生体分子計測システム及び生体分子計測方法
【課題】蛍光を用いた生体分子計測において、ＳＢ比とスループットを向上したホモジニアスアッセイ法を提供する。
【解決手段】定量対象の生体分子１１に電気双極子モーメント３０を誘起し、方向が変調された電界Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３を印加して蛍光測定を行う。定量対象分子と複合体１３を形成した蛍光分子からの蛍光は変調電界と同期して蛍光強度が変化するが、非結合の蛍光分子からの蛍光強度はランダムに変化する。定量対象分子と結合した蛍光分子とそうでない蛍光分子では、蛍光強度変調の振幅あるいは位相が異なることを利用して高いＳＢ比を得る。
【解決手段】定量対象の生体分子１１に電気双極子モーメント３０を誘起し、方向が変調された電界Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３を印加して蛍光測定を行う。定量対象分子と複合体１３を形成した蛍光分子からの蛍光は変調電界と同期して蛍光強度が変化するが、非結合の蛍光分子からの蛍光強度はランダムに変化する。定量対象分子と結合した蛍光分子とそうでない蛍光分子では、蛍光強度変調の振幅あるいは位相が異なることを利用して高いＳＢ比を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子計測システム及び生体分子計測方法に関し、例えば、遺伝子発現解析、細胞機能解析、免疫分析及び病気の診断、創薬などに適用できる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析や細胞機能解析、免疫分析においては、蛍光による定量分析が感度と精度の面で有用である。この蛍光による定量分析では、蛍光分子を定量対象分子と結合させて複合体とし、この複合体の量を蛍光量に対応させて定量する。ここで、蛍光分子を定量対象分子と結合させた後、結合しなかった過剰な蛍光分子を定量対象分子が含まれる溶液から取り除く必要のない、一般にホモジニアスアッセイと呼ばれる方法は簡便であり、かつ測定時間が短いという点で有用である。しかし、ホモジニアスアッセイはＳＢ比が低いという問題がある。なぜなら、ホモジニアスアッセイでは、多くの場合、定量対象分子と蛍光分子が結合したときのみ蛍光を発する機構を有するが、実際には非結合の蛍光分子も弱い蛍光を発し、この蛍光がバックグラウンド（＝Ｂ）となる。このバックグラウンドは、（測定領域内の非結合蛍光分子の数）×（１つの非結合蛍光分子が発する蛍光強度）に比例し、シグナル（＝Ｓ）は（測定領域内の定量対象分子数）×（１つの結合分子が発する蛍光強度）に比例する。蛍光分子数は未知数である定量対象分子数よりも必ず多い必要があるため、定量対象分子数が少ない場合には、結合した蛍光分子数に比べて非結合蛍光分子数の方が何ケタも多いことが普通である。そのため、非結合の蛍光分子１分子の蛍光強度がかなり低くてもＳＢ比は大幅に低下する。
【０００３】
ホモジニアスアッセイにおけるＳＢ比改善の効果的な方法は、励起レーザ光を十分に絞り、計測領域を小さくすることである。実際に、励起レーザ光を回折限界まで絞り、共焦点光学系により狭い領域からの蛍光を測定し時間相関関数を得るというＦＣＳ（蛍光相関分光法）は、有効なホモジニアスアッセイ法として知られる（非特許文献１）。これらの方法はｎＭ〜μＭオーダー（一分子あたりのＳＢ比によってはｍＭオーダー）の高い濃度の蛍光分子の存在下でも高いＳＢ比を得ることができる。
【０００４】
一方、ｒＦＬＩＭ（anisotropic Fluorescent Imaging Microscopy）という技術が知られている（非特許文献２）。この技術は、蛍光分子の回転緩和時間を２次元平面上で同時に計測し、イメージングする技術である。蛍光分子の双極子の方向が溶媒分子によるブラウン運動によってどの程度維持されるかを測定する方法が知られている。この方法は、回転緩和特性が非結合蛍光分子と、定量対象分子と蛍光分子が結合した複合体との間で異なることを利用して計測できるため、ホモジニアスアッセイ法として利用することも可能である。
【０００５】
一方、特許文献１〜３には、定量対象分子を捕捉した基板表面に非結合の蛍光分子が非特異に吸着し、洗浄できずに残ってしまうという問題を緩和する方法が記載されている。この方法は、基板とこれに対向する基板の間に変調電界を印加し、定量対象分子と蛍光分子の複合体は電界に応答して基板との距離が変化し、蛍光強度が変化するが、吸着した蛍光分子は蛍光強度が変化しないことを利用する。また、この基板との距離の変化を使って、蛍光ラベルを用いない定量方法のバックグラウンドシグナルを抑制する方法も知られている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１２７８０４号公報
【特許文献２】特開２００９−０８５６３６号公報
【特許文献３】特開２００９−０８５６３４号公報
【特許文献４】特開２００６−０７１３００号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】T. Sonehara et al., “Improvement of biomolecule quantification precision and use of a single-element aspheric objective lens in fluorescence correlation spectroscopy.” Anal. Chem. 78, (24), pp. 8395-8405, (2006)
【非特許文献２】H. Andrew etal., ”Dynamic Fluorescence Anisotropy Imaging Microscopy in the Frequency Domain (rFRIM)” Biophys Journal 83, pp. 1631-1649, (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の蛍光分子を用いたホモジニアスアッセイでは、定量対象分子と蛍光分子の結合による蛍光波長又は蛍光強度又は蛍光寿命又は回転緩和時間など、結合による受動的な物理量の変化を計測することによって、非結合の蛍光分子中の結合蛍光分子を定量し、定量対象分子を測定していた。
【０００９】
しかし、ホモジニアスアッセイはＳＢ比が低いという問題がある。これを避けるためにレーザを絞りこみ、極狭い領域からの蛍光を計測方法が知られている。しかし、この方法では、レーザ照射領域が小さいため、同時に計測できるサンプルの容積あるいは面積が小さく制限され、スループットが低下するという問題があった。
【００１０】
さらに、このスループットの問題を避けるため、平面内あるいは空間内に広がった領域中の蛍光分子を同時に計測しようとするとき、一つの受光デバイス（撮像素子の場合には一つピクセル）に入射する非結合蛍光分子の数が非常に多いためＳＢ比が低下する問題があった。この問題は、撮像素子を使わずに単一又は複数の受光素子を用いる場合にも同様に発生する。
【００１１】
ｒＦＬＩＭは、スループットの問題を解決するが、ＳＢ比の問題は解決されない。また、強い蛍光を発する蛍光体の場合、回転緩和時間より蛍光寿命が短いため、回転による大きな蛍光変化を定量対象分子で得ることは困難である。逆に、蛍光寿命の長い蛍光分子は本質的に蛍光強度が弱いという欠点を持つ。
【００１２】
さらに、基板上に定量対象分子を捕捉し、変調電界を印加して蛍光分子と基板との距離を変化させながら蛍光を計測することによって、基板上に吸着している非結合分子などの蛍光を分離する方法は、分子を固体表面に必ず固定する必要があるため、蛍光分子の固体表面への非特異吸着の問題を内包している。また、固体表面での計測では、定量対象分子と蛍光分子が複合体を形成する反応が溶液中に比べて遅く、効率も低いという問題が生じることが多い。さらに、この方法は本質的に基板が必要であり、溶液中での定量、細胞中での定量に適用できない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
以下では、説明に２種類の双極子モーメントが現れるのでこれを定義する。
蛍光分子の光吸収遷移にかかわる電気双極子を遷移双極子（モーメント）と呼び、その方向を、次で定義する。すなわち、蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が励起光の偏光方向と一致したとき最大の励起光吸収が起き、最大の蛍光が生じるが、最大の蛍光が得られた時の偏光方向を遷移双極子モーメントの方向と定義する。なお、パルスレーザを用いて励起したとき、最大吸収の偏光方向と蛍光の偏光方向は一致しないが、これは、分子の回転によって遷移双極子モーメントが回転するために生じる。
【００１４】
定量対象分子と蛍光分子及び結合分子の複合体がもつ電気双極子モーメントの方向及び大きさは、この複合体に属するすべての電荷のうちの正の電荷の重心位置と負の電荷の重心位置を求め、後者から前者に至るベクトルを電気双極子モーメントの方向とする。
【００１５】
なお、一般に、特定の周波数の変調電界を印加したときに応答する蛍光分子の電気双極子モーメントの方向と前記遷移双極子の方向は一致するとは限らない。
【００１６】
本発明の生体分子計測システムは、定量対象となる生体分子、蛍光分子、並びに生体分子及び蛍光分子と複合体を形成するための結合分子を含有する溶液を保持する保持部と、偏光した励起光を溶液に照射する励起光源と、溶液に方向が周期的に変化する変調電界を印加する電界印加部と、励起光照射によって蛍光分子から発生された蛍光を検出する受光部と、受光部による蛍光検出信号を処理する演算部とを有する。複合体は電気双極子モーメントを持ち、変調電界の印加によって複合体中の蛍光分子の遷移双極子モーメントの方が励起光の偏光方向又は偏光面に対して周期的に変化する。演算部は、変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングの蛍光検出信号から最小になるタイミングの蛍光検出信号を減算した値を複数周期にわたって積算する処理を行う。
【００１７】
本発明の一態様においては、受光部は撮像素子を有し、蛍光検出信号は蛍光スポット像である。このとき、演算部は、変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングで取得した第１の蛍光スポット像から最小になるタイミングで取得した第２の蛍光スポット像を対応する画素毎に減算した差分画像を複数周期にわたって積算する処理を行い、得られた積算画像をもとに一分子ずつカウンティングによって生体分子を定量する。
【００１８】
本発明の生体分子計測方法は、定量対象となる生体分子と、遷移双極子モーメントを有する蛍光分子と、結合分子とを含み電気双極子モーメントを有する複合体を形成する工程と、複合体を含有する溶液に、方向が周期的に変化する変調電界を印加した状態で、偏光した励起光を照射する工程と、励起光照射によって蛍光分子から発生された蛍光信号を検出する検出工程と、変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングの蛍光信号から最小になるタイミングの蛍光信号を減算した値を複数周期にわたって積算する処理工程と、を有する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、ホモジニアスアッセイにおいて高スループットで高ＳＢの計測が可能になる。このとき、固体表面への固定化が必ずしも必要ない。また、複数種類の蛍光分子を用いて多数の分子の同時定量が可能となる。
【００２０】
上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明による生体分子計測システムの一例を示す概略構成図。
【図２】電極に印加される変調電圧と蛍光強度変化の例を示す模式図。
【図３Ａ】電界方向がＥ１及びＥ３の場合の蛍光スポットの模式図。
【図３Ｂ】電界方向がＥ２の場合の蛍光スポットの模式図。
【図４】蛍光カウンティングによるデータ取得方法を示すフローチャート。
【図５】電極に印加される変調電圧と蛍光強度変化の例を示す模式図。
【図６】測定領域の拡大模式図。
【図７】電極に印加される変調電圧と蛍光強度変化の例を示す模式図。
【図８】本発明による生体分子計測システムの他の例を示す概略構成図。
【図９Ａ】電界方向Ｅ１のときの基板表面付近の分子の配向の様子を示す模式図。
【図９Ｂ】電界方向Ｅ２のときの基板表面付近の分子の配向の様子を示す模式図。
【図１０】本発明による生体分子計測システムの他の例を示す概略構成図。
【図１１】電極に印加される変調電圧と励起光照射、露光のタイミングの例を示す模式図。
【図１２】変調電界の周波数に対する蛍光強度変化の振幅の変化を示す模式図。
【図１３】変調電界の周波数に対する蛍光強度変化の振幅の変化を示す模式図。
【図１４】本発明による生体分子計測システムの他の例を示す概略構成図。
【図１５】測定領域内の模式図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明では、溶液中に方向が変化する変調電界を印加することによって、蛍光分子と定量対象分子が結合したときのみ有効に蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向を振動させる。これによって、定量対象分子と複合体を形成した蛍光分子からの蛍光と定量対象分子に結合していない非結合の蛍光分子からの蛍光を分離して、前者のみを定量できるようにする。すなわち、複合体の蛍光強度のみを振動させるようにし、蛍光の振動成分を抽出することにより、非結合蛍光分子からの蛍光（すなわちバックグラウンド蛍光）を除去し、ＳＢ比の向上を図る。
【００２３】
また、非結合蛍光分子の遷移双極子モーメントが外部電界によって振動したとしても、複数の周波数変調電界に対する蛍光強度の振動振幅や変調電界に対する位相遅れを計測し、これらから適切に選ばれた線形演算の結果から、複合体と非結合蛍光体とを分離することが可能である。すなわち、変調電界に対する蛍光の応答スペクトルの変化を用いて複合体の蛍光分子からの蛍光と非結合の蛍光分子からの蛍光の分離が可能であり、ＳＢ比を向上することができる。
