生体分子を表面に固定したアパタイト被覆生体インプラント及び細胞培養担体
【課題】水酸アパタイトの表面に骨形成タンパク質などの塩基性タンパク質が固定された、人工関節、人工歯根などの生体インプラント及び細胞培養担体を提供する。
【解決手段】水酸アパタイトを主成分とするセラミックスから成る生体材料であって、当該セラミックス中の水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有し、ＨＡ（００４）面のＸＲＤの薄膜配向度解析による配向度が１３．５°以上の高い結晶配向を示し、かつ、当該面の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定したことを特徴とする生体材料。
【効果】人歯エナメル質に見られるような高い配向性を有しかつ、特に生体内で炎症を引き起こすとされる酸化カルシウムが皮膜の少なくとも表面近傍においてほとんど含まないような水酸アパタイト皮膜及び当該皮膜を有する生体インプラントならびに細胞培養担体を提供することができる。
【解決手段】水酸アパタイトを主成分とするセラミックスから成る生体材料であって、当該セラミックス中の水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有し、ＨＡ（００４）面のＸＲＤの薄膜配向度解析による配向度が１３．５°以上の高い結晶配向を示し、かつ、当該面の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定したことを特徴とする生体材料。
【効果】人歯エナメル質に見られるような高い配向性を有しかつ、特に生体内で炎症を引き起こすとされる酸化カルシウムが皮膜の少なくとも表面近傍においてほとんど含まないような水酸アパタイト皮膜及び当該皮膜を有する生体インプラントならびに細胞培養担体を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水酸アパタイト皮膜の表面に塩基性タンパク質を固定した生体材料に関するものであり、更に詳しくは、水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有し、配向度が１３．５°以上の高い結晶配向を有し、当該面の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定した生体材料に関するものである。本発明は、例えば、人工関節、人工歯根などの生体インプラント材及び細胞培養担体を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）の未分化間葉系細胞の骨芽細胞・軟骨芽細胞への分化促進と他の系統の細胞への分化抑制により、ＢＭＰを固定した担体などの周囲には、骨組織が誘導される。ＢＭＰの生体内における特定の物質の薬効を効果的に発現させるためには、本物質を局所に保持し、適度な速度で徐放するような担体が必須である。
【０００３】
一般には、人工関節や人工歯根の表面へコーティングされる水酸アパタイト（ＨＡ）の表面には、タンパク質が強く固定されないことが知られている。人工関節の表面に、ＢＭＰなどの塩基性タンパク質を固定する方法として、タンパク質を含むリン酸カルシウムの前駆体溶液からタンパク質を含有するリン酸カルシウム皮膜を析出させる方法が提案されている（特許文献１、２参照）。
【０００４】
しかしながら、これらの方法では、皮膜の形成に１〜７日程度必要であり、使用するタンパク質の量に対して、固定されるタンパク質の量が少ないため、ＢＭＰなどの高価なタンパク質を多量に使用しなければならないという問題がある。また、これらの方法では、形成されるタンパク質含有リン酸カルシウム皮膜の密着性が低いという問題がある。このように、従来、ＢＭＰなどの塩基性タンパク質をＨＡ材表面に吸着させるだけの簡便な固定法ならびにそのようにタンパク質を表面に固定したＨＡ材は、これまでに知られていない。
【０００５】
水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶は、主に、（１００）又は（０１０）面（ａ面）と（００１面）（ｃ面）が現われる。これらの面では、タンパク質などの分子の吸着に差があることが知られており（非特許文献１）、唾液などの体液への溶解性に差がある（非特許文献２）。生体では、このような水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶面の性質の差をうまく利用しており、例えば、人歯のエナメル質は、ＨＡ結晶が（００１）配向した構造を有し、唾液に対して不活性なｃ面が優先的に表面に現われている。
【０００６】
結晶配向性を任意に制御したＨＡ材料の作製が実現できれば、ＨＡ結晶の物性の異方性や、結晶面の性質を引き出すような新しい生体材料としての可能性が期待できると考えられる。従来、プラズマ溶射法を用いてｃ面配向ＨＡ皮膜を作製したことが報告されている（非特許文献３、４）。そして、塩基性タンパク質は、主にＨＡのｃ面に吸着することは知られていたが、高い結晶配向性を有するＨＯ−ＨＡＣにおいて、配向度が１３．５℃以上で塩基性タンパク質が選択的に固定されることは知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２１２０８号公報
【特許文献２】特開２００５−１１２８４８号公報
【非特許文献１】Ｔ．ｋａｗａｓａｋｉ，Ｊ．ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５５４，１４７（１９９１）
【非特許文献２】青木秀希、表面科学、１０．９６−１０４（１９８９）
【非特許文献３】Ｍ．Ｉｎａｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１４．９１９−２２（２００３）
【非特許文献４】Ｍ．Ｉｎａｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＭＡＴＥＲＩＡＬＳ，２８，２９２３−３１（２００７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような状況の中で、本発明は、上記従来技術に鑑みて、ＢＭＰなどの塩基性タンパク質をＨＡ表面に吸着させるだけの簡便な固定法及びそのようにタンパク質を表面に固定したＨＡ材を主成分とする生体材料を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、配向度が１３．５°以上の高い結晶配向を有する水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有するＨＡを用いることにより所期の目的を達成できることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。そして、本発明では、配向度が１３．５°以上、より好ましくは１８．０°以上の場合、塩基性タンパク質の選択的担持が生じることが確認された。
【０００９】
本発明は、上記の問題を解決するものであり、水酸アパタイトの表面に、骨形成タンパク質などの塩基性タンパク質が固定された、人工関節、人工歯根などの生体インプラント及び細胞培養担体を提供することを目的とするものである。また、本発明は、塩基性タンパク質を表面に固定した水酸アパタイト及び当該水酸アパタイトの皮膜を有する生体インプラントならびに細胞培養担体をより少量のタンパク質を用いて短時間に作製し、提供することを目的とするものである。
