｔｚら、Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ、Ｓｐｉｎｅ、２００８年、３３巻（１７号）、１８４３〜９頁、その全体として参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４３】
より詳細には、椎間板修復又は回復を必要とする患者から採取した幹細胞を培養条件下におく。一実施形態において、培地は、ＤＭＥＭ又は他の同様な培地から調製される基礎細胞培養培地である。培地には糖、アミノ酸、脂質、鉱物、タンパク質又は幹細胞の増殖を促進することを目的とする他の同様な物質を添加することができる。
【００４４】
さらに、本明細書における実施形態は、採取され、増殖しつつある間葉幹細胞を損傷椎間板の環境を模擬する様々な大気条件下で培養することを含みうる。一実施形態において、採取された幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで１〜１５％酸素中で培養する。いくつかの例において、採取された幹細胞を３〜１０％酸素中で培養し、他の例において、採取された幹細胞を３〜７％酸素中で培養する。これらの低酸素条件は、典型的な損傷椎間板環境に存在する低酸素条件を再現するものである。低酸素条件は、幹細胞増殖期の一部又は全期間中に存在しうるが、一般的に当細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する時間の少なくとも１／３の時間存在する。選択は、細胞を培養するときに起こり、生存し、最終的に増殖することができる生存細胞は、低酸素環境を有する椎間板内に移植されたときに利点を有する。
【００４５】
他の実施形態において、採取された幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで高二酸化炭素条件下、一般的に２〜１０％二酸化炭素中で培養する。採取された幹細胞は、条件が２〜１０％二酸化炭素及び３〜１０％酸素を含む、高二酸化炭素及び低酸素環境の組合せ環境中でさらに培養することができる。上記のように、選択は、細胞を培養するときに起こり、生存し、最終的に増殖することができる生存細胞は、高二酸化炭素環境又は低酸素環境と組み合わされた高二酸化炭素環境を有する椎間板内に移植されたときに利点を有する。
【００４６】
他の実施形態において、採取された幹細胞を、採取され、培養された髄核細胞（ＮＰ細胞）又は線維輪細胞（ＡＦ細胞）と一緒に培養し、増殖させる。幹細胞と共培養するための髄核（ＮＰ）細胞は、針吸引又は他の同様な技術により椎間板修復を必要とする患者から採取することができる。これらのＮＰ細胞又はＡＦ細胞は、自己由来又は非自己由来であってよい。一般的実施形態において、約１０３〜１０９個のＮＰ又はＡＦ細胞を採取された幹細胞と共培養し、ＮＰ細胞及び／又はＡＦ細胞放出因子及び廃棄物に反応する幹細胞の選択に有用な環境を提供させる。共培養条件は、不良な栄養環境、低酸素、高二酸化炭素及び本明細書で述べた他の開示された実施形態を含みうる。いくつかの実施形態において、ＮＰ細胞を幹細胞と別個のｉｎ ｖｉｔｒｏフラスコ（又は同様な容器）中で培養する。次いで、ＮＰ細胞培養からの使用済み培地を、幹細胞の培養時の上記の条件の培地と組み合わせることができ、或いはそのような条件下で生存能を維持し、最終的に増殖することができる幹細胞を増殖し、選択するために専ら用いることができる。
【００４７】
他の実施形態において、採取された幹細胞を、損傷椎間板で認められるのと類似の修正ｐＨ条件下で培養し、増殖させる。例えば、（本明細書で述べたような）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培地は、６．６〜７．０、より一般的に６．７〜６．９のｐＨを有するように修正することができる。修正ｐＨは、本明細書で述べた培養条件のいずれかと組み合わせて、椎間板修復及び再生に用いる幹細胞の選択を促進することができる。
【００４８】
他の実施形態において、採取された幹細胞を損傷椎間板で認められるのと類似の修正オスモル濃度条件下で培養し、増殖させる。例えば、（本明細書で述べたような）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培地は、３５０〜６００ｍＯｓｍ、より一般的に４５０〜５００ｍＯｓｍのオスモル濃度を有するように修正することができる。修正オスモル濃度は、本明細書で述べた培養条件のいずれかと組み合わせて、椎間板修復及び再生に用いる幹細胞の選択を促進することができる。
【００４９】
他の実施形態において、１つ又は複数の増殖因子を含めることにより、１つ又は複数の選択条件下の幹細胞の生存及び増殖を修正することができる。これらの例において、選択下の細胞を、それら及び他の同様な因子の混合物を含む、ＴＧＦ−ベータ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ及び／又はＨＩＦ−１アルファの存在下で培養する。
【００５０】
上記の幹細胞培養に基づく実施形態のそれぞれについて、条件（単数又は複数）を細胞標準培養環境に徐々に組み込むことができることに留意されたい。例えば、採取された幹細胞を最初に１又は２継代にわたって１０％酸素中で培養し、次いで、１又は２継代にわたって９％酸素条件に移し、標的低酸素条件が得られるまで漸減レベルの酸素中で培養することができる。この手順のもとでは、細胞を損傷椎間板に存在する環境に徐々に適応させる。
【００５１】
他の無血管領域の処置についても本発明の範囲内にあると想定されるが、以下の処理手順は、損傷椎間板の治療に関連して述べる。
【００５２】
損傷椎間板の治療
上で述べた損傷椎間板モディファイアの少なくとも１つにより選択された幹細胞は、患者の損傷椎間板内への移植のための十分な数の細胞が存在するまで増殖させる。一般的な実施形態において、約１０５〜１０９個の選択される間葉幹細胞が損傷椎間板内への移植に必要である。
【００５３】
培養細胞をＰＢＳ又は他の同様な緩衝液を用いて洗浄して、患者の体内への移植を意図しない物質、すなわち、培地成分、廃棄物等を含まない細胞集団を得る。幹細胞をＮＰ細胞と共培養する場合、ＮＰ細胞集団は、細胞選別技術又はアフィニティークロマトグラフィーにより除去することはできるが、洗浄済み幹細胞は、ＮＰ細胞を含みうる。幹細胞は、今やそれを必要とする患者への移植の準備が整っている。
【００５４】
一実施形態において、洗浄済み幹細胞を損傷椎間板の後部輪内に直接移植する。従来の方法論が髄核内への細胞の移植を示している通り、これは、幹細胞の移植の予期しない位置である。細胞は、経皮的ｘ線ガイド又は外科的ＩＶＤアクセスによるものを含む当技術分野で公知の技術により損傷椎間板の後部輪内に移植する。１４〜１８０日の期間が治療間で一般的であるが、損傷椎間板の修復手技に細胞移植の１回又は複数回の反復を用いることができる。
【００５５】
他の実施形態において、治療を必要とする患者からの自己血小板をトロンビン及びＣａＣｌ２で約１〜７日間前処理する。この処理は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を選択的に発現するようにこれらの血小板を前処理するものである。いくつかの実施形態において、採取された血小板を約２８．５６Ｕ／ｍｌトロンビン及び約２．８６ｍｇ／ｍｌＣａＣｌ２で前処理する。さらなる実施形態において、それを必要とする患者からの自己血小板をトロンビン、カルシウム又はその塩、トロンボキサンＡ２、アデノシン三リン酸及びアリキドネート（ａｒｉｃｈｉｄｏｎａｔｅ）の組合せで前処理する。上記のように、前処理は、それを必要とする患者への移植１〜数日前であってよい。次いで、前処理済み自己血小板を前述の本発明の選択される条件づけ幹細胞の移植前、移植時又は移植後に移植する。血小板は、移植幹細胞と一般的に同じ位置に移植する。
【００５６】
他の実施形態において、本発明の採取され選択された幹細胞は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＩＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＴＧＦ−β、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、Ｔｉｅ２、ＰＤＧＦ、ＣＣＬ２、アルファ−Ｖベータ−５、アルファ−５ベータ−１、ＶＥ−カドヘリン、ＰＥＣＡＭ−１、プラスミノーゲン活性化因子及び酸化窒素シンターゼを含む、増殖因子、サイトカイン、インテグリン、カドヘリン又は新脈管形成、脈管形成又は動脈形成（ａｅｒｔｅｒｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進することが公知の薬物を含む１つ若しくは複数の補給物又は補給物処理とともに移植する。代替の実施形態において、それを必要とする患者における移植に用いる幹細胞は、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ又は幹細胞及び／又は間葉幹細胞の幹細胞性若しくは増殖を促進することを目的とする他の同様な増殖因子を含む増殖因子の組合せとともに共移植する。いくつかの実施形態において、自己血小板又は血小板溶解物を前述の補給物と組み合わせて移植することができる。
【００５７】
図１に重畳針穿刺による軸方向腰椎像を示す本発明の一実施形態の有用性を示す。本明細書で述べた実施形態を用いた条件づけ幹細胞を椎間板輪後部の血管及び移行血管領域に入れた。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）経皮的に移植した自己間葉幹細胞
方法：
被験体：
３例の患者被験体をＩＲＢ（Ｓｐｉｎａｌ Ｉｎｊｕｒｙ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔｍｉｎｓｔｅｒ、ＣＯ）承認済みＭＳＣ移植プロトコールに参加する意思に基づいて選択した。各被験体は、ＩＲＢ承認済み同意書に署名した。被験体は、以下の組み入れ／除外基準に基づいて選択した。
【００５９】
組み入れ基準：
１．年齢１８〜６５歳
２．保存的管理の失敗
３．椎間板突出又は内包性椎間板脱出（靭帯下）を伴う腰椎変性椎間板疾患
４．椎間板突出／神経を治療すべき疼痛発生源として確認した選択的神経根ブロック（主要な疼痛愁訴の＞７５％軽減）又は椎間板をＰ２疼痛発生源として確認した椎間板造影
５．Ｔ２加重ＭＲＩ画像上の脱水を伴う又は伴わない正常椎間板高の少なくとも７５％
６．外科的選択肢を求める意思がない
除外基準：
１．活動性炎症又は結合組織疾患（すなわち、狼瘡、線維筋痛、ＲＡ）
２．潜在的に症状を伴う活動性非矯正内分泌障害（すなわち、甲状腺機能低下、糖尿病）
３．潜在的に症状を伴う活動性神経障害（すなわち、末梢神経障害、多発性硬化症）
４．重度心疾患
５．薬剤の使用を必要とする肺疾患
６．呼吸困難又は自己血液製剤の輸液に対する他の反応の既往歴
手技前データ収集：
１．未知の医学的状態を除外するためにＭＳＣ移植の３ヵ月以内にＣＢＣ及び血液化学を得る。
【００６０】
２．手技前ＭＲＩ
３．手技前アウトカム測定
間葉幹細胞（ＭＳＣ）の単離及び増殖：
骨髄採取処置の前の１週間にわたり患者がコルチコステロイド又はＮＳＡＩＤを服用することを制限した。骨髄採取処置と同時にヘパリン加（Ａｂｒａｘｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）ＩＶ静脈血を採取して血小板溶解物（ＰＬ）を得るために用いた。血小板溶解物は、２００ｇで遠心分離することにより、赤血球（ＲＢＣ）から多血小板血漿（ＰＲＰ）を分離して調製した。ＰＲＰ容積を分割し、ＰＬを生成するために−２０℃で保存した。血小板溶解物を細胞培養培地に１０〜２０％で添加した。
【００６１】
血小板由来のＶＥＧＦに富む上清もＭａｒｔｉｎｅａｕによって記載された方法に基づいて調製した（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ， Ｉ．、Ｅ． Ｌａｃｏｓｔｅ及びＧ． Ｇａｇｎｏｎ、Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ：ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４年、２５巻（１８号）、４４８９〜５０２頁）。上記と同じＰＲＰ単離工程を用いて、ＰＲＰを抜き出し、分割量を２８．５６Ｕ／ｍＬのヒトトロンビン（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ）及び２．８５ｍｇ／ｍＬの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｇｅｎｔ）で３７℃及び５％ＣＯ２で６日間活性化した。活性化ＰＲＰ試料を３，０００ｒｐｍで６分間遠心分離し、上清を抜き出し、−８０℃で保存した。これは、後に増殖ＭＳＣ培養と混合する注入液として、並びに硬膜外注射により送達する補給物注射用に用いた。
【００６２】
全ＩＶ血採取と同時に、患者を手術室（ＯＲ）テーブル上に腹臥位とし、採取すべき部位を１％リドカインにより麻酔し、滅菌済みディスポーザブルトロカールを用いて、右ＰＳＩＳ部から１０ｃｃの骨髄血を、左ＰＳＩＳ部から１０ｃｃをヘパリン処理注射器に採取した。患者が局所麻酔により容易にコントロールされなかった痛みを骨髄採取中に報告した場合、仙骨硬膜外麻酔薬のみを加えた。
【００６３】
全骨髄を２００ｇで４〜６分間遠心分離して、ＲＢＣから有核細胞を分離した。有核細胞を除去し、別個の管に入れた。試料を１０００ｇで６分間遠心分離し、ペレットとした。有核細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＧｉｂＣｏ）で１回洗浄し、計数し、次いで、１０〜２０％ＰＬ、５ｕｇ／ｍＬドキシシリン（Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌａｂｓ）及び２ＩＵ／ｍＬヘパリン（Ａｂｒａｘｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含むダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧｉｂＣｏ）に再懸濁した。有核細胞を組織培養フラスコに１×１０６細胞／ｃｍ２で播種した。培養を加湿環境中で３７℃／５％ＣＯ２／５％Ｏ２でインキュベートした。４８〜７２時間後に培地を交換し、大部分の非付着細胞集団を除去した。ＭＳＣコロニーが６〜１２日後に発生し、コロニー形成ＭＳＣのみが脱離するように動物由来原料不使用トリプシン様酵素（ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ、ＧｉｂＣｏ）を用いて採取した。ＭＳＣを増殖するために、それらを１０〜２０％ＰＬ、５ｕｇ／ｍＬドキシシリン及び２ＩＵ／ｍＬヘパリンを含むアルファ修正イーグル培地（ＡＭＥＭ、ＧｉｂＣｏ）中で６〜１２，０００細胞／ｃｍ２の密度で平板培養し、３７℃／５％ＣＯ２／５％Ｏ２で集密状態近くまで増殖させた。骨髄由来の初代細胞を継代０と呼び、ＭＳＣの各後続の継代培養をさらなる１代継代とみなした。この単層細胞培養法により増殖させたＭＳＣの形態の例については図２を参照のこと。ＭＳＣを第２〜第５継代まで継代培養した後、それらを採取し、洗浄し、注射用活性化ＰＲＰに懸濁した。
