生物学的に活性なペプチド
【課題】免疫応答を変調することのできる生物学的に活性なポリペプチドを提供する。
【解決手段】３０個の実質的に純粋かつ生物学的に活性なペプチド、生物学的に活性なペプチドをコードしている配列を有する核酸およびそれから生産される医薬処方。該ペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調する。
【解決手段】３０個の実質的に純粋かつ生物学的に活性なペプチド、生物学的に活性なペプチドをコードしている配列を有する核酸およびそれから生産される医薬処方。該ペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学の分野に関する。特に、本発明は、免疫応答を変調することのできるペプチドおよびその医薬組成物に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは、疾患の治療の分野において、医薬組成物として知られている。例えば、特許文献１は、平滑筋細胞の成長に対する阻害活性を有し、したがって、動脈硬化症、血管形成後の再狭窄、血管移植後の管腔狭窄および平滑筋肉腫などの平滑筋細胞の成長に関連する病理学的状態の予防および治療に有用なペプチドを開示する。特許文献２は、重量増加、上皮増殖帯の活性および毛髪成長などの生理学的プロセスを変調することが見出された別のペプチドを開示する。
【特許文献１】米国特許第６，１９１，１１３号
【特許文献２】米国特許第６，１８４，２０８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の目的は、生物学的に活性なポリペプチドを同定することにある。多くのペプチドが、標準的な化学的方法によって合成され、その生物学的活性についてスクリーンされた。該ペプチドには、ＣＭＳの後に番号を付したコードを与える。全部で３０個のペプチドが、イン・ビボ生物学的活性を有すると同定された。これらの生物学的に活性なペプチドの配列および対応するＩＤ番号を表Ａに示す。
【０００４】
【表１】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明の１の態様は、配列番号１ないし配列番号３０として同定された配列を有する実質的に純粋なペプチドに関する。かくして、本発明は、また、配列番号１−３０からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドに関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドに関する。特定の具体例において、該ペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
【０００６】
本発明の別の態様は、配列番号１−３０として同定された配列を有するペプチドの機能的誘導体である実質的に純粋なペプチドに関する。かくして、本発明は、また、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸の機能的誘導体であるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドに関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体であるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドに関する。特定の具体例において、機能的誘導体である該ペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
【０００７】
本発明の別の態様は、配列番号１ないし３０として上記で同定されたペプチドをコードしている配列を有する核酸に関する。本発明のさらなる態様は、配列番号１ないし３０として下記に示されるペプチドの核酸配列を含有する発現ベクターに関する。かくして、本発明の該態様は、また、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。本発明は、また、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列からなる、ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。
【０００８】
また、本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドの隣りにリーダーまたはシグナルペプチドを含有するハイブリッドペプチドに関する。本発明は、また、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの機能的誘導体を含むペプチドの隣りにリーダーペプチドを含有するハイブリッドペプチドに関する。
【０００９】
本発明は、また、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列を含むペプチドの隣りにリーダーアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列からなる、ペプチドの隣りにリーダーアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。
【００１０】
特定の具体例において、上記の遺伝子ベクターのいずれかにおいて生産されたペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
また、本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むゲノムを有する微生物に関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むゲノムを有する微生物に関する。
【００１１】
また、本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列を含む外来性ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝物質を有する微生物に関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列からなる、外来性ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝的構成物を有する微生物に関する。本明細書で使用される場合、外来性ペプチドなる語は、天然の非修飾形態の微生物によって正常に発現されるいずれか他のペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドをいう。
【００１２】
また、本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドの隣りにリーダーアミノ酸配列を含む外来性ハイブリッドペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝的構成物を有する微生物に関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ペプチドの隣りにリーダーアミノ酸配列を含むハイブリッドペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むゲノムを有する微生物に関する。
【００１３】
また、本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列を含むペプチドの隣りにリーダーアミノ酸配列を含む外来性ハイブリッドペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝的構成物を有する微生物に関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列からなる、ペプチドの隣りにリーダーアミノ酸配列を含む外来性ハイブリッドペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝的構成物を有する微生物に関する。
【００１４】
特定の具体例において、上記の微生物のいずれかにおいて生産されたペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
【００１５】
また、本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物に関する。本発明は、また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物に関する。
本発明は、また、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体を含む実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物に関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体からなる、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物に関する。さらに、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体からなる、実質的に純粋なペプチドからなる医薬組成物に関する。
【００１６】
特定の具体例において、上記の医薬組成物のいずれかにおいて存在するペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
【００１７】
また、本発明のさらに別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを提供し；次いで、該実質的に純粋なペプチドを医薬上許容される担体と混合することを特徴とする、医薬組成物の製造法に関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドを提供することを特徴とする、医薬組成物の製造法に関する。
本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体であるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを提供し；次いで、該実質的に純粋なペプチドを医薬上許容される担体と混合することを特徴とする、医薬組成物の製造法である。
【００１８】
さらに、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体であるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドを提供することを特徴とする、医薬組成物の製造法に関する。
上記の方法のいずれかに関し、該ペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
【００１９】
また、本発明のさらなる態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドの医薬上有効量をヒトに投与することを特徴とする、ヒトの治療法に関する。また、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体であるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドの医薬上有効量を投与することを特徴とする、ヒトの治療法に関する。
特定の具体例において、上記のヒトの治療に使用されるペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調するために使用されうる。
【００２０】
上記の核酸配列に関し、これらの核酸配列から発現されるペプチドおよび／またはハイブリッドペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
本発明の別の態様は、配列番号１ないし配列番号３０の配列を有する実質的に純粋なペプチドの医薬上有効量を投与することを特徴とする、疾患の治療法に関する。特定の具体例において、そのように投与されるペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
【００２１】
上記のように、本発明の別の具体例は、本質的に本発明のペプチドからなる、ペプチドまたはポリペプチドである。本明細書で使用される場合、「本質的に、・・・からなる」なる語は、カルボキシおよび／またはアミノ末端に付加的なアミノ酸を有する本発明のペプチドのアミノ酸配列を包含し、かつ、本明細書において提供される本発明のペプチドの活性を維持するペプチドまたはポリペプチドをいう。かくして、非制限的な例として、本発明のペプチドの活性が免疫活性を変調することである場合、「本質的に、本発明のペプチドからなる」ペプチドまたはポリペプチドは、該ペプチドに関して本明細書において提供されるような免疫活性を変調する活性を有し、かつ、該ペプチドまたはポリペプチドの免疫活性変調能を著しく減少するかまたは免疫活性のモジュレーターとしての該ペプチドの基本的かつ新規な特徴の具体的変化を構成するいずれの特徴も有さないであろう。かくして、上記の例において、免疫活性の変調以外の一次活性を有し、本発明のペプチドのアミノ酸配列をどこかに含有する全長の天然ポリペプチドは、「本質的に、本発明のペプチドからなる」ペプチドまたはポリペプチドを構成しない。同様に、上記の例において、免疫活性の変調以外の一次活性を有するが、本発明のペプチドのアミノ酸配列をどこかに含む遺伝子操作されたペプチドまたはポリペプチドは、「本質的に、本発明のペプチドからなる」ペプチドまたはポリペプチドを構成しない。
【００２２】
上記の説明に用いられた免疫活性変調の例のほかに、本発明のペプチドのために提供された活性に関する全てのペプチドに、上記の定義が適用される。特に、上記の定義は、下記に詳述されるように、ウイルス感染の程度の変調、肝炎感染の程度の変調、腎炎の程度の変調、癌の成長の変調または体重の変調における活性を有する本発明のペプチドに適用する。
当業者は、上記の定義のもとに、本発明の特定のペプチドに関して本明細書に提供される免疫活性の変調、ウイルス感染の程度の変調、肝炎感染の程度の変調、腎炎の程度の変調、癌の成長の程度の変調または体重の変調に関するアッセイを用いてペプチドまたはポリペプチドの活性を測定することによって、ペプチドまたはポリペプチドが本質的に本発明のペプチドからなるかどうかを容易に決定できる。
【００２３】
好ましい具体例において、「本質的に、・・・からなる」なる語は、本発明のペプチドのほかに２０個未満のアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドをいう。より好ましい具体例において、該用語は、本発明のペプチドのほかに１５個未満のアミノ酸残基を有するペプチドをいう。まだより好ましい具体例において、該用語は、本発明のペプチドのほかに１０個未満のアミノ酸残基を有するペプチドをいう。別の好ましい具体例において、該用語は、本発明のペプチドの１つのほかに６個未満のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドをいう。別の好ましい具体例において、該用語は、本発明のペプチドの１つのほかに４個未満のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドをいう。最も好ましい具体例において、本発明のペプチドの１つのほかに２個未満のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドをいう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
ペプチドは、標準的な合成法によって、Ｌ−アミノ酸から容易に合成できるが、また、個々のペプチドをコードしている配列を有する核酸を用いて遺伝子操作方法によって合成してもよい。
【００２５】
Ｉ．生物学的活性
ペプチドの可能性のある生物学的活性を研究するために、動物モデルに対するペプチドの免疫学的影響を、中華人民共和国の衛生部によって発行された「新規薬物の前臨床研究の原理」［１］に従う手法で調べた。
Ｔリンパ球形質転換試験、ＮＫ細胞細胞毒活性試験およびＴリンパ球ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌試験を用いて、特異的細胞免疫機能に対するペプチドのいずれかの可能性のある影響を検出した。炭素粒子クリアランス試験を用いて、非特異的細胞免疫機能に対するペプチドのいずれかの可能性のある影響を検出した。ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）溶血試験を用いて、体液性免疫機能に対するペプチドのいずれかの可能性のある影響を検出した。免疫器官重量試験を用いて、該器官レベルにてペプチドのいずれかの可能性のある影響を検出した。
【００２６】
該研究において、セーライン群を負の対照として用い、一方、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γはよく研究された免疫賦活剤なので［１０］、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ群を正の対照として用いた。１０００倍投与量範囲に及ぶまでの４つの任意の濃度の試料ペプチドを該研究に用いた。イン・ビボ免疫学的応答の内因性の複雑さのため、および投与量対応答機能における事前知識の欠如のため、いずれかの投与量群における負の対照を超えるいずれかの統計学的に有意な差を、正の生物学的活性として記録した。
【００２７】
該研究の結果は下記のとおりであった：
１．ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２９およびＣＭＳ０３４は、Ｔリンパ球形質転換を増強することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見いだされた。ペプチドＣＭＳ０１４およびＣＭＳ０３６はまた、Ｔリンパ球形質転換を阻害することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見いだされた。
【００２８】
２．ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、ＮＫ細胞の細胞毒活性を増加することができ、セーライン正常対照群に対する統計学に有意な差を有することが見いだされた。ペプチドＣＭＳ００８およびＣＭＳ０１２はまた、適当な濃度で、ＮＫ細胞の細胞毒活性を減少することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【００２９】
３．ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２およびＣＭＳ０３４は、Ｔリンパ球によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）の分泌を増強することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【００３０】
４．ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２およびＣＭＳ０２８は、Ｔリンパ球によるＩＦＮの分泌を増強することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【００３１】
５．ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、抗原性攻撃における抗−ＳＲＢＣ抗体の合成を増強することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。ペプチドＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３６は、適当な濃度にて、抗原性攻撃における抗−ＳＲＢＣ抗体の合成を阻害することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【００３２】
６．ペプチドＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３５、ＣＭＳ０３６は、単核食細胞の食作用活性を増強することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的有意差を有することが見出された。
【００３３】
７．ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、胸腺の重量を増加することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【００３４】
８．ペプチドＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０およびＣＭＳ０３０は、脾臓の重量を増加することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２９およびＣＭＳ０３６はまた、適当な濃度にて、脾臓の重量を減少することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【００３５】
マウスに対する該ペプチドの影響を分析するために使用された材料および方法を下記する。
【００３６】
材料
１．実験動物
中華人民共和国の国立医学研究所（National Institute of Medical Science）、実験動物センターによって提供されたＢＡＬＢ／ｃマウス、体重１８−２２ｇ、５０％雌および５０％雄。
２．投与
組み換えマウスＩＦＮ−γ（ｒｍＩＦＮ−γ）群：３ｘ１０５ＩＵ／ｋｇ／日
組み換えヒトＩＬ（ｒｈＩＬ）−２群：３ｘ１０５ＩＵ／ｋｇ／日
セーライン群：０．５ｍｌ／各／日
ペプチド投与量Ｉ群：５００μｇ／ｋｇ／日
ペプチド投与量ＩＩ群：５０μｇ／ｋｇ／日
ペプチド投与量ＩＩＩ群：５μｇ／ｋｇ／日
ペプチド投与量ＩＶ群：０．５μｇ／ｋｇ／日
上記物質を全て、０．５ｍｌセーライン中に溶解し、１日に１回、１５日間連続で、腹膜内（ｉ．ｐ．）注射した。
【００３７】
３．主要な試薬
ペプチドは、American Peptide Company, Inc., USAで注文製造した。
胎仔ウシ血清およびＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地（Gibco, USA）
ＭＴＴおよびＣｏｎＡ（Sigma, USA）
ｒｍＩＦＮ−γ（Beijing Biotech Inc., China）
ｒｈＩＬ−２（Shanghai Huaxin Biotech Inc., China）
リンパ球分離溶液（Research Institute of Hematologic Disease, National Institute of Medical Science, PR China）
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２標準試料（National Institute For Control of Pharmaceutical and Biological Products, PR China）
ＨＴ−２細胞およびＬ９２９細胞（中華人民共和国、北京大学免疫学部のWF Chen教授からの贈与物）
【００３８】
方法
１．細胞性免疫に対するペプチドの影響
１．１脾臓細胞懸濁の調製［１，２］
ＢＡＬＢ／ｃマウスを無作為に、ペプチド、ＩＦＮ、ＩＬ−２、およびセーライン群に分けた。１群あたりマウス１０匹。最後の試験物質投与の次の日に、マウスを頚部脱臼によって殺した。脾臓を無菌状態で単離し、注射針を用いて、冷Ｄ−Ｈａｎｋ溶液中に手動で分散させた。分散した細胞懸濁をさらに、１００ゲージ１５０μｍ直径のステンレススチールシーブにより篩い分けした。２００ｇで１０分間の遠心分離後、上清を廃棄した。細胞ペレットを１０容量のＴｒｉｓ−ＮＨ４Ｃｌバッファー中に再懸濁し、次いで、室温で１０分間静置させた。懸濁した細胞を１５０ｇで１０分間の遠心分離によって収集した。細胞を、再懸濁および上記条件の遠心分離による収集によって、冷Ｄ−Ｈａｎｋ溶液で２−４回洗浄した。洗浄した細胞を次いで、１０％胎仔ウシ血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培養培地により、所望の細胞密度に希釈した。
【００３９】
１．２Ｔリンパ球形質転換に対するペプチドの影響［１，２］
１ｘ１０６／ｍｌ密度の脾臓細胞を９６ウェル細胞培養プレート上に、１００μｌ／ウェルにて、マウス１匹あたりアッセイ試料および対照試料の各々を３つの並行したウェルに置いた。アッセイウェルに、ＲＰＭＩ−１６４０中１００μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ １００μｌ／ウェルを加え、無添加のＲＰＭＩ−１６４０ １００μｌ／ウェルを対照に用いた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６６時間インキュベートした。次いで、細胞を１５０ｇで１０分間遠心分離によりペレット化した。上清を収集し、サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ測定のために、−２０℃で保存した。
【００４０】
ＲＰＭＩ−１６４０中１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ ５０μｌ／ウェルを細胞ペレットに加え、２分間の振盪によって細胞を再懸濁させた。インキュベーションを４時間続けた。１５０ｇで１０分間の遠心分離後に、上清を廃棄した。１２０μｌの４０ｍＭ ＨＣｌ−２−プロパノールを細胞ペレットに加え、３分間振盪して、６３０ｎｍをリファレンスとして各ウェルのＯＤ５７０ｎｍを得た。ＥＬＩＳＡリーダーを用いた。
計算：
各マウスは、３つのアッセイウェルおよび３つの対照ウェルを構成した。各マウスの刺激指数（Stimulation Index（ＳＩ））を、まず、３つの並行ウェルの平均ＯＤを求め、次いで、アッセイウェルの値を対照ウェルで除することによって得た。
【００４１】
１．３ＮＫ細胞活性に対するペプチドの影響［３，４］
マウス脾臓細胞を上記セクション１．１に記載のように、４ｘ１０６/ｍｌに調製した。標的細胞ＹＡＣ−１を対数期に導き、１ｘ１０５／ｍｌに調整した。９６ウェル細胞培養プレートを用い、１００μｌのマウス脾臓細胞および１００μｌの培養培地を、脾臓細胞のみを含有する対照ウェルに加え；１００μｌの標的細胞および１００μｌの培養培地を、標的細胞のみを含有する対照ウェルに加え；１００μｌのマウス脾臓細胞および１００μｌの標的細胞をＮＫ活性アッセイウェルに加えた。上記の３つの並行セットをマウス毎に調製した。
試料を１５０ｇで１０分間遠心分離して、細胞を収集した。上清を廃棄し、１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ ５０μｌ／ウェルを加えた。次いで、反応混合物を２分間振盪し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。１５０ｇで１０分間の遠心分離後に、上清を廃棄した。１２０μｌの４０ｍＭ ＨＣＬ−２−プロパノールを加え、３分間振盪した。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、６３０ｎｍをリファレンスとして各ウェルのＯＤ５７０ｎｍを得た。
【００４２】
計算：
各マウスは、９ウェルを有した：３つが脾臓細胞のみの対照であり、３つが標的細胞のみの対照であり、３つが脾臓および標的細胞の両方を有するアッセイウェルであった。各マウスのＮＫ細胞活性指数は、まず、各組合せの３つの並行ウェルの平均ＯＤを求め、次いで、該平均ＯＤを下記の式：
ＮＫ細胞活性指数＝［１ − （脾臓および標的細胞ウェルの平均ＯＤ − 脾臓細胞のみのウェルの平均ＯＤ） ÷ （標的細胞のみのウェルの平均ＯＤ）］ ｘ １００％
に当てはめることによって得た。
【００４３】
１．４ ＩＬ−２分泌における活性Ｔリンパ球に対するペプチドの影響［５］
対数期のＨＴ−２細胞を１５０ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、再懸濁および遠心分離を用いて、冷Ｈａｎｋ溶液で３回洗浄した。収集したＨＴ−２細胞をＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。再懸濁および遠心分離を用いて、細胞をＲＰＭＩ−１６４０でさらに２回洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０を用いて２ｘ１０５／ｍｌの最終濃度に再懸濁した。
セクション１．２で得られた上清を、ＲＰＭＩ−１６４０を用いて下記のパーセンテージに希釈した：１００％、５０％、２５％、１２．５％、６．２５％および３．１２５％。
ｒＩＬ−２を、ＲＰＭＩ−１６４０を用いて下記の濃度に希釈した：５００ＩＵ／ｍｌ、２５０ＩＵ／ｍｌ、１２５ＩＵ／ｍｌ、６２．５ＩＵ／ｍｌ、３１．２５ＩＵ／ｍｌおよび１５．５１ＩＵ／ｍｌ。
９６ウェル細胞培養プレートに、１つの組合せにつき３つの並行ウェルを準備した。
【００４４】
負の対照：１００μｌ ＲＰＭＩ−１６４０＋１００μｌ ＨＴ−２細胞懸濁
ｒＩＬ−２標準：１００μｌ ｒＩＬ−２溶液＋１００μｌ ＨＴ−２細胞懸濁
アッセイウェル：１００μｌ 希釈した上清＋１００μｌ ＨＴ−２細胞懸濁
プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６８時間インキュベートし、次いで、１５０ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去した。フェノールスルホンフタレイン不含のＲＰＭＩ−１６４０中における０．５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ １００μｌを各ウェルに加えた。３−４分間振盪させて細胞を再懸濁した後、さらに４時間インキュベートを続けた。次いで、試料を１５０ｇにて１５分間遠心分離し、上清を除去した。各ウェルに、４０ｍＭ ＨＣｌ−２−プロパノール １２０μｌを加え、３−４分間混合し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、６３０ｎｍをリファレンスとして５７０ｎｍでＯＤを分析した。
【００４５】
計算：
各希釈の３つの並行ウェルの平均ＯＤを得、半対数方眼紙に濃度に対してプロットした（Ｘ軸に濃度）。５０％ＯＤ飽和での濃度を、試験している上清およびｒＩＬ−２の両方について得た。
試料ＩＬ−２活性 ＝ （５０％最大作用での試料希釈度 ÷ ５０％最大作用でのｒＩＬ−２標準希釈度） ｘ ５０％最大作用でのｒＩＬ−２標準の活性（ＩＵ／ｍｌ）
【００４６】
１．５インターフェロン（ＩＦＮ）の分泌におけるＴリンパ球の活性に対するペプチドの影響［６］
セクション１．２由来の上清をＲＰＭＩ−１６４０培養培地を用いて下記のパーセンテージに希釈した：１００％、５０％、２５％、１２．５％、６．２５％および３．１２５％。
組み換えインターフェロン（ｒＩＦＮ）標準をＲＰＭＩ−１６４０を用いて下記の濃度に希釈した：５００ＩＵ／ｍｌ、２５０ＩＵ／ｍｌ、１２５ＩＵ／ｍｌ、６２．５ＩＵ／ｍｌ、３１．２５ＩＵ／ｍｌおよび１５．５１ＩＵ／ｍｌ。
対数期の標的細胞Ｌ９２９を、セクション１．４に記載のＨＴ−２細胞と同じ処理を用いて、ＲＰＭＩ−１６４０で２ｘ１０５／ｍｌに調整した。ストックＶＳＶもまた、ＲＰＭＩ−１６４０で１００ ＴＣＩＤ５０に調整した。
【００４７】
９６ウェル培養プレートにおいて、下記のように、１組合せあたり３つの並行ウェルを準備した：
負の対照ウェル：１５０μｌ ＲＰＭＩ−１６４０ ＋ １００μｌ Ｌ９２９
正の対照ウェル：１００μｌ ＲＰＭＩ−１６４０ ＋ １００μｌ Ｌ９２９ ＋ ５０μｌ ＶＳＶ
ｒＩＦＮ活性ウェル：１００μｌ ｒＩＦＮ標準 ＋ １００μｌ Ｌ９２９ ＋ ５０μｌ ＶＳＶ
アッセイウェル：１００μｌ 希釈上清 ＋ １００μｌ Ｌ９２９ ＋ ５０μｌ ＶＳＶ
【００４８】
試料を３７℃にて５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。正の対照ウェルを倒立顕微鏡下で周期的に観察して細胞溶解を確認し、次いで、収集、洗浄し、全ウェルのＯＤをセクション１．４に記載のように読み取った。
計算：
５０％最大作用での濃度をセクション１．４と同様に得た。試料のＩＦＮ活性を下記のように計算する：
試料ＩＦＮ活性 ＝ （５０％最大作用での試料希釈度 ÷ ５０％最大作用でのｒＩＦＮ標準希釈度） ｘ ５０％最大作用での標準ｒＩＦＮ活性（ＩＵ／ｍｌ）
【００４９】
２．抗体形成に対するペプチドの影響［７］
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を、頚静脈から血液を採取することによって調製し、ガラスビーズが入った滅菌フラスコ中に置いた。該フラスコを３分間振盪し、次いで、血液をＡｌｓｅｖｅｒ溶液（グルコース２．０５ｇ、ＮａＣｌ０．４ｇ、Ｎａレモネード０．８ｇ、蒸留水で１００ｍｌに調整）と混合し、４℃で保存した。使用直前に、試料を１３０ｇで５分間遠心分離して、ＳＲＢＣを収集した。細胞を正常セーライン中、再懸濁および遠心分離によって２回洗浄した。次いで、細胞ペレットを１８０ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、セーライン中で再懸濁して、最終的に用いられるＳＲＢＣ懸濁２％（ｖ／ｖ）を作成した。
【００５０】
補体は、１０容量の新鮮なテンジクネズミ血清を１容量の遠心分離パックしたＳＲＢＣに加え、次いで、４℃で３０分間穏やかに振盪することによって、調製された。ＳＲＢＣを２００ｇで１０分間の遠心分離によって除去した。１０容量の正常セーラインを加えて、補体溶液を得た。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを無作為に、ペプチド群、ＩＦＮ群、ＩＬ−２群およびセーライン群に１群あたり１０匹で分けた。試験物質をセクション１．１に記載のように投与し、さらに、１２日目に、１マウスあたり０．２ｍｌ ＳＲＢＣを腹膜内注射した。最後の試験物質投与の次の日（１６日目）に、血液を眼角から採取し、血清滲出のために、室温で１時間放置した。２００ｇで１０分間の遠心分離後、正常セーラインで血清を５００倍希釈した。
【００５１】
各マウスの１ｍｌの希釈したマウス血清に、０．５ｍｌ ＳＲＢＣ懸濁を加えた。氷冷した。次いで、１ｍｌの補体溶液を加え、３７℃水浴で１０分間インキュベートした。氷冷によって反応を停止させた。次いで、試料を２００ｇで１０分間遠心分離して、上清を得た。
１ｍｌの該上清に、３ｍｌ Ｄｒａｂｋｉｎ溶液を加え、室温で１０分間放置した。ＯＤ５４０ｎｍを得た。
計算：
リファレンスＯＤ５４０ｎｍを、０．２５ｍｌ ＳＲＢＣ懸濁をＤｒａｂｋｉｎ溶液と４ｍｌに混合することによって得、室温で１０分間放置した後、ＯＤ５４０ｎｍを得た。
試料血清指数 ＝ （試験試料のＯＤ５４０ｎｍ ÷ リファレンスＯＤ５４０ｎｍ） ｘ ５００
【００５２】
３．単核食細胞の食作用機能および免疫器官の重量に対するペプチドの影響［８，９］
最後の試験物質投与の次の日（１６日目）に、マウスに０．１ｍｌ／ｋｇ体重の墨汁（正常セーラインでの５倍希釈物）を尾の静脈から注射した。
墨汁注射の１分および５分後、ヘパリン処理した管を用いて、２０μｌの血液を眼角から得た。血液を２ｍｌ ０．１％ｗ／ｖ Ｎａ２ＣＯ３と混合し、次いで、ＯＤ６８０ｎｍを得た。アウトライン・クリア指数Ｋを下記の式から算出した：
Ｋ＝（ｌｇＡ１−ｌｇＡ２）÷（ｔ２−ｔ１）
キー：
Ａ１：１分目のＯＤ６８０ｎｍ
Ａ２：５分目のＯＤ６８０ｎｍ
ｔ２：５分
ｔ２：１分
【００５３】
最後の試験物質投与の次の日（１６日目）に、肝臓、脾臓および胸腺を分離し、ろ紙でブロットドライし、計量した。食作用指数αを下記のとおり算出した。
α＝（３√Ｋ）（Ｗ÷ＷＬＳ）
キー：
Ｗ：体重
ＷＬＳ：肝臓および脾臓の重量
胸腺指数（％）＝（胸腺重量／体重）ｘ１００％
脾臓指数（％）＝（脾臓重量／体重）ｘ１００％
【００５４】
結果
関与する大量の生データのため、実施した最終結果のみを提供する。また、セーライン負の対照に対する統計学的に有意な差のない群は省略する。
１．Ｔリンパ球形質転換に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２１およびＣＭＳ０２９は、Ｔリンパ球形質転換を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０１０およびＣＭＳ０１５は、下記の表１に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００５５】
【表２】
