特徴量取得方法及び特徴量取得装置
【課題】 生体試料の取得画像において関心領域（ＲＯＩ）の解析を行う際、ＲＯＩ内に異なる分子動態を呈する小領域が複数含まれる場合に、小領域における分子動態を分離して評価する。
【解決手段】 生体の挙動を測定して解析する装置を用いて生体の測定領域内に含まれる小領域の特徴量を取得する方法であって、小領域に隣接する他の小領域の割合を変化させて測定領域を移動して生体の挙動を測定して解析値を取得し、他の小領域の割合と取得した解析値との関係から、他の小領域の割合が０である場合の解析値を算出し、算出した解析値を小領域の特徴量とする特徴量の取得方法である。
【解決手段】 生体の挙動を測定して解析する装置を用いて生体の測定領域内に含まれる小領域の特徴量を取得する方法であって、小領域に隣接する他の小領域の割合を変化させて測定領域を移動して生体の挙動を測定して解析値を取得し、他の小領域の割合と取得した解析値との関係から、他の小領域の割合が０である場合の解析値を算出し、算出した解析値を小領域の特徴量とする特徴量の取得方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体画像を処理する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の生物顕微鏡は光学技術の発達や画像処理技術の進歩によって、生きた細胞や組織中の分子挙動が1分子レベルまで解析可能となってきた。これによって細胞や組織における分子シグナル伝達機構について有用な知見が多く得られ、創薬開発や治療法開発などに役立っている。
【０００３】
このような分子の挙動を定量計測する手段として、例えば、顕微鏡画像を利用したラスター画像相関分光法（ＲＩＣＳ：Raster-scan Image Correlation Spectroscopy）が知られている。ＲＩＣＳは、レーザースキャン顕微鏡において、画像中の各画素が取得される時間に差異があることを利用し、二点の蛍光強度の時間空間相関を測定する手法である。ＲＩＣＳを用いることで蛍光修飾された分子の拡散係数を測定することができる。
【０００４】
そして、ＲＩＣＳを代表とする分子拡散計測においては、画像の中から解析を行いたい一部分を選び出し、その範囲内で数値的な処理を行うことが良く行われている。その画像中の一部分は関心領域あるいはＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）と呼称されている。ＲＯＩ内の小領域に注目してその領域における分子拡散情報を求めることによって、複雑な細胞形態が反映される妥当な分子動態を評価することが可能になる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】MA.Digman et.al., “Measuring Fast Dynamics in Solutions and Cells with a Laser Scanning Microscope.”, Biophysical Journal Vol. 89, 1317−1327, 2005.
【非特許文献２】Gielen, E. et al. (2009), “Measuring diffusion of lipid-like probes in artificial and natural membranes by raster image correlation spectroscopy (RICS): use of a commercial laser-scanning microscope with analog detection”, Langmuir, 25, 5209-18.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＲＩＣＳにおける測定領域（ＲＯＩ）は、ある面積をもった領域内（ｐｉｘｅｌサイズ：２５６ｘ２５６， １２８ｘ１２８， ６４ｘ６４）での分子情報（速度、分子数など）を平均値として表すため、実際に求めたい部位以外に不必要な部位もその領域内に含まれてしまうという欠点がある。即ち、様々な形状を呈する細胞上で希望する箇所のみを含むことは困難である。例えば、細胞膜のみを計測しようとしても、ＲＯＩ指定によって細胞外、細胞膜、細胞質の３部位が混在してしまい、細胞膜における分子挙動を正確に得ることができない。
【０００７】
また、逆に細胞質における分子挙動も正確に得ることができない。例えば、リガンド分子が膜蛋白質に結合した際、リガンド/膜蛋白複合体分子は一般的に一定時間後に細胞内へとエンドサイトーシスによって取り込まれ、エンドソーム小胞として細胞質内を動く。一方、膜の複合体分子は膜上を並進拡散しており、細胞内のエンドソーム複合体とは拡散速度に違いが生じる。この場合、細胞外、細胞膜、細胞質の３部位が混在してしまい、細胞質におけるエンドソーム複合体の分子挙動を正確に得ることができない。
【０００８】
従って、生体試料の取得画像において関心領域（ＲＯＩ）の解析を行う際、ＲＯＩ内に異なる分子動態を呈する小領域が複数含まれる場合に、小領域における分子動態を分離して評価することのできる技術に対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための本発明は、生体の挙動を測定して解析する装置を用いて前記生体の測定領域内に含まれる小領域の特徴量を取得する方法であって、前記小領域に隣接する他の小領域の割合を変化させて前記測定領域を移動して前記生体の挙動を測定して解析値を取得し、前記他の小領域の割合と取得した解析値との関係から、前記他の小領域の割合が０である場合の解析値を算出し、算出した解析値を前記小領域の特徴量とする特徴量の取得方法である。
【００１０】
また本発明は、生体の挙動を測定して解析する装置に搭載されて前記生体の測定領域内に含まれる小領域の特徴量を取得する特徴量取得装置であって、前記小領域に隣接する他の小領域の割合を変化させて前記測定領域を移動して前記生体の挙動を測定して解析値を取得する解析値取得手段と、前記他の小領域の割合と取得した解析値との関係から、前記他の小領域の割合が０である場合の解析値を算出する解析値算出手段と、算出した解析値を前記小領域の特徴量とする特徴量取得手段とを備えた特徴量取得装置である。
【発明の効果】
【００１１】
この発明によれば、生体試料の取得画像において関心領域（ＲＯＩ）の解析を行う際、ＲＯＩ内に異なる分子動態を呈する小領域が複数含まれる場合に、小領域における分子動態を分離して評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本実施の形態のレーザ顕微鏡システムの構成を示す図。
【図２】本実施の形態のレーザ顕微鏡システムに搭載される画像処理装置の動作手順を示すフローチャート。
【図３】本実施の形態の表示装置に表示される処理画面を示す図。
【図４】本実施の形態のＲＯＩの移動に伴う、ＲＯＩ中の各領域の割合が変化する状態を示す図。
【図５】本実施の形態のＲＯＩを設定する実施例を示す図。
【図６】本実施の形態のコントロール細胞に対してＲＯＩを膜を含みながら移動させて拡散係数を求めた結果を示す図。
【図７】本実施の形態のコントロール細胞に対して測定した拡散係数と割合（ｒ）との関係を示す図。
【図８】本実施の形態のＭβＣ処理細胞に対して測定した拡散係数と割合（ｒ）との関係を示す図。
【図９】本実施の形態のＭβＣ処理細胞に対して、ＲＯＩが膜を含みながら移動して解析した結果を示す図。
【図１０】本実施の形態の複数のコントロール細胞とＭβＣ処理細胞とについて計測し、統計的処理を行った結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
図１は、本実施の形態のレーザ顕微鏡システムの構成を示す図である。
