生きた細胞をフィルタ上で分離して培養するまたはその細胞の遺伝子材料を抽出するための装置と方法
生きた細胞をフィルタ上で分離して培養するか、その細胞の遺伝子材料を抽出するための装置は、フィルタに固定されたフィルタ支持体（１０８）と、上方開口部および下方開口部を有する区画（１０２）と、フィルタ支持体に力を加えてそのフィルタ支持体を解放するために区画に対して移動する移動手段（１１０）とを備えている。本発明の実施態様によれば、フィルタ支持体は、上記の力が加えられるまで、区画または移動手段にメカニカルに接続されている。この装置は、気密かつ取外し可能に固定されていて、力を加えてフィルタ支持体を解放することを可能にする相対運動を前記移動手段と区画に禁じる取外し可能な先端部（１０４）を備えることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きた細胞をフィルタ上で分離して培養するか、フィルタ上で分離された生きた細胞の増幅された遺伝子材料を抽出するための装置と方法に関する。本発明は特に、液体、その中でも特に血液の中に存在する特定の細胞を分離して培養すること、またはその特定の細胞の遺伝子材料を抽出することに応用される。
【背景技術】
【０００２】
血液の特定のいくつかの細胞（例えば腫瘍細胞または栄養芽層）は割合が非常に少ないため、それらを数え上げて細胞学的分析を行なう必要がある。しかしそのような細胞は、血液中に存在する他の主要な細胞と比べてサイズが大きい。
【０００３】
ホルムアルデヒドをベースとした固定用パッドを血液サンプルに適用して求める細胞を固定した後、得られた液体を多孔性フィルタに通過させることが知られている。次にこのフィルタを利用し、実験室において顕微鏡下で求める細胞をそのフィルタの中に探す。しかしこの手続きでは生きた細胞を得ることはできない。
【０００４】
ところで発明者は、生きた細胞が得られると、腫瘍細胞または栄養芽層の中にある遺伝子の異常を診断するために特定のマーカーを同定し、分子生物学の技術、細胞遺伝学の技術、“ＦＩＳＨ”（蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーションの略号）の技術をよい条件で適用できるであろうと判断した。
【０００５】
本発明は、こうした欠点を解消してこの要求に応え、生きた細胞を実験室でのルーチンの試験に合った条件で回収できるようにすることを目的とする。その細胞は、その後、十分な増殖因子が存在する適切な培地の中で培養される。
【０００６】
本発明は、フィルタ上で分離された細胞の増幅された遺伝子材料の抽出と、標的療法または遺伝子の異常に対する感受性と耐性のある遺伝子の突然変異および発現レベルの検出、すなわち遺伝子の異常の検出にも関する。
【０００７】
本発明は特に、液体、その中でも特に血液の中に存在する特定の細胞のＤＮＡまたはＲＮＡを回収して一様に増幅することに応用される。
【０００８】
例えば文献ＰＣＴ／ＦＲ２００６／０００５６２から、ホルムアルデヒドをベースとした固定用パッドを血液サンプルに適用して求める細胞を固定した後、得られた液体を多孔性フィルタを通過させることが知られている。次いでこのフィルタは実験室で分析され、求める細胞を顕微鏡下でそのフィルタの中に探す。その後、フィルタ上でその細胞を採取して分析（例えば遺伝子分析）することができる。
【０００９】
しかしこの手続きは、必要とされる時間、材料、作業精度のため、大きなスケールと納得できるコストで再現することができない。ところでこのように大きなスケールで再現することとコストを最少にすることが可能だと、腫瘍細胞と栄養芽層細胞の両方に関して分子生物学的分析ができるであろう。
【００１０】
本発明は、こうした欠点を解消してこの要求に応え、細胞材料（特に求める細胞のＲＮＡとＤＮＡ）の多くを、実験室でのルーチンの試験に合った条件にて、よい状態で回収できるようにすることも目的とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで第１の特徴によれば、本発明は、フィルタ上で生きた細胞を分離するか、その細胞の遺伝子材料を抽出するための装置であって、
− フィルタに固定されたフィルタ支持体と、
− 上方開口部と下方開口部を有する区画と、
− フィルタ支持体に力を加えてそのフィルタ支持体を解放するために区画に対して移動する移動手段とを備えることを特徴とする装置を目的とする。
【００１２】
したがって、フィルタ上の生きた細胞または遺伝子材料の汚染または劣化が完全に回避される。適合した層流式ドラフトで操作を行なうとき、区画の培養物は無菌状態に維持される。したがって細胞を分離して培養するすべてのステップ、またはその遺伝子材料を抽出して分析するすべてのステップは、無菌状態で実行することができる。
【００１３】
したがってこの装置により、細胞形態学と細胞遺伝学の特徴を明らかにする実験を行なうための培養に完全に合った条件で、興味の対象である生きた細胞を回収することができる。この回収は、フィルタ上で直接行い、求める細胞が失われることは実質的にない。したがって、求める細胞の多くの割合が、実験室でのルーチンの培養に合った条件にて、よい状態かつ最少コストで回収される。
【００１４】
本発明が対象とする装置により、特定の細胞の細胞材料の迅速かつ効率的な回収も、例えば
− その特定の細胞と他の細胞の直径の中間の直径の微細孔を持つフィルタを、液体の大半と前記他の細胞を通過させる濾過ステップと、
− 区画内でＤＮＡおよび／またはＲＮＡを溶解させて増幅するステップと、
− 溶解させた細胞の増幅された遺伝子材料をフィルタ上で回収するステップを実施した後に実現することができる。
【００１５】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする装置は、気密かつ取外し可能に固定されていて、前記力を加えてフィルタ支持体を解放することを可能にする相対運動を移動手段と区画に禁じる取外し可能な先端部を備えている。
【００１６】
このような構成になっているおかげで、フィルタ支持体を確実に所定の位置に保持できる。それに加え、先端部は、フィルタ支持体をしぶきと汚染から保護することができる。
【００１７】
したがって濾過の間を通じてフィルタを保持し、次いで先端部を引っ張り、移動手段と区画をそれぞれ動かして力を加えることでフィルタ支持体を解放することにより、フィルタを解放して回収する。
【００１８】
特別な特徴によれば、先端部は、吸引システムの圧力低下室に合った下方開口部を有する。
【００１９】
このような構成になっているおかげで、圧力低下室の中で吸引することにより、区画の中に存在する興味の対象である細胞よりも小さな細胞と、溶解している可能性のある細胞と、液体の大半を濾過することができる。
【００２０】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、ワッシャの形態を取っている。ここで、ワッシャはリング状のフィルタ支持体であることを思い起こしておく。
【００２１】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体はＰＶＣからなる。実際、発明者は、疎水性ポリエチレンとは違ってこの材料が浮かぶことはなく、疎水性ポリエチレンよりも堅固であることを確認した。そのため培養ウエルの底でフィルタ支持体を使用する上で有利である。
【００２２】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は堅固なＰＶＣからなる。そうなっていることで、細胞形態学と細胞遺伝学の分析中にフィルタを操作することができる。
【００２３】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、カバーガラスの形態を取っている。
【００２４】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、カバーガラスと同じかそれよりも大きなサイズである。そうなっていることで、フィルタをガラス板とカバーガラスの間に取り付けることができる。
【００２５】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体の厚さは０．４ｍｍ以下であり、０．３ｍｍ以下であることが好ましい。
【００２６】
このような構成になっているおかげで、フィルタ支持体を顕微鏡下で用い、倍率が大きいときでさえ、フィルタ支持体を横方向に移動させるときにリスクなしに顕微鏡の一部に触ることができる。
【００２７】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、エッペンドルフ管の少なくとも一部の形態を取っている。
【００２８】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、上部内側において、エッペンドルフ管の上部内側の形態を再現している。
【００２９】
このような構成になっているおかげで、フィルタ支持体の上部開口部をエッペンドルフ管の栓で閉じることができる。
【００３０】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、下部内側において、エッペンドルフ管の下部内側の形態を再現している。
【００３１】
特別な特徴によれば、フィルタは直径が５ｍｍ以下であり、３．５ｍｍ以下が好ましい。そうなっていると、細胞を溶解させることと遺伝子材料をあらかじめ増幅することが容易になる。
【００３２】
したがってエッペンドルフ管の下部内面を真似ることができる。
【００３３】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、上部外側において、エッペンドルフ管の上部内側の形態を再現している。
【００３４】
このような構成になっているおかげで、フィルタ支持体は、エッペンドルフ管の上部に嵌まることができる。
【００３５】
したがってフィルタ支持体の上部外側とエッペンドルフ管の上部内側の間を気密にすることができる。
【００３６】
上に示した最後の３つの構成のおかげで、フィルタ支持体はカラム機能を有する。
【００３７】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体はポリカーボネートを含んでいる。
【００３８】
このような構成になっているおかげで、フィルタの孔は、溶解用パッドと遺伝子材料を増幅するための反応物質を保持する。
【００３９】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、力が加えられるまで区画にメカニカルに接続されている。
【００４０】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、力が加えられるまで移動手段にメカニカルに接続されている。
【００４１】
第２の側面によれば、本発明は、生きた細胞をフィルタ上で分離するか、その細胞の遺伝子材料を抽出するための方法であって、
− フィルタに固定されたフィルタ支持体を、上方開口部と下方開口部を有する区画と一体化するか、その区画に対して移動する移動手段と一体化するステップと、
− フィルタ支持体に力を加えてそのフィルタ支持体を解放するため、移動手段と区画をそれぞれ運動させるステップを含むことを特徴とする方法を目的とする。
【００４２】
特別な特徴によれば、運動ステップにおいてフィルタ支持体を培養ウエルに直接移行させる。
【００４３】
したがってフィルタ上の生きた細胞、または抽出された遺伝子材料の汚染または劣化が完全に回避される。こうした各構成のおかげで、層流式ドラフトのもとで操作するときに区画の内容物は無菌状態に維持される。したがってすべてのステップが、細胞の培養または遺伝子材料の抽出に適した無菌条件で実施される。
【００４４】
この方法の特別な利点、目的、特徴は、本発明が対象とする装置（例えば上に簡単に説明した装置）と同様であるため、ここに再現することはしない。
【００４５】
したがって本発明が対象とする方法により、細胞材料を迅速かつ効率的に回収することができる。一般に、本発明を実行して回収した細胞材料は、細胞の遺伝子材料である。したがって本発明が対象とする方法により、稀な細胞の遺伝子材料を、分離された１個の細胞まで、損失なくフィルタ上で直接回収することができる。したがって対象とする細胞の遺伝子材料の多くの割合が、ルーチンの実験室での実験に合った条件にて、よい状態で回収される。
【００４６】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする方法（例えば上に簡単に説明した方法）は、溶解ステップの後、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの増幅ステップを含んでおり、回収ステップにおいて、溶解した細胞の増幅された遺伝子材料を回収する。
【００４７】
特別な特徴によれば、溶解と増幅のステップにおいて、ＤＮＡとＲＮＡの定量的な側面を維持する一様な増幅を実行する。
【００４８】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする方法（例えば上に簡単に説明した方法）は、増幅されたＤＮＡをマトリックスとして利用し、少なくとも１つの標的療法に対する感受性または耐性のある遺伝子の少なくとも１つの突然変異を検出するステップをさらに含んでいる。
【００４９】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする方法（例えば上に簡単に説明した方法）は、増幅されたＤＮＡをマトリックスとして利用し、標的療法に対する感受性または耐性のある遺伝子の発現レベルの変化を検出するステップをさらに含んでいる。
【００５０】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする方法（例えば上に簡単に説明した方法）は、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、そのｃＤＮＡを利用して標的療法に対する感受性または耐性のある遺伝子の発現レベルを検出するステップをさらに含んでいる。
【００５１】
特別な特徴によれば、検出ステップにおいて、リアルタイム定量ＰＣＲ（“ポリメラーゼ連鎖反応の略号”）を利用する。
