生体関連分子の非特異的吸着を阻害する方法および生体関連分子検出用キット
【課題】 生体関連分子の担体への非特異的吸着を効果的に抑制し、生体関連分子の相互作用の高感度な検出を可能にする手段を提供する。
【解決手段】 担体に対する生体関連分子の非特異的吸着を阻害する方法であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体に対して、前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いることを特徴とする、前記方法。
【解決手段】 担体に対する生体関連分子の非特異的吸着を阻害する方法であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体に対して、前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いることを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質および核酸等の生体関連分子を担体上に固定化し、固定化された生体関連分子とその他の生体関連分子との特異的結合に基づいて検出を行う系において、生体関連分子の担体上への非特異的吸着を防止する方法、およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、核酸、糖鎖、タンパク質などの生体関連分子を担体上に固定化し、それにターゲットとなる生体関連分子を反応させて両分子の相互作用を研究する方法が広く使われている。例えば、分子間の相互作用として抗原抗体反応を利用するイムノブロッティングの一例を以下に示す。
【０００３】
まず、抗原タンパク質を担体上に固定化し、抗原特異的抗体（一次抗体）を抗原タンパク質へ結合させ、続いて、標識抗一次抗体（二次抗体）を一次抗体に結合させ、そして、蛍光などの標識によって二次抗体結合部位を可視化することにより検出を行う。また、標識二次抗体の代わりにビオチン化二次抗体を結合させ、さらにこれにビオチン化発色酵素とアビジンの複合体を結合させてシグナルを増幅する方法も知られている。ここで、抗原と一次抗体および一次抗体と二次抗体の結合はどちらも特異的な反応であるが、一次抗体、二次抗体等は、抗原タンパク質の固定化されていない担体表面にも数多く非特異的に吸着する。非特異的に吸着した標識抗体等は、特異的反応によって吸着したものと同様にシグナルを発して検出感度を低下させる。同様の現象が、その他のタンパク質および核酸等の特異的結合の検出においても観察される。
【０００４】
従って、この非特異的な吸着を抑えることが、高感度検出のためには重要になる。このような非特異的な吸着を防止するため、従来、担体上に固定化された生体関連分子にこれと相互作用する分子を反応させる前に、生体関連分子が結合していない担体上にブロッキング剤を吸着させて、非特異的吸着を抑制していた。
【０００５】
このようなブロッキング剤として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）など相互作用に無関係なタンパク質が用いられてきた（非特許文献１参照）が、非特異的吸着が十分に抑制できない場合もあった。特に、表面が負に帯電した担体、例えば、表面にカルボキシル基を有する担体または該カルボキシル基をさらに活性エステル化した基などを有する担体等を用いる場合（特許文献１〜３参照）、正に帯電したタンパク質の非特異的吸着が問題となるが、ＢＳＡは負に帯電しているため、非特異的吸着を防止することが困難であった。また、その他の成分を含むブロッキング剤についても知られているが、これらも担体への吸着が不十分であるなど問題点を有していた。（特許文献４参照）。
【０００６】
特許文献５には、ポリアルキレングリコール残基をω−メルカプト脂肪酸残基を介して半導体結晶表面に結合することにより生体物質の非特異的吸着を制御する方法が記載されている。しかし、該方法は、配位子交換反応によりメルカプト基を有するポリアルキレングリコール残基を半導体結晶に配位させるものであるため、担体が金属酸化物等に限定される。また、ポリアルキレングリコール残基を半導体結晶に配位させるための調整も煩雑であるという問題があった。
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ ００／２２１０８
【特許文献２】ＷＯ ０２／１２８９１
【特許文献３】特開２００２−８２１１６号公報
【特許文献４】特開平６−１６０３８５号公報
【特許文献５】特開２００２−１２１５４９号公報
【非特許文献１】新生化学実験講座１、１９９４年、東京化学同人発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、生体関連分子の担体への非特異的吸着を効果的に抑制し、生体関連分子の相互作用の高感度な検出を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体と、前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤とを組み合わせることにより、生体関連分子の担体への非特異的吸着を効果的に抑制できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）担体に対する生体関連分子の非特異的吸着を阻害する方法であって、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体に対して、
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いることを特徴とする、前記方法。
【００１１】
（２）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体に対して、アミノ基またはメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
カルボキシル基を表面に有する担体に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
マレイミド基を表面に有する担体に対して、メルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
アミノ基を表面に有する担体に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いる、（１）記載の方法。
【００１２】
（３）末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドが、末端に官能基を有するポリエチレングリコールである、（１）または（２）記載の方法。
【００１３】
（４）担体が、表面にカーボン層を有し、該カーボン層上に化学修飾基を有するものである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００１４】
（５）担体が、高分子材料と、カーボンブラックおよび／または黒鉛とを混練して成形したものの表面に化学修飾基を有するものである、（４）記載の方法。
【００１５】
（６）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体、および
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤、
を含む、生体関連分子検出用キット。
【００１６】
（７）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体、およびアミノ基またはメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ、
カルボキシル基を表面に有する担体、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ、
マレイミド基を表面に有する担体、およびメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ、または
アミノ基を表面に有する担体、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ
を含む、（６）記載のキット。
【００１７】
（８）末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドが、末端に官能基を有するポリエチレングリコールである、（６）または（７）記載のキット。
【００１８】
（９）担体が、表面にカーボン層を有し、該カーボン層上に化学修飾基を有するものである、請求項（６）〜（８）のいずれかに記載のキット。
【００１９】
（１０）担体が、高分子材料と、カーボンブラックおよび／または黒鉛とを混練して成形したものの表面に化学修飾基を有するものである、（９）記載のキット。
【００２０】
（１１）担体上に生体関連分子をパターン状に固定化する方法であって、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体に、該化学修飾基と反応しうる官能基を有する化合物を目的のパターン状に適用すること、
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を前記担体に適用すること、および
得られた担体に、生体関連分子を適用すること
を含む、前記方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、生体関連分子の担体への非特異的吸着を効果的に抑制し、生体関連分子の相互作用を高感度に検出する手段が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、担体に生体関連分子を固定化し、この固定化分子と別の生体関連分子との特異的な結合を検出する系において、生体関連分子および標識分子等の担体への非特異的な吸着を阻害すること（以下、ブロッキングと称する場合もある）を目的とする。上記のような系を用いる検出系としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡチップ、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫検定法）、免疫凝集法（特開平１０−１９７５３０号公報）および免疫沈降法などが挙げられる。
【００２３】
本発明において、固定化および検出の対象となる生体関連分子は、生体中に存在する分子およびその誘導体である。生体関連分子としては、例えば、一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸、ポリペプチド、オリゴペプチド、糖などが挙げられる。ＰＮＡ（ペプチド核酸）等も包含される。ペプチド核酸とは、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸類のデオキシリボースやリボースからなる骨格に代えてペプチド骨格または偽ペプチド骨格、例えば、アミノエチルグリシン主鎖、ならびにポリアミド、ポリチオアミド、ポリスルフィンアミドおよびポリスルホンアミドを含む他の同様の主鎖を有する核酸擬似体であって、該主鎖に結合した核酸塩基を有する化合物を意味する。本発明において、ポリペプチドには、オリゴペプチドおよびタンパク質が包含される。本発明は、生体関連分子としてポリペプチドの相互作用を検出する場合において、その非特異的吸着を阻害する場合に特に好適である。本発明の方法に好適なポリペプチドとして、各種抗原および抗体、酵素、ならびにアビジン、ビオチン等が挙げられる。生体関連分子間の相互作用としては、抗原抗体反応、アビジン−ビオチンの結合反応、酵素と基質の結合反応、核酸相補鎖間のハイブリダイゼーション、リガンドとレセプターの結合反応、核酸と転写因子の結合反応、細胞接着因子の結合反応などが挙げられる。
【００２４】
本発明は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基（−ＣＯＯ−ＮＨＳ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、マレイミド基およびアミノ基（−ＮＨ２）からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体を用いることを特徴とする。
【００２５】
本発明において使用することができる担体としては、上記化学修飾基を表面に有し、生体関連分子を固定化できるものであれば特に制限されず、当技術分野で通常用いられるものを使用できる。例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライトおよび感光性ガラス；繊維；木材；紙；ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、四フッ化エチレンーパーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体(４．６フッ化、ＥＦＰ)、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（２フッ化、ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（３フッ化、ＰＣＴＦＥ）などのフッ素樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブテン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコールおよびポリ酢酸ビニルなどのポリオレフィン、ナイロン（例えば、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロンＭＸＤ６）などのポリアミド、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレートおよびポリトリメチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ乳酸、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ樹脂）、アクリル樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂ならびにエポキシ樹脂などの高分子材料等の表面に、上記化学修飾基が導入されたものが挙げられる。
【００２６】