レーザ顕微鏡システムは、顕微鏡本体１、レーザコンバイナー２、スキャンユニット３、ディテクタユニット４、コントロールユニット５、表示装置６及び記憶装置７を備えている。
【００１４】
レーザコンバイナー２に設けられた１つのレーザ光源から出射したレーザ光は、ダイクロイックミラー（不図示）で反射された後スキャンユニット３に入射する。このスキャンユニット３によって、光軸はＸ軸、Ｙ軸方向に偏向走査され、顕微鏡本体１の対物レンズ（不図示）に入る。これによって視野内の焦点面上にある蛍光標識されたサンプル試料の任意の位置に、測定領域（焦点領域）を位置することができる。
【００１５】
焦点領域内の蛍光分子から発した蛍光は同じ対物レンズで補足され、逆の光路を通りダイクロイックミラーに導かれる。ダイクロイックミラーでは、励起光と比べ波長の長い蛍光を透過するように設計されており、蛍光はディテクタユニット４に到達する。ディテクタユニット４としては光電子増倍管が好適である。
【００１６】
ディテクタユニット４で光電変換された蛍光の強度信号は、コントロールユニット５に入力される。コントロールユニット５では、解析ソフトウェアによってＲＩＣＳ解析が行われる。コントロールユニット５は、ディテクタユニット４からの蛍光強度信号と、スキャンユニット３からの走査位置情報とを対応づけてＲＩＣＳ解析を行う。ＲＩＣＳ解析した結果は、適宜、表示装置６に表示され、また記憶装置７に記憶される。
【００１７】
図１の右側には、本レーザ顕微鏡システムで得られる情報を模式的に示している。
サンプル８ａにレーザ光を繰り返して走査照射して複数枚の蛍光画像８ｂを得る。このそれぞれの蛍光画像８ｂに基づいて蛍光強度に関するデータ８ｃを求めて、解析ソフトウェアに入力する。解析ソフトウェアは、それぞれのデータ８ｃに基づいてＲＩＣＳ解析を実行する。即ち、空間相関計算を行って空間相関関数図８ｄを求め、その結果と基準となる空間相関関数図との間でフィッティング解析を行う。
【００１８】
なお、使用者は、表示装置６に表示された生体画像に対して、コントロールユニット５を介してＲＯＩを設定することができる。表示装置６には、生体画像と設定されたＲＯＩを表す領域とが合成して表示される。
【００１９】
図２は、本実施の形態のレーザ顕微鏡システムに搭載される画像処理装置の動作手順を示すフローチャートである。
図２のステップＳ０１において、コントロールユニット５は、生体の蛍光顕微鏡画像１１を表示装置６に表示する。
【００２０】
図３は、本実施の形態の表示装置６に表示される処理画面１０を示す図である。
処理画面１０は、３つの表示領域を備えている。左上の第１のブロックには、蛍光顕微鏡画像１１が表示される。右上の第２のブロックには、領域分類画像１２が表示される。右下の第３のブロックには、領域割合図１５が表示される。領域分類画像１２及び領域割合図１５の詳細については後述する。
【００２１】
蛍光顕微鏡画像１１には複数の領域を含んでいる。各領域は、撮影手法や染色手法に応じて、形体やコントラスト・色彩の違いとして区別することができる。ただし、蛍光顕微鏡画像１１のどの部分がどの領域に帰属するかを決定する際には、ＲＯＩの位置を選定するのに必要な情報が得られれば十分である。従って、全ての領域を区別する必要は無く、生物学的な定義と厳密に対応して区別する必要は無い。例えば、細胞の画像において核と細胞質の割合に着目する場合は、細胞質に含まれる様々な細胞内小器官をそれぞれ区別する必要は無く、すべて細胞質という領域として良い。第１の実施の形態では、細胞外・細胞質・核の三種類の領域から構成されているとして説明する。
【００２２】
なお、複数の領域の例としては、上述の培養細胞の画像であれば、培養液に点在する細胞の中に、核・細胞質・細胞内小器官などの領域がある。生物個体の一部の画像であれば、各臓器や血管系が異なる領域として区別される。また、各臓器を構成する個別の組織を別の領域とすることができる。
【００２３】
ステップＳ０２において、コントロールユニット５は、蛍光顕微鏡画像１１に含まれる複数の領域を同定する。すなわち、上述のように蛍光顕微鏡画像１１を細胞外・細胞質・核の三種類の領域に同定する。領域の同定は、コントロールユニット５を介して、使用者が画像情報と既知の知見に基づいて手動で同定しても良く、コントロールユニット５が公知の画像解析ソフトウェアの支援により自動的・半自動的に行っても良い。
【００２４】
ステップＳ０３において、コントロールユニット５は、同定した複数の領域を区分して表した領域分類画像１２を処理画面１０に表示する。
【００２５】
ステップＳ０４において、コントロールユニット５は、領域分類画像１２から各画素の種別情報を取得する。種別情報とは、各画素が上述のいずれの領域に属するかを示す情報である。
【００２６】
種別情報は、例えば、整数値で表しても良い。その場合、種別情報Ｉは、画素の座標（ｘ，ｙ）に対して整数値を返す関数と定義することができる。あるいは、画素（ｘ，ｙ）の値を実数の行列Ｃ（ｘ，ｙ）として表したときに、画素（ｘ，ｙ）に対応する種別情報を整数の行列Ｉ（ｘ，ｙ）として表しても良い。このように表すことで、数学的な取扱いが容易となる。
【００２７】
例えば、細胞の画像において、細胞外・細胞質・核の三種類の領域を、細胞外に対して０、細胞質に対して１、核に対して２という種別情報を割り当てる。座標（１０，２０）に位置する画素が細胞質領域に含まれることは、式（１）で表される。
Ｉ（１０，２０）＝１ ・・・式（１）
このＩ（ｘ，ｙ）のデータは、記憶装置７に保存しておき、解析時に読み出すようにすることができる。その際、Ｉ（ｘ，ｙ）のデータは、独立したファイルとして保存しても良いし、複数の画像データを格納することができるファイル形式であれば、元の画像データに対応させて、同一ファイルに保存することもできる。
【００２８】
ステップＳ０５において、コントロールユニット５は、ＲＯＩを設定する使用者の操作をサポートする。
【００２９】
使用者は、図３の領域分類画像１２上でＲＯＩを設定する操作を実行する。但し、使用者は、蛍光顕微鏡画像１１上でＲＯＩを設定する操作を実行しても良い。一方の画像上でＲＯＩを設定する操作を行なった場合、他方の画像上の対応する位置にもＲＯＩが表示される。その際、一方の画像上でＲＯＩ操作しているときに、他方の画像に操作中のＲＯＩを表示するかどうかは、使用者が選択することができる。
【００３０】
使用者は、処理画面上で不図示のメニューバーから、ＲＯＩ設定モードを選択する。ＲＯＩを示す枠１３は、領域分類画像１２、蛍光顕微鏡画像１１のいずれかの画像上にマウスカーソル１４を移動させ、最初にマウスのボタンを押下げることによって現出する。ＲＯＩの大きさが解析手法の設定によってあらかじめ決定している場合は、その場に仮のＲＯＩが設定される。ＲＯＩの大きさが任意である場合は、その場でＲＯＩの形状（正方形、長方形、丸、楕円など）及びサイズを選択するモードに移行する。
【００３１】
例えば、使用者が長方形のＲＯＩを希望する場合は、以下のようにその大きさが決定される。マウスのボタンが初めて押下げられた位置を始点とし、そのボタンを押下げたままマウスを移動するに従いＲＯＩの枠の大きさが変化し、ボタンを放した位置を終点とする長方形がＲＯＩとして設定される。
【００３２】
ステップＳ０６において、コントロールユニット５は、ＲＯＩ中の各領域の割合を計算して表示する。
【００３３】
ＲＯＩ中で、種別情報インデックスがｉである領域（以下、領域ｉと記述する）に属する画素の数Ｓ（ｉ）は、Ｉ（ｘ，ｙ）＝ｉである画素の数である。すなわち、Ｓ（ｉ）は、式（２）で表される。
【数１】
【００３４】
領域ｉのＲＯＩ中の占有率Ｒ（ｉ）は、ＲＯＩ中の全画素数Ｎを用いて、式（３）で表すことができる。
【数２】
【００３５】
