生体コラーゲン合成促進剤
【課題】 生体内コラーゲンタンパク合成活性を飛躍的に高めることができる生体コラーゲン合成促進剤を提供すること
【解決手段】 分子量が４００以下のものコラーゲンまたはゼラチンの分解物を含有する生体コラーゲン合成促進剤。特にアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのトリペプチドを含むもの。本発明の、分子量４００以下のコラーゲン又はゼラチン分解物又はアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）トリペプチド、特にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、生体コラーゲンの合成促進剤として極めて有効である。
【解決手段】 分子量が４００以下のものコラーゲンまたはゼラチンの分解物を含有する生体コラーゲン合成促進剤。特にアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのトリペプチドを含むもの。本発明の、分子量４００以下のコラーゲン又はゼラチン分解物又はアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）トリペプチド、特にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、生体コラーゲンの合成促進剤として極めて有効である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体内でのコラーゲン合成の促進活性を高める剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは生体内のタンパク質の約１／３を占めるタンパク質で、血管や皮膚、骨に多く存在する。コラーゲンは消化酵素でほとんど分解されないため栄養価の低いタンパク質と考えられたことがあったが、コラーゲンを摂取することによる新陳代謝促進（特許文献１）、頭髪の直径が太くなる（非特許文献１）ことや、関節症治療用薬剤としての利用（特許文献２）が報告され、有用性が見直されている。更にこのコラーゲンタンパクは加齢とともに減少することから血管の脆弱化や皮膚の弾力性・柔軟性の減少などの一因と考えられている。近年、コラーゲンタンパクもしくはその加水分解物の経口摂取による皮膚の新陳代謝促進に関する特許（特許文献３）も開示され、主に美容向けの健康食品が多数販売されている。
【０００３】
コラーゲンの熱変性体であるゼラチンは、その高い粘性、凝固性、保水性および保湿性を利用して、食品の食感改良剤や化粧品（特許文献４）として使用されている。しかし、未処理のコラーゲンおよびゼラチンは粘性が高く凝固し易い性質を持つため、部分加水分解処理されたものを使用することが多い。また、タンパク質であるため抗原性を有し、アレルギー体質のヒトの摂取には問題がある。そのため、コラーゲンをコラゲナーゼによって、低分子化することにより抗原性をなくしアレルギー患者向けのタンパク質源あるいは輸液製剤成分としての利用が開示されている（特許文献５）。
【０００４】
コラゲナーゼによるコラーゲンの分解物の生理活性については、フィブリン凝集阻害活性（特許文献６）、麻酔作用（非特許文献２）が知られている。また、Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼによるコラーゲンの分解産物に関しては、Nagai,Y.が、生成するトリペプタイドの３６％がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐでもっとも多いと報告している（非特許文献３）。
【０００５】
コラーゲンタンパクもしくはその加水分解物の経口摂取により生体のコラーゲンタンパク生合成を促進させ、生体コラーゲンの新陳代謝を高める場合、０．５〜４０ｇの摂取が必要とされており（特開平７−２７８０１２）、イタリアにおいては１日あたり２〜６ｇの摂取を推奨している。しかしながら、数ｇのコラーゲンタンパク摂取は、臭いや凝固性の点から通常の食品に添加することは現実的でない。
【０００６】
【特許文献１】特開平７−２７８０１２公報
【非特許文献１】Nutrition Reports International,13,579,1976
【特許文献２】特開昭６３−３９８２１公報
【特許文献３】特開平７−２７８０１２公報
【特許文献４】特開昭５２−１１１６００
【特許文献５】特開平７−８２２９９公報
【特許文献６】特開平６−４６８７５公報
【非特許文献２】Br.J.Pharmacol.,69,551,1980
【非特許文献３】J.Biochem.,50,486,1961
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、生体内コラーゲンタンパク合成活性を飛躍的に高めることができる生体コラーゲン合成促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記のような問題点を解決するためにコラーゲンタンパクの経口摂取の薬理作用について鋭意研究を重ねた結果、コラーゲンタンパクを特定の分子量以下まで加水分解することにより、上記目的を達成できることを見出し、本発明に到達した。
即ち、本発明は、コラーゲンまたはゼラチンの分解物であって分子量が４００以下のものを含有することを特徴とする生体コラーゲン合成促進剤である。コラーゲンまたはゼラチンの分解物としては、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であるペプタイドが好ましく、特に好ましくはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのものである。