さらに、本発明において用いる担体としては、表面にカーボン層を有し、該カーボン層上に化学修飾基を有するものが好ましい。このような担体としては、基板表面にカーボン層を有し、該カーボン層上に化学修飾基を有するものが挙げられる。ここで、基板の材料としては、上記と同様のものを使用できる。
【００２７】
カーボン層には、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。本発明においては、カーボン層として軟ダイヤモンド層が好ましい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。本発明の担体には、基板自体がカーボン層で形成されたものも含まれる。
【００２８】
基板へのカーボン層の形成は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。
【００２９】
高周波プラズマＣＶＤ法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にカーボン層、好ましくはＤＬＣ層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりカーボン層を形成してもよい。
【００３０】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
【００３１】
レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
【００３２】
本発明に用いる上記カーボン層を有する担体としては、前記のように基板の上にカーボン層を形成した構造だけでなく、前記の材料の積層体や複合体（例えば、ダイヤモンドと他の物質との複合体、（例えば２相体））であってもよい。
【００３３】
カーボン層を有する基板の一例としては、スライドガラスやシリコン基板に軟ダイヤモンド（ＤＬＣ）を製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ＤＬＣが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。表面処理層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。
【００３４】
ＤＬＣ層を形成することにより、高密度に生体関連分子を固定化でき、高いＳ／Ｎ比が得られるため、感度の高い検出が可能になる。また、繰り返し使用することも可能である。
【００３５】
担体の形状およびサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００３６】
カーボン層として、高分子材料と炭素系物質とを混練して成形したものを使用することもできる。この場合、担体全体がカーボン層で構成され、その表面に化学修飾基が導入されていることが好ましい。炭素系物質としては、カーボンブラックおよび黒鉛が挙げられる。従って本発明においては、担体として、高分子材料と、カーボンブラックおよび／または黒鉛とを混練して成形したものの表面に化学修飾基を有する担体を使用することができる。炭素系物質は単独で使用してもよく、複数種を混合して使用してもよい。
【００３７】
高分子材料としては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、四フッ化エチレンーパーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体(４．６フッ化、ＥＦＰ)、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（２フッ化、ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（３フッ化、ＰＣＴＦＥ）などのフッ素樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブテン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコールおよびポリ酢酸ビニルなどのポリオレフィン、ナイロン（例えば、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロンＭＸＤ６）などのポリアミド、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレートおよびポリトリメチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ乳酸、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ樹脂）、アクリル樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂およびエポキシ樹脂などが挙げられる。カーボンブラックとしては、公知のカーボンブラックを使用でき、例えば、チャンネルブラック、サーマルブラック、ファーネスブラック、アセチレンブラック、ケッチェンブラック、黒鉛化カーボンブラックなどが挙げられる。黒鉛としては、公知の黒鉛を使用でき、例えば、人造黒鉛、鱗片状黒鉛、鱗状黒鉛、土壌黒鉛などが挙げられる。上記高分子材料と、上記カーボンブラックおよび／または上記黒鉛との混練割合は特に限定されるものではない。混練の際に接着剤を添加し、成形してもよい。このように混練した材料は非特異的吸着を抑制できるだけでなく、自家蛍光を抑制でき、ペプチドのみならずＤＮＡ等の核酸も固定することができる。
【００３８】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基（−ＣＯＯ−ＮＨＳ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、マレイミド基およびアミノ基（−ＮＨ２）からなる群から選択される化学修飾基の担体表面への導入方法は、公知の方法を使用でき、特に制限されない。
【００３９】
アミノ基は、例えば、アミノ基含有化合物を用いて導入することができる。アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、または炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ基を有するシランカップリング剤（アミノアルキルトリアルコキシシラン）、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、またはこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００４０】
また、表面にカーボン層を有する担体については、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することによりアミノ基を導入できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミン等の多価アミン類ガスを、塩素化したカーボン層と反応させることによってアミノ基を導入することもできる。カーボン層をアンモニア雰囲気下でプラズマ法に付すことによってアミノ基を導入することもできる。ここで、プラズマ法とは、真空条件下、直流または交流による放電にプラズマを発生させ、原料ガスとして例えばベンゼンやメタンを用い、イオン化したガスでバイアスを印加した基板を処理する方法である。
【００４１】
カルボキシル基の導入は、例えば、上記のように導入されたアミノ基に適当な多価カルボン酸を反応させることにより実施できる。
【００４２】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基は、例えば、導入されたカルボキシル基を、カルボジイミドまたはジシクロヘキシルカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させるすることにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基が結合した基を形成することができる（特開２００１−１３９５３２）。
【００４３】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基は、ポリペプチドのアミノ基を強固に結合することができるためポリペプチドを効果的に固定化することができる。また、固定化されたポリペプチドの機能が損なわれることもない。さらに、本発明によりブロッキング剤を適用した場合であっても、固定化されたポリペプチドの機能が保持され、相互作用が阻害されることもない。
【００４４】
マレイミド基は、例えば、上記のように形成したアミノ基と、マレイミド基を有する化合物とを反応させることにより導入できる。例えば、以下の式II：
【００４５】
【化１】
で表される化合物またはその塩を反応させることにより、式III：
【００４６】
【化２】
で表されるようなマレイミド基をカーボン層上に形成することができる。
【００４７】
式IIまたはIIIにおいて、ｎは１〜１２、好ましくは４〜６の整数、より好ましくは５である。式IIで表される化合物の塩としては特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等を使用できる。ナトリウム塩を使用するのが好ましい。
【００４８】
具体的には、アミノ基が導入された担体を、バッファー中に通常０．１〜１００ｍＭの濃度で式IIの化合物を含む溶液に浸漬することにより反応させる。バッファーとしては、ＰＢＳ、トリエタノールアミンバッファー、ホウ酸ナトリウムバッファー等を使用することができる。ＰＢＳ（ｐＨ６〜９）を使用するのが好ましい。反応温度は、通常１０〜８０℃、好ましくは２５〜３０℃、反応時間は、通常１〜３００分、好ましくは３０〜６０分である。
【００４９】
本発明の担体において、上記マレイミド基は、共有結合によって担体と強固に結合しているため、洗浄や温度変化によっても剥離することがなく、また担体を長期間保存することも可能である。
【００５０】
本発明はまた、ブロッキング剤として、前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いることを特徴とする。
【００５１】
本発明においてブロッキング剤とは、当技術分野において通常用いられる意味を有する。すなわち、担体に生体関連分子を固定化し、この固定化分子と別の生体関連分子との特異的な結合を検出する系において、生体関連分子および標識分子等の担体への非特異的な吸着を防止するために使用される試薬を意味する。本発明のブロッキング剤は、前記の官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを、水やＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）等の水性溶媒に溶解することにより調製することができる。ブロッキング剤に含まれる前記ポリアルキレンオキシドの濃度は、当業者であれば適宜設定することができ、特に制限されないが、通常０．０１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１０００ｍｇ／ｍｌ程度である。
【００５２】
担体上の化学修飾基と共有結合を形成する官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いるのが好ましい。
【００５３】
好ましくは、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体に対して、アミノ基またはメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
カルボキシル基を表面に有する担体に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基、特にアミノ基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
マレイミド基を表面に有する担体に対して、メルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
アミノ基を表面に有する担体に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いる。
【００５４】
本発明においては、非特異的吸着の阻害効果およびポリペプチド相互作用に対する影響の観点から、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体に対して、アミノ基またはメルカプト基、特にアミノ基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いるのが好ましい。
【００５５】
本発明においてポリアルキレンオキシドは、（−Ｒ−Ｏ−）ｎで表される繰り返し単位を含むポリマーを意味する。ホモポリマー、ブロックコポリマーおよびランダムコポリマーも包含される。上記繰り返し単位においてＲは、直鎖または分岐鎖アルキレン基、好ましくは炭素数２〜１０、より好ましくは２〜６のアルキレン基を表し、ポリマー鎖中に異なる種類のＲが含まれていてもよい。好ましくは重量平均分子量２００〜１０００００、より好ましくは１０００〜５００００のホモポリマーである。最も好ましくは、ポリエチレングリコールである。
【００５６】
本発明の末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドにおいて、官能基はいずれの末端に存在していてもよく、両末端に存在していてもよいが、好ましくは片方の末端に存在する。その場合、担体上の化学修飾基と反応しうる官能基が存在しない側の末端基は、特に制限されず、ヒドロキシル基でもよく、あるいは、アルキルエーテル、好ましくはメチルエーテルおよびエチルエーテル、アリールエーテル、好ましくはフェニルエーテル、アルキルエステル、好ましくはメチルエステルおよびエチルエステル等の形態をとりうる。
【００５７】
本発明において、ポリアルキレンオキシドは、好ましくは、一般式I：
Ｒ１−Ｌ１−（−Ｒ２−Ｏ−）ｎ−Ｌ２−Ｘ （I）
【００５８】
[式中、
Ｘは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基であり、
Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のアルキル基、炭素数１０以下のアリール基、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５のアルコキシ基および炭素数１〜１０、好ましくは１〜５のアシル基からなる群から選択され、