使用者の関心がＲＯＩ中の領域ｉの割合だけの場合は、Ｒ（ｉ）をＲＯＩの特徴を表す値として使用者に提示することができる。また、使用者の関心が要素ｉ，ｊ，ｋ，．．．にある時は、＜Ｒ（ｉ），Ｒ（ｊ），Ｒ（ｋ），．．．＞の値の組を使用者に提示することができる。図３の領域割合図１５には、ＲＯＩ中の細胞外、細胞質、核のそれぞれの領域の割合が表示される。なお、領域割合図１５に表示したい領域は、使用者が不図示の設定画面より指定することができる。
【００３６】
ステップＳ０７において、コントロールユニット５は、ＲＯＩの移動に合せてＲＯＩの表示と各領域の割合の表示とを更新する。
【００３７】
使用者がＲＯＩの枠上でマウスのボタンを押下げ、そのボタンを押下げたままマウスを移動（マウスのドラッグ）することによってＲＯＩを移動することができる。マウスをドラッグすると、マウスカーソル１４の動きに追随してＲＯＩの枠１３が移動する。ＲＯＩの枠１３の移動にともなって、ＲＯＩ中の各領域の割合が変化する。
【００３８】
図４は、本実施の形態のＲＯＩの移動に伴う、ＲＯＩ中の各領域の割合が変化する状態を示す図である。
【００３９】
図４に示すように、使用者がＲＯＩを移動するとリアルタイムでそのＲＯＩの位置での各領域の割合が表示されるので、使用者は移動中のＲＯＩの状況を容易に把握することができる。ＲＯＩが、画像上の位置、および各領域の割合の情報から望ましい位置にあると使用者が判断した場合、使用者はその位置でＲＯＩの移動を停止してＲＯＩを確定する。
【００４０】
次に、領域割合図１５に領域ｉの割合をリアルタイムで表示する方法について説明する。なお、以下では、特に区別の必要があるとき以外は、領域割合図１５に表示される領域ｉの割合を、＜Ｒ（ｉ）＞と表す。
【００４１】
＜Ｒ（ｉ）＞の計算は、式（２）、式（３）に示すように簡便であるため、現在一般的に用いられている計算機を用いて高速に計算することができる。従って使用者が、画像中に任意の形状・大きさのＲＯＩを設定すれば、ＲＯＩの移動に合せてリアルタイムで計算し表示することが可能である。
【００４２】
また、使用者がＲＯＩの形状・大きさを指定した際、画像中ですべての可能なＲＯＩの位置に対して＜Ｒ（ｉ）＞を計算しておくことも容易に可能である。すなわち、ＲＯＩの形状、大きさに対応して定義される代表座標（ｘ，ｙ）と、計算したＲｉ（ｘ，ｙ），Ｒｊ（ｘ，ｙ），Ｒｋ（ｘ，ｙ），．．．とを対応付けてメモリに保存する。使用者がＲＯＩを移動する操作を行っているときに、ＲＯＩの代表座標（ｘ，ｙ）に対応する＜Ｒ（ｉ）＞をメモリから抽出することで、使用者に対してリアルタイムで＜Ｒ（ｉ）＞を提示することができる。
【００４３】
図５は、本実施の形態のＲＯＩを設定する実施例を示す図である。
【００４４】
蛍光顕微鏡画像１１では、蛍光分子は、細胞内の細胞質に存在するため、輝度の高いところが細胞質であり、細胞質に囲まれた領域が核であると容易に判別することができる。領域分類画像１２は、この輝度の違いに基づき、使用者が手動で分類を行って作成した図である。なお、領域分類画像１２と共に分類の凡例が示されている。
【００４５】
この領域分類画像上に複数のＲＯＩを設定した。単一の領域に内包されるＲＯＩは、領域分類画像１２によらずとも、蛍光顕微鏡画像１１を見ながらでも容易に行うことができる。そのようにして、核のみを含むＲＯＩとして図中Ｂ，Ｇを、細胞質のみを含むＲＯＩとして図中Ｄ，Ｆを設定することができる。
【００４６】
細胞質を５０％含むＲＯＩ（図中Ａ，Ｅ）の設定は、マウスによってＲＯＩの枠を、細胞の縁付近で移動し、画面に表示される細胞質の占有率Ｒ（ｉ＝１）の値が０．５（５０％）になった位置でＲＯＩを確定する事によって行なうことができる。
【００４７】
核を３０％含むＲＯＩ（図中Ｃ，Ｈ，Ｉ）の設定は、マウスによってＲＯＩの枠を、核の縁付近で移動し、画面に表示される核の占有率Ｒ（ｉ＝２）の値が０．３（３０％）になった位置でＲＯＩを確定する事によって行なうことができる。図中ＩのＲＯＩは、核・細胞質・細胞外すべての領域を含み、＜Ｒ（０），Ｒ（１），Ｒ（２）＞＝＜０．１，０．６，０．３＞である。Ｒ（２）にのみ注目すれば図中ＣやＨと同様の領域と見なすこともできるし、核と細胞質のみを含むＲＯＩを選択したければ、Ｒ（０）＝０となるように注意してＲＯＩの場所を選択することができる。
【００４８】
従来は、使用者が目視によって、おおよその見当でＲＯＩを確定していたのに対して、本実施の形態では、Ｒ（ｉ）の値を見ながらＲＯＩを確定できるので、容易に再現性の高い設定を行うことができる。
【００４９】
続いて、上述の機能を用いてＲＩＣＳ解析を実施する方法について説明する。
【００５０】
培養神経細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）の細胞膜に発現するＧＭ１（ガングリオシド）に特異結合するＣＴｘＢ（コレラ毒素Ｂサブユニット）の系を用いた実施例を示す。ＡｌｅｘａＦｌｕｏ４８８を結合したＣＴｘＢ（ＣＴｘＢ−Ａｌｘ４８８）を培養細胞液に添加することによって、１０分以内で蛍光標識ＣＴｘＢが細胞膜に結合していることが観察された。ＣＴｘＢ−ＧＭ１複合体は膜上において並進拡散しているものと思われる。細胞膜にて結合した複合体は時間と共に細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれ、細胞質内にてダイナミックに動く輝粒エンドソームが見られた。この実験条件下において、以下のようにＲＩＣＳ計測を行った。
【００５１】
図６は、本実施の形態のコントロール細胞に対してＲＯＩを膜を含みながら移動させて拡散係数を求めた結果を示す図である。
図６（１）〜図６（７）に示すように、少しずつ細胞外を多く含む領域から細胞質を多く含む領域へとＲＯＩをずらしながら各位置において解析を行った。さらにＲＯＩ内細胞質のＲＯＩ全体に対する割合（ｒ）をそれぞれの位置で取得した。この割合（ｒ）は、上述の領域割合図１５に表示された値に基づいている。
【００５２】
図７は、本実施の形態のコントロール細胞に対して測定した拡散係数と割合（ｒ）との関係を示す図である。
図７に示すように、横軸に割合（ｒ）、縦軸に拡散係数Ｄ１をプロットすると、右肩下がりの曲線が得られた。
【００５３】
コントロール細胞ではＣＴｘＢは細胞膜のＧＭ１と結合した後、ＣＴｘＢ／ＧＭ１複合体はエンドサイトーシスによって取り込まれ、エンドソームとして細胞内を移動する。ＲＯＩ内の細胞質の割合を増やすにつれ、ＲＯＩ（ｒ＜０．２〜０．４）では拡散係数が少しずつ減少し、その後、細胞質の割合が半分以上になるｒ＝０．５〜１．０ではＤの値はほぼ一定となった。（Ｄ＝０．５）。
【００５４】
これは、ＲＯＩが占める細胞質の割合が増えるにつれて、細胞質に取り込まれたエンドソームの動きの影響を受けて、拡散係数が序々に小さくなったと考えられる。つまり、細胞膜における分子拡散に比べて、エンドサイトーシスの拡散のほうが遅いことから、このような傾きが認められたと言える。
【００５５】
即ち、ｒ＝１では全てが細胞質のエンドソームの結果を示し、ｒが小さくなるにつれて細胞質の影響が少なくなって細胞膜の影響がクローズアップされると考えられる。そうとすれば、実際にはＲＯＩのサイズや形状による制約があるために膜のみを選択して計測することが出来ないが、ｒ＝０の領域が細胞質の影響を全く受けない領域、即ち、このｒ＝０（グラフではｙ切片にあたる）での拡散係数値は膜のみの分子拡散係数と推測できる。
【００５６】
この推測を裏付けるため、細胞膜の構造を変化させた場合のＣＴｘＢ分子挙動を測定した結果について説明する。
細胞膜、特にラフト領域にはコレステロール分子が多く含まれていると言われているが、Ｍｅｔｈｙｌbｃｙｃｈｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（ＭβＣ）によって膜コレステロールを除去すると、エンドサイトーシスによるＣＴｘＢ分子の取り込みが抑制された結果、多くの複合体（蛍光蛋白質）は膜に留まる。
【００５７】