【００２４】
また、複数の分子を同時に定量する目的に、変調電界に対する蛍光強度の応答スペクトル及び位相ずれの変化を用いることができる。すなわち、蛍光波長が異なる複数の蛍光分子が同時に１つの定量対象分子に結合するようにし、この定量対象分子に対する蛍光分子の結合位置（正確には電気双極子モーメントが集中し、電界による力が集中する点からの距離）によって、応答スペクトル、位相ずれが異なるようにすると、蛍光位置を区別することができる。これによって、複数色の蛍光分子の順序（配列）を定量対象分子と対応させることができ、多種類の定量対象分子を比較的少数の種類の蛍光分子を使って分離して定量することが可能である。
【００２５】
また、蛍光体の励起状態の寿命が回転緩和時間よりも短いという問題に対しては、励起レーザ光が特定の偏光成分のみを持つようにして、蛍光分子を振動させ、蛍光の励起効率を変調することによって蛍光強度を変調するため、蛍光の励起キャリア（電子）の寿命の影響を受けない。もちろん、分子回転緩和を測定して、複合体と非結合蛍光分子を分離する分解能を向上させる目的に用いても構わない。
【００２６】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
［実施例１］
この実施例は、溶液中に分散したＤＮＡ又はＲＮＡのうち特定の配列を持つものを定量対象分子として定量するために、この配列の一部と相補的な配列を持つ蛍光プローブを用いる例である。
【００２７】
図１は、本実施例の生体分子計測システムの構成例を示す概略図である。発振波長４８８ｎｍの半導体レーザ光源１から直線偏光の励起光２を出力する。光学素子３は、蛍光プローブの蛍光双極子の動きに対応して、所望の偏光状態を得るための素子である。本実施例の場合には円偏光と直線偏光の両方が適用可能であるが、ここでは図１の紙面に並行な直線偏光（図１中、矢印３３の方向）になるように、直線偏光子を用いた。偏光状態を調整された励起レーザ光を、サンプル中の照射領域を調整するための視野レンズ４、励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラー５、対物レンズ６（ＮＡ＝０．８×４０）を通して、サンプル溶液８中の計測領域９に照射する。ここで、サンプル溶液８には、定量対象分子１１と蛍光プローブ１２が含まれている。蛍光プローブ１２は、蛍光分子、及び蛍光分子と定量対象分子１１との選択的結合を助ける結合分子が結合した分子である。これらは計測前に、サンプル溶液の保持手段である容器７に導入する。容器７は、ＸＹＺ方向に移動できるステージに搭載され、計測領域を任意に変更できる。また、サンプル溶液８の導入及び排出は、容器７に樹脂製チューブを複数接続し、シリンジポンプを用いて行う。容器７は石英ガラスを用いて作製したが、サイクリックポリオレフィン等の非蛍光性樹脂や半導体を用いてもよい。
【００２８】
図１には、計測領域９の拡大模式図１０をあわせて示した。定量対象分子１１であるｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）は、蛍光プローブ１２と結合して複合体１３を形成する。複合体１３を形成させるために、蛍光プローブ１２には結合分子としてｍＲＮＡの５’又は３’末端にハイブリダイズするＰＮＡ（Peptide Nucleic Acids：ペプチド核酸）オリゴマを用いた。また、蛍光分子としてはＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）を用いた。ＰＮＡとＧＦＰは、複数の結合サイトで化学結合を行って、ＧＦＰの遷移双極子モーメントの方向とＰＮＡ分子の長手方向の間の角度がブラウン運動によって大きく変化することがないようにした。ＰＮＡの鎖長は２７ベースとした。蛍光プローブ１２と定量対象分子１１の複合体１３が大きな電気双極子モーメントを持つように、ＰＮＡとｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは配列の末端の一部だけで起こるように配列を決定し、一本鎖の領域に正の電荷を保持できるようにリジンのペプチドを１０分子重合させている。ＰＮＡは一般に電荷をもたないため、ＰＮＡとＤＮＡがハイブリダイズ（ｍＲＮＡとＰＮＡの結合を意味する）した領域とＤＮＡのみの領域は負の電荷をもち、ＰＮＡのみの領域は正の電荷をもつ。このため複合体分子に大きな電気双極子モーメントを出現させることができる。
【００２９】
複合体分子に大きな電気双極子モーメントを出現させる方法としては、ＰＮＡのすべての塩基に正の電荷をもたせる方法がある。この場合には、ＰＮＡは１塩基ごとに正の電荷をもち、ｍＲＮＡは負の電荷を持っている。ＰＮＡの配列をｍＲＮＡの末端に合わせ、かつ１０ベース程度余らせるようにハイブリダイズさせることによって、ハイブリダイズした１７ベースの領域では電荷がほぼキャンセルされ、ＰＮＡ側には正の電荷がｍＲＮＡ側には負の電荷が露出する。
【００３０】
一方、ｍＲＮＡと複合体を形成していない蛍光プローブ１２は、複合体１３に比べるとごく小さな電気双極子モーメントしか持っていない。複合体の電気双極子モーメントをさらに大きくするためには、ｍＲＮＡとの選択的結合に必要な１３〜１８ベースのＰＮＡの先端の一本鎖のＰＮＡを長くして、正の電荷量を増やすことが有効であるが、市場で入手可能なＰＮＡの鎖長は現在のところ２７ベースに制限されている。本来は数百ベース程度のＰＮＡを結合分子として利用することが望ましいが、その塩基長は測定対象分子の大きさや、目標とする測定時間や精度、同時に測定する物理量に応じて最適な長さを選ぶべきである。
【００３１】
最後に、励起光の照射によって得られた蛍光分子像は対物レンズ６と結像レンズ１４で撮像素子１５である冷却ＣＣＤ上に結像される。撮像素子１５で撮像された画像は演算部２７で処理される。
【００３２】
計測領域９の拡大模式図１０には、電界がＥ１の方向に印加されている瞬間の状態を示している。図は、蛍光分子ＧＦＰの遷移双極子モーメントの方向がＰＮＡ鎖の長手方向と一致するようにＧＦＰとＰＮＡが固定できた場合を描いている。図中の矢印１６が遷移双極子モーメントの方向を示す。なお、遷移双極子モーメントの方向をすべての蛍光分子について一致させることができなかったとしても、後述するように、撮像素子にて蛍光ポットを計測する場合には、蛍光強度の変化の位相が分子ごとに変わるだけで計測精度には影響がない。
【００３３】
このとき、定量対象分子であるｍＲＮＡと複合体を形成していない蛍光プローブ１２中のＧＦＰの遷移双極子モーメントの方向は電界の方向と関係なくランダムな方向を向いている。一方、ＰＮＡの末端に正の電荷を多数持つため、複合体１３の電気双極子モーメントと印加電界の積は十分大きく、複合体１３の電気双極子モーメントの方向３０は、電界Ｅ１の方向と一致する。その結果、遷移双極子モーメントの方向も電界Ｅ１の方向と一致する。印加電界の方向をＥ１→Ｅ２→Ｅ３→Ｅ２→Ｅ１→Ｅ２と周期的に変化させると、この電界印加方向の変化の周波数が複合体の緩和振動周波数よりも小さく、複合体の運動が電界の変化に追随できれば、複合体の動きにあわせて、複合体中の蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向もそれぞれの瞬間の電界の方向を向く。励起光の偏光方向３３は、ベクトルＥ２に垂直な平面とベクトルＥ１とＥ３が張る平面が交わる直線に平行となるように設定している。
【００３４】
上述のように方向が変調される変調電界を発生するために、サンプル混合溶液８中に浸された４つの電極２３，２４，２５，２６と、電極に信号を入力する信号発生器２０，２１及び、２つの信号発生器２０，２１の間の位相を調整するための位相シフタ２２を設けた。なお、所望の電圧振幅を得るために、信号発生器には高出力アンプが接続されている。
【００３５】
図２に、信号発生器２０から出力され、電極２３，２４間に印加される電圧と、信号発生器２１から電極２５，２６間に印加される電圧、及び、撮像素子１５で得られる複合体１３に対応する蛍光スポットの蛍光強度（蛍光スポットの積分値）の変化を模式的に示す。電極への印加電圧を示す上の２つのグラフにおいて、それぞれ電極２３，２５に正の電圧を印加するときグラフ上で正の値を示すように描いた。実線で示した波形３４，３５は、正弦波での印加電圧波形を示している。また、破線で示した波形３６，３７は、より好ましい印加電圧の波形を示している。波形３６，３７で電圧印加した場合について詳細に説明すると、電界Ｅ１を印加するときは、電極２３を正に、電極２４を負に設定し、電極２５，２６には電圧を印加しない。電界Ｅ２を印加するときは、電極２３，２５に正の電圧を、電極２４，２６に負の電圧を同じ電圧値で印加する。電界Ｅ３を印加するときは、電極２５を正に、電極２６を負に設定し、電極２３，２４には電圧を印加しない。
【００３６】
破線の電圧印加波形と実線の電圧印加波形の違いは、実線で示した正弦波の波形３４，３５で電圧印加した場合には、Ｅ２方向に電圧を印加する場合の電圧強度が低下するという問題があり、破線で示した波形３６，３７で電圧印加した場合にはこの問題がないという点にある。
【００３７】
印加電圧はいずれも最大３００Ｖとし、電極２３，２４間及び電極２５，２６間の間隔を１ｍｍとした。このとき、複合体１３の電気双極子モーメントに加わる静電エネルギーは３３ｍｅＶと室温におけるｋＴ＝２６ｍｅＶよりも大きく、複合体の分極方向が安定に維持される。
【００３８】
印加電圧の周波数は１ｋＨｚとした。周波数は、矩形波を正弦波に変換して考えると明確になる。また、変調電界の周波数は、定量したい分子複合体が電界に応答できる限界の周波数（緩和振動周波数）以下であれば、どのような周波数でもよい。
【００３９】
蛍光強度は、図２のように振幅３１で周期的に変化するので、各周期ごとに検出した振幅３１の信号を積算して、複合体１３からの蛍光シグナルとする。具体的には、電界Ｅ１が印加されているときの蛍光強度から電界Ｅ２が印加されているときの蛍光強度を減算したものを複合体１３からの蛍光シグナルとする。また、電界Ｅ３が印加されているときの蛍光強度から次に電界Ｅ２が印加されているときの蛍光強度を減算したものを複合体１３からの蛍光シグナルとする。そして、これら各周期の蛍光シグナルを加算処理する。このような変調電界を印加しても、複合体を形成していない蛍光分子からの蛍光は時間的にランダムに変化するので、この和の操作によって値がほぼ０となり、バックグラウンドが抑圧されＳＢ比が大幅に向上する。
【００４０】
実際には、上記のような変調シグナル取得を、複合体１分子に対応する蛍光スポット一つひとつについて実行する。図３Ａ及び図３Ｂに、蛍光スポットの模式図を示す。図３Ａは電界方向がＥ１及びＥ３の場合の蛍光スポットの模式図であり、図３Ｂは電界方向がＥ２の場合の蛍光スポットの模式図である。
【００４１】
まず、電界方向がＥ１又はＥ３に設定されている場合の蛍光スポットである図３Ａについて説明する。スポット４１，４３は定量対象分子と蛍光分子が複合体を形成している状態の蛍光スポットを示しており、このスポットの数を数えることによって定量対象分子を定量する。一方、スポット４５，４７は、定量対象分子と複合体を形成していない非結合の蛍光分子に対応する蛍光スポットである。このスポットは本来カウントしてはいけないが、蛍光強度は無視できない強度を有し、その強度はスポットによっても異なる。この蛍光スポット４５，４７を定量対象分子に対応するスポットとしてカウントすると、バックグラウンドカウントを増やしてしまい、ＳＢ比を低下させる。
【００４２】
次に、図３Ｂを参照して、電界の方向をＥ２に変えた時の蛍光スポットの状態を説明する。図３Ｂに示した蛍光スポット４２，４４，４６，４８は、図３Ａに示した蛍光スポット４１，４３，４５，４７に一対一に対応し、それぞれ同じ蛍光分子から発生された蛍光が検出されたものである。複合体を形成している蛍光分子に起因する蛍光スポット４２，４４は、図３Ａのスポット４１，４３に対して蛍光強度が大きく変化する。すなわち、このとき複合体１３電気双極子モーメントの方向３０は電界の方向Ｅ２を向き、複合体１３を形成している蛍光体の遷移双極子モーメントの方向１６も励起光の偏光方向３３と直交するＥ２の方向を向くため、蛍光強度は低下する。こうして、複合体１３を形成している蛍光分子に起因するスポットの蛍光強度は、電界方向を変化させたとき、その変化に追随して規則的に変化する。一方、複合体を形成していない非結合の蛍光分子に起因するスポット４６，４８の蛍光強度は、蛍光分子のブラウン運動による回転によって、時間的にランダムに変化する。すなわち、非結合の蛍光分子に起因するスポットは、電界方向の変化の影響を受けず、もっぱら蛍光分子のブラウン運動による回転によって、ランダムに変化する。
【００４３】
本実施例では、図３Ａと図３Ｂで同じ位置の対応する蛍光スポットの蛍光強度の差を、それぞれの蛍光スポットからの信号強度として抽出する。そして、印加する電界の方向を周期的に変化させて各周期ごとに抽出した信号強度を積算し、最終的な複合体の蛍光スポットに対応するシグナルとする。ここで、電界方向を周期的に変化させて、図３Ａのスポット４５と図３Ｂのスポット４６の蛍光強度の差や、図３Ａのスポット４７と図３Ｂのスポット４８の蛍光強度の差を積算すると、積算信号強度を積算数で割った平均値は０に収束する。こうして、複合体を形成していない非結合の蛍光分子を誤ってカウントする確率が低下し、ＳＢ比を大幅に向上させることができる。
【００４４】
図３Ａ及び図３Ｂのように強度変調されたシグナルを得るためには、撮像素子の露光時間を素子に入射する蛍光強度が最大になる時刻と最小になる時刻に合わせる必要がある。図２の時間軸方向の矢印３２は、露光のタイミングと露光時間を示したものである。露光開始時刻と露光終了時刻は電界印加方向の変調と同期して決定する必要があり、そのための同期信号が信号発生器２０又は２１から信号線２８を通して撮像素子１５に伝えられる。タイミングの位相調整機能は撮像素子１５の制御回路内部に設置した。
【００４５】
また、露光時間が制限されたことによる受光強度の低下を補うために、イメージインテンシファイアを撮像素子と結像レンズの間に挿入して使用することも可能である。このとき、イメージインテンシファイアのゲート機能が、撮像素子のシャッターの役目を果たす。