【００１０】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）水酸アパタイトを主成分とするセラミックスから成る生体材料であって、当該セラミックス中の水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有し、ＨＡ（００４）面のＸＲＤの薄膜配向度解析による配向度が少なくとも１３．５°の高い結晶配向を示し、かつ、当該面の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定したことを特徴とする生体材料。
（２）上記生体材料が、セラミックス又は金属から成る基材上に形成された水酸アパタイトを主成分とするアパタイト皮膜を有し、当該皮膜がラメラ状に堆積した粒子から成り、当該皮膜中の水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が基材に対して垂直方向に優先的に配向することで、（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有する、前記（１）に記載の生体材料。
（３）三リン酸カルシウムならびに基材に対して垂直方向に結晶のａ軸方向が優先的に配向した四リン酸カルシウムを含有する、前記（２）に記載の生体材料。
（４）前記（１）から（３）のいずれか１項に記載の生体材料を構成要素として有することを特徴とする細胞培養担体。
（５）厚さが５〜１０００μｍのアパタイト皮膜を有する、前記（４）に記載の細胞培養担体。
（６）前記（１）から（３）のいずれか１項に記載の生体材料を構成要素として有することを特徴とする生体インプラント材。
（７）チタン又はチタン合金から成る基材上にアパタイト皮膜を有し、当該皮膜内にチタン又はチタン合金とそれらの窒化物の混合物を含有する層が形成されていて皮膜の基材に対する密着性が高められている、前記（６）に記載の生体インプラント材。
（８）厚さが５〜１０００μｍのアパタイト皮膜を有する、前記（６）又は（７）に記載の生体インプラント材。
（９）生体インプラント材の表面の限定された範囲に凹凸が形成されている、前記（６）から（７）のいずれか１項に記載の生体インプラント材。
【００１１】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、水酸アパタイトを主成分とするセラミックスから成る生体材料であって、当該セラミックス中の水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有し、ＨＡ（００４）面のＸＲＤの薄膜配向度解析による配向度が少なくとも１３．５°の高い結晶配向を示し、かつ、当該面の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定したことを特徴とするものである。
【００１２】
本発明では、上記生体材料が、セラミックス又は金属から成る基材上に形成された水酸アパタイトを主成分とするアパタイト皮膜を有し、当該皮膜がラメラ状に堆積した粒子から成り、当該皮膜中の水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が基材に対して垂直方向に優先的に配向することで、（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有すること、三リン酸カルシウムならびに基材に対して垂直方向に結晶のａ軸方向が優先的に配向した四リン酸カルシウムを含有すること、を好ましい実施の態様としている。
【００１３】
また、本発明は、上記生体材料を構成要素として有する細胞培養担体の点、上記生体材料を構成要素として有する生体インプラント材の点、を特徴とするものである。また、本発明では、チタン又はチタン合金から成る基材上にアパタイト皮膜を有し、当該皮膜内にチタン又はチタン合金とそれらの窒化物の混合物を含有する層が形成されていて皮膜の基材に対する密着性が高められていること、生体インプラント材の表面の限定された範囲に凹凸が形成されていること、を好ましい実施の態様としている。
【００１４】
本発明は、水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が表面に対して垂直方向に優先的に配向し、かつ、水酸アパタイトの少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を固定した点に最大の特徴を有する水酸アパタイト及び当該水酸アパタイト皮膜を有する生体インプラント材ならびに細胞培養担体である。本発明では、当該塩基性タンパク質を固定した水酸アパタイトをセラミックス、ポリマー又は金属から成る基材上に被覆して利用することが適宜可能である。
【００１５】
本発明では、水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が表面に対して垂直方向に優先的に配向し、かつ、水酸アパタイト皮膜の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を固定した水酸アパタイト又はその被覆物をセラミックス、ポリマー又は金属から成る基材に被覆して生体インプラントを製造する。本発明で云うセラミックス、ポリマー又は金属からなる基材は、使用目的に必要な特性を有するものであれば、セラミックス又は金属の組成、形状ならびに使用形態などは、特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明で云う生体インプラント材とは、少なくとも表面近傍に水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が表面に対して垂直方向に優先的に配向し、かつ、水酸アパタイト皮膜の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を固定した被覆組成物が形成された、生体内で使用するための成形体を意味する。生体インプラント材は、生体内で使用するために必要な特性と安全性を有するものであれば、形状ならびに使用形態などは、特に限定されるものではない。
【００１７】
本発明の生体インプラント材は、例えば、形状としては、柱状、板状、シート状、ブロック状、ワイヤ状、繊維状、粉末状など任意の形状のものが使用できる。また、使用形態としては、人工股関節用ステム、人工ひざ関節、人工椎体、人工椎間板、骨補填材、骨プレート、骨スクリュー、人工歯根などの製品形態を適宜採用することが可能である。
【００１８】
本発明で云う細胞培養担体とは、表面近傍に水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が表面に対して垂直方向に優先的に配向し、かつ、水酸アパタイト皮膜の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を固定した被覆組成物が形成された細胞を培養するための成形体を意味する。細胞を培養に使用するために必要な特性を有するものであれば、形状ならびに使用形態などは特に限定されるものではない。
【００１９】
本発明の細胞培養担体は、例えば、形状としては、板状、シート状、ブロック状、柱状、ワイヤ状、繊維状、粉末状など、任意の形状のものが使用できる。また、使用形態としては、細胞培養用シャーレ、細胞培養用シートなどの製品形態を適宜採用することが可能である。
【００２０】
本発明の生体材料の作製方法としては、具体的には、例えば、平均粒径が８０μｍの水酸アパタイト粉末を熱プラズマに導入し、プラズマ直下の基材上に堆積して、被覆組成物を形成した後に、熱処理したものを、塩基性タンパク質の溶液に浸漬する方法が好適なものとして例示される。しかし、本発明は、これらの方法に制限されるものではなく、上記プラズマガスの組成、粉体の種類及び粒径又は基材の種類は、目的製品に応じて適宜選択、設計及び変化させることが可能であり、適宜の方法で実施することが可能である。