図８は、本実施の形態のＭβＣ処理細胞に対して測定した拡散係数と割合（ｒ）との関係を示す図である。
図８（１）〜図８（６）に示すように、少しずつ細胞外を多く含む領域から細胞質を多く含む領域へとＲＯＩをずらしながら各位置において解析を行った。さらにＲＯＩ内細胞質のＲＯＩ全体に対する割合（ｒ）をそれぞれの位置で取得した。この割合（ｒ）は、上述の領域割合図１５に表示された値に基づいている。
【００５８】
図９は、本実施の形態のＭβＣ処理細胞に対して、ＲＯＩが膜を含みながら移動して解析した結果を示す図である。
図９に示すように、解析結果から横軸に割合（ｒ）、縦軸に拡散係数Ｄ１をプロットすると、ＲＯＩの位置に関わらず、ＭβＣ処理細胞では拡散係数の変動が少ない特性が得られた。この結果から、細胞内のエンドソームの影響をあまり受けずに膜依存の分子情報が得られたと考えられる。
【００５９】
図１０は、本実施の形態の複数のコントロール細胞とＭβＣ処理細胞とについて計測し、統計的処理を行った結果を示す図である。
【００６０】
コントロール細胞はＭβＣ処理細胞に比べてＣＴｘＢのエンドサイトーシス取り込みが盛んで、細胞内エンドソームに包まれたＣＴｘＢが多いことから、エンドソームの比較的遅い動きに影響される。従って、細胞質領域が多くなるようにＲＯＩを動かすにつれてＤ値が小さくなった（右肩下がりの線）。
これに対して、ＭβＣ処理細胞ではエンドサイトーシスが抑制されることからエンドソームの影響が少ない。このため、ＲＯＩを移動してもＤ値の変動が少なかった（フラットの線）。
【００６１】
この２つの線を外挿して求めたｙ軸切片での値はほぼ等しい値であることがわかる。図１０に示すこの結果は、コントロール細胞のカーブがｙ軸切片と交差するＤ値はエンドソームの影響を全く受けない、膜のみの拡散係数を表わすと判断できる根拠となるものである。従って、図１０に示すように、コントロール細胞のカーブを求め、そのカーブがｙ軸切片と交差するＤ値を膜上ＣＴｘＢ分子の拡散係数とする方法は、膜のみの拡散係数を知るうえで簡便でかつ有効な方法と考えられる。また、コントロール細胞のカーブの形状からＣＴｘＢ分子が細胞内に取り込まれる状況を推測することが可能となり、細胞への試薬投与によって起こる細胞膜の機能変化を調べることが出来る。
【００６２】
この解析方法はＲＯＩの位置をずらしてその位置ごとのＤ値を計測して解析を行うものである。しかし、ＲＯＩの位置を取得画像におけるピクセル座標とすると、異なる位置に存在する複数の細胞からの計測値を比較することが出来ない。そこで位置パラメータとして割合（ｒ）を使用することによって、図１０に示すように同じ実験条件下の複数の細胞から得られた計測値を統計処理したり、異なる実験条件下の計測値を比較することが可能となる。
【００６３】
以上説明したように、同一ＲＯＩ内において異なる動きを示す分子が混在する場合、ＲＯＩ位置を変えながら各位置での計測を行うことによって位置情報も加えて計測結果を評価することが可能となる。本実施の形態で述べた方法は、エンドソームと細胞膜蛋白質の動きの違いのみならず、例えば細胞質と核における分子の挙動の違いを調べるのにも有効な方法と考えられる。
【００６４】
なお、上述の実施の形態では、ＲＯＩが膜を含みながら１方向に移動して解析したがこの形態に限られず、例えば、割合（ｒ）が、０．１→１→０．２→０．９→０．３→０．８→・・・と、膜をはさんで交互に位置するようにＲＯＩを移動して解析しても良い。このように移動することで、測定に要する時間経過の影響を緩和することができる。
【００６５】
また、割合（ｒ）が同じ値となる異なる複数の位置での解析をまとめて実施しても良い。例えば、割合が０．１となる位置での解析を複数実施し、その後、割合が０．２となる位置での解析を複数実施し、・・・割合が１．０となる位置での解析を複数実施するといった移動方法を採用しても良い。
【００６６】
さらに、ＲＯＩの位置は、使用者が手動で移動して設定しても良く、コントロールユニット５が自動で移動して設定しても良い。ＲＯＩのサイズが、解析手法の要請によって予め決定している場合、あらかじめ領域分類画像１２に基づいて、すべての可能なＲＯＩの位置での占有率を計算しておくことが可能である。そして、その情報を元にして、コントロールユニット５が、使用者が指定した割合の位置に自動でＲＯＩを移動して解析することができる。
【００６７】
本実施の形態で開示したＲＯＩ選択を補助する手法を用いれば、細胞質の割合が同一のＲＯＩを多数選択することができるため、それらのＲＯＩそれぞれについて得られた拡散係数について平均値を算出するなどの処理が可能である。従って、各ＲＯＩで拡散係数を求めた結果をディスク上に記録する際に、そのＲＯＩ中での細胞質の割合を同時に記録しておき、後の操作で統計的な解析を行う際に、その記録を呼び出して細胞質の割合の情報を解析に利用することができる。
【００６８】
なお、上述の各実施の形態で説明した機能は、ハードウェアを用いて構成するに留まらず、ソフトウェアを用いて各機能を記載したプログラムをコンピュータに読み込ませて実現することもできる。また、各機能は、適宜ソフトウェア、ハードウェアのいずれかを選択して構成するものであっても良い。
【００６９】
尚、本発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。
上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。
【符号の説明】
【００７０】
１…顕微鏡本体、２…レーザコンバイナー、２ｂ…ＲＯＩ、３…スキャンユニット、３ｂ…ＲＯＩ、４…ディテクタユニット、５…コントロールユニット、６…表示装置、７…記憶装置、８ａ…サンプル、８ｂ…蛍光画像、８ｃ…データ、１０…処理画面、１１…蛍光顕微鏡画像、１２…領域分類画像、１３…枠、１４…マウスカーソル。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体画像を処理する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の生物顕微鏡は光学技術の発達や画像処理技術の進歩によって、生きた細胞や組織中の分子挙動が1分子レベルまで解析可能となってきた。これによって細胞や組織における分子シグナル伝達機構について有用な知見が多く得られ、創薬開発や治療法開発などに役立っている。
【０００３】
このような分子の挙動を定量計測する手段として、例えば、顕微鏡画像を利用したラスター画像相関分光法（ＲＩＣＳ：Raster-scan Image Correlation Spectroscopy）が知られている。ＲＩＣＳは、レーザースキャン顕微鏡において、画像中の各画素が取得される時間に差異があることを利用し、二点の蛍光強度の時間空間相関を測定する手法である。ＲＩＣＳを用いることで蛍光修飾された分子の拡散係数を測定することができる。
【０００４】
そして、ＲＩＣＳを代表とする分子拡散計測においては、画像の中から解析を行いたい一部分を選び出し、その範囲内で数値的な処理を行うことが良く行われている。その画像中の一部分は関心領域あるいはＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）と呼称されている。ＲＯＩ内の小領域に注目してその領域における分子拡散情報を求めることによって、複雑な細胞形態が反映される妥当な分子動態を評価することが可能になる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】MA.Digman et.al., “Measuring Fast Dynamics in Solutions and Cells with a Laser Scanning Microscope.”, Biophysical Journal Vol. 89, 1317−1327, 2005.