【００４６】
図４は、このような蛍光カウンティングによるデータ取得方法を示すフローチャートである。演算部２７では、図４のフローチャートに従ったデータ処理を行い、定量対象分子の濃度を求める。上記内容と重複する部分も含めて説明すると、次のようになる。
【００４７】
蛍光スポット像が、図２に矢印３２で示した露光時間に対応して、多数得られる。このような画像の例が図３Ａ及び図３Ｂである。まず、蛍光スポットの位置を抽出し（Ｓ１１）、この位置での蛍光強度の振幅が最大となるように位相シフタ２２で変調印加電圧の位相を調整する（Ｓ１２）。その結果、図２に示すように、蛍光強度の最大値とＥ１，Ｅ３方向の電界印加時刻、及び蛍光強度の最小値とＥ２方向の電界印加方向時刻を合わせることができる。この後、各蛍光スポットについて、Ｅ１，Ｅ３方向に電界が印加されたときの蛍光強度の積算値からＥ２方向に電界が印加されたときの蛍光強度の積算値を差し引く。具体的には、それぞれの蛍光スポットごとに、Ｅ２のタイミングで取得した蛍光強度に−１を掛けて、Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３のタイミングで計測された蛍光強度を積算する。すなわち、Σ（シグナル最大値）−Σ（シグナル最小値）を計算する。これによって各スポットの蛍光強度の変調成分を抽出することができる。この後、ある閾値以下の蛍光スポットを排除して、蛍光スポットを数え上げ（Ｓ１４）、測定対象溶液の容量の情報と併せて、定量対象分子の濃度を決定することができる（Ｓ１５）。このときの閾値としては、例えば、バックグラウンドレベルにバックグラウンドの標準偏差の３倍を足した数値とすることができる。
【００４８】
このような蛍光検出方法は、一分子ごとに蛍光スポットを識別しない場合に対しても適用可能である。たとえば、撮像素子の撮像面の一部あるいは全面で一括して計測される蛍光強度について、あるいはフォトダイオードのような光検出器で計測される蛍光強度について、蛍光強度の最大値と最小値を繰り返し計測できるように上記と同様に変調電界の位相を調整し、変調成分を上記と同様に抽出することによって、バックグラウンド蛍光の影響を少なくして蛍光強度を計測することが可能である。この場合には、蛍光強度の最大値と最小値の差が、定量対象分子の数、すなわち濃度に対応する。なお、以下の実施例でも同様に蛍光検出器として光検出器を用いることが可能である。
【００４９】
一般に、蛍光をカウンティングによって計測する場合には、スポットが存在しない領域（図３Ａ、図３Ｂの黒い背景領域）に対応するシグナルは、スポット位置を抽出した時点で排除できる。そのため、バックグラウンド発光の影響を少なくすることが可能となる。本実施例では、この効果に加えて、変調電界に対する蛍光強度の変調成分のみを計測することによって非結合蛍光分子からの信号を排除し、さらにＳＢ比を向上させている。
【００５０】
また、励起光を連続的に照射すると、蛍光分子が劣化する（退色する）という問題が生じる。この問題を緩和するために、励起レーザ光をパルス状にして、露光時間３２と同時刻だけ、計測領域にレーザを照射するように、信号線２９を通して同期信号をレーザ光源１に送る。本実施例では半導体レーザを用いているため、レーザ駆動回路に直接この同期信号を入力し、適切な位相調整を行って、パルス状の励起レーザ光を生成している。パルスレーザを発生する方法として、他にＣＷレーザとＡＯＭ（Acoustic Optical Modulator）やＥＯＭ（Electro Optic Modulator）を用いる方法も可能である。
【００５１】
本実施例では変調周波数が低いことから、電極２３〜２６の表面をＳｉＯ2，Ｓｉ3Ｎ4や樹脂等の絶縁膜で覆うことはしていない。そのため、電極表面での電子の授受によって電気分解反応が起きて、気泡が発生する。このため、この気泡が計測領域９やレーザの光路に干渉しないように電極を配置している。周波数が十分高い（下限の周波数はイオン強度によって異なる）場合には、電極２３〜２６の表面を絶縁膜で被覆しても、溶液中に有効に変調電界を印加することが可能である。そうすれば、気泡の発生は抑えることができる。絶縁膜がない場合でも、変調周波数が上がれば気泡の発生は抑圧することができるが、電圧信号のバイアスレベルとデューティー比の調整が必要で、自由なデューティー比の設定ができなくなる。
【００５２】
印加電界の波形は、図２に示した波形以外にも様々な波形を用いることができる。図５は、他の印加電圧波形を示す図である。ここでも変調電圧の最も基本となる正弦波を実線で示し、より好ましい矩形波を破線で示した。このとき、定量対象分子と蛍光プローブの複合体は変調電界の印加によって回転することになる。そのため、蛍光分子の遷移双極子モーメントを励起レーザの偏光方向と完全に一致させることが可能となり、受光蛍光強度変化は最大となり、シグナルを最大化することができる。
【００５３】
この実施例では定量対象分子としてｍＲＮＡを用いたが、ｍＲＮＡは比較的溶液中に活性が残りやすいＲＮａｓｅによって分解されやすいため、逆転写酵素によってｃＤＮＡに転写してから定量することもできる。また、ＲＮＡやＤＮＡなどの核酸の場合には中性に近いｐＨ条件で負の電荷をもつため、この電荷を複合体の電気双極子モーメント形成に利用したが、他の電荷や電気双極子モーメントをもたない分子の場合には、正負２種類の電荷をもった結合分子を使って複合体を形成するようにするか、大きな電気双極子モーメントをもった１つの結合分子を定量対象分子に選択的に結合させることによって、上記計測を実現してもよい。
【００５４】
さらに、定量対象分子が最初から大きな電気双極子モーメントを持っている場合には、電荷や電気双極子モーメントを後から複合させる必要がないことはいうまでもない。
【００５５】
［実施例２］
次に、蛍光分子と結合分子から形成した蛍光プローブを定量対象分子と結合させて複合体を形成するのではなく、３種類の役割の分子を混合することによって定量対象分子の定量を行う実施例について説明する。
【００５６】
本実施例の生体分子計測システムの構成は図１と同じである。また、測定領域にＥ１，Ｅ２，Ｅ３のように方向が周期的に変化する変調電界を印加し、図４のフローチャートで説明したように蛍光画像を処理して蛍光スポットの数を計数する方法、あるいは光検出器で検出された蛍光強度を処理して定量対象分子の濃度を求める方法は、実施例１と同様である。
【００５７】
図６は、測定領域９の拡大模式図である。蛍光分子５１には、２本鎖に特異的にインターカレートするPicogreenを使用した。結合分子５２としては、実施例１と同様に２７塩基のＰＮＡを使用した。ターゲットであるｍＲＮＡ１１に結合分子５２のＰＮＡが結合すると２本鎖領域が生じる。すると、そこに蛍光分子５１であるPicogreenが選択的にインターカレートし、複合体５３を形成して蛍光を発生する。複合体５３の電気双極子モーメントの方向３０は、実施例１の場合と同様である。複合体５３を構成する蛍光分子５１の遷移双極子モーメントの方向は、図１の場合と異なり、ｍＲＮＡ又はＰＮＡ鎖の長手方向に対して垂直方向に向いている。
【００５８】
一部の蛍光分子５１は一本鎖のＰＮＡにも結合し、蛍光を発する。蛍光分子は、どの分子にも結合していない状態よりも一本鎖ＰＮＡに結合した方が強い蛍光を発するため、従来の計測方法ではＳＢ比が低下してしまう。本実施例の計測方法では、実施例１と同様に複合体５３からの信号を選択的に積算するため、高いＳＢを保つことができる。検出される蛍光は、複合体５３として結合している蛍光分子からの蛍光と、結合分子５２と結合した蛍光分子からの蛍光と、他の分子と結合していない蛍光分子からの蛍光の和である。複合体５３に結合している蛍光分子の蛍光強度は、変調電界に同期して周期的に変化するが、結合分子５２と結合した蛍光分子の蛍光強度と、他の分子と結合していない蛍光分子の蛍光強度は、ブラウン運動による分子の回転のために、変調電界と非同期でランダムに変化する。
【００５９】
蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が複合体５３の電気双極子モーメントの方向３０に対して垂直であるので、変調電界に対する複合体からの蛍光シグナルの関係は実施例１の場合とは異なる。図７に、図２と同様の変調電界を印加した時に検出される蛍光シグナルの波形を示す。本実施例では、電界方向がＥ２の時、すなわち励起光の偏光方向３３に垂直な時に、検出される蛍光強度は最大となり、電界がＥ１，Ｅ３方向のとき最小となる。また、電界方向がＥ１，Ｅ３の時に励起光の偏光方向と蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が一致しないため、蛍光強度は実施例１の場合に比べて最小値が０に近づかない。
【００６０】
［実施例３］
基板表面に定量対象分子を捕捉した状態で定量する実施例について説明する。本実施例では、定量対象分子と特異的に結合する結合分子を基板表面に固定し、基板表面上で蛍光分子との複合体を振動させ、蛍光の変調成分のみを計測することによって、ＳＢ比を向上させる。本実施例では定量対象分子を基板表面に捕捉するため、定量対象分子に結合していない蛍光分子が基板表面に非特異的に吸着し、これを完全に洗浄することが困難である。そのため、基板表面に吸着した蛍光分子からの蛍光と複合体からの蛍光とを分離して計測することが重要である。
【００６１】
図８は、本実施例の生体分子計測システムの構成例を示す概略図である。定量対象分子を捕捉するための石英基板７１は、サンプル混合溶液中に浸漬され、容器７に固定されている。基板７１の上下に透明電極７２，７３を設けた。透明電極７２，７３は、その間に直流電源７６から静電圧を印加し、基板に捕捉されて一端が基板に固定された複合体の自由端を基板表面から離し、複合体の運動をスムーズにするために用いた。もちろん、この電極間に変調電圧を印加してもよい。電極７４，７５が溶液中の電界の方向を変えるための電極であり、信号発生器２１に接続されている。４つの電極７２〜７５を用いて、図示したＥ１及びＥ２の２つの方向の間で電界方向を変調する。
【００６２】
図９Ａに電界方向Ｅ１の場合の基板７１表面付近の分子の配向の様子を模式的に示し、図９Ｂに電界方向Ｅ２の場合の様子を示す。定量対象分子８１は、抗原抗体反応を用いて捕捉できる抗原、例えばＡＦＰなどである。８２はこの抗原と特異的に結合する一次抗体である。この一次抗体８２を基板表面に補足するための抗抗体抗体８３は、一次抗体８２が溶液に投入される前に、シランカンプリング剤８４を用いて石英基板上に固定されている。８５は一次抗体８２に補足された抗原に特異的に結合する二次抗体、８６はこの２次抗体８５に特異的に結合する抗抗体抗体である。１次抗体と２次抗体の間の選択性はない。抗体８６は、ＧＦＰ８７及び負電荷をもった２本鎖ＤＮＡ８８とサンプル溶液に投入される前に結合されているものを用いる。ＧＦＰは、その遷移双極子モーメントの方向８９が抗抗体抗体８６の分子の向きに対してほぼ固定されるように化学的に結合している。定量対象分子８１を含む複合体９０の分子の向きに対応して、ＧＦＰの遷移双極子モーメントの向きが固定されることになるため、電界をＥ１とＥ２の向きの間で変調すると、図９Ａの状態と図９Ｂの状態との間で遷移することになる。これによって、複合体９０を形成した分子のみが変調電界に同期して姿勢を変え、複合体９０に起因する蛍光強度が変調されることになる。
【００６３】
電界Ｅ１の時に最大の蛍光強度を得るために、励起光の偏光状態は円偏光か互いに直交する２種類の直線偏光の均等な混合光とした。このとき、複合体を形成していないＧＦＰからの蛍光は、前述の実施例と同様の演算によってバックグラウンドから取り除くことができる。このような偏光を選んだ理由は、蛍光分子の遷移双極子モーメントがレーザ光照射方向に垂直な面内で回転した場合にも、蛍光強度が変化しないようにするためである。もちろん、蛍光分子の遷移双極子モーメントが特定の方向を向くように、レーザ光照射方向と垂直な方向にも０でない電界を印加して、この方向と平行な方向の偏光方向のレーザで励起を行っても良い。ただし、この場合には励起レーザ光は直線偏光とする必要がある。
【００６４】
［実施例４］
受光する蛍光の偏光成分についての情報を得て、複合体と非結合の蛍光体の分離能を向上する本実施例について説明する。
【００６５】
図１０は、本実施例の生体分子計測システムの構成例を示す模式図である。対物レンズ６で集光された蛍光は、ダイロイックミラー５を通り、キューブ型の偏光ビームスプリッタ９１によって２つの偏光成分に分離され、結像レンズ１４ａ，１４ｂによって撮像素子１５ａ，１５ｂに結像され、同時に２つの撮像素子１５ａ，１５ｂにて蛍光像を得るようにする。このシステムによると、２つの撮像素子１５ａ，１５ｂにて同じ蛍光スポットの直交する偏光成分を同時に計測し、蛍光の偏光状態を計測することが可能となる。
【００６６】
もちろん、１つの撮像素子を用い、偏光ビームスプリッタ９１の代わりに偏光子を用いて偏光状態を選択してもよいが、その場合には、２つの偏光成分とトータルの蛍光強度を独立に計測することはできない。直交する２つの偏光成分を同時に計測することによって、蛍光強度と偏光方向を同時に計測することが可能となり、計測精度を向上させることができる。なぜなら、蛍光強度が何らかの原因で周期的に変化することがあり得るからである。
【００６７】
また、この方法によると、分子のサイズによって変調電界に対する応答性の違うことを利用して、特定のサイズの分子からの蛍光を選択的に得ることが可能である。ここでは、電界に対する応答の相違を、印加電界に対する蛍光シグナルの位相のずれによって計測する方法を説明する。
【００６８】
図１１は、変調された蛍光シグナルの変調電界に対する位相ずれを計測するために、励起レーザ光の照射タイミングと撮像素子による露光タイミングを説明する図である。変調電界は、最も単純な正弦波の場合を実線１００４，１００５で示し、より好ましい波形を破線１００６，１００７で示した。期間１００１は露光時間を示し、期間１００２はレーザ励起時間を示す。レーザ励起時間は変調電界と同じ位相になるように調整する。すなわち、レーザ励起時間と電界の最大値及び最小値が一致するように調整する。この条件で、蛍光強度が最大となるように露光時間の位相を調整し、露光と励起の同一位相の時間遅延として位相シフト量１００３を測定する。複合体の緩和時間を計測する。一般に、非結合の分子と複合体では、分子のサイズが異なるため、この位相シフト量が異なる。これにより精密に非結合蛍光分子からの蛍光の影響を排除することができ、ＳＢ比を向上することができる。なお、蛍光強度のグラフにはＳ偏光（紙面に平行な方向の偏光成分）の蛍光強度変化を示している。
