生体分子の検出方法、生体分子捕捉物質及び生体分子検出装置
【課題】表面プラズモン共鳴励起蛍光を利用した、高感度かつ高精度な生体分子の検出方法生体分子の検出方法、生体分子捕捉物質及び生体分子検出装置を提供することにある。
【解決手段】表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出する方法であって、外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合した生体分子捕捉物質を用いることを特徴とする生体分子の検出方法。
【解決手段】表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出する方法であって、外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合した生体分子捕捉物質を用いることを特徴とする生体分子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴励起蛍光を用いた生体分子の検出方法、生体分子捕捉物質及び生体分子検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の相互作用を調べる方法、またそれによって特定の生体分子を検出する方法として、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、以下ＳＰＲとも記す）を使用した分光分析法が知られている。例えば、特許文献１には、表面プラズモン共鳴測定及び蛍光測定によって得られた信号を個別に分析することによって、被検体の固相への結合を判定する装置及びその方法が開示されている。
【０００３】
また、下記特許文献２、３、５には、表面プラズモン共鳴を用いた２次元イメージング装置が開示され、特許文献４には、表面プラズモン共鳴測定、及び発生した蛍光が生じる第２のプラズモン共鳴を用いた表面プラズモン蛍光顕微鏡が開示され、特許文献６にはプラズモン共鳴蛍光を用いた生体分子相互作用検出装置及び検出方法が開示されている。
【０００４】
これら表面プラズモン共鳴励起蛍光法では、金属基板上に担体や生体分子捕捉物質等を介して固定された蛍光物質に対し、表面プラズモン共鳴によって生じた増強励起光が照射され、発する蛍光を検出する。このとき蛍光物質と金属基板との距離が近いと、励起された蛍光物質から金属基板へとエネルギー移動が起こり、蛍光量子収率が大幅に減少してしまう。微量な生体分子を高感度に検出し、精度よく定量するためには、標識蛍光物質の基盤からの距離を制御することが必要である。
【０００５】
金属基板上に生体分子捕捉物質、例えば抗体分子を配列する場合、通常ポリマー層ＳＡＡＭ層を形成し、この上に抗体分子を結合するが、これらを配向性よく配列するのは困難であり、したがってこれに抗原抗体反応によって捕捉される標識蛍光物質の基板からの距離を制御するのも同様にして困難であった。
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】特開２００１−２５５２６７号公報
【特許文献３】特開２００２−１１６１４９号公報
【特許文献４】特開２００４−１５６９１１号公報
【特許文献５】特開２００４−２７１３３７号公報
【特許文献６】特開２００６−２０８０６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、表面プラズモン共鳴励起蛍光を利用した、高感度かつ高精度な生体分子の検出方法生体分子の検出方法、生体分子捕捉物質及び生体分子検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の構成によって達成される。
１．表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出する方法であって、外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合した生体分子捕捉物質を用いることを特徴とする生体分子の検出方法。
２．前記外力が磁力であることを特徴とする前記１に記載の生体分子の検出方法。
３．前記生体分子捕捉物質が抗体であることを特徴とする前記１または２に記載の生体分子の検出方法。
４．前記生体分子捕捉物質が蛍光標識されていることを特徴とする前記１〜３のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
５．表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出するのに用いられる生体分子捕捉物質が、外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合していることを特徴とする生体分子捕捉物質。
６．外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合した生体分子捕捉物質を用い、表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出する生体分子検出装置であって、プリズム、レーザー発生手段、レーザー光検出手段、蛍光検出手段及び外力発生手段を有することを特徴とする生体分子検出装置。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、表面プラズモン共鳴励起蛍光を利用した、高感度かつ高精度な生体分子の検出方法、生体分子捕捉物質及び生体分子検出装置を提供できた。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
〔生体分子の検出方法〕
本発明の生体分子の検出方法を詳細に説明する。
【００１０】
本発明では表面プラズモン共鳴励起蛍光法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下ＳＰＦＳとも記す）を利用して生体分子（以下、被検体とも記す）の検出を行う。
【００１１】
表面プラズモン共鳴励起蛍光法の一般的なプロトコルを以下に示す。この方法は、プリズム（Ａ）と、プリズム表面の金属薄膜及び被検体検出層を有する被検体検出手段（Ｂ）と、レーザー発生手段（Ｃ）と、第１及び第２光検出手段（Ｄ、Ｅ）とを備えた装置を用い、レーザー発生手段（Ｃ）から薄膜に入射されたレーザー光の反射強度を第１光検出手段（Ｄ）で検出し、レーザー発生手段（Ｃ）から薄膜に入射されたレーザー光によって薄膜裏面に生じるプラズモン光によって励起された蛍光分子が出力する蛍光を、第２光検出手段（Ｅ）で検出する、という手順で行われる。
【００１２】
次にプラズモン光の特性について以下に説明する。
【００１３】
プラズモン光は、レーザー光が金属薄膜に対し全反射条件で照射されたときに、第１光検出手段（Ｄ）によって検出される反射光の強度が減衰する入射角領域で薄膜裏面に発生し、その強度はレーザー光の入射角度に依存して変動する。反射光強度の減衰が最大となるときのレーザー光入射角度を第１の入射角度とすると、その近傍でプラズモン光の強度が最大となるが、厳密にはプラズモン光の強度が最大となるときのレーザー光の入射角度（第２の入射角度）は、第１の入射角度よりわずかに低角度となる。この理論値の算出にあたっては、文献：Ｔ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ，Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，Ｓｕｒｆａｃｅ−ｐｌａｓｍｏｎ ｆｉｅｌｄ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｓｐｅｃｔｓ １７１（２０００）１１５−１３０やその引用文献等を参考にして算出することができる。また、プラズモン光は近接場光であり、その電場強度は金属薄膜からの距離が離れるほど減衰するという特性を有している。プラズモン光によって蛍光分子を励起するときは、この近接場光が届く範囲に蛍光分子が存在する必要がある。それに加え、蛍光分子が金属薄膜のごく近傍に位置する場合、金属薄膜へと励起エネルギーの遷移が起きてしまう。
【００１４】
従って、プラズモン光によって蛍光分子を効率的に励起するためには、蛍光分子の金属基板からの距離を制御する必要があることが分かる。
【００１５】
〔外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合している生体分子捕捉物質〕
表面プラズモン共鳴励起蛍光法によって生体分子（被検体とも表現する）を検出するためには、一般に生体分子を特異的に認識して吸着する物質（Ｆ）（生体分子捕捉物質あるいは被検体捕捉物質ともいう。例えば抗原に対する抗体等が挙げられる。）を利用する。生体分子捕捉物質（Ｆ）に蛍光分子を結合することで、蛍光を測定することによって被検体の検出が可能となる。