【００２１】
本発明で云う水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が表面に対して垂直方向に優先的に配向したとは、水酸アパタイト成形物の形成する表面の凹凸において、１０００μｍ以下のものを無視した平均的な表面の法線方向に水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向配向していることを意味する。本発明で云う配向度とは、ブラッグの条件にあるＨＡ（００４）面の格子面の法線に対する試料表面の法線の角度ψに対して回折強度をプロットし、ψ＝０のときの積分強度に対して積分強度が５０％となるψの角度を意味する。
【００２２】
従来、人工関節の表面に、ＢＭＰなどの塩基性タンパク質を固定する方法として、例えば、タンパク質を含むリン酸カルシウムの前駆体溶液からタンパク質を含有するリン酸カルシウム皮膜を析出させる方法が提案されていたが、この種の方法では、皮膜の形成に１〜７日程度必要であり、また、使用するタンパク質の量に対して、固定されるタンパク質の量が少ないため、ＢＭＰなどの高価なタンパク質を多量に使用しなければならないこと、また、形成されるタンパク質含有カルシウム皮膜の密着性が低いこと、などの問題点があった。
【００２３】
これに対して、本発明では、水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有し、かつ配向度が１３．５°以上、好ましくは１８．０°以上の結晶配向をするＨＡ面を使用すること、及び当該面の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定すること、により、短時間に、多量のタンパク質を使用することなく、しかも、基材に対して高い密着性を有するアパタイト皮膜−タンパク質複合体を有する生体材料を提供することを可能としたものである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）ＢＭＰなどの塩基性タンパク質をＨＡ材料表面に選択的に吸着、固定した生体材料を提供することができる。
（２）塩基性タンパク質をＨＡ材料表面に選択的に固定させる簡便な固定手法を提供することができる。
（３）特定の塩基性タンパク質を表面近傍に選択的に固定した細胞培養担体及び生体インプラント材を提供することができる。
（４）チタン又はチタン合金から成る基材上にアパタイト皮膜を有し、当該皮膜の基材に対する密着性が高められている生体インプラント材を提供することができる。
（５）表面に固定した骨形成タンパク質や新生血管の形成を促進する繊維芽細胞成長因子等により骨組織や血管の形成能を高めたインプラント材を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
プラズマ溶射法を用いて、ｃ面配向ＨＡ皮膜を作製した。溶射条件により配向性の高いＨＡ皮膜（ＨＯ−ＨＡＣ）と配向性の低いＨＡ皮膜（ＬＯ−ＨＡＣ）を作製した。リファレンスとして、焼結体ＨＡ（Ｓ−ＨＡ）（１２００℃、２ｈ焼結）を作製した。それぞれの試料の結晶配向度をＨＡの（００４）の回折ピークを用いて、ＸＲＤの薄膜配向度解析により評価した。ブラッグの条件にある特定の格子面の法線に対する試料表面の法線の角度ψに対して回折強度をプロットした。
【００２７】
図１に、ψ−回折強度曲線を示す。試料のψ＝０のときの積分強度に対して、積分強度が５０％となるψの角度を配向度（ＯＤ）とした。ＨＯ−ＨＡＣでは、配向度の異なるＯＤ＝１３．５°と１８．０°の皮膜が得られた。上記Ｓ−ＨＡ、ＬＯ−ＨＡＣ、ＨＯ−ＨＡＣ（ＯＤ＝１３．５°）及びＨＯ−ＨＡＣ（ＯＤ＝１８．０°）を試料として用いた。
【実施例２】
【００２８】
本実施例では、上記試料に吸着させる塩基性タンパク質としてラクトフェリンを用いた。ＦＩＴＣラベルしたラクトフェリン（ＦＩＴＣ−ＬＡＣ）を２２μｇ／１００μｌでリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶かした溶液を、各試料表面に室温で３０分吸着させた。これをＮａＣｌ濃度を１５４、２５０、５００、１０００ｍＭとしたリン酸バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、得られた像から蛍光強度を測定した。
【００２９】
図２に、タンパク質を吸着した試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示す。いずれの場合においても、コントロールのＳ−ＨＡでは、蛍光強度が低く、タンパク質の吸着量が低かった。
【００３０】
等電点が８．５の塩基性タンパク質であるラクトフェリンの場合は、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣに較べ、配向性の高いＨＯ−ＨＡＣの蛍光強度は、ＮａＣｌ濃度を１０００ｍＭとして洗浄した場合には７５％以上高く、配向性の高いＨＡ皮膜の方がタンパク質の保持量が高いことが分かった。配向性の高いＨＯ−ＨＡＣにおいて、より配向性の高いＯＤ＝１３．５°の方が蛍光強度が強く、タンパク質を約６５％多く吸着した。
【実施例３】
【００３１】
本実施例では、上記試料に吸着させる塩基性タンパク質としてシトクロムＣを用いた。ＦＩＴＣラベルしたシトクロムＣ（ＦＩＴＣ−ＣＣＣ）を２２μｇ／１００μｌでリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶かした溶液を、各試料表面に室温で３０分吸着させた。ＮａＣｌ濃度を１５４、２５０、５００、１０００ｍＭとしたリン酸バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、得られた像から蛍光強度を測定した。
【００３２】
図３に、タンパク質を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示す。いずれの場合においても、コントロールのＳ−ＨＡでは、蛍光強度が低く、タンパク質の吸着量が低かった。
【００３３】
等電点が約１０．９の塩基性タンパク質であるシトクロムＣの場合は、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣに較べ、配向性の高いＨＯ−ＨＡＣ（ＯＤ＝１３．５°）の蛍光強度は、ＮａＣｌ濃度を１０００ｍＭとして洗浄した場合には８３％程度高く、配向性の高いＨＡ皮膜の方がタンパク質の保持量が高いことが分かった。配向性の高いＨＯ−ＨＡＣにおいて、配向度が１８°程度の場合は、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣに較べ、顕著な差がなく、より塩基性の高いタンパク質の場合は、配向度の影響が強く発現した。
【実施例４】
【００３４】
本実施例では、上記試料に吸着させる塩基性タンパク質としてリゾチームを用いた。ＦＩＴＣラベルしたリゾチーム（ＦＩＴＣ−Ｌｙｚ）を２２μｇ／１００μｌでリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶かした溶液を、各試料表面に室温で３０分吸着させた。ＮａＣｌ濃度を１５４、２５０、５００、１０００ｍＭとしたリン酸バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、得られた像から蛍光強度を測定した。
【００３５】