また、本発明はアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であるペプタイドを含有することを特徴とする生体コラーゲン合成促進剤であり、好ましくはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の、分子量４００以下のコラーゲン又はゼラチン分解物又はアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）トリペプチド、特にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、生体コラーゲンの合成促進剤として極めて有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に用いられるコラーゲンタンパクは、例えば牛や豚などの動物の皮膚、骨および腱などの結合組織から抽出したもの、もしくはコラーゲンタンパクの熱変性物であるゼラチンがある。
【００１１】
本発明におけるコラーゲンまたはゼラチンの分解物とは分子量が４００以下のものである。コラーゲン又はゼラチンの加水分解は加水分解酵素による方法でもよく、酸あるいはアルカリによる加水分解であっても問題ない。酵素分解に用いる加水分解酵素としては、例えばコラゲナーゼ酵素においては、Clostridium histoticum,Streptomyces parvulusなどの細菌、放線菌あるいは真菌など由来のものを使用できる。また遺伝子組み替え技術により他の菌体に産生させたもので、類似の基質特異性を有する酵素であっても問題はなく、これらの微生物により発酵させることも有効である。さらに、その他のタンパク質加水分解酵素の混合物であってもよい。好ましくはＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であらわされるペプタイドを生成するものである。
【００１２】
分子量が４００以下のコラーゲンまたはゼラチンの分解物は精製したものでもよいが、精製しなくても差し支えない。例えば他のコラーゲンまたはゼラチンの分解生成物等の混合物でもよい。
【００１３】
コラーゲンの加水分解物は、既に市販されている。これらの酵素的に加水分解されたコラーゲンの多くは、分子量の分布範囲が二千から八万である。これらの加水分解物は水に対する分散性の向上を目的とするものであって、生体内でのコラーゲン合成促進活性の向上を目的としたものではない。これに対して本発明のコラーゲン加水分解物は、特定の有効成分として分子量で約４００以下のペプタイドを含むことを特徴とし、その加水分解処理により、生体内でのコラーゲン合成促進活性を飛躍的に向上させることができる。
【００１４】
本発明におけるコラーゲンまたはゼラチンの分解物は、好ましくは、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙのペプタイドであり、特に好ましくはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのものである。
また、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙのペプタイドの場合は、コラーゲンまたはゼラチンの分解物でなくとも差し支えなく、液相法、固相法に代表されるペプタイドの化学合成法により合成されたペプタイドであっても問題ない。好ましくは、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのものである。
【００１５】
分子量が４００以下のコラーゲンまたはゼラチンの分解物またはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙのペプタイドの量は全剤中１質量％以上が好ましく、特に好ましくは１５質量％以上である。分解物はゲルろ過などにより、分子量４００以下のペプタイド部分を高度に精製することもできる。
本発明の生体コラーゲン合成促進剤は、経口摂取可能な形態、例えば粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセルなどの剤型にすることができ、また飲料などの食品に配合することもできる。摂取量は特に制限はないが、通常分子量が４００以下のコラーゲンまたはゼラチンの分解物またはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙのペプタイドの量が０．０３〜３ｇ／日となるような量である。さらに外用剤として軟膏や化粧品に配合しても問題ない。
【実施例】
【００１６】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
調製例１
コラーゲンタンパクとして、ウシ真皮より調製したゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍｌに加温溶解し、０．４５μmのフィルターで滅菌ろ過した。
【００１７】
調製例２
コラーゲンタンパクとして、ウシ真皮より調製したゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍｌに加温溶解した。コラゲナーゼタイプＩ（Worthington Biochemical Corp.）３００ｍｇを加え、アンモニア水にてｐＨを７．５に調整した後３７℃で１時間放置した。反応終了後、反応液を１００℃で３分間加熱しコラゲナーゼを失活させ、次いで０．４５μmのフィルターで滅菌ろ過した。このろ液をＣＤＰ−０とする。
このろ液ＣＤＰ−０を蒸留水で平衡化したSephadex LH-20(Pharmacia)によるゲルろ過を行い２つの画分（ＣＤＰ−１，ＣＤＰ−２）に分け、それぞれを凍結乾燥した。ゲルろ過のクロマトを図１に示す。それぞれのピークをSuperdex Peptide HR10/30(Pharmacia)を用いて、０．３Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）を溶出液に用いて分子量を求めたところ、ＣＤＰ−１が約１２０００〜５００に分布し、ＣＤＰ−２が約３５０だった。ＣＤＰ−２の約５０％がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐであった。