【００５２】
特別な特徴によれば、検出ステップにおいて、少なくとも一対のセンス・プライマとアンチ−センス・プライマを利用して興味の対象である所定の配列を増幅する。
【００５３】
特別な特徴によれば、検出ステップにおいて、少なくとも一対のプローブを利用する。
【００５４】
特別な特徴によれば、一対のプローブの少なくとも２つのプローブは異なる２種類の蛍光色素と結合しており、一方が突然変異した配列を認識し、他方が正常な配列を認識するようにされている。
【００５５】
特別な特徴によれば、少なくとも一対のプライマと一対のプローブは、エルロチニブとゲフィチニブに耐性のあるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異Ｇ１２Ｄを検出することができる。
【００５６】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００５７】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００５８】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００５９】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６０】
特別な特徴によれば、少なくとも一対のプライマと一対のプローブは、エルロチニブとゲフィチニブに耐性のあるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異Ｇ１２Ｖを検出することができる。
【００６１】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６２】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６３】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６４】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６５】
特別な特徴によれば、少なくとも一対のプライマと一対のプローブは、エルロチニブとゲフィチニブに耐性のあるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異Ｇ１３Ｃを検出することができる。
【００６６】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６７】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６８】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６９】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＧＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００７０】
特別な特徴によれば、少なくとも一対のプライマと一対のプローブは、エルロチニブとゲフィチニブに対する感度が増大するＥＧＦＲ遺伝子の突然変異Ｌ８５８Ｒを検出することができる。
【００７１】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００７２】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００７３】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡの少なくとも８０％を含んでいる。
【００７４】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＡの少なくとも８０％を含んでいる。
【００７５】
第３の側面によれば、本発明は、フィルタ上で生きた細胞を分離するための装置であって、
− フィルタに固定されたフィルタ支持体と、
− 上方開口部と、フィルタ支持体とフィルタを保持するのに適した下方開口部とを有する区画と、
− 区画の内側からフィルタ支持体に力を加える手段とを備えることを特徴とする装置を目的とする。
【００７６】
この装置により、遺伝子の試験を行なうための培養に完全に適した条件で、興味の対象である生きた細胞を回収することができる。
【００７７】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする装置（例えば上に簡単に説明した装置）は、区画内に、フィルタ支持体に支持されて、区画内に挿入されるピストンが及ぼす力を受けるようにされた１つの可動部材を備えている。
【００７８】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする装置（例えば上に簡単に説明した装置）は、下方開口部に、フィルタとフィルタ支持体を保持する先端部を備えている。この先端部は、区画に対して気密かつ取外し可能に固定されている。
【００７９】
このような構成になっているおかげで、濾過の間を通じてフィルタが保持され、次いで先端部を引っ張り、区画の内側からフィルタ支持体に力を加えることで、そのフィルタが解放される。
【００８０】
特別な特徴によれば、先端部は、圧力低下室に合った下方開口部を有する。
【００８１】
このような構成になっているおかげで、圧力低下室の中で吸引することにより、区画の中に存在する興味の対象である細胞よりも小さな細胞と、溶解している可能性のある細胞と、液体の大半を濾過することができる。
【００８２】
第４の側面によれば、本発明は、液体中に存在する細胞を回収する方法であって、
− 上方開口部と下方開口部を備えていて内部にフィルタ支持体とフィルタを保持することができる区画にフィルタ支持体を固定するステップと、
− フィルタを通して生きた細胞を含む液体を濾過するステップと、
− 区画の内側からフィルタ支持体に力を加えて区画の外でフィルタを回収するステップを含む方法を目的とする。
【００８３】
この方法の特別な利点、目的、特徴は、本発明の第３の側面の装置（例えば上に簡単に説明した装置）と同様であるため、ここに再現することはしない。
【００８４】
第５の側面によれば、本発明は、生きた細胞をフィルタ上で分離する方法であって、
− 上方開口部と下方開口部を備えていて、その２つの開口部の間にはフィルタが配置され、そのフィルタの小孔は、特定の細胞と他の細胞の直径の中間の直径を持つ構成にされた区画の上方開口部を通じ、前記生きた細胞を含む液体とフィルタ用パッドをその区画の中に固定剤なしで挿入するステップと、
− 液体の大半と前記他の細胞がフィルタを通過する濾過ステップと
− フィルタと、フィルタ上に残った細胞とを回収するステップを含む方法を目的とする。
【００８５】
この方法により、遺伝子の試験を行なうための培養に完全に適した条件で、興味の対象である生きた細胞を回収することができる。この回収はフィルタ上で直接行い、求める細胞が失われることは実質的にない。したがって対象とする細胞の多くの割合が、ルーチンの実験室での培養に合った条件にて、よい状態で回収される。
【００８６】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする方法（例えば上に簡単に説明した方法）は、濾過ステップの前に、培地と、特定の細胞を含む液体に溶ける物質とからなる固定剤なしで、フィルタ用パッドを取り付けるステップを含んでいる。
【００８７】
特別な特徴によれば、濾過ステップにおいて、吸引してフィルタの下方で２５ミリバール以下の圧力低下を起こさせる。
【００８８】
このような構成になっているおかげで、濾過は効率的かつ迅速に行なわれ、フィルタ上で回収する生きた細胞が傷むことはない。
【００８９】
特別な特徴によれば、濾過ステップにおいて、区画の先端部がフィルタをその区画の中に保持し、フィルタ回収ステップにおいて、区画の先端部を引っ張り、区画の中にピストンを導入し、そのピストンでフィルタ支持体に力を加える。
【００９０】
この力により、フィルタを区画の下端に有するフィルタ支持体を、したがってフィルタを、区画から取り出すことができる。それに加え、力はフィルタに直接は作用しないため、過剰な圧力が発生することはなく、このフィルタに載った細胞がフィルタの回収時に傷むことはない。
【００９１】
特別な特徴によれば、回収ステップにおいて、フィルタを区画からプレートのウエルおよび／または培養容器まで直接移動させる。
【００９２】
このようにすると、フィルタ上の生きた細胞が汚染されたり劣化したりすることが完全に回避される。このような各構成のおかげで、区画の内容物は、細胞を無菌条件で操作できるような層流式ドラフトで操作するとき、無菌状態に維持される。
【００９３】
第６の側面によれば、本発明は、液体中に存在する細胞を回収する装置であって、
− 液体とフィルタパッドを、固定剤なしで、上方開口部と下方開口部を有する区画の中に、その区画の上方開口部を通じて挿入する手段と、
− 直径が特定の細胞と他の細胞の直径の中間である小孔を備えていて、区画の２つの開口部の間に位置するフィルタと、
− 液体の大半と前記他の細胞をフィルタにかけて通過させる濾過手段と、
− フィルタと、そのフィルタ上に残った細胞を回収する手段を備える装置を目的とする。
【００９４】
この装置の特別な利点、目的、特徴は、本発明の第５の側面が対象とする方法（例えば上に簡単に説明した方法）と同様であるため、ここに再現することはしない。
【００９５】
本発明の他の利点、目的、目的は、添付の図面を参照した以下の記述に現われるであろう。なおこの記述は説明を目的としたものであり、本発明がこの記述に限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明が対象とする装置の第１の実施態様を構成する部材の集合を斜めから見た概略図である。
【図２】使用前の装置の第１の実施態様を互いに垂直な軸で切断した断面の概略図である。
【図３−１】本発明が対象とする装置の第１の実施態様を実現するステップの大まかな立面図または断面図である。
【図３−２】本発明が対象とする装置の第１の実施態様を実現するステップの大まかな立面図または断面図である。
【図４】本発明が対象とする方法の特別な第１の実施態様を実行するステップのフロー・チャートである。
【図５】本発明が対象とする装置の特別な第２の実施態様を構成する部材の集合を斜めから見た概略図である。
【図６】装置の第２の実施態様を互いに垂直な軸で切断した断面の概略図である。
【図７−１】本発明が対象とする装置の第２の実施態様を実現するステップの大まかな立面図または断面図である。
【図７−２】本発明が対象とする装置の第２の実施態様を実現するステップの大まかな立面図または断面図である。
【図８】本発明が対象とする装置の第２の実施態様に組み込まれたフィルタ支持体の断面図である。
【図９】本発明が対象とする方法の特別な第２の実施態様を実行するステップのフロー・チャートである。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
図１には、リザーバまたは区画１０２と、先端部１０４と、接合具１０６と、フィルタ支持体１０８と、移動手段１１０と、接合具１１２と、栓１１４が見られる。
【００９８】
区画１０２は全体が円筒形である。その上端は、栓１１４で塞いで気密にすることができる。区画１０２の下端は、外面に不連続な複数のリングを有する。その不連続部によって移動手段１１０の突起部がガイドされる。そのリングの方は、移動手段１１０の本体をガイドする。
【００９９】
この移動手段１１０は全体が円筒形であり、先端部１０４に向かって延びる２つの突起部１１６を有する。これら突起部１１６は、フィルタ支持体１０８の直径よりも小さな距離だけ互いに離れた状態でこの方向に狭まっていく。図からわかるように、その後、この特別な形状、特に突起部１１６が互いの方に向かって曲がっている形状により、移動手段１１０は、フィルタ支持体１０８の方に運動するとき、先端部１０４から取り出した後にフィルタ支持体１０８を押して区画１０２から解放することができる。
【０１００】
移動手段１１０の突起部１１６の端部と区画１０２の下端は、培養箱または培養ウエルの中に侵入できるようにされている。逆に、区画１０２の端部の不連続なリングは、培養箱または培養ウエルの縁部に支持されるのに適した直径を有する。
【０１０１】
区画１０２の下方開口部には、気密かつ無菌状態かつ取り外し可能に、先端部またはアダプタ１０４が配置される。この先端部１０４は区画１０２の外壁を締め付けており、区画１０２の直径よりも小さな直径の先細になった下方開口部を有する。
【０１０２】
先端部１０４またはアダプタのこの先細になった下方開口部は、圧力が低下しているチェンバーから来るしぶきによって区画１０２の先端が潜在的に汚染されることを回避するのに十分な長さを有する。
【０１０３】
先端部１０４は、区画１０２の下端にある側方突起部１１８の形状に合致していて公知のやり方でその突起部を締め付けるための回転による固定手段を有する。したがって先端部１０４は、濾過ステップの間を通じてフィルタ支持体を確実に所定の位置に保持する。それに加え、先端部１０４は、フィルタをしぶきや汚染物から保護する。
【０１０４】
区画１０２の下端には、組み立て後、フィルタ支持体１０８によって支持されるフィルタに向かって開いている開口部がある。フィルタ支持体１０８それ自体は、区画１０２の下端と先端部１０４によって所定の位置に保持される。
【０１０５】
フィルタ支持体１０８は、第１の実施態様では、リング形のワッシャの形態を取る。フィルタには微細な孔が開けられている。このフィルタはフィルタ支持体１０８の下に接合され、次いで区画１０２の下端にワッシャとともに挿入される。
【０１０６】
フィルタ支持体１０８はＰＣＶでできていることが好ましく、厚さは０．４ｍｍ以下である。厚さは０．３ｍｍ以下であることが好ましい。フィルタ支持体の外径は、例えば１２．６ｍｍである。フィルタ支持体１０８に支持されるフィルタの直径は、例えば８．２ｍｍである。
【０１０７】
区画１０２、先端部１０４、移動手段１１０は、例えばポリプロピレンで実現される。接合具１０６と１１２は、例えばシリコーンでできている。
【０１０８】