Ｒ２は、炭素数２〜６、好ましくは２〜４のアルキレン基であり、
Ｌ１およびＬ２は、直接結合または連結基であり、
ｎは、４〜２３００、好ましくは２３〜１２００の自然数である］
で表される化合物である。
【００５９】
Ｌ１およびＬ２における連結基は、好ましくは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−Ｃ６Ｈ４−、−ＳＯ２−、−ＳＯ−、−ＮＨＣＯ−および−ＣＯＯ−から選択される二価の基により、好ましくは−Ｏ−により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数１〜３０、好ましくは２〜１０のアルキレン基であることができる。このようなアルキレン基は、分岐していてもよい。
【００６０】
Ｌ１およびＬ２の具体例としては、−（ＣＨ２）ａ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−、−ＣＯＯ−Ｃ６Ｈ４−および−（ＣＨ２）ｃ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｄ−などが挙げられる。ここでａ〜ｄは、それぞれ独立して、１〜５の整数、より好ましくは１〜３の整数である。
【００６１】
Ｒ１におけるアルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等の炭素数３以下のアルキル基、更に好ましくはメチル基またはエチル基、最も好ましくはメチル基である。Ｒ１におけるアリール基の具体例としては、フェニル基、トルイル基（モノメチルフェニル基）、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、イソプロピルフェニル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ビニルフェニル基、ピリジル基、モノメチルピリジル基、ジメチルピリジル基等が挙げられ、好ましくはフェニル基またはピリジル基である。Ｒ１におけるアシル基の具体例としては、アセチル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、マレオイル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基である。Ｒ１は好ましくは、ヒドロキシル基である。
【００６２】
Ｒ２の具体例としては、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基、ｎ−ペンチレン基、シクロペンチレン基、ｎ−ヘキシレン基、シクロヘキシレン基等が挙げられ、水溶性の点で好ましくはエチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基等の炭素数２〜４のアルキレン基が、更に好ましくはエチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基等の炭素数２または３のアルキレン基が、最も好ましくはエチレン基が使用される。一般式Iにおいて、１分子中に複数種のＲ２が混在していてもよく、この場合の共重合順序（シークエンス）にも制限はない。
【００６３】
Ｒ１−Ｌ１−は、好ましくはＨＯ−である。
【００６４】
−Ｌ２−Ｘは、好ましくは、−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ２、−（ＣＨ２）ａ−ＣＯＯ−ＮＨＳ、−（ＣＨ２）ａ−ＳＨ、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＯ−ＮＨＳ、および−（ＣＨ２）ｃ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｄ−マレイミドである。
【００６５】
本発明で使用できる末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドの具体例としては、（株）日本油脂製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴシリーズが挙げられる。
【００６６】
本発明において上記ブロッキング剤を用いた非特異的吸着の阻害は、当技術分野において一般に使用されているブロッキング剤と同様に使用することができる（例えば、分子生物学実験プロトコール、平成９年、丸善株式会社発行参照）。一実施形態として、担体にポリペプチドを固定化してこれと相互作用するポリペプチドを検出する方法を以下に説明する。
【００６７】
まず、ポリペプチド溶液を、好適な担体上にブロッティングすることにより固定化する。その後、当該担体を自然乾燥または減圧乾燥し、室温で約１時間静置する。続いて、使用した担体を好適なブロッキング剤に浸して１時間ほど振とうする。このときの浸漬温度は、０〜１００℃、好ましくは２０〜６０℃である。その後、水で洗浄し、遠心乾燥して、通常、０〜１００℃、好ましくは６０〜１００℃で乾燥させる。または、通常、１０〜６０℃、好ましくは１５〜３０℃で減圧乾燥させる。このようにブロッキング処理をした後、担体上に固定化されたポリペプチドと相互作用するポリペプチドを含有する溶液を添加する。
【００６８】
生体関連分子間の相互作用は、当技術分野で通常用いられる標識によって検出することができる。このような標識としては、放射性同位元素、酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびルシフェラーゼ、ならびに蛍光剤、例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、化学発光分子等が挙げられる。
【００６９】
あるいは、相互作用した後の担体を、そのままレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等で分析することもできる。イオン化法の様式としては、マトリックス補助レーザ脱着（ＭＡＬＤＩ）法が好ましい。
【００７０】
本発明はまた、上記のようなブロッキング方法を用いて生体関連分子を検出するためのキット関する。本発明の生体関連分子検出用キットは、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体、および
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を含む。担体およびブロッキング剤については、上記のとおりである。
【００７１】
本発明のキットは、上記担体およびブロッキング剤を含むことを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。例えば、生体分子を分解するための酵素、緩衝液、マトリックス溶媒、洗浄バッファー、試料希釈液、反応停止液、標準物質等を含みうる。更に本発明のキットには、アッセイ方法を説明するためのインストラクションマニュアルを組み合せることもできる。
【００７２】
本発明者らはまた、表面に化学修飾基を有する担体に、該化学修飾基と反応しうる官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を適用する前に、該化学修飾基と反応しうる官能基を有する別の化合物をスポッティング等により担体上に部分的に適用すると、担体表面において該化合物を適用した領域ではブロッキング作用が生じないことを見いだした。これは、担体上の化学修飾基に別の化合物に含まれる官能基が結合した結果、ポリアルキレンオキシドが担体に結合できず、ブロッキング作用が阻害されたためと考えられる。
【００７３】
従って、担体に生体関連分子を固定化する前に、担体上の化学修飾基と反応しうる官能基を有する別の化合物（末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドとは異なる化合物）を部分的に適用し、続いて担体上の化学修飾基と反応しうる官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを適用することにより、化学修飾基と反応しうる官能基を有する別の化合物を適用した部分にのみ生体関連分子を固定化できることが明らかとなった。
【００７４】
すなわち本発明は、担体上に生体関連分子をパターン状に固定化する方法であって、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体に、該化学修飾基と反応しうる官能基を有する化合物を目的のパターン状に適用すること、
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを前記担体に適用すること、
得られた担体に、生体関連分子を適用すること
を含む、前記方法に関する。
【００７５】
当該方法は、生体関連分子としてポリペプチドを用いる場合に好適である。
【００７６】
すなわち、表面に化学修飾基を有する担体に、目的の生体関連分子、好ましくはポリペプチドを固定化したい部分にのみ該化学修飾基と反応しうる官能基を有する化合物であって、ポリアルキレンオキシド以外の化合物を適用し、その後、該化学修飾基と反応しうる官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを適用し、洗浄後、目的の生体関連分子を担体に適用する。
【００７７】
ここで、表面に化学修飾基を有する担体としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体が好ましく、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基と反応しうる官能基を有する別の化合物としては、アミノ基含有化合物、特にポリアリルアミンが好ましく、担体上の化学修飾基と反応しうる官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドとしては、末端にアミノ基を有するポリアルキレンオキシドが好ましい。
【００７８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７９】
（実施例１）ガラス表面に化学修飾基を有する担体
ガラス表面に化学修飾基として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、またはアミノ基を有する担体を以下のように調製した。
(1)２５ｍｍ×７５ｍｍのスライドガラスをアルカリ洗浄し、３−アミノプロピルトリエトキシシランおよびポリアリルアミンで処理することにより、化学修飾基としてアミノ基を有する担体を得た（ＮＨ２担体）。
(2)(1)で得られた担体をポリアクリル酸で処理することにより、化学修飾基としてカルボキシル基を有する担体を得た（ＣＯＯＨ担体）。
(3)(2)で得られた担体を、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に浸漬することによって化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体を得た（ＮＨＳ担体）。
【００８０】
上記で得られた担体を、末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−２０Ｈ、（株）日本油脂製）、末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−０２０ＣＳ、（株）日本油脂製）または末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−０２０ＳＨ、（株）日本油脂製）をそれぞれ含むブロッキング剤（１００ｍｇ／ｍｌの水溶液）に１時間浸漬した。担体を取り出しＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）で洗浄した後、Ｃｙ３標識抗ＢＳＡ抗体の溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）に１時間浸漬した。浸漬は、担体上にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で円状のウェルを作成し、該ウェルにブロッキング剤または蛍光標識抗体溶液を滴下し、湿箱中でインキュベートすることにより行った（図１上）。担体を取り出しＰＢＳで洗浄した後、蛍光画像装置ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム製）を用いて蛍光画像を観察した。
【００８１】
結果を図１に示す。図１の結果から、本発明により、ポリペプチドの非特異的吸着を効果的に阻害できることが示された。また、化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体（図中、ＮＨＳ担体と表記）に対しては、末端にアミノ基を有するポリアルキレンオキシド（図中、ＮＨ２−ＰＥＧと表記）を含むブロッキング剤を用いるのが好ましく、化学修飾基としてアミノ基を有する担体（図中、ＮＨ２担体と表記）に対しては、末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するポリアルキレンオキシド（図中、ＮＨＳ−ＰＥＧと表記）を含むブロッキング剤を用いるのが好ましく、化学修飾基としてカルボキシル基を有する担体（図中、ＣＯＯＨ担体と表記）に対しては、末端にアミノ基を有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いるのが好ましいことがわかった。
【００８２】
（実施例２）シリコン基板上のカーボン層表面に化学修飾基を有する担体
シリコン基板上のカーボン層表面に化学修飾基として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基またはマレイミド基を有する担体を以下のように調製した。
(1)３ｍｍ角のシリコン基板にイオン化蒸着法によって、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１０ｎｍの厚みに形成した。その後に、アンモニアガスを５ｃｍ３／分の割合でチャンバーに挿入した。作動圧を２ＰａとしてアンモニアプラズマでＤＬＣ表面を処理した。
