異所性妊娠の同定
【課題】異所性妊娠の誤診等の問題を取り除く又は軽減すること。
【解決手段】本発明は、子宮外（又は異所性）妊娠を同定する方法に関するものであり、子宮外妊娠のマーカーであることが今や知られるに至った特定の分子の存在について試料をスクリーニングすることを含む。
【解決手段】本発明は、子宮外（又は異所性）妊娠を同定する方法に関するものであり、子宮外妊娠のマーカーであることが今や知られるに至った特定の分子の存在について試料をスクリーニングすることを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮外（又は異所性）妊娠を同定する方法に関するものであり、子宮外妊娠のマーカーであることが今や知られるに至った特定の分子の存在について試料をスクリーニングすることを含む。
【背景技術】
【０００２】
妊娠の全てのうちのわずかな比率のものが子宮外の位置で起き、別名では異所性妊娠として知られている。英国では年間およそ１２，０００症例の異所性妊娠がある（１）。
【０００３】
子宮外または異所性の妊娠は、免疫学的かつ形態学的に正常な胚が異常に着床した場合に起きる。典型的には、受精した胚の着床は、子宮の外側で起き、これには、卵管内の着床（卵管妊娠）が含まれ得るが、着床は他の位置でも起こる可能性がある。
【０００４】
子宮外の着床の素因である病原性事象は依然として不明である。卵管のような異所性部位での胚の着床は、外来病原体に対する正常な宿主免疫応答が破壊された結果のようである。脱落膜化（妊娠と共に起きる子宮内膜の変化）は、妊娠の成功の鍵となる免疫学的要素である。子宮外妊娠に伴って、子宮腔では脱落膜反応があるが、普通、卵管ではそれはない。
【０００５】
異所性妊娠の誤診は、結果的に死につながる可能性がある。現在、異所性妊娠は、患者の一般症状（出血及び痛みの存在を特に重視）、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の繰り返し（連続）試験、並びに経膣超音波（子宮内妊娠があるかどうかの確定のため）の評価によって診断される。これらの存在は、時間がかかり、国民医療サービスにとって財政的に、及び患者にとって心理的に犠牲が大きい。さらに、それらはしばしば、診断を確定するために、腹腔鏡検査（キーホール手術）についての不要な必要性を生じ、その固有の危険性を伴う（４）。さらに、異所性妊娠全てのうちの半分は、診断されないか、又は誤診されるかのいずれかである。初期の診断が、卵管の完全性の最適な保存（将来の受精能を失わないように）のために、及び生命を脅かす腹部出血の可能性を防ぐために必須である（２）。従って、新しい診断法を確立する重要な意欲がある。
【０００６】
プレゲノム時代では、一つずつの科学的なアプローチは、異所性妊娠に血液検査として使用され得るマーカーの解明に成功しなかった（５〜７）（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｒｋｈａｈｎ ＲＨら、Ａｎｎ Ｅｍｅｒｇ Ｍｅｄ ２００１ ３８（６）：６２８−３２．
【非特許文献２】Ｗｅｇｎｅｒ ＮＴら、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２００１ １８４（６）：１０７４−６．
【非特許文献３】Ｄｅｖｅｌｉｏｇｌｕ ＯＨら、Ｂｒｉｔ Ｊ Ｏｂｓ Ｇｙｎ ２００２ １０９（２）：１２１−８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、前述の問題のうちの少なくとも１つを取り除く又は軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、異所性又は子宮外妊娠、特に例えば、卵管妊娠を同定する改善された方法を提供する。具体的には、この方法は、被験体によって提供された試料中の特定の遺伝子及び／又はタンパク質のレベルを同定し、それらの遺伝子及び／又はタンパク質のレベルが異所性妊娠の指標であるかどうかを決定することを必要とする。
【００１０】
従って、第１の態様では、本発明は異所性妊娠を同定する方法を提供し、本方法は、
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）試料中の以下の１以上のレベルを同定する工程とを含み、
（ｉ）インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子
（ｉｉ）アクチビンＢ
（ｉｉｉ）システイン−リッチ分泌型タンパク質３（ＣＲＩＳＰ−３）及び／又は
（ｉｖ）カルボキシペプチダーゼ−Ｂ１（ＣＰＢ１）
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である。
【００１１】
本明細書で使用されるとき、用語「インヒビン／アクチビンβＢサブユニット」及び／又は「アクチビンＢ」は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニットをコードする遺伝子及び／又はそのタンパク質産物（即ち、アクチビンＢ）のいずれかを指し示すことを意図することが理解されるべきである。さらに、用語「レベル」又は「量」は、遺伝子及び／又はタンパク質発現のレベル又は量に関係すると理解すべきであることが理解されるべきである。
【００１２】
さらに、本明細書で使用されるとき、用語「ＣＲＩＳＰ−３」及び／又は「ＣＰＢ１」は、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする遺伝子及び／又はそのタンパク質産物（即ち、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１）のいずれかを指し示すことを意図することが理解されるべきである。ＣＲＩＳＰ−３は、別名では、２８ｋＤａの特異的顆粒タンパク質（ＳＧＰ２８）として知られ得ることに留意することが重要である。それは、精漿、前立腺、膵臓、好中球、唾液、汗及び血液で見出されているが、そのタンパク質の機能についてはほとんど知られておらず、作用の一般的様式も記載されていない（Ｂｊａｒｔｅｌｌ Ａら Ｐｒｏｓｔａｔｅ．２００６ ６６（６）：５９１−６０３；Ｕｄｂｙ Ｌら Ｊ Ａｎｄｒｏｌ．２００５ ２６（３）：３３３−４２）。ＣＰＢ１又はカルボキシペプチダーゼＢ１は、膵臓傷害に関連して研究されてきた（Ａｐｐｅｌｒｏｓ Ｓら Ｇｕｔ．１９９８ ４２：９７−１０２；Ａｐｐｅｌｒｏｓ Ｓら Ｂｒ Ｊ Ｓｕｒｇ ２００１ ８８：２１６−７）。それは、炎症応答を刺激すると考えられており、血漿及び尿中に見出されている。