【００５６】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２およびＣＭＳ００３は、Ｔリンパ球形質転換を刺激することができ、セーライン群、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ０１４およびＣＭＳ０３６は、Ｔリンパ球形質転換を阻害することができ、セーライン群に対する統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表２にデータを詳述する。
【００５７】
【表３】
【００５８】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７およびＣＭＳ０３４は、Ｔリンパ形質転換を刺激することができ、表３に示すように、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００５９】
【表４】
【００６０】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０およびＣＭＳ０１１は、表４に示すように、Ｔリンパ形質転換を刺激でき、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００６１】
【表５】
【００６２】
２．ＮＫ細胞細胞毒活性に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、ＮＫ細胞細胞毒活性を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１６およびＣＭＳ０３０は、表５に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００６３】
【表６】
【００６４】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２６およびＣＭＳ０３５は、ＮＫ細胞細胞毒活性を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０２１は、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ０１２は、ＮＫ細胞細胞毒活性を阻害することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表６にデータを詳述する。
【００６５】
【表７】
【００６６】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３６は、ＮＫ細胞細胞毒活性を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００８およびＣＭＳ００９は、表７に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有するとが見出された。
【００６７】
【表８】
【００６８】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２８およびＣＭＳ０３５は、ＮＫ細胞細胞毒活性を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ００８は、ＮＫ細胞細胞毒活性を阻害することができ、セーライン群に対する統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表８にデータを詳述する。
【００６９】
【表９】
【００７０】
３．ＩＬ−２分泌におけるＴリンパ球の活性に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０およびＣＭＳ０１５は、Ｔリンパ球からのＩＬ−２分泌を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００７およびＣＭＳ０１５は、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００９およびＣＭＳ０１０は、表９に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００７１】
【表１０】
【００７２】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１およびＣＭＳ００３は、ＩＬ−２分泌におけるＴリンパ球の活性を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００３は、表１０に示すように、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００７３】
【表１１】
【００７４】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ０１２およびＣＭＳ０２０は、表１１に示すように、ＩＬ−２分泌においてＴリンパ球を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００７５】
【表１２】
【００７６】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０２２およびＣＭＳ０３４は、ＩＬ−２分泌においてＴリンパ球を促進することがで、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０３４は、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ０１１およびＣＭＳ０２２は、表１２に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００７７】
【表１３】
【００７８】
４．ＩＦＮ分泌におけるＴリンパ球の活性に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１３およびＣＭＳ０１６は、表１３に示すように、インターフェロン（ＩＦＮ）分泌においてＴリンパ球を促進することができ、セーライン群、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００７９】
【表１４】
【００８０】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３およびＣＭＳ０２１は、ＩＦＮ分泌においてＴリンパ球を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０２１は、表１４に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００８１】
【表１５】
【００８２】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００９およびＣＭＳ０１２は、ＩＦＮ分泌においてＴリンパ球を促進でき、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００９は、表１５に示すように、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００８３】
【表１６】
【００８４】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０２２およびＣＭＳ０２８は、ＩＦＮ分泌においてＴリンパ球を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０１０およびＣＭＳ０２２は、表１６に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００８５】
【表１７】
【００８６】
５．抗体形成に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２９、ＭＳ０３３およびＣＭＳ０３５は、抗−ＳＲＢＣ抗体形成を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４およびＣＭＳ０３５は、ＩＦＮ−γ群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２９およびＣＭＳ０３３は、表１７に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００８７】
【表１８】
【００８８】
５０μｇ／ｋｇ／日に、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、抗−ＳＲＢＣ抗体形成を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３およびＣＭＳ０１５は、ＩＦＮ−γ群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ００９は、抗−ＳＲＢＣ抗体形成を阻害することができ、セーライン群に対する統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。表１８にデータを詳述する。
【００８９】
【表１９】
【００９０】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、抗−ＳＲＢＣ抗体形成を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０２０およびＣＭＳ０２１は、ＩＦＮ−γ群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、表１９に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００９１】
【表２０】
【００９２】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２７およびＣＭＳ０３３は、抗−ＳＲＢＣ抗体形成を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０２１およびＣＭＳ０３３は、ＩＦＮ−γ群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４およびＣＭＳ０２７は、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３６は、抗−ＳＲＢＣ抗体形成を阻害することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表２０にデータを詳述する。
【００９３】
【表２１】
【００９４】
６．単核食細胞の食作用活性に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２およびＣＭＳ０２４は、単核食細胞の食作用活性を増強することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０２２は、表２１に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００９５】
【表２２】
【００９６】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４およびＣＭＳ０３０は、単核食細胞の食作用活性を増強することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０１９は、表２２に示すように、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００９７】
【表２３】
【００９８】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００３＊、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９およびＣＭＳ０３５は、単核食細胞の食作用活性を増強することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９およびＣＭＳ０３５は、表２３に示すように、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００９９】
【表２４】
【０１００】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２７およびＣＭＳ０３６は、単核食細胞の食作用活性を増強することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０２４は、表２４に示すように、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１０１】
【表２５】
【０１０２】
７．免疫器官の重量に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、胸腺の重量を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０２７およびＣＭＳ０３４は、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３およびＣＭＳ０３５は、表２５に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差 （Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１０３】
【表２６】
【０１０４】
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０１９は、表２６に示すように、脾臓の重量を増加させることができ、セーライン対照群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２７およびＣＭＳ０３６は、脾臓の重量を減少することができ、セーライン対照群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表２６にデータを詳述する。
【０１０５】
【表２７】
【０１０６】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３６は、胸腺の重量を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０３４は、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２およびＣＭＳ０３６は、表２７に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１０７】
【表２８】
【０１０８】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０およびＣＭＳ０２９は、脾臓の重量を減少することができ、セーライン対照群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表２８にデータを詳述する。
【０１０９】
【表２９】
【０１１０】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３６は、胸腺の重量を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０２４およびＣＭＳ０３０は、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３６は、表２９に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１１１】
【表３０】
【０１１２】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０３０は、脾臓の重量を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ０１５は、脾臓の重量を減少することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表３０にデータを詳述する。
【０１１３】
【表３１】
【０１１４】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３２は、胸腺の重量を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００８およびＣＭＳ０１２は、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ０２０およびＣＭＳ０３０は、表３１に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１１５】
【表３２】
【０１１６】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０２０は、脾臓の重量を増加することができ、セーライン群、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ００１は、脾臓の重量を減少することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表３２にデータを詳述する。
【０１１７】
【表３３】
【０１１８】
まとめると、発明者らは、ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、試験した動物モデルにおいて、イン・ビボで生物学的活性を有することを見出した。
【０１１９】
ＩＩ．ペプチドのイン・ビボ抗ウイルス効果
これらのペプチドがウイルス感染に対して可能性のある治療効果を有するか否かを見出すために、発明者らは、該研究において、動物モデル アヒルＢ型肝炎感染を用いて、病気の動物に対する上記ペプチドのイン・ビボでの影響を試験した。
重慶（Chongqing）アヒルＢ型肝炎モデルを用意し、４週間、腹膜内注射（５０μｇ／ｋｇ／日、１日１回）によってペプチド処理した。ＤＨＢＶ ＤＮＡの血清レベルを血清ドット−ブロットハイブリダイゼーションによって分析した。ラミブジン（lamivudine）および正常セーライン処理を各々、正および負の対照として用いた。ペプチドＣＭＳ００１は、該処理の４週目に、ＤＨＢＶ ＤＮＡの血清レベルを減少させることができ、セーライン対照群に対する統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）を有することが見出された。結果として、ＣＭＳ００１は適当な投与量レベルで、一部として、または単独で、ウイルス性肝炎感染管理に用いることができる。
【０１２０】
材料および方法
１．ペプチドは、American Peptide Company, Inc., USAでＬ−アミノ酸から注文製造した。
２．動物モデル［１］
１日齢の重慶アヒルに、アヒルＢ型肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）ＤＮＡ陽性のストック血清（５×１０７コピー／ｍｌ）０．１ｍｌを腹膜内注射によって接種した。１週間後、血液試料を外頚静脈から採取し、感染を、ジゴキシンで標識したＤＨＢＶ ＤＮＡプローブを用いるドット−ブロットハイブリダイゼーションによって確認した［２］。アヒルは、研究に入るために、２週齢まで飼育した。
【０１２１】
３．グループ分けおよび処理
ＤＨＢＶ感染アヒルを下記の群に無作為化した：
ａ）負の対照群（ｎ＝９）：アヒル１匹当たり１ｍｌの正常セーラインを１日に１回、腹膜内注射した。
ｂ）ラミブジン群（ｎ＝８）：正の対照群とする。ラミブジン［４］５０ｍｇ／ｋｇ／日を１日に１回、経口投与した。
ｃ）ペプチド群（ｎ＝９）：５０μｇ／ｋｇ／日のペプチド（正常セーラインを用いて、最終容量を０．５ないし１ｍｌに調整）を１日に１回、腹膜内注射した。
処理を４週間続け、処理の終了後さらに１週間、観察を続けた。処理を開始したとき、０、７、１４、２１、２８および３５日目に、１ｍｌの血液試料をアヒルの外頚静脈から採取した。血液試料の血清をすぐに単離し［３］、分析まで−２０℃で保存した。
【０１２２】
４．血清ＤＨＢＶ ＤＮＡレベル測定
キット製造元（Amersham Pharmacia Biotech Co.）の標識キットプロトコールにしたがって、ＤＨＢＶ ＤＮＡプローブを蛍光標識した。４０μｌのアヒル血清をニトロセルロース膜上にドット−ブロットし（１試料あたり２連のドット）、定量のために、蛍光標識したＤＨＢＶ ＤＮＡプローブでハイブリダイズした［２］。ハイブリダイゼーション完了後、ブロットをＣＤＰ−Ｓｔａｒフルオロメトリー試薬ＲＰＮ３６９０中で発現させ、Ｖｕｅｇｏ Ｓｃａｎ（Brisa-620st）スキャナーでスキャンした。ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ ＴｏｔａｌＬａｂ ｖ１．１１．Ｉｎｋソフトウェアをブロットの定量分析に用いた。統計分析は、ＳＰＳＳソフトウェアを用いて、対応のあるｔ−検定によって行った。
【０１２３】
結果
【表３４】
【０１２４】
負（正常セーライン）および正（ラミブジン）の対照群は、肝炎動物モデルの確立の成功を示した。５０μｇ／ｋｇ／日にて、ペプチドＣＭＳ００１は、４週間の処理後の血清ＤＨＢＶ ＤＮＡ力価を減少させることができ、同じ動物の処理前の値に対する統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）を有することが見出された。処理終了時に、血清ＤＨＢＶ ＤＮＡ力価は、処理前と統計学的差のない値にリバウンドし、それは、ペプチドＣＭＳ００１の影響が可逆性であり、および／またはウイルス撲滅のためにより長い処理期間を必要としうることを示した。
【０１２５】
考察
アヒル肝炎動物モデル［１］は、ヒトＢ型肝炎病因研究のため、およびＢ型肝炎治療剤のスクリーニングのための確立された実験モデルである。該研究において、ＣＭＳ００１は、４週間の処理後に、ＤＨＢＶ ＤＮＡの血清力価を減少させることができることが見出され、それは、ペプチドＣＭＳ００１が適当な投与量レベルおよび適当な応用スキームで、単独または他の物質と組み合わせて、ヒトＢ型肝炎管理のための薬剤として有用であることを示した。
【０１２６】
本研究において、腹膜内注射による投与が試験されたが、これは、他の別の経路を介して投与した場合の該ペプチドの可能性のある効果を除外するものではない。該ペプチドは、また、リポソーム、徐放性保護などの送達促進デバイスを用いて、または用いない、静脈内注射、筋内注射、皮下注射および皮下埋め込みによって投与してもよい。該ペプチドはまた、修飾を用いない通常の形態において、または徐放性形態において、または胃腸保護を用いてもしくは用いないで、錠剤、カプセル、懸濁、溶液などの経口投与のいずれかの形態で投与してもよい。該ペプチドは、さらに、経皮促進デバイスを用いるまたは用いない軟膏、クリーム、ゲルなどの局所塗布のいずれかの形態において、または粉末、溶液の吸入薬として、またはリポソーム保護形態として適用されてもよい。該ペプチドは、また、その遺伝子配列に解読され、単独または他のペプチド配列と組み合わせて発現系中にクローン化して、得られるペプチド分子を作成して、該得られるペプチドを精製して、または精製しないで、本明細書中に記載されるような該ペプチドの活性を利用してもよい。
【０１２７】
【表３５】
【０１２８】
引用文献
１．Chen Yaxi, Guo shuhua, Zhang Dingfengら、「重慶アヒルＢ型肝炎モデルの基礎および応用（Foundation and application of Chongqing duck hepatitis B model）」、Chinese Journal of Hepatology. 1993; 1(2): 89-91
２．Chen Yaxi, Guo shuhua, Chen Xuehua、「ジゴキシンで標識したＤＨＢＶ ＤＮＡプローブの調製および応用（Preparation and application of DHBV DNA probe labeled with digoxin）」、Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 1994; 19(4): 295-297
３．Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhuaら、「アヒルＢ型肝炎ウイルスに対する体液性免疫の血清学的パラメーターの体系的基礎および応用（Systemic foundation and application of serological parameters of humoral immunity to duck hepatitis B virus）」、Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(1): 13-15
４．Chen Yaxi, Guo shuhua, Qi Zhenyuanら、「ファムシクロビルと組み合わせた、アヒルＢ型肝炎ウイルスに対するラミブジンの実験的研究（An experimental study of lamivudine against duck hepatitis B virus in combination with famciclovir）」、Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(4): 209-211
【０１２９】
ＩＩＩ．腎炎に対するペプチドの影響
これらのペプチドが腎炎に対する可能性のある治療効果を有するか否かを見出すために、発明者らは、動物モデル ラットＭａｓｕｇｉ腎炎を該研究に用いて、病気の動物に対する上記ペプチドのイン・ビボでの影響を試験した［３，４］。
本研究の目的は、慢性糸球体腎炎に対するペプチドのイン・ビボでの治療効果を調べることにある。Ｍａｓｕｇｉ腎炎ラットモデルは、ウサギ抗−ラット−腎−皮質ＩｇＧを健康なＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに注射した後、直ちに、１日に１回、３週間、５０μｇ／ｋｇ／日でペプチドの腹膜内注射で処理することによって構築された。ヒドロコルチゾンを正の対照として用いた。ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６で処理したラットの蛋白尿、血清クレアチニンレベルおよび脾臓指数は、対照群と比べて低下しており、統計学的差を有した（ｐ＜０．０５）。腎臓の死後顕微鏡試験は、これらのペプチドの治療効果がヒドロコルチゾン処理に類似していたことを示した。結果として、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６は慢性腎炎管理の手段として用いられうる。
【０１３０】
材料
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット、雄、体重１２０±２０ｇは、広州中医薬大学、実験動物センター（Center of Experimental Animal, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine）および第一軍医大学（First Military Medical University）から得た。体重３ｋｇのチンチラウサギは、広州中医薬大学、実験動物センターから得た。
Ｌ−アミノ酸由来のペプチドは、American Peptide Company, Inc, USAで注文製造し、滅菌正常セーライン中１０μｇ／ｍｌに希釈した。ヒドロコルチゾンは、Yangzhou Pharmaceutical Factory, Chinaから得た。
血清クレアチニンレベル測定キットは、Shanghai Rongsheng Biological Technique Company, PR Chinaから得た。
【０１３１】
方法
１．ウサギ抗−ラット−腎−皮質抗血清の調製［１］：２０匹の健康なＳＤラットを３％ペントバルビタールナトリウム４０ｍｇ／ｋｇの静脈内注射で麻酔した。腹部大動脈を露出し、血液が清浄するまで、腎臓を正常セーラインで潅流した。腎皮質を単離し、５容量の０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．１中でホモジナイズし、１４０−ゲージのステンレススチールメッシュでろ過した。ろ液を収集し、ＧＩＢＣＯ−ＲＲＥ完全または不完全フロイントアジュバンドのいずれかと１：１で混合し、乳化して、免疫化溶液を得た。
【０１３２】
１０匹の健康なウサギを、最初は完全フロイントアジュバンドを用いた該免疫化溶液、ついで、不完全フロイントアジュバンドを用いた該免疫化溶液で免疫した。抗原を６つの無作為な箇所から、１箇所につき０．１ｍｌを１０日に１回、皮下注射した。６週目以後、血液を耳静脈から採取し、抗体価を二重拡散法によって決定した［２］。免疫開始後８週目に、ウサギを３％ペントバルビタールナトリウム２０ｍｇ／ｋｇの静脈内注射で麻酔し、血液を頚動脈から採取した。次いで、抗−血清を滲出させ、単離した。
【０１３３】
全血を１５匹の健康なＳＤラットから採取した。赤血球を単離し、正常セーラインで３回洗浄した。清浄した赤血球を２５０ｍｌのウサギ抗血清と混合し、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、血液細胞を遠心分離によって除去し、上清をさらに５６℃で３０分間不活化した。遠心分離によっていずれかの沈殿物を除去後、粗ＩｇＧを単離し、３回の（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿（５０％、３３％および３３％）によって上清から部分的に精製した［５］。粗ＩｇＧを１２５ｍｌの２回蒸留した水中に再溶解し、硫酸アンモニウムで透析により清浄した。抗−ラット−腎−皮質抗体価を二重拡法によって決定した［２］。
【０１３４】
２．ラット糸球体腎炎の誘導［５］：誘導の５日前に、０．２５ｍｌのプライミング溶液（完全フロイントアジュバンドを用いた４ｍｇの非特異的ウサギＩｇＧを含有している）を健康なＳＤラットに腹膜内注射して、ラットをプライムした。正常セーラインを与えられた正常な健康な対照群を除き、全群はその後に、方法１において記載したように調製された１ｍｌのウサギ抗−ラット−腎−皮質ＩｇＧの腹膜内注射によって誘導された。
【０１３５】
３．グループ分けおよび投与：雄ＳＤラットを正常な健康対照（正常）、腎炎プラシーボ処理対照（プラシーボ）、腎炎ペプチド処理および腎炎ヒドロコルチゾン処理対照（ヒドロコルチゾン）の群に、１群につき１２匹で無作為化した。処理は誘導日に開始した。ペプチド５０μｇ／ｋｇ／日、ヒドロコルチゾン３．３ｍｇ／ｋｇ／日、およびプラシーボとして正常セーラインを用い、全て、１日に１回腹膜内投与し、３週間続けた。
【０１３６】
４．モニターされるパラメーター［４］：
（ａ）尿蛋白レベル：各ラットを個々に、１つのケージ中で維持した。十分な飲料水を供給した。１週間に１回、１回につき２４時間、尿を収集した。尿の蛋白質含量は、クーマシーブルー法によって測定した。
（ｂ）血清クレアチニンレベル：３週間の処理後に、血液を採取し、血清クレアチニンレベルを測定した。クレアチニンキットは、Shanghai Rongsheng Biological Technique Companyから供給された。
（ｃ）脾臓重量指数：脾臓重量指数は、下記の式によって決定された：
脾臓重量指数＝平均脾臓重量÷平均体重
（ｄ）腎臓の病理学的顕微鏡試験：病理学的試験のために、６個の最大重量の腎臓を各群から選択した。
【０１３７】
統計分析
群間の比較のためにｔ−検定を用い、カットオフをｐ＜０．０５に定める。全群に関し、最も低い尿蛋白レベルを有する２匹のラットを統計分析から排除した。
【０１３８】
結果
１．尿蛋白レベルに対するペプチド処理の影響
【表３６】
【０１３９】
ペプチドＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６は、１日に１回の５０μｇ／ｋｇ／日にて、Ｍａｓｕｇｉ腎炎ラットモデルの尿蛋白レベルを低下させることができ、プラシーボ処理対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された（ｐ＜０．０５）。また、群ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３６およびヒドロコルチゾンは、正常群よりもゆっくりと成長することが注目された。ヒドロコルチゾン群の成長速度は、第１週後に、重篤な不耐性を回避するために、該処理投与量が二等分されなくてはならないような程度まで減少した。
【０１４０】
２．血清クレアチニンレベルに対するペプチド処理の影響
【表３７】
【０１４１】
プラシーボ処理を受けているＭａｓｕｇｉ腎炎ラットの血清クレアチニンレベルは、正常対照群よりも非常に高く、腎炎ラットの腎機能が異常であることを示した。ペプチドＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６は、１日に１回の５０μｇ／ｋｇ／日にて、血清クレアチニンのレベルを低下させることができ、プラシーボ処理腎炎ラットに対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【０１４２】
３．脾臓指数に対するペプチドの影響
【表３８】
【０１４３】
全ての誘導したラットの脾臓は、正常ラットと比較して大きく、腎炎の誘導が免疫応答に関連することを示した。ペプチドＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６は、１日に１回の５０μｇ／ｋｇ／日にて、脾臓指数を減少させることができ、プラシーボ処理を受けている腎炎ラットの群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された（ｐ＜０．０５）。これは、該ペプチドが免疫抑制メカニズムを介して腎炎に対するその矯正的な影響を働かせたかもしれないことを示唆した。
【０１４４】
４．腎病理学的顕微鏡試験に対するペプチドの影響
正常ラットと比較すると、プラシーボ処理を受けている腎炎ラット（プラシーボ群）は、糸球体カプセルにおける繊維組織形成、糸球体上皮の過形成、半月の形成、糸球体キャピラリーの膨張および密集、近位曲尿細管上皮の浮腫、および遠位曲尿細管および集合管における円柱の形成の徴候を示した。これらの病理学的変化は、腎炎誘導の成功を確証した。群ＣＭＳ０１４において、たった１匹のラットだけが糸球体カプセルにおける繊維組織形成および糸球体上皮の過形成の徴候を示したことが観察された。同じラットの他のパラメーターおよび同じ群の他のラットは、本質的に、正常ラットと同じ腎臓組織学を有した。群ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６において、全ラットの全ての病理学的パラメーターは正常であった。
【０１４５】
結論
結果として、５０μｇ／ｋｇ／日にて１日１回、腹膜内投与されたペプチドＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６は、実験的Ｍａｓｕｇｉ腎炎ラットモデルに対して治療効果を有することができた。処理されたラットの蛋白尿、クレアチニン排出および腎組織学は、これらのペプチドによって治され、プラシーボ処理を受けている対照群に対する統計学的に有意な差を有した。これらのペプチドは、脾臓重量指数に対するその影響によって示されるように、免疫学的メカニズムを介して作用しうるが、他のメカニズムを介するその作用の可能性を排除することはない。
【０１４６】
考察
ペプチドＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６は、一部として、または単独で、ヒトにおける腎炎管理において有用でありうる。例えば、該ペプチドは、蛋白尿を治すために、または腎炎患者の排泄機能を復活させるために用いてもよい。該ペプチドは、また、腎炎患者におけるさらなる腎臓機能欠陥を予防するために用いてもよい。該ペプチドは、単独で、または２以上のペプチドを組み合わせて、または他の医薬もしくは食物サプリメントと組み合わせて、腎炎管理の全過程として用いてもよい。
【０１４７】
【表３９】
【０１４８】
引用文献
１．SDA(State Drug Administration, P.R.China)、「新薬の前臨床リサーチのガイドライン（The guideline of preclinical researches of new drugs）」、1994, 第１版, Page 96
２．Xu Shuyunら、「薬理学的実験の方法（The methodology of pharmacological experiment）」、the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, 第２版, 1991:1071