【００１６】
本発明では、生体分子捕捉物質（Ｆ）に、外力を受けることで配列を制御することが可能な物質（Ｇ）が結合されていることを特徴とする。
【００１７】
生体分子としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、糖鎖あるいはこれらの分解物等が挙げられる。生体分子捕捉物質とは、これらを特異的に認識し捕捉することのできる相補的なＤＮＡやＲＮＡ、抗体、レクチン、あるいはインプリントポリマー等が挙げられる。
【００１８】
生体分子を捕捉する方法としては、従来公知のアッセイに従えばよく、文献：バイオ検査薬の開発（株式会社シーエムシー出版）、バイオ診断薬の開発・評価と企業（株式会社シーエムシー出版）やその引用文献、イムノアッセイ講義（ＷＥＢ情報、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈｉｂａｙａｇｉ．ｃｏ．ｊｐ／ＩＡ−ＬＥＣＴＵＲＥ／Ｃｏｎｔｅｎｔｓ．ｈｔｍ）等が参考になる。本発明においてはイムノアッセイが好ましく、またサンドイッチ型のアッセイが好ましい。
【００１９】
例えば、検出層に用いるセンサー基板として金基板を選び、サンドイッチイムノアッセイを行う場合には、金基板にカルボキシル基やアミノ基等の反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有するアルカンチオールを作用させてＳＡＭ膜を形成し、これに適宜ポリマー等を介し、一次抗体を作用させ固定化する。また、１次抗体に対する反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を備えたポリマーを直接金基板上に固定化し、その上に１次抗体を固定化してもよい。各種反応性基を利用して抗体やポリマーを結合させる際には、スクシンイミジル化を経たアミド化縮合反応や、マレイミド化を経た付加反応等が一般的である。このようにして構成した検出層に抗原を含む溶液を流すことで、固定化した１次抗体によって抗原を捕捉することが可能である。これに対し、さらに標識した二次抗体を含む溶液を作用させることで捕捉された抗原を標識することができる。なお予め抗原と二次抗体とを反応させておいてから１次抗体を作用させてもよい。
【００２０】
本発明の外力とは、例えば磁力（磁気的引力、磁気的斥力）、クーロン力（電気的引力、電気的斥力）、浮力等の、装置がその物質に接触することなしに働きかけることのできる力であり、扱いやすさから磁力が好ましい。
【００２１】
外力を受けることで配列を制御することが可能な物質とは、例えば外力が磁力の時は磁性体（常磁性体、強磁性体、超常磁性体等）であり、具体的には酸化鉄・酸化クロム・コバルト・フェライト、ネオジム等を含む粒子型の磁性体や分子性磁性体等を用いることができる。また外力がクーロン力の場合には、多原子イオンやクラスターイオン等の電荷を持つ物質を用いることができる。外力として浮力を利用する場合には、溶媒よりも比重の軽い粒子、あるいは比重の軽い物質を封入した粒子等を用いることができる。
【００２２】
これに対し外力を与えるものが必要となるが、外力に磁力を用いる場合は、永久磁石や電磁石等が利用でき、外力にクーロン力を用いる場合には電極等が利用できる。
【００２３】
通常の蛍光法では基板平面に対して垂直方向から検出するので、磁石や電極を配置すると検出を阻害する場合があるが、例えば透明な磁石や電極を用いたり、検出窓を用意してその両側に磁石を配置したり、あるいは蛍光の検出を横方向から行うといった手段をとることにより解決することができる。
【００２４】
本発明において、外力を受けることで配列を制御することが可能な物質は、基板に固定する被検体捕捉物質や蛍光分子を結合する（あるいは結合した）被検体捕捉物質、被検体捕捉物質に結合された蛍光分子に、結合させて用いる。このとき蛍光分子自身が外力によって配列を制御することが可能な物質であっても構わない。
【００２５】
結合する場合は共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合等を利用して結合すればよく、適当な高分子材料や低分子材料を介して結合することができる。
【００２６】
外力によって蛍光分子の配列を制御する方法としては、例えば基板から、ＳＡＭ膜、コーティング層等を介し、被検体を捕捉する物質（被検体捕捉物質ともいう）を結合しておき、これに被検体を捕捉させ、その後、蛍光分子と外力によって配列を制御することが可能な物質を結合した被検体捕捉物質を加えて、基板に固定された被検体を捕捉する。通常のアッセイの場合、被検体を捕捉した鎖状の分子群は、さまざまな方向を向いていたり、折れ曲がっていたりするため、基板からの距離も分子群の鎖長に対してきわめて短かったり、ばらつきも大きい。本発明では被検体を捕捉した物質に結合された、外力を受けることで配列を制御することが可能な物質に対して、外力を加えてその位置を制御する。例えば検出層の上部に磁石を配置し、磁気的引力を利用することで、磁性体を上方向に持ち上げることができ、結合した被検体を捕捉した鎖状の分子群を引き伸ばすことが可能となり、結合された蛍光分子の基板からの距離を制御することができる。またこの時、吸着力の差異を利用して、ノイズの原因となる被検体を捕捉していない被検体捕捉物質のみをプラズモン光の届く範囲から遠ざけることもできる。
【００２７】
〔生体分子検出装置〕
以下、本発明の生体分子検出装置の構成例を示すが、本発明はこれに限定されない。
【００２８】
図１は、本発明の実施の形態に係る生体分子検出装置の概略構成を示すブロック図である。本実施の形態に係る生体分子検出装置は、プリズム１、プリズム１の上に形成された、検出対象の生体分子（以下、被検体と記す）を含む試料を保持する被検体検出部（以下、検出部と記す）２と、レーザー発生装置３と、レーザー発生装置３から出力されるレーザー光Ｌの光路上に配置された偏光板４１、絞り４２、シャッタ４３、回転ミラー４４及びレンズ４５で構成される光制御部４と光検出手段である第１及び第２ＣＣＤカメラ５、６と、第１及び第２フィルター７、８とを備えている。
【００２９】
図２は、プリズム１の上に形成される検出部２の構成の一例を示す断面図である。プリズム１には、高屈折率の４５度直角プリズムを用いることができる。検出部２は、プリズム１の表面にスパッター法あるいは蒸着法により３０〜６０ｎｍ（望ましくは４０〜６０ｎｍ、より望ましくは４３〜５３ｎｍ）の厚さに形成された金薄膜２１と、金薄膜２１表面上にスペーサ２３によって周囲を囲まれて形成された、抗原と反応させる抗体を含む被検体検出層（以下、検出層ともいう）２４と、石英基板２５と、これらを固定する固定具２２とを備えている。ここで、スペーサ２３、検出層２４及び石英基板２５によって、バッファ空間２７が形成されており、石英基板２５には貫通孔によって流路２６ａ、２６ｂが形成されている。流路２６ａ、２６ｂは、試料溶液をバッファ空間２７に注入するために使用され、例えば、試料溶液を、流路２６ａからチューブ（図示せず）を介してバッファ空間２７に注入し、流路２６ｂから別のチューブ（図示せず）を介してバッファ空間２７から排出させる。検出層２４には、抗体を結合させた高分子材料を用いることができる。抗体は高分子材料の一方の端部に結合されており、高分子材料の他方の端部は、直接若しくは間接に金薄膜２１表面に固定されている。高分子材料は複数種類が介在していてもよい。高分子材料としては例えばポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、以下ＰＥＧと記す）やＭＰＣポリマー等が挙げられる。これは用時に調製しても、予めこれらを結合させた基板を用いてもよい。
【００３０】
第１ＣＣＤカメラ５は、金薄膜による反射レーザー光を観測するためのものであり、第１フィルター７を介して反射レーザー光を受光可能な位置に配置されている。一方、第２ＣＣＤカメラ６は、検出層２４に含まれている蛍光分子からの蛍光を検出するためのものであり、観測波長に適した蛍光用高感度ＣＣＤカメラと第２フィルター８とが、検出部２の上方に設置されている。ここで、第１ＣＣＤカメラ５は、少なくとも反射光強度を測定することができればよく、２次元撮像ができなくてもよく、フォトダイオードであってもよい。
【００３１】
レーザー発生装置３には、例えば、Ｈｅ−Ｎｅレーザーを使用することができる。また、回転ミラー４４は、ミラーの角度を変更することが可能であり、レーザー光Ｌの金薄膜２１への入射角θを、例えば、θ＝２８〜６２（度の範囲で変化させることができる。なお、図１において、レーザー光Ｌが通過するプリズム表面での光路の屈曲は省略している。
【００３２】