図４に、タンパク質を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示す。いずれの場合においても、コントロールのＳ−ＨＡでは、蛍光強度が低く、タンパク質の吸着量が低かった。
【００３６】
等電点が約１１．２の塩基性タンパク質であるリゾチームの場合は、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣに較べ、配向性の高いＨＯ−ＨＡＣ（ＯＤ＝１３．５°）の蛍光強度は、ＮａＣｌ濃度を１０００ｍＭとして洗浄した場合には２．２倍程度高く、配向性の高いＨＡ皮膜の方がタンパク質の保持量が高いことが分かった。配向性の高いＨＯ−ＨＡＣにおいて、配向度が１８°程度の場合は、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣに較べ、顕著な差がなく、より塩基性の高いタンパク質の場合は、配向度の影響が強く発現した。
【００３７】
比較例１
ＦＩＴＣラベルした牛血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）を２２μｇ／１００μｌでリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶かした溶液を、各試料表面に室温で３０分吸着させた。ＮａＣｌ濃度を１５４、２５０、５００、１０００ｍＭとしたリン酸バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、得られた像から蛍光強度を測定した。
【００３８】
図５に、タンパク質を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示す。いずれの場合においても、コントロールのＳ−ＨＡでは、蛍光強度が低く、タンパク質の吸着量が低かった。
【００３９】
等電点が約４．５の酸性タンパク質であるアルブミンの場合は、配向性の高いＨＯ−ＨＡＣに較べ、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣの蛍光強度は、ＮａＣｌ濃度を１０００ｍＭとして洗浄した場合には３２％程度高く、配向性の低いＨＡ皮膜の方がタンパク質の保持量が高いことが分かった。配向性の高いＨＯ−ＨＡＣにおいて、配向度の差による蛍光強度の差は殆どなく、タンパク質の吸着量に差は見られなかった。
【００４０】
比較例２
ＦＩＴＣラベルした免疫グロブリンＧ（ＦＩＴＣ−ＩｇＧ）を２２μｇ／１００μｌでリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶かした溶液を、各試料表面に室温で３０分吸着させた。ＮａＣｌ濃度を１５４、２５０、５００、１０００ｍＭとしたリン酸バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、得られた像から蛍光強度を測定した。
【００４１】
図６に、各タンパク質を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示す。いずれの場合においても、コントロールのＳ−ＨＡでは、蛍光強度が低く、タンパク質の吸着量が低かった。
【００４２】
等電点が６．６の中性タンパク質である免疫グロブリンＧの場合は、配向性の高いＨＯ−ＨＡＣに較べ、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣの蛍光強度は、ＮａＣｌ濃度を１０００ｍＭとして洗浄した場合には５５％程度高く、配向性の低いＨＡ皮膜の方がタンパク質の保持量が高いことが分かった。配向性の高いＨＯ−ＨＡＣにおいて、配向度の差による蛍光強度の差は殆どなく、タンパク質の吸着量に差は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
以上詳述したように、本発明は、生体分子を表面に固定したアパタイト被覆生体インプラント及び細胞培養担体に係るものであり、本発明により、表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定した生体材料を提供することができる。本発明によれば、水酸アパタイト皮膜の表面に塩基性タンパク質を固定した生体インプラント材ならびに細胞培養担体を、タンパク質溶液に浸してタンパク質を吸着させるだけの簡便な方法で作製し、提供することができる。本発明は、ＢＭＰなどの塩基性タンパク質を表面に選択的に固定した人工関節、人工歯根などの生体インプラント材及び細胞培養担体を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】第１図は、実施例１のψ−回折強度曲線を示すものである。
【図２】第２図は、実施例２のＦＩＴＣラベルしたラクトフェリン（ＦＩＴＣ−ＬＡＣ）を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示すものである。
【図３】第３図は、実施例３のＦＩＴＣラベルしたシトクロムＣ（ＦＩＴＣ−ＣＣＣ）を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示すものである。
【図４】第４図は、実施例４のＦＩＴＣラベルしたリゾチーム（ＦＩＴＣ−Ｌｙｚ）を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示すものである。
【図５】第５図は、比較例１のＦＩＴＣラベルした牛血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示すものである。
【図６】第６図は、比較例２のＦＩＴＣラベル免疫グロブリンＧ（ＦＩＴＣ−ＩｇＧ）を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示すものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水酸アパタイト皮膜の表面に塩基性タンパク質を固定した生体材料に関するものであり、更に詳しくは、水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有し、配向度が１３．５°以上の高い結晶配向を有し、当該面の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定した生体材料に関するものである。本発明は、例えば、人工関節、人工歯根などの生体インプラント材及び細胞培養担体を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）の未分化間葉系細胞の骨芽細胞・軟骨芽細胞への分化促進と他の系統の細胞への分化抑制により、ＢＭＰを固定した担体などの周囲には、骨組織が誘導される。ＢＭＰの生体内における特定の物質の薬効を効果的に発現させるためには、本物質を局所に保持し、適度な速度で徐放するような担体が必須である。
【０００３】
一般には、人工関節や人工歯根の表面へコーティングされる水酸アパタイト（ＨＡ）の表面には、タンパク質が強く固定されないことが知られている。人工関節の表面に、ＢＭＰなどの塩基性タンパク質を固定する方法として、タンパク質を含むリン酸カルシウムの前駆体溶液からタンパク質を含有するリン酸カルシウム皮膜を析出させる方法が提案されている（特許文献１、２参照）。
【０００４】
しかしながら、これらの方法では、皮膜の形成に１〜７日程度必要であり、使用するタンパク質の量に対して、固定されるタンパク質の量が少ないため、ＢＭＰなどの高価なタンパク質を多量に使用しなければならないという問題がある。また、これらの方法では、形成されるタンパク質含有リン酸カルシウム皮膜の密着性が低いという問題がある。このように、従来、ＢＭＰなどの塩基性タンパク質をＨＡ材表面に吸着させるだけの簡便な固定法ならびにそのようにタンパク質を表面に固定したＨＡ材は、これまでに知られていない。