【００１８】
調製例３
コラーゲンタンパクとして、ウシ真皮より調製したゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍｌに加温溶解した。ペプシン（Ｂｉｏｚｙｍｅ Ｌａｂ．，ＬＴＤ．）３００ｍｇを加え、希塩酸にてｐＨを２．０に調整した後３７℃で１時間放置した。反応終了後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７に調整した後１００℃で３分間加熱しペプシンを失活させ、次いで０．４５μmのフィルターで滅菌ろ過した。このものの分子量を測定したところ、１２０００付近をピークに２００００〜６０に広く分布していた。図２にLH-20によるゲルろ過のクロマトを示す。
【００１９】
調製例４
表−１に示すアミノ酸組成物を蒸留水３００ｍｌに溶解し、０．４５μmのフィルターで滅菌ろ過した。この組成はコラーゲンを構成するアミノ酸の組成に等しい。
【００２０】
【表１】
【００２１】
調製例５
tert.ＢＯＣアミノ酸誘導体を用いる液相法により、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐを合成した。合成品は６Ｎ塩酸中、１１０℃で２２時間加水分解し、アミノ酸分析を行った。アミノ酸分析値と元素分析値を以下に示す。
アミノ酸分析：Gly 1.00(1),Pro 1.05(1),Hyp 1.05(1)、元素分析：C 43.22(43.11),H 6.43(6.45),N 12.37(12.57) C12H19N3O5・HCl・0.7H2Oとして、括弧内は理論値。
【００２２】
実施例１
６週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本クレア(株)）を１週間予備飼育した後、１〜５の５群、一群５匹に分けた。ラットの飼育は温度２３℃、湿度５５％環境下で行い、飼料はＣＥ−２（日本クレア(株)）を用い、飲料水とともに自由摂取させた。各群にはクエン酸でｐＨを３．８〜４．０に調整した試料液を１日１回、１３日間連続で胃ゾンデを用いて投与した。ペントバルビタール麻酔下、右腹側部を採取し可溶性コラーゲン量をハドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を指標に測定した。結果を表−２に示す。
ＣＤＰ−２が含まれているＣＤＰ−０を与えた群３は、蒸留水を与えた群１に比較して可溶性コラーゲン量の量が著しく多かった。これに対してゼラチン自体である調製例１とペプシンで分解し分子量が大きい調製例３の物質を与えた群２，４は可溶性コラーゲン量の増加量が少なく、アミノ酸の混合物である調製例４を与えた群５は群１とほとんど変わらなかった。
【００２３】
【表２】
【００２４】
実施例２
ＴＩＧ１０３ヒト皮膚正常細胞（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団）を１０％の非動化したウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ中３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下で培養した。コンフルエントになった後、血清濃度を０．５％に下げ２４時間培養し、１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸とＣＤＰ−１あるいはＣＤＰ−２を添加しさらに１２時間培養した。細胞を生理食塩水で洗浄した後ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎTM（ニッポンジーン）を用いて抽出し、32Ｐで標識したヒトタイプＩコラーゲンおよびβアクチンのｃＤＮＡプローブにてノーザンブロットを行った。結果を表−３に示す。
アスコルビン酸とＣＤＰ−２および合成ペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）の併用群にのみコラーゲン遺伝子の増加が見られる。活性ペプチドは分子量で約４００以下ペプチドであり、その活性本体のひとつとしてＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐであることがわかる。
【００２５】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明は、生体内コラーゲンタンパク合成活性を飛躍的に高めることができる生体コラーゲン合成促進剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１はコラゲナーゼで分解したゼラチンのＬＨ−２０のクロマトグラフである。先に溶出される大きな分子量画分をＣＤＰ−１とし、後の小さな分子量画分をＣＤＰ−２とした。
【図２】図２はペプシンで分解したゼラチンのＬＨ−２０のクロマトグラフである。全体をひとつの画分とした。
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体内でのコラーゲン合成の促進活性を高める剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは生体内のタンパク質の約１／３を占めるタンパク質で、血管や皮膚、骨に多く存在する。コラーゲンは消化酵素でほとんど分解されないため栄養価の低いタンパク質と考えられたことがあったが、コラーゲンを摂取することによる新陳代謝促進（特許文献１）、頭髪の直径が太くなる（非特許文献１）ことや、関節症治療用薬剤としての利用（特許文献２）が報告され、有用性が見直されている。更にこのコラーゲンタンパクは加齢とともに減少することから血管の脆弱化や皮膚の弾力性・柔軟性の減少などの一因と考えられている。近年、コラーゲンタンパクもしくはその加水分解物の経口摂取による皮膚の新陳代謝促進に関する特許（特許文献３）も開示され、主に美容向けの健康食品が多数販売されている。