図２Ａと図２Ｃは、図１に示した部材が組み立てられた状態の本発明による装置の第１の実施態様を互いに垂直な軸で切断した断面図である。図２Ｂと図２Ｄは、それぞれ図２Ａと図２Ｃの一部を拡大した詳細図である。図２Ａ〜図２Ｄには、図１で説明した要素が再び見られる。
【０１０９】
図３Ａは、装置が保管の構成になっているときの立面図である。図３Ｂは、栓１１４を外して区画１０２に上方開口部から液体（例えば血液）（図示せず）を導入した後、公知のタイプの吸引システム（図示せず）の支持台１２０の中に配置された装置を示している。図３Ｃは、図３Ｂの一部の拡大詳細図である。図３Ｂと図３Ｃから、先端部１０４が部材１２２の中で所定の位置に保持されていることと、ドーナツ状接合具１２４が先端部の内部（したがってフィルタ支持体１０８を通じて区画１０２の内部）と吸引システムの吸引室の間の接続の気密性を保証していることがわかる。先端部１０４は吸引室の内部を貫通していることがわかる。
【０１１０】
吸引時には、区画１０２の中に存在する液体中の直径がより大きな特定のいくつかの細胞がフィルタに保持されるのに対し、液体の大半、溶解した細胞の中身と壁、回収する細胞よりもサイズが小さい細胞は、フィルタを通じて区画１０２の外へ吸引される。
【０１１１】
図３Ｄからわかるように、濾過後、装置を支持台から引き抜く。次に、図３Ｅと図３Ｆに示してあるように、回転させて先端部１０４を突起部１１８から解放した後、その先端部１０４を引き抜く。次に、図３Ｇと図３Ｈに示してあるように、区画１０２の先端を培養箱または培養ウエル１３０の中に挿入する。
【０１１２】
上に説明するとともに図３Ｉに示してあるように、移動手段１１０の突起部１１６の互いに近づいていく端部と区画１０２の下端は、培養箱または培養ウエルの中に侵入するのに適している。逆に、区画１０２の不連続な端部リングは、培養箱または培養ウエル１３０の縁部に支持されるのに適した直径を有する。
【０１１３】
より詳細には、図３Ｊと図３Ｋからわかるように、移動手段１１０は、この位置でまだ区画１０２の軸線に平行に動くことができる。
【０１１４】
図３Ｎと図３Ｍからわかるように、この運動の際には、操作者の指によって動かされる移動手段の突起部１１６が、フィルタ支持体１０８に対して鉛直方向の力を上から下に及ぼし、フィルタ支持体を区画１０２の下端から解放する。するとフィルタ支持体１０８は、培養箱または培養ウエル１３０の中に落ちる。
【０１１５】
最後に、図３Ｏからわかるように、区画１０２と移動手段１１０を培養箱または培養ウエル１３０から引き抜く。
【０１１６】
図４は、このように実施するステップのまとめである。
【０１１７】
ステップ２０２では、装置を構成する部材を組み立てる。ステップ２０４では、装置を吸引システムの支持台１２０の中に配置する。ステップ２０６では、栓１１４を外す。ステップ２０８では、培養する細胞を含む液体（例えば血液）を区画１０２の上端から導入する。
【０１１８】
ステップ２１０では、吸引システムの圧力低下室の中で吸引することにより、区画１０２の中に存在する興味の対象となる細胞よりも小さい細胞と、溶解している可能性のある細胞と、液体の大半を濾過する。
【０１１９】
ステップ２１２では、装置を支持台から引き抜く。ステップ２１４では、先端部１０４を引き抜く。ステップ２１６では、区画１０２の先端を培養箱または培養ウエルの中に挿入する。
【０１２０】
ステップ２１８では、移動手段と区画をそれぞれ運動させてフィルタ支持体に力を及ぼすことによってそのフィルタ支持体を解放し、フィルタ支持体が培養箱または培養ウエルの中に落ちるようにする。ステップ２２０では、区画１０２と移動手段１１０を培養箱または培養ウエル１３０から引き抜く。
【０１２１】
ステップ２２０では、培養ウエル１３０の中で公知のようにして培養を実行する。フィルタの上面（その面には、フィルタ上で分離された細胞が載っている）のまわりにフィルタ支持体１０８が存在することで、細胞がフィルタから離れることを回避できることがわかる。
【０１２２】
フィルタ上にある興味の対象である生きた細胞を培養するステップでは、フィルタは、例えば、その興味の対象である細胞の増殖に適した因子を含む薄いマトリゲル層で覆う（か、プレートのウエルおよび／または培養容器の底にあらかじめ配置したマトリゲル（登録商標）層の上にフィルタが載って接触した状態にする）。
【０１２３】
ステップ２２２において細胞またはその細胞の遺伝子材料を観察したいときには、フィルタ支持体１０８を掴む。フィルタ支持体１０８の上面の側方に円筒形の穴が存在することにより、ピンセットでフィルタ支持体を掴むことが容易になる。
【０１２４】
次に、フィルタ支持体１０８をガラス板の上に置き、フィルタの自由な上面に合った直径の円板形のカバーガラスをフィルタに押し付ける。次いで、細胞またはその細胞の遺伝子材料の分析を公知のようにして行なう。
【０１２５】
図５に、リザーバまたは区画３０２、先端部３０４、接合具３０６、フィルタ支持体３０８、移動手段３１０、接合具３１２、栓３１４が見られる。
【０１２６】
区画３０２は全体が円筒形である。その上端は、栓３１４で塞いで気密にすることができる。区画３０２の下端は、外面に、側方リブ３５２の形態でのメカニカルな接続によって接続されるとき以外は区画３０２の本体と分離している円筒部３５０を有する。この円筒部３５０は、移動をガイドするため、移動手段３１０の本体の内径に対応する外径を有する。円筒部３５０には、移動手段３１０の突起部３１６を侵入させて長手方向に滑らせることのできるスリット３５４が設けられている。
【０１２７】
移動手段３１０は全体が円筒形であり、先端部３０４に向かって延びる２つの突起部３１６を有する。これらの突起部３１６は、フィルタ支持体３０８の直径よりも小さな距離だけ互いに離れた状態でこの方向に狭まっていく。図からわかるように、その後、この特別な形状、特に突起部３１６が互いの方に向かって曲がっている形状により、移動手段３１０は、フィルタ支持体３０８の方に運動するとき、先端部３０４から取り出した後にフィルタ支持体３０８を押して区画３０２から解放することができる。
【０１２８】
先端部３０４は、側方突起部３１８を有する区画３０２の下端の形状に合致していて公知のやり方でその突起部を締め付けるための回転による固定手段を有する。したがって先端部３０４は、濾過ステップの間を通じてフィルタ支持体を確実に所定の位置に保持する。それに加え、先端部３０４は、フィルタをしぶきや汚染物から保護する。
【０１２９】
区画３０２の下端には、組み立て後、フィルタ支持体３０８によって支持されるフィルタに向かって開いている開口部がある。フィルタ支持体３０８それ自体は、区画３０２の下端と先端部３０４によって所定の位置に保持される。
【０１３０】
図８からわかるように、フィルタ支持体３０８は、第２の実施態様では、エッペンドルフ管の形状に合致した形態を取る。
【０１３１】
特に、
− フィルタ支持体３０８は、上部内側において、エッペンドルフ管の上部内側の形状を有する。するとこのフィルタ支持体の上方開口部をエッペンドルフ管の栓で閉じることができる。
− フィルタ支持体３０８は、下部内側において、エッペンドルフ管の下部内側の形状を有する。するとエッペンドルフ管の下部内面を真似ることができる。
− フィルタ支持体３０８は、下部外側において、エッペンドルフ管の上部内側の形状を有する。するとこのフィルタ支持体３０８をエッペンドルフ管の上部の中に挿入することができる。
【０１３２】
それに加え、フィルタ支持体３０８は、フィルタ上に保持された細胞を溶解させるとともに、フィルタ支持体の細胞ライセートと遺伝子材料をエッペンドルフ管に向かって移すことを可能にするカラム機能を有する。
【０１３３】
フィルタ支持体３０８は、ＰＣ（ポリカーボネート）でできていることが好ましい。区画３０２と、先端部３０４と、移動手段３１０は、例えばポリプロピレンで実現される。接合具３０６と３１２は、例えばシリコーンからなる。
【０１３４】
図６Ａと図６Ｃは、図５に示した部材が組み立てられた状態の本発明による装置の第２の実施態様を互いに垂直な軸で切断した断面図である。図６Ｂと図６Ｄは、それぞれ図６Ａと図６Ｃの一部を拡大した詳細図である。図６Ａ〜図６Ｄには、図５で説明した要素が再び見られる。
【０１３５】
図７Ａは、装置が保管の構成になっているときの立面図である。図７Ｂは、栓３１４を外して区画３０２に上方開口部から液体（例えば血液）（図示せず）を導入した後、公知のタイプの吸引システム（図示せず）の支持台３２０の中に配置された装置を示している。図７Ｃは、図７Ｂの一部の拡大詳細図である。図７Ｂと図７Ｃから、先端部３０４が部材３２２の中で所定の位置に保持されていることと、ドーナツ状接合具３２４が先端部の内部（したがってフィルタ支持体３０８を通じて区画３０２の内部）と吸引システムの吸引室の間の接続の気密性を保証していることがわかる。先端部３０４は吸引室の内部を貫通していることがわかる。
【０１３６】
したがって、区画３０２の中に存在する興味の対象となる細胞よりもサイズが小さい細胞、溶解している可能性のある細胞、液体の大半は、圧力低下室の中で吸引することによって濾過される。
【０１３７】
図７Ｄからわかるように、濾過後、装置を支持台から引き抜く。次に、図７Ｅと図７Ｆに示してあるように、回転させて先端部３０４を突起部３１８から解放した後、その先端部３０４を引き抜く。次に、図７Ｇ、図７Ｈ、図７Ｉに示してあるように、区画３０２の先端を、エッペンドルフ管３３０が取り付けられたエッペンドルフ管支持体３２８の中に挿入する。
【０１３８】
図７Ｊと図７Ｋからわかるように、次に、移動手段３１０を区画３０２の軸線に平行に下方に移動させる。この運動の際には、操作者の指によって動かされる移動手段３１０の突起部３１６が、フィルタ支持体３０８に対して鉛直方向の力を上から下に及ぼし、フィルタ支持体を区画３０２の下端から解放する。するとフィルタ支持体３０８は、エッペンドルフ管３３０の中に落ちる。
【０１３９】
最後に、図７Ｌからわかるように、区画３０２と移動手段３１０を引き抜く。
【０１４０】
図９には、このように実施するステップのまとめである。
【０１４１】
ステップ４０２では、装置を構成する部材を組み立てる。ステップ４０４では、装置を公知のタイプの吸引システム（図示せず）の支持台３２０の中に配置する。ステップ４０６では、栓３１４を外す。ステップ４０８では、培養する細胞を含む液体（例えば血液）を区画３０２の上端から導入する。
【０１４２】
ステップ４１０では、吸引システムの圧力低下室の中で吸引することにより、区画３０２の中に存在する興味の対象となる細胞よりも小さい細胞と、溶解している可能性のある細胞と、液体の大半を濾過する。
【０１４３】
ステップ４１２では、装置を支持台から引き抜く。ステップ４１４では、先端部３０４を引き抜く。ステップ４１６では、区画３０２の先端をエッペンドルフ管の中に挿入する。
【０１４４】
ステップ４１８では、移動手段と区画をそれぞれ運動させてフィルタ支持体に力を及ぼすことによってそのフィルタ支持体を解放し、エッペンドルフ管の中に落とす。最後に、ステップ４２０では、区画３０２と移動手段３１０を引き抜き、エッペンドルフ管の栓を再び閉じる。
【０１４５】
次に、エッペンドルフ管を公知の方法で利用する。そのためには、例えばゲノム全体をあらかじめ増幅した後、遺伝子材料の溶解ステップ、遠心分離ステップ、回収ステップを実施する。
【０１４６】
ステップ４２２と４２４では、エッペンドルフ管１２５または１２６で回収された求める細胞の遺伝子材料（特にＤＮＡまたはＲＮＡ）の分析を行なう。増幅されたＤＮＡをマトリックスとして用い、標的療法に対する感受性または耐性のある突然変異を検出する。それに加え、またはその代わりに、ＲＴによって変換されて増幅されたＲＮＡに由来するｃＤＮＡ（“ｃ”は相補的を意味する）をマトリックスとして用い、標的療法に対する感受性または耐性のある遺伝子の発現レベルを検出する。
【０１４７】
増幅された遺伝子材料（特にＤＮＡ）を所定の体積だけ採取した後、対になったセンス・プライマおよびアンチ−センス・プライマと対になったプローブを利用し、定量リアルタイムＰＣＲ（“ポリメラーゼ連鎖反応”の略号）で標的療法に対する感受性または耐性のある突然変異を検出する。
【０１４８】
図示した実施態様では、標的療法に対する感受性または耐性のある突然変異の探索が実行されるが、その原理は以下の通りである。対立遺伝子識別または“ＳＮＰ遺伝子型アッセイ”（ＳＮＰは、一ヌクレオチド多型の略号である）により、遺伝子レベルでの点突然変異の存在または不在を知ることができる。対立遺伝子識別の第１のステップ４２２は、興味の対象である配列を増幅するための２つのプライマと、２つのプローブ（例えばＴａｑＭａｎタイプ（登録商標））とを用いて実施される定量リアルタイムＰＣＲの反応である。一方のプローブが突然変異した配列を認識し、他方のプローブが正常な配列を認識する。これら２つのプローブは異なる蛍光色素と結合している。その蛍光色素は、例えば正常な配列とハイブリダイズするプローブに関しては“ＶＩＣ”、突然変異した配列とハイブリダイズするプローブに関しては“ＦＡＭ”である。第２のステップ４２４では、蛍光色素ＦＡＭおよび／またはＶＩＣから出る初期の蛍光と最終的な蛍光を測定する対立遺伝子識別プログラムを利用する。このプログラムにより、各サンプルの中に存在する異なる配列を識別することができる。
− 蛍光ＶＩＣだけの増加は、正常な配列のホモ接合プロファイルを意味する。
− 蛍光ＦＡＭだけの増加は、突然変異した配列のホモ接合プロファイルを意味する。
− 蛍光ＶＩＣとＦＡＭ両方の増加は、ヘテロ接合プロファイルを意味する。
【０１４９】
突然変異を検出するには、例えばプライマとプローブの配列を以下のようにする（センス配列とアンチ−センス配列、５’から３’へ）。
【０１５０】
エルロチニブとゲフィチニブに耐性のあるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異Ｇ１２Ｄに関しては、
− センス・プライマ（または“順”プライマ）ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ、
− アンチセンス・プライマ（または“逆”プライマ）ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴ、
− “野生型”プローブ、色“ＶＩＣ”ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴ、