【０００５】
水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶は、主に、（１００）又は（０１０）面（ａ面）と（００１面）（ｃ面）が現われる。これらの面では、タンパク質などの分子の吸着に差があることが知られており（非特許文献１）、唾液などの体液への溶解性に差がある（非特許文献２）。生体では、このような水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶面の性質の差をうまく利用しており、例えば、人歯のエナメル質は、ＨＡ結晶が（００１）配向した構造を有し、唾液に対して不活性なｃ面が優先的に表面に現われている。
【０００６】
結晶配向性を任意に制御したＨＡ材料の作製が実現できれば、ＨＡ結晶の物性の異方性や、結晶面の性質を引き出すような新しい生体材料としての可能性が期待できると考えられる。従来、プラズマ溶射法を用いてｃ面配向ＨＡ皮膜を作製したことが報告されている（非特許文献３、４）。そして、塩基性タンパク質は、主にＨＡのｃ面に吸着することは知られていたが、高い結晶配向性を有するＨＯ−ＨＡＣにおいて、配向度が１３．５℃以上で塩基性タンパク質が選択的に固定されることは知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２１２０８号公報
【特許文献２】特開２００５−１１２８４８号公報
【非特許文献１】Ｔ．ｋａｗａｓａｋｉ，Ｊ．ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５５４，１４７（１９９１）
【非特許文献２】青木秀希、表面科学、１０．９６−１０４（１９８９）
【非特許文献３】Ｍ．Ｉｎａｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１４．９１９−２２（２００３）
【非特許文献４】Ｍ．Ｉｎａｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＭＡＴＥＲＩＡＬＳ，２８，２９２３−３１（２００７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような状況の中で、本発明は、上記従来技術に鑑みて、ＢＭＰなどの塩基性タンパク質をＨＡ表面に吸着させるだけの簡便な固定法及びそのようにタンパク質を表面に固定したＨＡ材を主成分とする生体材料を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、配向度が１３．５°以上の高い結晶配向を有する水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有するＨＡを用いることにより所期の目的を達成できることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。そして、本発明では、配向度が１３．５°以上、より好ましくは１８．０°以上の場合、塩基性タンパク質の選択的担持が生じることが確認された。
【０００９】
本発明は、上記の問題を解決するものであり、水酸アパタイトの表面に、骨形成タンパク質などの塩基性タンパク質が固定された、人工関節、人工歯根などの生体インプラント及び細胞培養担体を提供することを目的とするものである。また、本発明は、塩基性タンパク質を表面に固定した水酸アパタイト及び当該水酸アパタイトの皮膜を有する生体インプラントならびに細胞培養担体をより少量のタンパク質を用いて短時間に作製し、提供することを目的とするものである。
【００１０】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）水酸アパタイトを主成分とするセラミックスから成る生体材料であって、当該セラミックス中の水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有し、ＨＡ（００４）面のＸＲＤの薄膜配向度解析による配向度が少なくとも１３．５°の高い結晶配向を示し、かつ、当該面の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定したことを特徴とする生体材料。
（２）上記生体材料が、セラミックス又は金属から成る基材上に形成された水酸アパタイトを主成分とするアパタイト皮膜を有し、当該皮膜がラメラ状に堆積した粒子から成り、当該皮膜中の水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が基材に対して垂直方向に優先的に配向することで、（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有する、前記（１）に記載の生体材料。
（３）三リン酸カルシウムならびに基材に対して垂直方向に結晶のａ軸方向が優先的に配向した四リン酸カルシウムを含有する、前記（２）に記載の生体材料。
（４）前記（１）から（３）のいずれか１項に記載の生体材料を構成要素として有することを特徴とする細胞培養担体。
（５）厚さが５〜１０００μｍのアパタイト皮膜を有する、前記（４）に記載の細胞培養担体。
（６）前記（１）から（３）のいずれか１項に記載の生体材料を構成要素として有することを特徴とする生体インプラント材。
（７）チタン又はチタン合金から成る基材上にアパタイト皮膜を有し、当該皮膜内にチタン又はチタン合金とそれらの窒化物の混合物を含有する層が形成されていて皮膜の基材に対する密着性が高められている、前記（６）に記載の生体インプラント材。
（８）厚さが５〜１０００μｍのアパタイト皮膜を有する、前記（６）又は（７）に記載の生体インプラント材。
（９）生体インプラント材の表面の限定された範囲に凹凸が形成されている、前記（６）から（７）のいずれか１項に記載の生体インプラント材。
【００１１】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、水酸アパタイトを主成分とするセラミックスから成る生体材料であって、当該セラミックス中の水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有し、ＨＡ（００４）面のＸＲＤの薄膜配向度解析による配向度が少なくとも１３．５°の高い結晶配向を示し、かつ、当該面の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定したことを特徴とするものである。
【００１２】
本発明では、上記生体材料が、セラミックス又は金属から成る基材上に形成された水酸アパタイトを主成分とするアパタイト皮膜を有し、当該皮膜がラメラ状に堆積した粒子から成り、当該皮膜中の水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が基材に対して垂直方向に優先的に配向することで、（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有すること、三リン酸カルシウムならびに基材に対して垂直方向に結晶のａ軸方向が優先的に配向した四リン酸カルシウムを含有すること、を好ましい実施の態様としている。
【００１３】
また、本発明は、上記生体材料を構成要素として有する細胞培養担体の点、上記生体材料を構成要素として有する生体インプラント材の点、を特徴とするものである。また、本発明では、チタン又はチタン合金から成る基材上にアパタイト皮膜を有し、当該皮膜内にチタン又はチタン合金とそれらの窒化物の混合物を含有する層が形成されていて皮膜の基材に対する密着性が高められていること、生体インプラント材の表面の限定された範囲に凹凸が形成されていること、を好ましい実施の態様としている。