３．Chen Qiら、「漢方の薬理学的リサーチの方法（The methodology of pharmacological researches of traditional Chinese medicine）」、the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, 第１版、1993:390
４．Du Guanhua、「薬理学的実験のためのガイドライン−新薬の発見と薬理学的評価（The guideline for pharmacological experiment ---the discovery and pharmacological evaluation of new drugs）」、Science Publishing Company, Beijing, 第１版, 2001:598
５．Wang Shuxian、「腎臓病学（Nephrology）」、the People’s Sanitation Publishing Company, Beijing, 第１１版, 1987:244
【０１４９】
ＩＶ．癌に対するＣＭＳペプチドの影響
これらのペプチドが癌を治療できるか否かを見出すために、発明者らは、種々の標準的動物癌モデルを該研究に用いて、病気の動物に対する上記ペプチドの生物学影響を試験した。
【０１５０】
材料
１．実験動物
ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、およびＤＢＡ／２マウス、体重１８−２２ｇ（China Medical Science Institute, PR China）。
２．細胞系統
マウス肉腫Ｓ１８０細胞、Ｂ１６細胞およびＬ１２１０細胞（Cancer Research Department, China Medical Science Institute）。
ＹＡＣ−１細胞（Yao Zhi教授、天津医科大学（Tianjin Medical University）からの贈与物）。
【０１５１】
３．主要な薬物および試薬
該研究に使用されたペプチドは、American Peptide Company, Inc., USAによって注文製造された。
胎仔ウシ血清、ＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地（Gibco, USA）。
ＭＴＴ、ＣｏｎＡ（Sigma, USA）。
組み換えマウスインターフェロン−γ（ｒｍＩＦＮ−γ）（Beijing Biotech Inc., PR China）。
組み換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２）（Shanghai Huaxin Biotech Inc., PR China）。
リンパ球分離溶液（Research Institute of Hematologic Disease, National Institute of Medical Science, PR China）。
シクロホスファミド（The 12th pharmaceutical factory of Shanghai, PR China）。
【０１５２】
方法
１．試験物質の投与
１日１回の腹膜内注射。シクロホスファミド群をのぞき、全群は、癌細胞を移植する５日前に処理を開始した。シクロホスファミド群は、癌細胞を移植した次の日に処理した。試験物質を用いる全群の処理は、別記しないかぎり、３０日間または動物が死亡するまで続けた。
【０１５３】
２．ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける移植したＳ１８０肉腫細胞の成長速度に対するペプチドの影響、および宿主の免疫学的機能に対するその影響
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ペプチド群、シクロホスファミド群、ｒｍＩＦＮ−γ群、ｒｈＩＬ−２群、およびセーライン群に、１群につき２０匹で無作為化した。
ストックＳ１８０に肉腫細胞を１０％胎仔ウシ血清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、次いで、Ｈａｎｋ溶液で３−４回、室温で洗浄した。Ｈａｎｋ溶液を用いて、細胞濃度を１リットルにつき１−２ｘ１０９に調整した。０．２ｍｌの細胞懸濁をいくつかのＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０−１２日間、腋窩を介して移植した。マウスを頚椎脱臼によって殺した。活発に成長している非崩壊性の腫瘍塊が得られ、滅菌セーラインで清浄した。該組織をセーライン中に分散させて、４ｍｌセーラインに対して組織１ｇの割合で均一な細胞懸濁を得た。肉腫を有するマウスモデルは、０．２ｍｌの細胞懸濁を腋窩を介して注射して用意した［１］。試験物質の投与処理は、方法１のセクションに記載したとおりに開始した。
【０１５４】
２．１
Ｓ１８０肉腫を有するマウス［２，３］における単核食細胞の食作用機能に対するペプチドの影響を、最後の試験物質投与の２日後に、０．１ｍｌ／１０ｇ体重の墨汁（正常セーラインを用いる１：５希釈）を尾部静脈からマウスに注射することによって分析した。注射後１分および５分で、ヘパリン処理した管系を用いて、２０μｌの血液を眼角から得た。該血液を２ｍｌの０．１％ｗ／ｖ Ｎａ２ＣＯ３と混合し、次いで、ＯＤ６８０ｎｍを得た。アウトライン・クリア指数Ｋを下記の式から算出した：
Ｋ＝（ｌｇＡ１−ｌｇＡ２）÷（ｔ２−ｔ１）
キー：
Ａ１：１分目のＯＤ６８０ｎｍ
Ａ２：５分目のＯＤ６８０ｎｍ
ｔ２：５分
ｔ２：１分
【０１５５】
食作用指数研究の後、マウスを頚椎脱臼によって殺した。肝臓、脾臓および癌組織を切り出し、ブロットドライし、計量した。
食作用指数αは下記のように算出された：
α＝（３√Ｋ）ｘ（Ｗ÷ＷＬＳ）
キー：
Ｗ：体重
ＷＬＳ：肝臓および脾臓の重量
【０１５６】
２．２下記の式にしたがって、腫瘍成長阻害指数を算出した：
腫瘍成長阻害指数＝（対照群の平均腫瘍重量−処理群の平均腫瘍重量）÷対照群の平均腫瘍重量
【０１５７】
３．移植した腹水型肝臓癌Ｈ２２を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの生存に対するペプチドの影響
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ペプチド群、シクロホスファミド群、ｒｍＩＦＮ−γ群、ｒｈＩＬ−２群およびセーライン群に、１群につき２０匹で無作為にグループ分けされた。
ストックＨ２２細胞は、１０％胎仔ウシ血清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、次いで、Ｈａｎｋ溶液を用いて３−４回、室温で洗浄した。Ｈａｎｋ溶液を用いて、細胞濃度を１リットルあたり１−２ｘ１０９に調整した。０．２ｍｌの細胞懸濁を数匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に６−８日間移植した［１］。該マウスを頚椎脱臼により殺した。該マウスの腹水を無菌的に採取し、Ｈａｎｋ溶液を用いて、細胞濃度を１ｍｌあたり１ｘ１０６に調整した。０．２ｍｌの細胞懸濁を健康なマウスの腹腔に移植して、腹水型肝臓癌のＨ２２担持マウスを作成した。試験物質の投与は、方法１のセクションに記載したとおりに開始した。マウスの生存データを記録した。動物が実験期間よりも長く生存した場合、生存日数を実験期間として記録した。平均生存日数は、ＳＰＳＳソフトウェアのＳｕｒｖｉｖａｌオプションにおけるカプラン−マイヤー（Kaplan-meier）法によって得られた。生存指数は、下記の式にしたがって算出された：
生存指数＝（処理群の平均生存日数−対照群の平均生存日数）÷対照群の平均生存日数ｘ１００％
【０１５８】
４．移植した腹水型肝臓癌Ｈ２２を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの細胞性免疫に対するペプチドの影響
４．１脾臓細胞懸濁の調製［１，４］
健康なＢＡＬＢ／ｃマウスを、ペプチド群、ｒｍＩＦＮ−γ群、ｒｈＩＬ−２群、およびセーライン群に１群あたり１５匹で無作為化し、方法３のセクションに記載のとおりに、Ｈ２２担持マウスモデルに調製した。癌細胞の移植後、試験物質を１５日間投与し、マウスを頚脱臼によって殺した。脾臓を無菌的に単離し、注射針を用いて手動で冷Ｄ−Ｈａｎｋ溶液中に分散させた。分散させた細胞懸濁をさらに、１００−ゲージ１５０μｍ直径のステンレススチールシーブによって篩い分けした。２００ｇで１０分間の遠心分離後、上清を廃棄した。細胞ペレットを１０容量のＴｒｉｓ−ＮＨ４Ｃｌバッファー中で再懸濁し、次いで、室温で１０分間静置した。懸濁した細胞を１５０ｇで１０分間の遠心分離によって収集した。細胞を冷Ｄ−Ｈａｎｋ溶液を用いて２−４回、再懸濁および上記条件の遠心分離による収集によって洗浄した。次いで、洗浄した細胞を、１０％胎仔ウシ血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培養培地によって、所望の細胞密度に希釈した。
【０１５９】
４．２腹水型肝臓癌Ｈ２２を有するマウスにおけるＴリンパ球形質転換に対するペプチドの影響
密度１ｘ１０６／ｍｌの脾臓細胞を９６ウェル細胞培養プレート上、１００μｌ／ウェルにて、１マウスあたりアッセイ試料および対照試料毎に３つの並行ウェルに置いた。アッセイウェルに、ＲＰＭＩ−１６４０中における１００μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ １００μｌ／ウェルを加え、１００μｌ／ウェルの無添加ＲＰＭＩ−１６４０を対照に用いた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて、６６時間インキュベートした。次いで、細胞を１５０ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化した。上清を収集し、サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ測定のために−２０℃で保存した。
ＲＰＭＩ−１６４０中における１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ ５０μｌ／ウェルを細胞ペレットに加え、２分間の振盪によって細胞を再懸濁した。４時間インキュベーションを続けた。１５０ｇで１０分間の遠心分離後に、上清を廃棄した。４０ｍＭ ＨＣｌ−２−プロパノール１２０μｌを細胞ペレットに加え、３分間振盪させた。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、６３０ｎｍをリファレンスとして各ウェルのＯＤ５７０ｎｍを得た。
各マウスは、３つのアッセイウェルおよび３つの対照ウェルを形成した。各マウスの刺激指数（ＳＩ）は、まず、３つの並行ウェルの平均ＯＤを求め、次いで、アッセイウェルの値を対照ウェルで除することによって得られた。
【０１６０】
４．３腹水型肝臓癌Ｈ２２［５，６］を有するマウスにおけるＮＫ細胞活性に対するペプチドの影響
マウス脾臓細胞は、上記セクション４．１に記載のように、４ｘ１０６／ｍｌに調製した。標的細胞ＹＡＣ−１を対数期に導き、１ｘ１０５／ｍｌに調整した。９６ウェル細胞培養プレートを用いて、１００μｌのマウス脾臓細胞および１００μｌの培養培地を、脾臓細胞のみを含有する対照ウェルに加え；１００μｌの標的細胞および１００μｌの培養培地を標的細胞のみを含有する対照ウェルに加え；１００μｌのマウス脾臓細胞および１００μｌの標的細胞をＮＫ活性アッセイウェルに加えた。上記の３つの並行セットをマウス毎に調製した。その後、９６ウェル細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２にて４時間インキュベートした。
試料を１５０ｇで１０分間遠心分離して、細胞を収集した。上清を廃棄し、１ｍｇ／ｍのＭＴＴ ｌ５０μｌ／ウェルを加えた。次いで、反応混合物を２分間振盪し、３７℃、５％ＣＯ２にて４時間インキュベートした。１５０ｇで１０分間の遠心分離後、上清を廃棄した。１２０μｌの４０ｍＭ ＨＣｌ−２−プロパノールを加え、３分間振盪させた。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、６３０ｎｍをリファレンスとして各ウェルのＯＤ５７０ｎｍを得た。
各マウスは９ウェルを有した：脾臓細胞のみの対照が３つ、標的細胞のみの対照が３つ、脾臓および標的細胞の両方を含有するアッセイウェルが３つ。各マウスのＮＫ細胞活性指数は、まず、各組合せの３つの並行ウェルの平均ＯＤを求め、次いで、該平均ＯＤを下記の式に当てはめることによって得られた：
ＮＫ細胞活性指数＝［１−（脾臓および標的細胞ウェルの平均ＯＤ−脾臓細胞のみのウェルの平均ＯＤ）÷（標的細胞のみのウェルの平均ＯＤ）］ｘ１００％
【０１６１】
５．移植したＬ１２１０白血病を有するＤＢＡ／２マウスの生存に対するペプチドの影響
ＤＢＡ／２マウス、６−８週齢をペプチド群、シクロホスファミド群、ｒｍＩＦＮ−γ群、ｒｈＩＬ−２群およびセーライン群に、１群あたり２０匹で無作為化した。
ストックＬ１２１０細胞を、１０％胎仔ウシ血清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、次いで、Ｈａｎｋ溶液で３−４回洗浄し、１リットルあたり１ｘ１０５細胞に調整した。０．１ｍｌの細胞懸濁を数匹の健康なＤＢＡマウスの腹腔中に、６−８日間移植した。次いで、該マウスを頚椎脱臼によって殺し、その腹水を無菌的に収集した。収集した腹水の細胞濃度は、Ｈａｎｋ溶液で１ｍｌあたり１ｘ１０５に調整した。０．１ｍｌの細胞懸濁を各試験動物に移植し、動物の生存データを記録した。方法１のセクションに記載のとおりに、試験動物において処理を開始した。平均生存日数は、ＳＰＳＳソフトウェアのＳｕｒｖｉｖａｌオプションにおけるカプラン−マイヤー法によって得られた。動物が実験期間よりも長く生存した場合、生存日数は実験期間として記入した。生存指数は下記の式にしたがって算出された：
生存指数＝（処理群の平均生存日数−対照群の平均生存日数）÷対照群の平均生存日数
【０１６２】
６．移植したＢ１６黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの体液性免疫に対するペプチドの影響および接種した黒色腫細胞の転移ポテンシャルに対するその影響
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、６−８週齢、体重１８−２２ｇを、ペプチド群、シクロホスファミド群、ｒｍＩＦＮ−γ群、ｒｈＩＬ−２群およびセーライン群に、１群あたり２０匹で無作為化した。
ストックＢ１６マウス黒色腫細胞を、１０％胎仔ウシ血清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、次いで、Ｈａｎｋ溶液で３−４回洗浄した。細胞濃度をＨａｎｋ溶液で１ｍｌあたり１ｘ１０５に調整し、０．１ｍｌの細胞懸濁を尾静脈を介して試験マウス中へ注射して、Ｂ１６黒色腫担持動物モデルを作成した［７，８］。試験物質での処理は、方法１のセクションに記載のとおりに開始した。
【０１６３】
６．１移植したＢ１６黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの体液性免疫に対するペプチドの影響［９］
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を頚静脈から血液を採取することによって調製し、ガラスビーズを有する滅菌フラスコ中に入れた。該フラスコを３分間振盪させ、次いで、該血液とＡｌｓｅｖｅｒ溶液（グルコース２．０５ｇ、ＮａＣｌ ０．４ｇ、Ｎａレモネード ０．８ｇ、蒸留水で１００ｍｌに調整）を混合し、４℃で保存した。使用直前に、試料を１３０ｇで５分間遠心分離して、ＳＲＢＣを収集した。正常セーライン中での再懸濁および遠心分離によって、細胞を２回洗浄した。次いで、細胞ペレットを１８０ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、セーライン中に再懸濁して、最終的なＳＲＢＣ懸濁、２％（ｖ／ｖ）を作成した。
【０１６４】
補体を、新鮮なテンジクネズミ血清１０容量を１容量の遠心分離パックしたＳＲＢＣ中に加えることによって調製し、４℃で３０分間、穏やかに振盪させた。ＳＲＢＣを２００ｇで１０分間の遠心分離によって除去した。１０容量の正常セーラインを加えて、補体溶液を得た。
試験動物において、試験物質処理２７日目に、０．２ｍｌのＳＲＢＣ細胞懸濁を各動物に注射して抗体を産生させた。最後の試験物質投与の次の日に、血液を眼角から採取し、血清滲出のために室温で１時間放置した。２００ｇで１０分間の遠心分離後、収集した血清を正常セーラインで５００倍に希釈した。
【０１６５】
各マウスの１ｍｌの希釈したマウス血清に、０．５ｍｌのＳＲＢＣ懸濁を加えた。氷冷した。次いで、１ｍｌの補体溶液を加え、３７℃水浴で１０分間インキュベートした。氷冷によって反応を停止させた。次いで、試料を２００ｇで１０分間遠心分離して、上清を得た。
該上清１ｍｌに、３ｍｌのＤｒａｂｋｉｎ溶液を加え、室温で１０分間放置した。ＯＤ５４０ｎｍを得た。
リファレンスＯＤ５４０ｎｍを、０．２５ｍｌのＳＲＢＣ懸濁とＤｒａｂｋｉｎ溶液とを４ｍｌに混合し、室温で１０分間放置後にＯＤ５４０ｎｍを測定することによって得た。
溶血指数＝（試験試料のＯＤ５４０ｎｍ÷リファレンスＯＤ５４０ｎｍ）ｘ５００
【０１６６】
６．２ 体液性免疫研究後に、マウスを頚椎脱臼によって殺した。動物の死後試験を行った。病理学的変化を記録し、黒色腫肺転移病巣の数を数えた。
【０１６７】
結果
１．移植したＳ１８０肉腫を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける細胞性食作用に対するペプチドの影響（方法２．１）
【表４０】
【０１６８】
５０μｇ／ｋｇ／日および５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ００１、および５μｇ／ｋｇ／日および０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０３４は、食作用指数を増加させることができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【０１６９】
２．ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける移植したＳ１８０肉腫の成長速度に対するペプチドの影響（方法２．２）
【表４１】
【０１７０】
５００μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１０、０．５μｇ／日のＣＭＳ０３４、および５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０３５は、移植したＳ１８０肉腫の成長を減少させることができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１７１】
３．移植した腹水型肝臓癌Ｈ２２を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの生存に対するペプチドの影響（方法３）
【表４２】
【０１７２】
５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ００８、５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１１、５０μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０２４、０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０２４および０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０３２は、移植したＨ２２腹水型肝臓癌を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの生存を延長することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、群ＣＭＳ０２４ ０．５μｇ／ｋｇ／日において、３０％（ｎ＝６）以上のマウスが９０日より長く生存することができた（実験が終わった後２ヶ月）ことが観察された。マウスの死後試験は、腫瘍確立の徴候を示さなかった。したがって、０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０２４は、その確立を妨害するか、またはその確立した癌の完全な治癒を誘導することにより、移植したＨ２２の成長を妨害しうる。
【０１７３】
４．移植した腹水型肝臓癌Ｈ２２を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴリンパ球形質転換に対するペプチドの影響（方法４．２）
【表４３】
【０１７４】
５００μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１０、０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１９、０．５μｇ／ｋｇ／日および５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０２４、および０．５μｇ／ｋｇ／日および５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０３５は、Ｔリンパ球の刺激指数を増加させることができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された（Ｐ＜０．０５）。
【０１７５】
５．移植した腹水型肝臓癌Ｈ２２を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮＫ細胞活性に対するペプチドの影響（方法４．３）
【表４４】
【０１７６】
５００μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ００３、０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１４、０．５μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日および５０μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０２４、および５０μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０３４は、試験動物モデルにおいてＮＫ細胞細胞毒活性を増加させることができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１７７】
６．移植したＬ１２１０白血病を有するＤＢＡ／２マウスに対するペプチドの影響（方法５）
【表４５】
【０１７８】
０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１９、および０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０３５は、移植したＬ１２１０白血病を有するＤＢＡ／２マウスの生存を延長することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１７９】
７．移植したＢ１６黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの体液性免疫に対するペプチドの影響（方法６．１）
【表４６】
【０１８０】
ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３５は、移植したＢ１６黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの体液性応答（溶血指数における増加）を表ＩＶ．７に示すような投与量で増強することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１８１】
８．Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける接種したＢ１６黒色腫細胞の生存に対するペプチドの影響（方法６．２）
試験物質処理の終了後の動物の死後試験は、０．５μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日および５０μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ００８、および５μｇ／ｋｇ／日および５００μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１６で処理したマウスの肺におけるＢ１６転移病巣の存在のいずれの徴候も示さなかった。
【０１８２】
結論
１９９３年にBranch of Drug Administration, Department of Health, PR Chinaによって発行された「前臨床新薬リサーチガイダンス（the Preclinical New Drug Research Guidelines）」にしたがって、移植した癌細胞を有するマウスに対するペプチドの影響を研究した。結論として、
１．ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３５は、適当な投与量で、マウスにおける移植したＳ１８０肉腫の発現を有意に阻害することができた；
２．ＣＭＳ００１およびＣＭＳ０３４は、適当な投与量で、Ｓ１８０肉腫を移植したマウスの食作用免疫活性を増強することができた；
３．ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０２４およびＣＭＳ０３２は、適当な投与量で、腹水型肝臓癌Ｈ２２を移植したマウスの生存を延長することができた；
４．ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３５は、適当な投与量で、腹水型肝臓癌Ｈ２２を移植したマウスにおいてＴリンパ球形質転換を増強することができた；
５．ＣＭＳ００３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３２およびＣＭＳ０３４は、適当な投与量で、腹水型肝臓癌Ｈ２２を移植したマウスのＮＫ細胞細胞毒活性を増加することができた；
６．ＣＭＳ０１９およびＣＭＳ０３５は、適当な投与量で、Ｌ１２１０白血病を移植したマウスの生存を延長することができた；
７．ＣＭＳ００８およびＣＭＳ０１６は、適当な投与量で、マウスにおいて移植したＢ１６黒色腫の発現を阻害することができた；
８．ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３５は、適当な投与量で、Ｂ１６黒色腫を移植したマウスの体液性免疫応答を増強することができた。
【０１８３】
考察
ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５は、一部として、または単独で、ヒトにおける癌管理において有用でありうる。例えば、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３５は、癌患者の免疫を増加するために使用されうる。ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３５は、患者における癌細胞の成長を妨害するために使用されうる。ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３２およびＣＭＳ０３５は、癌患者の期待余命を延長するために使用されうる。該ペプチドは、単独で、２以上のペプチドを組み合わせて、または他の医薬もしくは食物サプリメントと組み合わせて、癌管理の全過程として使用されうる。
【０１８４】
【表４７】
【０１８５】
引用文献
１．「新薬の前臨床リサーチの原理（Principles of Pre-clinical Research of New Drugs）」、中華人民共和国、1993、7:137-143
２．「新薬の前臨床リサーチの原理（Principles of Pre-clinical Research of New Drugs）」、中華人民共和国、1993、7:128-129
３．Yuanpei Zhang, Huaide Su. 「薬理学的実験（第二版）（Pharmacological experiment (second edition)）」、People's Health Publishing House、1998、137-138
４．Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen、「薬理学的実験の方法（Methodology of pharmacological experiment）」、People's Health Publishing House、1991、1221-1234
５．「新薬の前臨床リサーチの原理（Principles of Pre-clinical Research of New Drugs）」、中華人民共和国、1993、7:140
６．Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong、「ＮＫ細胞活性を試験するＭＴＴ還元法における研究（The study on MTT reduction method of testing NK cell activity）」、China Immunology Journal、1996、1(6): 356-358
７．Yaoqin Yang, Huchuan Yang, Huihong Taoら、「高体温の抗腫瘍に対するＴｗｅｅｎ−８０の相乗効果−マウス黒色腫の実験的研究（The synergic effect of Tween-80 on the antitumor of hyperthermiaExperimental studies of mouse melanoma）」、Cancer Research on Prevention and Treatment、1999、26(4): 8-12
８．Jian Fu, Jie Zheng, Weigang Fangら、ネズミＢ１６黒色腫細胞中へのインターロイキン−１２遺伝子トランスフェクションは腫瘍形成を抑制し、転移ポテンシャルを減少させる（Interleukin-12 gene transfection into murine B16 melanoma cells suppresses tumorigenicity and decreases metastatic potential）」、National Medical Journal of China、1998、78(8): 627-629
９．Qian Wang、「現代の医学実験法（Modern medical experiment method）」、People's Health Publishing House、1998、482-483
１０．Qichao Pan, Bin Xu、「癌薬理学および化学療法（Cancer pharmacology and chemotherapy）」、Henan medical university Publishing House、2000、66-69
１１．Yuanpei Zhang, Huaide Su、「薬理学的実験（第二版）（Pharmacological experiment (second edition)）」、People's Health Publishing House、1998、131
【０１８６】
Ｖ．体重に対する影響
健康なラットに、同時にペプチド処理（筋内３００μｇ／ｋｇ／日）を行って、または行わないで、高栄養食餌を５週間与えた。セーライン注射をした通常の食餌におけるラットを負の対照として用いた。処理の５週後、注射を止め、同じ食餌をさらに３週間維持した。週１回の間隔で、体重データを集めた。ラットの行動も観察した。ペプチドＣＭＳ０１５を受けているラットは、ペプチド処理過程の間、対照と比べて統計学的に有意に低い体重増加を有することが見出された。この減少した体重の傾向は、ＣＭＳ０１５処理を止めた後に徐々に減少した。結論として、ＣＭＳ０１５は、適当な投与量レベルで、食べ過ぎによって誘導される肥満発現を可逆的に調節することができる。
【０１８７】
材料
体重１４５±１０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットは、中華人民共和国の広州中医薬大学の実験動物センター（the Center of Experimental Animal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine）によって提供された（証明番号：２０００Ａ０１９）。ペプチドはAmerican Peptide Company, Inc., USAによって（Ｌ−アミノ酸起源から）注文製造され、正常セーライン中における１０μｇ／ｍｌに希釈された。高および並栄養食餌を、中華人民共和国のＳＤＡ（国家薬品監督管理局（State Drug Administration））によって発行された抗肥満薬の前臨床リサーチのためのガイドライン（the guideline for pre-clinical research of anti-obesity drug）にしたがって、調製した［１］。
【０１８８】
方法
健康なラットを、実験、正の対照および負の対照群に無作為化した。１群あたり１０匹のラットであり、半分が雄、半分が雌であった。ラットの実験群に、高栄養食餌を５週間与え、同時に、１日に１回、３００μｇ／ｋｇ／日のペプチドの筋内注射を行った。正の対照群は、同じ高栄養食餌を受けたが、プラシーボセーライン注射を受け、一方、肥満モデルの確立の成功を証明するために使用される負の対照群は、並栄養食餌およびプラシーボセーライン注射を受けた。５週間処理後、注射を止め、同じ食餌をさらに３週間維持した。週１回の間隔で、ラットを計量した。ラットの行動も観察した。
【０１８９】
統計
データは、平均±標準偏差として表された。対応のあるｔ検定または単一因子ＡＮＯＶＡを、群間および群内比較に用いた。統計学的有意カットオフはＰ＜０．０５であった。
【０１９０】
結果
１．ＳＤラットの体重に対するペプチドの影響
【表４８】
【０１９１】
３００μｇ／ｋｇ／日の投与量で、ＣＭＳ０１５は、食べ過ぎによって誘導される肥満ラットの体重増加を制限することができ、対照群に対する統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）を有することが見いだされた。処理群と対照群の差は、処理の長さによって増加した。処理群におけるペプチドＣＭＳ０１５処理の終了時、処理群と対照群の差は、徐々に減少し、３週後、統計学的に有意差がなくなり、このことは、ＳＤラット体重に対するペプチドの影響が可逆的であることを示した。
実験の全過程の間、ラットの全群の食欲および活動は正常に維持されたことが観察された。
【０１９２】
考察
結論として、ＣＭＳ０１５は、適当な投与量レベルで、食べ過ぎによって誘導される肥満の発現を制限することができる。該ペプチドは、肥満の調節のためにヒトでの使用に付してもよい。該ペプチドは、単独で、２以上のペプチドを組み合わせて、または他の医薬もしくは食物サプリメントと組み合わせて、肥満管理の全過程として用いてもよい。
本研究において、筋内注射による投与が試験されたが、これは、他の別の経路を介して投与された場合のペプチドの可能性のある効力を排除するものではない。該ペプチドは、リポソーム、徐放性保護などの送達促進デバイスを用いる、または用いない、静脈内注射、筋内注射、腹膜内注射、皮下注射、および皮下埋め込みを介して投与されてもよい。該ペプチドは、また、錠剤、カプセル、懸濁、溶液などの経口投与のいずれかの形態において、修飾を用いない通常の形態または徐放性形態において、または胃腸保護を用いて、または用いないで、投与されてもよい。該ペプチドは、さらに、経皮促進デバイスを用るまたは用いない、軟膏、クリーム、ゲルなどの局所塗布のいずれかの形態において、または、粉末、溶液の吸入剤として、またはリポソーム保護形態として、塗布されてもよい。該ペプチドは、また、その遺伝子配列に解読され、単独または他のペプチド配列と組み合わせて発現系中にクローン化して、得られるペプチド分子を作成し、該得られるペプチドを精製して、または精製せずに、本明細書中に記載するようなペプチドの活性を利用してもよい。
【０１９３】
【表４９】
【０１９４】
引用文献
１．SDA, 中華人民共和国、「新薬の前臨床リサーチのためのガイドライン（The guideline for pre-clinical research of new drugs）」、1993
【０１９５】