【００６４】
経皮的移植手技
被験体をＸ線テーブル上で腹臥位とし、滅菌手袋及びドレープによりベタジンスワブを用いて準備した。ＡＰ蛍光透視像（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｉｓｏ−Ｃ）を同側斜位により得た。頭側−尾側傾斜を調節することにより、注射すべき標的レベルの前終板を「オンエンド」で視覚化した。無菌法を用いて、２２ゲージ７インチｑｕｉｎｋｅ針を二面蛍光透視下で治療すべきレベルの腰椎小関節面関節（ｌｕｍｂｅｒ ｆａｃｅｔ ｊｏｉｎｔ）の上関節突起に誘導し、小関節面を越えて、椎間板後部に進めた。椎間板アクセスが得られたならば、側面投影下で、近接のために治療前ＭＲＩ撮像を用いて、椎間板突出の解剖学的位置にできる限り近い輪後部（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｎｎｕｌｕｓ）内に造影剤の流れ（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ ３００ｍｇ／ｍｌ−ＮＤＣ０４０７−１４１３−５１ ＰＢＳにより５０％希釈）を最大化するように針を位置決めした（図３参照）。血小板由来ＶＥＧＦ上清中で培養増殖させた自己ＭＳＣを注射し、針を抜去した。
【００６５】
ＭＳＣ移植後、１週目及び２週目に被験体は標的レベルにおけるＶＥＧＦ由来上清を用いて実施した追加の経椎間孔（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｉｎａｌ）硬膜外処置のために戻った。硬膜外処置は、同じ製剤を用いて実施した。硬膜外アクセスは、二面蛍光透視下で操作し、注射する標的レベルの椎弓根下（ｓｕｂｐｅｄｉｃｕｌａｒ）陥凹に向けて誘導した２５ゲージ３．５インチｑｕｉｎｃｅ針を用いて得た。椎弓根（ｐｅｄｉｃｌｅ）の上方及び下に及ぶ良好な硬膜外色素流が視覚化されたならば、ＶＥＧＦ由来上清及び４％リドカインを注射し、針を抜去した（図４参照）。術後治療プロトコールは、理学療法における又は在宅での４週間にわたる週３回の腰椎牽引からなっていた。
【００６６】
撮像及び患者フォローアップ
ＧＥ ３．０Ｔｅｓｌａ Ｅｘｃｉｔｅ ＨＤを用いて腰椎を撮像した。撮像シーケンスは、矢状ショートタウ反転回復（ＳＴＩＲ）、矢状ファストグラジェントリコールエコー（ＦＧＲＥ）及びグラジェントリコールエコーファストスピン（ＧＲＥ−ＦＳ）を含むものであった。画像を観察し、Ｅ−Ｆｉｌｍ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．５．３（Ｍｅｒｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で測定した。マッチングＴＲ／ＴＥ及びマッチング撮像面を用いた矢状ショートタウ反転回復（ＳＴＩＲ）及びグラジェントリコールエコー（ＧＲＥ）ファストスピン画像を用いた。これは、同じ患者における連続画像の解釈の誤りの可能性を減らすために実施した。日周性の影響を低減するために、撮像センターにできる限り同じ時刻に連続撮像を実施するように指示した。
【００６７】
機能及び症状に関するフォローアップ質問を電話により開始し、患者から回答を得た。腰痛に関する修正ＶＡＳスコアを取得し、「機能評価指数（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ）」（ＦＲＩ）も得た。この質問は、患者の機能に焦点を合わせたものである（Ｆｅｉｓｅ， Ｒ．Ｊ．及びＪ． Ｍｉｃｈａｅｌ Ｍｅｎｋｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒａｔｉｎｇ ｉｎｄｅｘ： ａ ｎｅｗ ｖａｌｉｄ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ、Ｓｐｉｎｅ、２００１年、２６巻（１号）、７８〜８６頁； ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ８７）。診察所来院も術後検査に用いた。これらは、以下の間隔で開始した。
【００６８】
１．手技後６週目
２．手技後１２週目
結果：
登録された３例の被験体の病歴及びアウトカムを以下に述べる。
【００６９】
患者１：
ＨＯは、１９歳の白人女性で、持ち上げ（ｌｉｆｔｉｎｇ）外傷及び女性の選択したスポーツに二次的であると考えられた腰痛の７年の病歴を有する大学のスポーツ選手であった。女性は、インターベンショナル疼痛管理医師による評価及び治療を含む広範な保存的療法を提示の前に４年間受けた。腰椎椎間関節は、関節内注射に対する陰性反応により疼痛発生源として除外された。ＭＲＩは、右側が悪い、両Ｓ１神経根に隣接するＬ５−Ｓ１椎間板突出を示した。椎間板造影により、Ｌ５−Ｓ１椎間板の疼痛の一致した再現を伴う症候性の輪後部の裂傷が明らかになった。手技の前に被験体は、可変性の重症度の一定の疼痛と、著しい機能の制限をもたらす身体活動に伴う右足のＳ１分布におけるしびれ及び刺痛感を述べた。
【００７０】
被験体は、１２週間を通して最大７５％の改善を報告した。手技後６ヵ月目に、被験体は、報告された修正ＶＡＳ疼痛スコア及び機能評価指数の変化をほとんど示さなかった。治療後ＭＲＩ撮像結果の変化の対応する欠如が認められた。最大突出サイズの１ｍｍの減少が６週目に認められたが、これは、３．５ヵ月目に手技前のサイズに戻った。すべての椎間板高測定値は、すべての撮像セッションにわたって同じままであり、撮影されたすべての画像の最大時間間隔は、１時間４５分であった。ＨＯに関する結果を図１１、１２及び１３に示す。
【００７１】
患者２：
ＭＪＭは、提示の前に腰痛の１５年の病歴を有する３５歳の白人男性であった。男性は、保存的療法の失敗及び活動に起因する重度の疼痛エピソードの増加しつつある頻度を報告した。ＭＲＩにより、腰椎化Ｓ１−Ｓ２セグメント、Ｌ５−Ｓ１における中等度の椎間関節侵食及び中等度の椎間孔狭窄を伴う広範囲椎間板膨隆が明らかになった。さらに、Ｌ４−Ｌ５における左より大きい右の後部内包性突出が存在していた。理学的検査では活動性神経根障害は示されなかったが、患者は悪化を伴う間欠性根症状を報告した。保存的管理の失敗の後に手術が勧告されたが、辞退した。Ｌ４−Ｌ５椎間板をこの治療の焦点とし、脱水Ｌ５−Ｓ１椎間板を対照とした。
【００７２】
手技後６ヵ月目に、患者は、修正ＶＡＳの３から０への改善と疼痛の頻度の８０％以上の低下を示した（表１参照）。この患者のＦＲＩスコアは、６０％以上増加し、男性は全般的な症状の５０％の改善を報告した。Ｌ４−Ｌ５椎間板膨隆矢状ＳＴＩＲ画像は、術前ＭＲ画像におけるその最大程度の６ｍｍと測定される（図８参照）。２ヵ月及び４．５ヵ月フォローアップフィルム（対応する画像シーケンス及びスライス−図９及び１０参照）において、Ｌ４−Ｌ５膨隆は３ｍｍに減少したことが認められ、Ｌ４〜Ｓ２椎間板のいずれにおいても椎間板高の変化は測定されなかった。画像を得た時刻は、２０分以下の変動であった。
【００７３】
患者３：
ＭＬは、軍隊の訓練演習に伴う外傷性腰部損傷を有する２４歳の白人女性であった。提示の時点で女性は３年間症候性であった。女性の訴えは、片脚及び時として両脚への電流が走るような痛み、長時間の座位又は立位での腰痛、並びに屈伸又はかがみによる疼痛からなっていた。女性は、理学療法からなる保存的管理を失敗した。手技前のＭＲＩは、椎間板高の減少を示したが、Ｌ５−Ｓ１椎間板におけるいくぶん保存されたＴ２シグナルを示した（図５参照）。この椎間板は、後縦靭帯により含まれていた０．７ｃｍの突出も有していた。輪後部は崩壊し、髄核から後縦靭帯までの高強度領域が存在していた。Ｌ４−Ｌ５椎間板は、より低いＴ２シグナルを有し、脱水されていたが、椎間板高の保存を示した。このレベルでの突出は０．４ｃｍと測定され、椎間板の下中央部分に高強度領域が認められた。病歴、検査及びＭＲＩ所見に基づいて、Ｌ５及びＳ１における間欠性の横断（ｔｒａｖｅｒｓｉｎｇ）神経根刺激は、Ｌ４−Ｌ５及びＬ５−Ｓ１椎間板レベルにあると推定された。椎間板造影を実施したところ、両方が線維輪の裂傷を伴うＬ４−Ｌ５及びＬ５−Ｓ１における低圧調和的（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ）疼痛（Ｐ２）が示された。ＭＳＣ注射によりＬ５−Ｓ１椎間板のみを治療する決定を下し、Ｌ４−Ｌ５を無処置対照とした。
【００７４】
手技後６ヵ月目（表１参照）にＭＬは、腰部修正ＶＡＳ（１〜１０スケール）の約４０％の改善と疼痛の頻度の６０％以上の低下を報告した。機能は、ＦＲＩにより測定したとき７０％以上改善した。女性は、６０％の症状の改善を自己報告した。女性の手技後の腰椎ＭＲＩ撮像で、Ｌ５−Ｓ１椎間板突出のサイズが手技前の０．７ｃｍから手技後１ヵ月目の０．３ｃｍに、手技後５ヵ月目の０．４ｃｍに減少したことが示された（図６及び７）。さらに、椎間板輪後部のＨＩＺ部位のサイズは、両フォローアップフィルムで減少していた。画像取得の時間の差は、１．５時間以下であった。
【００７５】
表１：腰部修正ＶＡＳ及び頻度に関する手技前及び手技後６ヵ月目の報告されたアウトカム。１．０の頻度は、一定の疼痛に等しい。機能評価指数の測定並びに状態の変化の割合の自己報告。
【００７６】
【表１】
表２：総ＭＳＣ収量及び培養時間
【００７７】
【表２】
考察：
３例の治療被験体のうちの２例が治療した椎間板突出のサイズの減少を示し、持続的な主観的及び機能改善を報告した。１例の被験体は、症状の一時的な減少及び椎間板突出のサイズのわずかな一時的な変化を示した後、治療前のベースライン測定値に逆行した。興味深いことに、この患者の椎間板輪後部に細胞を選択的に入れることが技術的に困難であり、椎間板輪後部への造影剤の流れが最適以下であった。発明者らは、この最適以下の挿入と被験体の持続的反応の欠如との相関を疑っている。Ｋｏｇａらは、関節内腔に非特異的に注入されたＭＳＣは軟骨病変を修復しなかったが、標的組織への付着を可能にする、欠陥部に直接的に適用したものは、修復ができたことを示した。ＨＯの造影剤の流れ及びその後のＭＳＣの流れ（図１４参照）が主として髄核内への流れであったことに留意されたい。他の患者の髄核内に間葉幹細胞を直接入れた我々自身の未公表の臨床経験では観察できるＭＲＩ変化は起こらなかった。これらの所見も幹細胞の付着の位置が治療の成功に極めて重要であるという概念を裏付けていると思われる。特に、椎間板輪後部は、ある程度の血管潅流を維持しているが、無血管性髄核は、移植されたＭＳＣの持続性の欠如をもたらしうる、十分に立証された最適以下の栄養環境を有する。Ｍａｒｔｉｎ， Ｍ．Ｄ．、Ｃ．Ｍ． Ｂｏｘｅｌｌ及びＤ．Ｇ． Ｍａｌｏｎｅ、Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｌｕｍｂｅｒ ｄｉｓｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｆｏｃｕｓ、２００２年、１３巻（２号）、Ｅ１頁。また注目すべきことに、ＨＯは、最小の増殖性幹細胞の収量を有し、他の被験体より長い培養期間にわたって有意に少ない細胞が産生された（表２参照）。
【００７８】
ＭＳＣは単層培養において線維芽細胞の形態を有する（図２参照）ので、観測された結果は、椎間板輪後部に選択的に挿入されたＭＳＣの線維芽細胞分化に起因していた可能性がある。Ａｗａｄ， Ｈ．Ａ．ら、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｓｅｅｄｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｔｅｎｄｏｎ ｒｅｐａｉｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｅｅｄｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｒｅｓ、２０００年、５１巻（２号）、２３３〜４０頁。Ｄｅｌｏｒｍｅ， Ｂ．及びＰ． Ｃｈａｒｂｏｒｄ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２００７年、１４０巻、６７〜８１頁。Ｘｉａｎｇ， Ｙ．ら、Ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、Ｊ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖ Ｓｃｉ Ｂ、２００７年、８巻（２号）、１３６〜４６頁。
【００７９】
或いは、治療効果に寄与していた可能性がある他の変数は、フォローアップ血小板上清の硬膜外注射であった。Ｍａｒｔｉｎｅａｕらは、特殊なカルシウム及びトロンビン前処理を用いて調製した血小板上清が血小板（並びに他の増殖因子の宿主）からのＶＥＧＦ脱顆粒の最大バーストをもたらすことを示した。Ｍａｒｔｉｎｅａｕ， Ｉ．、Ｅ． Ｌａｃｏｓｔｅ及びＧ． Ｇａｇｎｏｎ、Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ： ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４年、２５巻（１８号）、４４８９〜５０２頁。ＶＥＧＦは、血管新生を引き起こすことが公知であり、ヒト変性椎間板（ＩＶＤ）は、血管潅流が不十分であることが公知である。Ｍａｒｏｕｄａｓ， Ａ．ら、Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｕｍｂａｒ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ：ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｊ Ａｎａｔ、１９７５年、１２０巻（Ｐｔ１）、１１３〜３０頁。Ｗａｌｌａｃｅ， Ａ．Ｌ．ら、Ｈｕｍｏｒａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｅｎｄｐｌａｔｅ、Ｓｐｉｎｅ、１９９４年、１９巻（１２号）、１３２４〜８頁。Ｐａｎｄｙａ， Ｎ．Ｍ．、Ｎ．Ｓ． Ｄｈａｌｌａ及びＤ．Ｄ． Ｓａｎｔａｎｉ、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−− ａ ｎｅｗ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｖａｓｃｕｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２００６年、４４巻（５号）、２６５〜７４頁。