− “突然変異した”プローブ、色“ＦＡＭ”ＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＴ。
【０１５１】
エルロチニブとゲフィチニブに耐性のあるＫ−ｒａｓ遺伝子の（“１２”をコードする）突然変異Ｇ１２Ｖに関しては、
− センス・プライマ（または“順”プライマ）ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ、
− アンチセンス・プライマ（または“逆”プライマ）ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴ、
− “野生型”プローブ、色“ＶＩＣ”ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴ、
− “突然変異した”プローブ、色“ＦＡＭ”ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＴ。
【０１５２】
エルロチニブとゲフィチニブに耐性のあるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異Ｇ１３Ｃに関しては、
− センス・プライマ（または“順”プライマ）ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ、
− アンチセンス・プライマ（または“逆”プライマ）ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴ、
− “野生型”プローブ、色“ＶＩＣ”ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴ、
− “突然変異した”プローブ、色“ＦＡＭ”ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＧＴ。
【０１５３】
エルロチニブとゲフィチニブに対する感度が増大したＥＧＦＲ遺伝子の突然変異Ｌ８５８Ｒに関しては、
− センス・プライマ（または“順”プライマ）ＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴ、
− アンチセンス・プライマ（または“逆”プライマ）ＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴ、
− “野生型”プローブ、色“ＶＩＣ”ＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡ、
− “突然変異した”プローブ、色“ＦＡＭ”ＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＡ。
【０１５４】
“センス”、“アンチ−センス”、“５’から３’へ”の意味は、当業者に周知である。プローブは、２つのプライマの間でペアになり、付随する蛍光の色から突然変異の存在または不在を明らかにする。参考として、“ＦＡＭ”という色は青に含まれ、“ＶＩＣ”という色は緑に含まれることを指摘しておく。ＰＣＲ装置でそれぞれの色の中の蛍光強度を１回測定すると、正常な遺伝子、突然変異したホモ接合の遺伝子、突然変異したヘテロ接合の遺伝子を識別することができる。増幅サイクルは例えば５０回実施する。
【０１５５】
別の実施態様では、所定の体積の遺伝子材料（特にＲＴ（“逆転写”の略号）によって変換されて増幅されたＲＮＡ）を採取した後、対になったセンス・プライマおよびアンチ−センス・プライマと対になったプローブを利用して定量リアルタイムＰＣＲ（“ポリメラーゼ連鎖反応”の略号）を例えば５０サイクル実施し、標的療法に対する感受性または耐性のある遺伝子の発現レベルを検出する。
【０１５６】
上に説明したそれぞれの実施態様では、フィルタはポリカーボネートで実現され、表面が親水性処理されている。このようなフィルタを用いることで、細胞を特別に溶解させたとき、特定の細胞の保持率が改善され、他の細胞またはその中身の接着が減る。
【０１５７】
フィルタは、孔の直径が、固定される同じ細胞（すなわち堅固にされる細胞）のために利用される対応する値よりも例えば１μｍだけ小さい値を中心としていることが好ましい。
【０１５８】
例えば固定された細胞に関して孔の直径が７．５μｍを中心としていたとすると、直径は、ここでは、より小さな値（例えば６．５μｍ）を中心とする。直径は分散しているため、ほとんどどの孔も７μｍを超える直径は持たない。
【０１５９】
本発明を血液細胞に適用する１つの応用では、フィルタは、孔の密度が５０，０００〜２００，０００個／ｃｍ２である。この値は、約１００，０００個／ｃｍ２であることが好ましい。
【０１６０】
ポリカーボネート製のフィルタを用いているおかげで、必要な圧力低下は従来のシステムよりもはるかに小さく、１／４になる。するとフィルタ上で回収しようとする細胞の劣化が回避される。−２５ミリバール以下の圧力低下による吸引をフィルタの下方で実現することが好ましい。
【０１６１】
さまざまな変形例では、フィルタ支持体１０８または３０８は、区画を培養ウエルまたはエッペンドルフ管に向かって移動させることによって力を加えてフィルタ支持体を移動手段から解放するまで、移動手段にメカニカルに接続されている。区画１０２または３０２の下端と移動手段１０２または３０２の役割を逆にし、培養ウエルまたはエッペンドルフ管の中または前でフィルタ支持体を保持するのが後者で、区画の上端に支持されるときフィルタ支持体を解放するのが前者であるようにすることは、上に与えた実施態様の説明をもとにして当業者が容易に実現できる変更である。
【０１６２】
単一の区画１０２または３０２に関して上に説明したことは、共通する１つの支持体（図示せず）によって保持された多数の区画に対して同時に実行することが好ましいことがわかる。
【０１６３】
さまざまな実施態様では、本発明が対象とする装置の外観は、外側の袋の中に内側の２つの袋が入ったキットの形態を取る。
− 第１の袋は、図２Ａまたは図６Ａに示したような組み立てられた装置を含んでおり、
− 第２の袋は、培養ウエルと円形板および／またはエッペンドルフ管、またはこの装置を実現する上で役に立つ他のあらゆる付属品を含んでいる。
【０１６４】
本発明を実施することにより、細胞（例えば羊水の細胞）の危険な採取を回避できる一方で、例えば羊水穿刺のための培養が可能である。それに加え、フィルタ支持体１０８のリザーバの形状から、このフィルタ支持体の中で免疫細胞化学または蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーション（“ＦＩＳＨ”）の反応を実現することができる。
【０１６５】
さまざまな実施態様（図示せず）では、リングが、注射器の形状になった区画の下方開口部から挿入されて、この区画に押し込められるか貼りついている。ワッシャまたはリングの形態のフィルタ支持体または椀状体がリングの中に配置されてフィルタを保持する。フィルタには微細な孔が開けられていて、椀状体の下に接合された後、椀状体とともに、注射器の形状になった区画の下端に挿入される。
【０１６６】
区画の下部の内側には、下部の形状が円錐形の下向きの部材が位置している。この部材は、フィルタ支持体の上面に支持される。この部材の下半分は、長さがリングと同じかそれよりも長い。したがって区画とこの部材の間の接続には、区画の軸線に沿って、少なくともフィルタ支持体の上部とリングの下方開口部を隔てる距離にわたって遊びがある。このように、注射器の形状になった区画に挿入されたピストンによってこの部材が軸方向に運動するとき、その部材は、フィルタ支持体がリングから解放されるまで、したがって注射器の形状になった区画から解放されるまで、そのフィルタ支持体を押す。それに加え、ピストンを区画の上方開口部の中に挿入し、円錐形部材に支持されるまでピストンの上部を押すとき、ピストンは、ピストンの外壁と区画の内壁の間を空気を自由に通過させるため、ピストンの移動によって区画内部の圧力が上昇することはない。するとフィルタ上に保持された生きた細胞が傷むリスクが回避される。上記の部材が円錐形になっているおかげで、ピストンはフィルタに支持されず、したがってこのフィルタ上に保持される細胞が傷む危険性がない。同様に、この部材はフィルタ支持体にも支持されていないため、やはりこれらの細胞が傷む危険性がない。
【０１６７】
ピストンで部材を下方に移動させるために遊びを実現しつつピストンの上部を押し続けると、その部材によってフィルタ支持体がリングと区画から出る。するとこのフィルタ支持体とフィルタは、プレートのウエルおよび／または培養容器の中に落ちる。区画内のピストンの行程はピストンの上方肩部によって制限されるため、行程の終わりにこの肩部が区画の上方開口部に支持されるとき、部材の移動時に遊びが完全に利用された状態であることが好ましい。したがってリングが外れてフィルタの上、および／またはプレートのウエルの中、および／または培養容器の中に落ちるリスクが回避される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きた細胞をフィルタ上で分離して培養するか、フィルタ上で分離された生きた細胞の増幅された遺伝子材料を抽出するための装置と方法に関する。本発明は特に、液体、その中でも特に血液の中に存在する特定の細胞を分離して培養すること、またはその特定の細胞の遺伝子材料を抽出することに応用される。
【背景技術】
【０００２】
血液の特定のいくつかの細胞（例えば腫瘍細胞または栄養芽層）は割合が非常に少ないため、それらを数え上げて細胞学的分析を行なう必要がある。しかしそのような細胞は、血液中に存在する他の主要な細胞と比べてサイズが大きい。
【０００３】
ホルムアルデヒドをベースとした固定用パッドを血液サンプルに適用して求める細胞を固定した後、得られた液体を多孔性フィルタに通過させることが知られている。次にこのフィルタを利用し、実験室において顕微鏡下で求める細胞をそのフィルタの中に探す。しかしこの手続きでは生きた細胞を得ることはできない。
【０００４】
ところで発明者は、生きた細胞が得られると、腫瘍細胞または栄養芽層の中にある遺伝子の異常を診断するために特定のマーカーを同定し、分子生物学の技術、細胞遺伝学の技術、“ＦＩＳＨ”（蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーションの略号）の技術をよい条件で適用できるであろうと判断した。
【０００５】
本発明は、こうした欠点を解消してこの要求に応え、生きた細胞を実験室でのルーチンの試験に合った条件で回収できるようにすることを目的とする。その細胞は、その後、十分な増殖因子が存在する適切な培地の中で培養される。
【０００６】
本発明は、フィルタ上で分離された細胞の増幅された遺伝子材料の抽出と、標的療法または遺伝子の異常に対する感受性と耐性のある遺伝子の突然変異および発現レベルの検出、すなわち遺伝子の異常の検出にも関する。
【０００７】
本発明は特に、液体、その中でも特に血液の中に存在する特定の細胞のＤＮＡまたはＲＮＡを回収して一様に増幅することに応用される。
【０００８】
例えば文献ＰＣＴ／ＦＲ２００６／０００５６２から、ホルムアルデヒドをベースとした固定用パッドを血液サンプルに適用して求める細胞を固定した後、得られた液体を多孔性フィルタを通過させることが知られている。次いでこのフィルタは実験室で分析され、求める細胞を顕微鏡下でそのフィルタの中に探す。その後、フィルタ上でその細胞を採取して分析（例えば遺伝子分析）することができる。
【０００９】
しかしこの手続きは、必要とされる時間、材料、作業精度のため、大きなスケールと納得できるコストで再現することができない。ところでこのように大きなスケールで再現することとコストを最少にすることが可能だと、腫瘍細胞と栄養芽層細胞の両方に関して分子生物学的分析ができるであろう。
【００１０】
本発明は、こうした欠点を解消してこの要求に応え、細胞材料（特に求める細胞のＲＮＡとＤＮＡ）の多くを、実験室でのルーチンの試験に合った条件にて、よい状態で回収できるようにすることも目的とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで第１の特徴によれば、本発明は、フィルタ上で生きた細胞を分離するか、その細胞の遺伝子材料を抽出するための装置であって、
− フィルタに固定されたフィルタ支持体と、
− 上方開口部と下方開口部を有する区画と、
− フィルタ支持体に力を加えてそのフィルタ支持体を解放するために区画に対して移動する移動手段とを備えることを特徴とする装置を目的とする。
【００１２】
したがって、フィルタ上の生きた細胞または遺伝子材料の汚染または劣化が完全に回避される。適合した層流式ドラフトで操作を行なうとき、区画の培養物は無菌状態に維持される。したがって細胞を分離して培養するすべてのステップ、またはその遺伝子材料を抽出して分析するすべてのステップは、無菌状態で実行することができる。
【００１３】
したがってこの装置により、細胞形態学と細胞遺伝学の特徴を明らかにする実験を行なうための培養に完全に合った条件で、興味の対象である生きた細胞を回収することができる。この回収は、フィルタ上で直接行い、求める細胞が失われることは実質的にない。したがって、求める細胞の多くの割合が、実験室でのルーチンの培養に合った条件にて、よい状態かつ最少コストで回収される。
【００１４】
本発明が対象とする装置により、特定の細胞の細胞材料の迅速かつ効率的な回収も、例えば
− その特定の細胞と他の細胞の直径の中間の直径の微細孔を持つフィルタを、液体の大半と前記他の細胞を通過させる濾過ステップと、
− 区画内でＤＮＡおよび／またはＲＮＡを溶解させて増幅するステップと、
− 溶解させた細胞の増幅された遺伝子材料をフィルタ上で回収するステップを実施した後に実現することができる。
【００１５】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする装置は、気密かつ取外し可能に固定されていて、前記力を加えてフィルタ支持体を解放することを可能にする相対運動を移動手段と区画に禁じる取外し可能な先端部を備えている。
【００１６】
このような構成になっているおかげで、フィルタ支持体を確実に所定の位置に保持できる。それに加え、先端部は、フィルタ支持体をしぶきと汚染から保護することができる。