レーザー発生装置３から出力されるレーザー光Ｌは、偏光板４１によってＰ偏光され、絞り４２を通過し、シャッタ４３が開いている間、回転ミラー４４、レンズ４５及びプリズム１を介して検出部２の金薄膜２１に入射され、その反射光が、レンズ４５及びフィルター７を介して第１ＣＣＤカメラ５で測定される。また、検出層２４内の蛍光分子からの蛍光は、第２ＣＣＤカメラ６で測定される。
【００３３】
〔生体分子の検出方法の詳細な説明〕
次に、本生体分子の検出装置を用いた生体分子の検出方法を、具体例を挙げて説明するが本発明はこれに限定されない。
【００３４】
まず検出部２のバッファ空間２７に、ＰＢＳ（あるいはその他の緩衝液）溶液を注入する。
【００３５】
レーザー発生装置３から出力されるレーザー光Ｌを、回転ミラー４４のミラー表面の角度を固定し、上記のようにプリズム１を介して検出部２の金薄膜２１に入射させ、その反射光を第１ＣＣＤカメラ５で測定し、反射強度を記録する。周知のように、偏光板４１を介してＰ偏光されたレーザー光Ｌは、金薄膜２１中の電子振動とカップリングしてＳＰＲ現象を生じた場合、反射光の強度が減少する。この反射光の強度が最低値になるように回転ミラーの角度を調整する。（ここからプラズモン光が最大となる入射角となるようにミラー角度を変更しても構わない。）
バッファ空間２７中の検出層２４には予め抗体を固定しておき、これに対する抗原を含む溶液を流した後、蛍光分子と磁性粒子とを結合させた二次抗体を含む溶液を流す。
【００３６】
これによって、ＳＰＲによるプラズモン光によって、検出層２４内の蛍光分子が励起され、蛍光を発生するが、この時上部から磁石を近づけることによって、二次抗体によって捕捉された抗原とそれに結合した抗体が上部に伸長し、蛍光強度を強めることができる。
【００３７】
発生した蛍光を、検出部２の上方に位置する第２ＣＣＤカメラ６で測定、即ち２次元撮像する。得られた２次元画像における各画素の輝度が、検出層上の各場所での蛍光強度に対応する。
【００３８】
以上のように、第２ＣＣＤカメラ６による蛍光強度の測定によって、検出層２４に注入した溶液中の抗原を高感度、高精度に検出することができる。
【００３９】
なおこの測定において蛍光分子としては、レーザー光の波長等を考慮して適切な蛍光分子を使用すればよい。例えば、光源として波長６３２．８ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを使用する場合、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７等を使用することができる。
【００４０】
また、上記では、ＰＥＧを用いる場合を説明したが、これに限定されず、端部に蛍光分子及び抗体を結合させることができ、長さが数〜数十ｎｍの柔らかい鎖状の高分子材料であればよい。使用する抗体や蛍光分子に応じて適切な高分子材料を使用することができ、例えば、ポリグルタミン酸、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、あるいは２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等を使用することができる。
【００４１】
また、プリズム表面に形成される薄膜は、金薄膜に限定されず、その他の金属（銀等）や、金属酸化物（ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ａｇ２Ｏ等）の薄膜であってもよい。
【００４２】
また、上記では、流路を有する石英基板及びスペーサを備えた検出部を説明したが、これに限定されない。金薄膜表面上に被検体検出層が形成され、被検体の生体分子を保持することができる構造であればよい。
【００４３】
また、上記では１つの検出層を備える場合を説明したが、金薄膜上に、異なる抗体を含む複数の検出層をアレイ状に配列して検出部を形成してもよい。
【００４４】
また、上記においては、１種類の蛍光分子を用いる場合を説明したが、これに限定されず、複数種類の抗体と、抗体の種類毎に、蛍光波長の異なる蛍光分子を結合させて検出部を形成してもよい。この場合、ＳＰＲ測定及びＳＰＦＳ測定は、蛍光分子の種類に応じた波長の異なる複数のレーザー光あるいは各種フィルターを挿入したランプを用いて行う。
【００４５】
また、第一光検出手段はＣＣＤカメラに限定されず、所定の波長のレーザー光を測定可能なものであればよい。例えばフォトダイオード等を用いることができる。同様に第２光検出手段も、上記したＣＣＤカメラに限定されず、所定の波長の蛍光を測定可能なものであればよい。例えば光電子増倍管等を用いてもよい。
【００４６】
照射する光源としては直進性のある形で光線を取り出せる光源であればよく、半導体レーザーでもＬＥＤでもランプでも構わない。
【００４７】
照射光を走査する方法としては、回転ミラーに限定されず、光源そのものをステージコントローラー等で走査させてもかまわない。
【００４８】
プリズムの形状としては、９０度の三角プリズムに限定されず、６０度の三角プリズムや半円柱のプリズムを用いてもよい。
【実施例】
【００４９】
本発明を、具体例を挙げて説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００５０】
実施例１
（検出部の作製）
図２に示したように、プリズム１として、高屈折率の４５度直角プリズムであるＳＣＨＯＴＴ ＧＬＡＳＳ社製のＬａＳＦＮ９（屈折率ｎ＝１．８５）を用い、その底面にスパッター法により膜厚約４８ｎｍの金薄膜２１を形成し、流路２６ａ、２６ｂが形成された石英基板２５を、厚さ２ｍｍのシリコンゴムのスペーサ２３で挟んで金薄膜２１の上に設置した。これに、ポンプを用いて、ＰＢＳ緩衝液（りん酸緩衝液、ｐＨ＝７．２）を注入した。このときのセル容積はおよそ１６０μｌであった。
【００５１】
次にＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＭＷ５０００、ｎａｎｏｃｓ社）の０．５ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を調製し、このＰＢＳ緩衝液をポンプにより、石英基板２５を形成した段階の検出部に注入して１夜放置し、金薄膜２１の表面に自己組織化膜を形成させた。
【００５２】
（本発明の標識抗体溶液の調製）
磁性を持った粒子であるｎａｎｏｍａｇ−Ｄ−ｓｐｉｏ（登録商標、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、５０ｎｍ、５ｍｇ／ｍｌ、コアフロント株式会社製）を１００ｍｌと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが５０ｍＭ、ＷＳＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｉｄｅ、縮合剤）が１００ｍＭとなるように調製したＰＢＳ緩衝液を５ｍｌ加え、２０分攪拌した後に、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍｌ、日本医学臨床検査研究所販売）を４０μｌ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液を１０μｌ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ ＮＨＳ ｅｓｔｅｒを０．５ｍｇ混合したものを加え、２時間反応を行うことで、磁性粒子と蛍光色素が結合された本発明の標識抗体のＰＢＳ緩衝液を得た。
【００５３】
（比較の標識抗体溶液の調製）
抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍｌ、日本医学臨床検査研究所販売）を４０μｌ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液を１０μｌ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ ＮＨＳ ｅｓｔｅｒを０．５ｍｇ、ＰＢＳを５ｍｌ混合、２時間反応を行うことで、蛍光色素のみが結合された比較の標識抗体のＰＢＳ緩衝液を得た。
【００５４】
（本発明の標識抗体の検出）
実際の測定について説明する。なおレーザーは６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザーを用いた。
【００５５】
前述のとおりに検出部の作製を行った後に、第１ＣＣＤに照射される反射光強度が最小となるようにレーザー入射光角度を調整して、第２ＣＣＤを用いて上方から検出部のレーザー照射範囲中心部の０．２ｍｍ角を観察し、このときのＣＣＤのカウント値を０点として調整した。
【００５６】