【非特許文献２】Gielen, E. et al. (2009), “Measuring diffusion of lipid-like probes in artificial and natural membranes by raster image correlation spectroscopy (RICS): use of a commercial laser-scanning microscope with analog detection”, Langmuir, 25, 5209-18.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＲＩＣＳにおける測定領域（ＲＯＩ）は、ある面積をもった領域内（ｐｉｘｅｌサイズ：２５６ｘ２５６， １２８ｘ１２８， ６４ｘ６４）での分子情報（速度、分子数など）を平均値として表すため、実際に求めたい部位以外に不必要な部位もその領域内に含まれてしまうという欠点がある。即ち、様々な形状を呈する細胞上で希望する箇所のみを含むことは困難である。例えば、細胞膜のみを計測しようとしても、ＲＯＩ指定によって細胞外、細胞膜、細胞質の３部位が混在してしまい、細胞膜における分子挙動を正確に得ることができない。
【０００７】
また、逆に細胞質における分子挙動も正確に得ることができない。例えば、リガンド分子が膜蛋白質に結合した際、リガンド/膜蛋白複合体分子は一般的に一定時間後に細胞内へとエンドサイトーシスによって取り込まれ、エンドソーム小胞として細胞質内を動く。一方、膜の複合体分子は膜上を並進拡散しており、細胞内のエンドソーム複合体とは拡散速度に違いが生じる。この場合、細胞外、細胞膜、細胞質の３部位が混在してしまい、細胞質におけるエンドソーム複合体の分子挙動を正確に得ることができない。
【０００８】
従って、生体試料の取得画像において関心領域（ＲＯＩ）の解析を行う際、ＲＯＩ内に異なる分子動態を呈する小領域が複数含まれる場合に、小領域における分子動態を分離して評価することのできる技術に対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための本発明は、生体の挙動を測定して解析する装置を用いて前記生体の測定領域内に含まれる小領域の特徴量を取得する方法であって、前記小領域に隣接する他の小領域の割合を変化させて前記測定領域を移動して前記生体の挙動を測定して解析値を取得し、前記他の小領域の割合と取得した解析値との関係から、前記他の小領域の割合が０である場合の解析値を算出し、算出した解析値を前記小領域の特徴量とする特徴量の取得方法である。
【００１０】
また本発明は、生体の挙動を測定して解析する装置に搭載されて前記生体の測定領域内に含まれる小領域の特徴量を取得する特徴量取得装置であって、前記小領域に隣接する他の小領域の割合を変化させて前記測定領域を移動して前記生体の挙動を測定して解析値を取得する解析値取得手段と、前記他の小領域の割合と取得した解析値との関係から、前記他の小領域の割合が０である場合の解析値を算出する解析値算出手段と、算出した解析値を前記小領域の特徴量とする特徴量取得手段とを備えた特徴量取得装置である。
【発明の効果】
【００１１】
この発明によれば、生体試料の取得画像において関心領域（ＲＯＩ）の解析を行う際、ＲＯＩ内に異なる分子動態を呈する小領域が複数含まれる場合に、小領域における分子動態を分離して評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本実施の形態のレーザ顕微鏡システムの構成を示す図。
【図２】本実施の形態のレーザ顕微鏡システムに搭載される画像処理装置の動作手順を示すフローチャート。
【図３】本実施の形態の表示装置に表示される処理画面を示す図。
【図４】本実施の形態のＲＯＩの移動に伴う、ＲＯＩ中の各領域の割合が変化する状態を示す図。
【図５】本実施の形態のＲＯＩを設定する実施例を示す図。
【図６】本実施の形態のコントロール細胞に対してＲＯＩを膜を含みながら移動させて拡散係数を求めた結果を示す図。
【図７】本実施の形態のコントロール細胞に対して測定した拡散係数と割合（ｒ）との関係を示す図。
【図８】本実施の形態のＭβＣ処理細胞に対して測定した拡散係数と割合（ｒ）との関係を示す図。
【図９】本実施の形態のＭβＣ処理細胞に対して、ＲＯＩが膜を含みながら移動して解析した結果を示す図。
【図１０】本実施の形態の複数のコントロール細胞とＭβＣ処理細胞とについて計測し、統計的処理を行った結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
図１は、本実施の形態のレーザ顕微鏡システムの構成を示す図である。
レーザ顕微鏡システムは、顕微鏡本体１、レーザコンバイナー２、スキャンユニット３、ディテクタユニット４、コントロールユニット５、表示装置６及び記憶装置７を備えている。
【００１４】
レーザコンバイナー２に設けられた１つのレーザ光源から出射したレーザ光は、ダイクロイックミラー（不図示）で反射された後スキャンユニット３に入射する。このスキャンユニット３によって、光軸はＸ軸、Ｙ軸方向に偏向走査され、顕微鏡本体１の対物レンズ（不図示）に入る。これによって視野内の焦点面上にある蛍光標識されたサンプル試料の任意の位置に、測定領域（焦点領域）を位置することができる。
【００１５】
焦点領域内の蛍光分子から発した蛍光は同じ対物レンズで補足され、逆の光路を通りダイクロイックミラーに導かれる。ダイクロイックミラーでは、励起光と比べ波長の長い蛍光を透過するように設計されており、蛍光はディテクタユニット４に到達する。ディテクタユニット４としては光電子増倍管が好適である。
【００１６】
ディテクタユニット４で光電変換された蛍光の強度信号は、コントロールユニット５に入力される。コントロールユニット５では、解析ソフトウェアによってＲＩＣＳ解析が行われる。コントロールユニット５は、ディテクタユニット４からの蛍光強度信号と、スキャンユニット３からの走査位置情報とを対応づけてＲＩＣＳ解析を行う。ＲＩＣＳ解析した結果は、適宜、表示装置６に表示され、また記憶装置７に記憶される。
【００１７】
図１の右側には、本レーザ顕微鏡システムで得られる情報を模式的に示している。
サンプル８ａにレーザ光を繰り返して走査照射して複数枚の蛍光画像８ｂを得る。このそれぞれの蛍光画像８ｂに基づいて蛍光強度に関するデータ８ｃを求めて、解析ソフトウェアに入力する。解析ソフトウェアは、それぞれのデータ８ｃに基づいてＲＩＣＳ解析を実行する。即ち、空間相関計算を行って空間相関関数図８ｄを求め、その結果と基準となる空間相関関数図との間でフィッティング解析を行う。
【００１８】
なお、使用者は、表示装置６に表示された生体画像に対して、コントロールユニット５を介してＲＯＩを設定することができる。表示装置６には、生体画像と設定されたＲＯＩを表す領域とが合成して表示される。
【００１９】
図２は、本実施の形態のレーザ顕微鏡システムに搭載される画像処理装置の動作手順を示すフローチャートである。
図２のステップＳ０１において、コントロールユニット５は、生体の蛍光顕微鏡画像１１を表示装置６に表示する。
【００２０】
図３は、本実施の形態の表示装置６に表示される処理画面１０を示す図である。
処理画面１０は、３つの表示領域を備えている。左上の第１のブロックには、蛍光顕微鏡画像１１が表示される。右上の第２のブロックには、領域分類画像１２が表示される。右下の第３のブロックには、領域割合図１５が表示される。領域分類画像１２及び領域割合図１５の詳細については後述する。
【００２１】
蛍光顕微鏡画像１１には複数の領域を含んでいる。各領域は、撮影手法や染色手法に応じて、形体やコントラスト・色彩の違いとして区別することができる。ただし、蛍光顕微鏡画像１１のどの部分がどの領域に帰属するかを決定する際には、ＲＯＩの位置を選定するのに必要な情報が得られれば十分である。従って、全ての領域を区別する必要は無く、生物学的な定義と厳密に対応して区別する必要は無い。例えば、細胞の画像において核と細胞質の割合に着目する場合は、細胞質に含まれる様々な細胞内小器官をそれぞれ区別する必要は無く、すべて細胞質という領域として良い。第１の実施の形態では、細胞外・細胞質・核の三種類の領域から構成されているとして説明する。