【０００３】
コラーゲンの熱変性体であるゼラチンは、その高い粘性、凝固性、保水性および保湿性を利用して、食品の食感改良剤や化粧品（特許文献４）として使用されている。しかし、未処理のコラーゲンおよびゼラチンは粘性が高く凝固し易い性質を持つため、部分加水分解処理されたものを使用することが多い。また、タンパク質であるため抗原性を有し、アレルギー体質のヒトの摂取には問題がある。そのため、コラーゲンをコラゲナーゼによって、低分子化することにより抗原性をなくしアレルギー患者向けのタンパク質源あるいは輸液製剤成分としての利用が開示されている（特許文献５）。
【０００４】
コラゲナーゼによるコラーゲンの分解物の生理活性については、フィブリン凝集阻害活性（特許文献６）、麻酔作用（非特許文献２）が知られている。また、Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼによるコラーゲンの分解産物に関しては、Nagai,Y.が、生成するトリペプタイドの３６％がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐでもっとも多いと報告している（非特許文献３）。
【０００５】
コラーゲンタンパクもしくはその加水分解物の経口摂取により生体のコラーゲンタンパク生合成を促進させ、生体コラーゲンの新陳代謝を高める場合、０．５〜４０ｇの摂取が必要とされており（特開平７−２７８０１２）、イタリアにおいては１日あたり２〜６ｇの摂取を推奨している。しかしながら、数ｇのコラーゲンタンパク摂取は、臭いや凝固性の点から通常の食品に添加することは現実的でない。
【０００６】
【特許文献１】特開平７−２７８０１２公報
【非特許文献１】Nutrition Reports International,13,579,1976
【特許文献２】特開昭６３−３９８２１公報
【特許文献３】特開平７−２７８０１２公報
【特許文献４】特開昭５２−１１１６００
【特許文献５】特開平７−８２２９９公報
【特許文献６】特開平６−４６８７５公報
【非特許文献２】Br.J.Pharmacol.,69,551,1980
【非特許文献３】J.Biochem.,50,486,1961
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、生体内コラーゲンタンパク合成活性を飛躍的に高めることができる生体コラーゲン合成促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記のような問題点を解決するためにコラーゲンタンパクの経口摂取の薬理作用について鋭意研究を重ねた結果、コラーゲンタンパクを特定の分子量以下まで加水分解することにより、上記目的を達成できることを見出し、本発明に到達した。
即ち、本発明は、コラーゲンまたはゼラチンの分解物であって分子量が４００以下のものを含有することを特徴とする生体コラーゲン合成促進剤である。コラーゲンまたはゼラチンの分解物としては、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であるペプタイドが好ましく、特に好ましくはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのものである。
また、本発明はアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であるペプタイドを含有することを特徴とする生体コラーゲン合成促進剤であり、好ましくはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の、分子量４００以下のコラーゲン又はゼラチン分解物又はアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）トリペプチド、特にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、生体コラーゲンの合成促進剤として極めて有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に用いられるコラーゲンタンパクは、例えば牛や豚などの動物の皮膚、骨および腱などの結合組織から抽出したもの、もしくはコラーゲンタンパクの熱変性物であるゼラチンがある。
【００１１】
本発明におけるコラーゲンまたはゼラチンの分解物とは分子量が４００以下のものである。コラーゲン又はゼラチンの加水分解は加水分解酵素による方法でもよく、酸あるいはアルカリによる加水分解であっても問題ない。酵素分解に用いる加水分解酵素としては、例えばコラゲナーゼ酵素においては、Clostridium histoticum,Streptomyces parvulusなどの細菌、放線菌あるいは真菌など由来のものを使用できる。また遺伝子組み替え技術により他の菌体に産生させたもので、類似の基質特異性を有する酵素であっても問題はなく、これらの微生物により発酵させることも有効である。さらに、その他のタンパク質加水分解酵素の混合物であってもよい。好ましくはＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であらわされるペプタイドを生成するものである。
【００１２】
分子量が４００以下のコラーゲンまたはゼラチンの分解物は精製したものでもよいが、精製しなくても差し支えない。例えば他のコラーゲンまたはゼラチンの分解生成物等の混合物でもよい。
【００１３】
コラーゲンの加水分解物は、既に市販されている。これらの酵素的に加水分解されたコラーゲンの多くは、分子量の分布範囲が二千から八万である。これらの加水分解物は水に対する分散性の向上を目的とするものであって、生体内でのコラーゲン合成促進活性の向上を目的としたものではない。これに対して本発明のコラーゲン加水分解物は、特定の有効成分として分子量で約４００以下のペプタイドを含むことを特徴とし、その加水分解処理により、生体内でのコラーゲン合成促進活性を飛躍的に向上させることができる。