【００１４】
本発明は、水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が表面に対して垂直方向に優先的に配向し、かつ、水酸アパタイトの少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を固定した点に最大の特徴を有する水酸アパタイト及び当該水酸アパタイト皮膜を有する生体インプラント材ならびに細胞培養担体である。本発明では、当該塩基性タンパク質を固定した水酸アパタイトをセラミックス、ポリマー又は金属から成る基材上に被覆して利用することが適宜可能である。
【００１５】
本発明では、水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が表面に対して垂直方向に優先的に配向し、かつ、水酸アパタイト皮膜の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を固定した水酸アパタイト又はその被覆物をセラミックス、ポリマー又は金属から成る基材に被覆して生体インプラントを製造する。本発明で云うセラミックス、ポリマー又は金属からなる基材は、使用目的に必要な特性を有するものであれば、セラミックス又は金属の組成、形状ならびに使用形態などは、特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明で云う生体インプラント材とは、少なくとも表面近傍に水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が表面に対して垂直方向に優先的に配向し、かつ、水酸アパタイト皮膜の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を固定した被覆組成物が形成された、生体内で使用するための成形体を意味する。生体インプラント材は、生体内で使用するために必要な特性と安全性を有するものであれば、形状ならびに使用形態などは、特に限定されるものではない。
【００１７】
本発明の生体インプラント材は、例えば、形状としては、柱状、板状、シート状、ブロック状、ワイヤ状、繊維状、粉末状など任意の形状のものが使用できる。また、使用形態としては、人工股関節用ステム、人工ひざ関節、人工椎体、人工椎間板、骨補填材、骨プレート、骨スクリュー、人工歯根などの製品形態を適宜採用することが可能である。
【００１８】
本発明で云う細胞培養担体とは、表面近傍に水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が表面に対して垂直方向に優先的に配向し、かつ、水酸アパタイト皮膜の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を固定した被覆組成物が形成された細胞を培養するための成形体を意味する。細胞を培養に使用するために必要な特性を有するものであれば、形状ならびに使用形態などは特に限定されるものではない。
【００１９】
本発明の細胞培養担体は、例えば、形状としては、板状、シート状、ブロック状、柱状、ワイヤ状、繊維状、粉末状など、任意の形状のものが使用できる。また、使用形態としては、細胞培養用シャーレ、細胞培養用シートなどの製品形態を適宜採用することが可能である。
【００２０】
本発明の生体材料の作製方法としては、具体的には、例えば、平均粒径が８０μｍの水酸アパタイト粉末を熱プラズマに導入し、プラズマ直下の基材上に堆積して、被覆組成物を形成した後に、熱処理したものを、塩基性タンパク質の溶液に浸漬する方法が好適なものとして例示される。しかし、本発明は、これらの方法に制限されるものではなく、上記プラズマガスの組成、粉体の種類及び粒径又は基材の種類は、目的製品に応じて適宜選択、設計及び変化させることが可能であり、適宜の方法で実施することが可能である。
【００２１】
本発明で云う水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が表面に対して垂直方向に優先的に配向したとは、水酸アパタイト成形物の形成する表面の凹凸において、１０００μｍ以下のものを無視した平均的な表面の法線方向に水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向配向していることを意味する。本発明で云う配向度とは、ブラッグの条件にあるＨＡ（００４）面の格子面の法線に対する試料表面の法線の角度ψに対して回折強度をプロットし、ψ＝０のときの積分強度に対して積分強度が５０％となるψの角度を意味する。
【００２２】
従来、人工関節の表面に、ＢＭＰなどの塩基性タンパク質を固定する方法として、例えば、タンパク質を含むリン酸カルシウムの前駆体溶液からタンパク質を含有するリン酸カルシウム皮膜を析出させる方法が提案されていたが、この種の方法では、皮膜の形成に１〜７日程度必要であり、また、使用するタンパク質の量に対して、固定されるタンパク質の量が少ないため、ＢＭＰなどの高価なタンパク質を多量に使用しなければならないこと、また、形成されるタンパク質含有カルシウム皮膜の密着性が低いこと、などの問題点があった。
【００２３】
これに対して、本発明では、水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有し、かつ配向度が１３．５°以上、好ましくは１８．０°以上の結晶配向をするＨＡ面を使用すること、及び当該面の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定すること、により、短時間に、多量のタンパク質を使用することなく、しかも、基材に対して高い密着性を有するアパタイト皮膜−タンパク質複合体を有する生体材料を提供することを可能としたものである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）ＢＭＰなどの塩基性タンパク質をＨＡ材料表面に選択的に吸着、固定した生体材料を提供することができる。
（２）塩基性タンパク質をＨＡ材料表面に選択的に固定させる簡便な固定手法を提供することができる。
（３）特定の塩基性タンパク質を表面近傍に選択的に固定した細胞培養担体及び生体インプラント材を提供することができる。
（４）チタン又はチタン合金から成る基材上にアパタイト皮膜を有し、当該皮膜の基材に対する密着性が高められている生体インプラント材を提供することができる。
（５）表面に固定した骨形成タンパク質や新生血管の形成を促進する繊維芽細胞成長因子等により骨組織や血管の形成能を高めたインプラント材を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
プラズマ溶射法を用いて、ｃ面配向ＨＡ皮膜を作製した。溶射条件により配向性の高いＨＡ皮膜（ＨＯ−ＨＡＣ）と配向性の低いＨＡ皮膜（ＬＯ−ＨＡＣ）を作製した。リファレンスとして、焼結体ＨＡ（Ｓ−ＨＡ）（１２００℃、２ｈ焼結）を作製した。それぞれの試料の結晶配向度をＨＡの（００４）の回折ピークを用いて、ＸＲＤの薄膜配向度解析により評価した。ブラッグの条件にある特定の格子面の法線に対する試料表面の法線の角度ψに対して回折強度をプロットした。
【００２７】
図１に、ψ−回折強度曲線を示す。試料のψ＝０のときの積分強度に対して、積分強度が５０％となるψの角度を配向度（ＯＤ）とした。ＨＯ−ＨＡＣでは、配向度の異なるＯＤ＝１３．５°と１８．０°の皮膜が得られた。上記Ｓ−ＨＡ、ＬＯ−ＨＡＣ、ＨＯ−ＨＡＣ（ＯＤ＝１３．５°）及びＨＯ−ＨＡＣ（ＯＤ＝１８．０°）を試料として用いた。