【００１７】
したがって濾過の間を通じてフィルタを保持し、次いで先端部を引っ張り、移動手段と区画をそれぞれ動かして力を加えることでフィルタ支持体を解放することにより、フィルタを解放して回収する。
【００１８】
特別な特徴によれば、先端部は、吸引システムの圧力低下室に合った下方開口部を有する。
【００１９】
このような構成になっているおかげで、圧力低下室の中で吸引することにより、区画の中に存在する興味の対象である細胞よりも小さな細胞と、溶解している可能性のある細胞と、液体の大半を濾過することができる。
【００２０】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、ワッシャの形態を取っている。ここで、ワッシャはリング状のフィルタ支持体であることを思い起こしておく。
【００２１】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体はＰＶＣからなる。実際、発明者は、疎水性ポリエチレンとは違ってこの材料が浮かぶことはなく、疎水性ポリエチレンよりも堅固であることを確認した。そのため培養ウエルの底でフィルタ支持体を使用する上で有利である。
【００２２】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は堅固なＰＶＣからなる。そうなっていることで、細胞形態学と細胞遺伝学の分析中にフィルタを操作することができる。
【００２３】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、カバーガラスの形態を取っている。
【００２４】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、カバーガラスと同じかそれよりも大きなサイズである。そうなっていることで、フィルタをガラス板とカバーガラスの間に取り付けることができる。
【００２５】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体の厚さは０．４ｍｍ以下であり、０．３ｍｍ以下であることが好ましい。
【００２６】
このような構成になっているおかげで、フィルタ支持体を顕微鏡下で用い、倍率が大きいときでさえ、フィルタ支持体を横方向に移動させるときにリスクなしに顕微鏡の一部に触ることができる。
【００２７】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、エッペンドルフ管の少なくとも一部の形態を取っている。
【００２８】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、上部内側において、エッペンドルフ管の上部内側の形態を再現している。
【００２９】
このような構成になっているおかげで、フィルタ支持体の上部開口部をエッペンドルフ管の栓で閉じることができる。
【００３０】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、下部内側において、エッペンドルフ管の下部内側の形態を再現している。
【００３１】
特別な特徴によれば、フィルタは直径が５ｍｍ以下であり、３．５ｍｍ以下が好ましい。そうなっていると、細胞を溶解させることと遺伝子材料をあらかじめ増幅することが容易になる。
【００３２】
したがってエッペンドルフ管の下部内面を真似ることができる。
【００３３】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、上部外側において、エッペンドルフ管の上部内側の形態を再現している。
【００３４】
このような構成になっているおかげで、フィルタ支持体は、エッペンドルフ管の上部に嵌まることができる。
【００３５】
したがってフィルタ支持体の上部外側とエッペンドルフ管の上部内側の間を気密にすることができる。
【００３６】
上に示した最後の３つの構成のおかげで、フィルタ支持体はカラム機能を有する。
【００３７】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体はポリカーボネートを含んでいる。
【００３８】
このような構成になっているおかげで、フィルタの孔は、溶解用パッドと遺伝子材料を増幅するための反応物質を保持する。
【００３９】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、力が加えられるまで区画にメカニカルに接続されている。
【００４０】
特別な特徴によれば、フィルタ支持体は、力が加えられるまで移動手段にメカニカルに接続されている。
【００４１】
第２の側面によれば、本発明は、生きた細胞をフィルタ上で分離するか、その細胞の遺伝子材料を抽出するための方法であって、
− フィルタに固定されたフィルタ支持体を、上方開口部と下方開口部を有する区画と一体化するか、その区画に対して移動する移動手段と一体化するステップと、
− フィルタ支持体に力を加えてそのフィルタ支持体を解放するため、移動手段と区画をそれぞれ運動させるステップを含むことを特徴とする方法を目的とする。
【００４２】
特別な特徴によれば、運動ステップにおいてフィルタ支持体を培養ウエルに直接移行させる。
【００４３】
したがってフィルタ上の生きた細胞、または抽出された遺伝子材料の汚染または劣化が完全に回避される。こうした各構成のおかげで、層流式ドラフトのもとで操作するときに区画の内容物は無菌状態に維持される。したがってすべてのステップが、細胞の培養または遺伝子材料の抽出に適した無菌条件で実施される。
【００４４】
この方法の特別な利点、目的、特徴は、本発明が対象とする装置（例えば上に簡単に説明した装置）と同様であるため、ここに再現することはしない。
【００４５】
したがって本発明が対象とする方法により、細胞材料を迅速かつ効率的に回収することができる。一般に、本発明を実行して回収した細胞材料は、細胞の遺伝子材料である。したがって本発明が対象とする方法により、稀な細胞の遺伝子材料を、分離された１個の細胞まで、損失なくフィルタ上で直接回収することができる。したがって対象とする細胞の遺伝子材料の多くの割合が、ルーチンの実験室での実験に合った条件にて、よい状態で回収される。
【００４６】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする方法（例えば上に簡単に説明した方法）は、溶解ステップの後、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの増幅ステップを含んでおり、回収ステップにおいて、溶解した細胞の増幅された遺伝子材料を回収する。
【００４７】
特別な特徴によれば、溶解と増幅のステップにおいて、ＤＮＡとＲＮＡの定量的な側面を維持する一様な増幅を実行する。
【００４８】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする方法（例えば上に簡単に説明した方法）は、増幅されたＤＮＡをマトリックスとして利用し、少なくとも１つの標的療法に対する感受性または耐性のある遺伝子の少なくとも１つの突然変異を検出するステップをさらに含んでいる。
【００４９】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする方法（例えば上に簡単に説明した方法）は、増幅されたＤＮＡをマトリックスとして利用し、標的療法に対する感受性または耐性のある遺伝子の発現レベルの変化を検出するステップをさらに含んでいる。
【００５０】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする方法（例えば上に簡単に説明した方法）は、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、そのｃＤＮＡを利用して標的療法に対する感受性または耐性のある遺伝子の発現レベルを検出するステップをさらに含んでいる。
【００５１】
特別な特徴によれば、検出ステップにおいて、リアルタイム定量ＰＣＲ（“ポリメラーゼ連鎖反応の略号”）を利用する。
【００５２】
特別な特徴によれば、検出ステップにおいて、少なくとも一対のセンス・プライマとアンチ−センス・プライマを利用して興味の対象である所定の配列を増幅する。
【００５３】
特別な特徴によれば、検出ステップにおいて、少なくとも一対のプローブを利用する。
【００５４】
特別な特徴によれば、一対のプローブの少なくとも２つのプローブは異なる２種類の蛍光色素と結合しており、一方が突然変異した配列を認識し、他方が正常な配列を認識するようにされている。
【００５５】
特別な特徴によれば、少なくとも一対のプライマと一対のプローブは、エルロチニブとゲフィチニブに耐性のあるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異Ｇ１２Ｄを検出することができる。
【００５６】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００５７】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００５８】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００５９】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６０】
特別な特徴によれば、少なくとも一対のプライマと一対のプローブは、エルロチニブとゲフィチニブに耐性のあるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異Ｇ１２Ｖを検出することができる。
【００６１】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６２】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６３】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６４】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６５】
特別な特徴によれば、少なくとも一対のプライマと一対のプローブは、エルロチニブとゲフィチニブに耐性のあるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異Ｇ１３Ｃを検出することができる。
【００６６】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６７】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６８】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００６９】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＧＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００７０】
特別な特徴によれば、少なくとも一対のプライマと一対のプローブは、エルロチニブとゲフィチニブに対する感度が増大するＥＧＦＲ遺伝子の突然変異Ｌ８５８Ｒを検出することができる。
【００７１】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００７２】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプライマは、配列ＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴの少なくとも８０％を含んでいる。
【００７３】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡの少なくとも８０％を含んでいる。
【００７４】
特別な特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列ＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＡの少なくとも８０％を含んでいる。
【００７５】
第３の側面によれば、本発明は、フィルタ上で生きた細胞を分離するための装置であって、
− フィルタに固定されたフィルタ支持体と、
− 上方開口部と、フィルタ支持体とフィルタを保持するのに適した下方開口部とを有する区画と、
− 区画の内側からフィルタ支持体に力を加える手段とを備えることを特徴とする装置を目的とする。
【００７６】
この装置により、遺伝子の試験を行なうための培養に完全に適した条件で、興味の対象である生きた細胞を回収することができる。
【００７７】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする装置（例えば上に簡単に説明した装置）は、区画内に、フィルタ支持体に支持されて、区画内に挿入されるピストンが及ぼす力を受けるようにされた１つの可動部材を備えている。
【００７８】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする装置（例えば上に簡単に説明した装置）は、下方開口部に、フィルタとフィルタ支持体を保持する先端部を備えている。この先端部は、区画に対して気密かつ取外し可能に固定されている。
【００７９】
このような構成になっているおかげで、濾過の間を通じてフィルタが保持され、次いで先端部を引っ張り、区画の内側からフィルタ支持体に力を加えることで、そのフィルタが解放される。
【００８０】
特別な特徴によれば、先端部は、圧力低下室に合った下方開口部を有する。
【００８１】
このような構成になっているおかげで、圧力低下室の中で吸引することにより、区画の中に存在する興味の対象である細胞よりも小さな細胞と、溶解している可能性のある細胞と、液体の大半を濾過することができる。
【００８２】
第４の側面によれば、本発明は、液体中に存在する細胞を回収する方法であって、
− 上方開口部と下方開口部を備えていて内部にフィルタ支持体とフィルタを保持することができる区画にフィルタ支持体を固定するステップと、