その後、検出部にＮ−ヒドロキシスクシンイミドが２５ｍＭ、ＷＳＣが５０ｍＭとなるように調製したＰＢＳ緩衝液を注入し３０分作用させ、その後、本発明の標識抗体を含むＰＢＳ緩衝液を注入し、循環させながら標識抗体の固定化反応を行った。注入から１時間後に０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ緩衝液で１０分洗浄を行い、第２ＣＣＤから観察したときのカウント値を計測した。このときのカウント値は８０００ａｕ（任意単位）であった。なお第２ＣＣＤは５０００００ａｕまでは光強度とカウント値が正比例となることを事前に確認した。
【００５７】
次に、市販のネオジムマグネット２個を検出部の３ｃｍ上方にセッティングし（上方からの光検出を妨げないようにセルの両脇に固定した）、再び第２ＣＣＤのカウント値を確認したところ１３０００ａｕであり、すなわち観測されたシグナルが１．６倍となった。
【００５８】
（比較の標識抗体の検出）
本発明の標識抗体の代わりに比較の標識抗体溶液を用いた以外は上述の本発明の標識抗体の検出と同様の手法で計測を行った。
【００５９】
このときのカウント値は９０００ａｕ（任意単位）であった。
【００６０】
次に市販のネオジムマグネット２個を検出部の３ｃｍ上方にセッティングし（上方からの光検出を妨げないようにセルの両脇に固定した）、再び第２ＣＣＤのカウント値を確認したところ９０００ａｕであり、観測されたシグナルに変化はなかった。
【００６１】
実施例２
（検出部の作製）
図２に示したように、プリズム１として、高屈折率の４５度直角プリズムであるＳＣＨＯＴＴ ＧＬＡＳＳ社製のＬａＳＦＮ９（屈折率ｎ＝１．８５）を用い、その底面にスパッター法により膜厚約４８ｎｍの金薄膜２１を形成し、流路２６ａ、２６ｂが形成された石英基板２５を、厚さ２ｍｍのシリコンゴムのスペーサ２３で挟んで金薄膜２１の上に設置した。これに、ポンプを用いて、ＰＢＳ緩衝液（りん酸緩衝液、ｐＨ＝７．２）を注入した。このときのセル容積はおよそ１６０μＬ（マイクロリットル）であった。
【００６２】
次に、ＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＭＷ５０００、ｎａｎｏｃｓ社製）の０．５ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を調製し、このＰＢＳ緩衝液をポンプにより、石英基板２５を形成した段階の検出部に注入して１夜放置し、金薄膜２１の表面に自己組織化膜を形成させた。
【００６３】
これにＮ−ヒドロキシスクシンイミドが２５ｍＭ、ＷＳＣが５０ｍＭとなるように調製したＰＢＳ緩衝液を注入し３０分作用させ、その後抗ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２０μｇ／ｍｌ、日本医学臨床検査研究所販売）を含むＰＢＳ緩衝液を注入し１時間作用させ、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ緩衝液を注入して１時間作用させ、最後にＰＢＳ緩衝液を注入して検出部を作製した。
【００６４】
（標識二次抗体の調製）
ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ−ｓｐｉｏ（登録商標、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、５０ｎｍ、５ｍｇ／ｍｌ、コアフロント株式会社製）を１００ｍｌと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが５０ｍＭ、ＷＳＣが１００ｍＭとなるように調製したＰＢＳ緩衝液を５ｍｌ加え、２０分攪拌した後に、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（６Ｄ２、２．５ｍｇ／ｍｌ、日本医学臨床検査研究所販売）を４０μｌ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液を１０μｌ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ ＮＨＳ ｅｓｔｅｒを０．５ｍｇを混合したものを加え、３時間反応を行うことで、標識二次抗体ＰＢＳ緩衝液を得た。
【００６５】
（アッセイ）
実際の測定について説明する。なおレーザーは６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザーを用いた。
【００６６】
前述のとおりに検出部の作製を行った後に、第１ＣＣＤに照射される反射光強度が最小となるようにレーザー入射光角度を調整して、第２ＣＣＤを用いて上方から検出部のレーザー照射範囲中心部の０．２ｍｍ角を観察し、このときのＣＣＤのカウント値を０点として調整した。ＡＦＰのＰＢＳ緩衝液（１０ｎｇ／ｍｌ、５ｍｌ）を注入、３０分循環送液しながら反応させ、その後、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ緩衝液で１０分洗浄を行った。次に標識二次抗体ＰＢＳ緩衝液、５ｍｌを３０分間循環送液させ、再び０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ緩衝液で洗浄を行った。洗浄開始から２０分後の第２ＣＣＤから観察したときのカウント値を計測した。このときのカウント値は３８０００ａｕ（任意単位）であった。なお第２ＣＣＤは５０００００ａｕまでは光強度とカウント値が正比例となることを事前に確認した。
【００６７】
次に市販のネオジムマグネット２個を検出部の３ｃｍ上方にセッティングし（上方からの光検出を妨げないようにセルの両脇に固定した）、再び第２ＣＣＤのカウント値を確認したところ５３０００ａｕであり、すなわち観測されたシグナルが１．４倍となった。
【００６８】
また３８０００ａｕのカウント値を示した時点（洗浄開始から２０分後）から前後５分のカウント値の標準偏差は１０００ａｕであったが、マグネットをセッティングした後、５３０００ａｕのカウント値を示した時点から前後５分のカウント値の標準偏差は８００ａｕであり、０．８倍となった。本発明の検出法ではカウント値のばらつきが抑えられ、より精度のよい測定であるといえる。
【００６９】
実施例３
ＡＦＰを混合したＰＢＳ緩衝液の代わりに、ＡＦＰを混合していないＰＢＳ緩衝液を送液した他は実施例２と同一の条件でアッセイを行った。
【００７０】
標識二次抗体ＰＢＳ緩衝液を送液し、洗浄を行ってから２０分後の第２ＣＣＤのカウント値は５０００ａｕであった。その後、実施例１と同様にマグネットをセッティングしたところ、第２ＣＣＤのカウント値は３８００ａｕを示した。
【００７１】
以上のように、本発明を用いることで１つの生体分子当たりの蛍光強度が上がるうえ、そのばらつきも抑えることができ、また非特異吸着によるノイズも軽減することが可能となり、従来のＳＰＦＳ法に比べて高感度、高精度に生体分子の検出を行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の生体分子検出装置の概略構成を示すブロック図である。
【図２】本実施の生体分子検出装置で使用される検出部の構成の一例を示す断面図である。
【符号の説明】
【００７３】
１ プリズム
２ 被検体検出部
３ レーザー発生装置
４ 光制御部
５ 第１ＣＣＤカメラ
６ 第２ＣＣＤカメラ
７ 第１フィルター
８ 第２フィルター
２１ 金薄膜
２２ 固定具
２３ スペーサ
２４ 被検体検出層
２５ 石英基板
２６ａ、２６ｂ 流路
２７ バッファ空間
４１ 偏光板
４２ 絞り
４３ シャッタ
４４ 回転ミラー
４５ レンズ
４６ 外力発生装置（磁石）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴励起蛍光を用いた生体分子の検出方法、生体分子捕捉物質及び生体分子検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の相互作用を調べる方法、またそれによって特定の生体分子を検出する方法として、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、以下ＳＰＲとも記す）を使用した分光分析法が知られている。例えば、特許文献１には、表面プラズモン共鳴測定及び蛍光測定によって得られた信号を個別に分析することによって、被検体の固相への結合を判定する装置及びその方法が開示されている。
【０００３】
また、下記特許文献２、３、５には、表面プラズモン共鳴を用いた２次元イメージング装置が開示され、特許文献４には、表面プラズモン共鳴測定、及び発生した蛍光が生じる第２のプラズモン共鳴を用いた表面プラズモン蛍光顕微鏡が開示され、特許文献６にはプラズモン共鳴蛍光を用いた生体分子相互作用検出装置及び検出方法が開示されている。
【０００４】
これら表面プラズモン共鳴励起蛍光法では、金属基板上に担体や生体分子捕捉物質等を介して固定された蛍光物質に対し、表面プラズモン共鳴によって生じた増強励起光が照射され、発する蛍光を検出する。このとき蛍光物質と金属基板との距離が近いと、励起された蛍光物質から金属基板へとエネルギー移動が起こり、蛍光量子収率が大幅に減少してしまう。微量な生体分子を高感度に検出し、精度よく定量するためには、標識蛍光物質の基盤からの距離を制御することが必要である。