本発明を実施する別の方法として、上記に開示したペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に付加的なアミノ酸を付加することが可能であることは理解される。例えば、１または２個のアミノ酸が、開示されたペプチドに、その生物学的機能に影響を及ぼさずに付加されうる。また、３または４個のアミノ酸を付加し、依然としてペプチドの機能を維持することも可能である。これらは全て、同じペプチドの変種といわれる。別法では、１または２個のアミノ酸を該ペプチドから、その生物学的活性に影響を及ぼさずに欠失させてもよい。さらに、３または４個のアミノ酸をそのペプチドの生物学的機能に影響を及ぼさずに欠失させることも可能である。これらは、該ペプチドのフラグメントといわれる。さらに、１のアミノ酸の同じ官能クラス内の別のアミノ酸での保存的置換などのペプチドの誘導体を用いて、本発明の別の態様を実施してもよい。例えば、非極性または疎水性側鎖を有するペプチドは、生物学的活性を減じることなく、１の側鎖基を別の基で置換することが可能である。さらなる例として、リンカー／スペーサーをペプチド中に挿入して、変種を形成してもよい。ただし、該変種は、該研究において用いられる元々のペプチドとして、その活性部分を依然として維持したままである。これらは、また、該ペプチドの変種と考えられる。本明細書で使用される場合、ペプチド類似体は、天然アミノ酸の構造を模倣するアミノ酸分子を有するペプチド、例えば、異なる骨格構造またはＤ−アミノ酸置換を有する類似体を包含する。さらなる例として、ペプチドの合成に用いられるアミノ酸はそのＬ光学異性体であるが、配列中、１以上のアミノ酸がＤ−形態で置換されたペプチドは類似の生物学的活性を有しうる。本請求の範囲で使用される場合、「機能的誘導体」なる語は、ペプチドのフラグメント、類似体または化学的誘導体を包含することを意味する。
【０１９６】
本明細書で使用される場合、「ハイブリッドペプチド」なる語は、配列番号１−３０を有する元々の生物学的に活性なペプチド中に挿入された付加的なペプチドまたはその機能的誘導体を含有するが、依然として、実質的に類似の活性を維持しているペプチドをいう。付加的なペプチドは、例えば、細胞中または細胞外へのハイブリッド蛋白質の分泌のためのシグナルとして、１以上の原核生物または真核生物細胞によって認識されるアミノ酸配列を含有するリーダーペプチドを包含する。該分泌は、直接的な分泌であってもよく、または分泌小胞を介して間接的であってもよい。
「実質的に純粋なペプチド」なる語は、少なくとも１０％ｗ／ｗ純粋、より好ましくは２０％、さらにより好ましくは４０％、非常により好ましくは６０％、はるかにより好ましくは９０％以上純粋であるペプチドをいう。最も好ましい具体例において、純粋とは、９９％以上のことである。実質的に純粋なペプチドは、下記のような複雑な混合物であってもよい医薬および栄養処方を調製するために用いることができる。
【０１９７】
医薬処方における上記で定義付けられたのペプチドの使用は、免疫に対する二次的影響を有する免疫学的障害または疾患、例えば、癌または感染または上記状態のいずれかのための可能性のある治療として用いてもよい。該処方は、他のペプチドを包含する他の活性または不活性な成分と混合した同定されたペプチドの１つを含有していてもよい。例えば、列挙されたペプチドのうち２ないし数個（例えば、３−５）を、他の成分を用いる、または用いない同じ処方に加えてもよい。別法では、列挙されたペプチドのうち１つを用いて、本明細書に列挙されていないペプチドと一緒に処方を調製してもよい。それらは、静脈内、筋内、皮内、皮下または皮内形態において投与することができる。投与様式は、また、目的の器官に直接導く動脈内注射であってもよい。他の投与様式は、経皮、粉末またはスプレーとして吸入、および当業者に知られた送達の他の形態である。該処方はまた、経口によって服用されてもよく、経口摂取後のペプチドの胃での消化を防ぐために用いることのできる担体または当該分野で既知のいずれか他の担体（リポソームなどの経皮のための）を含有していてもよい。
【０１９８】
医薬処方は、既知の医薬担体のいずれかを包含しうる。適当な担体の例は、当業者に知られた標準的な医薬上許容される担体のいずれかを包含する。これらは、限定するものではないが、生理学的セーライン溶液、水、油および水混合物またはトリグリセリドエマルジョンを包含するエマルジョン、および他の型の薬剤、充填剤、被覆錠剤およびカプセルを包含する。適当な担体は、医薬組成物の投与様式に基づいて選択されうる。
【０１９９】
該ペプチドは、静脈内注射、筋内注射、腹膜内注射、皮下注射および皮下埋め込みを介して投与されうる。該ペプチドは、また、錠剤、カプセル、懸濁、溶液などの経口投与のいずれかの形態において、修飾を用いない通常の形態または徐放性形態において、あるいは胃腸保護を伴う、または伴わないで、投与されうる。さらに、該ペプチドは、軟膏、クリーム、ゲルなどの、経皮促進デバイスを用いるまたは用いない、局所塗布のいずれかの形態において塗布されてもよい。該ペプチドは、また、その遺伝子配列に解読され、単独または他のペプチド配列と組み合わせて発現系中にクローン化されて、得られるペプチド分子を作成して本明細書に記載のような該ペプチドの活性を利用してもよい。
【０２００】
各ペプチドの投与量は、体重１ｋｇあたり１ｎｇ−１０ｇでありうる。好ましい投与量は、注射投与様式の場合、１０ｎｇ−１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１μｇ−１ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、１以上のペプチドが正常な生理学的応答のカスケードを包含するレセプターによって作動しうるので、有効量は、体重１ｋｇあたり１ｎｇと低くてもよい。別法では、１以上のペプチドは、単に、全カスケード反応の開始剤である。経口摂取の場合、該量は、体重１ｋｇあたり１ｎｇ−１０ｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり０．１μｇ−１ｇ、さらにより好ましくは１μｇ−１０ｍｇ／日であってもよい。
【０２０１】
ＶＩ．遺伝子療法および治療法
見出されたペプチド配列に基づく遺伝子療法は、これらのペプチドの１つをコードする核酸を設計することによって行う。核酸は、化学的に合成され、プロモーターに作動可能に連結され、発現ベクター中にクローン化されうる。次いで、該発現ベクターを、ヒト細胞中での発現のための遺伝子療法の形態として、人体に投与する。本明細書中で使用される場合、「遺伝子ベクター」なる語は、これらの発現ベクターを包含する。遺伝子療法に使用できるベクターは、アデノ随伴ウイルス (Mizuno, M.ら、(1998) Jpn J Cancer Res 89, 76-80) 、ＬＮＳＸベクター (Miller, A.D.ら、(1993) Methods Enzymol 217, 581-599) およびレンチウイルス (Goldman, M.J. ら、 (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268) を包含する。
【０２０２】
ペプチド送達のための他のビヒクルは、宿主生物の健康に対して重大な有害な影響を伴わないで該ペプチドを投与することが望まれる宿主生物中で複製することのできる生物中に運ばれることのできる所望のペプチドをコードしている発現ベクターを包含する。例えば、該発現ベクターは、該ペプチドを投与することが望まれる宿主生物に対して病原性ではない生物中に運ばれうる。いくつかの具体例において、該発現ベクターは、該ペプチドが投与されるべき宿主生物の健康に対して重大な有害な影響を有さない細菌または真菌生物中で、所望のペプチドを生産する。例えば、所望のペプチドをコードしている発現ベクターは、乳酸菌、イー・コリ（E.coli）または酵母のような生物中で所望のペプチドを生産する発現ベクターであってもよい。１の具体例において、発現ベクターは、哺乳動物の胃において通常見出される微生物または哺乳動物消化管に耐性のある微生物中で、所望のペプチドを生産する。所望のペプチドが発現されることのできる微生物種のいくつかは、限定するものではないが、乳酸桿菌（Lactobacillus）種、例えば、エル・アシドフィルス（L. acidophilus）、エル・アミロボルス（L. amylovorus）、エル・カセイ（L. casei）、エル・クリスパタス（L. crispatus）、エル・ガリナルム（L. gallinarum）、エル・ガセリ（L. gasseri）、エル・ジョンソニイ（L. johnsonii）、エル・パラカセイ（L. paracasei）、エル・プランタラム（L. plantarum）、エル・ロイテリ（L. reuteri）、エル・ラムノサス（L. rhamnosus）など；ビフィズス菌（Bifidobacterium）種、例えば、ビー・アドレスセンチス（B. adolescentis）、ビー・アニマルス（B. animalus）、ビー・ビフィダム（B. bifidum）、ビー・ブレブ（B. breve）、ビー・インファンティス（B. infantis）、ビー・ラクチス（B. lactis）、ビー・ロンガム（B. longum）など；エンテロカッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）またはエンテロカッカス・ファシウム（Ent. facium）；スポロラクトバシラス・イヌリナス（Sporolactobacillus inulinus）；バシラス・サチルス（Bacillus subtilis）またはバシラス・セレウス（Bacillus cereus；エシェリキア・コリ（Escherichia coli）；プロピオニバクテリウム・フロイデンレイチ（Propionibacterium freudenreichii）；またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはサッカロミセス・ボウラルディイ（Saccharomyces boulardii）を包含する。
【０２０３】
化学的に合成されたか、または限定するものではないが、ｍＲＮＡの逆転写を包含するｃＤＮＡ分子を製造するための他の手段によって製造された本発明のペプチドをコードする核酸配列は、当業者によく知られている遺伝子操作法によって、所望の生物中への遺伝子移入のための発現ベクター中に組み込まれる。該発現ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。例えば、発現ベクターは、プラスミドまたはウイルス性遺伝子エレメントに基づくベクターであってもよい。発現ベクターは、染色体外で複製するベクターであってもよく、または染色体中に一体化するベクターであってもよい。
【０２０４】
発現ベクターは、本発明のペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。該プロモーターは、調節可能なプロモーター、例えば、誘導可能なプロモーター、または構造性プロモーターであってもよい。いくつかの具体例において、該プロモーターは、所望のレベルのペプチド発現を提供するために選択されうる。さらに、所望により、発現ベクターは、ペプチドの生産、提示および／または分泌を促進するための他の配列を含んでいてもよい。いくつかの具体例において、本発明のペプチドをコードしている核酸は、ペプチドの分泌を指示する核酸配列に作動可能に連結される。例えば、本発明のペプチドをコードしている核酸は、シグナルペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結されうる。
【０２０５】
いくつかの具体例において、本発明のペプチドをコードするように操作される発現ベクターは、哺乳動物の通常の腸管内菌叢を構成する細菌種、例えば、乳酸桿菌種およびバシラス・サチルス中で、本発明のペプチドを発現するように適応させた発現ベクターであってもよい。かかる発現ベクターの例は、Casasの米国特許第６，１００，３８８号およびBelliniの米国特許第５，７２８，５７１号において、各々、見出すことができる。これらの特許文献は、出典明示により、全体として明白に本明細書の一部とされる。ペプチドが投与されるべき宿主生物の健康に対して有害ではない、生物中で本発明のペプチドの発現を容易にするいずれの発現ベクターを使用してもよいことは、当業者に明らかであろう。
【０２０６】
いくつかの具体例において、本発明にペプチドをコードするように操作された発現ベクターは、ヒトの胃においてコロニーを形成することができ、ある特定の形態の下痢を治療するのに使用される、哺乳動物の胃に対してよく耐性のある酵母種、例えば、サッカロミセス・セレビシエ；または好ましくは、サッカロミセス・ボウラルディイ中において、本発明のペプチドを発現するように適応させた発現ベクターであってもよい。異種蛋白質およびペプチドを構造発現し、非常に安定しており、それゆえ、有糸分裂および減数分裂の間、子孫細胞によく伝達され、高レベルの組み換え蛋白質分泌を指示するシグナルペプチドのコーディング配列を含みうる酵母発現ベクターを使用することができる。かかる酵母ベクターの一例は、Jangらの米国特許第６，３９１，５８５号（出典明示により、全体として明白に本明細書の一部とされる）に提供される。
【０２０７】
本発明のペプチドをコードしている発現ベクターは、当該分野で既知の技術によって、ペプチドを発現することを意図された生物中に導入されうる。これらの技術は、化学的にコンピテントな細菌細胞、エレクトロポレーションまたは酢酸リチウム形質転換（酵母用）の使用によって、細菌、酵母または他の微生物を形質転換する伝統的な方法、ならびに、例えば、これらの手法に不応性の細菌種の形質転換における最近の進歩を包含する。いくつかの具体例において、発現ベクターは、Leerら（ＷＯ９５／３５３８９）に開示される方法を用いて（その開示は、出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）、形質転換に対して不応性であることが知られた乳酸菌中に導入される。導入された配列は、微生物の染色体ＤＮＡ中に組み込まれるか、または染色体外ＤＮＡエレメントとして留まっていてもよい。
【０２０８】
該発現ベクターを含有するこの遺伝子操作された微生物を、次いで、消化管、膣、気管などに接種して、持続性免疫療法を達成することができる。いくつかの具体例において、本発明のペプチドを発現している生物は、不活性形態で、または好ましくは、生きている形態で摂取される。胃において、これらの微生物は、該ペプチドを生産し、分泌または微生物の溶解によって、管腔中にそれらを放出し、または別の方法で該ペプチドを宿主に提供し、それにより、該ペプチドはその目的の効果を宿主生物において生じる。他の具体例において、ペプチドは、鼻道、膣または小腸の粘膜にて宿主に提供される。
【０２０９】
別の治療法は、人体において細胞に特定の核酸を送達するための手段としてのリポソームの使用である。核酸（配列番号１〜３０のペプチドをコードする核酸配列を含有する発現ベクターのような）は、Gao, X. および Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722およびＵＳ６，２０７，４５６に記載のような細胞の取り込みおよび染色体の組み込みを促進する環境において送達される。別法では、ＵＳ６，２４５，４２７に記載の方法を用いて、ペプチド自体がリポソーム中に包まれ、直接送達されることができる。上記の科学出版物および特許は全て、出典明示により本明細書の一部とされる。
上記の遺伝子療法および治療法に有用な核酸配列は、これらのペプチドおよびその機能的誘導体をコードする配列を包含する。多くの核酸配列のうちどれでも、これらのペプチドおよび縮重コドン系に基づくその誘導体をコードするために用いられうる。
【０２１０】
下記の引用文献は、出典明示により、全体として本明細書の一部とされる。
１．「新薬の前臨床リサーチの原理（Principles of Pre-clinical Research of New Drugs）」、中華人民共和国、1993、7:134-135
２．Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen、「薬理学的実験の方法（Methodology of pharmacological experiment）」、People's Health Publishing House、1991、1221-1234
３．中華人民共和国の衛生部によって発行された「前臨床における新薬リサーチの原理（Principle of new drug research in pre-clinic）」、1993、7:140
４．Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong、「ＮＫ細胞活性を試験するＭＴＴ還元法における研究（The study on MTT reduction method of testing NK cell activity）」、China Immunology Journal、1996、1(6): 356-358
５．Qian Wang、「現代の医学実験法（Modern medical experiment method）」、People's Health Publishing House、1998、482-483
６．中華人民共和国の衛生部によって発行された「前臨床における新薬リサーチの原理（Principle of new drug research in pre-clinic）」、1993、7: 141
７．中華人民共和国の衛生部によって発行された「前臨床における新薬リサーチの原理（Principle of new drug research in pre-clinic）」、1993、7: 132-133
８．中華人民共和国の衛生部によって発行された「前臨床における新薬リサーチの原理（Principle of new drug research in pre-clinic）」、1993、7: 128-129
９．Yuanpei Zhang, Huaide Su、「薬理学実験（第二版）（Phamalogical experiment (second edition)」、People's Health Publishing House、1998、137-138
１０．Jiatai Li、「臨床薬理学（第二版）（clinical pharmacology(second edition)）」、People's Health Publishing House、1998、1338-1339
【実施例１】
【０２１１】
遺伝子操作した乳酸桿菌細菌種によるペプチドの送達
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための一例の方法を提供する。上記の表Ａに列挙したペプチドのうち１つをコードするＤＮＡ配列は、化学的手段によって合成され、該ＤＮＡ配列は、当業者によく知られた遺伝子操作の標準的技術を用いて、発現ベクター中へ挿入される。選択された発現ベクターは、乳酸桿菌において機能的な構造性プロモーター、特定の５’ないし３’配向におけるＤＮＡ配列の導入のためのマルチプルクローニングサイト、ならびに抗生物質耐性（クローニング法において助けるための）を与える選択マーカー遺伝子を含有し、ペプチドの生産および／または分泌を補助するための他の配列、例えば、シグナルペプチド配列を含みうる。かかるベクターの例は、Pavlaの米国特許第５，５９２，９０８号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）によって提供される。簡単に言うと、該特許は、乳酸桿菌種において機能する数個の既知のプロモーター、ならびに該細菌中の新規なプロモーター（そのいずれも、乳酸桿菌中でペプチドを発現するように、本発明のペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結されていてもよい）を見出す方法を論じる。上記の米国特許第５，５２９，９０８号に記載のようなラクトバシラス・ラクチス中で活性な１６ないし３５個のほとんど疎水性のアミノ酸よりなるペプチドのようなシグナルペプチドをコードしている核酸は、プロモーターと本発明のペプチドをコードしている核酸との間に挿入され、その結果、シグナルペプチドをコードしている核酸は、本発明のペプチドをコードしている核酸を有するフレーム内にある。
【０２１２】
ペプチドのコーディング配列のほかに、合成されたＤＮＡ配列は、該ＤＮＡの発現ベクター中への連結およびクローニングにおいて助けとなる配列を含んでいてもよい。例えば、ベクターのマルチプルクローニングサイトにおいて見出される配列に対応する制限酵素認識部位を、該配列の５’および３’末端にて該合成ＤＮＡ中に組み込むことができ、その結果、該配列をベクター内で適当な配向でクローン化することができる。ベクターおよび合成ＤＮＡの両方とも、特定の制限酵素で消化され、次いで、精製される。ベクターおよび合成ＤＮＡとの連結反応の後、イー・コリの適当な株に形質転換する。形質転換された細菌は、ベクターが耐性を与える抗生物質を含有する培地に植える。形質転換された細菌のコロニーを、生育培養およびプラスミド調製法について選択し；正しい配向の合成ＤＮＡの存在を確認する。
【０２１３】
次いで、発現ベクターを乳酸桿菌種、例えば、エル・アシドフィルスの細菌宿主細胞中に形質転換する。形質転換細胞は、ベクター配列内に見出される選択マーカーによって選択され、該ペプチドの分泌は、ウェスタン・ブロットを行い、成長培地中に存在するペプチドのゲル電気泳動を行い、または他の標準的な技術によって証明されうる。細菌の形質転換コロニーを選択し、遺伝子操作した細菌の大量培養を調製するために用いる。所望のペプチドを発現している遺伝子操作した細菌の培養物を増殖させ、少なくとも、その一部を、その中で細菌が複製することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。所望により、細菌培養物は、宿主による腸での消費のためのサプリメントを生産するための種々の方法において処理することができる。これらの処理は、凍結乾燥または細菌を保存するための他の方法を包含し、さらに、細菌と担体薬剤、例えば、溶液、溶媒、分散培地、遅延剤、エマルジョンなどと組み合わせる。サプリメントを調製するためのこれらの薬剤の使用は、当該分野でよく知られている。例えば、細菌を用いて、ヒト消費用の発酵乳製品または他の食品を製造することができ、その結果、該ペプチドを発現している生物は宿主生物の胃でコロニー形成する。乳酸菌の特定の株をヨーグルト、キムチ、チーズおよびバターなどの食品中に組み込むための多くの異なる方法が、Ohの米国特許第６，０３６，９５２号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）において開示される。多くの経路のうち１つによる細菌の消費において、操作された生物は胃でコロニー形成でき、胃の粘膜層を介する本発明のペプチドの提示および／または吸収を可能にする。
【実施例２】
【０２１４】
バシラス・サチルスの遺伝子操作形態によるペプチドの送達
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための別例の方法を提供する。上記の表Ａに列挙したペプチドのうち１つをコードするＤＮＡ配列は、化学的手段によって合成され、該ＤＮＡ配列は、遺伝子操作技術（全ての技術は当該分野で知られている）によって、発現ベクター中へ挿入される。選択される発現ベクターは、イー・コリおよびビー・サチルスの両方において増殖することができ、形質転換細菌のコロニーを選択するための抗生物質耐性遺伝子を含有するシャトルベクター、例えば、ｐＴＺ１８Ｒ（Pharmacia, Piscataway, NJ）を含む。該ベクターは、ビー・サチルスにおいて活性な構造性プロモーター、例えば、ビー・サチルスのＳａｃ Ｂ遺伝子由来のプロモーターならびに細菌細胞からの発現した異種蛋白質の有効な輸送を指示するビー・サチルスにおいて活性なシグナルまたはリーダーペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含有することができる。かかるベクターの一例は、Fahnestockの米国特許第６，２６８，１６９号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に開示される。簡単に言うと、上記のように、本発明のペプチドをコードしているＤＮＡは、当業者によく知られた技術によって、ＤＮＡのクローニングを容易にするための制限酵素部位および／または他の配列を用いて合成されるであろう。イー・コリ中への形質転換、播種、選択およびプラスミドを増殖してプラスミドストックを作成後、該プラスミドをビー・サチルス中に形質転換し、播種培地において、形質転換体を抗生物質耐性によって選択する。
【０２１５】
遺伝子操作したビー・サチルスにおけるペプチドの生産および該細菌からのその分泌は、当業者によく知られた技術、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析またはウェスタンブロット後のオートラジオグラフィック検出のためのペプチドの放射能標識を用いて証明される。
遺伝子操作された細菌の培養物を増殖させ、少なくともその一部を細菌が増殖することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。
【実施例３】
【０２１６】
遺伝子操作されたサッカロミセス酵母種によるペプチドの送達
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための別例の方法を提供する。上記の表Ａに列挙されたペプチドのうち１つをコードするＤＮＡ配列は、化学的手段によって合成され、該ＤＮＡ配列は、遺伝子操作技術（全ての技術は当該分野で知られている）によって発現ベクター中へ挿入される。選択される発現ベクターは、安定に維持された酵母蛋白質発現ベクターを含み、それは、ｐＡＤＨ１のような構造性酵母プロモーター、酵母およびイー・コリの両方におけるベクターの複製のための部位、選択目的のために栄養要求性酵母突然変異体に栄養を与える遺伝子、マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）および、所望により、シグナルペプチドをコードする配列を含む。このようなベクターは、商業的に入手可能であり、当該分野でよく知られているか、または標準的な技術を用いて容易に構築できる。合成ＤＮＡの酵母ベクター中への挿入、イー・コリ中への形質転換、形質転換したイー・コリの選択培地への播種、形質転換した細菌コロニーの選択および該コロニー由来の細菌の成長培養物からのプラスミドＤＮＡの調製後、よく知られた技術、例えば、酢酸リチウム形質転換またはエレクトロポレーションによって、ベクターをサッカロミセス・セレビシエ中に形質転換する。形質転換のために選択されたサッカロミセス・セレビシエの株は、最少培地プレート上で生育するために、プラスミド上の遺伝子を必要とするであろう突然変異体栄養要求株である。形質転換された酵母コロニーは、ベクター上に提供される遺伝子を欠く成長培地上に酵母を播種することによって、単離される。ベクターおよびその選択遺伝子を受け取り、その遺伝子産物を発現している酵母だけが、最少培地上でコロニーに成長できるであろう。ペプチド分泌の証明は、ウェスタンブロットを行い、成長培地に存在するペプチドのゲル電気泳動を行うことによって、または他の標準的技術によって、得ることができる。
【０２１７】
酵母の形質転換コロニーを選択し、大量培養物を調製するために使用する。所望のペプチドを発現している遺伝子操作した酵母の培養物を増殖させ、少なくともその一部を、細菌が複製することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。所望により、酵母培養物は、宿主による腸での消化のためのサプリメントを生産する種々の方法において処理できる。これらの処理は、凍結乾燥または酵母を保存する他の方法を包含し、さらに、溶液、溶媒、分散培地、遅延剤、エマルジョンなどの担体物質と細菌を組み合わせることを含む。サプリメントを調製するためのこれらの薬剤の使用は、当該分野でよく知られている。別の具体例において、形質転換した酵母を、当業者によく知られた技術によって、食品、例えば、ヨーグルトおよびケフィールなどの発酵乳製品の生産に用いる。これらの食品中の生きている乳酸菌培養物と同様に、形質転換した酵母は、少なくとも一時的に胃でコロニー形成し、胃の管腔を介してペプチドを宿主へ提供する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学の分野に関する。特に、本発明は、免疫応答を変調することのできるペプチドおよびその医薬組成物に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは、疾患の治療の分野において、医薬組成物として知られている。例えば、特許文献１は、平滑筋細胞の成長に対する阻害活性を有し、したがって、動脈硬化症、血管形成後の再狭窄、血管移植後の管腔狭窄および平滑筋肉腫などの平滑筋細胞の成長に関連する病理学的状態の予防および治療に有用なペプチドを開示する。特許文献２は、重量増加、上皮増殖帯の活性および毛髪成長などの生理学的プロセスを変調することが見出された別のペプチドを開示する。
【特許文献１】米国特許第６，１９１，１１３号
【特許文献２】米国特許第６，１８４，２０８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の目的は、生物学的に活性なポリペプチドを同定することにある。多くのペプチドが、標準的な化学的方法によって合成され、その生物学的活性についてスクリーンされた。該ペプチドには、ＣＭＳの後に番号を付したコードを与える。全部で３０個のペプチドが、イン・ビボ生物学的活性を有すると同定された。これらの生物学的に活性なペプチドの配列および対応するＩＤ番号を表Ａに示す。
【０００４】
【表１】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明の１の態様は、配列番号１ないし配列番号３０として同定された配列を有する実質的に純粋なペプチドに関する。かくして、本発明は、また、配列番号１−３０からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドに関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドに関する。特定の具体例において、該ペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
【０００６】
本発明の別の態様は、配列番号１−３０として同定された配列を有するペプチドの機能的誘導体である実質的に純粋なペプチドに関する。かくして、本発明は、また、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸の機能的誘導体であるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドに関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体であるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドに関する。特定の具体例において、機能的誘導体である該ペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
【０００７】
本発明の別の態様は、配列番号１ないし３０として上記で同定されたペプチドをコードしている配列を有する核酸に関する。本発明のさらなる態様は、配列番号１ないし３０として下記に示されるペプチドの核酸配列を含有する発現ベクターに関する。かくして、本発明の該態様は、また、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。本発明は、また、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列からなる、ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。
【０００８】
また、本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドの隣りにリーダーまたはシグナルペプチドを含有するハイブリッドペプチドに関する。本発明は、また、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの機能的誘導体を含むペプチドの隣りにリーダーペプチドを含有するハイブリッドペプチドに関する。
【０００９】
本発明は、また、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列を含むペプチドの隣りにリーダーアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列からなる、ペプチドの隣りにリーダーアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。
【００１０】
特定の具体例において、上記の遺伝子ベクターのいずれかにおいて生産されたペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
また、本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むゲノムを有する微生物に関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むゲノムを有する微生物に関する。
【００１１】
また、本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列を含む外来性ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝物質を有する微生物に関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列からなる、外来性ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝的構成物を有する微生物に関する。本明細書で使用される場合、外来性ペプチドなる語は、天然の非修飾形態の微生物によって正常に発現されるいずれか他のペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドをいう。
【００１２】
また、本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドの隣りにリーダーアミノ酸配列を含む外来性ハイブリッドペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝的構成物を有する微生物に関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ペプチドの隣りにリーダーアミノ酸配列を含むハイブリッドペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むゲノムを有する微生物に関する。
【００１３】
また、本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列を含むペプチドの隣りにリーダーアミノ酸配列を含む外来性ハイブリッドペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝的構成物を有する微生物に関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択される生物学的に活性なアミノ酸配列の機能的誘導体である機能的アミノ酸配列からなる、ペプチドの隣りにリーダーアミノ酸配列を含む外来性ハイブリッドペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝的構成物を有する微生物に関する。
【００１４】
特定の具体例において、上記の微生物のいずれかにおいて生産されたペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
【００１５】
また、本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物に関する。本発明は、また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物に関する。
本発明は、また、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体を含む実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物に関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体からなる、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物に関する。さらに、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体からなる、実質的に純粋なペプチドからなる医薬組成物に関する。