【００１４】
本発明におけるコラーゲンまたはゼラチンの分解物は、好ましくは、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙのペプタイドであり、特に好ましくはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのものである。
また、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙのペプタイドの場合は、コラーゲンまたはゼラチンの分解物でなくとも差し支えなく、液相法、固相法に代表されるペプタイドの化学合成法により合成されたペプタイドであっても問題ない。好ましくは、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのものである。
【００１５】
分子量が４００以下のコラーゲンまたはゼラチンの分解物またはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙのペプタイドの量は全剤中１質量％以上が好ましく、特に好ましくは１５質量％以上である。分解物はゲルろ過などにより、分子量４００以下のペプタイド部分を高度に精製することもできる。
本発明の生体コラーゲン合成促進剤は、経口摂取可能な形態、例えば粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセルなどの剤型にすることができ、また飲料などの食品に配合することもできる。摂取量は特に制限はないが、通常分子量が４００以下のコラーゲンまたはゼラチンの分解物またはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙのペプタイドの量が０．０３〜３ｇ／日となるような量である。さらに外用剤として軟膏や化粧品に配合しても問題ない。
【実施例】
【００１６】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
調製例１
コラーゲンタンパクとして、ウシ真皮より調製したゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍｌに加温溶解し、０．４５μmのフィルターで滅菌ろ過した。
【００１７】
調製例２
コラーゲンタンパクとして、ウシ真皮より調製したゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍｌに加温溶解した。コラゲナーゼタイプＩ（Worthington Biochemical Corp.）３００ｍｇを加え、アンモニア水にてｐＨを７．５に調整した後３７℃で１時間放置した。反応終了後、反応液を１００℃で３分間加熱しコラゲナーゼを失活させ、次いで０．４５μmのフィルターで滅菌ろ過した。このろ液をＣＤＰ−０とする。
このろ液ＣＤＰ−０を蒸留水で平衡化したSephadex LH-20(Pharmacia)によるゲルろ過を行い２つの画分（ＣＤＰ−１，ＣＤＰ−２）に分け、それぞれを凍結乾燥した。ゲルろ過のクロマトを図１に示す。それぞれのピークをSuperdex Peptide HR10/30(Pharmacia)を用いて、０．３Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．２）を溶出液に用いて分子量を求めたところ、ＣＤＰ−１が約１２０００〜５００に分布し、ＣＤＰ−２が約３５０だった。ＣＤＰ−２の約５０％がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐであった。
【００１８】
調製例３
コラーゲンタンパクとして、ウシ真皮より調製したゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍｌに加温溶解した。ペプシン（Ｂｉｏｚｙｍｅ Ｌａｂ．，ＬＴＤ．）３００ｍｇを加え、希塩酸にてｐＨを２．０に調整した後３７℃で１時間放置した。反応終了後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７に調整した後１００℃で３分間加熱しペプシンを失活させ、次いで０．４５μmのフィルターで滅菌ろ過した。このものの分子量を測定したところ、１２０００付近をピークに２００００〜６０に広く分布していた。図２にLH-20によるゲルろ過のクロマトを示す。
【００１９】
調製例４
表−１に示すアミノ酸組成物を蒸留水３００ｍｌに溶解し、０．４５μmのフィルターで滅菌ろ過した。この組成はコラーゲンを構成するアミノ酸の組成に等しい。
【００２０】
【表１】
【００２１】
調製例５
tert.ＢＯＣアミノ酸誘導体を用いる液相法により、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐを合成した。合成品は６Ｎ塩酸中、１１０℃で２２時間加水分解し、アミノ酸分析を行った。アミノ酸分析値と元素分析値を以下に示す。
アミノ酸分析：Gly 1.00(1),Pro 1.05(1),Hyp 1.05(1)、元素分析：C 43.22(43.11),H 6.43(6.45),N 12.37(12.57) C12H19N3O5・HCl・0.7H2Oとして、括弧内は理論値。
【００２２】
実施例１
６週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本クレア(株)）を１週間予備飼育した後、１〜５の５群、一群５匹に分けた。ラットの飼育は温度２３℃、湿度５５％環境下で行い、飼料はＣＥ−２（日本クレア(株)）を用い、飲料水とともに自由摂取させた。各群にはクエン酸でｐＨを３．８〜４．０に調整した試料液を１日１回、１３日間連続で胃ゾンデを用いて投与した。ペントバルビタール麻酔下、右腹側部を採取し可溶性コラーゲン量をハドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を指標に測定した。結果を表−２に示す。