(2)(1)で得られた担体をポリアクリル酸で処理することにより、カルボキシル基を導入し、続いて、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に浸漬することによって化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体を得た（ＮＨＳ担体）。
(3)(1)で得られた担体をポリアリルアミンで処理することにより、化学修飾基としてアミノ基を有する担体を得た（ＮＨ２担体）。
(4)(1)で得られた担体をスルホ−ＥＭＣＳ（同仁化学研究所（株））で処理することにより化学修飾基としてマレイミド基を有する担体を得た（マレイミド担体）。
【００８３】
上記で得られた担体を、末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−２０Ｈ、（株）日本油脂製）、末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−０２０ＣＳ、（株）日本油脂製）または末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−０２０ＳＨ、（株）日本油脂製）をそれぞれ含むブロッキング剤（１００ｍｇ／ｍｌの水溶液）に１時間浸漬した。担体を取り出しＰＢＳ（リン酸緩化食塩水）で洗浄した後、Ｃｙ３標識抗ＢＳＡ抗体の溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）に１時間浸漬した。担体を取り出しＰＢＳで洗浄した後、蛍光画像装置ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム製）を用いて蛍光画像を観察した。
【００８４】
結果を図２に示す。図２の結果から、本発明により、ポリペプチドの非特異的吸着を効果的に阻害できることが示された。また、化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体（図中、ＮＨＳ担体と表記）に対しては、末端にアミノ基またはメルカプト基を有するポリアルキレンオキシド（図中、ＮＨ２−ＰＥＧまたはＳＨ−ＰＥＧと表記）を含むブロッキング剤を用いるのが好ましく、化学修飾基としてアミノ基を有する担体（図中、ＮＨ２担体と表記）に対しては、末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するポリアルキレンオキシド（図中、ＮＨＳ−ＰＥＧと表記）を含むブロッキング剤を用いるのが好ましく、化学修飾基としてマレイミド基を有する担体（図中、マレイミド担体と表記）に対しては、末端にメルカプト基を有するポリアルキレンオキシド（図中、ＳＨ−ＰＥＧと表記）を含むブロッキング剤を用いるのが好ましいことがわかった。
【００８５】
（実施例３）ポリペプチド−ポリペプチド相互作用の検出
実施例２で作成したシリコン基板上のＤＬＣ層表面に化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基またはマレイミド基を有する担体を用いてポリペプチド−ポリペプチド相互作用の検出を行った（図３）。
(1)ＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中、２００μｇ／ｍｌ）を各担体にスポッティングし、１時間反応させた。
(2)担体を各種修飾ポリエチレングリコールを含むブロッキング剤（１００ｍｇ／ｍｌの水溶液）に１時間浸漬した。化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体は、末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−２０Ｈ、（株）日本油脂製）または末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−０２０ＳＨ、（株）日本油脂製）を含むブロッキング剤に浸漬した。化学修飾基としてアミノ基を有する担体は、末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−０２０ＣＳ、（株）日本油脂製）を含むブロッキング剤に浸漬した。化学修飾基としてマレイミド基を有する担体は、末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−０２０ＳＨ、（株）日本油脂製）を含むブロッキング剤に浸漬した。
(3)担体を取り出しＰＢＳで洗浄し、Ｃｙ３標識抗ＢＳＡ抗体の溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）またはＣｙ３標識抗ＩＬ−２（インターロイキン−２）抗体の溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）に１時間浸漬した。担体を取り出しＰＢＳで洗浄した後、蛍光画像装置ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム製）を用いて蛍光画像を観察した。結果を図４に示す。
【００８６】
図４の結果から、本発明により、ポリペプチドの非特異的吸着を効果的に阻害できるととともに、ポリペプチドの機能を阻害することもなく、ポリペプチドの相互作用を正確に検出できることが示された。また、化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体を用いて、末端にアミノ基またはメルカプト基を有するポリアルキレンオキシド、特に末端にアミノ基を有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いるのが最も効果的であると考えられる。
【００８７】
（実施例４）ポリペプチドの部分的な固定化
(1)実施例２で作成した、化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体に、ポリアリルアミン水溶液（１ｗｔ％）０．３μｌを２００μｍ径でスポットし、８０℃で３０分間乾燥させた。
(2)末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−２０Ｈ、（株）日本油脂製）の水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）に１時間浸漬した。
(3)担体を取り出しＰＢＳで洗浄した後、Ｃｙ３標識ＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）に１時間浸漬した。
(4)担体を取り出しＰＢＳで洗浄した後、蛍光画像装置ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム製）を用いて蛍光画像を観察した。結果を図５の上に示す。
【００８８】
また、(1)においてポリアリルアミン水溶液をスポットするかわりに、超純水０．３μｌを２００μｍ径でスポットしたこと以外は上記工程と同様の工程を実施し、蛍光画像を観察した。結果を図５の下に示す。
【００８９】
図５の結果から、アミノ基含有化合物であるポリアリルアミンをスポットした領域にのみＢＳＡが固定化されていることがわかる。従って、ポリアリルアミンをスポットした領域においては、末端にアミノ基を有するポリエチレングリコールの担体への結合が阻害され、ブロッキング作用が失われたことがわかる。
【００９０】
（実施例５）炭素系物質と高分子材料とを混練成形した担体
(1)ポリプロピレン（三井ポリプロ製Ｆ３２９Ｔ）９０部およびカーボンブラック（三菱化学製＃３２３０Ｂ）１０部を、押出機を用いて２００℃にて０．２ｍｍ厚にシート成形した。続いて、１９０℃で１ｍｍ厚にプレス成形し、３ｍｍ角に切断した。
(2)(1)で得られたチップに、イオン化蒸着法により、作動圧２Ｐａでアンモニアプラズマに曝すことにより表面にアミノ基を導入した。続いて無水コハク酸で処理することによりカルボキシル基を導入し、さらに１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液で処理することによって、化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体を得た（ＮＨＳ担体）。
(3)(2)で得られた担体を用いてポリペプチド−ポリペプチド相互作用の検出を行った。ＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中、２００μｇ／ｍｌ）を担体にスポッティングし、１時間反応させた。担体を末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−２０Ｈ、（株）日本油脂製）を含むブロッキング剤（１００ｍｇ／ｍｌの水溶液）に１時間浸漬した。担体を取り出しＰＢＳ（リン酸緩化食塩水）で洗浄した後、Ｃｙ３標識抗ＢＳＡ抗体の溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）またはＣｙ３標識抗ＩＬ−２（インターロイキン−２）抗体の溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）に１時間浸漬した。担体を取り出しＰＢＳで洗浄した後、蛍光画像装置ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム製）を用いて蛍光画像を観察した。
【００９１】
結果を図６に示す。炭素系物質と高分子材料とを混練成形し化学修飾基を導入して担体として用いた場合も非特異吸着を抑制できることが示された。高分子材料に炭素系物質を練り込むことにより、自家蛍光を抑制でき、ペプチドアレイのみならずＤＮＡアレイ用基板として用いることができることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】実施例１における浸漬方法、および化学修飾基を有するガラス担体を、各種修飾ポリエチレングリコールでブロッキングした後、蛍光標識抗ＢＳＡ抗体溶液に浸漬し、洗浄後、蛍光画像観察した結果を示す。
【図２】実施例２で、化学修飾基を有するシリコン−ＤＬＣ担体を、各種修飾ポリエチレングリコールでブロッキングした後、蛍光標識抗ＢＳＡ抗体溶液に浸漬し、洗浄後、蛍光画像観察した結果を示す。
【図３】実施例３の手順の概要を示す。
【図４】実施例３で、化学修飾基を有するシリコン−ＤＬＣ担体に、ＢＳＡ溶液をスポッティングし、各種修飾ポリエチレングリコールでブロッキングした後、蛍光標識抗ＢＳＡ抗体または蛍光標識抗ＩＬ−２抗体の溶液に浸漬し、洗浄後、蛍光画像観察した結果を示す。
【図５】実施例４で、蛍光画像観察した結果を示す。
【図６】実施例５で、蛍光画像観察した結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質および核酸等の生体関連分子を担体上に固定化し、固定化された生体関連分子とその他の生体関連分子との特異的結合に基づいて検出を行う系において、生体関連分子の担体上への非特異的吸着を防止する方法、およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、核酸、糖鎖、タンパク質などの生体関連分子を担体上に固定化し、それにターゲットとなる生体関連分子を反応させて両分子の相互作用を研究する方法が広く使われている。例えば、分子間の相互作用として抗原抗体反応を利用するイムノブロッティングの一例を以下に示す。
【０００３】
まず、抗原タンパク質を担体上に固定化し、抗原特異的抗体（一次抗体）を抗原タンパク質へ結合させ、続いて、標識抗一次抗体（二次抗体）を一次抗体に結合させ、そして、蛍光などの標識によって二次抗体結合部位を可視化することにより検出を行う。また、標識二次抗体の代わりにビオチン化二次抗体を結合させ、さらにこれにビオチン化発色酵素とアビジンの複合体を結合させてシグナルを増幅する方法も知られている。ここで、抗原と一次抗体および一次抗体と二次抗体の結合はどちらも特異的な反応であるが、一次抗体、二次抗体等は、抗原タンパク質の固定化されていない担体表面にも数多く非特異的に吸着する。非特異的に吸着した標識抗体等は、特異的反応によって吸着したものと同様にシグナルを発して検出感度を低下させる。同様の現象が、その他のタンパク質および核酸等の特異的結合の検出においても観察される。
【０００４】
従って、この非特異的な吸着を抑えることが、高感度検出のためには重要になる。このような非特異的な吸着を防止するため、従来、担体上に固定化された生体関連分子にこれと相互作用する分子を反応させる前に、生体関連分子が結合していない担体上にブロッキング剤を吸着させて、非特異的吸着を抑制していた。
【０００５】
このようなブロッキング剤として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）など相互作用に無関係なタンパク質が用いられてきた（非特許文献１参照）が、非特異的吸着が十分に抑制できない場合もあった。特に、表面が負に帯電した担体、例えば、表面にカルボキシル基を有する担体または該カルボキシル基をさらに活性エステル化した基などを有する担体等を用いる場合（特許文献１〜３参照）、正に帯電したタンパク質の非特異的吸着が問題となるが、ＢＳＡは負に帯電しているため、非特異的吸着を防止することが困難であった。また、その他の成分を含むブロッキング剤についても知られているが、これらも担体への吸着が不十分であるなど問題点を有していた。（特許文献４参照）。
【０００６】
特許文献５には、ポリアルキレングリコール残基をω−メルカプト脂肪酸残基を介して半導体結晶表面に結合することにより生体物質の非特異的吸着を制御する方法が記載されている。しかし、該方法は、配位子交換反応によりメルカプト基を有するポリアルキレングリコール残基を半導体結晶に配位させるものであるため、担体が金属酸化物等に限定される。また、ポリアルキレングリコール残基を半導体結晶に配位させるための調整も煩雑であるという問題があった。
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ ００／２２１０８
【特許文献２】ＷＯ ０２／１２８９１
【特許文献３】特開２００２−８２１１６号公報
【特許文献４】特開平６−１６０３８５号公報
【特許文献５】特開２００２−１２１５４９号公報