【００２２】
なお、複数の領域の例としては、上述の培養細胞の画像であれば、培養液に点在する細胞の中に、核・細胞質・細胞内小器官などの領域がある。生物個体の一部の画像であれば、各臓器や血管系が異なる領域として区別される。また、各臓器を構成する個別の組織を別の領域とすることができる。
【００２３】
ステップＳ０２において、コントロールユニット５は、蛍光顕微鏡画像１１に含まれる複数の領域を同定する。すなわち、上述のように蛍光顕微鏡画像１１を細胞外・細胞質・核の三種類の領域に同定する。領域の同定は、コントロールユニット５を介して、使用者が画像情報と既知の知見に基づいて手動で同定しても良く、コントロールユニット５が公知の画像解析ソフトウェアの支援により自動的・半自動的に行っても良い。
【００２４】
ステップＳ０３において、コントロールユニット５は、同定した複数の領域を区分して表した領域分類画像１２を処理画面１０に表示する。
【００２５】
ステップＳ０４において、コントロールユニット５は、領域分類画像１２から各画素の種別情報を取得する。種別情報とは、各画素が上述のいずれの領域に属するかを示す情報である。
【００２６】
種別情報は、例えば、整数値で表しても良い。その場合、種別情報Ｉは、画素の座標（ｘ，ｙ）に対して整数値を返す関数と定義することができる。あるいは、画素（ｘ，ｙ）の値を実数の行列Ｃ（ｘ，ｙ）として表したときに、画素（ｘ，ｙ）に対応する種別情報を整数の行列Ｉ（ｘ，ｙ）として表しても良い。このように表すことで、数学的な取扱いが容易となる。
【００２７】
例えば、細胞の画像において、細胞外・細胞質・核の三種類の領域を、細胞外に対して０、細胞質に対して１、核に対して２という種別情報を割り当てる。座標（１０，２０）に位置する画素が細胞質領域に含まれることは、式（１）で表される。
Ｉ（１０，２０）＝１ ・・・式（１）
このＩ（ｘ，ｙ）のデータは、記憶装置７に保存しておき、解析時に読み出すようにすることができる。その際、Ｉ（ｘ，ｙ）のデータは、独立したファイルとして保存しても良いし、複数の画像データを格納することができるファイル形式であれば、元の画像データに対応させて、同一ファイルに保存することもできる。
【００２８】
ステップＳ０５において、コントロールユニット５は、ＲＯＩを設定する使用者の操作をサポートする。
【００２９】
使用者は、図３の領域分類画像１２上でＲＯＩを設定する操作を実行する。但し、使用者は、蛍光顕微鏡画像１１上でＲＯＩを設定する操作を実行しても良い。一方の画像上でＲＯＩを設定する操作を行なった場合、他方の画像上の対応する位置にもＲＯＩが表示される。その際、一方の画像上でＲＯＩ操作しているときに、他方の画像に操作中のＲＯＩを表示するかどうかは、使用者が選択することができる。
【００３０】
使用者は、処理画面上で不図示のメニューバーから、ＲＯＩ設定モードを選択する。ＲＯＩを示す枠１３は、領域分類画像１２、蛍光顕微鏡画像１１のいずれかの画像上にマウスカーソル１４を移動させ、最初にマウスのボタンを押下げることによって現出する。ＲＯＩの大きさが解析手法の設定によってあらかじめ決定している場合は、その場に仮のＲＯＩが設定される。ＲＯＩの大きさが任意である場合は、その場でＲＯＩの形状（正方形、長方形、丸、楕円など）及びサイズを選択するモードに移行する。
【００３１】
例えば、使用者が長方形のＲＯＩを希望する場合は、以下のようにその大きさが決定される。マウスのボタンが初めて押下げられた位置を始点とし、そのボタンを押下げたままマウスを移動するに従いＲＯＩの枠の大きさが変化し、ボタンを放した位置を終点とする長方形がＲＯＩとして設定される。
【００３２】
ステップＳ０６において、コントロールユニット５は、ＲＯＩ中の各領域の割合を計算して表示する。
【００３３】
ＲＯＩ中で、種別情報インデックスがｉである領域（以下、領域ｉと記述する）に属する画素の数Ｓ（ｉ）は、Ｉ（ｘ，ｙ）＝ｉである画素の数である。すなわち、Ｓ（ｉ）は、式（２）で表される。
【数１】
【００３４】
領域ｉのＲＯＩ中の占有率Ｒ（ｉ）は、ＲＯＩ中の全画素数Ｎを用いて、式（３）で表すことができる。
【数２】
【００３５】
使用者の関心がＲＯＩ中の領域ｉの割合だけの場合は、Ｒ（ｉ）をＲＯＩの特徴を表す値として使用者に提示することができる。また、使用者の関心が要素ｉ，ｊ，ｋ，．．．にある時は、＜Ｒ（ｉ），Ｒ（ｊ），Ｒ（ｋ），．．．＞の値の組を使用者に提示することができる。図３の領域割合図１５には、ＲＯＩ中の細胞外、細胞質、核のそれぞれの領域の割合が表示される。なお、領域割合図１５に表示したい領域は、使用者が不図示の設定画面より指定することができる。
【００３６】
ステップＳ０７において、コントロールユニット５は、ＲＯＩの移動に合せてＲＯＩの表示と各領域の割合の表示とを更新する。
【００３７】
使用者がＲＯＩの枠上でマウスのボタンを押下げ、そのボタンを押下げたままマウスを移動（マウスのドラッグ）することによってＲＯＩを移動することができる。マウスをドラッグすると、マウスカーソル１４の動きに追随してＲＯＩの枠１３が移動する。ＲＯＩの枠１３の移動にともなって、ＲＯＩ中の各領域の割合が変化する。
【００３８】
図４は、本実施の形態のＲＯＩの移動に伴う、ＲＯＩ中の各領域の割合が変化する状態を示す図である。
【００３９】
図４に示すように、使用者がＲＯＩを移動するとリアルタイムでそのＲＯＩの位置での各領域の割合が表示されるので、使用者は移動中のＲＯＩの状況を容易に把握することができる。ＲＯＩが、画像上の位置、および各領域の割合の情報から望ましい位置にあると使用者が判断した場合、使用者はその位置でＲＯＩの移動を停止してＲＯＩを確定する。
【００４０】
次に、領域割合図１５に領域ｉの割合をリアルタイムで表示する方法について説明する。なお、以下では、特に区別の必要があるとき以外は、領域割合図１５に表示される領域ｉの割合を、＜Ｒ（ｉ）＞と表す。
【００４１】
＜Ｒ（ｉ）＞の計算は、式（２）、式（３）に示すように簡便であるため、現在一般的に用いられている計算機を用いて高速に計算することができる。従って使用者が、画像中に任意の形状・大きさのＲＯＩを設定すれば、ＲＯＩの移動に合せてリアルタイムで計算し表示することが可能である。
【００４２】
また、使用者がＲＯＩの形状・大きさを指定した際、画像中ですべての可能なＲＯＩの位置に対して＜Ｒ（ｉ）＞を計算しておくことも容易に可能である。すなわち、ＲＯＩの形状、大きさに対応して定義される代表座標（ｘ，ｙ）と、計算したＲｉ（ｘ，ｙ），Ｒｊ（ｘ，ｙ），Ｒｋ（ｘ，ｙ），．．．とを対応付けてメモリに保存する。使用者がＲＯＩを移動する操作を行っているときに、ＲＯＩの代表座標（ｘ，ｙ）に対応する＜Ｒ（ｉ）＞をメモリから抽出することで、使用者に対してリアルタイムで＜Ｒ（ｉ）＞を提示することができる。
【００４３】
図５は、本実施の形態のＲＯＩを設定する実施例を示す図である。
【００４４】
蛍光顕微鏡画像１１では、蛍光分子は、細胞内の細胞質に存在するため、輝度の高いところが細胞質であり、細胞質に囲まれた領域が核であると容易に判別することができる。領域分類画像１２は、この輝度の違いに基づき、使用者が手動で分類を行って作成した図である。なお、領域分類画像１２と共に分類の凡例が示されている。
【００４５】
この領域分類画像上に複数のＲＯＩを設定した。単一の領域に内包されるＲＯＩは、領域分類画像１２によらずとも、蛍光顕微鏡画像１１を見ながらでも容易に行うことができる。そのようにして、核のみを含むＲＯＩとして図中Ｂ，Ｇを、細胞質のみを含むＲＯＩとして図中Ｄ，Ｆを設定することができる。
【００４６】
細胞質を５０％含むＲＯＩ（図中Ａ，Ｅ）の設定は、マウスによってＲＯＩの枠を、細胞の縁付近で移動し、画面に表示される細胞質の占有率Ｒ（ｉ＝１）の値が０．５（５０％）になった位置でＲＯＩを確定する事によって行なうことができる。
【００４７】