【００１３】
異所性妊娠を同定するために、当業者が、被験体によって提供された試料中の、本明細書中に記載された物質（遺伝子及び／又はタンパク質）のいずれか１つのレベルを同定することを選択し得ることが理解されるべきである。あるいは、被験体によって提供された同じ又は多数の異なる試料中の前述の物質のいずれか２以上のレベルを同定してもよい。
【００１４】
実施態様の１つでは、被験体によって提供される試料は、例えば、全血、血漿、血清、唾液、汗及び／又は尿を含んでいてもよい。好ましくは、試料は、全血、血清及び／又は血漿を含む。さらに、又は代わりに、試料は、特定の組織に由来する生検、小片又は塗抹標本を含んでいてもよい。例示としては、及び実施態様の１つでは、試料は、子宮脱落膜を含んでいてもよい。さらなる実施態様では、試料は、分泌物又は洗浄物を含んでいてもよい。例えば、試料は、膣又は子宮の分泌物を含んでいてもよい。
【００１５】
本発明は、哺乳類の被験体、特にヒトにおける異所性妊娠の同定において特定の適用を有する。
【００１６】
本明細書中に記載される方法によって試験される被験体は、最初に、特定の症状を示していてもよく、従って、異所性妊娠を有することが疑われていてもよい。異所性妊娠の指標である症状としては、例えば、軽い／激しい痛み、軽い／激しい膣出血、超音波にて検知できない子宮内妊娠、及び異常なレベルの連続的血清ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）レベル（例、４８時間にわたって倍増しない）が挙げられる。あるいは、被験体は、無症状であってもよく、さらなる実施態様では、被験体は、異所性妊娠を発生するリスクがあってもよく、又はその素因があってもよい。
【００１７】
異所性妊娠を有すると同定された被験体では、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体のいずれかにおけるインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現のレベルと比較した場合、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現のレベルが低下することが理解されるべきである。同様に、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体のいずれかに存在するアクチビンＢのレベル（例えば、全身性のレベル）と比較した場合、アクチビンＢのレベル（特に、全身性のレベル）は低下する。
【００１８】
異所性妊娠を有すると同定された被験体では、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体のいずれかに存在するＣＲＩＳＰ−３のレベルと比較した場合、ＣＲＩＳＰ−３のレベルは上昇し得る。さらに、異所性妊娠を有すると同定された被験体におけるＣＰＢ１のレベルは、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体のいずれかに存在するＣＰＢ１のレベルと比較した場合、低下する。
【００１９】
従って、異所性妊娠を同定するために、当業者は、本明細書中に記載される方法のいずれかから得られた結果（即ち、被験体によって提供された試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベル）を、参照又は対照試料中の同じタンパク質及び／又は遺伝子のレベルと、又は参照値と比較してもよい。
【００２０】
従って、実施態様の１つでは、本発明は、異所性妊娠を同定する方法を提供し、本方法は、
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）試料中の以下の１以上のレベルを同定する工程と、
（ｉ）インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子
（ｉｉ）アクチビンＢ
（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰ−３及び／又は
（ｉｖ）ＣＰＢ１
（ｃ）試料中で同定されたインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを、参照試料中で同定されたインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベル、又は参照値と比較する工程とを含み、
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である。
【００２１】
「参照試料」は、妊娠していない被験体、又は正常な、即ち、進行中の子宮内妊娠を有する（超音波により子宮腔内に胎児性心臓および胎児性ポール（ｆｏｅｔａｌ ｐｏｌｅ）が見られる）、若しくは不全の子宮内妊娠を有する（子宮腔内に胎児性心臓はないが、胎児性ポールはある）被験体（参照被験体）に由来する試料であるとみなされ得る。好ましくは、参照試料は、被験体に由来する試料と同じ種類の試料であるべきである。例えば、被験体によって提供される試料が血液血漿を含む又はそれからなる場合には、参照試料もそのようにあるべきである。有利なことには、被験体により提供される試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルは、それぞれ異なる参照被験体に由来する多数の参照試料中の同じタンパク質及び／又は遺伝子のレベルと比較されてもよい。
【００２２】
参照値は、参照試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを表すとみなされ得る。有利なことには、参照値は、多数の異なる参照被験体に由来する多数の参照試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルの平均値を表してもよい。
【００２３】