【００８０】
これらの患者におけるＩＶＤ突出の減少の別の説明は、日周効果に帰せられた。Ｐａｒｋらは、ＭＲＩを朝及び夕に実施した場合の８例の無症候性志願者における椎間板膨隆のサイズの変化を実証した。Ｐａｒｋ， Ｃ．Ｏ．、Ｄｉｕｒｎａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｕｍｂｅｒ ＭＲＩ、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｉｇｎａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ｄｉｓｃ ｈｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｄｉｓｃ ｂｕｌｇｅ、Ｙｏｎｓｅｉ Ｍｅｄ Ｊ、１９９７年、３８巻（１号）、８〜１８頁。これらの効果はこれらの被験体で発生した可能性があるが、患者の２例は、サイズが変化しなかった無処置対照椎間板を有していた。さらに、ＭＲＩ試験を担当した単一撮像センターには、最初のスキャンの同じ時刻にできる限り近い時刻にフォローアップスキャンを実施するように指示した。結果として、患者の画像間の最大の時刻変動は、２時間未満であった。最後に、処置及び対照椎間板の高さを測定したところ、すべての被験体について有意な変化は認められなかった。日周変化が存在していた場合、吸水膨潤の効果に起因する椎間板の高さの有意な変動が予想されよう。椎間板突出サイズの減少の別の説明は、針外傷によって直接的に誘発される治癒効果であった可能性がある。Ｋｏｒｅｃｋｉらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ動物モデルにおけるこの効果を検討し、真実に反して、針穿刺が椎間板の生体力学的損傷及びその全般的機能の低下をもたらした可能性があることを発見した。Ｋｏｒｅｃｋｉ， Ｃ．Ｌ．、Ｊ．Ｊ． Ｃｏｓｔｉ及びＪ．Ｃ． Ｉａｔｒｉｄｉｓ、Ｎｅｅｄｌｅ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｉｎｊｕｒｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ａｎ ｏｒｇａｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ、Ｓｐｉｎｅ、２００８年、３３巻（３号）、２３５〜４１頁。さらに、動物におけるＤＤＤを誘発するための標準モデルは穿刺損傷によるものであることに留意されたい。Ｎｉｉｎｉｍａｋｉ Ｊ．ら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｊｕｒｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ、Ａｃｔａ Ｒａｄｉｏｌ、２００７年、４８巻（６号）、６４３〜９頁。
【００８１】
結論：
この実施例は、血小板上清硬膜外補給とともに経皮的に移植された自己ＭＳＣは、内包性腰椎椎間板突出のサイズを減少させることができることを実証している。１例の患者が該療法に反応しなかった理由は不明であるが、反応の欠如は比較的に低いＭＳＣ収量並びにＭＳＣの最適以下の挿入に起因していたと仮説を立てることが妥当である。
【００８２】
この実施例におけるデータは、本明細書で述べた方法が当技術分野で記載された他の方法と比べて修復の驚くべき改善をもたらす、本発明の一実施形態の有用性を示している。他の無血管修復部位、例えば、肩、股関節部等に関するデータは、同様のレベルの改善を示すと予想される。
【００８３】
本開示の様々な実施形態は、各従属請求項が先行する従属請求項のそれぞれの制限を組み込んでいる複数の従属請求項並びに独立請求項であったかのように、特許請求の範囲に挙げられている様々な要素の置換も含みうる。そのような置換は、明確に本開示の範囲内にある。
【００８４】
本発明を多くの実施形態に関して特に示し、述べたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく本明細書で開示した様々な実施形態の形態及び詳細の変更を行うことができ、本明細書で開示した様々な実施形態は、特許請求の範囲に対する制限として働くことを意図するものでないことは、当業者により理解されるであろう。
【００８５】
本発明の記述は、例示及び記述の目的のために示したものであって、網羅的なもの又は本発明を開示した形態に限定することを意図するものではない。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。多くの修飾形態及び変形形態が当業者には明らかであろう。記述し、図に示した実施形態は、本発明の原理、実際的適用を最もよく説明し、当業者が予期される特定の用途に適するような様々な修正を含む様々な実施形態について本発明を理解することを可能にするために選択し、記述した。
【００８６】
本明細書は、特許、特許出願及び刊行物の多くの引用を含む。それぞれがすべての目的のために参照により組み込まれている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、損傷した無血管部位、例えば、椎間板の修復を促進するための組成物及び方法を提供し、より具体的には、本発明は、それを必要とする患者における無血管部位内又は無血管部位に隣接する最適化位置に環境に適応させた自己幹細胞を適用することを提供する。
【背景技術】
【０００２】
無血管移行領域及び他の修復困難部位は、身体の多くの重要な組織に存在する。これらの領域は、組織、例えば、椎間板への血液供給が限られている若しくは欠如している部位又は組織の損傷が修復処置に抵抗する過酷な環境をもたらした部位に存在する。例えば、無血管組織が損傷を受けた場合、当組織への血液供給の欠如又は制限は、修復過程に対する重大な障害となる。これは、通常の負荷の問題が修復及び治癒を促進することを困難にする、椎間板、膝及び股関節部に特に当てはまる。
【０００３】
１つの特に重要な体内の無血管移行領域は、直接的な血液供給が存在しない椎間板内にある。椎間板への栄養素は、軟骨下骨中の小毛細血管床を経て一般的に到達し、時間の経過とともに椎間板全体に広がる。さらに、椎間板は、歩行、走行などの軸方向負荷活動中に周囲組織から栄養素を吸引、言い換えれば、吸収することにより栄養素を受け入れる。
【０００４】
椎間板は、脊柱の２つの椎骨を互いに分離させる衝撃吸収パッドである。これらの円板は、脊柱に３つの機能を本質的に与え、第１に直立位であるときに身体の軸方向負荷を支える衝撃吸収材としての役割を果たし、第２に２つの隣接する椎骨を一緒に保持する靭帯としての役割を果たし、第３に脊柱の曲げ及び回転の促進のための回転軸としての役割を果たす。
【０００５】
ヒトは、脊柱に２３個の円板、すなわち、頸部に６個、胸部に１２個、腰部に５個を有する。各円板は、髄核、線維輪及び椎骨終板からなっている。髄核は、水に富み、ゼラチン様であり、円板の中心領域を含む。線維輪は、本質的に線維性であり、コラーゲンからなり、（髄核と比較して）水をほとんど含まず、髄核を取り囲んでいる。加圧髄核を含むために一連の薄層が線維輪に配置されている。さらに、椎骨終板は、各円板を隣接する椎体に付着させる役割を果たす。
【０００６】
上述のように、円板の環境上の過酷な側面（無血管性、高圧、有害なｐＨ等）及び修復中に円盤に置かれる困難な機械的要件（二足歩行運動に伴う応力及び歪み）のため、組織の修復及び再生は、損傷円板においては困難であることが証明された。幹細胞技術を利用する従来の修復方法論は、一般的にキャリア物質の存在下で髄核内への幹細胞（一般的に先在性非自己細胞系から得られる）の直接的な移植に焦点を合わせたものであった。これらの方法論は動物モデルにおけるいくつかの希望のもてる結果をもたらしたが、これらの修復は、変性椎間板疾患（ＤＤＤ）又は他の同様な状態を有するヒトにおいてまだ実証されていない。これらの動物モデルにおける有望な結果は、動物に関する研究に用いられた椎間板変性モデルの急性性質に起因する可能性がある。例えば、これらの動物モデルにおける椎間板は、ヒトにおける長期にわたる変性椎間板より良好な血液供給状態で新たに変性させたものである。さらに、これらのモデルに用いられた動物は、二足性であるヒトに対して一般的に四足性であり、したがって、椎間板に対する負荷が異なる。最後に、これらのＤＤＤモデルに用いられた動物は、若く、健康である傾向があり、ＤＤＤについて一般的に臨床で認められるコホートよりはるかに若い患者と年齢が同等である。したがって一般的に、従来の方法論は、幹細胞療法を必要とするヒト患者に認められるものと潜在的に非常に異なる損傷椎間板環境の修復及び再生に基づいている。
【０００７】
椎間板における組織の修復及び再生に関連する問題は、股関節部、膝及び肩（回旋腱板を含む）においても一般的に見られる。これらの組織のそれぞれにおいて、過酷な環境上の側面が損傷又は老化によりしばしば確立され、この場合、無血管移行領域と困難な機械的必要条件とが相まって、低い幹細胞修復の成功のシナリオを構築する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述の１つ又は複数の問題を克服することを対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、１つ若しくは複数の不良な栄養領域又は不利な環境、すなわち無血管領域を有する損傷組織の修復に使用される組成物及び方法を提供する。不良な栄養領域又は不利な環境は、一般的に、組織が限られた血管血液供給を受ける又は血管血液供給を欠く部位、すなわち、本明細書で無血管移行領域又は無血管領域と呼ばれる部位にある。この点における領域又は環境としては、椎間板、股関節部（関節唇）、肩（回旋腱板を含む）及び他の同様な部位が挙げられる。本明細書における実施形態は、無血管領域の修復を必要とする患者からの幹細胞、例えば、間葉幹細胞の入手を含む。次に、入手した細胞を、患者の無血管領域の修復に使用される細胞の能力の最適化を可能にする環境にｉｎ ｖｉｔｒｏで条件づける。十分な数の最適化され、条件づけられた細胞が存在する場合、修復を必要とする無血管領域の標的部位に細胞を入れる。いくつかの実施形態において、該部位への血液の流れ／栄養素の流れを増大させるために血小板若しくは血小板溶解物（一般的に自己由来）及び／又は補給物処理を条件づけ細胞と併用して行う。血小板及び／又は補給物処理の時期は、一般的に条件づけ細胞の挿入の直前、挿入時又は挿入直後であるが、他の時期も考えられる。部位の修復を保証するために条件づけ細胞の挿入又は血小板／血小板溶解物／補給物処理（単数又は複数）のみの繰返しを含む処置を繰り返すことができる。
【００１０】
一実施形態において、それを必要とする患者における損傷椎間板の修復に使用される組成物及び方法を提供する。一態様において、損傷椎間板の修復及び／又は再生に使用される細胞の能力を最適化する条件下での幹細胞の入手及び培養の方法を提供する。他の態様において、損傷椎間板組織の増殖及び再生を最適化するための損傷椎間板の標的部位へのこれらの条件づけ幹細胞の挿入の方法を提供する。他の態様において、損傷椎間板組織への、かつそれを通しての血流を増大させるための硬膜外補給物処理（ｅｐｉｄｕｒａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）と併用した患者体内の標的部位への条件づけ幹細胞の挿入の方法を提供する。さらに、本発明は、損傷椎間板を修復及び／又は再生することができる細胞の選択に専用の幹細胞の培養のための改良組成物を提供する。個別に、かつ／又は併用で、本発明の方法及び組成物は、（他の従来の技術と比べて）椎間板の修復及び再生の分野の驚くべき、かつ予期しない発展をもたらす。
【００１１】
他の実施形態において、幹細胞（例えば、間葉幹細胞）は、椎間板の修復を必要とする患者から採取し、不良な栄養環境、他の点で不利な環境（例えば、ｐＨが健常な細胞の増殖を促進することに通常調和する範囲内にない環境）、低酸素環境及び／又は損傷椎間板内の高い二酸化炭素レベルを示す環境に耐えることができる細胞を選択し、増殖することに基づく条件下で培養する。次いで、これらの条件づけ細胞を椎間板輪後部（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｄｉｓｃ ａｎｎｕｌｕｓ）に移植する（髄核における移植を一般的に必要とする従来の方法論と比較）。場合によって、次いで椎間板輪後部への血流を促進するために硬膜外補給（増殖因子、サイトカイン、インテグリン、カドヘリン等）により患者を治療する。実施形態の各態様は、椎間板環境が移植細胞への栄養素及び酸素の増加をもたらすことを促進することに加えて、損傷椎間板環境において生存及び増殖することができる幹細胞も増加させ、選択する。さらに、損傷椎間板内の幹細胞の生存及び増殖を促進するために、自己血小板又は血小板溶解物組成物を選択される幹細胞と別個に又は併用投与することができる。別個又は併用で、本明細書におけるアプローチは、自己幹細胞に基づく椎間板修復の修復過程及び結果を向上させる。
【００１２】
いくつかの事例において、椎間板の修復を必要とする患者から採取した幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで１〜１０％酸素中で、より一般的には３〜７％酸素中で１〜２８日間の期間中培養する。これは、患者の体内移植の前に細胞を培養する時間の約１／３からすべてに相当しうる。生存細胞、すなわち、低酸素条件下で増殖することができる細胞を生存能力について選択し、損傷椎間板内への移植のための十分な細胞を入手するためにこれらの低酸素条件下で増殖させる。選択される細胞は、損傷椎間板の酸素欠乏環境中で生存し、増殖し、最終的に修復する高い能力を有する。
【００１３】
他の事例において、椎間板の修復を必要とする患者から採取した幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで高濃度二酸化炭素中で、より一般的には２〜１０％二酸化炭素中で１〜２８日間の期間にわたり培養する。これは、患者の体内移植の前に細胞を培養する時間の約１／３からすべてに相当しうる。生存細胞、すなわち、高二酸化炭素条件下で増殖することができる細胞を生存能力について選択し、損傷椎間板内への移植のための十分な細胞を入手するためにこれらの条件下で増殖させる。選択される細胞は、損傷椎間板のより高い二酸化炭素条件の環境中で生存し、増殖し、最終的に修復する高い能力を有する。この同じアプローチは、（傷害又は老化による）損傷股関節部及び／又は肩の無血管部位を修復／再生するために用いる幹細胞を選択するのに用いることができる。