【００１６】
特定の具体例において、上記の医薬組成物のいずれかにおいて存在するペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
【００１７】
また、本発明のさらに別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを提供し；次いで、該実質的に純粋なペプチドを医薬上許容される担体と混合することを特徴とする、医薬組成物の製造法に関する。また、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドを提供することを特徴とする、医薬組成物の製造法に関する。
本発明の別の態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体であるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを提供し；次いで、該実質的に純粋なペプチドを医薬上許容される担体と混合することを特徴とする、医薬組成物の製造法である。
【００１８】
さらに、本質的に、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体であるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドを提供することを特徴とする、医薬組成物の製造法に関する。
上記の方法のいずれかに関し、該ペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
【００１９】
また、本発明のさらなる態様は、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドの医薬上有効量をヒトに投与することを特徴とする、ヒトの治療法に関する。また、配列番号１−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体であるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドの医薬上有効量を投与することを特徴とする、ヒトの治療法に関する。
特定の具体例において、上記のヒトの治療に使用されるペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調するために使用されうる。
【００２０】
上記の核酸配列に関し、これらの核酸配列から発現されるペプチドおよび／またはハイブリッドペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
本発明の別の態様は、配列番号１ないし配列番号３０の配列を有する実質的に純粋なペプチドの医薬上有効量を投与することを特徴とする、疾患の治療法に関する。特定の具体例において、そのように投与されるペプチドは、限定するものではないが、免疫活性；限定するものではないが、Ｂ型肝炎感染を包含する肝炎感染；腎炎；限定するものではないが、肉腫、肝臓癌、白血病および黒色腫を包含する癌の成長；および体重のうち１以上を変調することができる。
【００２１】
上記のように、本発明の別の具体例は、本質的に本発明のペプチドからなる、ペプチドまたはポリペプチドである。本明細書で使用される場合、「本質的に、・・・からなる」なる語は、カルボキシおよび／またはアミノ末端に付加的なアミノ酸を有する本発明のペプチドのアミノ酸配列を包含し、かつ、本明細書において提供される本発明のペプチドの活性を維持するペプチドまたはポリペプチドをいう。かくして、非制限的な例として、本発明のペプチドの活性が免疫活性を変調することである場合、「本質的に、本発明のペプチドからなる」ペプチドまたはポリペプチドは、該ペプチドに関して本明細書において提供されるような免疫活性を変調する活性を有し、かつ、該ペプチドまたはポリペプチドの免疫活性変調能を著しく減少するかまたは免疫活性のモジュレーターとしての該ペプチドの基本的かつ新規な特徴の具体的変化を構成するいずれの特徴も有さないであろう。かくして、上記の例において、免疫活性の変調以外の一次活性を有し、本発明のペプチドのアミノ酸配列をどこかに含有する全長の天然ポリペプチドは、「本質的に、本発明のペプチドからなる」ペプチドまたはポリペプチドを構成しない。同様に、上記の例において、免疫活性の変調以外の一次活性を有するが、本発明のペプチドのアミノ酸配列をどこかに含む遺伝子操作されたペプチドまたはポリペプチドは、「本質的に、本発明のペプチドからなる」ペプチドまたはポリペプチドを構成しない。
【００２２】
上記の説明に用いられた免疫活性変調の例のほかに、本発明のペプチドのために提供された活性に関する全てのペプチドに、上記の定義が適用される。特に、上記の定義は、下記に詳述されるように、ウイルス感染の程度の変調、肝炎感染の程度の変調、腎炎の程度の変調、癌の成長の変調または体重の変調における活性を有する本発明のペプチドに適用する。
当業者は、上記の定義のもとに、本発明の特定のペプチドに関して本明細書に提供される免疫活性の変調、ウイルス感染の程度の変調、肝炎感染の程度の変調、腎炎の程度の変調、癌の成長の程度の変調または体重の変調に関するアッセイを用いてペプチドまたはポリペプチドの活性を測定することによって、ペプチドまたはポリペプチドが本質的に本発明のペプチドからなるかどうかを容易に決定できる。
【００２３】
好ましい具体例において、「本質的に、・・・からなる」なる語は、本発明のペプチドのほかに２０個未満のアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドをいう。より好ましい具体例において、該用語は、本発明のペプチドのほかに１５個未満のアミノ酸残基を有するペプチドをいう。まだより好ましい具体例において、該用語は、本発明のペプチドのほかに１０個未満のアミノ酸残基を有するペプチドをいう。別の好ましい具体例において、該用語は、本発明のペプチドの１つのほかに６個未満のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドをいう。別の好ましい具体例において、該用語は、本発明のペプチドの１つのほかに４個未満のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドをいう。最も好ましい具体例において、本発明のペプチドの１つのほかに２個未満のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドをいう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
ペプチドは、標準的な合成法によって、Ｌ−アミノ酸から容易に合成できるが、また、個々のペプチドをコードしている配列を有する核酸を用いて遺伝子操作方法によって合成してもよい。
【００２５】
Ｉ．生物学的活性
ペプチドの可能性のある生物学的活性を研究するために、動物モデルに対するペプチドの免疫学的影響を、中華人民共和国の衛生部によって発行された「新規薬物の前臨床研究の原理」［１］に従う手法で調べた。
Ｔリンパ球形質転換試験、ＮＫ細胞細胞毒活性試験およびＴリンパ球ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌試験を用いて、特異的細胞免疫機能に対するペプチドのいずれかの可能性のある影響を検出した。炭素粒子クリアランス試験を用いて、非特異的細胞免疫機能に対するペプチドのいずれかの可能性のある影響を検出した。ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）溶血試験を用いて、体液性免疫機能に対するペプチドのいずれかの可能性のある影響を検出した。免疫器官重量試験を用いて、該器官レベルにてペプチドのいずれかの可能性のある影響を検出した。
【００２６】
該研究において、セーライン群を負の対照として用い、一方、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γはよく研究された免疫賦活剤なので［１０］、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ群を正の対照として用いた。１０００倍投与量範囲に及ぶまでの４つの任意の濃度の試料ペプチドを該研究に用いた。イン・ビボ免疫学的応答の内因性の複雑さのため、および投与量対応答機能における事前知識の欠如のため、いずれかの投与量群における負の対照を超えるいずれかの統計学的に有意な差を、正の生物学的活性として記録した。
【００２７】
該研究の結果は下記のとおりであった：
１．ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２９およびＣＭＳ０３４は、Ｔリンパ球形質転換を増強することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見いだされた。ペプチドＣＭＳ０１４およびＣＭＳ０３６はまた、Ｔリンパ球形質転換を阻害することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見いだされた。
【００２８】
２．ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、ＮＫ細胞の細胞毒活性を増加することができ、セーライン正常対照群に対する統計学に有意な差を有することが見いだされた。ペプチドＣＭＳ００８およびＣＭＳ０１２はまた、適当な濃度で、ＮＫ細胞の細胞毒活性を減少することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【００２９】
３．ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２およびＣＭＳ０３４は、Ｔリンパ球によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）の分泌を増強することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【００３０】
４．ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２およびＣＭＳ０２８は、Ｔリンパ球によるＩＦＮの分泌を増強することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【００３１】
５．ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、抗原性攻撃における抗−ＳＲＢＣ抗体の合成を増強することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。ペプチドＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３６は、適当な濃度にて、抗原性攻撃における抗−ＳＲＢＣ抗体の合成を阻害することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【００３２】
６．ペプチドＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３５、ＣＭＳ０３６は、単核食細胞の食作用活性を増強することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的有意差を有することが見出された。
【００３３】
７．ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、胸腺の重量を増加することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【００３４】
８．ペプチドＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０およびＣＭＳ０３０は、脾臓の重量を増加することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２９およびＣＭＳ０３６はまた、適当な濃度にて、脾臓の重量を減少することができ、セーライン正常対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【００３５】
マウスに対する該ペプチドの影響を分析するために使用された材料および方法を下記する。
【００３６】
材料
１．実験動物
中華人民共和国の国立医学研究所（National Institute of Medical Science）、実験動物センターによって提供されたＢＡＬＢ／ｃマウス、体重１８−２２ｇ、５０％雌および５０％雄。
２．投与
組み換えマウスＩＦＮ−γ（ｒｍＩＦＮ−γ）群：３ｘ１０５ＩＵ／ｋｇ／日
組み換えヒトＩＬ（ｒｈＩＬ）−２群：３ｘ１０５ＩＵ／ｋｇ／日
セーライン群：０．５ｍｌ／各／日
ペプチド投与量Ｉ群：５００μｇ／ｋｇ／日
ペプチド投与量ＩＩ群：５０μｇ／ｋｇ／日
ペプチド投与量ＩＩＩ群：５μｇ／ｋｇ／日
ペプチド投与量ＩＶ群：０．５μｇ／ｋｇ／日
上記物質を全て、０．５ｍｌセーライン中に溶解し、１日に１回、１５日間連続で、腹膜内（ｉ．ｐ．）注射した。
【００３７】
３．主要な試薬
ペプチドは、American Peptide Company, Inc., USAで注文製造した。
胎仔ウシ血清およびＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地（Gibco, USA）
ＭＴＴおよびＣｏｎＡ（Sigma, USA）
ｒｍＩＦＮ−γ（Beijing Biotech Inc., China）
ｒｈＩＬ−２（Shanghai Huaxin Biotech Inc., China）
リンパ球分離溶液（Research Institute of Hematologic Disease, National Institute of Medical Science, PR China）
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２標準試料（National Institute For Control of Pharmaceutical and Biological Products, PR China）
ＨＴ−２細胞およびＬ９２９細胞（中華人民共和国、北京大学免疫学部のWF Chen教授からの贈与物）
【００３８】
方法
１．細胞性免疫に対するペプチドの影響
１．１脾臓細胞懸濁の調製［１，２］
ＢＡＬＢ／ｃマウスを無作為に、ペプチド、ＩＦＮ、ＩＬ−２、およびセーライン群に分けた。１群あたりマウス１０匹。最後の試験物質投与の次の日に、マウスを頚部脱臼によって殺した。脾臓を無菌状態で単離し、注射針を用いて、冷Ｄ−Ｈａｎｋ溶液中に手動で分散させた。分散した細胞懸濁をさらに、１００ゲージ１５０μｍ直径のステンレススチールシーブにより篩い分けした。２００ｇで１０分間の遠心分離後、上清を廃棄した。細胞ペレットを１０容量のＴｒｉｓ−ＮＨ４Ｃｌバッファー中に再懸濁し、次いで、室温で１０分間静置させた。懸濁した細胞を１５０ｇで１０分間の遠心分離によって収集した。細胞を、再懸濁および上記条件の遠心分離による収集によって、冷Ｄ−Ｈａｎｋ溶液で２−４回洗浄した。洗浄した細胞を次いで、１０％胎仔ウシ血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培養培地により、所望の細胞密度に希釈した。
【００３９】
１．２Ｔリンパ球形質転換に対するペプチドの影響［１，２］
１ｘ１０６／ｍｌ密度の脾臓細胞を９６ウェル細胞培養プレート上に、１００μｌ／ウェルにて、マウス１匹あたりアッセイ試料および対照試料の各々を３つの並行したウェルに置いた。アッセイウェルに、ＲＰＭＩ−１６４０中１００μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ １００μｌ／ウェルを加え、無添加のＲＰＭＩ−１６４０ １００μｌ／ウェルを対照に用いた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６６時間インキュベートした。次いで、細胞を１５０ｇで１０分間遠心分離によりペレット化した。上清を収集し、サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ測定のために、−２０℃で保存した。
【００４０】
ＲＰＭＩ−１６４０中１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ ５０μｌ／ウェルを細胞ペレットに加え、２分間の振盪によって細胞を再懸濁させた。インキュベーションを４時間続けた。１５０ｇで１０分間の遠心分離後に、上清を廃棄した。１２０μｌの４０ｍＭ ＨＣｌ−２−プロパノールを細胞ペレットに加え、３分間振盪して、６３０ｎｍをリファレンスとして各ウェルのＯＤ５７０ｎｍを得た。ＥＬＩＳＡリーダーを用いた。
計算：
各マウスは、３つのアッセイウェルおよび３つの対照ウェルを構成した。各マウスの刺激指数（Stimulation Index（ＳＩ））を、まず、３つの並行ウェルの平均ＯＤを求め、次いで、アッセイウェルの値を対照ウェルで除することによって得た。
【００４１】
１．３ＮＫ細胞活性に対するペプチドの影響［３，４］
マウス脾臓細胞を上記セクション１．１に記載のように、４ｘ１０６/ｍｌに調製した。標的細胞ＹＡＣ−１を対数期に導き、１ｘ１０５／ｍｌに調整した。９６ウェル細胞培養プレートを用い、１００μｌのマウス脾臓細胞および１００μｌの培養培地を、脾臓細胞のみを含有する対照ウェルに加え；１００μｌの標的細胞および１００μｌの培養培地を、標的細胞のみを含有する対照ウェルに加え；１００μｌのマウス脾臓細胞および１００μｌの標的細胞をＮＫ活性アッセイウェルに加えた。上記の３つの並行セットをマウス毎に調製した。
試料を１５０ｇで１０分間遠心分離して、細胞を収集した。上清を廃棄し、１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ ５０μｌ／ウェルを加えた。次いで、反応混合物を２分間振盪し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。１５０ｇで１０分間の遠心分離後に、上清を廃棄した。１２０μｌの４０ｍＭ ＨＣＬ−２−プロパノールを加え、３分間振盪した。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、６３０ｎｍをリファレンスとして各ウェルのＯＤ５７０ｎｍを得た。
【００４２】
計算：
各マウスは、９ウェルを有した：３つが脾臓細胞のみの対照であり、３つが標的細胞のみの対照であり、３つが脾臓および標的細胞の両方を有するアッセイウェルであった。各マウスのＮＫ細胞活性指数は、まず、各組合せの３つの並行ウェルの平均ＯＤを求め、次いで、該平均ＯＤを下記の式：
ＮＫ細胞活性指数＝［１ − （脾臓および標的細胞ウェルの平均ＯＤ − 脾臓細胞のみのウェルの平均ＯＤ） ÷ （標的細胞のみのウェルの平均ＯＤ）］ ｘ １００％
に当てはめることによって得た。
【００４３】
１．４ ＩＬ−２分泌における活性Ｔリンパ球に対するペプチドの影響［５］
対数期のＨＴ−２細胞を１５０ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、再懸濁および遠心分離を用いて、冷Ｈａｎｋ溶液で３回洗浄した。収集したＨＴ−２細胞をＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。再懸濁および遠心分離を用いて、細胞をＲＰＭＩ−１６４０でさらに２回洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０を用いて２ｘ１０５／ｍｌの最終濃度に再懸濁した。
セクション１．２で得られた上清を、ＲＰＭＩ−１６４０を用いて下記のパーセンテージに希釈した：１００％、５０％、２５％、１２．５％、６．２５％および３．１２５％。
ｒＩＬ−２を、ＲＰＭＩ−１６４０を用いて下記の濃度に希釈した：５００ＩＵ／ｍｌ、２５０ＩＵ／ｍｌ、１２５ＩＵ／ｍｌ、６２．５ＩＵ／ｍｌ、３１．２５ＩＵ／ｍｌおよび１５．５１ＩＵ／ｍｌ。
９６ウェル細胞培養プレートに、１つの組合せにつき３つの並行ウェルを準備した。
【００４４】
負の対照：１００μｌ ＲＰＭＩ−１６４０＋１００μｌ ＨＴ−２細胞懸濁
ｒＩＬ−２標準：１００μｌ ｒＩＬ−２溶液＋１００μｌ ＨＴ−２細胞懸濁
アッセイウェル：１００μｌ 希釈した上清＋１００μｌ ＨＴ−２細胞懸濁
プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６８時間インキュベートし、次いで、１５０ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去した。フェノールスルホンフタレイン不含のＲＰＭＩ−１６４０中における０．５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ １００μｌを各ウェルに加えた。３−４分間振盪させて細胞を再懸濁した後、さらに４時間インキュベートを続けた。次いで、試料を１５０ｇにて１５分間遠心分離し、上清を除去した。各ウェルに、４０ｍＭ ＨＣｌ−２−プロパノール １２０μｌを加え、３−４分間混合し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、６３０ｎｍをリファレンスとして５７０ｎｍでＯＤを分析した。
【００４５】
計算：
各希釈の３つの並行ウェルの平均ＯＤを得、半対数方眼紙に濃度に対してプロットした（Ｘ軸に濃度）。５０％ＯＤ飽和での濃度を、試験している上清およびｒＩＬ−２の両方について得た。
試料ＩＬ−２活性 ＝ （５０％最大作用での試料希釈度 ÷ ５０％最大作用でのｒＩＬ−２標準希釈度） ｘ ５０％最大作用でのｒＩＬ−２標準の活性（ＩＵ／ｍｌ）
【００４６】
１．５インターフェロン（ＩＦＮ）の分泌におけるＴリンパ球の活性に対するペプチドの影響［６］
セクション１．２由来の上清をＲＰＭＩ−１６４０培養培地を用いて下記のパーセンテージに希釈した：１００％、５０％、２５％、１２．５％、６．２５％および３．１２５％。
組み換えインターフェロン（ｒＩＦＮ）標準をＲＰＭＩ−１６４０を用いて下記の濃度に希釈した：５００ＩＵ／ｍｌ、２５０ＩＵ／ｍｌ、１２５ＩＵ／ｍｌ、６２．５ＩＵ／ｍｌ、３１．２５ＩＵ／ｍｌおよび１５．５１ＩＵ／ｍｌ。
対数期の標的細胞Ｌ９２９を、セクション１．４に記載のＨＴ−２細胞と同じ処理を用いて、ＲＰＭＩ−１６４０で２ｘ１０５／ｍｌに調整した。ストックＶＳＶもまた、ＲＰＭＩ−１６４０で１００ ＴＣＩＤ５０に調整した。
【００４７】
９６ウェル培養プレートにおいて、下記のように、１組合せあたり３つの並行ウェルを準備した：
負の対照ウェル：１５０μｌ ＲＰＭＩ−１６４０ ＋ １００μｌ Ｌ９２９
正の対照ウェル：１００μｌ ＲＰＭＩ−１６４０ ＋ １００μｌ Ｌ９２９ ＋ ５０μｌ ＶＳＶ
ｒＩＦＮ活性ウェル：１００μｌ ｒＩＦＮ標準 ＋ １００μｌ Ｌ９２９ ＋ ５０μｌ ＶＳＶ
アッセイウェル：１００μｌ 希釈上清 ＋ １００μｌ Ｌ９２９ ＋ ５０μｌ ＶＳＶ
【００４８】
試料を３７℃にて５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。正の対照ウェルを倒立顕微鏡下で周期的に観察して細胞溶解を確認し、次いで、収集、洗浄し、全ウェルのＯＤをセクション１．４に記載のように読み取った。
計算：
５０％最大作用での濃度をセクション１．４と同様に得た。試料のＩＦＮ活性を下記のように計算する：
試料ＩＦＮ活性 ＝ （５０％最大作用での試料希釈度 ÷ ５０％最大作用でのｒＩＦＮ標準希釈度） ｘ ５０％最大作用での標準ｒＩＦＮ活性（ＩＵ／ｍｌ）
【００４９】
２．抗体形成に対するペプチドの影響［７］
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を、頚静脈から血液を採取することによって調製し、ガラスビーズが入った滅菌フラスコ中に置いた。該フラスコを３分間振盪し、次いで、血液をＡｌｓｅｖｅｒ溶液（グルコース２．０５ｇ、ＮａＣｌ０．４ｇ、Ｎａレモネード０．８ｇ、蒸留水で１００ｍｌに調整）と混合し、４℃で保存した。使用直前に、試料を１３０ｇで５分間遠心分離して、ＳＲＢＣを収集した。細胞を正常セーライン中、再懸濁および遠心分離によって２回洗浄した。次いで、細胞ペレットを１８０ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、セーライン中で再懸濁して、最終的に用いられるＳＲＢＣ懸濁２％（ｖ／ｖ）を作成した。
【００５０】
補体は、１０容量の新鮮なテンジクネズミ血清を１容量の遠心分離パックしたＳＲＢＣに加え、次いで、４℃で３０分間穏やかに振盪することによって、調製された。ＳＲＢＣを２００ｇで１０分間の遠心分離によって除去した。１０容量の正常セーラインを加えて、補体溶液を得た。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを無作為に、ペプチド群、ＩＦＮ群、ＩＬ−２群およびセーライン群に１群あたり１０匹で分けた。試験物質をセクション１．１に記載のように投与し、さらに、１２日目に、１マウスあたり０．２ｍｌ ＳＲＢＣを腹膜内注射した。最後の試験物質投与の次の日（１６日目）に、血液を眼角から採取し、血清滲出のために、室温で１時間放置した。２００ｇで１０分間の遠心分離後、正常セーラインで血清を５００倍希釈した。
【００５１】
各マウスの１ｍｌの希釈したマウス血清に、０．５ｍｌ ＳＲＢＣ懸濁を加えた。氷冷した。次いで、１ｍｌの補体溶液を加え、３７℃水浴で１０分間インキュベートした。氷冷によって反応を停止させた。次いで、試料を２００ｇで１０分間遠心分離して、上清を得た。
１ｍｌの該上清に、３ｍｌ Ｄｒａｂｋｉｎ溶液を加え、室温で１０分間放置した。ＯＤ５４０ｎｍを得た。
計算：
リファレンスＯＤ５４０ｎｍを、０．２５ｍｌ ＳＲＢＣ懸濁をＤｒａｂｋｉｎ溶液と４ｍｌに混合することによって得、室温で１０分間放置した後、ＯＤ５４０ｎｍを得た。
試料血清指数 ＝ （試験試料のＯＤ５４０ｎｍ ÷ リファレンスＯＤ５４０ｎｍ） ｘ ５００
【００５２】
３．単核食細胞の食作用機能および免疫器官の重量に対するペプチドの影響［８，９］
最後の試験物質投与の次の日（１６日目）に、マウスに０．１ｍｌ／ｋｇ体重の墨汁（正常セーラインでの５倍希釈物）を尾の静脈から注射した。
墨汁注射の１分および５分後、ヘパリン処理した管を用いて、２０μｌの血液を眼角から得た。血液を２ｍｌ ０．１％ｗ／ｖ Ｎａ２ＣＯ３と混合し、次いで、ＯＤ６８０ｎｍを得た。アウトライン・クリア指数Ｋを下記の式から算出した：
Ｋ＝（ｌｇＡ１−ｌｇＡ２）÷（ｔ２−ｔ１）
キー：
Ａ１：１分目のＯＤ６８０ｎｍ
Ａ２：５分目のＯＤ６８０ｎｍ
ｔ２：５分
ｔ２：１分
【００５３】
最後の試験物質投与の次の日（１６日目）に、肝臓、脾臓および胸腺を分離し、ろ紙でブロットドライし、計量した。食作用指数αを下記のとおり算出した。
α＝（３√Ｋ）（Ｗ÷ＷＬＳ）
キー：
Ｗ：体重
ＷＬＳ：肝臓および脾臓の重量
胸腺指数（％）＝（胸腺重量／体重）ｘ１００％
脾臓指数（％）＝（脾臓重量／体重）ｘ１００％
【００５４】
結果
関与する大量の生データのため、実施した最終結果のみを提供する。また、セーライン負の対照に対する統計学的に有意な差のない群は省略する。
１．Ｔリンパ球形質転換に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２１およびＣＭＳ０２９は、Ｔリンパ球形質転換を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０１０およびＣＭＳ０１５は、下記の表１に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００５５】
【表２】
【００５６】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２およびＣＭＳ００３は、Ｔリンパ球形質転換を刺激することができ、セーライン群、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ０１４およびＣＭＳ０３６は、Ｔリンパ球形質転換を阻害することができ、セーライン群に対する統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表２にデータを詳述する。
【００５７】
【表３】
【００５８】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７およびＣＭＳ０３４は、Ｔリンパ形質転換を刺激することができ、表３に示すように、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００５９】
【表４】
【００６０】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０およびＣＭＳ０１１は、表４に示すように、Ｔリンパ形質転換を刺激でき、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００６１】
【表５】
【００６２】
２．ＮＫ細胞細胞毒活性に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、ＮＫ細胞細胞毒活性を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１６およびＣＭＳ０３０は、表５に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００６３】
【表６】
【００６４】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２６およびＣＭＳ０３５は、ＮＫ細胞細胞毒活性を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０２１は、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ０１２は、ＮＫ細胞細胞毒活性を阻害することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表６にデータを詳述する。
【００６５】
【表７】
【００６６】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３６は、ＮＫ細胞細胞毒活性を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００８およびＣＭＳ００９は、表７に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有するとが見出された。
【００６７】
【表８】
【００６８】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２８およびＣＭＳ０３５は、ＮＫ細胞細胞毒活性を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ００８は、ＮＫ細胞細胞毒活性を阻害することができ、セーライン群に対する統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表８にデータを詳述する。
【００６９】
【表９】
【００７０】
３．ＩＬ−２分泌におけるＴリンパ球の活性に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０およびＣＭＳ０１５は、Ｔリンパ球からのＩＬ−２分泌を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００７およびＣＭＳ０１５は、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００９およびＣＭＳ０１０は、表９に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００７１】
【表１０】
【００７２】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１およびＣＭＳ００３は、ＩＬ−２分泌におけるＴリンパ球の活性を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００３は、表１０に示すように、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００７３】
【表１１】
【００７４】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ０１２およびＣＭＳ０２０は、表１１に示すように、ＩＬ−２分泌においてＴリンパ球を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００７５】
【表１２】
【００７６】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０２２およびＣＭＳ０３４は、ＩＬ−２分泌においてＴリンパ球を促進することがで、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０３４は、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ０１１およびＣＭＳ０２２は、表１２に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００７７】
【表１３】
【００７８】
４．ＩＦＮ分泌におけるＴリンパ球の活性に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１３およびＣＭＳ０１６は、表１３に示すように、インターフェロン（ＩＦＮ）分泌においてＴリンパ球を促進することができ、セーライン群、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００７９】
【表１４】
【００８０】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３およびＣＭＳ０２１は、ＩＦＮ分泌においてＴリンパ球を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０２１は、表１４に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００８１】
【表１５】
【００８２】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００９およびＣＭＳ０１２は、ＩＦＮ分泌においてＴリンパ球を促進でき、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００９は、表１５に示すように、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００８３】
【表１６】
【００８４】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０２２およびＣＭＳ０２８は、ＩＦＮ分泌においてＴリンパ球を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０１０およびＣＭＳ０２２は、表１６に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００８５】
【表１７】
【００８６】
５．抗体形成に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２９、ＭＳ０３３およびＣＭＳ０３５は、抗−ＳＲＢＣ抗体形成を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４およびＣＭＳ０３５は、ＩＦＮ−γ群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２９およびＣＭＳ０３３は、表１７に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００８７】
【表１８】
【００８８】
５０μｇ／ｋｇ／日に、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、抗−ＳＲＢＣ抗体形成を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３およびＣＭＳ０１５は、ＩＦＮ−γ群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ００９は、抗−ＳＲＢＣ抗体形成を阻害することができ、セーライン群に対する統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。表１８にデータを詳述する。