核を３０％含むＲＯＩ（図中Ｃ，Ｈ，Ｉ）の設定は、マウスによってＲＯＩの枠を、核の縁付近で移動し、画面に表示される核の占有率Ｒ（ｉ＝２）の値が０．３（３０％）になった位置でＲＯＩを確定する事によって行なうことができる。図中ＩのＲＯＩは、核・細胞質・細胞外すべての領域を含み、＜Ｒ（０），Ｒ（１），Ｒ（２）＞＝＜０．１，０．６，０．３＞である。Ｒ（２）にのみ注目すれば図中ＣやＨと同様の領域と見なすこともできるし、核と細胞質のみを含むＲＯＩを選択したければ、Ｒ（０）＝０となるように注意してＲＯＩの場所を選択することができる。
【００４８】
従来は、使用者が目視によって、おおよその見当でＲＯＩを確定していたのに対して、本実施の形態では、Ｒ（ｉ）の値を見ながらＲＯＩを確定できるので、容易に再現性の高い設定を行うことができる。
【００４９】
続いて、上述の機能を用いてＲＩＣＳ解析を実施する方法について説明する。
【００５０】
培養神経細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）の細胞膜に発現するＧＭ１（ガングリオシド）に特異結合するＣＴｘＢ（コレラ毒素Ｂサブユニット）の系を用いた実施例を示す。ＡｌｅｘａＦｌｕｏ４８８を結合したＣＴｘＢ（ＣＴｘＢ−Ａｌｘ４８８）を培養細胞液に添加することによって、１０分以内で蛍光標識ＣＴｘＢが細胞膜に結合していることが観察された。ＣＴｘＢ−ＧＭ１複合体は膜上において並進拡散しているものと思われる。細胞膜にて結合した複合体は時間と共に細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれ、細胞質内にてダイナミックに動く輝粒エンドソームが見られた。この実験条件下において、以下のようにＲＩＣＳ計測を行った。
【００５１】
図６は、本実施の形態のコントロール細胞に対してＲＯＩを膜を含みながら移動させて拡散係数を求めた結果を示す図である。
図６（１）〜図６（７）に示すように、少しずつ細胞外を多く含む領域から細胞質を多く含む領域へとＲＯＩをずらしながら各位置において解析を行った。さらにＲＯＩ内細胞質のＲＯＩ全体に対する割合（ｒ）をそれぞれの位置で取得した。この割合（ｒ）は、上述の領域割合図１５に表示された値に基づいている。
【００５２】
図７は、本実施の形態のコントロール細胞に対して測定した拡散係数と割合（ｒ）との関係を示す図である。
図７に示すように、横軸に割合（ｒ）、縦軸に拡散係数Ｄ１をプロットすると、右肩下がりの曲線が得られた。
【００５３】
コントロール細胞ではＣＴｘＢは細胞膜のＧＭ１と結合した後、ＣＴｘＢ／ＧＭ１複合体はエンドサイトーシスによって取り込まれ、エンドソームとして細胞内を移動する。ＲＯＩ内の細胞質の割合を増やすにつれ、ＲＯＩ（ｒ＜０．２〜０．４）では拡散係数が少しずつ減少し、その後、細胞質の割合が半分以上になるｒ＝０．５〜１．０ではＤの値はほぼ一定となった。（Ｄ＝０．５）。
【００５４】
これは、ＲＯＩが占める細胞質の割合が増えるにつれて、細胞質に取り込まれたエンドソームの動きの影響を受けて、拡散係数が序々に小さくなったと考えられる。つまり、細胞膜における分子拡散に比べて、エンドサイトーシスの拡散のほうが遅いことから、このような傾きが認められたと言える。
【００５５】
即ち、ｒ＝１では全てが細胞質のエンドソームの結果を示し、ｒが小さくなるにつれて細胞質の影響が少なくなって細胞膜の影響がクローズアップされると考えられる。そうとすれば、実際にはＲＯＩのサイズや形状による制約があるために膜のみを選択して計測することが出来ないが、ｒ＝０の領域が細胞質の影響を全く受けない領域、即ち、このｒ＝０（グラフではｙ切片にあたる）での拡散係数値は膜のみの分子拡散係数と推測できる。
【００５６】
この推測を裏付けるため、細胞膜の構造を変化させた場合のＣＴｘＢ分子挙動を測定した結果について説明する。
細胞膜、特にラフト領域にはコレステロール分子が多く含まれていると言われているが、Ｍｅｔｈｙｌbｃｙｃｈｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（ＭβＣ）によって膜コレステロールを除去すると、エンドサイトーシスによるＣＴｘＢ分子の取り込みが抑制された結果、多くの複合体（蛍光蛋白質）は膜に留まる。
【００５７】
図８は、本実施の形態のＭβＣ処理細胞に対して測定した拡散係数と割合（ｒ）との関係を示す図である。
図８（１）〜図８（６）に示すように、少しずつ細胞外を多く含む領域から細胞質を多く含む領域へとＲＯＩをずらしながら各位置において解析を行った。さらにＲＯＩ内細胞質のＲＯＩ全体に対する割合（ｒ）をそれぞれの位置で取得した。この割合（ｒ）は、上述の領域割合図１５に表示された値に基づいている。
【００５８】
図９は、本実施の形態のＭβＣ処理細胞に対して、ＲＯＩが膜を含みながら移動して解析した結果を示す図である。
図９に示すように、解析結果から横軸に割合（ｒ）、縦軸に拡散係数Ｄ１をプロットすると、ＲＯＩの位置に関わらず、ＭβＣ処理細胞では拡散係数の変動が少ない特性が得られた。この結果から、細胞内のエンドソームの影響をあまり受けずに膜依存の分子情報が得られたと考えられる。
【００５９】
図１０は、本実施の形態の複数のコントロール細胞とＭβＣ処理細胞とについて計測し、統計的処理を行った結果を示す図である。
【００６０】
コントロール細胞はＭβＣ処理細胞に比べてＣＴｘＢのエンドサイトーシス取り込みが盛んで、細胞内エンドソームに包まれたＣＴｘＢが多いことから、エンドソームの比較的遅い動きに影響される。従って、細胞質領域が多くなるようにＲＯＩを動かすにつれてＤ値が小さくなった（右肩下がりの線）。
これに対して、ＭβＣ処理細胞ではエンドサイトーシスが抑制されることからエンドソームの影響が少ない。このため、ＲＯＩを移動してもＤ値の変動が少なかった（フラットの線）。
【００６１】
この２つの線を外挿して求めたｙ軸切片での値はほぼ等しい値であることがわかる。図１０に示すこの結果は、コントロール細胞のカーブがｙ軸切片と交差するＤ値はエンドソームの影響を全く受けない、膜のみの拡散係数を表わすと判断できる根拠となるものである。従って、図１０に示すように、コントロール細胞のカーブを求め、そのカーブがｙ軸切片と交差するＤ値を膜上ＣＴｘＢ分子の拡散係数とする方法は、膜のみの拡散係数を知るうえで簡便でかつ有効な方法と考えられる。また、コントロール細胞のカーブの形状からＣＴｘＢ分子が細胞内に取り込まれる状況を推測することが可能となり、細胞への試薬投与によって起こる細胞膜の機能変化を調べることが出来る。
【００６２】
この解析方法はＲＯＩの位置をずらしてその位置ごとのＤ値を計測して解析を行うものである。しかし、ＲＯＩの位置を取得画像におけるピクセル座標とすると、異なる位置に存在する複数の細胞からの計測値を比較することが出来ない。そこで位置パラメータとして割合（ｒ）を使用することによって、図１０に示すように同じ実験条件下の複数の細胞から得られた計測値を統計処理したり、異なる実験条件下の計測値を比較することが可能となる。
【００６３】
以上説明したように、同一ＲＯＩ内において異なる動きを示す分子が混在する場合、ＲＯＩ位置を変えながら各位置での計測を行うことによって位置情報も加えて計測結果を評価することが可能となる。本実施の形態で述べた方法は、エンドソームと細胞膜蛋白質の動きの違いのみならず、例えば細胞質と核における分子の挙動の違いを調べるのにも有効な方法と考えられる。
【００６４】
なお、上述の実施の形態では、ＲＯＩが膜を含みながら１方向に移動して解析したがこの形態に限られず、例えば、割合（ｒ）が、０．１→１→０．２→０．９→０．３→０．８→・・・と、膜をはさんで交互に位置するようにＲＯＩを移動して解析しても良い。このように移動することで、測定に要する時間経過の影響を緩和することができる。
【００６５】
また、割合（ｒ）が同じ値となる異なる複数の位置での解析をまとめて実施しても良い。例えば、割合が０．１となる位置での解析を複数実施し、その後、割合が０．２となる位置での解析を複数実施し、・・・割合が１．０となる位置での解析を複数実施するといった移動方法を採用しても良い。
【００６６】