− フィルタを通して生きた細胞を含む液体を濾過するステップと、
− 区画の内側からフィルタ支持体に力を加えて区画の外でフィルタを回収するステップを含む方法を目的とする。
【００８３】
この方法の特別な利点、目的、特徴は、本発明の第３の側面の装置（例えば上に簡単に説明した装置）と同様であるため、ここに再現することはしない。
【００８４】
第５の側面によれば、本発明は、生きた細胞をフィルタ上で分離する方法であって、
− 上方開口部と下方開口部を備えていて、その２つの開口部の間にはフィルタが配置され、そのフィルタの小孔は、特定の細胞と他の細胞の直径の中間の直径を持つ構成にされた区画の上方開口部を通じ、前記生きた細胞を含む液体とフィルタ用パッドをその区画の中に固定剤なしで挿入するステップと、
− 液体の大半と前記他の細胞がフィルタを通過する濾過ステップと
− フィルタと、フィルタ上に残った細胞とを回収するステップを含む方法を目的とする。
【００８５】
この方法により、遺伝子の試験を行なうための培養に完全に適した条件で、興味の対象である生きた細胞を回収することができる。この回収はフィルタ上で直接行い、求める細胞が失われることは実質的にない。したがって対象とする細胞の多くの割合が、ルーチンの実験室での培養に合った条件にて、よい状態で回収される。
【００８６】
特別な特徴によれば、本発明が対象とする方法（例えば上に簡単に説明した方法）は、濾過ステップの前に、培地と、特定の細胞を含む液体に溶ける物質とからなる固定剤なしで、フィルタ用パッドを取り付けるステップを含んでいる。
【００８７】
特別な特徴によれば、濾過ステップにおいて、吸引してフィルタの下方で２５ミリバール以下の圧力低下を起こさせる。
【００８８】
このような構成になっているおかげで、濾過は効率的かつ迅速に行なわれ、フィルタ上で回収する生きた細胞が傷むことはない。
【００８９】
特別な特徴によれば、濾過ステップにおいて、区画の先端部がフィルタをその区画の中に保持し、フィルタ回収ステップにおいて、区画の先端部を引っ張り、区画の中にピストンを導入し、そのピストンでフィルタ支持体に力を加える。
【００９０】
この力により、フィルタを区画の下端に有するフィルタ支持体を、したがってフィルタを、区画から取り出すことができる。それに加え、力はフィルタに直接は作用しないため、過剰な圧力が発生することはなく、このフィルタに載った細胞がフィルタの回収時に傷むことはない。
【００９１】
特別な特徴によれば、回収ステップにおいて、フィルタを区画からプレートのウエルおよび／または培養容器まで直接移動させる。
【００９２】
このようにすると、フィルタ上の生きた細胞が汚染されたり劣化したりすることが完全に回避される。このような各構成のおかげで、区画の内容物は、細胞を無菌条件で操作できるような層流式ドラフトで操作するとき、無菌状態に維持される。
【００９３】
第６の側面によれば、本発明は、液体中に存在する細胞を回収する装置であって、
− 液体とフィルタパッドを、固定剤なしで、上方開口部と下方開口部を有する区画の中に、その区画の上方開口部を通じて挿入する手段と、
− 直径が特定の細胞と他の細胞の直径の中間である小孔を備えていて、区画の２つの開口部の間に位置するフィルタと、
− 液体の大半と前記他の細胞をフィルタにかけて通過させる濾過手段と、
− フィルタと、そのフィルタ上に残った細胞を回収する手段を備える装置を目的とする。
【００９４】
この装置の特別な利点、目的、特徴は、本発明の第５の側面が対象とする方法（例えば上に簡単に説明した方法）と同様であるため、ここに再現することはしない。
【００９５】
本発明の他の利点、目的、目的は、添付の図面を参照した以下の記述に現われるであろう。なおこの記述は説明を目的としたものであり、本発明がこの記述に限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明が対象とする装置の第１の実施態様を構成する部材の集合を斜めから見た概略図である。
【図２】使用前の装置の第１の実施態様を互いに垂直な軸で切断した断面の概略図である。
【図３−１】本発明が対象とする装置の第１の実施態様を実現するステップの大まかな立面図または断面図である。
【図３−２】本発明が対象とする装置の第１の実施態様を実現するステップの大まかな立面図または断面図である。
【図４】本発明が対象とする方法の特別な第１の実施態様を実行するステップのフロー・チャートである。
【図５】本発明が対象とする装置の特別な第２の実施態様を構成する部材の集合を斜めから見た概略図である。
【図６】装置の第２の実施態様を互いに垂直な軸で切断した断面の概略図である。
【図７−１】本発明が対象とする装置の第２の実施態様を実現するステップの大まかな立面図または断面図である。
【図７−２】本発明が対象とする装置の第２の実施態様を実現するステップの大まかな立面図または断面図である。
【図８】本発明が対象とする装置の第２の実施態様に組み込まれたフィルタ支持体の断面図である。
【図９】本発明が対象とする方法の特別な第２の実施態様を実行するステップのフロー・チャートである。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
図１には、リザーバまたは区画１０２と、先端部１０４と、接合具１０６と、フィルタ支持体１０８と、移動手段１１０と、接合具１１２と、栓１１４が見られる。
【００９８】
区画１０２は全体が円筒形である。その上端は、栓１１４で塞いで気密にすることができる。区画１０２の下端は、外面に不連続な複数のリングを有する。その不連続部によって移動手段１１０の突起部がガイドされる。そのリングの方は、移動手段１１０の本体をガイドする。
【００９９】
この移動手段１１０は全体が円筒形であり、先端部１０４に向かって延びる２つの突起部１１６を有する。これら突起部１１６は、フィルタ支持体１０８の直径よりも小さな距離だけ互いに離れた状態でこの方向に狭まっていく。図からわかるように、その後、この特別な形状、特に突起部１１６が互いの方に向かって曲がっている形状により、移動手段１１０は、フィルタ支持体１０８の方に運動するとき、先端部１０４から取り出した後にフィルタ支持体１０８を押して区画１０２から解放することができる。
【０１００】
移動手段１１０の突起部１１６の端部と区画１０２の下端は、培養箱または培養ウエルの中に侵入できるようにされている。逆に、区画１０２の端部の不連続なリングは、培養箱または培養ウエルの縁部に支持されるのに適した直径を有する。
【０１０１】
区画１０２の下方開口部には、気密かつ無菌状態かつ取り外し可能に、先端部またはアダプタ１０４が配置される。この先端部１０４は区画１０２の外壁を締め付けており、区画１０２の直径よりも小さな直径の先細になった下方開口部を有する。
【０１０２】
先端部１０４またはアダプタのこの先細になった下方開口部は、圧力が低下しているチェンバーから来るしぶきによって区画１０２の先端が潜在的に汚染されることを回避するのに十分な長さを有する。
【０１０３】
先端部１０４は、区画１０２の下端にある側方突起部１１８の形状に合致していて公知のやり方でその突起部を締め付けるための回転による固定手段を有する。したがって先端部１０４は、濾過ステップの間を通じてフィルタ支持体を確実に所定の位置に保持する。それに加え、先端部１０４は、フィルタをしぶきや汚染物から保護する。
【０１０４】
区画１０２の下端には、組み立て後、フィルタ支持体１０８によって支持されるフィルタに向かって開いている開口部がある。フィルタ支持体１０８それ自体は、区画１０２の下端と先端部１０４によって所定の位置に保持される。
【０１０５】
フィルタ支持体１０８は、第１の実施態様では、リング形のワッシャの形態を取る。フィルタには微細な孔が開けられている。このフィルタはフィルタ支持体１０８の下に接合され、次いで区画１０２の下端にワッシャとともに挿入される。
【０１０６】
フィルタ支持体１０８はＰＣＶでできていることが好ましく、厚さは０．４ｍｍ以下である。厚さは０．３ｍｍ以下であることが好ましい。フィルタ支持体の外径は、例えば１２．６ｍｍである。フィルタ支持体１０８に支持されるフィルタの直径は、例えば８．２ｍｍである。
【０１０７】
区画１０２、先端部１０４、移動手段１１０は、例えばポリプロピレンで実現される。接合具１０６と１１２は、例えばシリコーンでできている。
【０１０８】
図２Ａと図２Ｃは、図１に示した部材が組み立てられた状態の本発明による装置の第１の実施態様を互いに垂直な軸で切断した断面図である。図２Ｂと図２Ｄは、それぞれ図２Ａと図２Ｃの一部を拡大した詳細図である。図２Ａ〜図２Ｄには、図１で説明した要素が再び見られる。
【０１０９】
図３Ａは、装置が保管の構成になっているときの立面図である。図３Ｂは、栓１１４を外して区画１０２に上方開口部から液体（例えば血液）（図示せず）を導入した後、公知のタイプの吸引システム（図示せず）の支持台１２０の中に配置された装置を示している。図３Ｃは、図３Ｂの一部の拡大詳細図である。図３Ｂと図３Ｃから、先端部１０４が部材１２２の中で所定の位置に保持されていることと、ドーナツ状接合具１２４が先端部の内部（したがってフィルタ支持体１０８を通じて区画１０２の内部）と吸引システムの吸引室の間の接続の気密性を保証していることがわかる。先端部１０４は吸引室の内部を貫通していることがわかる。
【０１１０】
吸引時には、区画１０２の中に存在する液体中の直径がより大きな特定のいくつかの細胞がフィルタに保持されるのに対し、液体の大半、溶解した細胞の中身と壁、回収する細胞よりもサイズが小さい細胞は、フィルタを通じて区画１０２の外へ吸引される。
【０１１１】
図３Ｄからわかるように、濾過後、装置を支持台から引き抜く。次に、図３Ｅと図３Ｆに示してあるように、回転させて先端部１０４を突起部１１８から解放した後、その先端部１０４を引き抜く。次に、図３Ｇと図３Ｈに示してあるように、区画１０２の先端を培養箱または培養ウエル１３０の中に挿入する。
【０１１２】
上に説明するとともに図３Ｉに示してあるように、移動手段１１０の突起部１１６の互いに近づいていく端部と区画１０２の下端は、培養箱または培養ウエルの中に侵入するのに適している。逆に、区画１０２の不連続な端部リングは、培養箱または培養ウエル１３０の縁部に支持されるのに適した直径を有する。
【０１１３】
より詳細には、図３Ｊと図３Ｋからわかるように、移動手段１１０は、この位置でまだ区画１０２の軸線に平行に動くことができる。
【０１１４】
図３Ｎと図３Ｍからわかるように、この運動の際には、操作者の指によって動かされる移動手段の突起部１１６が、フィルタ支持体１０８に対して鉛直方向の力を上から下に及ぼし、フィルタ支持体を区画１０２の下端から解放する。するとフィルタ支持体１０８は、培養箱または培養ウエル１３０の中に落ちる。
【０１１５】
最後に、図３Ｏからわかるように、区画１０２と移動手段１１０を培養箱または培養ウエル１３０から引き抜く。
【０１１６】
図４は、このように実施するステップのまとめである。
【０１１７】
ステップ２０２では、装置を構成する部材を組み立てる。ステップ２０４では、装置を吸引システムの支持台１２０の中に配置する。ステップ２０６では、栓１１４を外す。ステップ２０８では、培養する細胞を含む液体（例えば血液）を区画１０２の上端から導入する。
【０１１８】
ステップ２１０では、吸引システムの圧力低下室の中で吸引することにより、区画１０２の中に存在する興味の対象となる細胞よりも小さい細胞と、溶解している可能性のある細胞と、液体の大半を濾過する。
【０１１９】
ステップ２１２では、装置を支持台から引き抜く。ステップ２１４では、先端部１０４を引き抜く。ステップ２１６では、区画１０２の先端を培養箱または培養ウエルの中に挿入する。
【０１２０】
ステップ２１８では、移動手段と区画をそれぞれ運動させてフィルタ支持体に力を及ぼすことによってそのフィルタ支持体を解放し、フィルタ支持体が培養箱または培養ウエルの中に落ちるようにする。ステップ２２０では、区画１０２と移動手段１１０を培養箱または培養ウエル１３０から引き抜く。
【０１２１】
ステップ２２０では、培養ウエル１３０の中で公知のようにして培養を実行する。フィルタの上面（その面には、フィルタ上で分離された細胞が載っている）のまわりにフィルタ支持体１０８が存在することで、細胞がフィルタから離れることを回避できることがわかる。
【０１２２】
フィルタ上にある興味の対象である生きた細胞を培養するステップでは、フィルタは、例えば、その興味の対象である細胞の増殖に適した因子を含む薄いマトリゲル層で覆う（か、プレートのウエルおよび／または培養容器の底にあらかじめ配置したマトリゲル（登録商標）層の上にフィルタが載って接触した状態にする）。
【０１２３】
ステップ２２２において細胞またはその細胞の遺伝子材料を観察したいときには、フィルタ支持体１０８を掴む。フィルタ支持体１０８の上面の側方に円筒形の穴が存在することにより、ピンセットでフィルタ支持体を掴むことが容易になる。
【０１２４】
次に、フィルタ支持体１０８をガラス板の上に置き、フィルタの自由な上面に合った直径の円板形のカバーガラスをフィルタに押し付ける。次いで、細胞またはその細胞の遺伝子材料の分析を公知のようにして行なう。
【０１２５】
図５に、リザーバまたは区画３０２、先端部３０４、接合具３０６、フィルタ支持体３０８、移動手段３１０、接合具３１２、栓３１４が見られる。
【０１２６】
区画３０２は全体が円筒形である。その上端は、栓３１４で塞いで気密にすることができる。区画３０２の下端は、外面に、側方リブ３５２の形態でのメカニカルな接続によって接続されるとき以外は区画３０２の本体と分離している円筒部３５０を有する。この円筒部３５０は、移動をガイドするため、移動手段３１０の本体の内径に対応する外径を有する。円筒部３５０には、移動手段３１０の突起部３１６を侵入させて長手方向に滑らせることのできるスリット３５４が設けられている。
【０１２７】
移動手段３１０は全体が円筒形であり、先端部３０４に向かって延びる２つの突起部３１６を有する。これらの突起部３１６は、フィルタ支持体３０８の直径よりも小さな距離だけ互いに離れた状態でこの方向に狭まっていく。図からわかるように、その後、この特別な形状、特に突起部３１６が互いの方に向かって曲がっている形状により、移動手段３１０は、フィルタ支持体３０８の方に運動するとき、先端部３０４から取り出した後にフィルタ支持体３０８を押して区画３０２から解放することができる。