【００６９】
また、これと同様の原理を使って、周波数の異なる２つの変調電界を交互に印加し、応答振幅３１又は位相シフト量１００３の変化量を蛍光スポットごとに測定することによってＳＢ比を向上することができる。２つの周波数を決定するには次のような操作を行う。一般に、変調電界に対する複合体の応答は、変調周波数が緩和振動周波数より大きくなると、位相シフト量が急激に大きくなり振幅が急激に低下する。既知の種類の定量対象分子を定量する場合、事前に複合体の緩和振動周波数を調べるために変調電界を本実施例の波形で周波数を低いものから高いものに順次変えていって、位相シフト量１００３と応答振幅３１が大きく変化する周波数を調べる。その周波数を挟んだ２つの周波数を前記２つの周波数として、周波数応答の変化を測定することによって、より厳密に複合体と非結合蛍光分子を分離して計測することができる。
【００７０】
さらに、位相シフトではなく、変調蛍光シグナルの振幅を用いて、複合体のみを定量することも可能である。
【００７１】
図１２は、変調電界の周波数に対する蛍光強度変化の振幅３１の変化を示す模式図である。図の横軸は印加電界の周波数、縦軸は蛍光強度変化の振幅である。実線１４０１は複合体に対応する曲線であり、破線１４０２は複合体を形成していない、非結合の蛍光体に対応する曲線である。上記と同様に２種類の周波数Ｆ１，Ｆ２での蛍光強度変化の振幅３１を計測し、その差を測定すると、複合体に対応するシグナル変化は大きいが、蛍光体単独でのシグナル変化は小さい。これは２種類の周波数Ｆ１，Ｆ２が複合体の緩和振動周波数（蛍光変化が小さくなり始める周波数）を挟むように設定されているからである。この緩和振動周波数は複合体分子構造特有の値を示すため、複数の分子が混合した状況においても正確に定量することが可能である。
【００７２】
また、分子によっては、図１３の曲線１５０１に示すように、変調蛍光シグナルが特定の周波数（共鳴周波数）でピークを持つ場合がある。このとき、この分子は振動あるいは回転が共鳴振動しており、２つの周波数Ｆ１，Ｆ２を図１３に示すように設定することによって、より大きなシグナルを得ることが可能となる。
【００７３】
［実施例５］
本実施例は、混合溶液中に含まれる複数種類の定量対象分子を同時に計測するために実施例４の方法を応用する例である。
【００７４】
図１４は、本実施例の生体分子計測システムの構成例を示す概略図である。本システムでは２種類の蛍光波長の蛍光分子を同時に計測するために、ローパスフィルタを１つ用いた。ローパスフィルタ１２０１として、特定の波長より長い光は通過させ、短い光は反射する誘電体多層膜フィルタを用いた。本実施例では蛍光分子はＧＦＰとＲ−フィコエリスリンの２種類であり、５６０ｎｍのローパスフィルタを用いた。蛍光分子の種類の数を増やすためにはこのローパスフィルタを波長の短いものから順次直列に（図１４の上の方向に）挿入していけばよい。
【００７５】
また、一つの定量対象分子に結合する蛍光プローブの結合位置を計測するために、電荷や電気双極子モーメントをもった電荷プローブを用いる。これを説明するために、図１５に、２種類の定量対象分子であるｍＲＮＡに２色の蛍光プローブを用いた例を示す。
【００７６】
電荷プローブ１１０３は実施例１と同様に２７ベースのＰＮＡである。ＰＮＡの１５ベースのポリＴ領域が定量対象分子であるｍＲＮＡ１（１１０１）及びｍＲＮＡ２（１１０２）のポリＡ配列とハイブリダイズし、これによって大きな電気双極子モーメントを生成する。これによって、既知配列の既知の位置に電気双極子モーメントによる電気力を集中させることができる。この末端から１００ベース程度離れた領域の３０ベースの領域にＤＮＡ蛍光プローブ１１０４又は１１０６をハイブリさせ、さらに３００ベース程度離れた領域にＤＮＡプローブ１１０５又は１１０７をハイブリするようにさせる。これらの蛍光プローブを構成する蛍光分子１１０４，１１０７はＧＦＰ、蛍光分子１１０５，１１０６はＲ−フィコエリスリンであり、波長４８８ｎｍのレーザ励起に対してそれぞれ５１０ｎｍ及び５７５ｎｍで発光するため、これらの蛍光像を別々に得ることができる。
【００７７】
図１１と同様の変調電界を印加したとき、位相シフト量が電荷プローブと蛍光プローブの距離で異なるため、電荷プローブを基準としてどのような順序でＧＦＰとＲ−フィコエリスリンが並んでいるかを判定することが可能である。
【００７８】
すなわち、ｍＲＮＡ１の場合には５１０ｎｍ（ＧＦＰ）の発光の位相シフトは５７５ｎｍ（Ｒ−ＰＥ）の発光の位相シフトより小さく、ｍＲＮＡ２の場合には位相シフトの大小が逆転するため、同じように２種類の蛍光分子がハイブリダイズによって結合した場合でもその結合位置を位相シフト量で判定し、区別することが可能である。
【００７９】
本例では蛍光による発光波長は２種類であったが、励起レーザの波長数も増やして、更に多くの蛍光波長を同時に計測することが可能である。その発光波長の数をｎとすると、ｎの階乗分の組み合わせの蛍光ラベルが得られたことになり、非常に多数の種類の定量対象分子を同時に計測することが可能となる。
【００８０】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００８１】
１ レーザ光源
２ 励起光
３ 光学素子
４ 視野レンズ
５ ダイクロイックミラー
６ 対物レンズ
７ 容器
８ サンプル溶液
９ 計測領域
１１ 定量対象分子
１２ 蛍光プローブ
１３ 複合体
１４ 結像レンズ
１５ 撮像素子
１６ 遷移双極子モーメントの方向
２０，２１ 信号発生器
２２ 位相シフタ
２３〜２６ 電極
２７ 演算部
５１ 蛍光分子
５２ 結合分子
５３ 複合体
７１ 石英基板
７２〜７５ 電極
７６ 直流電源
８１ 定量対象分子
９０ 複合体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子計測システム及び生体分子計測方法に関し、例えば、遺伝子発現解析、細胞機能解析、免疫分析及び病気の診断、創薬などに適用できる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析や細胞機能解析、免疫分析においては、蛍光による定量分析が感度と精度の面で有用である。この蛍光による定量分析では、蛍光分子を定量対象分子と結合させて複合体とし、この複合体の量を蛍光量に対応させて定量する。ここで、蛍光分子を定量対象分子と結合させた後、結合しなかった過剰な蛍光分子を定量対象分子が含まれる溶液から取り除く必要のない、一般にホモジニアスアッセイと呼ばれる方法は簡便であり、かつ測定時間が短いという点で有用である。しかし、ホモジニアスアッセイはＳＢ比が低いという問題がある。なぜなら、ホモジニアスアッセイでは、多くの場合、定量対象分子と蛍光分子が結合したときのみ蛍光を発する機構を有するが、実際には非結合の蛍光分子も弱い蛍光を発し、この蛍光がバックグラウンド（＝Ｂ）となる。このバックグラウンドは、（測定領域内の非結合蛍光分子の数）×（１つの非結合蛍光分子が発する蛍光強度）に比例し、シグナル（＝Ｓ）は（測定領域内の定量対象分子数）×（１つの結合分子が発する蛍光強度）に比例する。蛍光分子数は未知数である定量対象分子数よりも必ず多い必要があるため、定量対象分子数が少ない場合には、結合した蛍光分子数に比べて非結合蛍光分子数の方が何ケタも多いことが普通である。そのため、非結合の蛍光分子１分子の蛍光強度がかなり低くてもＳＢ比は大幅に低下する。
【０００３】
ホモジニアスアッセイにおけるＳＢ比改善の効果的な方法は、励起レーザ光を十分に絞り、計測領域を小さくすることである。実際に、励起レーザ光を回折限界まで絞り、共焦点光学系により狭い領域からの蛍光を測定し時間相関関数を得るというＦＣＳ（蛍光相関分光法）は、有効なホモジニアスアッセイ法として知られる（非特許文献１）。これらの方法はｎＭ〜μＭオーダー（一分子あたりのＳＢ比によってはｍＭオーダー）の高い濃度の蛍光分子の存在下でも高いＳＢ比を得ることができる。
【０００４】
一方、ｒＦＬＩＭ（anisotropic Fluorescent Imaging Microscopy）という技術が知られている（非特許文献２）。この技術は、蛍光分子の回転緩和時間を２次元平面上で同時に計測し、イメージングする技術である。蛍光分子の双極子の方向が溶媒分子によるブラウン運動によってどの程度維持されるかを測定する方法が知られている。この方法は、回転緩和特性が非結合蛍光分子と、定量対象分子と蛍光分子が結合した複合体との間で異なることを利用して計測できるため、ホモジニアスアッセイ法として利用することも可能である。
【０００５】
一方、特許文献１〜３には、定量対象分子を捕捉した基板表面に非結合の蛍光分子が非特異に吸着し、洗浄できずに残ってしまうという問題を緩和する方法が記載されている。この方法は、基板とこれに対向する基板の間に変調電界を印加し、定量対象分子と蛍光分子の複合体は電界に応答して基板との距離が変化し、蛍光強度が変化するが、吸着した蛍光分子は蛍光強度が変化しないことを利用する。また、この基板との距離の変化を使って、蛍光ラベルを用いない定量方法のバックグラウンドシグナルを抑制する方法も知られている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１２７８０４号公報
【特許文献２】特開２００９−０８５６３６号公報
【特許文献３】特開２００９−０８５６３４号公報
【特許文献４】特開２００６−０７１３００号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】T. Sonehara et al., “Improvement of biomolecule quantification precision and use of a single-element aspheric objective lens in fluorescence correlation spectroscopy.” Anal. Chem. 78, (24), pp. 8395-8405, (2006)
【非特許文献２】H. Andrew etal., ”Dynamic Fluorescence Anisotropy Imaging Microscopy in the Frequency Domain (rFRIM)” Biophys Journal 83, pp. 1631-1649, (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の蛍光分子を用いたホモジニアスアッセイでは、定量対象分子と蛍光分子の結合による蛍光波長又は蛍光強度又は蛍光寿命又は回転緩和時間など、結合による受動的な物理量の変化を計測することによって、非結合の蛍光分子中の結合蛍光分子を定量し、定量対象分子を測定していた。
【０００９】
しかし、ホモジニアスアッセイはＳＢ比が低いという問題がある。これを避けるためにレーザを絞りこみ、極狭い領域からの蛍光を計測方法が知られている。しかし、この方法では、レーザ照射領域が小さいため、同時に計測できるサンプルの容積あるいは面積が小さく制限され、スループットが低下するという問題があった。
【００１０】
さらに、このスループットの問題を避けるため、平面内あるいは空間内に広がった領域中の蛍光分子を同時に計測しようとするとき、一つの受光デバイス（撮像素子の場合には一つピクセル）に入射する非結合蛍光分子の数が非常に多いためＳＢ比が低下する問題があった。この問題は、撮像素子を使わずに単一又は複数の受光素子を用いる場合にも同様に発生する。
【００１１】
ｒＦＬＩＭは、スループットの問題を解決するが、ＳＢ比の問題は解決されない。また、強い蛍光を発する蛍光体の場合、回転緩和時間より蛍光寿命が短いため、回転による大きな蛍光変化を定量対象分子で得ることは困難である。逆に、蛍光寿命の長い蛍光分子は本質的に蛍光強度が弱いという欠点を持つ。
【００１２】
さらに、基板上に定量対象分子を捕捉し、変調電界を印加して蛍光分子と基板との距離を変化させながら蛍光を計測することによって、基板上に吸着している非結合分子などの蛍光を分離する方法は、分子を固体表面に必ず固定する必要があるため、蛍光分子の固体表面への非特異吸着の問題を内包している。また、固体表面での計測では、定量対象分子と蛍光分子が複合体を形成する反応が溶液中に比べて遅く、効率も低いという問題が生じることが多い。さらに、この方法は本質的に基板が必要であり、溶液中での定量、細胞中での定量に適用できない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
以下では、説明に２種類の双極子モーメントが現れるのでこれを定義する。
蛍光分子の光吸収遷移にかかわる電気双極子を遷移双極子（モーメント）と呼び、その方向を、次で定義する。すなわち、蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が励起光の偏光方向と一致したとき最大の励起光吸収が起き、最大の蛍光が生じるが、最大の蛍光が得られた時の偏光方向を遷移双極子モーメントの方向と定義する。なお、パルスレーザを用いて励起したとき、最大吸収の偏光方向と蛍光の偏光方向は一致しないが、これは、分子の回転によって遷移双極子モーメントが回転するために生じる。
【００１４】
定量対象分子と蛍光分子及び結合分子の複合体がもつ電気双極子モーメントの方向及び大きさは、この複合体に属するすべての電荷のうちの正の電荷の重心位置と負の電荷の重心位置を求め、後者から前者に至るベクトルを電気双極子モーメントの方向とする。
【００１５】
なお、一般に、特定の周波数の変調電界を印加したときに応答する蛍光分子の電気双極子モーメントの方向と前記遷移双極子の方向は一致するとは限らない。
【００１６】