さらに、ＲＯＩの位置は、使用者が手動で移動して設定しても良く、コントロールユニット５が自動で移動して設定しても良い。ＲＯＩのサイズが、解析手法の要請によって予め決定している場合、あらかじめ領域分類画像１２に基づいて、すべての可能なＲＯＩの位置での占有率を計算しておくことが可能である。そして、その情報を元にして、コントロールユニット５が、使用者が指定した割合の位置に自動でＲＯＩを移動して解析することができる。
【００６７】
本実施の形態で開示したＲＯＩ選択を補助する手法を用いれば、細胞質の割合が同一のＲＯＩを多数選択することができるため、それらのＲＯＩそれぞれについて得られた拡散係数について平均値を算出するなどの処理が可能である。従って、各ＲＯＩで拡散係数を求めた結果をディスク上に記録する際に、そのＲＯＩ中での細胞質の割合を同時に記録しておき、後の操作で統計的な解析を行う際に、その記録を呼び出して細胞質の割合の情報を解析に利用することができる。
【００６８】
なお、上述の各実施の形態で説明した機能は、ハードウェアを用いて構成するに留まらず、ソフトウェアを用いて各機能を記載したプログラムをコンピュータに読み込ませて実現することもできる。また、各機能は、適宜ソフトウェア、ハードウェアのいずれかを選択して構成するものであっても良い。
【００６９】
尚、本発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。
上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。
【符号の説明】
【００７０】
１…顕微鏡本体、２…レーザコンバイナー、２ｂ…ＲＯＩ、３…スキャンユニット、３ｂ…ＲＯＩ、４…ディテクタユニット、５…コントロールユニット、６…表示装置、７…記憶装置、８ａ…サンプル、８ｂ…蛍光画像、８ｃ…データ、１０…処理画面、１１…蛍光顕微鏡画像、１２…領域分類画像、１３…枠、１４…マウスカーソル。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の挙動を測定して解析する装置を用いて前記生体の測定領域内に含まれる小領域の特徴量を取得する方法であって、
前記小領域に隣接する他の小領域の割合を変化させて前記測定領域を移動して前記生体の挙動を測定して解析値を取得し、
前記他の小領域の割合と取得した解析値との関係から、前記他の小領域の割合が０である場合の解析値を算出し、
算出した解析値を前記小領域の特徴量とすること
を特徴とする特徴量の取得方法。
【請求項２】
前記生体の挙動を測定して解析する装置は、前記小領域に隣接する他の小領域の割合を提示するようになされていることを特徴とする請求項１に記載の特徴量の取得方法。
【請求項３】
前記小領域を境として、前記小領域の一方の側から他方の側に前記測定領域を移動させつつ前記生体の挙動を測定して解析値を取得することを特徴とする請求項２に記載の特徴量の取得方法。
【請求項４】
前記小領域を境として、前記小領域の一方の側と他方の側とに交互に前記測定領域を移動させつつ前記生体の挙動を測定して解析値を取得することを特徴とする請求項２に記載の特徴量の取得方法。
【請求項５】
前記小領域が膜領域であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の特徴量の取得方法。
【請求項６】
生体の挙動を測定して解析する装置に搭載されて前記生体の測定領域内に含まれる小領域の特徴量を取得する特徴量取得装置であって、
前記小領域に隣接する他の小領域の割合を変化させて前記測定領域を移動して前記生体の挙動を測定して解析値を取得する解析値取得手段と、
前記他の小領域の割合と取得した解析値との関係から、前記他の小領域の割合が０である場合の解析値を算出する解析値算出手段と、
算出した解析値を前記小領域の特徴量とする特徴量取得手段と
を備えたことを特徴とする特徴量取得装置。
【請求項７】
前記特徴量取得装置は、前記小領域に隣接する他の小領域の割合を算出する割合算出手段を有し、
前記解析値取得手段は、前記算出される割合が所定の割合となる位置に前記測定領域を移動して前記生体の挙動を測定することを特徴とする請求項６に記載の特徴量取得装置。
【請求項８】
前記解析値取得手段は、前記小領域を境として、前記小領域の一方の側から他方の側に前記測定領域を移動させつつ前記生体の挙動を測定して解析値を取得することを特徴とする請求項７に記載の特徴量取得装置。
【請求項９】
前記解析値取得手段は、前記小領域を境として、前記小領域の一方の側と他方の側とに交互に前記測定領域を移動させつつ前記生体の挙動を測定して解析値を取得することを特徴とする請求項７に記載の特徴量取得装置。
【請求項１０】
前記小領域が膜領域であることを特徴とする請求項５乃至９のいずれか１項に記載の特徴量取得装置。
【請求項１】
生体の挙動を測定して解析する装置を用いて前記生体の測定領域内に含まれる小領域の特徴量を取得する方法であって、
前記小領域に隣接する他の小領域の割合を変化させて前記測定領域を移動して前記生体の挙動を測定して解析値を取得し、
前記他の小領域の割合と取得した解析値との関係から、前記他の小領域の割合が０である場合の解析値を算出し、
算出した解析値を前記小領域の特徴量とすること
を特徴とする特徴量の取得方法。
【請求項２】
前記生体の挙動を測定して解析する装置は、前記小領域に隣接する他の小領域の割合を提示するようになされていることを特徴とする請求項１に記載の特徴量の取得方法。
【請求項３】
前記小領域を境として、前記小領域の一方の側から他方の側に前記測定領域を移動させつつ前記生体の挙動を測定して解析値を取得することを特徴とする請求項２に記載の特徴量の取得方法。
【請求項４】
前記小領域を境として、前記小領域の一方の側と他方の側とに交互に前記測定領域を移動させつつ前記生体の挙動を測定して解析値を取得することを特徴とする請求項２に記載の特徴量の取得方法。
【請求項５】
前記小領域が膜領域であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の特徴量の取得方法。
【請求項６】
生体の挙動を測定して解析する装置に搭載されて前記生体の測定領域内に含まれる小領域の特徴量を取得する特徴量取得装置であって、
前記小領域に隣接する他の小領域の割合を変化させて前記測定領域を移動して前記生体の挙動を測定して解析値を取得する解析値取得手段と、
前記他の小領域の割合と取得した解析値との関係から、前記他の小領域の割合が０である場合の解析値を算出する解析値算出手段と、
算出した解析値を前記小領域の特徴量とする特徴量取得手段と
を備えたことを特徴とする特徴量取得装置。
【請求項７】
前記特徴量取得装置は、前記小領域に隣接する他の小領域の割合を算出する割合算出手段を有し、
前記解析値取得手段は、前記算出される割合が所定の割合となる位置に前記測定領域を移動して前記生体の挙動を測定することを特徴とする請求項６に記載の特徴量取得装置。
【請求項８】
前記解析値取得手段は、前記小領域を境として、前記小領域の一方の側から他方の側に前記測定領域を移動させつつ前記生体の挙動を測定して解析値を取得することを特徴とする請求項７に記載の特徴量取得装置。
【請求項９】
前記解析値取得手段は、前記小領域を境として、前記小領域の一方の側と他方の側とに交互に前記測定領域を移動させつつ前記生体の挙動を測定して解析値を取得することを特徴とする請求項７に記載の特徴量取得装置。
【請求項１０】
前記小領域が膜領域であることを特徴とする請求項５乃至９のいずれか１項に記載の特徴量取得装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１２−１９８１４０（Ｐ２０１２−１９８１４０Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６３１４３（Ｐ２０１１−６３１４３）
【出願日】平成２３年３月２２日（２０１１．３．２２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２２日（２０１１．３．２２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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