【００８９】
【表１９】
【００９０】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、抗−ＳＲＢＣ抗体形成を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０２０およびＣＭＳ０２１は、ＩＦＮ−γ群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、表１９に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００９１】
【表２０】
【００９２】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２７およびＣＭＳ０３３は、抗−ＳＲＢＣ抗体形成を促進することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０２１およびＣＭＳ０３３は、ＩＦＮ−γ群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４およびＣＭＳ０２７は、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３６は、抗−ＳＲＢＣ抗体形成を阻害することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表２０にデータを詳述する。
【００９３】
【表２１】
【００９４】
６．単核食細胞の食作用活性に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２およびＣＭＳ０２４は、単核食細胞の食作用活性を増強することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０２２は、表２１に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００９５】
【表２２】
【００９６】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４およびＣＭＳ０３０は、単核食細胞の食作用活性を増強することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０１９は、表２２に示すように、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００９７】
【表２３】
【００９８】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００３＊、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９およびＣＭＳ０３５は、単核食細胞の食作用活性を増強することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９およびＣＭＳ０３５は、表２３に示すように、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【００９９】
【表２４】
【０１００】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２７およびＣＭＳ０３６は、単核食細胞の食作用活性を増強することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０２４は、表２４に示すように、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１０１】
【表２５】
【０１０２】
７．免疫器官の重量に対するペプチドの影響
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、胸腺の重量を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０２７およびＣＭＳ０３４は、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３およびＣＭＳ０３５は、表２５に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差 （Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１０３】
【表２６】
【０１０４】
５００μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０１９は、表２６に示すように、脾臓の重量を増加させることができ、セーライン対照群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２７およびＣＭＳ０３６は、脾臓の重量を減少することができ、セーライン対照群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表２６にデータを詳述する。
【０１０５】
【表２７】
【０１０６】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３６は、胸腺の重量を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ０３４は、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２およびＣＭＳ０３６は、表２７に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１０７】
【表２８】
【０１０８】
５０μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０およびＣＭＳ０２９は、脾臓の重量を減少することができ、セーライン対照群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表２８にデータを詳述する。
【０１０９】
【表２９】
【０１１０】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３６は、胸腺の重量を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０２４およびＣＭＳ０３０は、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３６は、表２９に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１１１】
【表３０】
【０１１２】
５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０３０は、脾臓の重量を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ０１５は、脾臓の重量を減少することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表３０にデータを詳述する。
【０１１３】
【表３１】
【０１１４】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３２は、胸腺の重量を増加することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。これらのペプチドの中でも、ＣＭＳ００８およびＣＭＳ０１２は、ＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ０２０およびＣＭＳ０３０は、表３１に示すように、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群の両方に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１１５】
【表３２】
【０１１６】
０．５μｇ／ｋｇ／日にて、ＣＭＳ０２０は、脾臓の重量を増加することができ、セーライン群、ＩＦＮ−γ群およびＩＬ−２群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。ＣＭＳ００１は、脾臓の重量を減少することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。下記表３２にデータを詳述する。
【０１１７】
【表３３】
【０１１８】
まとめると、発明者らは、ペプチドＣＭＳ００１、ＣＭＳ００２、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００７、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ００９、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１２、ＣＭＳ０１３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１５、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２０、ＣＭＳ０２１、ＣＭＳ０２２、ＣＭＳ０２３、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０２６、ＣＭＳ０２７、ＣＭＳ０２８、ＣＭＳ０２９、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３３、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５およびＣＭＳ０３６は、試験した動物モデルにおいて、イン・ビボで生物学的活性を有することを見出した。
【０１１９】
ＩＩ．ペプチドのイン・ビボ抗ウイルス効果
これらのペプチドがウイルス感染に対して可能性のある治療効果を有するか否かを見出すために、発明者らは、該研究において、動物モデル アヒルＢ型肝炎感染を用いて、病気の動物に対する上記ペプチドのイン・ビボでの影響を試験した。
重慶（Chongqing）アヒルＢ型肝炎モデルを用意し、４週間、腹膜内注射（５０μｇ／ｋｇ／日、１日１回）によってペプチド処理した。ＤＨＢＶ ＤＮＡの血清レベルを血清ドット−ブロットハイブリダイゼーションによって分析した。ラミブジン（lamivudine）および正常セーライン処理を各々、正および負の対照として用いた。ペプチドＣＭＳ００１は、該処理の４週目に、ＤＨＢＶ ＤＮＡの血清レベルを減少させることができ、セーライン対照群に対する統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）を有することが見出された。結果として、ＣＭＳ００１は適当な投与量レベルで、一部として、または単独で、ウイルス性肝炎感染管理に用いることができる。
【０１２０】
材料および方法
１．ペプチドは、American Peptide Company, Inc., USAでＬ−アミノ酸から注文製造した。
２．動物モデル［１］
１日齢の重慶アヒルに、アヒルＢ型肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）ＤＮＡ陽性のストック血清（５×１０７コピー／ｍｌ）０．１ｍｌを腹膜内注射によって接種した。１週間後、血液試料を外頚静脈から採取し、感染を、ジゴキシンで標識したＤＨＢＶ ＤＮＡプローブを用いるドット−ブロットハイブリダイゼーションによって確認した［２］。アヒルは、研究に入るために、２週齢まで飼育した。
【０１２１】
３．グループ分けおよび処理
ＤＨＢＶ感染アヒルを下記の群に無作為化した：
ａ）負の対照群（ｎ＝９）：アヒル１匹当たり１ｍｌの正常セーラインを１日に１回、腹膜内注射した。
ｂ）ラミブジン群（ｎ＝８）：正の対照群とする。ラミブジン［４］５０ｍｇ／ｋｇ／日を１日に１回、経口投与した。
ｃ）ペプチド群（ｎ＝９）：５０μｇ／ｋｇ／日のペプチド（正常セーラインを用いて、最終容量を０．５ないし１ｍｌに調整）を１日に１回、腹膜内注射した。
処理を４週間続け、処理の終了後さらに１週間、観察を続けた。処理を開始したとき、０、７、１４、２１、２８および３５日目に、１ｍｌの血液試料をアヒルの外頚静脈から採取した。血液試料の血清をすぐに単離し［３］、分析まで−２０℃で保存した。
【０１２２】
４．血清ＤＨＢＶ ＤＮＡレベル測定
キット製造元（Amersham Pharmacia Biotech Co.）の標識キットプロトコールにしたがって、ＤＨＢＶ ＤＮＡプローブを蛍光標識した。４０μｌのアヒル血清をニトロセルロース膜上にドット−ブロットし（１試料あたり２連のドット）、定量のために、蛍光標識したＤＨＢＶ ＤＮＡプローブでハイブリダイズした［２］。ハイブリダイゼーション完了後、ブロットをＣＤＰ−Ｓｔａｒフルオロメトリー試薬ＲＰＮ３６９０中で発現させ、Ｖｕｅｇｏ Ｓｃａｎ（Brisa-620st）スキャナーでスキャンした。ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ ＴｏｔａｌＬａｂ ｖ１．１１．Ｉｎｋソフトウェアをブロットの定量分析に用いた。統計分析は、ＳＰＳＳソフトウェアを用いて、対応のあるｔ−検定によって行った。
【０１２３】
結果
【表３４】
【０１２４】
負（正常セーライン）および正（ラミブジン）の対照群は、肝炎動物モデルの確立の成功を示した。５０μｇ／ｋｇ／日にて、ペプチドＣＭＳ００１は、４週間の処理後の血清ＤＨＢＶ ＤＮＡ力価を減少させることができ、同じ動物の処理前の値に対する統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）を有することが見出された。処理終了時に、血清ＤＨＢＶ ＤＮＡ力価は、処理前と統計学的差のない値にリバウンドし、それは、ペプチドＣＭＳ００１の影響が可逆性であり、および／またはウイルス撲滅のためにより長い処理期間を必要としうることを示した。
【０１２５】
考察
アヒル肝炎動物モデル［１］は、ヒトＢ型肝炎病因研究のため、およびＢ型肝炎治療剤のスクリーニングのための確立された実験モデルである。該研究において、ＣＭＳ００１は、４週間の処理後に、ＤＨＢＶ ＤＮＡの血清力価を減少させることができることが見出され、それは、ペプチドＣＭＳ００１が適当な投与量レベルおよび適当な応用スキームで、単独または他の物質と組み合わせて、ヒトＢ型肝炎管理のための薬剤として有用であることを示した。
【０１２６】
本研究において、腹膜内注射による投与が試験されたが、これは、他の別の経路を介して投与した場合の該ペプチドの可能性のある効果を除外するものではない。該ペプチドは、また、リポソーム、徐放性保護などの送達促進デバイスを用いて、または用いない、静脈内注射、筋内注射、皮下注射および皮下埋め込みによって投与してもよい。該ペプチドはまた、修飾を用いない通常の形態において、または徐放性形態において、または胃腸保護を用いてもしくは用いないで、錠剤、カプセル、懸濁、溶液などの経口投与のいずれかの形態で投与してもよい。該ペプチドは、さらに、経皮促進デバイスを用いるまたは用いない軟膏、クリーム、ゲルなどの局所塗布のいずれかの形態において、または粉末、溶液の吸入薬として、またはリポソーム保護形態として適用されてもよい。該ペプチドは、また、その遺伝子配列に解読され、単独または他のペプチド配列と組み合わせて発現系中にクローン化して、得られるペプチド分子を作成して、該得られるペプチドを精製して、または精製しないで、本明細書中に記載されるような該ペプチドの活性を利用してもよい。
【０１２７】
【表３５】
【０１２８】
引用文献
１．Chen Yaxi, Guo shuhua, Zhang Dingfengら、「重慶アヒルＢ型肝炎モデルの基礎および応用（Foundation and application of Chongqing duck hepatitis B model）」、Chinese Journal of Hepatology. 1993; 1(2): 89-91
２．Chen Yaxi, Guo shuhua, Chen Xuehua、「ジゴキシンで標識したＤＨＢＶ ＤＮＡプローブの調製および応用（Preparation and application of DHBV DNA probe labeled with digoxin）」、Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 1994; 19(4): 295-297
３．Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhuaら、「アヒルＢ型肝炎ウイルスに対する体液性免疫の血清学的パラメーターの体系的基礎および応用（Systemic foundation and application of serological parameters of humoral immunity to duck hepatitis B virus）」、Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(1): 13-15
４．Chen Yaxi, Guo shuhua, Qi Zhenyuanら、「ファムシクロビルと組み合わせた、アヒルＢ型肝炎ウイルスに対するラミブジンの実験的研究（An experimental study of lamivudine against duck hepatitis B virus in combination with famciclovir）」、Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(4): 209-211
【０１２９】
ＩＩＩ．腎炎に対するペプチドの影響
これらのペプチドが腎炎に対する可能性のある治療効果を有するか否かを見出すために、発明者らは、動物モデル ラットＭａｓｕｇｉ腎炎を該研究に用いて、病気の動物に対する上記ペプチドのイン・ビボでの影響を試験した［３，４］。
本研究の目的は、慢性糸球体腎炎に対するペプチドのイン・ビボでの治療効果を調べることにある。Ｍａｓｕｇｉ腎炎ラットモデルは、ウサギ抗−ラット−腎−皮質ＩｇＧを健康なＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに注射した後、直ちに、１日に１回、３週間、５０μｇ／ｋｇ／日でペプチドの腹膜内注射で処理することによって構築された。ヒドロコルチゾンを正の対照として用いた。ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６で処理したラットの蛋白尿、血清クレアチニンレベルおよび脾臓指数は、対照群と比べて低下しており、統計学的差を有した（ｐ＜０．０５）。腎臓の死後顕微鏡試験は、これらのペプチドの治療効果がヒドロコルチゾン処理に類似していたことを示した。結果として、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６は慢性腎炎管理の手段として用いられうる。
【０１３０】
材料
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット、雄、体重１２０±２０ｇは、広州中医薬大学、実験動物センター（Center of Experimental Animal, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine）および第一軍医大学（First Military Medical University）から得た。体重３ｋｇのチンチラウサギは、広州中医薬大学、実験動物センターから得た。
Ｌ−アミノ酸由来のペプチドは、American Peptide Company, Inc, USAで注文製造し、滅菌正常セーライン中１０μｇ／ｍｌに希釈した。ヒドロコルチゾンは、Yangzhou Pharmaceutical Factory, Chinaから得た。
血清クレアチニンレベル測定キットは、Shanghai Rongsheng Biological Technique Company, PR Chinaから得た。
【０１３１】
方法
１．ウサギ抗−ラット−腎−皮質抗血清の調製［１］：２０匹の健康なＳＤラットを３％ペントバルビタールナトリウム４０ｍｇ／ｋｇの静脈内注射で麻酔した。腹部大動脈を露出し、血液が清浄するまで、腎臓を正常セーラインで潅流した。腎皮質を単離し、５容量の０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．１中でホモジナイズし、１４０−ゲージのステンレススチールメッシュでろ過した。ろ液を収集し、ＧＩＢＣＯ−ＲＲＥ完全または不完全フロイントアジュバンドのいずれかと１：１で混合し、乳化して、免疫化溶液を得た。
【０１３２】
１０匹の健康なウサギを、最初は完全フロイントアジュバンドを用いた該免疫化溶液、ついで、不完全フロイントアジュバンドを用いた該免疫化溶液で免疫した。抗原を６つの無作為な箇所から、１箇所につき０．１ｍｌを１０日に１回、皮下注射した。６週目以後、血液を耳静脈から採取し、抗体価を二重拡散法によって決定した［２］。免疫開始後８週目に、ウサギを３％ペントバルビタールナトリウム２０ｍｇ／ｋｇの静脈内注射で麻酔し、血液を頚動脈から採取した。次いで、抗−血清を滲出させ、単離した。
【０１３３】
全血を１５匹の健康なＳＤラットから採取した。赤血球を単離し、正常セーラインで３回洗浄した。清浄した赤血球を２５０ｍｌのウサギ抗血清と混合し、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、血液細胞を遠心分離によって除去し、上清をさらに５６℃で３０分間不活化した。遠心分離によっていずれかの沈殿物を除去後、粗ＩｇＧを単離し、３回の（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿（５０％、３３％および３３％）によって上清から部分的に精製した［５］。粗ＩｇＧを１２５ｍｌの２回蒸留した水中に再溶解し、硫酸アンモニウムで透析により清浄した。抗−ラット−腎−皮質抗体価を二重拡法によって決定した［２］。
【０１３４】
２．ラット糸球体腎炎の誘導［５］：誘導の５日前に、０．２５ｍｌのプライミング溶液（完全フロイントアジュバンドを用いた４ｍｇの非特異的ウサギＩｇＧを含有している）を健康なＳＤラットに腹膜内注射して、ラットをプライムした。正常セーラインを与えられた正常な健康な対照群を除き、全群はその後に、方法１において記載したように調製された１ｍｌのウサギ抗−ラット−腎−皮質ＩｇＧの腹膜内注射によって誘導された。
【０１３５】
３．グループ分けおよび投与：雄ＳＤラットを正常な健康対照（正常）、腎炎プラシーボ処理対照（プラシーボ）、腎炎ペプチド処理および腎炎ヒドロコルチゾン処理対照（ヒドロコルチゾン）の群に、１群につき１２匹で無作為化した。処理は誘導日に開始した。ペプチド５０μｇ／ｋｇ／日、ヒドロコルチゾン３．３ｍｇ／ｋｇ／日、およびプラシーボとして正常セーラインを用い、全て、１日に１回腹膜内投与し、３週間続けた。
【０１３６】
４．モニターされるパラメーター［４］：
（ａ）尿蛋白レベル：各ラットを個々に、１つのケージ中で維持した。十分な飲料水を供給した。１週間に１回、１回につき２４時間、尿を収集した。尿の蛋白質含量は、クーマシーブルー法によって測定した。
（ｂ）血清クレアチニンレベル：３週間の処理後に、血液を採取し、血清クレアチニンレベルを測定した。クレアチニンキットは、Shanghai Rongsheng Biological Technique Companyから供給された。
（ｃ）脾臓重量指数：脾臓重量指数は、下記の式によって決定された：
脾臓重量指数＝平均脾臓重量÷平均体重
（ｄ）腎臓の病理学的顕微鏡試験：病理学的試験のために、６個の最大重量の腎臓を各群から選択した。
【０１３７】
統計分析
群間の比較のためにｔ−検定を用い、カットオフをｐ＜０．０５に定める。全群に関し、最も低い尿蛋白レベルを有する２匹のラットを統計分析から排除した。
【０１３８】
結果
１．尿蛋白レベルに対するペプチド処理の影響
【表３６】
【０１３９】
ペプチドＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６は、１日に１回の５０μｇ／ｋｇ／日にて、Ｍａｓｕｇｉ腎炎ラットモデルの尿蛋白レベルを低下させることができ、プラシーボ処理対照群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された（ｐ＜０．０５）。また、群ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０３０、ＣＭＳ０３６およびヒドロコルチゾンは、正常群よりもゆっくりと成長することが注目された。ヒドロコルチゾン群の成長速度は、第１週後に、重篤な不耐性を回避するために、該処理投与量が二等分されなくてはならないような程度まで減少した。
【０１４０】
２．血清クレアチニンレベルに対するペプチド処理の影響
【表３７】
【０１４１】
プラシーボ処理を受けているＭａｓｕｇｉ腎炎ラットの血清クレアチニンレベルは、正常対照群よりも非常に高く、腎炎ラットの腎機能が異常であることを示した。ペプチドＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６は、１日に１回の５０μｇ／ｋｇ／日にて、血清クレアチニンのレベルを低下させることができ、プラシーボ処理腎炎ラットに対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【０１４２】
３．脾臓指数に対するペプチドの影響
【表３８】
【０１４３】
全ての誘導したラットの脾臓は、正常ラットと比較して大きく、腎炎の誘導が免疫応答に関連することを示した。ペプチドＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６は、１日に１回の５０μｇ／ｋｇ／日にて、脾臓指数を減少させることができ、プラシーボ処理を受けている腎炎ラットの群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された（ｐ＜０．０５）。これは、該ペプチドが免疫抑制メカニズムを介して腎炎に対するその矯正的な影響を働かせたかもしれないことを示唆した。
【０１４４】
４．腎病理学的顕微鏡試験に対するペプチドの影響
正常ラットと比較すると、プラシーボ処理を受けている腎炎ラット（プラシーボ群）は、糸球体カプセルにおける繊維組織形成、糸球体上皮の過形成、半月の形成、糸球体キャピラリーの膨張および密集、近位曲尿細管上皮の浮腫、および遠位曲尿細管および集合管における円柱の形成の徴候を示した。これらの病理学的変化は、腎炎誘導の成功を確証した。群ＣＭＳ０１４において、たった１匹のラットだけが糸球体カプセルにおける繊維組織形成および糸球体上皮の過形成の徴候を示したことが観察された。同じラットの他のパラメーターおよび同じ群の他のラットは、本質的に、正常ラットと同じ腎臓組織学を有した。群ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６において、全ラットの全ての病理学的パラメーターは正常であった。
【０１４５】
結論
結果として、５０μｇ／ｋｇ／日にて１日１回、腹膜内投与されたペプチドＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６は、実験的Ｍａｓｕｇｉ腎炎ラットモデルに対して治療効果を有することができた。処理されたラットの蛋白尿、クレアチニン排出および腎組織学は、これらのペプチドによって治され、プラシーボ処理を受けている対照群に対する統計学的に有意な差を有した。これらのペプチドは、脾臓重量指数に対するその影響によって示されるように、免疫学的メカニズムを介して作用しうるが、他のメカニズムを介するその作用の可能性を排除することはない。
【０１４６】
考察
ペプチドＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１８、ＣＭＳ０３０およびＣＭＳ０３６は、一部として、または単独で、ヒトにおける腎炎管理において有用でありうる。例えば、該ペプチドは、蛋白尿を治すために、または腎炎患者の排泄機能を復活させるために用いてもよい。該ペプチドは、また、腎炎患者におけるさらなる腎臓機能欠陥を予防するために用いてもよい。該ペプチドは、単独で、または２以上のペプチドを組み合わせて、または他の医薬もしくは食物サプリメントと組み合わせて、腎炎管理の全過程として用いてもよい。
【０１４７】
【表３９】
【０１４８】
引用文献
１．SDA(State Drug Administration, P.R.China)、「新薬の前臨床リサーチのガイドライン（The guideline of preclinical researches of new drugs）」、1994, 第１版, Page 96
２．Xu Shuyunら、「薬理学的実験の方法（The methodology of pharmacological experiment）」、the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, 第２版, 1991:1071
３．Chen Qiら、「漢方の薬理学的リサーチの方法（The methodology of pharmacological researches of traditional Chinese medicine）」、the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, 第１版、1993:390
４．Du Guanhua、「薬理学的実験のためのガイドライン−新薬の発見と薬理学的評価（The guideline for pharmacological experiment ---the discovery and pharmacological evaluation of new drugs）」、Science Publishing Company, Beijing, 第１版, 2001:598
５．Wang Shuxian、「腎臓病学（Nephrology）」、the People’s Sanitation Publishing Company, Beijing, 第１１版, 1987:244
【０１４９】
ＩＶ．癌に対するＣＭＳペプチドの影響
これらのペプチドが癌を治療できるか否かを見出すために、発明者らは、種々の標準的動物癌モデルを該研究に用いて、病気の動物に対する上記ペプチドの生物学影響を試験した。
【０１５０】
材料
１．実験動物
ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、およびＤＢＡ／２マウス、体重１８−２２ｇ（China Medical Science Institute, PR China）。
２．細胞系統
マウス肉腫Ｓ１８０細胞、Ｂ１６細胞およびＬ１２１０細胞（Cancer Research Department, China Medical Science Institute）。
ＹＡＣ−１細胞（Yao Zhi教授、天津医科大学（Tianjin Medical University）からの贈与物）。
【０１５１】
３．主要な薬物および試薬
該研究に使用されたペプチドは、American Peptide Company, Inc., USAによって注文製造された。
胎仔ウシ血清、ＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地（Gibco, USA）。
ＭＴＴ、ＣｏｎＡ（Sigma, USA）。
組み換えマウスインターフェロン−γ（ｒｍＩＦＮ−γ）（Beijing Biotech Inc., PR China）。
組み換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２）（Shanghai Huaxin Biotech Inc., PR China）。
リンパ球分離溶液（Research Institute of Hematologic Disease, National Institute of Medical Science, PR China）。
シクロホスファミド（The 12th pharmaceutical factory of Shanghai, PR China）。
【０１５２】
方法
１．試験物質の投与
１日１回の腹膜内注射。シクロホスファミド群をのぞき、全群は、癌細胞を移植する５日前に処理を開始した。シクロホスファミド群は、癌細胞を移植した次の日に処理した。試験物質を用いる全群の処理は、別記しないかぎり、３０日間または動物が死亡するまで続けた。
【０１５３】
２．ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける移植したＳ１８０肉腫細胞の成長速度に対するペプチドの影響、および宿主の免疫学的機能に対するその影響
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ペプチド群、シクロホスファミド群、ｒｍＩＦＮ−γ群、ｒｈＩＬ−２群、およびセーライン群に、１群につき２０匹で無作為化した。
ストックＳ１８０に肉腫細胞を１０％胎仔ウシ血清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、次いで、Ｈａｎｋ溶液で３−４回、室温で洗浄した。Ｈａｎｋ溶液を用いて、細胞濃度を１リットルにつき１−２ｘ１０９に調整した。０．２ｍｌの細胞懸濁をいくつかのＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０−１２日間、腋窩を介して移植した。マウスを頚椎脱臼によって殺した。活発に成長している非崩壊性の腫瘍塊が得られ、滅菌セーラインで清浄した。該組織をセーライン中に分散させて、４ｍｌセーラインに対して組織１ｇの割合で均一な細胞懸濁を得た。肉腫を有するマウスモデルは、０．２ｍｌの細胞懸濁を腋窩を介して注射して用意した［１］。試験物質の投与処理は、方法１のセクションに記載したとおりに開始した。
【０１５４】
２．１
Ｓ１８０肉腫を有するマウス［２，３］における単核食細胞の食作用機能に対するペプチドの影響を、最後の試験物質投与の２日後に、０．１ｍｌ／１０ｇ体重の墨汁（正常セーラインを用いる１：５希釈）を尾部静脈からマウスに注射することによって分析した。注射後１分および５分で、ヘパリン処理した管系を用いて、２０μｌの血液を眼角から得た。該血液を２ｍｌの０．１％ｗ／ｖ Ｎａ２ＣＯ３と混合し、次いで、ＯＤ６８０ｎｍを得た。アウトライン・クリア指数Ｋを下記の式から算出した：
Ｋ＝（ｌｇＡ１−ｌｇＡ２）÷（ｔ２−ｔ１）
キー：
Ａ１：１分目のＯＤ６８０ｎｍ
Ａ２：５分目のＯＤ６８０ｎｍ
ｔ２：５分
ｔ２：１分
【０１５５】
食作用指数研究の後、マウスを頚椎脱臼によって殺した。肝臓、脾臓および癌組織を切り出し、ブロットドライし、計量した。
食作用指数αは下記のように算出された：
α＝（３√Ｋ）ｘ（Ｗ÷ＷＬＳ）
キー：
Ｗ：体重
ＷＬＳ：肝臓および脾臓の重量
【０１５６】
２．２下記の式にしたがって、腫瘍成長阻害指数を算出した：
腫瘍成長阻害指数＝（対照群の平均腫瘍重量−処理群の平均腫瘍重量）÷対照群の平均腫瘍重量
【０１５７】
３．移植した腹水型肝臓癌Ｈ２２を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの生存に対するペプチドの影響
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ペプチド群、シクロホスファミド群、ｒｍＩＦＮ−γ群、ｒｈＩＬ−２群およびセーライン群に、１群につき２０匹で無作為にグループ分けされた。
ストックＨ２２細胞は、１０％胎仔ウシ血清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、次いで、Ｈａｎｋ溶液を用いて３−４回、室温で洗浄した。Ｈａｎｋ溶液を用いて、細胞濃度を１リットルあたり１−２ｘ１０９に調整した。０．２ｍｌの細胞懸濁を数匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に６−８日間移植した［１］。該マウスを頚椎脱臼により殺した。該マウスの腹水を無菌的に採取し、Ｈａｎｋ溶液を用いて、細胞濃度を１ｍｌあたり１ｘ１０６に調整した。０．２ｍｌの細胞懸濁を健康なマウスの腹腔に移植して、腹水型肝臓癌のＨ２２担持マウスを作成した。試験物質の投与は、方法１のセクションに記載したとおりに開始した。マウスの生存データを記録した。動物が実験期間よりも長く生存した場合、生存日数を実験期間として記録した。平均生存日数は、ＳＰＳＳソフトウェアのＳｕｒｖｉｖａｌオプションにおけるカプラン−マイヤー（Kaplan-meier）法によって得られた。生存指数は、下記の式にしたがって算出された：
生存指数＝（処理群の平均生存日数−対照群の平均生存日数）÷対照群の平均生存日数ｘ１００％
【０１５８】
４．移植した腹水型肝臓癌Ｈ２２を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの細胞性免疫に対するペプチドの影響