【実施例２】
【００２８】
本実施例では、上記試料に吸着させる塩基性タンパク質としてラクトフェリンを用いた。ＦＩＴＣラベルしたラクトフェリン（ＦＩＴＣ−ＬＡＣ）を２２μｇ／１００μｌでリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶かした溶液を、各試料表面に室温で３０分吸着させた。これをＮａＣｌ濃度を１５４、２５０、５００、１０００ｍＭとしたリン酸バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、得られた像から蛍光強度を測定した。
【００２９】
図２に、タンパク質を吸着した試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示す。いずれの場合においても、コントロールのＳ−ＨＡでは、蛍光強度が低く、タンパク質の吸着量が低かった。
【００３０】
等電点が８．５の塩基性タンパク質であるラクトフェリンの場合は、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣに較べ、配向性の高いＨＯ−ＨＡＣの蛍光強度は、ＮａＣｌ濃度を１０００ｍＭとして洗浄した場合には７５％以上高く、配向性の高いＨＡ皮膜の方がタンパク質の保持量が高いことが分かった。配向性の高いＨＯ−ＨＡＣにおいて、より配向性の高いＯＤ＝１３．５°の方が蛍光強度が強く、タンパク質を約６５％多く吸着した。
【実施例３】
【００３１】
本実施例では、上記試料に吸着させる塩基性タンパク質としてシトクロムＣを用いた。ＦＩＴＣラベルしたシトクロムＣ（ＦＩＴＣ−ＣＣＣ）を２２μｇ／１００μｌでリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶かした溶液を、各試料表面に室温で３０分吸着させた。ＮａＣｌ濃度を１５４、２５０、５００、１０００ｍＭとしたリン酸バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、得られた像から蛍光強度を測定した。
【００３２】
図３に、タンパク質を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示す。いずれの場合においても、コントロールのＳ−ＨＡでは、蛍光強度が低く、タンパク質の吸着量が低かった。
【００３３】
等電点が約１０．９の塩基性タンパク質であるシトクロムＣの場合は、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣに較べ、配向性の高いＨＯ−ＨＡＣ（ＯＤ＝１３．５°）の蛍光強度は、ＮａＣｌ濃度を１０００ｍＭとして洗浄した場合には８３％程度高く、配向性の高いＨＡ皮膜の方がタンパク質の保持量が高いことが分かった。配向性の高いＨＯ−ＨＡＣにおいて、配向度が１８°程度の場合は、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣに較べ、顕著な差がなく、より塩基性の高いタンパク質の場合は、配向度の影響が強く発現した。
【実施例４】
【００３４】
本実施例では、上記試料に吸着させる塩基性タンパク質としてリゾチームを用いた。ＦＩＴＣラベルしたリゾチーム（ＦＩＴＣ−Ｌｙｚ）を２２μｇ／１００μｌでリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶かした溶液を、各試料表面に室温で３０分吸着させた。ＮａＣｌ濃度を１５４、２５０、５００、１０００ｍＭとしたリン酸バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、得られた像から蛍光強度を測定した。
【００３５】
図４に、タンパク質を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示す。いずれの場合においても、コントロールのＳ−ＨＡでは、蛍光強度が低く、タンパク質の吸着量が低かった。
【００３６】
等電点が約１１．２の塩基性タンパク質であるリゾチームの場合は、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣに較べ、配向性の高いＨＯ−ＨＡＣ（ＯＤ＝１３．５°）の蛍光強度は、ＮａＣｌ濃度を１０００ｍＭとして洗浄した場合には２．２倍程度高く、配向性の高いＨＡ皮膜の方がタンパク質の保持量が高いことが分かった。配向性の高いＨＯ−ＨＡＣにおいて、配向度が１８°程度の場合は、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣに較べ、顕著な差がなく、より塩基性の高いタンパク質の場合は、配向度の影響が強く発現した。
【００３７】
比較例１
ＦＩＴＣラベルした牛血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）を２２μｇ／１００μｌでリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶かした溶液を、各試料表面に室温で３０分吸着させた。ＮａＣｌ濃度を１５４、２５０、５００、１０００ｍＭとしたリン酸バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、得られた像から蛍光強度を測定した。
【００３８】
図５に、タンパク質を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示す。いずれの場合においても、コントロールのＳ−ＨＡでは、蛍光強度が低く、タンパク質の吸着量が低かった。
【００３９】
等電点が約４．５の酸性タンパク質であるアルブミンの場合は、配向性の高いＨＯ−ＨＡＣに較べ、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣの蛍光強度は、ＮａＣｌ濃度を１０００ｍＭとして洗浄した場合には３２％程度高く、配向性の低いＨＡ皮膜の方がタンパク質の保持量が高いことが分かった。配向性の高いＨＯ−ＨＡＣにおいて、配向度の差による蛍光強度の差は殆どなく、タンパク質の吸着量に差は見られなかった。
【００４０】
比較例２
ＦＩＴＣラベルした免疫グロブリンＧ（ＦＩＴＣ−ＩｇＧ）を２２μｇ／１００μｌでリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶かした溶液を、各試料表面に室温で３０分吸着させた。ＮａＣｌ濃度を１５４、２５０、５００、１０００ｍＭとしたリン酸バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、得られた像から蛍光強度を測定した。
【００４１】
図６に、各タンパク質を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示す。いずれの場合においても、コントロールのＳ−ＨＡでは、蛍光強度が低く、タンパク質の吸着量が低かった。
【００４２】
等電点が６．６の中性タンパク質である免疫グロブリンＧの場合は、配向性の高いＨＯ−ＨＡＣに較べ、配向性の低いＬＯ−ＨＡＣの蛍光強度は、ＮａＣｌ濃度を１０００ｍＭとして洗浄した場合には５５％程度高く、配向性の低いＨＡ皮膜の方がタンパク質の保持量が高いことが分かった。配向性の高いＨＯ−ＨＡＣにおいて、配向度の差による蛍光強度の差は殆どなく、タンパク質の吸着量に差は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