【０００５】
金属基板上に生体分子捕捉物質、例えば抗体分子を配列する場合、通常ポリマー層ＳＡＡＭ層を形成し、この上に抗体分子を結合するが、これらを配向性よく配列するのは困難であり、したがってこれに抗原抗体反応によって捕捉される標識蛍光物質の基板からの距離を制御するのも同様にして困難であった。
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】特開２００１−２５５２６７号公報
【特許文献３】特開２００２−１１６１４９号公報
【特許文献４】特開２００４−１５６９１１号公報
【特許文献５】特開２００４−２７１３３７号公報
【特許文献６】特開２００６−２０８０６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、表面プラズモン共鳴励起蛍光を利用した、高感度かつ高精度な生体分子の検出方法生体分子の検出方法、生体分子捕捉物質及び生体分子検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の構成によって達成される。
１．表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出する方法であって、外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合した生体分子捕捉物質を用いることを特徴とする生体分子の検出方法。
２．前記外力が磁力であることを特徴とする前記１に記載の生体分子の検出方法。
３．前記生体分子捕捉物質が抗体であることを特徴とする前記１または２に記載の生体分子の検出方法。
４．前記生体分子捕捉物質が蛍光標識されていることを特徴とする前記１〜３のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
５．表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出するのに用いられる生体分子捕捉物質が、外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合していることを特徴とする生体分子捕捉物質。
６．外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合した生体分子捕捉物質を用い、表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出する生体分子検出装置であって、プリズム、レーザー発生手段、レーザー光検出手段、蛍光検出手段及び外力発生手段を有することを特徴とする生体分子検出装置。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、表面プラズモン共鳴励起蛍光を利用した、高感度かつ高精度な生体分子の検出方法、生体分子捕捉物質及び生体分子検出装置を提供できた。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
〔生体分子の検出方法〕
本発明の生体分子の検出方法を詳細に説明する。
【００１０】
本発明では表面プラズモン共鳴励起蛍光法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下ＳＰＦＳとも記す）を利用して生体分子（以下、被検体とも記す）の検出を行う。
【００１１】
表面プラズモン共鳴励起蛍光法の一般的なプロトコルを以下に示す。この方法は、プリズム（Ａ）と、プリズム表面の金属薄膜及び被検体検出層を有する被検体検出手段（Ｂ）と、レーザー発生手段（Ｃ）と、第１及び第２光検出手段（Ｄ、Ｅ）とを備えた装置を用い、レーザー発生手段（Ｃ）から薄膜に入射されたレーザー光の反射強度を第１光検出手段（Ｄ）で検出し、レーザー発生手段（Ｃ）から薄膜に入射されたレーザー光によって薄膜裏面に生じるプラズモン光によって励起された蛍光分子が出力する蛍光を、第２光検出手段（Ｅ）で検出する、という手順で行われる。
【００１２】
次にプラズモン光の特性について以下に説明する。
【００１３】
プラズモン光は、レーザー光が金属薄膜に対し全反射条件で照射されたときに、第１光検出手段（Ｄ）によって検出される反射光の強度が減衰する入射角領域で薄膜裏面に発生し、その強度はレーザー光の入射角度に依存して変動する。反射光強度の減衰が最大となるときのレーザー光入射角度を第１の入射角度とすると、その近傍でプラズモン光の強度が最大となるが、厳密にはプラズモン光の強度が最大となるときのレーザー光の入射角度（第２の入射角度）は、第１の入射角度よりわずかに低角度となる。この理論値の算出にあたっては、文献：Ｔ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ，Ｗ．Ｋｎｏｌｌ，Ｓｕｒｆａｃｅ−ｐｌａｓｍｏｎ ｆｉｅｌｄ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｓｐｅｃｔｓ １７１（２０００）１１５−１３０やその引用文献等を参考にして算出することができる。また、プラズモン光は近接場光であり、その電場強度は金属薄膜からの距離が離れるほど減衰するという特性を有している。プラズモン光によって蛍光分子を励起するときは、この近接場光が届く範囲に蛍光分子が存在する必要がある。それに加え、蛍光分子が金属薄膜のごく近傍に位置する場合、金属薄膜へと励起エネルギーの遷移が起きてしまう。
【００１４】
従って、プラズモン光によって蛍光分子を効率的に励起するためには、蛍光分子の金属基板からの距離を制御する必要があることが分かる。
【００１５】
〔外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合している生体分子捕捉物質〕
表面プラズモン共鳴励起蛍光法によって生体分子（被検体とも表現する）を検出するためには、一般に生体分子を特異的に認識して吸着する物質（Ｆ）（生体分子捕捉物質あるいは被検体捕捉物質ともいう。例えば抗原に対する抗体等が挙げられる。）を利用する。生体分子捕捉物質（Ｆ）に蛍光分子を結合することで、蛍光を測定することによって被検体の検出が可能となる。
【００１６】
本発明では、生体分子捕捉物質（Ｆ）に、外力を受けることで配列を制御することが可能な物質（Ｇ）が結合されていることを特徴とする。
【００１７】
生体分子としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、糖鎖あるいはこれらの分解物等が挙げられる。生体分子捕捉物質とは、これらを特異的に認識し捕捉することのできる相補的なＤＮＡやＲＮＡ、抗体、レクチン、あるいはインプリントポリマー等が挙げられる。
【００１８】
生体分子を捕捉する方法としては、従来公知のアッセイに従えばよく、文献：バイオ検査薬の開発（株式会社シーエムシー出版）、バイオ診断薬の開発・評価と企業（株式会社シーエムシー出版）やその引用文献、イムノアッセイ講義（ＷＥＢ情報、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈｉｂａｙａｇｉ．ｃｏ．ｊｐ／ＩＡ−ＬＥＣＴＵＲＥ／Ｃｏｎｔｅｎｔｓ．ｈｔｍ）等が参考になる。本発明においてはイムノアッセイが好ましく、またサンドイッチ型のアッセイが好ましい。
【００１９】
例えば、検出層に用いるセンサー基板として金基板を選び、サンドイッチイムノアッセイを行う場合には、金基板にカルボキシル基やアミノ基等の反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有するアルカンチオールを作用させてＳＡＭ膜を形成し、これに適宜ポリマー等を介し、一次抗体を作用させ固定化する。また、１次抗体に対する反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を備えたポリマーを直接金基板上に固定化し、その上に１次抗体を固定化してもよい。各種反応性基を利用して抗体やポリマーを結合させる際には、スクシンイミジル化を経たアミド化縮合反応や、マレイミド化を経た付加反応等が一般的である。このようにして構成した検出層に抗原を含む溶液を流すことで、固定化した１次抗体によって抗原を捕捉することが可能である。これに対し、さらに標識した二次抗体を含む溶液を作用させることで捕捉された抗原を標識することができる。なお予め抗原と二次抗体とを反応させておいてから１次抗体を作用させてもよい。
【００２０】
本発明の外力とは、例えば磁力（磁気的引力、磁気的斥力）、クーロン力（電気的引力、電気的斥力）、浮力等の、装置がその物質に接触することなしに働きかけることのできる力であり、扱いやすさから磁力が好ましい。