実施態様の１つでは、被験体によって提供された試料で同定されたインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルはまた、異所性妊娠を有することが把握されている被験体に由来する試料中の同じタンパク質及び／又は遺伝子のレベルと比較されてもよい。このような試料は、別名では、陽性対照として知られ得る。
【００２４】
要約すれば、参照試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現レベルよりも低いインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現レベルを示す試料は、子宮外妊娠を有する被験体に由来し得る。参照試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現レベルと同等以上であるインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現のレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有さない被験体に由来し得る。参照試料中に存在するアクチビンＢのレベルよりも低いアクチビンＢのレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有する被験体に由来し得る。参照試料中に存在するアクチビンＢのレベルと同等以上のアクチビンＢのレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有さない被験体に由来し得る。
【００２５】
例示としては、参照試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現レベルと比べた場合、試験した試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現の量における約１％の低下が、子宮外妊娠を示してもよい。好ましくは、試験した試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現の量における約２％、さらに好ましくは約５％、一層さらに好ましくは約１０％の低下が、子宮外妊娠を示してもよい。他の場合には、少なくとも約１５％〜約１００％の低下が子宮外妊娠の指標である。
【００２６】
参照試料中に存在するアクチビンＢのレベルと比べた場合、試験した試料中のアクチビンＢの量における約１％の低下が、子宮外妊娠を示してもよい。好ましくは、試験した試料中のアクチビンＢの量における約２％、さらに好ましくは約５％、一層さらに好ましくは約１０％、尚一層好ましくは約２０％の低下が、子宮外妊娠を示してもよい。他の場合には、アクチビンＢの量における少なくとも約３０％〜約１００％の低下が、子宮外妊娠の指標である。
【００２７】
参照試料中に存在するＣＲＩＳＰ−３のレベルより高いＣＲＩＳＰ−３のレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有する被験体に由来し得る。参照試料中に存在するＣＲＩＳＰ−３のレベルと同等以下であるＣＲＩＳＰ−３のレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有さない被験体に由来し得る。参照試料中に存在するＣＢＰ１のレベルより低いＣＢＰ−１のレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有する被験体に由来し得る。参照試料中に存在するＣＢＰ１のレベルと同等以上であるＣＢＰ−１のレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有さない被験体に由来し得る。
【００２８】
例示としては、参照試料中に存在するＣＲＩＳＰ−３のレベルと比べた場合、試験した試料中のＣＲＩＳＰ−３の量における約１％の増加が、子宮外妊娠を示してもよい。好ましくは、試験した試料中のＣＲＩＳＰ−３の量における約１０％、さらに好ましくは約１００％、一層さらに好ましくは約１０００％の増加が、子宮外妊娠を示してもよい。典型的には、少なくとも約１０％〜約１０００％の増加が、子宮外妊娠の指標である。
【００２９】
参照試料中に存在するＣＰＢ１のレベルと比べた場合、試験した試料中のＣＰＢ１の量における約１％の低下が、子宮外妊娠を示してもよい。好ましくは、試験した試料中のＣＲＩＳＰ−３の量における約１０％、さらに好ましくは約１００％、一層さらに好ましくは約１０００％、尚一層さらに好ましくは約３０００％の低下が、子宮外妊娠を示してもよい。
【００３０】
当業者は、上記で列記されたもののような試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のようなタンパク質及び／又は遺伝子のレベルの同定に使用され得る技術に精通しているであろう。
【００３１】
実施態様の１つでは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤を利用する、免疫学的技術のような技術によって同定されてもよい。そのような方法は特に、特定のタンパク質のレベルを同定するために適する。
【００３２】
実施態様の１つでは、本発明は、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の基材への会合、相互作用、結合及び／又は固定を可能にする条件下で、試験されるべき試料に、前記基材（又はその一部）を接触させる工程を含む方法を提供してもよい。
【００３３】
好適な基材としては、例えば、ガラス、ニトロセルロース、紙、アガロース及び／又はプラスチックが挙げることができる。例えば、プラスチック材料のような基材はマイクロタイタープレートの形態を取ってもよい。当業者は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１からなる群のうちの２以上のレベルを試料中で同定すべき場合、１以上の基材を使用してもよいことを理解するであろう。例えば、物質の前述の群の２つのレベルを同定すべき場合、２つの基材を使用してもよく、検出される各物質につき１つを使用してもよい。
【００３４】