【０１２８】
先端部３０４は、側方突起部３１８を有する区画３０２の下端の形状に合致していて公知のやり方でその突起部を締め付けるための回転による固定手段を有する。したがって先端部３０４は、濾過ステップの間を通じてフィルタ支持体を確実に所定の位置に保持する。それに加え、先端部３０４は、フィルタをしぶきや汚染物から保護する。
【０１２９】
区画３０２の下端には、組み立て後、フィルタ支持体３０８によって支持されるフィルタに向かって開いている開口部がある。フィルタ支持体３０８それ自体は、区画３０２の下端と先端部３０４によって所定の位置に保持される。
【０１３０】
図８からわかるように、フィルタ支持体３０８は、第２の実施態様では、エッペンドルフ管の形状に合致した形態を取る。
【０１３１】
特に、
− フィルタ支持体３０８は、上部内側において、エッペンドルフ管の上部内側の形状を有する。するとこのフィルタ支持体の上方開口部をエッペンドルフ管の栓で閉じることができる。
− フィルタ支持体３０８は、下部内側において、エッペンドルフ管の下部内側の形状を有する。するとエッペンドルフ管の下部内面を真似ることができる。
− フィルタ支持体３０８は、下部外側において、エッペンドルフ管の上部内側の形状を有する。するとこのフィルタ支持体３０８をエッペンドルフ管の上部の中に挿入することができる。
【０１３２】
それに加え、フィルタ支持体３０８は、フィルタ上に保持された細胞を溶解させるとともに、フィルタ支持体の細胞ライセートと遺伝子材料をエッペンドルフ管に向かって移すことを可能にするカラム機能を有する。
【０１３３】
フィルタ支持体３０８は、ＰＣ（ポリカーボネート）でできていることが好ましい。区画３０２と、先端部３０４と、移動手段３１０は、例えばポリプロピレンで実現される。接合具３０６と３１２は、例えばシリコーンからなる。
【０１３４】
図６Ａと図６Ｃは、図５に示した部材が組み立てられた状態の本発明による装置の第２の実施態様を互いに垂直な軸で切断した断面図である。図６Ｂと図６Ｄは、それぞれ図６Ａと図６Ｃの一部を拡大した詳細図である。図６Ａ〜図６Ｄには、図５で説明した要素が再び見られる。
【０１３５】
図７Ａは、装置が保管の構成になっているときの立面図である。図７Ｂは、栓３１４を外して区画３０２に上方開口部から液体（例えば血液）（図示せず）を導入した後、公知のタイプの吸引システム（図示せず）の支持台３２０の中に配置された装置を示している。図７Ｃは、図７Ｂの一部の拡大詳細図である。図７Ｂと図７Ｃから、先端部３０４が部材３２２の中で所定の位置に保持されていることと、ドーナツ状接合具３２４が先端部の内部（したがってフィルタ支持体３０８を通じて区画３０２の内部）と吸引システムの吸引室の間の接続の気密性を保証していることがわかる。先端部３０４は吸引室の内部を貫通していることがわかる。
【０１３６】
したがって、区画３０２の中に存在する興味の対象となる細胞よりもサイズが小さい細胞、溶解している可能性のある細胞、液体の大半は、圧力低下室の中で吸引することによって濾過される。
【０１３７】
図７Ｄからわかるように、濾過後、装置を支持台から引き抜く。次に、図７Ｅと図７Ｆに示してあるように、回転させて先端部３０４を突起部３１８から解放した後、その先端部３０４を引き抜く。次に、図７Ｇ、図７Ｈ、図７Ｉに示してあるように、区画３０２の先端を、エッペンドルフ管３３０が取り付けられたエッペンドルフ管支持体３２８の中に挿入する。
【０１３８】
図７Ｊと図７Ｋからわかるように、次に、移動手段３１０を区画３０２の軸線に平行に下方に移動させる。この運動の際には、操作者の指によって動かされる移動手段３１０の突起部３１６が、フィルタ支持体３０８に対して鉛直方向の力を上から下に及ぼし、フィルタ支持体を区画３０２の下端から解放する。するとフィルタ支持体３０８は、エッペンドルフ管３３０の中に落ちる。
【０１３９】
最後に、図７Ｌからわかるように、区画３０２と移動手段３１０を引き抜く。
【０１４０】
図９には、このように実施するステップのまとめである。
【０１４１】
ステップ４０２では、装置を構成する部材を組み立てる。ステップ４０４では、装置を公知のタイプの吸引システム（図示せず）の支持台３２０の中に配置する。ステップ４０６では、栓３１４を外す。ステップ４０８では、培養する細胞を含む液体（例えば血液）を区画３０２の上端から導入する。
【０１４２】
ステップ４１０では、吸引システムの圧力低下室の中で吸引することにより、区画３０２の中に存在する興味の対象となる細胞よりも小さい細胞と、溶解している可能性のある細胞と、液体の大半を濾過する。
【０１４３】
ステップ４１２では、装置を支持台から引き抜く。ステップ４１４では、先端部３０４を引き抜く。ステップ４１６では、区画３０２の先端をエッペンドルフ管の中に挿入する。
【０１４４】
ステップ４１８では、移動手段と区画をそれぞれ運動させてフィルタ支持体に力を及ぼすことによってそのフィルタ支持体を解放し、エッペンドルフ管の中に落とす。最後に、ステップ４２０では、区画３０２と移動手段３１０を引き抜き、エッペンドルフ管の栓を再び閉じる。
【０１４５】
次に、エッペンドルフ管を公知の方法で利用する。そのためには、例えばゲノム全体をあらかじめ増幅した後、遺伝子材料の溶解ステップ、遠心分離ステップ、回収ステップを実施する。
【０１４６】
ステップ４２２と４２４では、エッペンドルフ管１２５または１２６で回収された求める細胞の遺伝子材料（特にＤＮＡまたはＲＮＡ）の分析を行なう。増幅されたＤＮＡをマトリックスとして用い、標的療法に対する感受性または耐性のある突然変異を検出する。それに加え、またはその代わりに、ＲＴによって変換されて増幅されたＲＮＡに由来するｃＤＮＡ（“ｃ”は相補的を意味する）をマトリックスとして用い、標的療法に対する感受性または耐性のある遺伝子の発現レベルを検出する。
【０１４７】
増幅された遺伝子材料（特にＤＮＡ）を所定の体積だけ採取した後、対になったセンス・プライマおよびアンチ−センス・プライマと対になったプローブを利用し、定量リアルタイムＰＣＲ（“ポリメラーゼ連鎖反応”の略号）で標的療法に対する感受性または耐性のある突然変異を検出する。
【０１４８】
図示した実施態様では、標的療法に対する感受性または耐性のある突然変異の探索が実行されるが、その原理は以下の通りである。対立遺伝子識別または“ＳＮＰ遺伝子型アッセイ”（ＳＮＰは、一ヌクレオチド多型の略号である）により、遺伝子レベルでの点突然変異の存在または不在を知ることができる。対立遺伝子識別の第１のステップ４２２は、興味の対象である配列を増幅するための２つのプライマと、２つのプローブ（例えばＴａｑＭａｎタイプ（登録商標））とを用いて実施される定量リアルタイムＰＣＲの反応である。一方のプローブが突然変異した配列を認識し、他方のプローブが正常な配列を認識する。これら２つのプローブは異なる蛍光色素と結合している。その蛍光色素は、例えば正常な配列とハイブリダイズするプローブに関しては“ＶＩＣ”、突然変異した配列とハイブリダイズするプローブに関しては“ＦＡＭ”である。第２のステップ４２４では、蛍光色素ＦＡＭおよび／またはＶＩＣから出る初期の蛍光と最終的な蛍光を測定する対立遺伝子識別プログラムを利用する。このプログラムにより、各サンプルの中に存在する異なる配列を識別することができる。
− 蛍光ＶＩＣだけの増加は、正常な配列のホモ接合プロファイルを意味する。
− 蛍光ＦＡＭだけの増加は、突然変異した配列のホモ接合プロファイルを意味する。
− 蛍光ＶＩＣとＦＡＭ両方の増加は、ヘテロ接合プロファイルを意味する。
【０１４９】
突然変異を検出するには、例えばプライマとプローブの配列を以下のようにする（センス配列とアンチ−センス配列、５’から３’へ）。
【０１５０】
エルロチニブとゲフィチニブに耐性のあるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異Ｇ１２Ｄに関しては、
− センス・プライマ（または“順”プライマ）ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ、
− アンチセンス・プライマ（または“逆”プライマ）ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴ、
− “野生型”プローブ、色“ＶＩＣ”ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴ、
− “突然変異した”プローブ、色“ＦＡＭ”ＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＴ。
【０１５１】
エルロチニブとゲフィチニブに耐性のあるＫ−ｒａｓ遺伝子の（“１２”をコードする）突然変異Ｇ１２Ｖに関しては、
− センス・プライマ（または“順”プライマ）ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ、
− アンチセンス・プライマ（または“逆”プライマ）ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴ、
− “野生型”プローブ、色“ＶＩＣ”ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴ、
− “突然変異した”プローブ、色“ＦＡＭ”ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＴ。
【０１５２】
エルロチニブとゲフィチニブに耐性のあるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異Ｇ１３Ｃに関しては、
− センス・プライマ（または“順”プライマ）ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴ、
− アンチセンス・プライマ（または“逆”プライマ）ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴ、
− “野生型”プローブ、色“ＶＩＣ”ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴ、
− “突然変異した”プローブ、色“ＦＡＭ”ＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＧＴ。
【０１５３】
エルロチニブとゲフィチニブに対する感度が増大したＥＧＦＲ遺伝子の突然変異Ｌ８５８Ｒに関しては、
− センス・プライマ（または“順”プライマ）ＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴ、
− アンチセンス・プライマ（または“逆”プライマ）ＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴ、
− “野生型”プローブ、色“ＶＩＣ”ＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡ、
− “突然変異した”プローブ、色“ＦＡＭ”ＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＡ。
【０１５４】
“センス”、“アンチ−センス”、“５’から３’へ”の意味は、当業者に周知である。プローブは、２つのプライマの間でペアになり、付随する蛍光の色から突然変異の存在または不在を明らかにする。参考として、“ＦＡＭ”という色は青に含まれ、“ＶＩＣ”という色は緑に含まれることを指摘しておく。ＰＣＲ装置でそれぞれの色の中の蛍光強度を１回測定すると、正常な遺伝子、突然変異したホモ接合の遺伝子、突然変異したヘテロ接合の遺伝子を識別することができる。増幅サイクルは例えば５０回実施する。
【０１５５】
別の実施態様では、所定の体積の遺伝子材料（特にＲＴ（“逆転写”の略号）によって変換されて増幅されたＲＮＡ）を採取した後、対になったセンス・プライマおよびアンチ−センス・プライマと対になったプローブを利用して定量リアルタイムＰＣＲ（“ポリメラーゼ連鎖反応”の略号）を例えば５０サイクル実施し、標的療法に対する感受性または耐性のある遺伝子の発現レベルを検出する。
【０１５６】
上に説明したそれぞれの実施態様では、フィルタはポリカーボネートで実現され、表面が親水性処理されている。このようなフィルタを用いることで、細胞を特別に溶解させたとき、特定の細胞の保持率が改善され、他の細胞またはその中身の接着が減る。
【０１５７】
フィルタは、孔の直径が、固定される同じ細胞（すなわち堅固にされる細胞）のために利用される対応する値よりも例えば１μｍだけ小さい値を中心としていることが好ましい。
【０１５８】
例えば固定された細胞に関して孔の直径が７．５μｍを中心としていたとすると、直径は、ここでは、より小さな値（例えば６．５μｍ）を中心とする。直径は分散しているため、ほとんどどの孔も７μｍを超える直径は持たない。
【０１５９】
本発明を血液細胞に適用する１つの応用では、フィルタは、孔の密度が５０，０００〜２００，０００個／ｃｍ２である。この値は、約１００，０００個／ｃｍ２であることが好ましい。
【０１６０】
ポリカーボネート製のフィルタを用いているおかげで、必要な圧力低下は従来のシステムよりもはるかに小さく、１／４になる。するとフィルタ上で回収しようとする細胞の劣化が回避される。−２５ミリバール以下の圧力低下による吸引をフィルタの下方で実現することが好ましい。
【０１６１】
さまざまな変形例では、フィルタ支持体１０８または３０８は、区画を培養ウエルまたはエッペンドルフ管に向かって移動させることによって力を加えてフィルタ支持体を移動手段から解放するまで、移動手段にメカニカルに接続されている。区画１０２または３０２の下端と移動手段１０２または３０２の役割を逆にし、培養ウエルまたはエッペンドルフ管の中または前でフィルタ支持体を保持するのが後者で、区画の上端に支持されるときフィルタ支持体を解放するのが前者であるようにすることは、上に与えた実施態様の説明をもとにして当業者が容易に実現できる変更である。
【０１６２】
単一の区画１０２または３０２に関して上に説明したことは、共通する１つの支持体（図示せず）によって保持された多数の区画に対して同時に実行することが好ましいことがわかる。
【０１６３】