【非特許文献１】新生化学実験講座１、１９９４年、東京化学同人発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、生体関連分子の担体への非特異的吸着を効果的に抑制し、生体関連分子の相互作用の高感度な検出を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体と、前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤とを組み合わせることにより、生体関連分子の担体への非特異的吸着を効果的に抑制できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）担体に対する生体関連分子の非特異的吸着を阻害する方法であって、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体に対して、
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いることを特徴とする、前記方法。
【００１１】
（２）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体に対して、アミノ基またはメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
カルボキシル基を表面に有する担体に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
マレイミド基を表面に有する担体に対して、メルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
アミノ基を表面に有する担体に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いる、（１）記載の方法。
【００１２】
（３）末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドが、末端に官能基を有するポリエチレングリコールである、（１）または（２）記載の方法。
【００１３】
（４）担体が、表面にカーボン層を有し、該カーボン層上に化学修飾基を有するものである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００１４】
（５）担体が、高分子材料と、カーボンブラックおよび／または黒鉛とを混練して成形したものの表面に化学修飾基を有するものである、（４）記載の方法。
【００１５】
（６）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体、および
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤、
を含む、生体関連分子検出用キット。
【００１６】
（７）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体、およびアミノ基またはメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ、
カルボキシル基を表面に有する担体、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ、
マレイミド基を表面に有する担体、およびメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ、または
アミノ基を表面に有する担体、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ
を含む、（６）記載のキット。
【００１７】
（８）末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドが、末端に官能基を有するポリエチレングリコールである、（６）または（７）記載のキット。
【００１８】
（９）担体が、表面にカーボン層を有し、該カーボン層上に化学修飾基を有するものである、請求項（６）〜（８）のいずれかに記載のキット。
【００１９】
（１０）担体が、高分子材料と、カーボンブラックおよび／または黒鉛とを混練して成形したものの表面に化学修飾基を有するものである、（９）記載のキット。
【００２０】
（１１）担体上に生体関連分子をパターン状に固定化する方法であって、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体に、該化学修飾基と反応しうる官能基を有する化合物を目的のパターン状に適用すること、
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を前記担体に適用すること、および
得られた担体に、生体関連分子を適用すること
を含む、前記方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、生体関連分子の担体への非特異的吸着を効果的に抑制し、生体関連分子の相互作用を高感度に検出する手段が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、担体に生体関連分子を固定化し、この固定化分子と別の生体関連分子との特異的な結合を検出する系において、生体関連分子および標識分子等の担体への非特異的な吸着を阻害すること（以下、ブロッキングと称する場合もある）を目的とする。上記のような系を用いる検出系としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡチップ、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫検定法）、免疫凝集法（特開平１０−１９７５３０号公報）および免疫沈降法などが挙げられる。
【００２３】
本発明において、固定化および検出の対象となる生体関連分子は、生体中に存在する分子およびその誘導体である。生体関連分子としては、例えば、一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸、ポリペプチド、オリゴペプチド、糖などが挙げられる。ＰＮＡ（ペプチド核酸）等も包含される。ペプチド核酸とは、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸類のデオキシリボースやリボースからなる骨格に代えてペプチド骨格または偽ペプチド骨格、例えば、アミノエチルグリシン主鎖、ならびにポリアミド、ポリチオアミド、ポリスルフィンアミドおよびポリスルホンアミドを含む他の同様の主鎖を有する核酸擬似体であって、該主鎖に結合した核酸塩基を有する化合物を意味する。本発明において、ポリペプチドには、オリゴペプチドおよびタンパク質が包含される。本発明は、生体関連分子としてポリペプチドの相互作用を検出する場合において、その非特異的吸着を阻害する場合に特に好適である。本発明の方法に好適なポリペプチドとして、各種抗原および抗体、酵素、ならびにアビジン、ビオチン等が挙げられる。生体関連分子間の相互作用としては、抗原抗体反応、アビジン−ビオチンの結合反応、酵素と基質の結合反応、核酸相補鎖間のハイブリダイゼーション、リガンドとレセプターの結合反応、核酸と転写因子の結合反応、細胞接着因子の結合反応などが挙げられる。
【００２４】
本発明は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基（−ＣＯＯ−ＮＨＳ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、マレイミド基およびアミノ基（−ＮＨ２）からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体を用いることを特徴とする。
【００２５】
本発明において使用することができる担体としては、上記化学修飾基を表面に有し、生体関連分子を固定化できるものであれば特に制限されず、当技術分野で通常用いられるものを使用できる。例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライトおよび感光性ガラス；繊維；木材；紙；ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、四フッ化エチレンーパーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体(４．６フッ化、ＥＦＰ)、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（２フッ化、ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（３フッ化、ＰＣＴＦＥ）などのフッ素樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブテン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコールおよびポリ酢酸ビニルなどのポリオレフィン、ナイロン（例えば、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロンＭＸＤ６）などのポリアミド、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレートおよびポリトリメチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ乳酸、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ樹脂）、アクリル樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂ならびにエポキシ樹脂などの高分子材料等の表面に、上記化学修飾基が導入されたものが挙げられる。
【００２６】
さらに、本発明において用いる担体としては、表面にカーボン層を有し、該カーボン層上に化学修飾基を有するものが好ましい。このような担体としては、基板表面にカーボン層を有し、該カーボン層上に化学修飾基を有するものが挙げられる。ここで、基板の材料としては、上記と同様のものを使用できる。
【００２７】
カーボン層には、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。本発明においては、カーボン層として軟ダイヤモンド層が好ましい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。本発明の担体には、基板自体がカーボン層で形成されたものも含まれる。
【００２８】
基板へのカーボン層の形成は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。
【００２９】
高周波プラズマＣＶＤ法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にカーボン層、好ましくはＤＬＣ層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりカーボン層を形成してもよい。
【００３０】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
【００３１】
レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
【００３２】
本発明に用いる上記カーボン層を有する担体としては、前記のように基板の上にカーボン層を形成した構造だけでなく、前記の材料の積層体や複合体（例えば、ダイヤモンドと他の物質との複合体、（例えば２相体））であってもよい。
【００３３】
カーボン層を有する基板の一例としては、スライドガラスやシリコン基板に軟ダイヤモンド（ＤＬＣ）を製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ＤＬＣが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。表面処理層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。
【００３４】
ＤＬＣ層を形成することにより、高密度に生体関連分子を固定化でき、高いＳ／Ｎ比が得られるため、感度の高い検出が可能になる。また、繰り返し使用することも可能である。
【００３５】
担体の形状およびサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００３６】
カーボン層として、高分子材料と炭素系物質とを混練して成形したものを使用することもできる。この場合、担体全体がカーボン層で構成され、その表面に化学修飾基が導入されていることが好ましい。炭素系物質としては、カーボンブラックおよび黒鉛が挙げられる。従って本発明においては、担体として、高分子材料と、カーボンブラックおよび／または黒鉛とを混練して成形したものの表面に化学修飾基を有する担体を使用することができる。炭素系物質は単独で使用してもよく、複数種を混合して使用してもよい。
【００３７】
高分子材料としては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、四フッ化エチレンーパーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体(４．６フッ化、ＥＦＰ)、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（２フッ化、ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（３フッ化、ＰＣＴＦＥ）などのフッ素樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブテン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコールおよびポリ酢酸ビニルなどのポリオレフィン、ナイロン（例えば、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロンＭＸＤ６）などのポリアミド、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレートおよびポリトリメチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ乳酸、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ樹脂）、アクリル樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂およびエポキシ樹脂などが挙げられる。カーボンブラックとしては、公知のカーボンブラックを使用でき、例えば、チャンネルブラック、サーマルブラック、ファーネスブラック、アセチレンブラック、ケッチェンブラック、黒鉛化カーボンブラックなどが挙げられる。黒鉛としては、公知の黒鉛を使用でき、例えば、人造黒鉛、鱗片状黒鉛、鱗状黒鉛、土壌黒鉛などが挙げられる。上記高分子材料と、上記カーボンブラックおよび／または上記黒鉛との混練割合は特に限定されるものではない。混練の際に接着剤を添加し、成形してもよい。このように混練した材料は非特異的吸着を抑制できるだけでなく、自家蛍光を抑制でき、ペプチドのみならずＤＮＡ等の核酸も固定することができる。