【００２１】
外力を受けることで配列を制御することが可能な物質とは、例えば外力が磁力の時は磁性体（常磁性体、強磁性体、超常磁性体等）であり、具体的には酸化鉄・酸化クロム・コバルト・フェライト、ネオジム等を含む粒子型の磁性体や分子性磁性体等を用いることができる。また外力がクーロン力の場合には、多原子イオンやクラスターイオン等の電荷を持つ物質を用いることができる。外力として浮力を利用する場合には、溶媒よりも比重の軽い粒子、あるいは比重の軽い物質を封入した粒子等を用いることができる。
【００２２】
これに対し外力を与えるものが必要となるが、外力に磁力を用いる場合は、永久磁石や電磁石等が利用でき、外力にクーロン力を用いる場合には電極等が利用できる。
【００２３】
通常の蛍光法では基板平面に対して垂直方向から検出するので、磁石や電極を配置すると検出を阻害する場合があるが、例えば透明な磁石や電極を用いたり、検出窓を用意してその両側に磁石を配置したり、あるいは蛍光の検出を横方向から行うといった手段をとることにより解決することができる。
【００２４】
本発明において、外力を受けることで配列を制御することが可能な物質は、基板に固定する被検体捕捉物質や蛍光分子を結合する（あるいは結合した）被検体捕捉物質、被検体捕捉物質に結合された蛍光分子に、結合させて用いる。このとき蛍光分子自身が外力によって配列を制御することが可能な物質であっても構わない。
【００２５】
結合する場合は共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合等を利用して結合すればよく、適当な高分子材料や低分子材料を介して結合することができる。
【００２６】
外力によって蛍光分子の配列を制御する方法としては、例えば基板から、ＳＡＭ膜、コーティング層等を介し、被検体を捕捉する物質（被検体捕捉物質ともいう）を結合しておき、これに被検体を捕捉させ、その後、蛍光分子と外力によって配列を制御することが可能な物質を結合した被検体捕捉物質を加えて、基板に固定された被検体を捕捉する。通常のアッセイの場合、被検体を捕捉した鎖状の分子群は、さまざまな方向を向いていたり、折れ曲がっていたりするため、基板からの距離も分子群の鎖長に対してきわめて短かったり、ばらつきも大きい。本発明では被検体を捕捉した物質に結合された、外力を受けることで配列を制御することが可能な物質に対して、外力を加えてその位置を制御する。例えば検出層の上部に磁石を配置し、磁気的引力を利用することで、磁性体を上方向に持ち上げることができ、結合した被検体を捕捉した鎖状の分子群を引き伸ばすことが可能となり、結合された蛍光分子の基板からの距離を制御することができる。またこの時、吸着力の差異を利用して、ノイズの原因となる被検体を捕捉していない被検体捕捉物質のみをプラズモン光の届く範囲から遠ざけることもできる。
【００２７】
〔生体分子検出装置〕
以下、本発明の生体分子検出装置の構成例を示すが、本発明はこれに限定されない。
【００２８】
図１は、本発明の実施の形態に係る生体分子検出装置の概略構成を示すブロック図である。本実施の形態に係る生体分子検出装置は、プリズム１、プリズム１の上に形成された、検出対象の生体分子（以下、被検体と記す）を含む試料を保持する被検体検出部（以下、検出部と記す）２と、レーザー発生装置３と、レーザー発生装置３から出力されるレーザー光Ｌの光路上に配置された偏光板４１、絞り４２、シャッタ４３、回転ミラー４４及びレンズ４５で構成される光制御部４と光検出手段である第１及び第２ＣＣＤカメラ５、６と、第１及び第２フィルター７、８とを備えている。
【００２９】
図２は、プリズム１の上に形成される検出部２の構成の一例を示す断面図である。プリズム１には、高屈折率の４５度直角プリズムを用いることができる。検出部２は、プリズム１の表面にスパッター法あるいは蒸着法により３０〜６０ｎｍ（望ましくは４０〜６０ｎｍ、より望ましくは４３〜５３ｎｍ）の厚さに形成された金薄膜２１と、金薄膜２１表面上にスペーサ２３によって周囲を囲まれて形成された、抗原と反応させる抗体を含む被検体検出層（以下、検出層ともいう）２４と、石英基板２５と、これらを固定する固定具２２とを備えている。ここで、スペーサ２３、検出層２４及び石英基板２５によって、バッファ空間２７が形成されており、石英基板２５には貫通孔によって流路２６ａ、２６ｂが形成されている。流路２６ａ、２６ｂは、試料溶液をバッファ空間２７に注入するために使用され、例えば、試料溶液を、流路２６ａからチューブ（図示せず）を介してバッファ空間２７に注入し、流路２６ｂから別のチューブ（図示せず）を介してバッファ空間２７から排出させる。検出層２４には、抗体を結合させた高分子材料を用いることができる。抗体は高分子材料の一方の端部に結合されており、高分子材料の他方の端部は、直接若しくは間接に金薄膜２１表面に固定されている。高分子材料は複数種類が介在していてもよい。高分子材料としては例えばポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、以下ＰＥＧと記す）やＭＰＣポリマー等が挙げられる。これは用時に調製しても、予めこれらを結合させた基板を用いてもよい。
【００３０】
第１ＣＣＤカメラ５は、金薄膜による反射レーザー光を観測するためのものであり、第１フィルター７を介して反射レーザー光を受光可能な位置に配置されている。一方、第２ＣＣＤカメラ６は、検出層２４に含まれている蛍光分子からの蛍光を検出するためのものであり、観測波長に適した蛍光用高感度ＣＣＤカメラと第２フィルター８とが、検出部２の上方に設置されている。ここで、第１ＣＣＤカメラ５は、少なくとも反射光強度を測定することができればよく、２次元撮像ができなくてもよく、フォトダイオードであってもよい。
【００３１】
レーザー発生装置３には、例えば、Ｈｅ−Ｎｅレーザーを使用することができる。また、回転ミラー４４は、ミラーの角度を変更することが可能であり、レーザー光Ｌの金薄膜２１への入射角θを、例えば、θ＝２８〜６２（度の範囲で変化させることができる。なお、図１において、レーザー光Ｌが通過するプリズム表面での光路の屈曲は省略している。
【００３２】
レーザー発生装置３から出力されるレーザー光Ｌは、偏光板４１によってＰ偏光され、絞り４２を通過し、シャッタ４３が開いている間、回転ミラー４４、レンズ４５及びプリズム１を介して検出部２の金薄膜２１に入射され、その反射光が、レンズ４５及びフィルター７を介して第１ＣＣＤカメラ５で測定される。また、検出層２４内の蛍光分子からの蛍光は、第２ＣＣＤカメラ６で測定される。
【００３３】
〔生体分子の検出方法の詳細な説明〕
次に、本生体分子の検出装置を用いた生体分子の検出方法を、具体例を挙げて説明するが本発明はこれに限定されない。
【００３４】
まず検出部２のバッファ空間２７に、ＰＢＳ（あるいはその他の緩衝液）溶液を注入する。
【００３５】
レーザー発生装置３から出力されるレーザー光Ｌを、回転ミラー４４のミラー表面の角度を固定し、上記のようにプリズム１を介して検出部２の金薄膜２１に入射させ、その反射光を第１ＣＣＤカメラ５で測定し、反射強度を記録する。周知のように、偏光板４１を介してＰ偏光されたレーザー光Ｌは、金薄膜２１中の電子振動とカップリングしてＳＰＲ現象を生じた場合、反射光の強度が減少する。この反射光の強度が最低値になるように回転ミラーの角度を調整する。（ここからプラズモン光が最大となる入射角となるようにミラー角度を変更しても構わない。）
バッファ空間２７中の検出層２４には予め抗体を固定しておき、これに対する抗原を含む溶液を流した後、蛍光分子と磁性粒子とを結合させた二次抗体を含む溶液を流す。
【００３６】
これによって、ＳＰＲによるプラズモン光によって、検出層２４内の蛍光分子が励起され、蛍光を発生するが、この時上部から磁石を近づけることによって、二次抗体によって捕捉された抗原とそれに結合した抗体が上部に伸長し、蛍光強度を強めることができる。
【００３７】
発生した蛍光を、検出部２の上方に位置する第２ＣＣＤカメラ６で測定、即ち２次元撮像する。得られた２次元画像における各画素の輝度が、検出層上の各場所での蛍光強度に対応する。
【００３８】
以上のように、第２ＣＣＤカメラ６による蛍光強度の測定によって、検出層２４に注入した溶液中の抗原を高感度、高精度に検出することができる。
【００３９】
なおこの測定において蛍光分子としては、レーザー光の波長等を考慮して適切な蛍光分子を使用すればよい。例えば、光源として波長６３２．８ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを使用する場合、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７等を使用することができる。
【００４０】