【００１４】
他の事例において、椎間板の修復を必要とする患者から採取した幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで低酸素及び高二酸化炭素条件下で培養する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件は、細胞の総培養時間の１／３からすべての期間にわたって維持することができる。選択される細胞は、損傷椎間板で一般的に認められるより低酸素及びより高い二酸化炭素条件下で生存し、増殖し、修復する高い能力を有する。この同じアプローチは、（傷害又は老化による）損傷股関節部及び／又は肩の無血管部位を修復／再生するために用いる幹細胞を選択するのに用いることができる。
【００１５】
他の事例において、椎間板の修復を必要とする患者から採取した幹細胞を栄養不良条件下で培養して、生存能力について選択し、これらの不良な栄養環境中で増殖させる。培養条件は、糖、アミノ酸、脂質、鉱物、タンパク質又は幹細胞の増殖を促進することを目的とする他の物質を添加したダルベッコ変法必須培地（ＤＭＥＭ）から調製した基礎細胞培養培地（又は他の同様な基礎培地）の使用を含む。増殖培地は、ウシ胎児血清、ヒト全血清、多血小板血漿、血小板溶解物等を含んでいても含んでいなくてもよい。しかし、これらの調製物は、低酸素、ｐＨの変化又はある制限された栄養利用性などのヒト変性椎間板の局所環境を模倣するように特別に設計されている。この同じアプローチは、（傷害又は老化による）損傷股関節部（例えば、関節唇）及び／又は肩の無血管部位を修復／再生するために用いる幹細胞を選択するのに用いることができる。
【００１６】
ｐＨ、使用済み培地の使用、標的部位が損傷椎間板に存在する場合に髄核細胞との共培養（それにより、培養細胞の送達の最終的な標的部位に近接して存在する環境因子を供給する）及び類似のものを含む、他の選択条件を用いて採取幹細胞を増殖することができる。いくつかの事例において本明細書で述べた２つ又はそれ以上の選択条件を用いて無血管部位の修復に用いる幹細胞を同定し、増殖させることができることも留意されたい。したがって例えば、不十分な栄養培地及び低酸素条件は、第１の患者に用いる幹細胞を選択するのに用いることができるが、ｐＨ及び二酸化炭素条件は、第２の患者における選択に用いることができる。これは、所定の患者における局所微小環境の実際の測定に基づいていてよい。
【００１７】
さらなる事例において、損傷部位を有する同じ患者から血小板を入手し（採取し）、トロンビン及び塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）で処理する。処理済み血小板は、損傷部位内への移植のために培養され、選択される幹細胞と併用する。血小板の処理は、損傷部位内への移植の前に１日から７日に、特に５日から７日に延長してもよいことに留意されたい。さらに、血小板は、選択される幹細胞の移植の直前、移植時又は移植後に移植することができる。そのような前条件づけ血小板は、損傷部位内の幹細胞の生存及び増殖の促進に有用な無血管領域環境中に標的増殖因子を放出することができる。或いは、又は併用で、増殖因子、サイトカイン、インテグリン等を選択される幹細胞とともに損傷部位内に直接投与することができる。一実施形態において、これらの増殖因子は、硬膜外腔に入るような例えば損傷椎間板の外側の周りに投与する。
【００１８】
本発明のこれら及び様々な他の特徴並びに利点は、以下の詳細な説明を読むこと及び添付の特許請求の範囲を再検討することにより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本明細書で述べた実施形態を用いた椎間板輪後部の血管及び移行血管領域への幹細胞の針による挿入の重ね合わせ経路の軸方向腰部像である。
【図２】図２は、本明細書で示した技術により単層培養中で増殖させたＭＳＣを示す図である。
【図３】図３は、Ｌ５−Ｓ１椎間板（被験体ＭＬ）の椎間板輪後部へのＭＳＣ及び血小板由来ＶＥＧＦ上清の注射位置の例示的な蛍光顕微鏡像である。椎間板輪後部における造影剤の濃度に留意されたい（造影剤の流れを青により強調）。
【図４】図４は、幹細胞移植後に実施した血小板由来ＶＥＧＦ上清の注射により達成された例示的な硬膜外流を示す図である。
【図５】図５は、手技の１ヵ月未満前に撮影したＭＬショートタウ反転回復（ＳＴＩＲ）画像を示す図である。この矢状スライスは、含まれる最大の程度のＬ５−Ｓ１椎間板脱出を示すように選択されている。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．１で、撮像時刻は午後１：０１であった。この画像は、Ｌ５−Ｓ１における０．７ｃｍの椎間板脱出を示している。椎間板中央部で測定されるＬ５−Ｓ１椎間板高さは、０．５ｃｍであり、Ｌ４−Ｌ５では０．７ｃｍと測定される。
【図６】図６は、同じＳＴＩＲパラメーターを用いたＭＬの手技後１ヵ月目の対応する矢状スライスを示す図である。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．１。撮像時刻は午前１１：０１であった。この画像は、Ｌ５−Ｓ１における０．３ｃｍの椎間板脱出を示している。椎間板高さはＬ５−Ｓ１で０．５ｃｍであり、Ｌ４−Ｌ５では０．７ｃｍであることに留意されたい。
【図７】図７は、同じＳＴＩＲパラメーターを用いたＭＬの手技後５ヵ月目の対応する矢状スライスを示す図である。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．３。撮像時刻は午前１０：２３であった。この画像は、Ｌ５−Ｓ１における０．３ｃｍの椎間板脱出を示している。椎間板高さはＬ５−Ｓ１で０．５ｃｍであり、Ｌ４−Ｌ５では０．７ｃｍであることに留意されたい。
【図８】図８は、含まれる最大の程度のＬ４−Ｌ５椎間板脱出部を通るＭＪＭの手技前矢状スライスを示す図である。画像は、午後１２：１５に撮影した。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．１。Ｌ４−Ｌ５椎間板脱出は６ｍｍと測定される。スライスの中央部で測定された椎間板高さは、Ｌ４−Ｌ５＝８ｍｍ、Ｌ５−Ｓ１＝７ｍｍ、Ｓ１−Ｓ２＝５ｍｍであった。
【図９】図９は、同じＳＴＩＲパラメーターを用いたＭＪＭの手技後２ヵ月目の対応する矢状スライスを示す図である。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．１。画像は、午後１２：３５に撮影した。Ｌ４−Ｌ５椎間板脱出は３ｍｍと測定される。椎間板高さは、手技前と同じと測定される：Ｌ４−Ｌ５＝８ｍｍ、Ｌ５−Ｓ１＝７ｍｍ、Ｓ１−Ｓ２＝５ｍｍ。
【図１０】図１０は、ＭＪＭの手技後４．５ヵ月目を示す図である。これは、同じ撮像パラメーターを用いた対応する矢状ＳＴＩＲスライスである。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８３３．３、ＴＥ＝４８．２。画像は、午後１２：２７に撮影した。Ｌ４−Ｌ５椎間板脱出は３ｍｍと測定される。椎間板高さは、手技前と同じと測定される：Ｌ４−Ｌ５＝８ｍｍ、Ｌ５−Ｓ１＝７ｍｍ、Ｓ１−Ｓ２＝５ｍｍ。
【図１１】図１１は、最大の程度のＬ５−Ｓ１椎間板脱出部を通るＨＯの手技前矢状ＳＴＩＲスライスを示す図である。ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．３。画像の時刻は、午前１１：２６であった。Ｌ５−Ｓ１椎間板脱出は、９ｍｍと測定される。椎間板高さの測定：Ｌ４−Ｌ５＝６ｍｍ、Ｌ５−Ｓ１＝８ｍｍ。
【図１２】図１２は、ＨＯの手技後６週目の対応する矢状ＳＴＩＲスライスを示す図である。撮像パラメーターは、ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．３に一定に維持した。画像の時刻は、午前１１：２５であった。Ｌ５−Ｓ１椎間板脱出は、８ｍｍと測定される。椎間板高さの測定：Ｌ４−Ｌ５＝６ｍｍ、Ｌ５−Ｓ１＝８ｍｍ。
【図１３】図１３は、ＨＯの手技後３．５ヵ月目の対応する矢状ＳＴＩＲスライスを示す図である。撮像パラメーターは、ＥＴ＝６、ＴＲ＝４８１６．７、ＴＥ＝４８．３に一定に維持した。画像の時刻は、午後１：１０であった。Ｌ５−Ｓ１椎間板脱出は、９ｍｍと測定される。椎間板高さの測定：Ｌ４−Ｌ５＝６ｍｍ、Ｌ５−Ｓ１＝８ｍｍ。
【図１４】図１４は、椎間板輪後部であった意図した標的より髄核造影に特有の、ＨＯにおける造影剤の流れ（青で強調）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、１つ若しくは複数の不良な栄養領域又は不利な環境、すなわち無血管領域を有する損傷組織の修復に使用される組成物及び方法を提供する。不良な栄養領域又は不利な環境は、一般的に、組織が限られた血管血液供給を受ける又は血管血液供給を欠く部位、すなわち、本明細書で無血管移行領域と呼ばれる部位にある。この点における領域又は環境としては、椎間板、股関節部、肩（回旋腱板を含む）及び他の同様な部位が挙げられる。本明細書における実施形態は、無血管領域の修復を必要とする患者からの幹細胞、例えば、間葉幹細胞の入手を含む。次に、入手した細胞を、患者の無血管領域の修復に使用される細胞の能力の最適化を可能にする環境にｉｎ ｖｉｔｒｏで条件づける。十分な数の最適化され、条件づけられた細胞が存在する場合、修復を必要とする無血管領域の標的部位に細胞を入れる。いくつかの実施形態において、該部位への血液の流れ／栄養素の流れを増大させるために補給物処理を条件づけ細胞と併用して行う。補給物処理の時期は、一般的に条件づけ細胞の挿入の直前、挿入時又は挿入直後であるが、他の時期も考えられる。部位の修復を保証するために条件づけ細胞の挿入又は補給物処理のみの繰返しを含む処置を繰り返すことができる。
【００２１】
本明細書における幹細胞の選択のための無血管領域の条件としては、１〜１０％酸素、２〜１０％二酸化炭素、ｐＨの変化、栄養の変化及び同類のものの組合せが挙げられる。選択される細胞は、補給物、例えば、増殖因子、サイトカイン、インテグリン、カドヘリン及び同類のものと、かつ／又は処理済み自己血小板とともに修復部位に入れることができる。
【００２２】
定義
以下の定義は、本明細書で頻繁に用いる特定の用語の理解を促進するために示すものであり、本開示の範囲を制限することを意味するものでない。
【００２３】
「幹細胞（単数又は複数）」は、本明細書では、自己再生の特性及び潜在力を有する細胞を意味する。間葉幹細胞に関しては、これらの細胞は、多能性であり、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞及び他の同様な細胞に分化する能力を有する。
【００２４】
膨隆は、本明細書では、椎間板の線維輪内への髄核の突出を意味する。
【００２５】
椎間板ヘルニアは、本明細書では、線維輪の境界を越えた髄核の脱出を意味する。
【００２６】
内包性椎間板ヘルニアは、本明細書では、線維輪の境界を越え、後部縦靭帯により閉じ込められている髄核の脱出を意味する。
【００２７】
「患者」は、本明細書では、１つ又は複数の損傷又は老化無血管部位、例えば、損傷椎間板を有する哺乳動物、より一般的にはヒトを意味する。損傷椎間板に関して、損傷は、椎間板ヘルニア、膨隆椎間板、椎間板破壊、椎間板突出、椎間板脱出、椎間板腐骨化及び他の同様な椎間板の病気を含みうる。
【００２８】
「血小板及び血小板溶解物」は、本明細書では同義で用いられ、血小板の溶解により放出された血小板に含まれる天然増殖因子の組合せを含む。これは、化学的手段（すなわちＣａＣｌ２）、浸透圧による手段（蒸留Ｈ２Ｏの使用）、又は凍結／解凍処置により達成することができる。本発明の血小板溶解物は、全血から得ることもでき、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１９８，３５７号に記載の通り調製することができる。
【００２９】
「修復」又は「再生」は、同義で用いられ、標的無血管領域又は無血管領域に隣接する領域内の損傷部位の部分的又は完全な置換を意味する。例えば、椎間板の修復は、椎間板内の組織の部分的又は完全な修復又は置換を含む。修復又は再生は、通常は高齢化した患者における無血管領域の修復又は再生、すなわち、年齢により誘発された領域の損傷の修復も意味しうる。
【００３０】
「環境」は、本明細書では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで細胞に作用又は影響を及ぼす一連のすべての条件を意味する。
【００３１】
「低酸素症又は低酸素」は、本明細書では、環境において１０％以下の酸素を有するｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ状態を意味する。
【００３２】
「補給物」又は補給物処理は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＩＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＦＧＦ、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、ＭＣＰ−１エンドグリン、ＴＧＦ−β、ＣＣＬ２、ＶＥ−カドヘリンを含む増殖因子、サイトカイン、インテグリンを含む。
【００３３】
本発明による実施形態は、損傷した無血管領域、例えば、椎間板の修復及び再生に有用な方法及び組成物を含む。本明細書における実施形態は、不良な栄養及び低酸素条件下での自己幹細胞の採取及び増殖により、無血管領域の修復により高い能力がある細胞が得られるという予期しない所見に基礎を置いている。さらに、条件づけ細胞と自己血小板の移植、並びに損傷部位への血流の促進により、修復の劇的な向上がもたらされる。移植は、１つ又は複数の補給物処理（血小板を含む又は含まない）も含みうる。最後に、本明細書における実施形態は、修復及び／又は再生をさらに促進するために損傷部位内の最適化部位へのこれらの条件づけ細胞及び補助物質の投与を含む。
【００３４】
幹細胞