本発明の生体分子計測システムは、定量対象となる生体分子、蛍光分子、並びに生体分子及び蛍光分子と複合体を形成するための結合分子を含有する溶液を保持する保持部と、偏光した励起光を溶液に照射する励起光源と、溶液に方向が周期的に変化する変調電界を印加する電界印加部と、励起光照射によって蛍光分子から発生された蛍光を検出する受光部と、受光部による蛍光検出信号を処理する演算部とを有する。複合体は電気双極子モーメントを持ち、変調電界の印加によって複合体中の蛍光分子の遷移双極子モーメントの方が励起光の偏光方向又は偏光面に対して周期的に変化する。演算部は、変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングの蛍光検出信号から最小になるタイミングの蛍光検出信号を減算した値を複数周期にわたって積算する処理を行う。
【００１７】
本発明の一態様においては、受光部は撮像素子を有し、蛍光検出信号は蛍光スポット像である。このとき、演算部は、変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングで取得した第１の蛍光スポット像から最小になるタイミングで取得した第２の蛍光スポット像を対応する画素毎に減算した差分画像を複数周期にわたって積算する処理を行い、得られた積算画像をもとに一分子ずつカウンティングによって生体分子を定量する。
【００１８】
本発明の生体分子計測方法は、定量対象となる生体分子と、遷移双極子モーメントを有する蛍光分子と、結合分子とを含み電気双極子モーメントを有する複合体を形成する工程と、複合体を含有する溶液に、方向が周期的に変化する変調電界を印加した状態で、偏光した励起光を照射する工程と、励起光照射によって蛍光分子から発生された蛍光信号を検出する検出工程と、変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングの蛍光信号から最小になるタイミングの蛍光信号を減算した値を複数周期にわたって積算する処理工程と、を有する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、ホモジニアスアッセイにおいて高スループットで高ＳＢの計測が可能になる。このとき、固体表面への固定化が必ずしも必要ない。また、複数種類の蛍光分子を用いて多数の分子の同時定量が可能となる。
【００２０】
上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明による生体分子計測システムの一例を示す概略構成図。
【図２】電極に印加される変調電圧と蛍光強度変化の例を示す模式図。
【図３Ａ】電界方向がＥ１及びＥ３の場合の蛍光スポットの模式図。
【図３Ｂ】電界方向がＥ２の場合の蛍光スポットの模式図。
【図４】蛍光カウンティングによるデータ取得方法を示すフローチャート。
【図５】電極に印加される変調電圧と蛍光強度変化の例を示す模式図。
【図６】測定領域の拡大模式図。
【図７】電極に印加される変調電圧と蛍光強度変化の例を示す模式図。
【図８】本発明による生体分子計測システムの他の例を示す概略構成図。
【図９Ａ】電界方向Ｅ１のときの基板表面付近の分子の配向の様子を示す模式図。
【図９Ｂ】電界方向Ｅ２のときの基板表面付近の分子の配向の様子を示す模式図。
【図１０】本発明による生体分子計測システムの他の例を示す概略構成図。
【図１１】電極に印加される変調電圧と励起光照射、露光のタイミングの例を示す模式図。
【図１２】変調電界の周波数に対する蛍光強度変化の振幅の変化を示す模式図。
【図１３】変調電界の周波数に対する蛍光強度変化の振幅の変化を示す模式図。
【図１４】本発明による生体分子計測システムの他の例を示す概略構成図。
【図１５】測定領域内の模式図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明では、溶液中に方向が変化する変調電界を印加することによって、蛍光分子と定量対象分子が結合したときのみ有効に蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向を振動させる。これによって、定量対象分子と複合体を形成した蛍光分子からの蛍光と定量対象分子に結合していない非結合の蛍光分子からの蛍光を分離して、前者のみを定量できるようにする。すなわち、複合体の蛍光強度のみを振動させるようにし、蛍光の振動成分を抽出することにより、非結合蛍光分子からの蛍光（すなわちバックグラウンド蛍光）を除去し、ＳＢ比の向上を図る。
【００２３】
また、非結合蛍光分子の遷移双極子モーメントが外部電界によって振動したとしても、複数の周波数変調電界に対する蛍光強度の振動振幅や変調電界に対する位相遅れを計測し、これらから適切に選ばれた線形演算の結果から、複合体と非結合蛍光体とを分離することが可能である。すなわち、変調電界に対する蛍光の応答スペクトルの変化を用いて複合体の蛍光分子からの蛍光と非結合の蛍光分子からの蛍光の分離が可能であり、ＳＢ比を向上することができる。
【００２４】
また、複数の分子を同時に定量する目的に、変調電界に対する蛍光強度の応答スペクトル及び位相ずれの変化を用いることができる。すなわち、蛍光波長が異なる複数の蛍光分子が同時に１つの定量対象分子に結合するようにし、この定量対象分子に対する蛍光分子の結合位置（正確には電気双極子モーメントが集中し、電界による力が集中する点からの距離）によって、応答スペクトル、位相ずれが異なるようにすると、蛍光位置を区別することができる。これによって、複数色の蛍光分子の順序（配列）を定量対象分子と対応させることができ、多種類の定量対象分子を比較的少数の種類の蛍光分子を使って分離して定量することが可能である。
【００２５】
また、蛍光体の励起状態の寿命が回転緩和時間よりも短いという問題に対しては、励起レーザ光が特定の偏光成分のみを持つようにして、蛍光分子を振動させ、蛍光の励起効率を変調することによって蛍光強度を変調するため、蛍光の励起キャリア（電子）の寿命の影響を受けない。もちろん、分子回転緩和を測定して、複合体と非結合蛍光分子を分離する分解能を向上させる目的に用いても構わない。
【００２６】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
［実施例１］
この実施例は、溶液中に分散したＤＮＡ又はＲＮＡのうち特定の配列を持つものを定量対象分子として定量するために、この配列の一部と相補的な配列を持つ蛍光プローブを用いる例である。
【００２７】
図１は、本実施例の生体分子計測システムの構成例を示す概略図である。発振波長４８８ｎｍの半導体レーザ光源１から直線偏光の励起光２を出力する。光学素子３は、蛍光プローブの蛍光双極子の動きに対応して、所望の偏光状態を得るための素子である。本実施例の場合には円偏光と直線偏光の両方が適用可能であるが、ここでは図１の紙面に並行な直線偏光（図１中、矢印３３の方向）になるように、直線偏光子を用いた。偏光状態を調整された励起レーザ光を、サンプル中の照射領域を調整するための視野レンズ４、励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラー５、対物レンズ６（ＮＡ＝０．８×４０）を通して、サンプル溶液８中の計測領域９に照射する。ここで、サンプル溶液８には、定量対象分子１１と蛍光プローブ１２が含まれている。蛍光プローブ１２は、蛍光分子、及び蛍光分子と定量対象分子１１との選択的結合を助ける結合分子が結合した分子である。これらは計測前に、サンプル溶液の保持手段である容器７に導入する。容器７は、ＸＹＺ方向に移動できるステージに搭載され、計測領域を任意に変更できる。また、サンプル溶液８の導入及び排出は、容器７に樹脂製チューブを複数接続し、シリンジポンプを用いて行う。容器７は石英ガラスを用いて作製したが、サイクリックポリオレフィン等の非蛍光性樹脂や半導体を用いてもよい。
【００２８】
図１には、計測領域９の拡大模式図１０をあわせて示した。定量対象分子１１であるｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）は、蛍光プローブ１２と結合して複合体１３を形成する。複合体１３を形成させるために、蛍光プローブ１２には結合分子としてｍＲＮＡの５’又は３’末端にハイブリダイズするＰＮＡ（Peptide Nucleic Acids：ペプチド核酸）オリゴマを用いた。また、蛍光分子としてはＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）を用いた。ＰＮＡとＧＦＰは、複数の結合サイトで化学結合を行って、ＧＦＰの遷移双極子モーメントの方向とＰＮＡ分子の長手方向の間の角度がブラウン運動によって大きく変化することがないようにした。ＰＮＡの鎖長は２７ベースとした。蛍光プローブ１２と定量対象分子１１の複合体１３が大きな電気双極子モーメントを持つように、ＰＮＡとｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは配列の末端の一部だけで起こるように配列を決定し、一本鎖の領域に正の電荷を保持できるようにリジンのペプチドを１０分子重合させている。ＰＮＡは一般に電荷をもたないため、ＰＮＡとＤＮＡがハイブリダイズ（ｍＲＮＡとＰＮＡの結合を意味する）した領域とＤＮＡのみの領域は負の電荷をもち、ＰＮＡのみの領域は正の電荷をもつ。このため複合体分子に大きな電気双極子モーメントを出現させることができる。
【００２９】
複合体分子に大きな電気双極子モーメントを出現させる方法としては、ＰＮＡのすべての塩基に正の電荷をもたせる方法がある。この場合には、ＰＮＡは１塩基ごとに正の電荷をもち、ｍＲＮＡは負の電荷を持っている。ＰＮＡの配列をｍＲＮＡの末端に合わせ、かつ１０ベース程度余らせるようにハイブリダイズさせることによって、ハイブリダイズした１７ベースの領域では電荷がほぼキャンセルされ、ＰＮＡ側には正の電荷がｍＲＮＡ側には負の電荷が露出する。
【００３０】
一方、ｍＲＮＡと複合体を形成していない蛍光プローブ１２は、複合体１３に比べるとごく小さな電気双極子モーメントしか持っていない。複合体の電気双極子モーメントをさらに大きくするためには、ｍＲＮＡとの選択的結合に必要な１３〜１８ベースのＰＮＡの先端の一本鎖のＰＮＡを長くして、正の電荷量を増やすことが有効であるが、市場で入手可能なＰＮＡの鎖長は現在のところ２７ベースに制限されている。本来は数百ベース程度のＰＮＡを結合分子として利用することが望ましいが、その塩基長は測定対象分子の大きさや、目標とする測定時間や精度、同時に測定する物理量に応じて最適な長さを選ぶべきである。
【００３１】
最後に、励起光の照射によって得られた蛍光分子像は対物レンズ６と結像レンズ１４で撮像素子１５である冷却ＣＣＤ上に結像される。撮像素子１５で撮像された画像は演算部２７で処理される。
【００３２】
計測領域９の拡大模式図１０には、電界がＥ１の方向に印加されている瞬間の状態を示している。図は、蛍光分子ＧＦＰの遷移双極子モーメントの方向がＰＮＡ鎖の長手方向と一致するようにＧＦＰとＰＮＡが固定できた場合を描いている。図中の矢印１６が遷移双極子モーメントの方向を示す。なお、遷移双極子モーメントの方向をすべての蛍光分子について一致させることができなかったとしても、後述するように、撮像素子にて蛍光ポットを計測する場合には、蛍光強度の変化の位相が分子ごとに変わるだけで計測精度には影響がない。
【００３３】
このとき、定量対象分子であるｍＲＮＡと複合体を形成していない蛍光プローブ１２中のＧＦＰの遷移双極子モーメントの方向は電界の方向と関係なくランダムな方向を向いている。一方、ＰＮＡの末端に正の電荷を多数持つため、複合体１３の電気双極子モーメントと印加電界の積は十分大きく、複合体１３の電気双極子モーメントの方向３０は、電界Ｅ１の方向と一致する。その結果、遷移双極子モーメントの方向も電界Ｅ１の方向と一致する。印加電界の方向をＥ１→Ｅ２→Ｅ３→Ｅ２→Ｅ１→Ｅ２と周期的に変化させると、この電界印加方向の変化の周波数が複合体の緩和振動周波数よりも小さく、複合体の運動が電界の変化に追随できれば、複合体の動きにあわせて、複合体中の蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向もそれぞれの瞬間の電界の方向を向く。励起光の偏光方向３３は、ベクトルＥ２に垂直な平面とベクトルＥ１とＥ３が張る平面が交わる直線に平行となるように設定している。
【００３４】
上述のように方向が変調される変調電界を発生するために、サンプル混合溶液８中に浸された４つの電極２３，２４，２５，２６と、電極に信号を入力する信号発生器２０，２１及び、２つの信号発生器２０，２１の間の位相を調整するための位相シフタ２２を設けた。なお、所望の電圧振幅を得るために、信号発生器には高出力アンプが接続されている。
【００３５】
図２に、信号発生器２０から出力され、電極２３，２４間に印加される電圧と、信号発生器２１から電極２５，２６間に印加される電圧、及び、撮像素子１５で得られる複合体１３に対応する蛍光スポットの蛍光強度（蛍光スポットの積分値）の変化を模式的に示す。電極への印加電圧を示す上の２つのグラフにおいて、それぞれ電極２３，２５に正の電圧を印加するときグラフ上で正の値を示すように描いた。実線で示した波形３４，３５は、正弦波での印加電圧波形を示している。また、破線で示した波形３６，３７は、より好ましい印加電圧の波形を示している。波形３６，３７で電圧印加した場合について詳細に説明すると、電界Ｅ１を印加するときは、電極２３を正に、電極２４を負に設定し、電極２５，２６には電圧を印加しない。電界Ｅ２を印加するときは、電極２３，２５に正の電圧を、電極２４，２６に負の電圧を同じ電圧値で印加する。電界Ｅ３を印加するときは、電極２５を正に、電極２６を負に設定し、電極２３，２４には電圧を印加しない。
【００３６】
破線の電圧印加波形と実線の電圧印加波形の違いは、実線で示した正弦波の波形３４，３５で電圧印加した場合には、Ｅ２方向に電圧を印加する場合の電圧強度が低下するという問題があり、破線で示した波形３６，３７で電圧印加した場合にはこの問題がないという点にある。
【００３７】