また、上記では、ＰＥＧを用いる場合を説明したが、これに限定されず、端部に蛍光分子及び抗体を結合させることができ、長さが数〜数十ｎｍの柔らかい鎖状の高分子材料であればよい。使用する抗体や蛍光分子に応じて適切な高分子材料を使用することができ、例えば、ポリグルタミン酸、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、あるいは２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等を使用することができる。
【００４１】
また、プリズム表面に形成される薄膜は、金薄膜に限定されず、その他の金属（銀等）や、金属酸化物（ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ａｇ２Ｏ等）の薄膜であってもよい。
【００４２】
また、上記では、流路を有する石英基板及びスペーサを備えた検出部を説明したが、これに限定されない。金薄膜表面上に被検体検出層が形成され、被検体の生体分子を保持することができる構造であればよい。
【００４３】
また、上記では１つの検出層を備える場合を説明したが、金薄膜上に、異なる抗体を含む複数の検出層をアレイ状に配列して検出部を形成してもよい。
【００４４】
また、上記においては、１種類の蛍光分子を用いる場合を説明したが、これに限定されず、複数種類の抗体と、抗体の種類毎に、蛍光波長の異なる蛍光分子を結合させて検出部を形成してもよい。この場合、ＳＰＲ測定及びＳＰＦＳ測定は、蛍光分子の種類に応じた波長の異なる複数のレーザー光あるいは各種フィルターを挿入したランプを用いて行う。
【００４５】
また、第一光検出手段はＣＣＤカメラに限定されず、所定の波長のレーザー光を測定可能なものであればよい。例えばフォトダイオード等を用いることができる。同様に第２光検出手段も、上記したＣＣＤカメラに限定されず、所定の波長の蛍光を測定可能なものであればよい。例えば光電子増倍管等を用いてもよい。
【００４６】
照射する光源としては直進性のある形で光線を取り出せる光源であればよく、半導体レーザーでもＬＥＤでもランプでも構わない。
【００４７】
照射光を走査する方法としては、回転ミラーに限定されず、光源そのものをステージコントローラー等で走査させてもかまわない。
【００４８】
プリズムの形状としては、９０度の三角プリズムに限定されず、６０度の三角プリズムや半円柱のプリズムを用いてもよい。
【実施例】
【００４９】
本発明を、具体例を挙げて説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００５０】
実施例１
（検出部の作製）
図２に示したように、プリズム１として、高屈折率の４５度直角プリズムであるＳＣＨＯＴＴ ＧＬＡＳＳ社製のＬａＳＦＮ９（屈折率ｎ＝１．８５）を用い、その底面にスパッター法により膜厚約４８ｎｍの金薄膜２１を形成し、流路２６ａ、２６ｂが形成された石英基板２５を、厚さ２ｍｍのシリコンゴムのスペーサ２３で挟んで金薄膜２１の上に設置した。これに、ポンプを用いて、ＰＢＳ緩衝液（りん酸緩衝液、ｐＨ＝７．２）を注入した。このときのセル容積はおよそ１６０μｌであった。
【００５１】
次にＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＭＷ５０００、ｎａｎｏｃｓ社）の０．５ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を調製し、このＰＢＳ緩衝液をポンプにより、石英基板２５を形成した段階の検出部に注入して１夜放置し、金薄膜２１の表面に自己組織化膜を形成させた。
【００５２】
（本発明の標識抗体溶液の調製）
磁性を持った粒子であるｎａｎｏｍａｇ−Ｄ−ｓｐｉｏ（登録商標、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、５０ｎｍ、５ｍｇ／ｍｌ、コアフロント株式会社製）を１００ｍｌと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが５０ｍＭ、ＷＳＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｉｄｅ、縮合剤）が１００ｍＭとなるように調製したＰＢＳ緩衝液を５ｍｌ加え、２０分攪拌した後に、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍｌ、日本医学臨床検査研究所販売）を４０μｌ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液を１０μｌ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ ＮＨＳ ｅｓｔｅｒを０．５ｍｇ混合したものを加え、２時間反応を行うことで、磁性粒子と蛍光色素が結合された本発明の標識抗体のＰＢＳ緩衝液を得た。
【００５３】
（比較の標識抗体溶液の調製）
抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍｌ、日本医学臨床検査研究所販売）を４０μｌ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液を１０μｌ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ ＮＨＳ ｅｓｔｅｒを０．５ｍｇ、ＰＢＳを５ｍｌ混合、２時間反応を行うことで、蛍光色素のみが結合された比較の標識抗体のＰＢＳ緩衝液を得た。
【００５４】
（本発明の標識抗体の検出）
実際の測定について説明する。なおレーザーは６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザーを用いた。
【００５５】
前述のとおりに検出部の作製を行った後に、第１ＣＣＤに照射される反射光強度が最小となるようにレーザー入射光角度を調整して、第２ＣＣＤを用いて上方から検出部のレーザー照射範囲中心部の０．２ｍｍ角を観察し、このときのＣＣＤのカウント値を０点として調整した。
【００５６】
その後、検出部にＮ−ヒドロキシスクシンイミドが２５ｍＭ、ＷＳＣが５０ｍＭとなるように調製したＰＢＳ緩衝液を注入し３０分作用させ、その後、本発明の標識抗体を含むＰＢＳ緩衝液を注入し、循環させながら標識抗体の固定化反応を行った。注入から１時間後に０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ緩衝液で１０分洗浄を行い、第２ＣＣＤから観察したときのカウント値を計測した。このときのカウント値は８０００ａｕ（任意単位）であった。なお第２ＣＣＤは５０００００ａｕまでは光強度とカウント値が正比例となることを事前に確認した。
【００５７】
次に、市販のネオジムマグネット２個を検出部の３ｃｍ上方にセッティングし（上方からの光検出を妨げないようにセルの両脇に固定した）、再び第２ＣＣＤのカウント値を確認したところ１３０００ａｕであり、すなわち観測されたシグナルが１．６倍となった。
【００５８】
（比較の標識抗体の検出）
本発明の標識抗体の代わりに比較の標識抗体溶液を用いた以外は上述の本発明の標識抗体の検出と同様の手法で計測を行った。
【００５９】
このときのカウント値は９０００ａｕ（任意単位）であった。
【００６０】
次に市販のネオジムマグネット２個を検出部の３ｃｍ上方にセッティングし（上方からの光検出を妨げないようにセルの両脇に固定した）、再び第２ＣＣＤのカウント値を確認したところ９０００ａｕであり、観測されたシグナルに変化はなかった。
【００６１】
実施例２
（検出部の作製）
図２に示したように、プリズム１として、高屈折率の４５度直角プリズムであるＳＣＨＯＴＴ ＧＬＡＳＳ社製のＬａＳＦＮ９（屈折率ｎ＝１．８５）を用い、その底面にスパッター法により膜厚約４８ｎｍの金薄膜２１を形成し、流路２６ａ、２６ｂが形成された石英基板２５を、厚さ２ｍｍのシリコンゴムのスペーサ２３で挟んで金薄膜２１の上に設置した。これに、ポンプを用いて、ＰＢＳ緩衝液（りん酸緩衝液、ｐＨ＝７．２）を注入した。このときのセル容積はおよそ１６０μＬ（マイクロリットル）であった。
【００６２】
次に、ＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＭＷ５０００、ｎａｎｏｃｓ社製）の０．５ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を調製し、このＰＢＳ緩衝液をポンプにより、石英基板２５を形成した段階の検出部に注入して１夜放置し、金薄膜２１の表面に自己組織化膜を形成させた。
【００６３】