間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、再生医療における治療薬として大いに有望である。Ａｌｈａｄｌａｑ， Ａ．及びＪ．Ｊ． Ｍａｏ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ、２００４年、１３巻（４号）、４３６〜４８頁。Ｂａｒｒｙ， Ｆ．Ｐ．、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｊｏｉｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ、２００３年、２４９巻、８６〜９６頁； ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ９６〜１０２、１７０〜４、２３９〜４１。Ｂｒｕｄｅｒ， Ｓ．Ｐ．、Ｄ．Ｊ． Ｆｉｎｋ及びＡ．Ｉ． Ｃａｐｌａｎ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ｂｏｎｅ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９４年、１９９４年、５６巻（３号）、２８３〜９４頁。Ｃｈａ， Ｊ．及びＶ． Ｆａｌａｎｇａ、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ、Ｃｌｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２００７年、２５巻（１号）、７３〜８頁。Ｇａｎｇｊｉ， Ｖ．、Ｍ． Ｔｏｕｎｇｏｕｚ及びＪ． Ｐ． Ｈａｕｚｅｕｒ、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｍｏｒａｌ ｈｅａｄ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ、２００５年、５巻（４号）、４３７〜４２頁。これらの成人幹細胞は、体内の多くの源から容易に分離することができる。Ａｌｈａｄｌａｑ， Ａ．及びＪ．Ｊ． Ｍａｏ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ、２００４年、１３巻（４号）、４３６〜４８頁。さらに、それらは、多くの動物試験において筋肉、骨、軟骨、神経、腱及び様々な内部器官細胞に分化する能力を示した。椎間板の変性及び病変は、重大な身体障害及び相当額の医療費の主な原因である。Ｄａｇｅｎａｉｓ， Ｓ．、Ｊ． Ｃａｒｏ及びＳ． Ｈａｌｄｅｒｍａｎ、Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｌｏｗ ｂａｃｋ ｐａｉｎ ｃｏｓｔ ｏｆ ｉｌｌｎｅｓｓ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｌｙ、Ｓｐｉｎｅ Ｊ、２００８年、８巻（１号）、８〜２０頁。椎間板切開術、固定術及び椎間板置換術などの外科的治療が臨床診療で用いられ、重大な病的状態を伴う可能性が大きい。ｄｅ Ｋｌｅｕｖｅｒ， Ｍ．、Ｆ．Ｃ． Ｏｎｅｒ及びＷ．Ｃ． Ｊａｃｏｂｓ、Ｔｏｔａｌ ｄｉｓｃ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｏｗ ｂａｃｋ ｐａｉｎ： ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｎｄ ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ、Ｅｕｒ Ｓｐｉｎｅ Ｊ、２００３年、１２巻（２号）、１０８〜１６頁。Ｇｏｔｆｒｙｄ， Ａ．及びＯ． Ａｖａｎｚｉ、Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｌｕｍｂｅｒ ｄｉｓｃ ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｔ Ｏｒｔｈｏｐ、２００８年。Ｋａｔｏｎｉｓ， Ｐ．ら、Ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｏｒａｃｉｃ ａｎｄ ｌｕｍｂａｒ ｓｐｉｎｅ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ １８ ｃａｓｅｓ、Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ、２００７年、４５４巻、１１４〜９頁。結果として、外科的修正又は除去ではなく、椎間板（ＩＶＤ）を修復する能力は、魅力的な治療選択肢である。Ｓａｋａｉらは、ＭＳＣが模擬椎間板変性の穿刺モデルを用いた動物試験において椎間板修復の能力があることを示した。Ｓａｋａｉ， Ｄ．ら、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｉｎ ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００６年、２７巻（３号）、３３５〜３４５頁。Ｓａｋａｉ， Ｄ．ら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｔｏ ａ ｒａｂｂｉｔ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｃ ｍｏｄｅｌ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｄｉｓｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｓｐｉｎｅ、２００５年、３０巻（２１号）、２３７９〜８７頁。Ｓａｋａｉ， Ｄ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｉｎ Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｌ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ： ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｄｉｓｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００３年、２４巻（２０号）、３５３１〜４１頁。発明者らは、動物ＩＶＤモデルとヒトＩＶＤモデルとの間に多くの生理学的差異があることを認識した。これらは、ヒトにおける二足力学と比べてヒツジ、ブタ及びマウス動物における四足により生じた異なる力を含む。さらに、多くの動物研究者らによって用いられている変性椎間板疾患（ＤＤＤ）のよく知られている穿刺モデルは、急性損傷椎間板の科学的同等物を生じさせる。ヒトＤＤＤは、患者が内科的又は外科的治療を求める前にしばしば数十年間存在する。本明細書における実施形態（実施例参照）は、ヒト被験体の椎間板輪後部にＶＥＧＦ強化血小板由来上清とともに経皮的に挿入したＭＳＣは、有意な椎間板修復をもたらすことを示している。椎間板輪後部に細胞を入れる決定は、髄核内の明確な無血管、低密度栄養環境と比べてこの部位の血管化が高いことに部分的に基づくものであった。
【００３５】
本発明の実施形態は、無血管部位の修復を必要とする患者からの幹細胞の採取を含む。本発明による幹細胞は、定義の項で上述した通りである。いくつかの実施形態において、幹細胞は、間葉幹細胞、すなわち、いくつかある細胞型の中で特に、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞及び膵島細胞に分化することができる多能性細胞である。本発明の目的のために、他の幹細胞型も用いることができ、本発明の範囲内にあるが、多くの実施形態を間葉幹細胞に関して述べることに留意されたい。
【００３６】
本発明の態様による幹細胞の採取は、全体として参照により組み込まれる米国特許出願Ｓ／Ｎ ＰＣＴ／ｕｓ０８／６８２０２に記載されているものを含む。さらに、米国特許第５，４８６，３５９号、第６，３８７，３６７号及び第５，１９７，９８５号に記載されている方法及び組成物は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
より詳細には、間葉幹細胞は、骨髄、末梢血、脂肪組織及び他の同様な源に存在する多能性幹細胞である。ＭＳＣは、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞及びベータ膵島細胞を含む多くの細胞型に分化する能力を有する。
【００３８】
本発明の源ＭＳＣは、回復／置換療法（又は適切なドナー）を必要とする患者の腸骨稜（或いはＩＶＤ、骨膜、滑液又は椎体若しくは椎弓根（ｐｅｄｉｃｌｅ）などの他の源）から一般的に採取し、そのような患者は、本明細書で「必要とする患者又はそれを必要とする患者」と呼ぶ（脂肪組織、滑膜組織及び結合組織などの他の源が最近同定され、本発明の範囲内のＭＳＣ源ともみなされることに留意されたい）。一実施形態において、約１０〜１００ｃｃの骨髄を採取し、Ｃｅｎｔｅｎｏへの米国特許出願６０／７６１，４４１に記載されている方法を用いて又はＣａｐｌａｎらへの米国特許第５，４８６，３５９号に記載されているようにプラスチックへの付着により「分離する」。これらの参考文献のそれぞれは、すべての目的のためにそれらの全体として本明細書に組み込まれている。
【００３９】
以下でより詳細に述べるように、本発明の実施形態は、ある程度のレベル又は量の血小板も必要とすることがある。したがって、本発明は、血小板又は血小板溶解技法を用いるために適切な有核細胞数を得ることを可能にするための標準的骨髄吸引手順の変更を組み込んでいる。さらに、これらの血小板は、全血から得ることができる。大多数の公表研究が再び健常なヒト又は動物において実施されているので、様々な疾患状態を有するヒトへのこの技術の適用は、全く試験されていない。各側について３つのわずか２〜３ｃｃの骨髄分割試料（合計６つの分割試料）を吸引する変法を用いることにより、２０％血小板溶解物中で増殖させるのに成功した必要な有核細胞の収量が得られたことに留意されたい。
【００４０】
本明細書で用いる血小板及び血小板溶解物は、全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｕｃｅｔの方法（Ｄｏｕｃｅｔ、Ｅｒｎｏｕら、２００５年、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０５巻（２号）、２８８〜３６頁）を用いて骨髄採取物から調製する。一般的な溶解物は、約数千万個から数千億個の血小板を含む。Ｍａｒｔｉｎｅａｕら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４年２５巻（１８号）、４４８９〜５０３頁（その全体として参照により本明細書に組み込まれる）により示されたように、血小板溶解物は、一貫したＭＳＣの増殖を促進するのに必要な増殖因子を本質的に含む。一般的な実施形態において、血小板溶解物及びＭＳＣは、自己由来であり、ＭＳＣの有効かつ一貫した増殖に有用な量で存在する（以下でより十分に述べる）。特に、ＴＧＦ−ベータなどの増殖因子のレベルは、ＭＳＣを増殖するのに一般的に用いられるものより血小板溶解物中ではるかに低いが、血小板溶解物中に含まれている低レベルの増殖因子のすべてを一緒に用いる場合、著しい相乗効果が存在すると考えられていることに留意されたい。
【００４１】
幹細胞の選択（選択圧）
採取した幹細胞は、幹細胞（一般的に間葉幹細胞）及び最終的に修復を必要とする部位、例えば、修復を必要とする椎間板に認められる条件と同様な環境条件下で生存でき、増殖する幹細胞を選択するために培養する。選択圧は、椎間板修復に関連するので、以下でより詳細に述べるが、同様な条件は、股関節部、肩及び類似のものについて存在し、確認される。
【００４２】
Ｕｒｂａｎら、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ Ｄｉｓｃ、Ｓｐｉｎｅ、２００４年、２９巻（２３号）、２７００〜９頁（その全体として参照により本明細書に組み込まれる）に述べられているように、損傷を受け、変性している椎間板は、不良な栄養並びに酸素環境をもたらす。この環境は、健常椎間板の環境と異なる。実際、損傷椎間板における移植間葉幹細胞の生存率を測定するために実施された試験で、不十分な細胞生存率結果が示され、少数の細胞が椎間板の修復の促進に必要な必要数の細胞を供給するように増殖することができるにすぎない（Ｗｕｅｒｔｚら、Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ、Ｓｐｉｎｅ、２００８年、３３巻（１７号）、１８４３〜９頁、その全体として参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４３】
より詳細には、椎間板修復又は回復を必要とする患者から採取した幹細胞を培養条件下におく。一実施形態において、培地は、ＤＭＥＭ又は他の同様な培地から調製される基礎細胞培養培地である。培地には糖、アミノ酸、脂質、鉱物、タンパク質又は幹細胞の増殖を促進することを目的とする他の同様な物質を添加することができる。
【００４４】
さらに、本明細書における実施形態は、採取され、増殖しつつある間葉幹細胞を損傷椎間板の環境を模擬する様々な大気条件下で培養することを含みうる。一実施形態において、採取された幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで１〜１５％酸素中で培養する。いくつかの例において、採取された幹細胞を３〜１０％酸素中で培養し、他の例において、採取された幹細胞を３〜７％酸素中で培養する。これらの低酸素条件は、典型的な損傷椎間板環境に存在する低酸素条件を再現するものである。低酸素条件は、幹細胞増殖期の一部又は全期間中に存在しうるが、一般的に当細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する時間の少なくとも１／３の時間存在する。選択は、細胞を培養するときに起こり、生存し、最終的に増殖することができる生存細胞は、低酸素環境を有する椎間板内に移植されたときに利点を有する。
【００４５】
他の実施形態において、採取された幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで高二酸化炭素条件下、一般的に２〜１０％二酸化炭素中で培養する。採取された幹細胞は、条件が２〜１０％二酸化炭素及び３〜１０％酸素を含む、高二酸化炭素及び低酸素環境の組合せ環境中でさらに培養することができる。上記のように、選択は、細胞を培養するときに起こり、生存し、最終的に増殖することができる生存細胞は、高二酸化炭素環境又は低酸素環境と組み合わされた高二酸化炭素環境を有する椎間板内に移植されたときに利点を有する。
【００４６】
他の実施形態において、採取された幹細胞を、採取され、培養された髄核細胞（ＮＰ細胞）又は線維輪細胞（ＡＦ細胞）と一緒に培養し、増殖させる。幹細胞と共培養するための髄核（ＮＰ）細胞は、針吸引又は他の同様な技術により椎間板修復を必要とする患者から採取することができる。これらのＮＰ細胞又はＡＦ細胞は、自己由来又は非自己由来であってよい。一般的実施形態において、約１０３〜１０９個のＮＰ又はＡＦ細胞を採取された幹細胞と共培養し、ＮＰ細胞及び／又はＡＦ細胞放出因子及び廃棄物に反応する幹細胞の選択に有用な環境を提供させる。共培養条件は、不良な栄養環境、低酸素、高二酸化炭素及び本明細書で述べた他の開示された実施形態を含みうる。いくつかの実施形態において、ＮＰ細胞を幹細胞と別個のｉｎ ｖｉｔｒｏフラスコ（又は同様な容器）中で培養する。次いで、ＮＰ細胞培養からの使用済み培地を、幹細胞の培養時の上記の条件の培地と組み合わせることができ、或いはそのような条件下で生存能を維持し、最終的に増殖することができる幹細胞を増殖し、選択するために専ら用いることができる。