印加電圧はいずれも最大３００Ｖとし、電極２３，２４間及び電極２５，２６間の間隔を１ｍｍとした。このとき、複合体１３の電気双極子モーメントに加わる静電エネルギーは３３ｍｅＶと室温におけるｋＴ＝２６ｍｅＶよりも大きく、複合体の分極方向が安定に維持される。
【００３８】
印加電圧の周波数は１ｋＨｚとした。周波数は、矩形波を正弦波に変換して考えると明確になる。また、変調電界の周波数は、定量したい分子複合体が電界に応答できる限界の周波数（緩和振動周波数）以下であれば、どのような周波数でもよい。
【００３９】
蛍光強度は、図２のように振幅３１で周期的に変化するので、各周期ごとに検出した振幅３１の信号を積算して、複合体１３からの蛍光シグナルとする。具体的には、電界Ｅ１が印加されているときの蛍光強度から電界Ｅ２が印加されているときの蛍光強度を減算したものを複合体１３からの蛍光シグナルとする。また、電界Ｅ３が印加されているときの蛍光強度から次に電界Ｅ２が印加されているときの蛍光強度を減算したものを複合体１３からの蛍光シグナルとする。そして、これら各周期の蛍光シグナルを加算処理する。このような変調電界を印加しても、複合体を形成していない蛍光分子からの蛍光は時間的にランダムに変化するので、この和の操作によって値がほぼ０となり、バックグラウンドが抑圧されＳＢ比が大幅に向上する。
【００４０】
実際には、上記のような変調シグナル取得を、複合体１分子に対応する蛍光スポット一つひとつについて実行する。図３Ａ及び図３Ｂに、蛍光スポットの模式図を示す。図３Ａは電界方向がＥ１及びＥ３の場合の蛍光スポットの模式図であり、図３Ｂは電界方向がＥ２の場合の蛍光スポットの模式図である。
【００４１】
まず、電界方向がＥ１又はＥ３に設定されている場合の蛍光スポットである図３Ａについて説明する。スポット４１，４３は定量対象分子と蛍光分子が複合体を形成している状態の蛍光スポットを示しており、このスポットの数を数えることによって定量対象分子を定量する。一方、スポット４５，４７は、定量対象分子と複合体を形成していない非結合の蛍光分子に対応する蛍光スポットである。このスポットは本来カウントしてはいけないが、蛍光強度は無視できない強度を有し、その強度はスポットによっても異なる。この蛍光スポット４５，４７を定量対象分子に対応するスポットとしてカウントすると、バックグラウンドカウントを増やしてしまい、ＳＢ比を低下させる。
【００４２】
次に、図３Ｂを参照して、電界の方向をＥ２に変えた時の蛍光スポットの状態を説明する。図３Ｂに示した蛍光スポット４２，４４，４６，４８は、図３Ａに示した蛍光スポット４１，４３，４５，４７に一対一に対応し、それぞれ同じ蛍光分子から発生された蛍光が検出されたものである。複合体を形成している蛍光分子に起因する蛍光スポット４２，４４は、図３Ａのスポット４１，４３に対して蛍光強度が大きく変化する。すなわち、このとき複合体１３電気双極子モーメントの方向３０は電界の方向Ｅ２を向き、複合体１３を形成している蛍光体の遷移双極子モーメントの方向１６も励起光の偏光方向３３と直交するＥ２の方向を向くため、蛍光強度は低下する。こうして、複合体１３を形成している蛍光分子に起因するスポットの蛍光強度は、電界方向を変化させたとき、その変化に追随して規則的に変化する。一方、複合体を形成していない非結合の蛍光分子に起因するスポット４６，４８の蛍光強度は、蛍光分子のブラウン運動による回転によって、時間的にランダムに変化する。すなわち、非結合の蛍光分子に起因するスポットは、電界方向の変化の影響を受けず、もっぱら蛍光分子のブラウン運動による回転によって、ランダムに変化する。
【００４３】
本実施例では、図３Ａと図３Ｂで同じ位置の対応する蛍光スポットの蛍光強度の差を、それぞれの蛍光スポットからの信号強度として抽出する。そして、印加する電界の方向を周期的に変化させて各周期ごとに抽出した信号強度を積算し、最終的な複合体の蛍光スポットに対応するシグナルとする。ここで、電界方向を周期的に変化させて、図３Ａのスポット４５と図３Ｂのスポット４６の蛍光強度の差や、図３Ａのスポット４７と図３Ｂのスポット４８の蛍光強度の差を積算すると、積算信号強度を積算数で割った平均値は０に収束する。こうして、複合体を形成していない非結合の蛍光分子を誤ってカウントする確率が低下し、ＳＢ比を大幅に向上させることができる。
【００４４】
図３Ａ及び図３Ｂのように強度変調されたシグナルを得るためには、撮像素子の露光時間を素子に入射する蛍光強度が最大になる時刻と最小になる時刻に合わせる必要がある。図２の時間軸方向の矢印３２は、露光のタイミングと露光時間を示したものである。露光開始時刻と露光終了時刻は電界印加方向の変調と同期して決定する必要があり、そのための同期信号が信号発生器２０又は２１から信号線２８を通して撮像素子１５に伝えられる。タイミングの位相調整機能は撮像素子１５の制御回路内部に設置した。
【００４５】
また、露光時間が制限されたことによる受光強度の低下を補うために、イメージインテンシファイアを撮像素子と結像レンズの間に挿入して使用することも可能である。このとき、イメージインテンシファイアのゲート機能が、撮像素子のシャッターの役目を果たす。
【００４６】
図４は、このような蛍光カウンティングによるデータ取得方法を示すフローチャートである。演算部２７では、図４のフローチャートに従ったデータ処理を行い、定量対象分子の濃度を求める。上記内容と重複する部分も含めて説明すると、次のようになる。
【００４７】
蛍光スポット像が、図２に矢印３２で示した露光時間に対応して、多数得られる。このような画像の例が図３Ａ及び図３Ｂである。まず、蛍光スポットの位置を抽出し（Ｓ１１）、この位置での蛍光強度の振幅が最大となるように位相シフタ２２で変調印加電圧の位相を調整する（Ｓ１２）。その結果、図２に示すように、蛍光強度の最大値とＥ１，Ｅ３方向の電界印加時刻、及び蛍光強度の最小値とＥ２方向の電界印加方向時刻を合わせることができる。この後、各蛍光スポットについて、Ｅ１，Ｅ３方向に電界が印加されたときの蛍光強度の積算値からＥ２方向に電界が印加されたときの蛍光強度の積算値を差し引く。具体的には、それぞれの蛍光スポットごとに、Ｅ２のタイミングで取得した蛍光強度に−１を掛けて、Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３のタイミングで計測された蛍光強度を積算する。すなわち、Σ（シグナル最大値）−Σ（シグナル最小値）を計算する。これによって各スポットの蛍光強度の変調成分を抽出することができる。この後、ある閾値以下の蛍光スポットを排除して、蛍光スポットを数え上げ（Ｓ１４）、測定対象溶液の容量の情報と併せて、定量対象分子の濃度を決定することができる（Ｓ１５）。このときの閾値としては、例えば、バックグラウンドレベルにバックグラウンドの標準偏差の３倍を足した数値とすることができる。
【００４８】
このような蛍光検出方法は、一分子ごとに蛍光スポットを識別しない場合に対しても適用可能である。たとえば、撮像素子の撮像面の一部あるいは全面で一括して計測される蛍光強度について、あるいはフォトダイオードのような光検出器で計測される蛍光強度について、蛍光強度の最大値と最小値を繰り返し計測できるように上記と同様に変調電界の位相を調整し、変調成分を上記と同様に抽出することによって、バックグラウンド蛍光の影響を少なくして蛍光強度を計測することが可能である。この場合には、蛍光強度の最大値と最小値の差が、定量対象分子の数、すなわち濃度に対応する。なお、以下の実施例でも同様に蛍光検出器として光検出器を用いることが可能である。
【００４９】
一般に、蛍光をカウンティングによって計測する場合には、スポットが存在しない領域（図３Ａ、図３Ｂの黒い背景領域）に対応するシグナルは、スポット位置を抽出した時点で排除できる。そのため、バックグラウンド発光の影響を少なくすることが可能となる。本実施例では、この効果に加えて、変調電界に対する蛍光強度の変調成分のみを計測することによって非結合蛍光分子からの信号を排除し、さらにＳＢ比を向上させている。
【００５０】
また、励起光を連続的に照射すると、蛍光分子が劣化する（退色する）という問題が生じる。この問題を緩和するために、励起レーザ光をパルス状にして、露光時間３２と同時刻だけ、計測領域にレーザを照射するように、信号線２９を通して同期信号をレーザ光源１に送る。本実施例では半導体レーザを用いているため、レーザ駆動回路に直接この同期信号を入力し、適切な位相調整を行って、パルス状の励起レーザ光を生成している。パルスレーザを発生する方法として、他にＣＷレーザとＡＯＭ（Acoustic Optical Modulator）やＥＯＭ（Electro Optic Modulator）を用いる方法も可能である。
【００５１】
本実施例では変調周波数が低いことから、電極２３〜２６の表面をＳｉＯ2，Ｓｉ3Ｎ4や樹脂等の絶縁膜で覆うことはしていない。そのため、電極表面での電子の授受によって電気分解反応が起きて、気泡が発生する。このため、この気泡が計測領域９やレーザの光路に干渉しないように電極を配置している。周波数が十分高い（下限の周波数はイオン強度によって異なる）場合には、電極２３〜２６の表面を絶縁膜で被覆しても、溶液中に有効に変調電界を印加することが可能である。そうすれば、気泡の発生は抑えることができる。絶縁膜がない場合でも、変調周波数が上がれば気泡の発生は抑圧することができるが、電圧信号のバイアスレベルとデューティー比の調整が必要で、自由なデューティー比の設定ができなくなる。
【００５２】
印加電界の波形は、図２に示した波形以外にも様々な波形を用いることができる。図５は、他の印加電圧波形を示す図である。ここでも変調電圧の最も基本となる正弦波を実線で示し、より好ましい矩形波を破線で示した。このとき、定量対象分子と蛍光プローブの複合体は変調電界の印加によって回転することになる。そのため、蛍光分子の遷移双極子モーメントを励起レーザの偏光方向と完全に一致させることが可能となり、受光蛍光強度変化は最大となり、シグナルを最大化することができる。
【００５３】
この実施例では定量対象分子としてｍＲＮＡを用いたが、ｍＲＮＡは比較的溶液中に活性が残りやすいＲＮａｓｅによって分解されやすいため、逆転写酵素によってｃＤＮＡに転写してから定量することもできる。また、ＲＮＡやＤＮＡなどの核酸の場合には中性に近いｐＨ条件で負の電荷をもつため、この電荷を複合体の電気双極子モーメント形成に利用したが、他の電荷や電気双極子モーメントをもたない分子の場合には、正負２種類の電荷をもった結合分子を使って複合体を形成するようにするか、大きな電気双極子モーメントをもった１つの結合分子を定量対象分子に選択的に結合させることによって、上記計測を実現してもよい。
【００５４】
さらに、定量対象分子が最初から大きな電気双極子モーメントを持っている場合には、電荷や電気双極子モーメントを後から複合させる必要がないことはいうまでもない。
【００５５】
［実施例２］
次に、蛍光分子と結合分子から形成した蛍光プローブを定量対象分子と結合させて複合体を形成するのではなく、３種類の役割の分子を混合することによって定量対象分子の定量を行う実施例について説明する。
【００５６】
本実施例の生体分子計測システムの構成は図１と同じである。また、測定領域にＥ１，Ｅ２，Ｅ３のように方向が周期的に変化する変調電界を印加し、図４のフローチャートで説明したように蛍光画像を処理して蛍光スポットの数を計数する方法、あるいは光検出器で検出された蛍光強度を処理して定量対象分子の濃度を求める方法は、実施例１と同様である。
【００５７】
図６は、測定領域９の拡大模式図である。蛍光分子５１には、２本鎖に特異的にインターカレートするPicogreenを使用した。結合分子５２としては、実施例１と同様に２７塩基のＰＮＡを使用した。ターゲットであるｍＲＮＡ１１に結合分子５２のＰＮＡが結合すると２本鎖領域が生じる。すると、そこに蛍光分子５１であるPicogreenが選択的にインターカレートし、複合体５３を形成して蛍光を発生する。複合体５３の電気双極子モーメントの方向３０は、実施例１の場合と同様である。複合体５３を構成する蛍光分子５１の遷移双極子モーメントの方向は、図１の場合と異なり、ｍＲＮＡ又はＰＮＡ鎖の長手方向に対して垂直方向に向いている。
【００５８】
一部の蛍光分子５１は一本鎖のＰＮＡにも結合し、蛍光を発する。蛍光分子は、どの分子にも結合していない状態よりも一本鎖ＰＮＡに結合した方が強い蛍光を発するため、従来の計測方法ではＳＢ比が低下してしまう。本実施例の計測方法では、実施例１と同様に複合体５３からの信号を選択的に積算するため、高いＳＢを保つことができる。検出される蛍光は、複合体５３として結合している蛍光分子からの蛍光と、結合分子５２と結合した蛍光分子からの蛍光と、他の分子と結合していない蛍光分子からの蛍光の和である。複合体５３に結合している蛍光分子の蛍光強度は、変調電界に同期して周期的に変化するが、結合分子５２と結合した蛍光分子の蛍光強度と、他の分子と結合していない蛍光分子の蛍光強度は、ブラウン運動による分子の回転のために、変調電界と非同期でランダムに変化する。
【００５９】
蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が複合体５３の電気双極子モーメントの方向３０に対して垂直であるので、変調電界に対する複合体からの蛍光シグナルの関係は実施例１の場合とは異なる。図７に、図２と同様の変調電界を印加した時に検出される蛍光シグナルの波形を示す。本実施例では、電界方向がＥ２の時、すなわち励起光の偏光方向３３に垂直な時に、検出される蛍光強度は最大となり、電界がＥ１，Ｅ３方向のとき最小となる。また、電界方向がＥ１，Ｅ３の時に励起光の偏光方向と蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が一致しないため、蛍光強度は実施例１の場合に比べて最小値が０に近づかない。
【００６０】
［実施例３］
基板表面に定量対象分子を捕捉した状態で定量する実施例について説明する。本実施例では、定量対象分子と特異的に結合する結合分子を基板表面に固定し、基板表面上で蛍光分子との複合体を振動させ、蛍光の変調成分のみを計測することによって、ＳＢ比を向上させる。本実施例では定量対象分子を基板表面に捕捉するため、定量対象分子に結合していない蛍光分子が基板表面に非特異的に吸着し、これを完全に洗浄することが困難である。そのため、基板表面に吸着した蛍光分子からの蛍光と複合体からの蛍光とを分離して計測することが重要である。