あるいは、試験されるべき試料に接触される基材は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤を含んでいてもよい。好ましくは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤は、基材（又はその少なくとも一部）に結合される。好適な結合剤には、例えば、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得るモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のような抗体（又はその抗原結合断片）、オリゴヌクレオチド及び／又はその他の種類のペプチド又は低分子が挙げられてもよい。この定義は、本明細書中で言及されるあらゆる種類の結合剤に適用されることが理解されるべきである。従って、基材（又はその一部）は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤と、試料中に存在する任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１との間の結合又は相互作用を可能にする条件下で、試験されるべき試料に接触されてもよい。
【００３５】
基材に結合した任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１、又はインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得るさらなる剤（本明細書では以降、「一次結合剤」と呼ぶ）の使用によって検出されてもよい。さらに、又は代わりに、一次結合剤は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１と基材との複合体、あるいはインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１と、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る前述の剤とを含む複合体に対して、親和性を有してもよく、又は結合してもよい。
【００３６】
一次結合剤は、その検出を可能にする部分（本明細書では以降、「検出可能部分」と呼ぶ）に結合し得る。例えば、一次剤は、比色化学発光反応を介してレベルを伝え得る酵素に結合し得る。そのような結合される酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＫＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、又は代わりに、一次結合剤は、例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン又はテキサスレッドのような蛍光体（特にオリゴヌクレオチドの標識に有用）のような蛍光分子に結合し得る。結合剤に結合してもよいその他の種類の分子には、放射性標識部分が挙げられる。
【００３７】
あるいは、基材に結合した任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１、あるいはインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤は、一次結合剤に対して親和性を有する、なおさらなる結合剤（本明細書では以降、「二次結合剤」と呼ぶ）によって検出されてもよい。好ましくは、二次結合剤は、検出可能部分に結合される。
【００３８】
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１に結合した一次結合剤（又はそれに結合した二次結合剤）の量は、試験された試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを表し得る。
【００３９】
実施態様の１つでは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを同定する前述の方法は、「浸漬スティック（ｄｉｐ−ｓｔｉｃｋ）」試験の形態を取ってもよく、その際、１以上の基材（又はその一部）が、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の基材又はそれに結合した若しくは固定された結合剤への結合を可能にする条件下で、試験されるべき１以上の試料に接触される。
【００４０】
さらなる実施態様では、方法は、例えば、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような免疫学的アッセイの形態を取ってもよい。ＥＬＩＳＡは、「捕捉」ＥＬＩＳＡの形態を取ってもよく、その際、試験されるべき試料が、基材に接触され、そして試料中に存在する任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１が、基材に結合された又は固定された（インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る）結合剤によって、「補足される」又は結合される。あるいは、試料は、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１と基材との間で「直接」結合を可能にする条件下で、基材に接触されてもよい。
【００４１】
上記のＥＬＩＳＡ法のそれぞれが、「直接」のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の検出工程、又は「間接」の同定工程を含んでいてもよい。そのような工程を利用するＥＬＩＳＡは、「直接」ＥＬＩＳＡ又は「間接」ＥＬＩＳＡとして知られてもよい。
【００４２】
「直接」ＥＬＩＳＡには、試料中に存在する任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の基材及び／又はそれに結合した結合剤への結合を可能にする条件下で、試験されるべき試料を基材に接触させることが含まれてもよい。任意のブロッキング工程の後、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤（すなわち、一次結合剤）を手段として、結合させたインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を検出してもよい。好ましくは、一次結合剤は、検出可能部分に結合させる。