ＣＤＰ−２が含まれているＣＤＰ−０を与えた群３は、蒸留水を与えた群１に比較して可溶性コラーゲン量の量が著しく多かった。これに対してゼラチン自体である調製例１とペプシンで分解し分子量が大きい調製例３の物質を与えた群２，４は可溶性コラーゲン量の増加量が少なく、アミノ酸の混合物である調製例４を与えた群５は群１とほとんど変わらなかった。
【００２３】
【表２】
【００２４】
実施例２
ＴＩＧ１０３ヒト皮膚正常細胞（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団）を１０％の非動化したウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ中３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下で培養した。コンフルエントになった後、血清濃度を０．５％に下げ２４時間培養し、１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸とＣＤＰ−１あるいはＣＤＰ−２を添加しさらに１２時間培養した。細胞を生理食塩水で洗浄した後ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎTM（ニッポンジーン）を用いて抽出し、32Ｐで標識したヒトタイプＩコラーゲンおよびβアクチンのｃＤＮＡプローブにてノーザンブロットを行った。結果を表−３に示す。
アスコルビン酸とＣＤＰ−２および合成ペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）の併用群にのみコラーゲン遺伝子の増加が見られる。活性ペプチドは分子量で約４００以下ペプチドであり、その活性本体のひとつとしてＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐであることがわかる。
【００２５】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明は、生体内コラーゲンタンパク合成活性を飛躍的に高めることができる生体コラーゲン合成促進剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１はコラゲナーゼで分解したゼラチンのＬＨ−２０のクロマトグラフである。先に溶出される大きな分子量画分をＣＤＰ−１とし、後の小さな分子量画分をＣＤＰ−２とした。
【図２】図２はペプシンで分解したゼラチンのＬＨ−２０のクロマトグラフである。全体をひとつの画分とした。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンまたはゼラチンの分解物であって分子量が４００以下のものを含有することを特徴とする生体コラーゲン合成促進剤。
【請求項２】
アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であるペプタイドを含有することを特徴とする生体コラーゲン合成促進剤。
【請求項３】
アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのトリペプチドを含むことを特徴とする生体コラーゲン合成促進剤。
【請求項４】
コラーゲンまたはゼラチン分解物のアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であることを特徴とする請求項１の生体コラーゲン合成促進剤。
【請求項５】
コラーゲンまたはゼラチン分解物のアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐであることを特徴とする請求項１の生体コラーゲン合成促進剤。
【請求項１】
コラーゲンまたはゼラチンの分解物であって分子量が４００以下のものを含有することを特徴とする生体コラーゲン合成促進剤。
【請求項２】
アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であるペプタイドを含有することを特徴とする生体コラーゲン合成促進剤。
【請求項３】
アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのトリペプチドを含むことを特徴とする生体コラーゲン合成促進剤。
【請求項４】
コラーゲンまたはゼラチン分解物のアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であることを特徴とする請求項１の生体コラーゲン合成促進剤。
【請求項５】
コラーゲンまたはゼラチン分解物のアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐであることを特徴とする請求項１の生体コラーゲン合成促進剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−５６９０４（Ｐ２００６−５６９０４Ａ）
【公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３１４２５９（Ｐ２００５−３１４２５９）
【出願日】平成１７年１０月２８日（２００５．１０．２８）
【分割の表示】特願平１１−３１５４６１の分割
【原出願日】平成１１年１１月５日（１９９９．１１．５）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２８日（２００５．１０．２８）
【分割の表示】特願平１１−３１５４６１の分割
【原出願日】平成１１年１１月５日（１９９９．１１．５）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
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