【００６１】
図８は、本実施例の生体分子計測システムの構成例を示す概略図である。定量対象分子を捕捉するための石英基板７１は、サンプル混合溶液中に浸漬され、容器７に固定されている。基板７１の上下に透明電極７２，７３を設けた。透明電極７２，７３は、その間に直流電源７６から静電圧を印加し、基板に捕捉されて一端が基板に固定された複合体の自由端を基板表面から離し、複合体の運動をスムーズにするために用いた。もちろん、この電極間に変調電圧を印加してもよい。電極７４，７５が溶液中の電界の方向を変えるための電極であり、信号発生器２１に接続されている。４つの電極７２〜７５を用いて、図示したＥ１及びＥ２の２つの方向の間で電界方向を変調する。
【００６２】
図９Ａに電界方向Ｅ１の場合の基板７１表面付近の分子の配向の様子を模式的に示し、図９Ｂに電界方向Ｅ２の場合の様子を示す。定量対象分子８１は、抗原抗体反応を用いて捕捉できる抗原、例えばＡＦＰなどである。８２はこの抗原と特異的に結合する一次抗体である。この一次抗体８２を基板表面に補足するための抗抗体抗体８３は、一次抗体８２が溶液に投入される前に、シランカンプリング剤８４を用いて石英基板上に固定されている。８５は一次抗体８２に補足された抗原に特異的に結合する二次抗体、８６はこの２次抗体８５に特異的に結合する抗抗体抗体である。１次抗体と２次抗体の間の選択性はない。抗体８６は、ＧＦＰ８７及び負電荷をもった２本鎖ＤＮＡ８８とサンプル溶液に投入される前に結合されているものを用いる。ＧＦＰは、その遷移双極子モーメントの方向８９が抗抗体抗体８６の分子の向きに対してほぼ固定されるように化学的に結合している。定量対象分子８１を含む複合体９０の分子の向きに対応して、ＧＦＰの遷移双極子モーメントの向きが固定されることになるため、電界をＥ１とＥ２の向きの間で変調すると、図９Ａの状態と図９Ｂの状態との間で遷移することになる。これによって、複合体９０を形成した分子のみが変調電界に同期して姿勢を変え、複合体９０に起因する蛍光強度が変調されることになる。
【００６３】
電界Ｅ１の時に最大の蛍光強度を得るために、励起光の偏光状態は円偏光か互いに直交する２種類の直線偏光の均等な混合光とした。このとき、複合体を形成していないＧＦＰからの蛍光は、前述の実施例と同様の演算によってバックグラウンドから取り除くことができる。このような偏光を選んだ理由は、蛍光分子の遷移双極子モーメントがレーザ光照射方向に垂直な面内で回転した場合にも、蛍光強度が変化しないようにするためである。もちろん、蛍光分子の遷移双極子モーメントが特定の方向を向くように、レーザ光照射方向と垂直な方向にも０でない電界を印加して、この方向と平行な方向の偏光方向のレーザで励起を行っても良い。ただし、この場合には励起レーザ光は直線偏光とする必要がある。
【００６４】
［実施例４］
受光する蛍光の偏光成分についての情報を得て、複合体と非結合の蛍光体の分離能を向上する本実施例について説明する。
【００６５】
図１０は、本実施例の生体分子計測システムの構成例を示す模式図である。対物レンズ６で集光された蛍光は、ダイロイックミラー５を通り、キューブ型の偏光ビームスプリッタ９１によって２つの偏光成分に分離され、結像レンズ１４ａ，１４ｂによって撮像素子１５ａ，１５ｂに結像され、同時に２つの撮像素子１５ａ，１５ｂにて蛍光像を得るようにする。このシステムによると、２つの撮像素子１５ａ，１５ｂにて同じ蛍光スポットの直交する偏光成分を同時に計測し、蛍光の偏光状態を計測することが可能となる。
【００６６】
もちろん、１つの撮像素子を用い、偏光ビームスプリッタ９１の代わりに偏光子を用いて偏光状態を選択してもよいが、その場合には、２つの偏光成分とトータルの蛍光強度を独立に計測することはできない。直交する２つの偏光成分を同時に計測することによって、蛍光強度と偏光方向を同時に計測することが可能となり、計測精度を向上させることができる。なぜなら、蛍光強度が何らかの原因で周期的に変化することがあり得るからである。
【００６７】
また、この方法によると、分子のサイズによって変調電界に対する応答性の違うことを利用して、特定のサイズの分子からの蛍光を選択的に得ることが可能である。ここでは、電界に対する応答の相違を、印加電界に対する蛍光シグナルの位相のずれによって計測する方法を説明する。
【００６８】
図１１は、変調された蛍光シグナルの変調電界に対する位相ずれを計測するために、励起レーザ光の照射タイミングと撮像素子による露光タイミングを説明する図である。変調電界は、最も単純な正弦波の場合を実線１００４，１００５で示し、より好ましい波形を破線１００６，１００７で示した。期間１００１は露光時間を示し、期間１００２はレーザ励起時間を示す。レーザ励起時間は変調電界と同じ位相になるように調整する。すなわち、レーザ励起時間と電界の最大値及び最小値が一致するように調整する。この条件で、蛍光強度が最大となるように露光時間の位相を調整し、露光と励起の同一位相の時間遅延として位相シフト量１００３を測定する。複合体の緩和時間を計測する。一般に、非結合の分子と複合体では、分子のサイズが異なるため、この位相シフト量が異なる。これにより精密に非結合蛍光分子からの蛍光の影響を排除することができ、ＳＢ比を向上することができる。なお、蛍光強度のグラフにはＳ偏光（紙面に平行な方向の偏光成分）の蛍光強度変化を示している。
【００６９】
また、これと同様の原理を使って、周波数の異なる２つの変調電界を交互に印加し、応答振幅３１又は位相シフト量１００３の変化量を蛍光スポットごとに測定することによってＳＢ比を向上することができる。２つの周波数を決定するには次のような操作を行う。一般に、変調電界に対する複合体の応答は、変調周波数が緩和振動周波数より大きくなると、位相シフト量が急激に大きくなり振幅が急激に低下する。既知の種類の定量対象分子を定量する場合、事前に複合体の緩和振動周波数を調べるために変調電界を本実施例の波形で周波数を低いものから高いものに順次変えていって、位相シフト量１００３と応答振幅３１が大きく変化する周波数を調べる。その周波数を挟んだ２つの周波数を前記２つの周波数として、周波数応答の変化を測定することによって、より厳密に複合体と非結合蛍光分子を分離して計測することができる。
【００７０】
さらに、位相シフトではなく、変調蛍光シグナルの振幅を用いて、複合体のみを定量することも可能である。
【００７１】
図１２は、変調電界の周波数に対する蛍光強度変化の振幅３１の変化を示す模式図である。図の横軸は印加電界の周波数、縦軸は蛍光強度変化の振幅である。実線１４０１は複合体に対応する曲線であり、破線１４０２は複合体を形成していない、非結合の蛍光体に対応する曲線である。上記と同様に２種類の周波数Ｆ１，Ｆ２での蛍光強度変化の振幅３１を計測し、その差を測定すると、複合体に対応するシグナル変化は大きいが、蛍光体単独でのシグナル変化は小さい。これは２種類の周波数Ｆ１，Ｆ２が複合体の緩和振動周波数（蛍光変化が小さくなり始める周波数）を挟むように設定されているからである。この緩和振動周波数は複合体分子構造特有の値を示すため、複数の分子が混合した状況においても正確に定量することが可能である。
【００７２】
また、分子によっては、図１３の曲線１５０１に示すように、変調蛍光シグナルが特定の周波数（共鳴周波数）でピークを持つ場合がある。このとき、この分子は振動あるいは回転が共鳴振動しており、２つの周波数Ｆ１，Ｆ２を図１３に示すように設定することによって、より大きなシグナルを得ることが可能となる。
【００７３】
［実施例５］
本実施例は、混合溶液中に含まれる複数種類の定量対象分子を同時に計測するために実施例４の方法を応用する例である。
【００７４】
図１４は、本実施例の生体分子計測システムの構成例を示す概略図である。本システムでは２種類の蛍光波長の蛍光分子を同時に計測するために、ローパスフィルタを１つ用いた。ローパスフィルタ１２０１として、特定の波長より長い光は通過させ、短い光は反射する誘電体多層膜フィルタを用いた。本実施例では蛍光分子はＧＦＰとＲ−フィコエリスリンの２種類であり、５６０ｎｍのローパスフィルタを用いた。蛍光分子の種類の数を増やすためにはこのローパスフィルタを波長の短いものから順次直列に（図１４の上の方向に）挿入していけばよい。
【００７５】
また、一つの定量対象分子に結合する蛍光プローブの結合位置を計測するために、電荷や電気双極子モーメントをもった電荷プローブを用いる。これを説明するために、図１５に、２種類の定量対象分子であるｍＲＮＡに２色の蛍光プローブを用いた例を示す。
【００７６】
電荷プローブ１１０３は実施例１と同様に２７ベースのＰＮＡである。ＰＮＡの１５ベースのポリＴ領域が定量対象分子であるｍＲＮＡ１（１１０１）及びｍＲＮＡ２（１１０２）のポリＡ配列とハイブリダイズし、これによって大きな電気双極子モーメントを生成する。これによって、既知配列の既知の位置に電気双極子モーメントによる電気力を集中させることができる。この末端から１００ベース程度離れた領域の３０ベースの領域にＤＮＡ蛍光プローブ１１０４又は１１０６をハイブリさせ、さらに３００ベース程度離れた領域にＤＮＡプローブ１１０５又は１１０７をハイブリするようにさせる。これらの蛍光プローブを構成する蛍光分子１１０４，１１０７はＧＦＰ、蛍光分子１１０５，１１０６はＲ−フィコエリスリンであり、波長４８８ｎｍのレーザ励起に対してそれぞれ５１０ｎｍ及び５７５ｎｍで発光するため、これらの蛍光像を別々に得ることができる。
【００７７】
図１１と同様の変調電界を印加したとき、位相シフト量が電荷プローブと蛍光プローブの距離で異なるため、電荷プローブを基準としてどのような順序でＧＦＰとＲ−フィコエリスリンが並んでいるかを判定することが可能である。
【００７８】
すなわち、ｍＲＮＡ１の場合には５１０ｎｍ（ＧＦＰ）の発光の位相シフトは５７５ｎｍ（Ｒ−ＰＥ）の発光の位相シフトより小さく、ｍＲＮＡ２の場合には位相シフトの大小が逆転するため、同じように２種類の蛍光分子がハイブリダイズによって結合した場合でもその結合位置を位相シフト量で判定し、区別することが可能である。
【００７９】
本例では蛍光による発光波長は２種類であったが、励起レーザの波長数も増やして、更に多くの蛍光波長を同時に計測することが可能である。その発光波長の数をｎとすると、ｎの階乗分の組み合わせの蛍光ラベルが得られたことになり、非常に多数の種類の定量対象分子を同時に計測することが可能となる。
【００８０】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００８１】
１ レーザ光源
２ 励起光
３ 光学素子
４ 視野レンズ
５ ダイクロイックミラー
６ 対物レンズ
７ 容器
８ サンプル溶液
９ 計測領域
１１ 定量対象分子
１２ 蛍光プローブ
１３ 複合体
１４ 結像レンズ
１５ 撮像素子
１６ 遷移双極子モーメントの方向
２０，２１ 信号発生器
２２ 位相シフタ
２３〜２６ 電極
２７ 演算部
５１ 蛍光分子
５２ 結合分子
５３ 複合体
７１ 石英基板
７２〜７５ 電極
７６ 直流電源
８１ 定量対象分子
９０ 複合体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光を利用して生体分子を定量する生体分子計測システムであって、
定量対象となる生体分子、蛍光分子、並びに前記生体分子及び前記蛍光分子と複合体を形成するための結合分子を含有する溶液を保持する保持部と、
偏光した励起光を前記溶液に照射する励起光源と、
前記溶液に方向が周期的に変化する変調電界を印加する電界印加部と、
前記励起光照射によって前記蛍光分子から発生された蛍光を検出する受光部と、
前記受光部による蛍光検出信号を処理する演算部とを有し、
前記複合体は電気双極子モーメントを持ち、前記変調電界の印加によって前記複合体中の前記蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が前記励起光の偏光方向又は偏光面に対して周期的に変化し、
前記演算部は、前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングの蛍光検出信号から最小になるタイミングの蛍光検出信号を減算した値を複数周期にわたって積算する処理を行うことを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項２】
請求項１に記載の生体分子計測システムにおいて、
前記受光部は撮像素子を有し、前記蛍光検出信号は蛍光スポット像であり、
前記演算部は、前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングで取得した第１の蛍光スポット像から最小になるタイミングで取得した第２の蛍光スポット像を対応する画素毎に減算した差分画像を複数周期にわたって積算する処理を行い、得られた積算画像をもとに生体分子を定量することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項３】
請求項１に記載の生体分子計測システムにおいて、前記受光部は受光素子を有することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の生体分子計測システムにおいて、蛍光の特定の偏光成分を前記受光部に入射させる手段、あるいは偏光状態によって蛍光を分離する手段を設けたことを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項５】
請求項２に記載の生体分子計測システムにおいて、異なる波長の蛍光スポット像を同時に取得する手段を有することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項６】