【００４７】
他の実施形態において、採取された幹細胞を、損傷椎間板で認められるのと類似の修正ｐＨ条件下で培養し、増殖させる。例えば、（本明細書で述べたような）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培地は、６．６〜７．０、より一般的に６．７〜６．９のｐＨを有するように修正することができる。修正ｐＨは、本明細書で述べた培養条件のいずれかと組み合わせて、椎間板修復及び再生に用いる幹細胞の選択を促進することができる。
【００４８】
他の実施形態において、採取された幹細胞を損傷椎間板で認められるのと類似の修正オスモル濃度条件下で培養し、増殖させる。例えば、（本明細書で述べたような）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培地は、３５０〜６００ｍＯｓｍ、より一般的に４５０〜５００ｍＯｓｍのオスモル濃度を有するように修正することができる。修正オスモル濃度は、本明細書で述べた培養条件のいずれかと組み合わせて、椎間板修復及び再生に用いる幹細胞の選択を促進することができる。
【００４９】
他の実施形態において、１つ又は複数の増殖因子を含めることにより、１つ又は複数の選択条件下の幹細胞の生存及び増殖を修正することができる。これらの例において、選択下の細胞を、それら及び他の同様な因子の混合物を含む、ＴＧＦ−ベータ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ及び／又はＨＩＦ−１アルファの存在下で培養する。
【００５０】
上記の幹細胞培養に基づく実施形態のそれぞれについて、条件（単数又は複数）を細胞標準培養環境に徐々に組み込むことができることに留意されたい。例えば、採取された幹細胞を最初に１又は２継代にわたって１０％酸素中で培養し、次いで、１又は２継代にわたって９％酸素条件に移し、標的低酸素条件が得られるまで漸減レベルの酸素中で培養することができる。この手順のもとでは、細胞を損傷椎間板に存在する環境に徐々に適応させる。
【００５１】
他の無血管領域の処置についても本発明の範囲内にあると想定されるが、以下の処理手順は、損傷椎間板の治療に関連して述べる。
【００５２】
損傷椎間板の治療
上で述べた損傷椎間板モディファイアの少なくとも１つにより選択された幹細胞は、患者の損傷椎間板内への移植のための十分な数の細胞が存在するまで増殖させる。一般的な実施形態において、約１０５〜１０９個の選択される間葉幹細胞が損傷椎間板内への移植に必要である。
【００５３】
培養細胞をＰＢＳ又は他の同様な緩衝液を用いて洗浄して、患者の体内への移植を意図しない物質、すなわち、培地成分、廃棄物等を含まない細胞集団を得る。幹細胞をＮＰ細胞と共培養する場合、ＮＰ細胞集団は、細胞選別技術又はアフィニティークロマトグラフィーにより除去することはできるが、洗浄済み幹細胞は、ＮＰ細胞を含みうる。幹細胞は、今やそれを必要とする患者への移植の準備が整っている。
【００５４】
一実施形態において、洗浄済み幹細胞を損傷椎間板の後部輪内に直接移植する。従来の方法論が髄核内への細胞の移植を示している通り、これは、幹細胞の移植の予期しない位置である。細胞は、経皮的ｘ線ガイド又は外科的ＩＶＤアクセスによるものを含む当技術分野で公知の技術により損傷椎間板の後部輪内に移植する。１４〜１８０日の期間が治療間で一般的であるが、損傷椎間板の修復手技に細胞移植の１回又は複数回の反復を用いることができる。
【００５５】
他の実施形態において、治療を必要とする患者からの自己血小板をトロンビン及びＣａＣｌ２で約１〜７日間前処理する。この処理は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を選択的に発現するようにこれらの血小板を前処理するものである。いくつかの実施形態において、採取された血小板を約２８．５６Ｕ／ｍｌトロンビン及び約２．８６ｍｇ／ｍｌＣａＣｌ２で前処理する。さらなる実施形態において、それを必要とする患者からの自己血小板をトロンビン、カルシウム又はその塩、トロンボキサンＡ２、アデノシン三リン酸及びアリキドネート（ａｒｉｃｈｉｄｏｎａｔｅ）の組合せで前処理する。上記のように、前処理は、それを必要とする患者への移植１〜数日前であってよい。次いで、前処理済み自己血小板を前述の本発明の選択される条件づけ幹細胞の移植前、移植時又は移植後に移植する。血小板は、移植幹細胞と一般的に同じ位置に移植する。
【００５６】
他の実施形態において、本発明の採取され選択された幹細胞は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＩＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＴＧＦ−β、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、Ｔｉｅ２、ＰＤＧＦ、ＣＣＬ２、アルファ−Ｖベータ−５、アルファ−５ベータ−１、ＶＥ−カドヘリン、ＰＥＣＡＭ−１、プラスミノーゲン活性化因子及び酸化窒素シンターゼを含む、増殖因子、サイトカイン、インテグリン、カドヘリン又は新脈管形成、脈管形成又は動脈形成（ａｅｒｔｅｒｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進することが公知の薬物を含む１つ若しくは複数の補給物又は補給物処理とともに移植する。代替の実施形態において、それを必要とする患者における移植に用いる幹細胞は、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ又は幹細胞及び／又は間葉幹細胞の幹細胞性若しくは増殖を促進することを目的とする他の同様な増殖因子を含む増殖因子の組合せとともに共移植する。いくつかの実施形態において、自己血小板又は血小板溶解物を前述の補給物と組み合わせて移植することができる。
【００５７】
図１に重畳針穿刺による軸方向腰椎像を示す本発明の一実施形態の有用性を示す。本明細書で述べた実施形態を用いた条件づけ幹細胞を椎間板輪後部の血管及び移行血管領域に入れた。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）経皮的に移植した自己間葉幹細胞
方法：
被験体：
３例の患者被験体をＩＲＢ（Ｓｐｉｎａｌ Ｉｎｊｕｒｙ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔｍｉｎｓｔｅｒ、ＣＯ）承認済みＭＳＣ移植プロトコールに参加する意思に基づいて選択した。各被験体は、ＩＲＢ承認済み同意書に署名した。被験体は、以下の組み入れ／除外基準に基づいて選択した。
【００５９】
組み入れ基準：
１．年齢１８〜６５歳
２．保存的管理の失敗
３．椎間板突出又は内包性椎間板脱出（靭帯下）を伴う腰椎変性椎間板疾患
４．椎間板突出／神経を治療すべき疼痛発生源として確認した選択的神経根ブロック（主要な疼痛愁訴の＞７５％軽減）又は椎間板をＰ２疼痛発生源として確認した椎間板造影
５．Ｔ２加重ＭＲＩ画像上の脱水を伴う又は伴わない正常椎間板高の少なくとも７５％
６．外科的選択肢を求める意思がない
除外基準：
１．活動性炎症又は結合組織疾患（すなわち、狼瘡、線維筋痛、ＲＡ）
２．潜在的に症状を伴う活動性非矯正内分泌障害（すなわち、甲状腺機能低下、糖尿病）
３．潜在的に症状を伴う活動性神経障害（すなわち、末梢神経障害、多発性硬化症）
４．重度心疾患
５．薬剤の使用を必要とする肺疾患
６．呼吸困難又は自己血液製剤の輸液に対する他の反応の既往歴
手技前データ収集：
１．未知の医学的状態を除外するためにＭＳＣ移植の３ヵ月以内にＣＢＣ及び血液化学を得る。
【００６０】
２．手技前ＭＲＩ
３．手技前アウトカム測定
間葉幹細胞（ＭＳＣ）の単離及び増殖：
骨髄採取処置の前の１週間にわたり患者がコルチコステロイド又はＮＳＡＩＤを服用することを制限した。骨髄採取処置と同時にヘパリン加（Ａｂｒａｘｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）ＩＶ静脈血を採取して血小板溶解物（ＰＬ）を得るために用いた。血小板溶解物は、２００ｇで遠心分離することにより、赤血球（ＲＢＣ）から多血小板血漿（ＰＲＰ）を分離して調製した。ＰＲＰ容積を分割し、ＰＬを生成するために−２０℃で保存した。血小板溶解物を細胞培養培地に１０〜２０％で添加した。
【００６１】
血小板由来のＶＥＧＦに富む上清もＭａｒｔｉｎｅａｕによって記載された方法に基づいて調製した（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ， Ｉ．、Ｅ． Ｌａｃｏｓｔｅ及びＧ． Ｇａｇｎｏｎ、Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ：ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４年、２５巻（１８号）、４４８９〜５０２頁）。上記と同じＰＲＰ単離工程を用いて、ＰＲＰを抜き出し、分割量を２８．５６Ｕ／ｍＬのヒトトロンビン（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ）及び２．８５ｍｇ／ｍＬの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｇｅｎｔ）で３７℃及び５％ＣＯ２で６日間活性化した。活性化ＰＲＰ試料を３，０００ｒｐｍで６分間遠心分離し、上清を抜き出し、−８０℃で保存した。これは、後に増殖ＭＳＣ培養と混合する注入液として、並びに硬膜外注射により送達する補給物注射用に用いた。
【００６２】
全ＩＶ血採取と同時に、患者を手術室（ＯＲ）テーブル上に腹臥位とし、採取すべき部位を１％リドカインにより麻酔し、滅菌済みディスポーザブルトロカールを用いて、右ＰＳＩＳ部から１０ｃｃの骨髄血を、左ＰＳＩＳ部から１０ｃｃをヘパリン処理注射器に採取した。患者が局所麻酔により容易にコントロールされなかった痛みを骨髄採取中に報告した場合、仙骨硬膜外麻酔薬のみを加えた。
【００６３】
全骨髄を２００ｇで４〜６分間遠心分離して、ＲＢＣから有核細胞を分離した。有核細胞を除去し、別個の管に入れた。試料を１０００ｇで６分間遠心分離し、ペレットとした。有核細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＧｉｂＣｏ）で１回洗浄し、計数し、次いで、１０〜２０％ＰＬ、５ｕｇ／ｍＬドキシシリン（Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌａｂｓ）及び２ＩＵ／ｍＬヘパリン（Ａｂｒａｘｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含むダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧｉｂＣｏ）に再懸濁した。有核細胞を組織培養フラスコに１×１０６細胞／ｃｍ２で播種した。培養を加湿環境中で３７℃／５％ＣＯ２／５％Ｏ２でインキュベートした。４８〜７２時間後に培地を交換し、大部分の非付着細胞集団を除去した。ＭＳＣコロニーが６〜１２日後に発生し、コロニー形成ＭＳＣのみが脱離するように動物由来原料不使用トリプシン様酵素（ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ、ＧｉｂＣｏ）を用いて採取した。ＭＳＣを増殖するために、それらを１０〜２０％ＰＬ、５ｕｇ／ｍＬドキシシリン及び２ＩＵ／ｍＬヘパリンを含むアルファ修正イーグル培地（ＡＭＥＭ、ＧｉｂＣｏ）中で６〜１２，０００細胞／ｃｍ２の密度で平板培養し、３７℃／５％ＣＯ２／５％Ｏ２で集密状態近くまで増殖させた。骨髄由来の初代細胞を継代０と呼び、ＭＳＣの各後続の継代培養をさらなる１代継代とみなした。この単層細胞培養法により増殖させたＭＳＣの形態の例については図２を参照のこと。ＭＳＣを第２〜第５継代まで継代培養した後、それらを採取し、洗浄し、注射用活性化ＰＲＰに懸濁した。
【００６４】
経皮的移植手技
被験体をＸ線テーブル上で腹臥位とし、滅菌手袋及びドレープによりベタジンスワブを用いて準備した。ＡＰ蛍光透視像（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｉｓｏ−Ｃ）を同側斜位により得た。頭側−尾側傾斜を調節することにより、注射すべき標的レベルの前終板を「オンエンド」で視覚化した。無菌法を用いて、２２ゲージ７インチｑｕｉｎｋｅ針を二面蛍光透視下で治療すべきレベルの腰椎小関節面関節（ｌｕｍｂｅｒ ｆａｃｅｔ ｊｏｉｎｔ）の上関節突起に誘導し、小関節面を越えて、椎間板後部に進めた。椎間板アクセスが得られたならば、側面投影下で、近接のために治療前ＭＲＩ撮像を用いて、椎間板突出の解剖学的位置にできる限り近い輪後部（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｎｎｕｌｕｓ）内に造影剤の流れ（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ ３００ｍｇ／ｍｌ−ＮＤＣ０４０７−１４１３−５１ ＰＢＳにより５０％希釈）を最大化するように針を位置決めした（図３参照）。血小板由来ＶＥＧＦ上清中で培養増殖させた自己ＭＳＣを注射し、針を抜去した。
【００６５】
ＭＳＣ移植後、１週目及び２週目に被験体は標的レベルにおけるＶＥＧＦ由来上清を用いて実施した追加の経椎間孔（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｉｎａｌ）硬膜外処置のために戻った。硬膜外処置は、同じ製剤を用いて実施した。硬膜外アクセスは、二面蛍光透視下で操作し、注射する標的レベルの椎弓根下（ｓｕｂｐｅｄｉｃｕｌａｒ）陥凹に向けて誘導した２５ゲージ３．５インチｑｕｉｎｃｅ針を用いて得た。椎弓根（ｐｅｄｉｃｌｅ）の上方及び下に及ぶ良好な硬膜外色素流が視覚化されたならば、ＶＥＧＦ由来上清及び４％リドカインを注射し、針を抜去した（図４参照）。術後治療プロトコールは、理学療法における又は在宅での４週間にわたる週３回の腰椎牽引からなっていた。
【００６６】
撮像及び患者フォローアップ