【００３８】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基（−ＣＯＯ−ＮＨＳ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、マレイミド基およびアミノ基（−ＮＨ２）からなる群から選択される化学修飾基の担体表面への導入方法は、公知の方法を使用でき、特に制限されない。
【００３９】
アミノ基は、例えば、アミノ基含有化合物を用いて導入することができる。アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、または炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ基を有するシランカップリング剤（アミノアルキルトリアルコキシシラン）、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、またはこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００４０】
また、表面にカーボン層を有する担体については、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することによりアミノ基を導入できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミン等の多価アミン類ガスを、塩素化したカーボン層と反応させることによってアミノ基を導入することもできる。カーボン層をアンモニア雰囲気下でプラズマ法に付すことによってアミノ基を導入することもできる。ここで、プラズマ法とは、真空条件下、直流または交流による放電にプラズマを発生させ、原料ガスとして例えばベンゼンやメタンを用い、イオン化したガスでバイアスを印加した基板を処理する方法である。
【００４１】
カルボキシル基の導入は、例えば、上記のように導入されたアミノ基に適当な多価カルボン酸を反応させることにより実施できる。
【００４２】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基は、例えば、導入されたカルボキシル基を、カルボジイミドまたはジシクロヘキシルカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させるすることにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基が結合した基を形成することができる（特開２００１−１３９５３２）。
【００４３】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基は、ポリペプチドのアミノ基を強固に結合することができるためポリペプチドを効果的に固定化することができる。また、固定化されたポリペプチドの機能が損なわれることもない。さらに、本発明によりブロッキング剤を適用した場合であっても、固定化されたポリペプチドの機能が保持され、相互作用が阻害されることもない。
【００４４】
マレイミド基は、例えば、上記のように形成したアミノ基と、マレイミド基を有する化合物とを反応させることにより導入できる。例えば、以下の式II：
【００４５】
【化１】
で表される化合物またはその塩を反応させることにより、式III：
【００４６】
【化２】
で表されるようなマレイミド基をカーボン層上に形成することができる。
【００４７】
式IIまたはIIIにおいて、ｎは１〜１２、好ましくは４〜６の整数、より好ましくは５である。式IIで表される化合物の塩としては特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等を使用できる。ナトリウム塩を使用するのが好ましい。
【００４８】
具体的には、アミノ基が導入された担体を、バッファー中に通常０．１〜１００ｍＭの濃度で式IIの化合物を含む溶液に浸漬することにより反応させる。バッファーとしては、ＰＢＳ、トリエタノールアミンバッファー、ホウ酸ナトリウムバッファー等を使用することができる。ＰＢＳ（ｐＨ６〜９）を使用するのが好ましい。反応温度は、通常１０〜８０℃、好ましくは２５〜３０℃、反応時間は、通常１〜３００分、好ましくは３０〜６０分である。
【００４９】
本発明の担体において、上記マレイミド基は、共有結合によって担体と強固に結合しているため、洗浄や温度変化によっても剥離することがなく、また担体を長期間保存することも可能である。
【００５０】
本発明はまた、ブロッキング剤として、前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いることを特徴とする。
【００５１】
本発明においてブロッキング剤とは、当技術分野において通常用いられる意味を有する。すなわち、担体に生体関連分子を固定化し、この固定化分子と別の生体関連分子との特異的な結合を検出する系において、生体関連分子および標識分子等の担体への非特異的な吸着を防止するために使用される試薬を意味する。本発明のブロッキング剤は、前記の官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを、水やＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）等の水性溶媒に溶解することにより調製することができる。ブロッキング剤に含まれる前記ポリアルキレンオキシドの濃度は、当業者であれば適宜設定することができ、特に制限されないが、通常０．０１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１０００ｍｇ／ｍｌ程度である。
【００５２】
担体上の化学修飾基と共有結合を形成する官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いるのが好ましい。
【００５３】
好ましくは、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体に対して、アミノ基またはメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
カルボキシル基を表面に有する担体に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基、特にアミノ基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
マレイミド基を表面に有する担体に対して、メルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
アミノ基を表面に有する担体に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いる。
【００５４】
本発明においては、非特異的吸着の阻害効果およびポリペプチド相互作用に対する影響の観点から、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体に対して、アミノ基またはメルカプト基、特にアミノ基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いるのが好ましい。
【００５５】
本発明においてポリアルキレンオキシドは、（−Ｒ−Ｏ−）ｎで表される繰り返し単位を含むポリマーを意味する。ホモポリマー、ブロックコポリマーおよびランダムコポリマーも包含される。上記繰り返し単位においてＲは、直鎖または分岐鎖アルキレン基、好ましくは炭素数２〜１０、より好ましくは２〜６のアルキレン基を表し、ポリマー鎖中に異なる種類のＲが含まれていてもよい。好ましくは重量平均分子量２００〜１０００００、より好ましくは１０００〜５００００のホモポリマーである。最も好ましくは、ポリエチレングリコールである。
【００５６】
本発明の末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドにおいて、官能基はいずれの末端に存在していてもよく、両末端に存在していてもよいが、好ましくは片方の末端に存在する。その場合、担体上の化学修飾基と反応しうる官能基が存在しない側の末端基は、特に制限されず、ヒドロキシル基でもよく、あるいは、アルキルエーテル、好ましくはメチルエーテルおよびエチルエーテル、アリールエーテル、好ましくはフェニルエーテル、アルキルエステル、好ましくはメチルエステルおよびエチルエステル等の形態をとりうる。
【００５７】
本発明において、ポリアルキレンオキシドは、好ましくは、一般式I：
Ｒ１−Ｌ１−（−Ｒ２−Ｏ−）ｎ−Ｌ２−Ｘ （I）
【００５８】
[式中、
Ｘは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基であり、
Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のアルキル基、炭素数１０以下のアリール基、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５のアルコキシ基および炭素数１〜１０、好ましくは１〜５のアシル基からなる群から選択され、
Ｒ２は、炭素数２〜６、好ましくは２〜４のアルキレン基であり、
Ｌ１およびＬ２は、直接結合または連結基であり、
ｎは、４〜２３００、好ましくは２３〜１２００の自然数である］
で表される化合物である。
【００５９】
Ｌ１およびＬ２における連結基は、好ましくは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−Ｃ６Ｈ４−、−ＳＯ２−、−ＳＯ−、−ＮＨＣＯ−および−ＣＯＯ−から選択される二価の基により、好ましくは−Ｏ−により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数１〜３０、好ましくは２〜１０のアルキレン基であることができる。このようなアルキレン基は、分岐していてもよい。
【００６０】
Ｌ１およびＬ２の具体例としては、−（ＣＨ２）ａ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−、−ＣＯＯ−Ｃ６Ｈ４−および−（ＣＨ２）ｃ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｄ−などが挙げられる。ここでａ〜ｄは、それぞれ独立して、１〜５の整数、より好ましくは１〜３の整数である。
【００６１】
Ｒ１におけるアルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等の炭素数３以下のアルキル基、更に好ましくはメチル基またはエチル基、最も好ましくはメチル基である。Ｒ１におけるアリール基の具体例としては、フェニル基、トルイル基（モノメチルフェニル基）、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、イソプロピルフェニル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ビニルフェニル基、ピリジル基、モノメチルピリジル基、ジメチルピリジル基等が挙げられ、好ましくはフェニル基またはピリジル基である。Ｒ１におけるアシル基の具体例としては、アセチル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、マレオイル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基である。Ｒ１は好ましくは、ヒドロキシル基である。
【００６２】
Ｒ２の具体例としては、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基、ｎ−ペンチレン基、シクロペンチレン基、ｎ−ヘキシレン基、シクロヘキシレン基等が挙げられ、水溶性の点で好ましくはエチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基等の炭素数２〜４のアルキレン基が、更に好ましくはエチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基等の炭素数２または３のアルキレン基が、最も好ましくはエチレン基が使用される。一般式Iにおいて、１分子中に複数種のＲ２が混在していてもよく、この場合の共重合順序（シークエンス）にも制限はない。
【００６３】
Ｒ１−Ｌ１−は、好ましくはＨＯ−である。
【００６４】
−Ｌ２−Ｘは、好ましくは、−（ＣＨ２）ａ−ＮＨ２、−（ＣＨ２）ａ−ＣＯＯ−ＮＨＳ、−（ＣＨ２）ａ−ＳＨ、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＯ−ＮＨＳ、および−（ＣＨ２）ｃ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｄ−マレイミドである。
【００６５】
本発明で使用できる末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドの具体例としては、（株）日本油脂製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴシリーズが挙げられる。
【００６６】
本発明において上記ブロッキング剤を用いた非特異的吸着の阻害は、当技術分野において一般に使用されているブロッキング剤と同様に使用することができる（例えば、分子生物学実験プロトコール、平成９年、丸善株式会社発行参照）。一実施形態として、担体にポリペプチドを固定化してこれと相互作用するポリペプチドを検出する方法を以下に説明する。
【００６７】