請求項２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記撮像素子の前に前記蛍光分子からの蛍光を増幅する増幅手段を有し、前記増幅手段は、前記変調電界の変調周期に同期して前記蛍光を増幅することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記変調電界の変調周期に同期して前記励起光の強度を変調する手段を有することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記溶液中で、前記生体分子の電荷の符号と前記結合分子の電荷の符号又は前記蛍光分子と前記結合分子とからなる蛍光プローブの電荷の符号が異なることを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記演算部は、前記変調電界の印加から検出された蛍光の強度ピークまでの時間遅延を測定することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記電界印加部は、前記複合体の共鳴周波数で前記電界の方向を周期的に変化させることを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記電界印加部は、電界を変化させる周波数を前記複合体の緩和振動周波数より高い周波数と低い周波数の２種類の周波数とし、前記演算部は、前記２種類の周波数に対する蛍光強度変化の応答の差を測定することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項１２】
蛍光を利用して生体分子を定量するための生体分子計測システムであって、
定量対象となる生体分子を捕捉するための分子が固定された基板を備え、前記生体分子、蛍光分子、並びに前記生体分子及び前記蛍光分子と複合体を形成するための結合分子を含有する溶液とを保持する保持部と、
偏光した励起光を前記溶液に照射する励起光源と、
前記溶液に方向が周期的に変化する変調電界を印加する電界印加部と、
前記励起光照射によって前記蛍光分子から発生された蛍光スポット像を検出する撮像素子と、
前記蛍光スポット像を処理する演算部とを有し、
前記生体分子と前記蛍光分子と前記結合分子の複合体が電気双極子モーメントを持ち、
前記変調電界の印加によって、前記複合体中の前記蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が前記励起光の偏光方向又は偏光面に対して周期的に変化し、
前記演算部は、前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングで取得した第１の蛍光スポット像から最小になるタイミングで取得した蛍光スポット像を減算した差分画像を複数周期にわたって積算する処理を行い、得られた積算画像をもとに前記生体分子を定量することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項１３】
請求項１２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記積算画像から一分子ずつカウンティングによって前記生体分子を定量することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の生体分子計測システムにおいて、前記励起光は複数の偏光成分を含むことを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項１５】
蛍光を利用して生体分子を定量するための生体分子計測方法であって、
定量対象となる生体分子と、遷移双極子モーメントを有する蛍光分子と、結合分子とを含み電気双極子モーメントを有する複合体を形成する工程と、
前記複合体を含有する溶液に、方向が周期的に変化する変調電界を印加した状態で、偏光した励起光を照射する工程と、
前記励起光照射によって前記蛍光分子から発生された蛍光信号を検出する検出工程と、
前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングの蛍光信号から最小になるタイミングの蛍光信号を減算した値を複数周期にわたって積算する処理工程と、
を有することを特徴とする生体分子計測方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の生体分子計測方法において、
前記検出工程では撮像素子によって蛍光スポット像を検出し、
前記処理工程では、前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングで取得した第１の蛍光スポット像から最小になるタイミングで取得した第２の蛍光スポット像を対応する画素毎に減算した差分画像を複数周期にわたって積算する処理を行い、得られた積算画像をもとに生体分子を定量することを特徴とする生体分子計測方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の生体分子計測方法において、前記結合分子を別の分子として前記生体分子を含む溶液に混合する工程を有することを特徴とする生体分子計測方法。
【請求項１８】
請求項１５又は１６に記載の生体分子計測方法において、
複数種類の生体分子を前記定量対象とし、蛍光分子と結合分子からなる複数種類の蛍光プローブを溶液中に混合する工程と、
前記複数種類の蛍光プローブから発生される複数の蛍光波長の前記変調電界に対する周波数応答の違いを計測して、各蛍光プローブの定量対象分子内での結合位置を測定する工程とを有し、
複数の生体分子を同時に定量することを特徴とする生体分子計測方法。
【請求項１】
蛍光を利用して生体分子を定量する生体分子計測システムであって、
定量対象となる生体分子、蛍光分子、並びに前記生体分子及び前記蛍光分子と複合体を形成するための結合分子を含有する溶液を保持する保持部と、
偏光した励起光を前記溶液に照射する励起光源と、
前記溶液に方向が周期的に変化する変調電界を印加する電界印加部と、
前記励起光照射によって前記蛍光分子から発生された蛍光を検出する受光部と、
前記受光部による蛍光検出信号を処理する演算部とを有し、
前記複合体は電気双極子モーメントを持ち、前記変調電界の印加によって前記複合体中の前記蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が前記励起光の偏光方向又は偏光面に対して周期的に変化し、
前記演算部は、前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングの蛍光検出信号から最小になるタイミングの蛍光検出信号を減算した値を複数周期にわたって積算する処理を行うことを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項２】
請求項１に記載の生体分子計測システムにおいて、
前記受光部は撮像素子を有し、前記蛍光検出信号は蛍光スポット像であり、
前記演算部は、前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングで取得した第１の蛍光スポット像から最小になるタイミングで取得した第２の蛍光スポット像を対応する画素毎に減算した差分画像を複数周期にわたって積算する処理を行い、得られた積算画像をもとに生体分子を定量することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項３】
請求項１に記載の生体分子計測システムにおいて、前記受光部は受光素子を有することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の生体分子計測システムにおいて、蛍光の特定の偏光成分を前記受光部に入射させる手段、あるいは偏光状態によって蛍光を分離する手段を設けたことを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項５】
請求項２に記載の生体分子計測システムにおいて、異なる波長の蛍光スポット像を同時に取得する手段を有することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項６】
請求項２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記撮像素子の前に前記蛍光分子からの蛍光を増幅する増幅手段を有し、前記増幅手段は、前記変調電界の変調周期に同期して前記蛍光を増幅することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記変調電界の変調周期に同期して前記励起光の強度を変調する手段を有することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記溶液中で、前記生体分子の電荷の符号と前記結合分子の電荷の符号又は前記蛍光分子と前記結合分子とからなる蛍光プローブの電荷の符号が異なることを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記演算部は、前記変調電界の印加から検出された蛍光の強度ピークまでの時間遅延を測定することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記電界印加部は、前記複合体の共鳴周波数で前記電界の方向を周期的に変化させることを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記電界印加部は、電界を変化させる周波数を前記複合体の緩和振動周波数より高い周波数と低い周波数の２種類の周波数とし、前記演算部は、前記２種類の周波数に対する蛍光強度変化の応答の差を測定することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項１２】
蛍光を利用して生体分子を定量するための生体分子計測システムであって、
定量対象となる生体分子を捕捉するための分子が固定された基板を備え、前記生体分子、蛍光分子、並びに前記生体分子及び前記蛍光分子と複合体を形成するための結合分子を含有する溶液とを保持する保持部と、
偏光した励起光を前記溶液に照射する励起光源と、
前記溶液に方向が周期的に変化する変調電界を印加する電界印加部と、
前記励起光照射によって前記蛍光分子から発生された蛍光スポット像を検出する撮像素子と、
前記蛍光スポット像を処理する演算部とを有し、
前記生体分子と前記蛍光分子と前記結合分子の複合体が電気双極子モーメントを持ち、
前記変調電界の印加によって、前記複合体中の前記蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が前記励起光の偏光方向又は偏光面に対して周期的に変化し、
前記演算部は、前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングで取得した第１の蛍光スポット像から最小になるタイミングで取得した蛍光スポット像を減算した差分画像を複数周期にわたって積算する処理を行い、得られた積算画像をもとに前記生体分子を定量することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項１３】
請求項１２に記載の生体分子計測システムにおいて、前記積算画像から一分子ずつカウンティングによって前記生体分子を定量することを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の生体分子計測システムにおいて、前記励起光は複数の偏光成分を含むことを特徴とする生体分子計測システム。
【請求項１５】
蛍光を利用して生体分子を定量するための生体分子計測方法であって、
定量対象となる生体分子と、遷移双極子モーメントを有する蛍光分子と、結合分子とを含み電気双極子モーメントを有する複合体を形成する工程と、
前記複合体を含有する溶液に、方向が周期的に変化する変調電界を印加した状態で、偏光した励起光を照射する工程と、
前記励起光照射によって前記蛍光分子から発生された蛍光信号を検出する検出工程と、
前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングの蛍光信号から最小になるタイミングの蛍光信号を減算した値を複数周期にわたって積算する処理工程と、
を有することを特徴とする生体分子計測方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の生体分子計測方法において、
前記検出工程では撮像素子によって蛍光スポット像を検出し、
前記処理工程では、前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングで取得した第１の蛍光スポット像から最小になるタイミングで取得した第２の蛍光スポット像を対応する画素毎に減算した差分画像を複数周期にわたって積算する処理を行い、得られた積算画像をもとに生体分子を定量することを特徴とする生体分子計測方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の生体分子計測方法において、前記結合分子を別の分子として前記生体分子を含む溶液に混合する工程を有することを特徴とする生体分子計測方法。
【請求項１８】
請求項１５又は１６に記載の生体分子計測方法において、
複数種類の生体分子を前記定量対象とし、蛍光分子と結合分子からなる複数種類の蛍光プローブを溶液中に混合する工程と、
前記複数種類の蛍光プローブから発生される複数の蛍光波長の前記変調電界に対する周波数応答の違いを計測して、各蛍光プローブの定量対象分子内での結合位置を測定する工程とを有し、
複数の生体分子を同時に定量することを特徴とする生体分子計測方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−１９８０５８（Ｐ２０１２−１９８０５８Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６１１５９（Ｐ２０１１−６１１５９）
【出願日】平成２３年３月１８日（２０１１．３．１８）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１８日（２０１１．３．１８）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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