ＧＥ ３．０Ｔｅｓｌａ Ｅｘｃｉｔｅ ＨＤを用いて腰椎を撮像した。撮像シーケンスは、矢状ショートタウ反転回復（ＳＴＩＲ）、矢状ファストグラジェントリコールエコー（ＦＧＲＥ）及びグラジェントリコールエコーファストスピン（ＧＲＥ−ＦＳ）を含むものであった。画像を観察し、Ｅ−Ｆｉｌｍ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．５．３（Ｍｅｒｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で測定した。マッチングＴＲ／ＴＥ及びマッチング撮像面を用いた矢状ショートタウ反転回復（ＳＴＩＲ）及びグラジェントリコールエコー（ＧＲＥ）ファストスピン画像を用いた。これは、同じ患者における連続画像の解釈の誤りの可能性を減らすために実施した。日周性の影響を低減するために、撮像センターにできる限り同じ時刻に連続撮像を実施するように指示した。
【００６７】
機能及び症状に関するフォローアップ質問を電話により開始し、患者から回答を得た。腰痛に関する修正ＶＡＳスコアを取得し、「機能評価指数（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ）」（ＦＲＩ）も得た。この質問は、患者の機能に焦点を合わせたものである（Ｆｅｉｓｅ， Ｒ．Ｊ．及びＪ． Ｍｉｃｈａｅｌ Ｍｅｎｋｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒａｔｉｎｇ ｉｎｄｅｘ： ａ ｎｅｗ ｖａｌｉｄ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ、Ｓｐｉｎｅ、２００１年、２６巻（１号）、７８〜８６頁； ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ８７）。診察所来院も術後検査に用いた。これらは、以下の間隔で開始した。
【００６８】
１．手技後６週目
２．手技後１２週目
結果：
登録された３例の被験体の病歴及びアウトカムを以下に述べる。
【００６９】
患者１：
ＨＯは、１９歳の白人女性で、持ち上げ（ｌｉｆｔｉｎｇ）外傷及び女性の選択したスポーツに二次的であると考えられた腰痛の７年の病歴を有する大学のスポーツ選手であった。女性は、インターベンショナル疼痛管理医師による評価及び治療を含む広範な保存的療法を提示の前に４年間受けた。腰椎椎間関節は、関節内注射に対する陰性反応により疼痛発生源として除外された。ＭＲＩは、右側が悪い、両Ｓ１神経根に隣接するＬ５−Ｓ１椎間板突出を示した。椎間板造影により、Ｌ５−Ｓ１椎間板の疼痛の一致した再現を伴う症候性の輪後部の裂傷が明らかになった。手技の前に被験体は、可変性の重症度の一定の疼痛と、著しい機能の制限をもたらす身体活動に伴う右足のＳ１分布におけるしびれ及び刺痛感を述べた。
【００７０】
被験体は、１２週間を通して最大７５％の改善を報告した。手技後６ヵ月目に、被験体は、報告された修正ＶＡＳ疼痛スコア及び機能評価指数の変化をほとんど示さなかった。治療後ＭＲＩ撮像結果の変化の対応する欠如が認められた。最大突出サイズの１ｍｍの減少が６週目に認められたが、これは、３．５ヵ月目に手技前のサイズに戻った。すべての椎間板高測定値は、すべての撮像セッションにわたって同じままであり、撮影されたすべての画像の最大時間間隔は、１時間４５分であった。ＨＯに関する結果を図１１、１２及び１３に示す。
【００７１】
患者２：
ＭＪＭは、提示の前に腰痛の１５年の病歴を有する３５歳の白人男性であった。男性は、保存的療法の失敗及び活動に起因する重度の疼痛エピソードの増加しつつある頻度を報告した。ＭＲＩにより、腰椎化Ｓ１−Ｓ２セグメント、Ｌ５−Ｓ１における中等度の椎間関節侵食及び中等度の椎間孔狭窄を伴う広範囲椎間板膨隆が明らかになった。さらに、Ｌ４−Ｌ５における左より大きい右の後部内包性突出が存在していた。理学的検査では活動性神経根障害は示されなかったが、患者は悪化を伴う間欠性根症状を報告した。保存的管理の失敗の後に手術が勧告されたが、辞退した。Ｌ４−Ｌ５椎間板をこの治療の焦点とし、脱水Ｌ５−Ｓ１椎間板を対照とした。
【００７２】
手技後６ヵ月目に、患者は、修正ＶＡＳの３から０への改善と疼痛の頻度の８０％以上の低下を示した（表１参照）。この患者のＦＲＩスコアは、６０％以上増加し、男性は全般的な症状の５０％の改善を報告した。Ｌ４−Ｌ５椎間板膨隆矢状ＳＴＩＲ画像は、術前ＭＲ画像におけるその最大程度の６ｍｍと測定される（図８参照）。２ヵ月及び４．５ヵ月フォローアップフィルム（対応する画像シーケンス及びスライス−図９及び１０参照）において、Ｌ４−Ｌ５膨隆は３ｍｍに減少したことが認められ、Ｌ４〜Ｓ２椎間板のいずれにおいても椎間板高の変化は測定されなかった。画像を得た時刻は、２０分以下の変動であった。
【００７３】
患者３：
ＭＬは、軍隊の訓練演習に伴う外傷性腰部損傷を有する２４歳の白人女性であった。提示の時点で女性は３年間症候性であった。女性の訴えは、片脚及び時として両脚への電流が走るような痛み、長時間の座位又は立位での腰痛、並びに屈伸又はかがみによる疼痛からなっていた。女性は、理学療法からなる保存的管理を失敗した。手技前のＭＲＩは、椎間板高の減少を示したが、Ｌ５−Ｓ１椎間板におけるいくぶん保存されたＴ２シグナルを示した（図５参照）。この椎間板は、後縦靭帯により含まれていた０．７ｃｍの突出も有していた。輪後部は崩壊し、髄核から後縦靭帯までの高強度領域が存在していた。Ｌ４−Ｌ５椎間板は、より低いＴ２シグナルを有し、脱水されていたが、椎間板高の保存を示した。このレベルでの突出は０．４ｃｍと測定され、椎間板の下中央部分に高強度領域が認められた。病歴、検査及びＭＲＩ所見に基づいて、Ｌ５及びＳ１における間欠性の横断（ｔｒａｖｅｒｓｉｎｇ）神経根刺激は、Ｌ４−Ｌ５及びＬ５−Ｓ１椎間板レベルにあると推定された。椎間板造影を実施したところ、両方が線維輪の裂傷を伴うＬ４−Ｌ５及びＬ５−Ｓ１における低圧調和的（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ）疼痛（Ｐ２）が示された。ＭＳＣ注射によりＬ５−Ｓ１椎間板のみを治療する決定を下し、Ｌ４−Ｌ５を無処置対照とした。
【００７４】
手技後６ヵ月目（表１参照）にＭＬは、腰部修正ＶＡＳ（１〜１０スケール）の約４０％の改善と疼痛の頻度の６０％以上の低下を報告した。機能は、ＦＲＩにより測定したとき７０％以上改善した。女性は、６０％の症状の改善を自己報告した。女性の手技後の腰椎ＭＲＩ撮像で、Ｌ５−Ｓ１椎間板突出のサイズが手技前の０．７ｃｍから手技後１ヵ月目の０．３ｃｍに、手技後５ヵ月目の０．４ｃｍに減少したことが示された（図６及び７）。さらに、椎間板輪後部のＨＩＺ部位のサイズは、両フォローアップフィルムで減少していた。画像取得の時間の差は、１．５時間以下であった。
【００７５】
表１：腰部修正ＶＡＳ及び頻度に関する手技前及び手技後６ヵ月目の報告されたアウトカム。１．０の頻度は、一定の疼痛に等しい。機能評価指数の測定並びに状態の変化の割合の自己報告。
【００７６】
【表１】
表２：総ＭＳＣ収量及び培養時間
【００７７】
【表２】
考察：
３例の治療被験体のうちの２例が治療した椎間板突出のサイズの減少を示し、持続的な主観的及び機能改善を報告した。１例の被験体は、症状の一時的な減少及び椎間板突出のサイズのわずかな一時的な変化を示した後、治療前のベースライン測定値に逆行した。興味深いことに、この患者の椎間板輪後部に細胞を選択的に入れることが技術的に困難であり、椎間板輪後部への造影剤の流れが最適以下であった。発明者らは、この最適以下の挿入と被験体の持続的反応の欠如との相関を疑っている。Ｋｏｇａらは、関節内腔に非特異的に注入されたＭＳＣは軟骨病変を修復しなかったが、標的組織への付着を可能にする、欠陥部に直接的に適用したものは、修復ができたことを示した。ＨＯの造影剤の流れ及びその後のＭＳＣの流れ（図１４参照）が主として髄核内への流れであったことに留意されたい。他の患者の髄核内に間葉幹細胞を直接入れた我々自身の未公表の臨床経験では観察できるＭＲＩ変化は起こらなかった。これらの所見も幹細胞の付着の位置が治療の成功に極めて重要であるという概念を裏付けていると思われる。特に、椎間板輪後部は、ある程度の血管潅流を維持しているが、無血管性髄核は、移植されたＭＳＣの持続性の欠如をもたらしうる、十分に立証された最適以下の栄養環境を有する。Ｍａｒｔｉｎ， Ｍ．Ｄ．、Ｃ．Ｍ． Ｂｏｘｅｌｌ及びＤ．Ｇ． Ｍａｌｏｎｅ、Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｌｕｍｂｅｒ ｄｉｓｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｆｏｃｕｓ、２００２年、１３巻（２号）、Ｅ１頁。また注目すべきことに、ＨＯは、最小の増殖性幹細胞の収量を有し、他の被験体より長い培養期間にわたって有意に少ない細胞が産生された（表２参照）。
【００７８】
ＭＳＣは単層培養において線維芽細胞の形態を有する（図２参照）ので、観測された結果は、椎間板輪後部に選択的に挿入されたＭＳＣの線維芽細胞分化に起因していた可能性がある。Ａｗａｄ， Ｈ．Ａ．ら、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｓｅｅｄｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｔｅｎｄｏｎ ｒｅｐａｉｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｅｅｄｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｒｅｓ、２０００年、５１巻（２号）、２３３〜４０頁。Ｄｅｌｏｒｍｅ， Ｂ．及びＰ． Ｃｈａｒｂｏｒｄ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、２００７年、１４０巻、６７〜８１頁。Ｘｉａｎｇ， Ｙ．ら、Ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、Ｊ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖ Ｓｃｉ Ｂ、２００７年、８巻（２号）、１３６〜４６頁。
【００７９】
或いは、治療効果に寄与していた可能性がある他の変数は、フォローアップ血小板上清の硬膜外注射であった。Ｍａｒｔｉｎｅａｕらは、特殊なカルシウム及びトロンビン前処理を用いて調製した血小板上清が血小板（並びに他の増殖因子の宿主）からのＶＥＧＦ脱顆粒の最大バーストをもたらすことを示した。Ｍａｒｔｉｎｅａｕ， Ｉ．、Ｅ． Ｌａｃｏｓｔｅ及びＧ． Ｇａｇｎｏｎ、Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ： ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４年、２５巻（１８号）、４４８９〜５０２頁。ＶＥＧＦは、血管新生を引き起こすことが公知であり、ヒト変性椎間板（ＩＶＤ）は、血管潅流が不十分であることが公知である。Ｍａｒｏｕｄａｓ， Ａ．ら、Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｕｍｂａｒ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ：ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｊ Ａｎａｔ、１９７５年、１２０巻（Ｐｔ１）、１１３〜３０頁。Ｗａｌｌａｃｅ， Ａ．Ｌ．ら、Ｈｕｍｏｒａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｅｎｄｐｌａｔｅ、Ｓｐｉｎｅ、１９９４年、１９巻（１２号）、１３２４〜８頁。Ｐａｎｄｙａ， Ｎ．Ｍ．、Ｎ．Ｓ． Ｄｈａｌｌａ及びＤ．Ｄ． Ｓａｎｔａｎｉ、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−− ａ ｎｅｗ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｖａｓｃｕｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２００６年、４４巻（５号）、２６５〜７４頁。
【００８０】
これらの患者におけるＩＶＤ突出の減少の別の説明は、日周効果に帰せられた。Ｐａｒｋらは、ＭＲＩを朝及び夕に実施した場合の８例の無症候性志願者における椎間板膨隆のサイズの変化を実証した。Ｐａｒｋ， Ｃ．Ｏ．、Ｄｉｕｒｎａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｕｍｂｅｒ ＭＲＩ、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｉｇｎａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ｄｉｓｃ ｈｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｄｉｓｃ ｂｕｌｇｅ、Ｙｏｎｓｅｉ Ｍｅｄ Ｊ、１９９７年、３８巻（１号）、８〜１８頁。これらの効果はこれらの被験体で発生した可能性があるが、患者の２例は、サイズが変化しなかった無処置対照椎間板を有していた。さらに、ＭＲＩ試験を担当した単一撮像センターには、最初のスキャンの同じ時刻にできる限り近い時刻にフォローアップスキャンを実施するように指示した。結果として、患者の画像間の最大の時刻変動は、２時間未満であった。最後に、処置及び対照椎間板の高さを測定したところ、すべての被験体について有意な変化は認められなかった。日周変化が存在していた場合、吸水膨潤の効果に起因する椎間板の高さの有意な変動が予想されよう。椎間板突出サイズの減少の別の説明は、針外傷によって直接的に誘発される治癒効果であった可能性がある。Ｋｏｒｅｃｋｉらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ動物モデルにおけるこの効果を検討し、真実に反して、針穿刺が椎間板の生体力学的損傷及びその全般的機能の低下をもたらした可能性があることを発見した。Ｋｏｒｅｃｋｉ， Ｃ．Ｌ．、Ｊ．Ｊ． Ｃｏｓｔｉ及びＪ．Ｃ． Ｉａｔｒｉｄｉｓ、Ｎｅｅｄｌｅ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｉｎｊｕｒｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ａｎ ｏｒｇａｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ、Ｓｐｉｎｅ、２００８年、３３巻（３号）、２３５〜４１頁。さらに、動物におけるＤＤＤを誘発するための標準モデルは穿刺損傷によるものであることに留意されたい。Ｎｉｉｎｉｍａｋｉ Ｊ．ら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｊｕｒｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ、Ａｃｔａ Ｒａｄｉｏｌ、２００７年、４８巻（６号）、６４３〜９頁。