【００４３】
「間接」ＥＬＩＳＡは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を一次結合剤と接触させた後、一次結合剤に親和性又は特異性を持つさらなる結合剤（二次結合剤）を用いるさらなる工程を含んでいてもよい。好ましくは、二次結合剤は、検出可能部分に結合させてもよい。
【００４４】
試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを同定するために使用してもよいその他の免疫学的技術には、例えば、免疫組織化学が挙げられ、その際、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１と、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１との間での結合を可能にする条件下で、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る抗体のような結合剤を、試料、好ましくは組織試料と接触させる。典型的には、試料を結合剤と接触させるのに先立って、例えば、トリトンＸ１００のような界面活性剤で試料を処理する。そのような技術は、「直接」免疫組織化学染色と呼ばれ得る。
【００４５】
あるいは、試験されるべき試料を、間接免疫組織化学染色プロトコルに供してもよく、その際、試料を、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の結合剤に接触させた後、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１結合剤に特異性がある、親和性がある又はそれを結合し得るさらなる結合剤（二次結合剤）を用いて、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１と結合剤との複合体を検出する。
【００４６】
熟練者は、直接及び間接双方の免疫組織化学技術において、結合剤又は二次結合剤を検出可能部分に結合させてもよいことを理解するであろう。好ましくは、結合剤又は二次結合剤は、比色化学発光反応を介して、結合した結合剤又は二次結合剤のレベルを伝えることが可能である部分に結合される。
【００４７】
試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを同定するために、免疫組織化学染色の結果を、参照試料で実施した免疫組織化学染色の結果と比較してもよい。例示としては、参照試料よりも結合したインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子結合剤（又は二次結合剤）が少ないことを示す試料は、異所性妊娠の被験体によって提供されたものであってもよい。参照試料よりも結合したアクチビンＢ結合剤（又は二次結合剤）が少ないことを示す試料は、異所性妊娠の被験体によって提供されたものであってもよい。参照試料よりも結合したＣＲＩＳＰ−３結合剤（又は二次結合剤）が多いことを示す試料は、異所性妊娠の被験体によって提供されたものであってもよい。参照試料よりも結合したＣＢＰ１結合剤（又は二次結合剤）が少ないことを示す試料は、異所性妊娠を有さない被験体によって提供されたものであってもよい。
【００４８】
参照試料で同定された結合剤（又は二次結合剤）の量と同等以上であるインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子結合剤（又は二次結合剤）の量を示す試料は、異所性妊娠を有さない被験体に由来したものであってもよい。参照試料で同定された結合剤（又は二次結合剤）の量と同等以上であるアクチビンＢ結合剤（又は二次結合剤）の量を示す試料は、異所性妊娠を有さない被験体に由来したものであってもよい。参照試料で同定された結合剤（又は二次結合剤）の量と同等以下であるＣＲＩＳＰ−３結合剤（又は二次結合剤）の量を示す試料は、異所性妊娠を有さない被験体に由来したものであってもよい。参照試料で同定された結合剤（又は二次結合剤）の量と同等以上であるＣＢＰ１結合剤（又は二次結合剤）の量を示す試料は、異所性妊娠を有さない被験体に由来したものであってもよい。
【００４９】
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤の使用を活用するその他の技術には、例えば、ウエスタンブロット又はドットブロットのような技術が挙げられる。ウエスタンブロットには、例えば、試料のタンパク様成分及び／又は核酸成分のような成分を分離又は分解するために、試料を電気泳動に供することが含まれる。次いで分解された成分を、例えば、ニトロセルロースのような基材上に移してもよい。試料中に存在する任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を同定するために、試料中に存在する任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１と、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤との間の結合を可能にする条件下で、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る結合剤に基材を接触させてもよい。
【００５０】
有利なことには、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤を、検出可能部分に結合させてもよい。
【００５１】
あるいは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る結合剤に親和性を有するさらなる結合剤に基材を接触させてもよい。有利なことには、さらなる結合剤を、検出可能部分に結合させてもよい。
【００５２】
ドットブロットの場合、試料中に存在する任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１が基材上に結合されるように、又は基材上に固定されるように、試料又はその一部を、基材に接触させてもよい。結合された又は固定された任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の同定は、上述のように行われてもよい。