さまざまな実施態様では、本発明が対象とする装置の外観は、外側の袋の中に内側の２つの袋が入ったキットの形態を取る。
− 第１の袋は、図２Ａまたは図６Ａに示したような組み立てられた装置を含んでおり、
− 第２の袋は、培養ウエルと円形板および／またはエッペンドルフ管、またはこの装置を実現する上で役に立つ他のあらゆる付属品を含んでいる。
【０１６４】
本発明を実施することにより、細胞（例えば羊水の細胞）の危険な採取を回避できる一方で、例えば羊水穿刺のための培養が可能である。それに加え、フィルタ支持体１０８のリザーバの形状から、このフィルタ支持体の中で免疫細胞化学または蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーション（“ＦＩＳＨ”）の反応を実現することができる。
【０１６５】
さまざまな実施態様（図示せず）では、リングが、注射器の形状になった区画の下方開口部から挿入されて、この区画に押し込められるか貼りついている。ワッシャまたはリングの形態のフィルタ支持体または椀状体がリングの中に配置されてフィルタを保持する。フィルタには微細な孔が開けられていて、椀状体の下に接合された後、椀状体とともに、注射器の形状になった区画の下端に挿入される。
【０１６６】
区画の下部の内側には、下部の形状が円錐形の下向きの部材が位置している。この部材は、フィルタ支持体の上面に支持される。この部材の下半分は、長さがリングと同じかそれよりも長い。したがって区画とこの部材の間の接続には、区画の軸線に沿って、少なくともフィルタ支持体の上部とリングの下方開口部を隔てる距離にわたって遊びがある。このように、注射器の形状になった区画に挿入されたピストンによってこの部材が軸方向に運動するとき、その部材は、フィルタ支持体がリングから解放されるまで、したがって注射器の形状になった区画から解放されるまで、そのフィルタ支持体を押す。それに加え、ピストンを区画の上方開口部の中に挿入し、円錐形部材に支持されるまでピストンの上部を押すとき、ピストンは、ピストンの外壁と区画の内壁の間を空気を自由に通過させるため、ピストンの移動によって区画内部の圧力が上昇することはない。するとフィルタ上に保持された生きた細胞が傷むリスクが回避される。上記の部材が円錐形になっているおかげで、ピストンはフィルタに支持されず、したがってこのフィルタ上に保持される細胞が傷む危険性がない。同様に、この部材はフィルタ支持体にも支持されていないため、やはりこれらの細胞が傷む危険性がない。
【０１６７】
ピストンで部材を下方に移動させるために遊びを実現しつつピストンの上部を押し続けると、その部材によってフィルタ支持体がリングと区画から出る。するとこのフィルタ支持体とフィルタは、プレートのウエルおよび／または培養容器の中に落ちる。区画内のピストンの行程はピストンの上方肩部によって制限されるため、行程の終わりにこの肩部が区画の上方開口部に支持されるとき、部材の移動時に遊びが完全に利用された状態であることが好ましい。したがってリングが外れてフィルタの上、および／またはプレートのウエルの中、および／または培養容器の中に落ちるリスクが回避される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィルタ上で生きた細胞を分離するための装置であって、
− フィルタに固定されたフィルタ支持体（１０８、３０８）と、
− 上方開口部と下方開口部を有する区画（１０２、３０２）と、
− 前記フィルタ支持体に力を加えてそのフィルタ支持体を解放するために前記区画に対して移動する移動手段（１１０、３１０）とを備えることを特徴とする装置。
【請求項２】
気密かつ取外し可能に固定されていて、前記力を加えて前記フィルタ支持体（１０８、３０８）を解放することを可能にする相対運動を前記移動手段（１１０、３１０）と前記区画（１０２、３０２）に禁じる取外し可能な先端部（１０４、３０４）を備えることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記先端部（１０４、３０４）が、吸引システムの圧力低下室に合った下方開口部を有することを特徴とする、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記フィルタ支持体（１０８）がワッシャの形態を取ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記フィルタ支持体（１０８）がＰＶＣからなることを特徴とする、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記フィルタ支持体（１０８）が堅固なＰＶＣからなることを特徴とする、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記フィルタ支持体（１０８）が、カバーガラスの形態を取ることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記フィルタ支持体（１０８）が、カバーガラスと同じかそれよりも大きなサイズであることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記フィルタ支持体（１０８）の厚さが０．４ｍｍ以下であり、０．３ｍｍ以下であることが好ましいことを特徴とする、請求項４〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記フィルタ支持体（３０８）が、エッペンドルフ管（３３０）の少なくとも一部の形態を取ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記フィルタ支持体（３０８）が、上部内側において、エッペンドルフ管（３３０）の上部内側の形態を再現していることを特徴とする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記フィルタ支持体（３０８）が、下部内側において、エッペンドルフ管（３３０）の下部内側の形態を再現していることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記フィルタ支持体（３０８）が、上部外側において、エッペンドルフ管（３３０）の上部内側の形態を再現していることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
前記フィルタ支持体（３０８）がポリカーボネートを含むことを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
前記フィルタ支持体（１０８、３０８）が、前記力が加えられるまで前記区画（１０２、３０２）にメカニカルに接続されていることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
前記フィルタ支持体（１０８、３０８）が、前記力が加えられるまで前記移動手段にメカニカルに接続されていることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
生きた細胞をフィルタ上で分離するか、その細胞の遺伝子材料を抽出するための方法であって、
− フィルタに固定されたフィルタ支持体を、上方開口部と下方開口部を有する区画と一体化するか、その区画に対して移動する移動手段と一体化するステップと、
− 前記フィルタ支持体に力を加えてそのフィルタ支持体を解放するため、前記移動手段と前記区画をそれぞれ運動させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記運動ステップにおいて前記フィルタ支持体を培養ウエル（１３０）に直接移行させることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
フィルタ上で生きた細胞を分離するための装置であって、
− フィルタに固定されたフィルタ支持体（１０８、３０８）と、
− 上方開口部と下方開口部を有する区画（１０２、３０２）と、
− 前記フィルタ支持体に力を加えてそのフィルタ支持体を解放するために前記区画に対して移動する移動手段（１１０、３１０）とを備えることを特徴とする装置。
【請求項２】
気密かつ取外し可能に固定されていて、前記力を加えて前記フィルタ支持体（１０８、３０８）を解放することを可能にする相対運動を前記移動手段（１１０、３１０）と前記区画（１０２、３０２）に禁じる取外し可能な先端部（１０４、３０４）を備えることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記先端部（１０４、３０４）が、吸引システムの圧力低下室に合った下方開口部を有することを特徴とする、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記フィルタ支持体（１０８）がワッシャの形態を取ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記フィルタ支持体（１０８）がＰＶＣからなることを特徴とする、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記フィルタ支持体（１０８）が堅固なＰＶＣからなることを特徴とする、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記フィルタ支持体（１０８）が、カバーガラスの形態を取ることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記フィルタ支持体（１０８）が、カバーガラスと同じかそれよりも大きなサイズであることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記フィルタ支持体（１０８）の厚さが０．４ｍｍ以下であり、０．３ｍｍ以下であることが好ましいことを特徴とする、請求項４〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記フィルタ支持体（３０８）が、エッペンドルフ管（３３０）の少なくとも一部の形態を取ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記フィルタ支持体（３０８）が、上部内側において、エッペンドルフ管（３３０）の上部内側の形態を再現していることを特徴とする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記フィルタ支持体（３０８）が、下部内側において、エッペンドルフ管（３３０）の下部内側の形態を再現していることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記フィルタ支持体（３０８）が、上部外側において、エッペンドルフ管（３３０）の上部内側の形態を再現していることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
前記フィルタ支持体（３０８）がポリカーボネートを含むことを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
前記フィルタ支持体（１０８、３０８）が、前記力が加えられるまで前記区画（１０２、３０２）にメカニカルに接続されていることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
前記フィルタ支持体（１０８、３０８）が、前記力が加えられるまで前記移動手段にメカニカルに接続されていることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
生きた細胞をフィルタ上で分離するか、その細胞の遺伝子材料を抽出するための方法であって、
− フィルタに固定されたフィルタ支持体を、上方開口部と下方開口部を有する区画と一体化するか、その区画に対して移動する移動手段と一体化するステップと、
− 前記フィルタ支持体に力を加えてそのフィルタ支持体を解放するため、前記移動手段と前記区画をそれぞれ運動させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記運動ステップにおいて前記フィルタ支持体を培養ウエル（１３０）に直接移行させることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図３Ｌ】
【図３Ｍ】
【図３Ｎ】
【図３Ｏ】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図７Ｉ】
【図７Ｊ】
【図７Ｋ】
【図７Ｌ】
【図８】
【図９】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図３Ｌ】
【図３Ｍ】
【図３Ｎ】
【図３Ｏ】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図７Ｉ】
【図７Ｊ】
【図７Ｋ】
【図７Ｌ】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１１−５０９４０７（Ｐ２０１１−５０９４０７Ａ）
【公表日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４１８２１（Ｐ２０１０−５４１８２１）
【出願日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／００００１９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０６７６０
【国際公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【出願人】（５１００７６１００）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／００００１９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０６７６０
【国際公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【出願人】（５１００７６１００）
【Ｆターム（参考）】
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