４．１脾臓細胞懸濁の調製［１，４］
健康なＢＡＬＢ／ｃマウスを、ペプチド群、ｒｍＩＦＮ−γ群、ｒｈＩＬ−２群、およびセーライン群に１群あたり１５匹で無作為化し、方法３のセクションに記載のとおりに、Ｈ２２担持マウスモデルに調製した。癌細胞の移植後、試験物質を１５日間投与し、マウスを頚脱臼によって殺した。脾臓を無菌的に単離し、注射針を用いて手動で冷Ｄ−Ｈａｎｋ溶液中に分散させた。分散させた細胞懸濁をさらに、１００−ゲージ１５０μｍ直径のステンレススチールシーブによって篩い分けした。２００ｇで１０分間の遠心分離後、上清を廃棄した。細胞ペレットを１０容量のＴｒｉｓ−ＮＨ４Ｃｌバッファー中で再懸濁し、次いで、室温で１０分間静置した。懸濁した細胞を１５０ｇで１０分間の遠心分離によって収集した。細胞を冷Ｄ−Ｈａｎｋ溶液を用いて２−４回、再懸濁および上記条件の遠心分離による収集によって洗浄した。次いで、洗浄した細胞を、１０％胎仔ウシ血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培養培地によって、所望の細胞密度に希釈した。
【０１５９】
４．２腹水型肝臓癌Ｈ２２を有するマウスにおけるＴリンパ球形質転換に対するペプチドの影響
密度１ｘ１０６／ｍｌの脾臓細胞を９６ウェル細胞培養プレート上、１００μｌ／ウェルにて、１マウスあたりアッセイ試料および対照試料毎に３つの並行ウェルに置いた。アッセイウェルに、ＲＰＭＩ−１６４０中における１００μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ １００μｌ／ウェルを加え、１００μｌ／ウェルの無添加ＲＰＭＩ−１６４０を対照に用いた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて、６６時間インキュベートした。次いで、細胞を１５０ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化した。上清を収集し、サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ測定のために−２０℃で保存した。
ＲＰＭＩ−１６４０中における１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ ５０μｌ／ウェルを細胞ペレットに加え、２分間の振盪によって細胞を再懸濁した。４時間インキュベーションを続けた。１５０ｇで１０分間の遠心分離後に、上清を廃棄した。４０ｍＭ ＨＣｌ−２−プロパノール１２０μｌを細胞ペレットに加え、３分間振盪させた。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、６３０ｎｍをリファレンスとして各ウェルのＯＤ５７０ｎｍを得た。
各マウスは、３つのアッセイウェルおよび３つの対照ウェルを形成した。各マウスの刺激指数（ＳＩ）は、まず、３つの並行ウェルの平均ＯＤを求め、次いで、アッセイウェルの値を対照ウェルで除することによって得られた。
【０１６０】
４．３腹水型肝臓癌Ｈ２２［５，６］を有するマウスにおけるＮＫ細胞活性に対するペプチドの影響
マウス脾臓細胞は、上記セクション４．１に記載のように、４ｘ１０６／ｍｌに調製した。標的細胞ＹＡＣ−１を対数期に導き、１ｘ１０５／ｍｌに調整した。９６ウェル細胞培養プレートを用いて、１００μｌのマウス脾臓細胞および１００μｌの培養培地を、脾臓細胞のみを含有する対照ウェルに加え；１００μｌの標的細胞および１００μｌの培養培地を標的細胞のみを含有する対照ウェルに加え；１００μｌのマウス脾臓細胞および１００μｌの標的細胞をＮＫ活性アッセイウェルに加えた。上記の３つの並行セットをマウス毎に調製した。その後、９６ウェル細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２にて４時間インキュベートした。
試料を１５０ｇで１０分間遠心分離して、細胞を収集した。上清を廃棄し、１ｍｇ／ｍのＭＴＴ ｌ５０μｌ／ウェルを加えた。次いで、反応混合物を２分間振盪し、３７℃、５％ＣＯ２にて４時間インキュベートした。１５０ｇで１０分間の遠心分離後、上清を廃棄した。１２０μｌの４０ｍＭ ＨＣｌ−２−プロパノールを加え、３分間振盪させた。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、６３０ｎｍをリファレンスとして各ウェルのＯＤ５７０ｎｍを得た。
各マウスは９ウェルを有した：脾臓細胞のみの対照が３つ、標的細胞のみの対照が３つ、脾臓および標的細胞の両方を含有するアッセイウェルが３つ。各マウスのＮＫ細胞活性指数は、まず、各組合せの３つの並行ウェルの平均ＯＤを求め、次いで、該平均ＯＤを下記の式に当てはめることによって得られた：
ＮＫ細胞活性指数＝［１−（脾臓および標的細胞ウェルの平均ＯＤ−脾臓細胞のみのウェルの平均ＯＤ）÷（標的細胞のみのウェルの平均ＯＤ）］ｘ１００％
【０１６１】
５．移植したＬ１２１０白血病を有するＤＢＡ／２マウスの生存に対するペプチドの影響
ＤＢＡ／２マウス、６−８週齢をペプチド群、シクロホスファミド群、ｒｍＩＦＮ−γ群、ｒｈＩＬ−２群およびセーライン群に、１群あたり２０匹で無作為化した。
ストックＬ１２１０細胞を、１０％胎仔ウシ血清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、次いで、Ｈａｎｋ溶液で３−４回洗浄し、１リットルあたり１ｘ１０５細胞に調整した。０．１ｍｌの細胞懸濁を数匹の健康なＤＢＡマウスの腹腔中に、６−８日間移植した。次いで、該マウスを頚椎脱臼によって殺し、その腹水を無菌的に収集した。収集した腹水の細胞濃度は、Ｈａｎｋ溶液で１ｍｌあたり１ｘ１０５に調整した。０．１ｍｌの細胞懸濁を各試験動物に移植し、動物の生存データを記録した。方法１のセクションに記載のとおりに、試験動物において処理を開始した。平均生存日数は、ＳＰＳＳソフトウェアのＳｕｒｖｉｖａｌオプションにおけるカプラン−マイヤー法によって得られた。動物が実験期間よりも長く生存した場合、生存日数は実験期間として記入した。生存指数は下記の式にしたがって算出された：
生存指数＝（処理群の平均生存日数−対照群の平均生存日数）÷対照群の平均生存日数
【０１６２】
６．移植したＢ１６黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの体液性免疫に対するペプチドの影響および接種した黒色腫細胞の転移ポテンシャルに対するその影響
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、６−８週齢、体重１８−２２ｇを、ペプチド群、シクロホスファミド群、ｒｍＩＦＮ−γ群、ｒｈＩＬ−２群およびセーライン群に、１群あたり２０匹で無作為化した。
ストックＢ１６マウス黒色腫細胞を、１０％胎仔ウシ血清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、次いで、Ｈａｎｋ溶液で３−４回洗浄した。細胞濃度をＨａｎｋ溶液で１ｍｌあたり１ｘ１０５に調整し、０．１ｍｌの細胞懸濁を尾静脈を介して試験マウス中へ注射して、Ｂ１６黒色腫担持動物モデルを作成した［７，８］。試験物質での処理は、方法１のセクションに記載のとおりに開始した。
【０１６３】
６．１移植したＢ１６黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの体液性免疫に対するペプチドの影響［９］
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を頚静脈から血液を採取することによって調製し、ガラスビーズを有する滅菌フラスコ中に入れた。該フラスコを３分間振盪させ、次いで、該血液とＡｌｓｅｖｅｒ溶液（グルコース２．０５ｇ、ＮａＣｌ ０．４ｇ、Ｎａレモネード ０．８ｇ、蒸留水で１００ｍｌに調整）を混合し、４℃で保存した。使用直前に、試料を１３０ｇで５分間遠心分離して、ＳＲＢＣを収集した。正常セーライン中での再懸濁および遠心分離によって、細胞を２回洗浄した。次いで、細胞ペレットを１８０ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、セーライン中に再懸濁して、最終的なＳＲＢＣ懸濁、２％（ｖ／ｖ）を作成した。
【０１６４】
補体を、新鮮なテンジクネズミ血清１０容量を１容量の遠心分離パックしたＳＲＢＣ中に加えることによって調製し、４℃で３０分間、穏やかに振盪させた。ＳＲＢＣを２００ｇで１０分間の遠心分離によって除去した。１０容量の正常セーラインを加えて、補体溶液を得た。
試験動物において、試験物質処理２７日目に、０．２ｍｌのＳＲＢＣ細胞懸濁を各動物に注射して抗体を産生させた。最後の試験物質投与の次の日に、血液を眼角から採取し、血清滲出のために室温で１時間放置した。２００ｇで１０分間の遠心分離後、収集した血清を正常セーラインで５００倍に希釈した。
【０１６５】
各マウスの１ｍｌの希釈したマウス血清に、０．５ｍｌのＳＲＢＣ懸濁を加えた。氷冷した。次いで、１ｍｌの補体溶液を加え、３７℃水浴で１０分間インキュベートした。氷冷によって反応を停止させた。次いで、試料を２００ｇで１０分間遠心分離して、上清を得た。
該上清１ｍｌに、３ｍｌのＤｒａｂｋｉｎ溶液を加え、室温で１０分間放置した。ＯＤ５４０ｎｍを得た。
リファレンスＯＤ５４０ｎｍを、０．２５ｍｌのＳＲＢＣ懸濁とＤｒａｂｋｉｎ溶液とを４ｍｌに混合し、室温で１０分間放置後にＯＤ５４０ｎｍを測定することによって得た。
溶血指数＝（試験試料のＯＤ５４０ｎｍ÷リファレンスＯＤ５４０ｎｍ）ｘ５００
【０１６６】
６．２ 体液性免疫研究後に、マウスを頚椎脱臼によって殺した。動物の死後試験を行った。病理学的変化を記録し、黒色腫肺転移病巣の数を数えた。
【０１６７】
結果
１．移植したＳ１８０肉腫を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける細胞性食作用に対するペプチドの影響（方法２．１）
【表４０】
【０１６８】
５０μｇ／ｋｇ／日および５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ００１、および５μｇ／ｋｇ／日および０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０３４は、食作用指数を増加させることができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された。
【０１６９】
２．ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける移植したＳ１８０肉腫の成長速度に対するペプチドの影響（方法２．２）
【表４１】
【０１７０】
５００μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１０、０．５μｇ／日のＣＭＳ０３４、および５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０３５は、移植したＳ１８０肉腫の成長を減少させることができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１７１】
３．移植した腹水型肝臓癌Ｈ２２を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの生存に対するペプチドの影響（方法３）
【表４２】
【０１７２】
５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ００８、５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１１、５０μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０２４、０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０２４および０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０３２は、移植したＨ２２腹水型肝臓癌を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの生存を延長することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。また、群ＣＭＳ０２４ ０．５μｇ／ｋｇ／日において、３０％（ｎ＝６）以上のマウスが９０日より長く生存することができた（実験が終わった後２ヶ月）ことが観察された。マウスの死後試験は、腫瘍確立の徴候を示さなかった。したがって、０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０２４は、その確立を妨害するか、またはその確立した癌の完全な治癒を誘導することにより、移植したＨ２２の成長を妨害しうる。
【０１７３】
４．移植した腹水型肝臓癌Ｈ２２を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴリンパ球形質転換に対するペプチドの影響（方法４．２）
【表４３】
【０１７４】
５００μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１０、０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１９、０．５μｇ／ｋｇ／日および５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０２４、および０．５μｇ／ｋｇ／日および５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０３５は、Ｔリンパ球の刺激指数を増加させることができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差を有することが見出された（Ｐ＜０．０５）。
【０１７５】
５．移植した腹水型肝臓癌Ｈ２２を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮＫ細胞活性に対するペプチドの影響（方法４．３）
【表４４】
【０１７６】
５００μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ００３、０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１４、０．５μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日および５０μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０２４、および５０μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０３４は、試験動物モデルにおいてＮＫ細胞細胞毒活性を増加させることができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１７７】
６．移植したＬ１２１０白血病を有するＤＢＡ／２マウスに対するペプチドの影響（方法５）
【表４５】
【０１７８】
０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１９、および０．５μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０３５は、移植したＬ１２１０白血病を有するＤＢＡ／２マウスの生存を延長することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１７９】
７．移植したＢ１６黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの体液性免疫に対するペプチドの影響（方法６．１）
【表４６】
【０１８０】
ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３５は、移植したＢ１６黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの体液性応答（溶血指数における増加）を表ＩＶ．７に示すような投与量で増強することができ、セーライン群に対する統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を有することが見出された。
【０１８１】
８．Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける接種したＢ１６黒色腫細胞の生存に対するペプチドの影響（方法６．２）
試験物質処理の終了後の動物の死後試験は、０．５μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日および５０μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ００８、および５μｇ／ｋｇ／日および５００μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ０１６で処理したマウスの肺におけるＢ１６転移病巣の存在のいずれの徴候も示さなかった。
【０１８２】
結論
１９９３年にBranch of Drug Administration, Department of Health, PR Chinaによって発行された「前臨床新薬リサーチガイダンス（the Preclinical New Drug Research Guidelines）」にしたがって、移植した癌細胞を有するマウスに対するペプチドの影響を研究した。結論として、
１．ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３５は、適当な投与量で、マウスにおける移植したＳ１８０肉腫の発現を有意に阻害することができた；
２．ＣＭＳ００１およびＣＭＳ０３４は、適当な投与量で、Ｓ１８０肉腫を移植したマウスの食作用免疫活性を増強することができた；
３．ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０２４およびＣＭＳ０３２は、適当な投与量で、腹水型肝臓癌Ｈ２２を移植したマウスの生存を延長することができた；
４．ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３５は、適当な投与量で、腹水型肝臓癌Ｈ２２を移植したマウスにおいてＴリンパ球形質転換を増強することができた；
５．ＣＭＳ００３、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３２およびＣＭＳ０３４は、適当な投与量で、腹水型肝臓癌Ｈ２２を移植したマウスのＮＫ細胞細胞毒活性を増加することができた；
６．ＣＭＳ０１９およびＣＭＳ０３５は、適当な投与量で、Ｌ１２１０白血病を移植したマウスの生存を延長することができた；
７．ＣＭＳ００８およびＣＭＳ０１６は、適当な投与量で、マウスにおいて移植したＢ１６黒色腫の発現を阻害することができた；
８．ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３５は、適当な投与量で、Ｂ１６黒色腫を移植したマウスの体液性免疫応答を増強することができた。
【０１８３】
考察
ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３４、ＣＭＳ０３５は、一部として、または単独で、ヒトにおける癌管理において有用でありうる。例えば、ＣＭＳ００１、ＣＭＳ００３、ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１４、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３２、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３５は、癌患者の免疫を増加するために使用されうる。ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１０、ＣＭＳ０１６、ＣＭＳ０３４およびＣＭＳ０３５は、患者における癌細胞の成長を妨害するために使用されうる。ＣＭＳ００８、ＣＭＳ０１１、ＣＭＳ０１９、ＣＭＳ０２４、ＣＭＳ０３２およびＣＭＳ０３５は、癌患者の期待余命を延長するために使用されうる。該ペプチドは、単独で、２以上のペプチドを組み合わせて、または他の医薬もしくは食物サプリメントと組み合わせて、癌管理の全過程として使用されうる。
【０１８４】
【表４７】
【０１８５】
引用文献
１．「新薬の前臨床リサーチの原理（Principles of Pre-clinical Research of New Drugs）」、中華人民共和国、1993、7:137-143
２．「新薬の前臨床リサーチの原理（Principles of Pre-clinical Research of New Drugs）」、中華人民共和国、1993、7:128-129
３．Yuanpei Zhang, Huaide Su. 「薬理学的実験（第二版）（Pharmacological experiment (second edition)）」、People's Health Publishing House、1998、137-138
４．Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen、「薬理学的実験の方法（Methodology of pharmacological experiment）」、People's Health Publishing House、1991、1221-1234
５．「新薬の前臨床リサーチの原理（Principles of Pre-clinical Research of New Drugs）」、中華人民共和国、1993、7:140
６．Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong、「ＮＫ細胞活性を試験するＭＴＴ還元法における研究（The study on MTT reduction method of testing NK cell activity）」、China Immunology Journal、1996、1(6): 356-358
７．Yaoqin Yang, Huchuan Yang, Huihong Taoら、「高体温の抗腫瘍に対するＴｗｅｅｎ−８０の相乗効果−マウス黒色腫の実験的研究（The synergic effect of Tween-80 on the antitumor of hyperthermiaExperimental studies of mouse melanoma）」、Cancer Research on Prevention and Treatment、1999、26(4): 8-12
８．Jian Fu, Jie Zheng, Weigang Fangら、ネズミＢ１６黒色腫細胞中へのインターロイキン−１２遺伝子トランスフェクションは腫瘍形成を抑制し、転移ポテンシャルを減少させる（Interleukin-12 gene transfection into murine B16 melanoma cells suppresses tumorigenicity and decreases metastatic potential）」、National Medical Journal of China、1998、78(8): 627-629
９．Qian Wang、「現代の医学実験法（Modern medical experiment method）」、People's Health Publishing House、1998、482-483
１０．Qichao Pan, Bin Xu、「癌薬理学および化学療法（Cancer pharmacology and chemotherapy）」、Henan medical university Publishing House、2000、66-69
１１．Yuanpei Zhang, Huaide Su、「薬理学的実験（第二版）（Pharmacological experiment (second edition)）」、People's Health Publishing House、1998、131
【０１８６】
Ｖ．体重に対する影響
健康なラットに、同時にペプチド処理（筋内３００μｇ／ｋｇ／日）を行って、または行わないで、高栄養食餌を５週間与えた。セーライン注射をした通常の食餌におけるラットを負の対照として用いた。処理の５週後、注射を止め、同じ食餌をさらに３週間維持した。週１回の間隔で、体重データを集めた。ラットの行動も観察した。ペプチドＣＭＳ０１５を受けているラットは、ペプチド処理過程の間、対照と比べて統計学的に有意に低い体重増加を有することが見出された。この減少した体重の傾向は、ＣＭＳ０１５処理を止めた後に徐々に減少した。結論として、ＣＭＳ０１５は、適当な投与量レベルで、食べ過ぎによって誘導される肥満発現を可逆的に調節することができる。
【０１８７】
材料
体重１４５±１０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットは、中華人民共和国の広州中医薬大学の実験動物センター（the Center of Experimental Animal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine）によって提供された（証明番号：２０００Ａ０１９）。ペプチドはAmerican Peptide Company, Inc., USAによって（Ｌ−アミノ酸起源から）注文製造され、正常セーライン中における１０μｇ／ｍｌに希釈された。高および並栄養食餌を、中華人民共和国のＳＤＡ（国家薬品監督管理局（State Drug Administration））によって発行された抗肥満薬の前臨床リサーチのためのガイドライン（the guideline for pre-clinical research of anti-obesity drug）にしたがって、調製した［１］。
【０１８８】
方法
健康なラットを、実験、正の対照および負の対照群に無作為化した。１群あたり１０匹のラットであり、半分が雄、半分が雌であった。ラットの実験群に、高栄養食餌を５週間与え、同時に、１日に１回、３００μｇ／ｋｇ／日のペプチドの筋内注射を行った。正の対照群は、同じ高栄養食餌を受けたが、プラシーボセーライン注射を受け、一方、肥満モデルの確立の成功を証明するために使用される負の対照群は、並栄養食餌およびプラシーボセーライン注射を受けた。５週間処理後、注射を止め、同じ食餌をさらに３週間維持した。週１回の間隔で、ラットを計量した。ラットの行動も観察した。
【０１８９】
統計
データは、平均±標準偏差として表された。対応のあるｔ検定または単一因子ＡＮＯＶＡを、群間および群内比較に用いた。統計学的有意カットオフはＰ＜０．０５であった。
【０１９０】
結果
１．ＳＤラットの体重に対するペプチドの影響
【表４８】
【０１９１】
３００μｇ／ｋｇ／日の投与量で、ＣＭＳ０１５は、食べ過ぎによって誘導される肥満ラットの体重増加を制限することができ、対照群に対する統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）を有することが見いだされた。処理群と対照群の差は、処理の長さによって増加した。処理群におけるペプチドＣＭＳ０１５処理の終了時、処理群と対照群の差は、徐々に減少し、３週後、統計学的に有意差がなくなり、このことは、ＳＤラット体重に対するペプチドの影響が可逆的であることを示した。
実験の全過程の間、ラットの全群の食欲および活動は正常に維持されたことが観察された。
【０１９２】
考察
結論として、ＣＭＳ０１５は、適当な投与量レベルで、食べ過ぎによって誘導される肥満の発現を制限することができる。該ペプチドは、肥満の調節のためにヒトでの使用に付してもよい。該ペプチドは、単独で、２以上のペプチドを組み合わせて、または他の医薬もしくは食物サプリメントと組み合わせて、肥満管理の全過程として用いてもよい。
本研究において、筋内注射による投与が試験されたが、これは、他の別の経路を介して投与された場合のペプチドの可能性のある効力を排除するものではない。該ペプチドは、リポソーム、徐放性保護などの送達促進デバイスを用いる、または用いない、静脈内注射、筋内注射、腹膜内注射、皮下注射、および皮下埋め込みを介して投与されてもよい。該ペプチドは、また、錠剤、カプセル、懸濁、溶液などの経口投与のいずれかの形態において、修飾を用いない通常の形態または徐放性形態において、または胃腸保護を用いて、または用いないで、投与されてもよい。該ペプチドは、さらに、経皮促進デバイスを用るまたは用いない、軟膏、クリーム、ゲルなどの局所塗布のいずれかの形態において、または、粉末、溶液の吸入剤として、またはリポソーム保護形態として、塗布されてもよい。該ペプチドは、また、その遺伝子配列に解読され、単独または他のペプチド配列と組み合わせて発現系中にクローン化して、得られるペプチド分子を作成し、該得られるペプチドを精製して、または精製せずに、本明細書中に記載するようなペプチドの活性を利用してもよい。
【０１９３】
【表４９】
【０１９４】
引用文献
１．SDA, 中華人民共和国、「新薬の前臨床リサーチのためのガイドライン（The guideline for pre-clinical research of new drugs）」、1993
【０１９５】
本発明を実施する別の方法として、上記に開示したペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に付加的なアミノ酸を付加することが可能であることは理解される。例えば、１または２個のアミノ酸が、開示されたペプチドに、その生物学的機能に影響を及ぼさずに付加されうる。また、３または４個のアミノ酸を付加し、依然としてペプチドの機能を維持することも可能である。これらは全て、同じペプチドの変種といわれる。別法では、１または２個のアミノ酸を該ペプチドから、その生物学的活性に影響を及ぼさずに欠失させてもよい。さらに、３または４個のアミノ酸をそのペプチドの生物学的機能に影響を及ぼさずに欠失させることも可能である。これらは、該ペプチドのフラグメントといわれる。さらに、１のアミノ酸の同じ官能クラス内の別のアミノ酸での保存的置換などのペプチドの誘導体を用いて、本発明の別の態様を実施してもよい。例えば、非極性または疎水性側鎖を有するペプチドは、生物学的活性を減じることなく、１の側鎖基を別の基で置換することが可能である。さらなる例として、リンカー／スペーサーをペプチド中に挿入して、変種を形成してもよい。ただし、該変種は、該研究において用いられる元々のペプチドとして、その活性部分を依然として維持したままである。これらは、また、該ペプチドの変種と考えられる。本明細書で使用される場合、ペプチド類似体は、天然アミノ酸の構造を模倣するアミノ酸分子を有するペプチド、例えば、異なる骨格構造またはＤ−アミノ酸置換を有する類似体を包含する。さらなる例として、ペプチドの合成に用いられるアミノ酸はそのＬ光学異性体であるが、配列中、１以上のアミノ酸がＤ−形態で置換されたペプチドは類似の生物学的活性を有しうる。本請求の範囲で使用される場合、「機能的誘導体」なる語は、ペプチドのフラグメント、類似体または化学的誘導体を包含することを意味する。
【０１９６】
本明細書で使用される場合、「ハイブリッドペプチド」なる語は、配列番号１−３０を有する元々の生物学的に活性なペプチド中に挿入された付加的なペプチドまたはその機能的誘導体を含有するが、依然として、実質的に類似の活性を維持しているペプチドをいう。付加的なペプチドは、例えば、細胞中または細胞外へのハイブリッド蛋白質の分泌のためのシグナルとして、１以上の原核生物または真核生物細胞によって認識されるアミノ酸配列を含有するリーダーペプチドを包含する。該分泌は、直接的な分泌であってもよく、または分泌小胞を介して間接的であってもよい。
「実質的に純粋なペプチド」なる語は、少なくとも１０％ｗ／ｗ純粋、より好ましくは２０％、さらにより好ましくは４０％、非常により好ましくは６０％、はるかにより好ましくは９０％以上純粋であるペプチドをいう。最も好ましい具体例において、純粋とは、９９％以上のことである。実質的に純粋なペプチドは、下記のような複雑な混合物であってもよい医薬および栄養処方を調製するために用いることができる。
【０１９７】
医薬処方における上記で定義付けられたのペプチドの使用は、免疫に対する二次的影響を有する免疫学的障害または疾患、例えば、癌または感染または上記状態のいずれかのための可能性のある治療として用いてもよい。該処方は、他のペプチドを包含する他の活性または不活性な成分と混合した同定されたペプチドの１つを含有していてもよい。例えば、列挙されたペプチドのうち２ないし数個（例えば、３−５）を、他の成分を用いる、または用いない同じ処方に加えてもよい。別法では、列挙されたペプチドのうち１つを用いて、本明細書に列挙されていないペプチドと一緒に処方を調製してもよい。それらは、静脈内、筋内、皮内、皮下または皮内形態において投与することができる。投与様式は、また、目的の器官に直接導く動脈内注射であってもよい。他の投与様式は、経皮、粉末またはスプレーとして吸入、および当業者に知られた送達の他の形態である。該処方はまた、経口によって服用されてもよく、経口摂取後のペプチドの胃での消化を防ぐために用いることのできる担体または当該分野で既知のいずれか他の担体（リポソームなどの経皮のための）を含有していてもよい。
【０１９８】
医薬処方は、既知の医薬担体のいずれかを包含しうる。適当な担体の例は、当業者に知られた標準的な医薬上許容される担体のいずれかを包含する。これらは、限定するものではないが、生理学的セーライン溶液、水、油および水混合物またはトリグリセリドエマルジョンを包含するエマルジョン、および他の型の薬剤、充填剤、被覆錠剤およびカプセルを包含する。適当な担体は、医薬組成物の投与様式に基づいて選択されうる。
【０１９９】
該ペプチドは、静脈内注射、筋内注射、腹膜内注射、皮下注射および皮下埋め込みを介して投与されうる。該ペプチドは、また、錠剤、カプセル、懸濁、溶液などの経口投与のいずれかの形態において、修飾を用いない通常の形態または徐放性形態において、あるいは胃腸保護を伴う、または伴わないで、投与されうる。さらに、該ペプチドは、軟膏、クリーム、ゲルなどの、経皮促進デバイスを用いるまたは用いない、局所塗布のいずれかの形態において塗布されてもよい。該ペプチドは、また、その遺伝子配列に解読され、単独または他のペプチド配列と組み合わせて発現系中にクローン化されて、得られるペプチド分子を作成して本明細書に記載のような該ペプチドの活性を利用してもよい。
【０２００】
各ペプチドの投与量は、体重１ｋｇあたり１ｎｇ−１０ｇでありうる。好ましい投与量は、注射投与様式の場合、１０ｎｇ−１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１μｇ−１ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、１以上のペプチドが正常な生理学的応答のカスケードを包含するレセプターによって作動しうるので、有効量は、体重１ｋｇあたり１ｎｇと低くてもよい。別法では、１以上のペプチドは、単に、全カスケード反応の開始剤である。経口摂取の場合、該量は、体重１ｋｇあたり１ｎｇ−１０ｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり０．１μｇ−１ｇ、さらにより好ましくは１μｇ−１０ｍｇ／日であってもよい。
【０２０１】
ＶＩ．遺伝子療法および治療法
見出されたペプチド配列に基づく遺伝子療法は、これらのペプチドの１つをコードする核酸を設計することによって行う。核酸は、化学的に合成され、プロモーターに作動可能に連結され、発現ベクター中にクローン化されうる。次いで、該発現ベクターを、ヒト細胞中での発現のための遺伝子療法の形態として、人体に投与する。本明細書中で使用される場合、「遺伝子ベクター」なる語は、これらの発現ベクターを包含する。遺伝子療法に使用できるベクターは、アデノ随伴ウイルス (Mizuno, M.ら、(1998) Jpn J Cancer Res 89, 76-80) 、ＬＮＳＸベクター (Miller, A.D.ら、(1993) Methods Enzymol 217, 581-599) およびレンチウイルス (Goldman, M.J. ら、 (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268) を包含する。
【０２０２】