【００５３】
前述の技術のいずれにおいても、検出される一次又は二次の結合剤の量は、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の量を表すか、又はそれに比例する。
【００５４】
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを同定するために使用してもよいその他の技術には、例えば、リアルタイムＰＣＲ（別名では定量的ＰＣＲとして知られる）のようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技術が挙げられる。そのような技術を用いて、特定の核酸配列が試料中に存在するのかどうか、及びその核酸の発現のレベルを決定してもよい。この場合、リアルタイムＰＣＲを用いて、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子の核酸配列、又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする核酸配列が試料中に存在するのかどうか、及びそれらの核酸配列の発現のレベルを決定してもよい。典型的には、及び特定の核酸配列の発現のレベルを定量するために、逆転写酵素ＰＣＲを用いて、関連するｍＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写してもよい。好ましくは、逆転写酵素のプロトコルは、目的のｍＲＮＡ配列を特異的に増幅するように設計されたプライマーを使用してもよい。その後、ＰＣＲを用いて、逆転写によって生成されたｃＤＮＡを増幅してもよい。
【００５５】
典型的には、特定の配列と特異的にハイブリダイゼーションを行うように設計されたプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅し、ＰＣＲに使用されるヌクレオチドを、蛍光化合物又は放射性標識された化合物で標識してもよい。
【００５６】
当業者は、ＰＣＲの間に生成されたＤＮＡの量を定量することを可能にする標識ヌクレオチドを用いる技術に精通するであろう。手短には、及び例示としては、標識され増幅された核酸の量を、ＰＣＲサイクル中に取り込まれた標識ヌクレオチドの量をモニターすることによって決定してもよい。
【００５７】
好ましくは、得られた結果を、参照試料から得られた結果と比較してもよい。
【００５８】
本明細書で記載されるＰＣＲに基づく技術のさらなる情報は、例えば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃａｒｌ Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｇａｂｒｉｅｌａ Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編による、実験室マニュアル（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｄａｖｉｄ Ｒｕｓｓｅｌｌによる実験室マニュアル、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に見出され得る。
【００５９】
試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを決定するために使用してもよいその他の技術には、例えば、ノザンブロット法及び／又はサザンブロット法が挙げられる。ノザンブロットを用いて試料中に存在する特定のｍＲＮＡの量を決定し得るので、それを用いて、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする核酸の量を決定してもよい。簡単に言えば、当業者に既知の技術を用いて試料からｍＲＮＡを抽出し、電気泳動に供してもよい。次いで、目的のｍＲＮＡ（この場合、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子に由来するｍＲＮＡ又はアクチビンＢタンパク質をコードするｍＲＮＡ）にハイブリッドする（すなわち、それに相補的である）ように設計された核酸プローブを用いて試料中に存在する特定のｍＲＮＡを検出し、その量を定量してもよい。有利なことには、得られた結果を、参照試料から得られた結果と比較してもよい。
【００６０】
同様に、サザンブロットを用いて、試料中の任意の所定のＤＮＡ配列の存在及び量を検出してもよく、それを用いて、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子の配列、及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする核酸配列を検出してもよい。簡単に言えば、試料から核酸を抽出し、断片化プロトコルに供し、電気泳動によって分離し、核酸プローブによって特定配列の存在について探査してもよい。この場合、核酸プローブは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子の核酸配列、及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする核酸の配列とハイブリダイゼーションしてもよい（すなわち相補的）。有利なことには、得られた結果を、参照試料から得られた結果と比較してもよい。
【００６１】
追加的に、又は交換的に、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルは、マイクロアレイ解析の手段によって同定されてもよい。そのような方法には、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子に由来する核酸及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする核酸を含むＤＮＡのマイクロアレイの使用が含まれる。試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを同定するために、当業者は、試料から核酸、好ましくはｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素ＰＣＲのような増幅プロトコルにそれを供し、ｃＤＮＡを生成してもよい。好ましくは、特定のｍＲＮＡ配列（この場合、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子の配列及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする配列）に特異的なプライマーを使用してもよい。