【００８１】
結論：
この実施例は、血小板上清硬膜外補給とともに経皮的に移植された自己ＭＳＣは、内包性腰椎椎間板突出のサイズを減少させることができることを実証している。１例の患者が該療法に反応しなかった理由は不明であるが、反応の欠如は比較的に低いＭＳＣ収量並びにＭＳＣの最適以下の挿入に起因していたと仮説を立てることが妥当である。
【００８２】
この実施例におけるデータは、本明細書で述べた方法が当技術分野で記載された他の方法と比べて修復の驚くべき改善をもたらす、本発明の一実施形態の有用性を示している。他の無血管修復部位、例えば、肩、股関節部等に関するデータは、同様のレベルの改善を示すと予想される。
【００８３】
本開示の様々な実施形態は、各従属請求項が先行する従属請求項のそれぞれの制限を組み込んでいる複数の従属請求項並びに独立請求項であったかのように、特許請求の範囲に挙げられている様々な要素の置換も含みうる。そのような置換は、明確に本開示の範囲内にある。
【００８４】
本発明を多くの実施形態に関して特に示し、述べたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく本明細書で開示した様々な実施形態の形態及び詳細の変更を行うことができ、本明細書で開示した様々な実施形態は、特許請求の範囲に対する制限として働くことを意図するものでないことは、当業者により理解されるであろう。
【００８５】
本発明の記述は、例示及び記述の目的のために示したものであって、網羅的なもの又は本発明を開示した形態に限定することを意図するものではない。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。多くの修飾形態及び変形形態が当業者には明らかであろう。記述し、図に示した実施形態は、本発明の原理、実際的適用を最もよく説明し、当業者が予期される特定の用途に適するような様々な修正を含む様々な実施形態について本発明を理解することを可能にするために選択し、記述した。
【００８６】
本明細書は、特許、特許出願及び刊行物の多くの引用を含む。それぞれがすべての目的のために参照により組み込まれている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変性椎間板の治療を必要とする患者における変性椎間板を治療する方法であって、
前記必要とする患者から幹細胞を採取する工程、
前記採取された幹細胞を損傷椎間板の環境に対応する選択圧下で培養する工程、及び
前記選択された幹細胞を前記変性椎間板の椎間板輪後部に移植する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記選択圧が、前記採取された幹細胞を約３〜約１０％酸素中で培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択圧が、前記採取された幹細胞を約３〜約７％酸素中で培養することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記選択圧が、前記採取された幹細胞を約２〜約１０％二酸化炭素中で培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記採取された幹細胞を約２〜約１０％二酸化炭素中で培養することを含む前記選択圧をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記必要とする患者からＮＰ細胞を採取する工程、及び
前記ＮＰ細胞を前記採取された幹細胞と選択圧下で共培養する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞が間葉幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記必要とする患者から血小板を採取する工程、及び
選択された幹細胞を移植する前、移植の間又は移植後に前記血小板を移植する工程
をさらに含み、前記血小板及び前記幹細胞の移植が前記椎間板輪後部においてである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
椎間板輪後部に移植する１〜７日前に前記血小板をトロンビン及び塩化カルシウムで処理する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記トロンビンの量が２８．５６Ｕ／ｍｌであり、前記塩化カルシウムの量が２．８６ｍｇ／ｍｌである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記血小板をトロンビン、塩化カルシウム又はその塩、トロンボキサンＡ２、アデノシン三リン酸及びアリキドネートで処理する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
増殖因子、サイトカイン、インテグリン、カドヘリン、新脈管形成を促進する分子若しくは薬物、脈管形成を促進する分子若しくは薬物、又は動脈形成を促進する分子若しくは薬物からなる群から選択される１つ又は複数の化合物を投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＩＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＴＧＦ−β、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、Ｔｉｅ２、ＰＤＧＦ、ＣＣＬ２、アルファ−Ｖベータ−５、アルファ−５ベータ−１、ＶＥ−カドヘリン、ＰＥＣＡＭ−１、プラスミノーゲン活性化因子または酸化窒素シンターゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
選択された幹細胞を前記椎間板輪後部に移植する前、移植の間又は移植した後に１つ又は複数の増殖因子を投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ又は複数の増殖因子がＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ及びＩＧＦからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記採取された幹細胞の培養をＤ−ＭＥＭベースから調製した基礎培地中で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
幹細胞、血小板、１つ又は複数の増殖因子及び薬学的キャリア又は希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項１８】
前記幹細胞が間葉幹細胞である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記幹細胞を低酸素条件下でのその生存及び増殖の能力について選択した、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記幹細胞を損傷椎間板と同等の培養条件下での前記幹細胞の生存及び増殖の能力について選択した、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
無血管領域の治療を必要とする患者における無血管領域を治療する方法であって、
前記必要とする患者から幹細胞を採取する工程、
前記採取された幹細胞を損傷無血管領域又は老化無血管領域の環境に対応する選択圧下で培養する工程、及び
前記選択された幹細胞を前記無血管領域に移植する工程
を含む方法。
【請求項２２】
前記無血管領域が患者の肩にある、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記無血管領域が患者の股関節部にある、請求項２１に記載の方法。
【請求項１】
変性椎間板の治療を必要とする患者における変性椎間板を治療する方法であって、
前記必要とする患者から幹細胞を採取する工程、
前記採取された幹細胞を損傷椎間板の環境に対応する選択圧下で培養する工程、及び
前記選択された幹細胞を前記変性椎間板の椎間板輪後部に移植する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記選択圧が、前記採取された幹細胞を約３〜約１０％酸素中で培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択圧が、前記採取された幹細胞を約３〜約７％酸素中で培養することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記選択圧が、前記採取された幹細胞を約２〜約１０％二酸化炭素中で培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記採取された幹細胞を約２〜約１０％二酸化炭素中で培養することを含む前記選択圧をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記必要とする患者からＮＰ細胞を採取する工程、及び
前記ＮＰ細胞を前記採取された幹細胞と選択圧下で共培養する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞が間葉幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記必要とする患者から血小板を採取する工程、及び
選択された幹細胞を移植する前、移植の間又は移植後に前記血小板を移植する工程
をさらに含み、前記血小板及び前記幹細胞の移植が前記椎間板輪後部においてである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
椎間板輪後部に移植する１〜７日前に前記血小板をトロンビン及び塩化カルシウムで処理する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記トロンビンの量が２８．５６Ｕ／ｍｌであり、前記塩化カルシウムの量が２．８６ｍｇ／ｍｌである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記血小板をトロンビン、塩化カルシウム又はその塩、トロンボキサンＡ２、アデノシン三リン酸及びアリキドネートで処理する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
増殖因子、サイトカイン、インテグリン、カドヘリン、新脈管形成を促進する分子若しくは薬物、脈管形成を促進する分子若しくは薬物、又は動脈形成を促進する分子若しくは薬物からなる群から選択される１つ又は複数の化合物を投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＩＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＴＧＦ−β、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、Ｔｉｅ２、ＰＤＧＦ、ＣＣＬ２、アルファ−Ｖベータ−５、アルファ−５ベータ−１、ＶＥ−カドヘリン、ＰＥＣＡＭ−１、プラスミノーゲン活性化因子または酸化窒素シンターゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
選択された幹細胞を前記椎間板輪後部に移植する前、移植の間又は移植した後に１つ又は複数の増殖因子を投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ又は複数の増殖因子がＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ及びＩＧＦからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記採取された幹細胞の培養をＤ−ＭＥＭベースから調製した基礎培地中で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
幹細胞、血小板、１つ又は複数の増殖因子及び薬学的キャリア又は希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項１８】
前記幹細胞が間葉幹細胞である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記幹細胞を低酸素条件下でのその生存及び増殖の能力について選択した、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記幹細胞を損傷椎間板と同等の培養条件下での前記幹細胞の生存及び増殖の能力について選択した、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
無血管領域の治療を必要とする患者における無血管領域を治療する方法であって、
前記必要とする患者から幹細胞を採取する工程、
前記採取された幹細胞を損傷無血管領域又は老化無血管領域の環境に対応する選択圧下で培養する工程、及び
前記選択された幹細胞を前記無血管領域に移植する工程
を含む方法。
【請求項２２】
前記無血管領域が患者の肩にある、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記無血管領域が患者の股関節部にある、請求項２１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１２−５１０８７４（Ｐ２０１２−５１０８７４Ａ）
【公表日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３９７３７（Ｐ２０１１−５３９７３７）
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６７７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６５８５４
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５１０００４２０６）リジェネレイティブ サイエンシーズ， エルエルシー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６７７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６５８５４
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５１０００４２０６）リジェネレイティブ サイエンシーズ， エルエルシー (2)
【Ｆターム（参考）】
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