まず、ポリペプチド溶液を、好適な担体上にブロッティングすることにより固定化する。その後、当該担体を自然乾燥または減圧乾燥し、室温で約１時間静置する。続いて、使用した担体を好適なブロッキング剤に浸して１時間ほど振とうする。このときの浸漬温度は、０〜１００℃、好ましくは２０〜６０℃である。その後、水で洗浄し、遠心乾燥して、通常、０〜１００℃、好ましくは６０〜１００℃で乾燥させる。または、通常、１０〜６０℃、好ましくは１５〜３０℃で減圧乾燥させる。このようにブロッキング処理をした後、担体上に固定化されたポリペプチドと相互作用するポリペプチドを含有する溶液を添加する。
【００６８】
生体関連分子間の相互作用は、当技術分野で通常用いられる標識によって検出することができる。このような標識としては、放射性同位元素、酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびルシフェラーゼ、ならびに蛍光剤、例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、化学発光分子等が挙げられる。
【００６９】
あるいは、相互作用した後の担体を、そのままレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等で分析することもできる。イオン化法の様式としては、マトリックス補助レーザ脱着（ＭＡＬＤＩ）法が好ましい。
【００７０】
本発明はまた、上記のようなブロッキング方法を用いて生体関連分子を検出するためのキット関する。本発明の生体関連分子検出用キットは、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体、および
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を含む。担体およびブロッキング剤については、上記のとおりである。
【００７１】
本発明のキットは、上記担体およびブロッキング剤を含むことを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。例えば、生体分子を分解するための酵素、緩衝液、マトリックス溶媒、洗浄バッファー、試料希釈液、反応停止液、標準物質等を含みうる。更に本発明のキットには、アッセイ方法を説明するためのインストラクションマニュアルを組み合せることもできる。
【００７２】
本発明者らはまた、表面に化学修飾基を有する担体に、該化学修飾基と反応しうる官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を適用する前に、該化学修飾基と反応しうる官能基を有する別の化合物をスポッティング等により担体上に部分的に適用すると、担体表面において該化合物を適用した領域ではブロッキング作用が生じないことを見いだした。これは、担体上の化学修飾基に別の化合物に含まれる官能基が結合した結果、ポリアルキレンオキシドが担体に結合できず、ブロッキング作用が阻害されたためと考えられる。
【００７３】
従って、担体に生体関連分子を固定化する前に、担体上の化学修飾基と反応しうる官能基を有する別の化合物（末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドとは異なる化合物）を部分的に適用し、続いて担体上の化学修飾基と反応しうる官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを適用することにより、化学修飾基と反応しうる官能基を有する別の化合物を適用した部分にのみ生体関連分子を固定化できることが明らかとなった。
【００７４】
すなわち本発明は、担体上に生体関連分子をパターン状に固定化する方法であって、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体に、該化学修飾基と反応しうる官能基を有する化合物を目的のパターン状に適用すること、
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを前記担体に適用すること、
得られた担体に、生体関連分子を適用すること
を含む、前記方法に関する。
【００７５】
当該方法は、生体関連分子としてポリペプチドを用いる場合に好適である。
【００７６】
すなわち、表面に化学修飾基を有する担体に、目的の生体関連分子、好ましくはポリペプチドを固定化したい部分にのみ該化学修飾基と反応しうる官能基を有する化合物であって、ポリアルキレンオキシド以外の化合物を適用し、その後、該化学修飾基と反応しうる官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを適用し、洗浄後、目的の生体関連分子を担体に適用する。
【００７７】
ここで、表面に化学修飾基を有する担体としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体が好ましく、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基と反応しうる官能基を有する別の化合物としては、アミノ基含有化合物、特にポリアリルアミンが好ましく、担体上の化学修飾基と反応しうる官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドとしては、末端にアミノ基を有するポリアルキレンオキシドが好ましい。
【００７８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７９】
（実施例１）ガラス表面に化学修飾基を有する担体
ガラス表面に化学修飾基として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、またはアミノ基を有する担体を以下のように調製した。
(1)２５ｍｍ×７５ｍｍのスライドガラスをアルカリ洗浄し、３−アミノプロピルトリエトキシシランおよびポリアリルアミンで処理することにより、化学修飾基としてアミノ基を有する担体を得た（ＮＨ２担体）。
(2)(1)で得られた担体をポリアクリル酸で処理することにより、化学修飾基としてカルボキシル基を有する担体を得た（ＣＯＯＨ担体）。
(3)(2)で得られた担体を、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に浸漬することによって化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体を得た（ＮＨＳ担体）。
【００８０】
上記で得られた担体を、末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−２０Ｈ、（株）日本油脂製）、末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−０２０ＣＳ、（株）日本油脂製）または末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−０２０ＳＨ、（株）日本油脂製）をそれぞれ含むブロッキング剤（１００ｍｇ／ｍｌの水溶液）に１時間浸漬した。担体を取り出しＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）で洗浄した後、Ｃｙ３標識抗ＢＳＡ抗体の溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）に１時間浸漬した。浸漬は、担体上にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で円状のウェルを作成し、該ウェルにブロッキング剤または蛍光標識抗体溶液を滴下し、湿箱中でインキュベートすることにより行った（図１上）。担体を取り出しＰＢＳで洗浄した後、蛍光画像装置ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム製）を用いて蛍光画像を観察した。
【００８１】
結果を図１に示す。図１の結果から、本発明により、ポリペプチドの非特異的吸着を効果的に阻害できることが示された。また、化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体（図中、ＮＨＳ担体と表記）に対しては、末端にアミノ基を有するポリアルキレンオキシド（図中、ＮＨ２−ＰＥＧと表記）を含むブロッキング剤を用いるのが好ましく、化学修飾基としてアミノ基を有する担体（図中、ＮＨ２担体と表記）に対しては、末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するポリアルキレンオキシド（図中、ＮＨＳ−ＰＥＧと表記）を含むブロッキング剤を用いるのが好ましく、化学修飾基としてカルボキシル基を有する担体（図中、ＣＯＯＨ担体と表記）に対しては、末端にアミノ基を有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いるのが好ましいことがわかった。
【００８２】
（実施例２）シリコン基板上のカーボン層表面に化学修飾基を有する担体
シリコン基板上のカーボン層表面に化学修飾基として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基またはマレイミド基を有する担体を以下のように調製した。
(1)３ｍｍ角のシリコン基板にイオン化蒸着法によって、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１０ｎｍの厚みに形成した。その後に、アンモニアガスを５ｃｍ３／分の割合でチャンバーに挿入した。作動圧を２ＰａとしてアンモニアプラズマでＤＬＣ表面を処理した。
(2)(1)で得られた担体をポリアクリル酸で処理することにより、カルボキシル基を導入し、続いて、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に浸漬することによって化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体を得た（ＮＨＳ担体）。
(3)(1)で得られた担体をポリアリルアミンで処理することにより、化学修飾基としてアミノ基を有する担体を得た（ＮＨ２担体）。
(4)(1)で得られた担体をスルホ−ＥＭＣＳ（同仁化学研究所（株））で処理することにより化学修飾基としてマレイミド基を有する担体を得た（マレイミド担体）。
【００８３】
上記で得られた担体を、末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−２０Ｈ、（株）日本油脂製）、末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−０２０ＣＳ、（株）日本油脂製）または末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−０２０ＳＨ、（株）日本油脂製）をそれぞれ含むブロッキング剤（１００ｍｇ／ｍｌの水溶液）に１時間浸漬した。担体を取り出しＰＢＳ（リン酸緩化食塩水）で洗浄した後、Ｃｙ３標識抗ＢＳＡ抗体の溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）に１時間浸漬した。担体を取り出しＰＢＳで洗浄した後、蛍光画像装置ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム製）を用いて蛍光画像を観察した。
【００８４】
結果を図２に示す。図２の結果から、本発明により、ポリペプチドの非特異的吸着を効果的に阻害できることが示された。また、化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体（図中、ＮＨＳ担体と表記）に対しては、末端にアミノ基またはメルカプト基を有するポリアルキレンオキシド（図中、ＮＨ２−ＰＥＧまたはＳＨ−ＰＥＧと表記）を含むブロッキング剤を用いるのが好ましく、化学修飾基としてアミノ基を有する担体（図中、ＮＨ２担体と表記）に対しては、末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するポリアルキレンオキシド（図中、ＮＨＳ−ＰＥＧと表記）を含むブロッキング剤を用いるのが好ましく、化学修飾基としてマレイミド基を有する担体（図中、マレイミド担体と表記）に対しては、末端にメルカプト基を有するポリアルキレンオキシド（図中、ＳＨ−ＰＥＧと表記）を含むブロッキング剤を用いるのが好ましいことがわかった。
【００８５】
（実施例３）ポリペプチド−ポリペプチド相互作用の検出
実施例２で作成したシリコン基板上のＤＬＣ層表面に化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基またはマレイミド基を有する担体を用いてポリペプチド−ポリペプチド相互作用の検出を行った（図３）。
(1)ＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中、２００μｇ／ｍｌ）を各担体にスポッティングし、１時間反応させた。
(2)担体を各種修飾ポリエチレングリコールを含むブロッキング剤（１００ｍｇ／ｍｌの水溶液）に１時間浸漬した。化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体は、末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−２０Ｈ、（株）日本油脂製）または末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−０２０ＳＨ、（株）日本油脂製）を含むブロッキング剤に浸漬した。化学修飾基としてアミノ基を有する担体は、末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−０２０ＣＳ、（株）日本油脂製）を含むブロッキング剤に浸漬した。化学修飾基としてマレイミド基を有する担体は、末端にメルカプト基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−０２０ＳＨ、（株）日本油脂製）を含むブロッキング剤に浸漬した。
(3)担体を取り出しＰＢＳで洗浄し、Ｃｙ３標識抗ＢＳＡ抗体の溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）またはＣｙ３標識抗ＩＬ−２（インターロイキン−２）抗体の溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）に１時間浸漬した。担体を取り出しＰＢＳで洗浄した後、蛍光画像装置ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム製）を用いて蛍光画像を観察した。結果を図４に示す。