ペプチド送達のための他のビヒクルは、宿主生物の健康に対して重大な有害な影響を伴わないで該ペプチドを投与することが望まれる宿主生物中で複製することのできる生物中に運ばれることのできる所望のペプチドをコードしている発現ベクターを包含する。例えば、該発現ベクターは、該ペプチドを投与することが望まれる宿主生物に対して病原性ではない生物中に運ばれうる。いくつかの具体例において、該発現ベクターは、該ペプチドが投与されるべき宿主生物の健康に対して重大な有害な影響を有さない細菌または真菌生物中で、所望のペプチドを生産する。例えば、所望のペプチドをコードしている発現ベクターは、乳酸菌、イー・コリ（E.coli）または酵母のような生物中で所望のペプチドを生産する発現ベクターであってもよい。１の具体例において、発現ベクターは、哺乳動物の胃において通常見出される微生物または哺乳動物消化管に耐性のある微生物中で、所望のペプチドを生産する。所望のペプチドが発現されることのできる微生物種のいくつかは、限定するものではないが、乳酸桿菌（Lactobacillus）種、例えば、エル・アシドフィルス（L. acidophilus）、エル・アミロボルス（L. amylovorus）、エル・カセイ（L. casei）、エル・クリスパタス（L. crispatus）、エル・ガリナルム（L. gallinarum）、エル・ガセリ（L. gasseri）、エル・ジョンソニイ（L. johnsonii）、エル・パラカセイ（L. paracasei）、エル・プランタラム（L. plantarum）、エル・ロイテリ（L. reuteri）、エル・ラムノサス（L. rhamnosus）など；ビフィズス菌（Bifidobacterium）種、例えば、ビー・アドレスセンチス（B. adolescentis）、ビー・アニマルス（B. animalus）、ビー・ビフィダム（B. bifidum）、ビー・ブレブ（B. breve）、ビー・インファンティス（B. infantis）、ビー・ラクチス（B. lactis）、ビー・ロンガム（B. longum）など；エンテロカッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）またはエンテロカッカス・ファシウム（Ent. facium）；スポロラクトバシラス・イヌリナス（Sporolactobacillus inulinus）；バシラス・サチルス（Bacillus subtilis）またはバシラス・セレウス（Bacillus cereus；エシェリキア・コリ（Escherichia coli）；プロピオニバクテリウム・フロイデンレイチ（Propionibacterium freudenreichii）；またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはサッカロミセス・ボウラルディイ（Saccharomyces boulardii）を包含する。
【０２０３】
化学的に合成されたか、または限定するものではないが、ｍＲＮＡの逆転写を包含するｃＤＮＡ分子を製造するための他の手段によって製造された本発明のペプチドをコードする核酸配列は、当業者によく知られている遺伝子操作法によって、所望の生物中への遺伝子移入のための発現ベクター中に組み込まれる。該発現ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。例えば、発現ベクターは、プラスミドまたはウイルス性遺伝子エレメントに基づくベクターであってもよい。発現ベクターは、染色体外で複製するベクターであってもよく、または染色体中に一体化するベクターであってもよい。
【０２０４】
発現ベクターは、本発明のペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。該プロモーターは、調節可能なプロモーター、例えば、誘導可能なプロモーター、または構造性プロモーターであってもよい。いくつかの具体例において、該プロモーターは、所望のレベルのペプチド発現を提供するために選択されうる。さらに、所望により、発現ベクターは、ペプチドの生産、提示および／または分泌を促進するための他の配列を含んでいてもよい。いくつかの具体例において、本発明のペプチドをコードしている核酸は、ペプチドの分泌を指示する核酸配列に作動可能に連結される。例えば、本発明のペプチドをコードしている核酸は、シグナルペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結されうる。
【０２０５】
いくつかの具体例において、本発明のペプチドをコードするように操作される発現ベクターは、哺乳動物の通常の腸管内菌叢を構成する細菌種、例えば、乳酸桿菌種およびバシラス・サチルス中で、本発明のペプチドを発現するように適応させた発現ベクターであってもよい。かかる発現ベクターの例は、Casasの米国特許第６，１００，３８８号およびBelliniの米国特許第５，７２８，５７１号において、各々、見出すことができる。これらの特許文献は、出典明示により、全体として明白に本明細書の一部とされる。ペプチドが投与されるべき宿主生物の健康に対して有害ではない、生物中で本発明のペプチドの発現を容易にするいずれの発現ベクターを使用してもよいことは、当業者に明らかであろう。
【０２０６】
いくつかの具体例において、本発明にペプチドをコードするように操作された発現ベクターは、ヒトの胃においてコロニーを形成することができ、ある特定の形態の下痢を治療するのに使用される、哺乳動物の胃に対してよく耐性のある酵母種、例えば、サッカロミセス・セレビシエ；または好ましくは、サッカロミセス・ボウラルディイ中において、本発明のペプチドを発現するように適応させた発現ベクターであってもよい。異種蛋白質およびペプチドを構造発現し、非常に安定しており、それゆえ、有糸分裂および減数分裂の間、子孫細胞によく伝達され、高レベルの組み換え蛋白質分泌を指示するシグナルペプチドのコーディング配列を含みうる酵母発現ベクターを使用することができる。かかる酵母ベクターの一例は、Jangらの米国特許第６，３９１，５８５号（出典明示により、全体として明白に本明細書の一部とされる）に提供される。
【０２０７】
本発明のペプチドをコードしている発現ベクターは、当該分野で既知の技術によって、ペプチドを発現することを意図された生物中に導入されうる。これらの技術は、化学的にコンピテントな細菌細胞、エレクトロポレーションまたは酢酸リチウム形質転換（酵母用）の使用によって、細菌、酵母または他の微生物を形質転換する伝統的な方法、ならびに、例えば、これらの手法に不応性の細菌種の形質転換における最近の進歩を包含する。いくつかの具体例において、発現ベクターは、Leerら（ＷＯ９５／３５３８９）に開示される方法を用いて（その開示は、出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）、形質転換に対して不応性であることが知られた乳酸菌中に導入される。導入された配列は、微生物の染色体ＤＮＡ中に組み込まれるか、または染色体外ＤＮＡエレメントとして留まっていてもよい。
【０２０８】
該発現ベクターを含有するこの遺伝子操作された微生物を、次いで、消化管、膣、気管などに接種して、持続性免疫療法を達成することができる。いくつかの具体例において、本発明のペプチドを発現している生物は、不活性形態で、または好ましくは、生きている形態で摂取される。胃において、これらの微生物は、該ペプチドを生産し、分泌または微生物の溶解によって、管腔中にそれらを放出し、または別の方法で該ペプチドを宿主に提供し、それにより、該ペプチドはその目的の効果を宿主生物において生じる。他の具体例において、ペプチドは、鼻道、膣または小腸の粘膜にて宿主に提供される。
【０２０９】
別の治療法は、人体において細胞に特定の核酸を送達するための手段としてのリポソームの使用である。核酸（配列番号１〜３０のペプチドをコードする核酸配列を含有する発現ベクターのような）は、Gao, X. および Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722およびＵＳ６，２０７，４５６に記載のような細胞の取り込みおよび染色体の組み込みを促進する環境において送達される。別法では、ＵＳ６，２４５，４２７に記載の方法を用いて、ペプチド自体がリポソーム中に包まれ、直接送達されることができる。上記の科学出版物および特許は全て、出典明示により本明細書の一部とされる。
上記の遺伝子療法および治療法に有用な核酸配列は、これらのペプチドおよびその機能的誘導体をコードする配列を包含する。多くの核酸配列のうちどれでも、これらのペプチドおよび縮重コドン系に基づくその誘導体をコードするために用いられうる。
【０２１０】
下記の引用文献は、出典明示により、全体として本明細書の一部とされる。
１．「新薬の前臨床リサーチの原理（Principles of Pre-clinical Research of New Drugs）」、中華人民共和国、1993、7:134-135
２．Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen、「薬理学的実験の方法（Methodology of pharmacological experiment）」、People's Health Publishing House、1991、1221-1234
３．中華人民共和国の衛生部によって発行された「前臨床における新薬リサーチの原理（Principle of new drug research in pre-clinic）」、1993、7:140
４．Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong、「ＮＫ細胞活性を試験するＭＴＴ還元法における研究（The study on MTT reduction method of testing NK cell activity）」、China Immunology Journal、1996、1(6): 356-358
５．Qian Wang、「現代の医学実験法（Modern medical experiment method）」、People's Health Publishing House、1998、482-483
６．中華人民共和国の衛生部によって発行された「前臨床における新薬リサーチの原理（Principle of new drug research in pre-clinic）」、1993、7: 141
７．中華人民共和国の衛生部によって発行された「前臨床における新薬リサーチの原理（Principle of new drug research in pre-clinic）」、1993、7: 132-133
８．中華人民共和国の衛生部によって発行された「前臨床における新薬リサーチの原理（Principle of new drug research in pre-clinic）」、1993、7: 128-129
９．Yuanpei Zhang, Huaide Su、「薬理学実験（第二版）（Phamalogical experiment (second edition)」、People's Health Publishing House、1998、137-138
１０．Jiatai Li、「臨床薬理学（第二版）（clinical pharmacology(second edition)）」、People's Health Publishing House、1998、1338-1339
【実施例１】
【０２１１】
遺伝子操作した乳酸桿菌細菌種によるペプチドの送達
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための一例の方法を提供する。上記の表Ａに列挙したペプチドのうち１つをコードするＤＮＡ配列は、化学的手段によって合成され、該ＤＮＡ配列は、当業者によく知られた遺伝子操作の標準的技術を用いて、発現ベクター中へ挿入される。選択された発現ベクターは、乳酸桿菌において機能的な構造性プロモーター、特定の５’ないし３’配向におけるＤＮＡ配列の導入のためのマルチプルクローニングサイト、ならびに抗生物質耐性（クローニング法において助けるための）を与える選択マーカー遺伝子を含有し、ペプチドの生産および／または分泌を補助するための他の配列、例えば、シグナルペプチド配列を含みうる。かかるベクターの例は、Pavlaの米国特許第５，５９２，９０８号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）によって提供される。簡単に言うと、該特許は、乳酸桿菌種において機能する数個の既知のプロモーター、ならびに該細菌中の新規なプロモーター（そのいずれも、乳酸桿菌中でペプチドを発現するように、本発明のペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結されていてもよい）を見出す方法を論じる。上記の米国特許第５，５２９，９０８号に記載のようなラクトバシラス・ラクチス中で活性な１６ないし３５個のほとんど疎水性のアミノ酸よりなるペプチドのようなシグナルペプチドをコードしている核酸は、プロモーターと本発明のペプチドをコードしている核酸との間に挿入され、その結果、シグナルペプチドをコードしている核酸は、本発明のペプチドをコードしている核酸を有するフレーム内にある。
【０２１２】
ペプチドのコーディング配列のほかに、合成されたＤＮＡ配列は、該ＤＮＡの発現ベクター中への連結およびクローニングにおいて助けとなる配列を含んでいてもよい。例えば、ベクターのマルチプルクローニングサイトにおいて見出される配列に対応する制限酵素認識部位を、該配列の５’および３’末端にて該合成ＤＮＡ中に組み込むことができ、その結果、該配列をベクター内で適当な配向でクローン化することができる。ベクターおよび合成ＤＮＡの両方とも、特定の制限酵素で消化され、次いで、精製される。ベクターおよび合成ＤＮＡとの連結反応の後、イー・コリの適当な株に形質転換する。形質転換された細菌は、ベクターが耐性を与える抗生物質を含有する培地に植える。形質転換された細菌のコロニーを、生育培養およびプラスミド調製法について選択し；正しい配向の合成ＤＮＡの存在を確認する。
【０２１３】
次いで、発現ベクターを乳酸桿菌種、例えば、エル・アシドフィルスの細菌宿主細胞中に形質転換する。形質転換細胞は、ベクター配列内に見出される選択マーカーによって選択され、該ペプチドの分泌は、ウェスタン・ブロットを行い、成長培地中に存在するペプチドのゲル電気泳動を行い、または他の標準的な技術によって証明されうる。細菌の形質転換コロニーを選択し、遺伝子操作した細菌の大量培養を調製するために用いる。所望のペプチドを発現している遺伝子操作した細菌の培養物を増殖させ、少なくとも、その一部を、その中で細菌が複製することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。所望により、細菌培養物は、宿主による腸での消費のためのサプリメントを生産するための種々の方法において処理することができる。これらの処理は、凍結乾燥または細菌を保存するための他の方法を包含し、さらに、細菌と担体薬剤、例えば、溶液、溶媒、分散培地、遅延剤、エマルジョンなどと組み合わせる。サプリメントを調製するためのこれらの薬剤の使用は、当該分野でよく知られている。例えば、細菌を用いて、ヒト消費用の発酵乳製品または他の食品を製造することができ、その結果、該ペプチドを発現している生物は宿主生物の胃でコロニー形成する。乳酸菌の特定の株をヨーグルト、キムチ、チーズおよびバターなどの食品中に組み込むための多くの異なる方法が、Ohの米国特許第６，０３６，９５２号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）において開示される。多くの経路のうち１つによる細菌の消費において、操作された生物は胃でコロニー形成でき、胃の粘膜層を介する本発明のペプチドの提示および／または吸収を可能にする。
【実施例２】
【０２１４】
バシラス・サチルスの遺伝子操作形態によるペプチドの送達
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための別例の方法を提供する。上記の表Ａに列挙したペプチドのうち１つをコードするＤＮＡ配列は、化学的手段によって合成され、該ＤＮＡ配列は、遺伝子操作技術（全ての技術は当該分野で知られている）によって、発現ベクター中へ挿入される。選択される発現ベクターは、イー・コリおよびビー・サチルスの両方において増殖することができ、形質転換細菌のコロニーを選択するための抗生物質耐性遺伝子を含有するシャトルベクター、例えば、ｐＴＺ１８Ｒ（Pharmacia, Piscataway, NJ）を含む。該ベクターは、ビー・サチルスにおいて活性な構造性プロモーター、例えば、ビー・サチルスのＳａｃ Ｂ遺伝子由来のプロモーターならびに細菌細胞からの発現した異種蛋白質の有効な輸送を指示するビー・サチルスにおいて活性なシグナルまたはリーダーペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含有することができる。かかるベクターの一例は、Fahnestockの米国特許第６，２６８，１６９号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に開示される。簡単に言うと、上記のように、本発明のペプチドをコードしているＤＮＡは、当業者によく知られた技術によって、ＤＮＡのクローニングを容易にするための制限酵素部位および／または他の配列を用いて合成されるであろう。イー・コリ中への形質転換、播種、選択およびプラスミドを増殖してプラスミドストックを作成後、該プラスミドをビー・サチルス中に形質転換し、播種培地において、形質転換体を抗生物質耐性によって選択する。
【０２１５】
遺伝子操作したビー・サチルスにおけるペプチドの生産および該細菌からのその分泌は、当業者によく知られた技術、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析またはウェスタンブロット後のオートラジオグラフィック検出のためのペプチドの放射能標識を用いて証明される。
遺伝子操作された細菌の培養物を増殖させ、少なくともその一部を細菌が増殖することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。
【実施例３】
【０２１６】
遺伝子操作されたサッカロミセス酵母種によるペプチドの送達
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための別例の方法を提供する。上記の表Ａに列挙されたペプチドのうち１つをコードするＤＮＡ配列は、化学的手段によって合成され、該ＤＮＡ配列は、遺伝子操作技術（全ての技術は当該分野で知られている）によって発現ベクター中へ挿入される。選択される発現ベクターは、安定に維持された酵母蛋白質発現ベクターを含み、それは、ｐＡＤＨ１のような構造性酵母プロモーター、酵母およびイー・コリの両方におけるベクターの複製のための部位、選択目的のために栄養要求性酵母突然変異体に栄養を与える遺伝子、マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）および、所望により、シグナルペプチドをコードする配列を含む。このようなベクターは、商業的に入手可能であり、当該分野でよく知られているか、または標準的な技術を用いて容易に構築できる。合成ＤＮＡの酵母ベクター中への挿入、イー・コリ中への形質転換、形質転換したイー・コリの選択培地への播種、形質転換した細菌コロニーの選択および該コロニー由来の細菌の成長培養物からのプラスミドＤＮＡの調製後、よく知られた技術、例えば、酢酸リチウム形質転換またはエレクトロポレーションによって、ベクターをサッカロミセス・セレビシエ中に形質転換する。形質転換のために選択されたサッカロミセス・セレビシエの株は、最少培地プレート上で生育するために、プラスミド上の遺伝子を必要とするであろう突然変異体栄養要求株である。形質転換された酵母コロニーは、ベクター上に提供される遺伝子を欠く成長培地上に酵母を播種することによって、単離される。ベクターおよびその選択遺伝子を受け取り、その遺伝子産物を発現している酵母だけが、最少培地上でコロニーに成長できるであろう。ペプチド分泌の証明は、ウェスタンブロットを行い、成長培地に存在するペプチドのゲル電気泳動を行うことによって、または他の標準的技術によって、得ることができる。
【０２１７】
酵母の形質転換コロニーを選択し、大量培養物を調製するために使用する。所望のペプチドを発現している遺伝子操作した酵母の培養物を増殖させ、少なくともその一部を、細菌が複製することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。所望により、酵母培養物は、宿主による腸での消化のためのサプリメントを生産する種々の方法において処理できる。これらの処理は、凍結乾燥または酵母を保存する他の方法を包含し、さらに、溶液、溶媒、分散培地、遅延剤、エマルジョンなどの担体物質と細菌を組み合わせることを含む。サプリメントを調製するためのこれらの薬剤の使用は、当該分野でよく知られている。別の具体例において、形質転換した酵母を、当業者によく知られた技術によって、食品、例えば、ヨーグルトおよびケフィールなどの発酵乳製品の生産に用いる。これらの食品中の生きている乳酸菌培養物と同様に、形質転換した酵母は、少なくとも一時的に胃でコロニー形成し、胃の管腔を介してペプチドを宿主へ提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチド。
【請求項２】
下記の状態：免疫活性、肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、腎炎の程度および癌の成長のうち少なくとも１つを変調する請求項１記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項３】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチド。
【請求項４】
下記の状態：免疫活性、肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、腎炎の程度および癌の成長のうち少なくとも１つを変調する請求項３記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項５】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチド。
【請求項６】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体を含む、実質的に純粋なペプチド。
【請求項７】
下記の状態：免疫活性、肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、腎炎の程度および癌の成長のうち少なくとも１つを変調する請求項６記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項８】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体からなる、実質的に純粋なペプチド。
【請求項９】
下記の状態：免疫活性、肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、腎炎の程度および癌の成長のうち少なくとも１つを変調する請求項８記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１０】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体からなる、実質的に純粋なペプチド。
【請求項１１】
下記の状態：免疫活性、肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、腎炎の程度および癌の成長のうち少なくとも１つを変調する請求項１０記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１２】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項１３】
ペプチドが下記の状態：免疫活性、肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、腎炎の程度および癌の成長のうち少なくとも１つを変調する請求項１２記載のベクター。
【請求項１４】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項１５】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項１６】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体からなるペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項１７】
ペプチドをコードしている核酸配列を含む遺伝的構成物を有する微生物であって、該ペプチドが生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体を含み、該生物学的に活性なペプチドが配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する微生物。
【請求項１８】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１９】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体を含む実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２０】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体からなる実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２１】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体からなる実質的に純粋なペプチドからなる医薬組成物。
【請求項２２】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを提供し、次いで、該実質的に純粋なペプチドと医薬上許容される担体とを混合することを特徴とする、医薬組成物の製造法。
【請求項２３】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドを提供することを特徴とする、医薬組成物の製造法。
【請求項２４】
生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体であるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを提供し、該生物学的に活性なペプチドが配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；次いで、該実質的に純粋なペプチドと医薬上許容される担体とを混合することを特徴とする、医薬組成物の製造法。
【請求項２５】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体であるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドを提供することを特徴とする、医薬組成物の製造法。
【請求項２６】
癌の治療において有用なヒトに対して医薬上有効投与量の、配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチド。
【請求項２７】
免疫学的障害の治療において有用なヒトに対して医薬上有効投与量の、配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチド。
【請求項２８】
癌の治療において有用なヒトに対して医薬上有効投与量の、配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体を含む実質的に純粋なペプチド。
【請求項２９】
免疫学的障害の治療において有用なヒトに対して医薬上有効投与量の、配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体を含む実質的に純粋なペプチド。
【請求項１】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチド。
【請求項２】
下記の状態：免疫活性、肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、腎炎の程度および癌の成長のうち少なくとも１つを変調する請求項１記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項３】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチド。
【請求項４】
下記の状態：免疫活性、肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、腎炎の程度および癌の成長のうち少なくとも１つを変調する請求項３記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項５】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチド。
【請求項６】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体を含む、実質的に純粋なペプチド。
【請求項７】
下記の状態：免疫活性、肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、腎炎の程度および癌の成長のうち少なくとも１つを変調する請求項６記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項８】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体からなる、実質的に純粋なペプチド。
【請求項９】
下記の状態：免疫活性、肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、腎炎の程度および癌の成長のうち少なくとも１つを変調する請求項８記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１０】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体からなる、実質的に純粋なペプチド。
【請求項１１】
下記の状態：免疫活性、肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、腎炎の程度および癌の成長のうち少なくとも１つを変調する請求項１０記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１２】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項１３】
ペプチドが下記の状態：免疫活性、肝炎感染、Ｂ型肝炎感染、腎炎の程度および癌の成長のうち少なくとも１つを変調する請求項１２記載のベクター。
【請求項１４】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項１５】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体を含むペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項１６】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列の機能的誘導体からなるペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項１７】
ペプチドをコードしている核酸配列を含む遺伝的構成物を有する微生物であって、該ペプチドが生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体を含み、該生物学的に活性なペプチドが配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する微生物。
【請求項１８】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１９】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体を含む実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２０】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体からなる実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２１】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体からなる実質的に純粋なペプチドからなる医薬組成物。
【請求項２２】
配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを提供し、次いで、該実質的に純粋なペプチドと医薬上許容される担体とを混合することを特徴とする、医薬組成物の製造法。
【請求項２３】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドを提供することを特徴とする、医薬組成物の製造法。
【請求項２４】
生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体であるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを提供し、該生物学的に活性なペプチドが配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；次いで、該実質的に純粋なペプチドと医薬上許容される担体とを混合することを特徴とする、医薬組成物の製造法。
【請求項２５】
本質的に配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体であるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドを提供することを特徴とする、医薬組成物の製造法。
【請求項２６】
癌の治療において有用なヒトに対して医薬上有効投与量の、配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチド。
【請求項２７】
免疫学的障害の治療において有用なヒトに対して医薬上有効投与量の、配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチド。
【請求項２８】
癌の治療において有用なヒトに対して医薬上有効投与量の、配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体を含む実質的に純粋なペプチド。
【請求項２９】
免疫学的障害の治療において有用なヒトに対して医薬上有効投与量の、配列番号１−１５および１７−３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なペプチドの機能的誘導体を含む実質的に純粋なペプチド。
【公開番号】特開２００７−３１２７８５（Ｐ２００７−３１２７８５Ａ）
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８７７１３（Ｐ２００７−１８７７１３）
【出願日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【分割の表示】特願２００３−５１２２６２（Ｐ２００３−５１２２６２）の分割
【原出願日】平成１４年７月１１日（２００２．７．１１）
【出願人】（５０６２６３３９８）シーエムエス・ペプチズ・パテント・ホールディング・カンパニー・リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＭＳ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｈｏｌｄｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【分割の表示】特願２００３−５１２２６２（Ｐ２００３−５１２２６２）の分割
【原出願日】平成１４年７月１１日（２００２．７．１１）
【出願人】（５０６２６３３９８）シーエムエス・ペプチズ・パテント・ホールディング・カンパニー・リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＭＳ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｈｏｌｄｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
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