以上詳述したように、本発明は、生体分子を表面に固定したアパタイト被覆生体インプラント及び細胞培養担体に係るものであり、本発明により、表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定した生体材料を提供することができる。本発明によれば、水酸アパタイト皮膜の表面に塩基性タンパク質を固定した生体インプラント材ならびに細胞培養担体を、タンパク質溶液に浸してタンパク質を吸着させるだけの簡便な方法で作製し、提供することができる。本発明は、ＢＭＰなどの塩基性タンパク質を表面に選択的に固定した人工関節、人工歯根などの生体インプラント材及び細胞培養担体を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】第１図は、実施例１のψ−回折強度曲線を示すものである。
【図２】第２図は、実施例２のＦＩＴＣラベルしたラクトフェリン（ＦＩＴＣ−ＬＡＣ）を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示すものである。
【図３】第３図は、実施例３のＦＩＴＣラベルしたシトクロムＣ（ＦＩＴＣ−ＣＣＣ）を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示すものである。
【図４】第４図は、実施例４のＦＩＴＣラベルしたリゾチーム（ＦＩＴＣ−Ｌｙｚ）を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示すものである。
【図５】第５図は、比較例１のＦＩＴＣラベルした牛血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示すものである。
【図６】第６図は、比較例２のＦＩＴＣラベル免疫グロブリンＧ（ＦＩＴＣ−ＩｇＧ）を吸着した各試料表面を異なるＮａＣｌ濃度のリン酸バッファーで洗浄した後の蛍光強度を、洗浄液のＮａＣｌ濃度に対してプロットしたものを示すものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸アパタイトを主成分とするセラミックスから成る生体材料であって、当該セラミックス中の水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有し、ＨＡ（００４）面のＸＲＤの薄膜配向度解析による配向度が少なくとも１３．５°の高い結晶配向を示し、かつ、当該面の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定したことを特徴とする生体材料。
【請求項２】
上記生体材料が、セラミックス又は金属から成る基材上に形成された水酸アパタイトを主成分とするアパタイト皮膜を有し、当該皮膜がラメラ状に堆積した粒子から成り、当該皮膜中の水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が基材に対して垂直方向に優先的に配向することで、（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有する、請求項１に記載の生体材料。
【請求項３】
三リン酸カルシウムならびに基材に対して垂直方向に結晶のａ軸方向が優先的に配向した四リン酸カルシウムを含有する、請求項２に記載の生体材料。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の生体材料を構成要素として有することを特徴とする細胞培養担体。
【請求項５】
厚さが５〜１０００μｍのアパタイト皮膜を有する、請求項４に記載の細胞培養担体。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１項に記載の生体材料を構成要素として有することを特徴とする生体インプラント材。
【請求項７】
チタン又はチタン合金から成る基材上にアパタイト皮膜を有し、当該皮膜内にチタン又はチタン合金とそれらの窒化物の混合物を含有する層が形成されていて皮膜の基材に対する密着性が高められている、請求項６に記載の生体インプラント材。
【請求項８】
厚さが５〜１０００μｍのアパタイト皮膜を有する、請求項６又は７に記載の生体インプラント材。
【請求項９】
生体インプラント材の表面の限定された範囲に凹凸が形成されている、請求項６から７のいずれか１項に記載の生体インプラント材。
【請求項１】
水酸アパタイトを主成分とするセラミックスから成る生体材料であって、当該セラミックス中の水酸アパタイト（ＨＡ）の結晶の（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有し、ＨＡ（００４）面のＸＲＤの薄膜配向度解析による配向度が少なくとも１３．５°の高い結晶配向を示し、かつ、当該面の少なくとも表面近傍に塩基性タンパク質を選択的に固定したことを特徴とする生体材料。
【請求項２】
上記生体材料が、セラミックス又は金属から成る基材上に形成された水酸アパタイトを主成分とするアパタイト皮膜を有し、当該皮膜がラメラ状に堆積した粒子から成り、当該皮膜中の水酸アパタイトの結晶のｃ軸方向が基材に対して垂直方向に優先的に配向することで、（００１）面（ｃ面）が表面に優先的に露出した面を有する、請求項１に記載の生体材料。
【請求項３】
三リン酸カルシウムならびに基材に対して垂直方向に結晶のａ軸方向が優先的に配向した四リン酸カルシウムを含有する、請求項２に記載の生体材料。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の生体材料を構成要素として有することを特徴とする細胞培養担体。
【請求項５】
厚さが５〜１０００μｍのアパタイト皮膜を有する、請求項４に記載の細胞培養担体。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１項に記載の生体材料を構成要素として有することを特徴とする生体インプラント材。
【請求項７】
チタン又はチタン合金から成る基材上にアパタイト皮膜を有し、当該皮膜内にチタン又はチタン合金とそれらの窒化物の混合物を含有する層が形成されていて皮膜の基材に対する密着性が高められている、請求項６に記載の生体インプラント材。
【請求項８】
厚さが５〜１０００μｍのアパタイト皮膜を有する、請求項６又は７に記載の生体インプラント材。
【請求項９】
生体インプラント材の表面の限定された範囲に凹凸が形成されている、請求項６から７のいずれか１項に記載の生体インプラント材。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−２１３７２３（Ｐ２００９−２１３７２３Ａ）
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６１８８６（Ｐ２００８−６１８８６）
【出願日】平成２０年３月１１日（２００８．３．１１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年９月１２日 社団法人日本セラミックス協会発行の「第２０回秋季シンポジウム講演予稿集」に発表
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１１日（２００８．３．１１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年９月１２日 社団法人日本セラミックス協会発行の「第２０回秋季シンポジウム講演予稿集」に発表
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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