これにＮ−ヒドロキシスクシンイミドが２５ｍＭ、ＷＳＣが５０ｍＭとなるように調製したＰＢＳ緩衝液を注入し３０分作用させ、その後抗ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２０μｇ／ｍｌ、日本医学臨床検査研究所販売）を含むＰＢＳ緩衝液を注入し１時間作用させ、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ緩衝液を注入して１時間作用させ、最後にＰＢＳ緩衝液を注入して検出部を作製した。
【００６４】
（標識二次抗体の調製）
ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ−ｓｐｉｏ（登録商標、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、５０ｎｍ、５ｍｇ／ｍｌ、コアフロント株式会社製）を１００ｍｌと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが５０ｍＭ、ＷＳＣが１００ｍＭとなるように調製したＰＢＳ緩衝液を５ｍｌ加え、２０分攪拌した後に、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（６Ｄ２、２．５ｍｇ／ｍｌ、日本医学臨床検査研究所販売）を４０μｌ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液を１０μｌ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ ＮＨＳ ｅｓｔｅｒを０．５ｍｇを混合したものを加え、３時間反応を行うことで、標識二次抗体ＰＢＳ緩衝液を得た。
【００６５】
（アッセイ）
実際の測定について説明する。なおレーザーは６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザーを用いた。
【００６６】
前述のとおりに検出部の作製を行った後に、第１ＣＣＤに照射される反射光強度が最小となるようにレーザー入射光角度を調整して、第２ＣＣＤを用いて上方から検出部のレーザー照射範囲中心部の０．２ｍｍ角を観察し、このときのＣＣＤのカウント値を０点として調整した。ＡＦＰのＰＢＳ緩衝液（１０ｎｇ／ｍｌ、５ｍｌ）を注入、３０分循環送液しながら反応させ、その後、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ緩衝液で１０分洗浄を行った。次に標識二次抗体ＰＢＳ緩衝液、５ｍｌを３０分間循環送液させ、再び０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ緩衝液で洗浄を行った。洗浄開始から２０分後の第２ＣＣＤから観察したときのカウント値を計測した。このときのカウント値は３８０００ａｕ（任意単位）であった。なお第２ＣＣＤは５０００００ａｕまでは光強度とカウント値が正比例となることを事前に確認した。
【００６７】
次に市販のネオジムマグネット２個を検出部の３ｃｍ上方にセッティングし（上方からの光検出を妨げないようにセルの両脇に固定した）、再び第２ＣＣＤのカウント値を確認したところ５３０００ａｕであり、すなわち観測されたシグナルが１．４倍となった。
【００６８】
また３８０００ａｕのカウント値を示した時点（洗浄開始から２０分後）から前後５分のカウント値の標準偏差は１０００ａｕであったが、マグネットをセッティングした後、５３０００ａｕのカウント値を示した時点から前後５分のカウント値の標準偏差は８００ａｕであり、０．８倍となった。本発明の検出法ではカウント値のばらつきが抑えられ、より精度のよい測定であるといえる。
【００６９】
実施例３
ＡＦＰを混合したＰＢＳ緩衝液の代わりに、ＡＦＰを混合していないＰＢＳ緩衝液を送液した他は実施例２と同一の条件でアッセイを行った。
【００７０】
標識二次抗体ＰＢＳ緩衝液を送液し、洗浄を行ってから２０分後の第２ＣＣＤのカウント値は５０００ａｕであった。その後、実施例１と同様にマグネットをセッティングしたところ、第２ＣＣＤのカウント値は３８００ａｕを示した。
【００７１】
以上のように、本発明を用いることで１つの生体分子当たりの蛍光強度が上がるうえ、そのばらつきも抑えることができ、また非特異吸着によるノイズも軽減することが可能となり、従来のＳＰＦＳ法に比べて高感度、高精度に生体分子の検出を行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の生体分子検出装置の概略構成を示すブロック図である。
【図２】本実施の生体分子検出装置で使用される検出部の構成の一例を示す断面図である。
【符号の説明】
【００７３】
１ プリズム
２ 被検体検出部
３ レーザー発生装置
４ 光制御部
５ 第１ＣＣＤカメラ
６ 第２ＣＣＤカメラ
７ 第１フィルター
８ 第２フィルター
２１ 金薄膜
２２ 固定具
２３ スペーサ
２４ 被検体検出層
２５ 石英基板
２６ａ、２６ｂ 流路
２７ バッファ空間
４１ 偏光板
４２ 絞り
４３ シャッタ
４４ 回転ミラー
４５ レンズ
４６ 外力発生装置（磁石）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出する方法であって、外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合した生体分子捕捉物質を用いることを特徴とする生体分子の検出方法。
【請求項２】
前記外力が磁力であることを特徴とする請求項１に記載の生体分子の検出方法。
【請求項３】
前記生体分子捕捉物質が抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載の生体分子の検出方法。
【請求項４】
前記生体分子捕捉物質が蛍光標識されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
【請求項５】
表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出するのに用いられる生体分子捕捉物質が、外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合していることを特徴とする生体分子捕捉物質。
【請求項６】
外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合した生体分子捕捉物質を用い、表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出する生体分子検出装置であって、プリズム、レーザー発生手段、レーザー光検出手段、蛍光検出手段及び外力発生手段を有することを特徴とする生体分子検出装置。
【請求項１】
表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出する方法であって、外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合した生体分子捕捉物質を用いることを特徴とする生体分子の検出方法。
【請求項２】
前記外力が磁力であることを特徴とする請求項１に記載の生体分子の検出方法。
【請求項３】
前記生体分子捕捉物質が抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載の生体分子の検出方法。
【請求項４】
前記生体分子捕捉物質が蛍光標識されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
【請求項５】
表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出するのに用いられる生体分子捕捉物質が、外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合していることを特徴とする生体分子捕捉物質。
【請求項６】
外力を受けることにより配列を制御することが可能な物質を結合した生体分子捕捉物質を用い、表面プラズモン共鳴励起蛍光を検出することにより生体分子を検出する生体分子検出装置であって、プリズム、レーザー発生手段、レーザー光検出手段、蛍光検出手段及び外力発生手段を有することを特徴とする生体分子検出装置。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２５０９６０（Ｐ２００９−２５０９６０Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１０３４４２（Ｐ２００８−１０３４４２）
【出願日】平成２０年４月１１日（２００８．４．１１）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１１日（２００８．４．１１）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
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