【００８６】
図４の結果から、本発明により、ポリペプチドの非特異的吸着を効果的に阻害できるととともに、ポリペプチドの機能を阻害することもなく、ポリペプチドの相互作用を正確に検出できることが示された。また、化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体を用いて、末端にアミノ基またはメルカプト基を有するポリアルキレンオキシド、特に末端にアミノ基を有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いるのが最も効果的であると考えられる。
【００８７】
（実施例４）ポリペプチドの部分的な固定化
(1)実施例２で作成した、化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体に、ポリアリルアミン水溶液（１ｗｔ％）０．３μｌを２００μｍ径でスポットし、８０℃で３０分間乾燥させた。
(2)末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−２０Ｈ、（株）日本油脂製）の水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）に１時間浸漬した。
(3)担体を取り出しＰＢＳで洗浄した後、Ｃｙ３標識ＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）に１時間浸漬した。
(4)担体を取り出しＰＢＳで洗浄した後、蛍光画像装置ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム製）を用いて蛍光画像を観察した。結果を図５の上に示す。
【００８８】
また、(1)においてポリアリルアミン水溶液をスポットするかわりに、超純水０．３μｌを２００μｍ径でスポットしたこと以外は上記工程と同様の工程を実施し、蛍光画像を観察した。結果を図５の下に示す。
【００８９】
図５の結果から、アミノ基含有化合物であるポリアリルアミンをスポットした領域にのみＢＳＡが固定化されていることがわかる。従って、ポリアリルアミンをスポットした領域においては、末端にアミノ基を有するポリエチレングリコールの担体への結合が阻害され、ブロッキング作用が失われたことがわかる。
【００９０】
（実施例５）炭素系物質と高分子材料とを混練成形した担体
(1)ポリプロピレン（三井ポリプロ製Ｆ３２９Ｔ）９０部およびカーボンブラック（三菱化学製＃３２３０Ｂ）１０部を、押出機を用いて２００℃にて０．２ｍｍ厚にシート成形した。続いて、１９０℃で１ｍｍ厚にプレス成形し、３ｍｍ角に切断した。
(2)(1)で得られたチップに、イオン化蒸着法により、作動圧２Ｐａでアンモニアプラズマに曝すことにより表面にアミノ基を導入した。続いて無水コハク酸で処理することによりカルボキシル基を導入し、さらに１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液で処理することによって、化学修飾基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する担体を得た（ＮＨＳ担体）。
(3)(2)で得られた担体を用いてポリペプチド−ポリペプチド相互作用の検出を行った。ＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中、２００μｇ／ｍｌ）を担体にスポッティングし、１時間反応させた。担体を末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−２０Ｈ、（株）日本油脂製）を含むブロッキング剤（１００ｍｇ／ｍｌの水溶液）に１時間浸漬した。担体を取り出しＰＢＳ（リン酸緩化食塩水）で洗浄した後、Ｃｙ３標識抗ＢＳＡ抗体の溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）またはＣｙ３標識抗ＩＬ−２（インターロイキン−２）抗体の溶液（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）に１時間浸漬した。担体を取り出しＰＢＳで洗浄した後、蛍光画像装置ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム製）を用いて蛍光画像を観察した。
【００９１】
結果を図６に示す。炭素系物質と高分子材料とを混練成形し化学修飾基を導入して担体として用いた場合も非特異吸着を抑制できることが示された。高分子材料に炭素系物質を練り込むことにより、自家蛍光を抑制でき、ペプチドアレイのみならずＤＮＡアレイ用基板として用いることができることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】実施例１における浸漬方法、および化学修飾基を有するガラス担体を、各種修飾ポリエチレングリコールでブロッキングした後、蛍光標識抗ＢＳＡ抗体溶液に浸漬し、洗浄後、蛍光画像観察した結果を示す。
【図２】実施例２で、化学修飾基を有するシリコン−ＤＬＣ担体を、各種修飾ポリエチレングリコールでブロッキングした後、蛍光標識抗ＢＳＡ抗体溶液に浸漬し、洗浄後、蛍光画像観察した結果を示す。
【図３】実施例３の手順の概要を示す。
【図４】実施例３で、化学修飾基を有するシリコン−ＤＬＣ担体に、ＢＳＡ溶液をスポッティングし、各種修飾ポリエチレングリコールでブロッキングした後、蛍光標識抗ＢＳＡ抗体または蛍光標識抗ＩＬ−２抗体の溶液に浸漬し、洗浄後、蛍光画像観察した結果を示す。
【図５】実施例４で、蛍光画像観察した結果を示す。
【図６】実施例５で、蛍光画像観察した結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体に対する生体関連分子の非特異的吸着を阻害する方法であって、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体に対して、
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体に対して、アミノ基またはメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
カルボキシル基を表面に有する担体に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
マレイミド基を表面に有する担体に対して、メルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
アミノ基を表面に有する担体に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドが、末端に官能基を有するポリエチレングリコールである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
担体が、表面にカーボン層を有し、該カーボン層上に化学修飾基を有するものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
担体が、高分子材料と、カーボンブラックおよび／または黒鉛とを混練して成形したものの表面に化学修飾基を有するものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体、および
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤、
を含む、生体関連分子検出用キット。
【請求項７】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体、およびアミノ基またはメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ、
カルボキシル基を表面に有する担体、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ、
マレイミド基を表面に有する担体、およびメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ、または
アミノ基を表面に有する担体、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ
を含む、請求項６記載のキット。
【請求項８】
末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドが、末端に官能基を有するポリエチレングリコールである、請求項６または７記載のキット。
【請求項９】
担体が、表面にカーボン層を有し、該カーボン層上に化学修飾基を有するものである、請求項６〜８のいずれか１項記載のキット。
【請求項１０】
担体が、高分子材料と、カーボンブラックおよび／または黒鉛とを混練して成形したものの表面に化学修飾基を有するものである、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
担体上に生体関連分子をパターン状に固定化する方法であって、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体に、該化学修飾基と反応しうる官能基を有する化合物を目的のパターン状に適用すること、
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を前記担体に適用すること、および
得られた担体に、生体関連分子を適用すること
を含む、前記方法。
【請求項１】
担体に対する生体関連分子の非特異的吸着を阻害する方法であって、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体に対して、
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体に対して、アミノ基またはメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
カルボキシル基を表面に有する担体に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
マレイミド基を表面に有する担体に対して、メルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用い、
アミノ基を表面に有する担体に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドが、末端に官能基を有するポリエチレングリコールである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
担体が、表面にカーボン層を有し、該カーボン層上に化学修飾基を有するものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
担体が、高分子材料と、カーボンブラックおよび／または黒鉛とを混練して成形したものの表面に化学修飾基を有するものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体、および
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤、
を含む、生体関連分子検出用キット。
【請求項７】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を表面に有する担体、およびアミノ基またはメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ、
カルボキシル基を表面に有する担体、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ、
マレイミド基を表面に有する担体、およびメルカプト基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ、または
アミノ基を表面に有する担体、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤の組合せ
を含む、請求項６記載のキット。
【請求項８】
末端に官能基を有するポリアルキレンオキシドが、末端に官能基を有するポリエチレングリコールである、請求項６または７記載のキット。
【請求項９】
担体が、表面にカーボン層を有し、該カーボン層上に化学修飾基を有するものである、請求項６〜８のいずれか１項記載のキット。
【請求項１０】
担体が、高分子材料と、カーボンブラックおよび／または黒鉛とを混練して成形したものの表面に化学修飾基を有するものである、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
担体上に生体関連分子をパターン状に固定化する方法であって、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、カルボキシル基、マレイミド基およびアミノ基からなる群から選択される化学修飾基を表面に有する担体に、該化学修飾基と反応しうる官能基を有する化合物を目的のパターン状に適用すること、
前記担体上の化学修飾基と反応しうる官能基であって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、メルカプト基およびアミノ基からなる群から選択される官能基を末端に有するポリアルキレンオキシドを含むブロッキング剤を前記担体に適用すること、および
得られた担体に、生体関連分子を適用すること
を含む、前記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−３０８３０７（Ｐ２００６−３０８３０７Ａ）
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１２７９３８（Ｐ２００５−１２７９３８）
【出願日】平成１７年４月２６日（２００５．４．２６）
【出願人】（３９０００３１９３）東洋鋼鈑株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２６日（２００５．４．２６）
【出願人】（３９０００３１９３）東洋鋼鈑株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
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