【００６２】
増幅された（インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする遺伝子）ｃＤＮＡは、必要に応じて、標識ヌクレオチド（上述のような）の存在下で、さらなる増幅工程に供されてもよい。その後、マイクロアレイのＤＮＡとの結合を可能にする条件下にて、必要に応じて標識され、増幅されたｃＤＮＡを、マイクロアレイと接触させてもよい。このように、試験された試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現レベル及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする遺伝子発現レベルを同定することが可能であってもよい。有利なことには、得られた結果を、参照試料から得られた結果と比較してもよい。
【００６３】
上述の技術に関するさらなる情報は、例えば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃａｒｌ Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｇａｂｒｉｅｌａ Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編による、実験室マニュアル（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｄａｖｉｄ Ｒｕｓｓｅｌｌによる実験室マニュアル、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に見出され得る。
【００６４】
実施態様の１つでは、異所性妊娠を同定するさらに信頼できる方法を提供するために、本発明によって提供される方法を、既存の診断法と組み合わせてもよい。例えば、本方法を、連続ｈＣＧアッセイ、超音波法及び／又は腹腔鏡検査と組み合わせてもよい。
【００６５】
当業者は、本明細書で記載される方法が多数のアッセイを提供し、そのそれぞれが異所性妊娠を同定し、及び／又は診断するために使用されてもよいことを十分に理解するであろう。任意の所定のアッセイがインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１からなる群より選択される１つの物質のレベルの同定を含んでいてもよい一方で、ユーザーは、前述の物質の２以上のレベルの同定を含むアッセイを実施したいと考え得ることが理解されるべきである。当業者は、２以上の前述の物質（すなわち、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１）のレベルを同定するアッセイが異所性妊娠をさらに迅速及び／又は正確に同定及び／又は診断し得る方法を提供し得ることを十分に理解するであろう。
【００６６】
上記に加えて、インヒビンαサブユニットの発現レベルにおける変化も異所性妊娠の指標であり得ることが理解されるべきである。従って、本明細書中に記載される方法及び手順のそれぞれはインヒビンαのレベルとも関係し、異所性妊娠の場合、そのレベルは、低下したレベル（対照、又は上述のような参照試料との比較）で検出されてもよい。さらに、インヒビンαのレベルの同定を含む方法は、例えば、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の同定に関する、本明細書で記載される方法のいずれか又は全てと組み合わせられてもよいことが理解されるべきである。
【００６７】
本発明者らはまた、天然の抗菌ペプチドである分泌型白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）及びエラフィンのレベルが異所性妊娠又は卵管妊娠の被験体で上昇することを発見した。従って、本明細書中に記載される方法及び／又は技術のいずれかは、被験体によって提供される試料中のＳＬＰＩ及び／又はエラフィンのレベルを同定することを含む異所性妊娠を同定する方法を包含する（又はそれに関して必要とされる）ようにさらに拡大されてもよく、その際、試料中のＳＬＰＩ及び／又はエラフィンのレベルは、異所性妊娠の指標である。当業者は、被験体から得られた試料中のタンパク質を同定するために好適な、本明細書中に記載される技術のいずれか（例えば、免疫学的技術及び／又はＰＣＲに基づいた技術）を用いてＳＬＰＩ及び／又はエラフィンのレベルを同定してもよいことを十分に理解するであろう。さらに、ＳＬＰＩ及び／又はエラフィンのレベルの同定を含む方法は、例えば、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１及び／又はインヒビンαの同定に関する、本明細書で記載される方法のいずれか又は全てと組み合わせられてもよいことが理解されるべきである。
【００６８】
上記に加えて、本発明者らは、異所性妊娠又は卵管妊娠の被験体でプロラクチンのレベルが低下することに気付いた。従って、本明細書中に記載される方法及び／又は技術のいずれかは、被験体によって提供される試料中のプロラクチンのレベルを同定することを含む異所性妊娠を同定する方法を包含する（又はそれに関して必要とされる）ようにさらに拡大されてもよく、その際、試料中のプロラクチンのレベルは、異所性妊娠の指標である。当業者は、被験体から得られた試料中のタンパク質を同定するために好適な、本明細書中に記載される技術のいずれか（例えば、免疫学的技術及び／又はＰＣＲに基づいた技術）を用いてプロラクチンのレベルを同定してもよいことを十分に理解するであろう。さらに、プロラクチンのレベルの同定を含む方法は、例えば、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ及び／又はエラフィンの同定に関する、本明細書で記載される方法のいずれか又は全てと組み合わせられてもよいことが理解されるべきである。
【００６９】
例示としては、及び実施態様の１つでは、異所性妊娠を同定する方法は、被験体由来の１以上の試料を提供し、前記試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンの１以上のレベルを同定する工程を含んでいてもよい。
【００７０】
上記に加えて、及び本明細書で言及された物質（遺伝子及びタンパク質）のレベルが妊娠、特に異常な妊娠に関連付けられるという事実を考慮すると、本明細書に記載された方法のいずれかを用いて妊娠及び／又は異常な妊娠を同定する及び／又は診断することが可能であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】子宮脱落膜におけるインヒビン／アクチビンサブユニットｍＲＮＡの発現：ａ）βＢサブユニットは、差示的に発現する（ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。流産の外科的処置（Ｍｉｓｃ）（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）及び外科的妊娠中絶（ＴＯＰ）（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）を受けている女性のものと比べた場合、卵管異所性妊娠（異所性）の女性ではそれは低下している。ｂ）これらの群でβＡの発現には差異はなかった（ＡＮＯＶＡ）。ｃ）αサブユニットは、群で差示的に発現し（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）、流産よりも異所性妊娠で発現は低かった（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。
【図２】インヒビン／アクチビンのαサブユニットとβＡサブユニットについての免疫組織化学：ａ）妊娠顆粒膜黄体細胞（ＧＬＣ）における局在（茶色）及び周辺の間質（Ｓｔ）における非染色を示す陽性対照としての、αサブユニットについて免疫染色されたヒト黄体。ｂ）間質（Ｓ）におけるより明るい染色を伴う、脱落膜化した組織（Ｇ）の子宮内膜腺におけるαサブユニットについての染色。ｃ）近隣の卵胞膜細胞（ｔｃ）における弱い染色を伴う、顆粒膜細胞（ｇｃ）における顕著な染色（茶色）を示す陽性対照としての、βＢサブユニットについて免疫染色されたヒト卵胞。ｄ）幾らかの腺（Ｇ）及び間質（Ｓ）局在を示す脱落膜におけるβＢサブユニットについての染色。ｅ）腺上皮（Ｇ）における細胞質染色及び間質細胞（Ｓ）における最小染色を示す卵管異所性妊娠の女性からの脱落膜βＢサブユニットの局在。ｆ）間質細胞（Ｓ）におけるより強い免疫染色の証拠を伴う、腺における同様の発現パターンを示す流産の外科的処置を受けている女性からの子宮脱落膜。ｇ）腺上皮（Ｇ）及び間質細胞（Ｓ）の双方でのβＢ免疫局在を示すＴＯＰを受けている女性からの子宮脱落膜。腺（Ｇ）又は間質（Ｓ）における特異的な免疫染色を示さない（ｇ）の陰性対照部分。スケール・バー＝５０μｍ（１００μｍであるｃ）を除く）。
【図３】インビトロにおける子宮内膜間質細胞の脱落膜化の間のインヒビン／アクチビンのサブユニットｍＲＮＡの発現。ａ）βＢの発現は、脱落膜化の間に増加した（ｐ＜０．０５）（ＡＮＯＶＡ、ピアソン相関）。ｂ）αサブユニットの発現も増加した（ｐ＜０．０５）が、顕著な程度ではない（ＡＮＯＶＡ、ピアソン相関）。ｃ）βＡサブユニットの発現には差異はなかった（ＡＮＯＶＡ、ピアソン相関）。Ｔ１＝０時間、Ｔ２＝２４時間、Ｔ３＝４８時間、Ｔ４＝７２時間、Ｔ５＝９６時間、Ｔ６＝１２０時間。
【図４】インビボにおける子宮内膜の脱落膜化の程度の形態学的評価。ａ）流産の外科的処置（Ｍｉｓｃ）、妊娠中絶（ＴＯＰ）及び卵管異所性妊娠（異所性）から回収した子宮内膜における腺上皮の分泌変化及び間質の脱落膜化のレベルのスコア化。ｂ）生検脱落膜化の形態学的程度の分類（＋、＋／−、−）は、異所性妊娠の子宮内膜があまり脱落膜化されないことを示した（ｐ＜０．０５、カイ２乗）。ｃ）脱落膜化のレベル（−、＋／−、＋）と脱落膜のインヒビン／アクチビンβＢ発現との間の相関（ｐ＝０．０００５、スピアマン相関）。
【図５】脱落膜化の鍵となるマーカーの発現。ａ）ＩＧＦＢＰ１の発現は、群間で異なっていた（ｐ＜０．００５、クラスカル・ウォリス）。流産（Ｍｉｓｃ）（ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス）又は妊娠中絶（ＴＯＰ）（ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス）と比べた場合、それは、卵管異所性妊娠（異所性）でさらに低かった。ｂ）プロラクチンの発現も、群間で異なる（ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス）。妊娠中絶と比べた場合、それは、異所性妊娠でさらに低かった（ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス）。
【図６】血清アクチビンＢ及びプロゲステロン濃度。ａ）流産（Ｍｉｓｃ）及び妊娠中絶（ＴＯＰ）と比べた場合、血清アクチビンＢは、卵管異所性妊娠（異所性）で最も低い（ｐ＝０．００１、ＡＮＯＶＡ）。ｂ）血清アクチビンＢは、子宮内妊娠（ＩＵＰ）より卵管妊娠（ＥＰ）のほうが低い（ｐ＜０．００５、ｔ−検定）。ｃ）アクチビンＢと脱落膜化の程度（＋、＋／−、−）との間に相関がある（ｐ＝０．００５、スピアマン相関）。ｄ）血清プロゲステロンは、流産で最も低い（ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス）。ｅ）子宮内妊娠を卵管妊娠と比べた場合、プロゲステロン濃度に差異はなかった（ｔ−検定）。ｆ）脱落膜化の程度と血清プロゲステロンの濃度との間に相関はなかった（スピアマン相関）。
【図７】子宮内（ＳＴＯＰ及び流産）妊娠、並びに子宮外（卵管）妊娠の女性からの子宮脱落膜におけるＣＲＩＳＰ−３（図７ａ）及びＣＰＢ１（図７ｂ）のレベルを実証する定量的ＲＴ−ＰＣＲ。
【図８】卵管妊娠の子宮脱落膜におけるＣＲＩＳＰ３についての免疫組織化学。腺上皮及び分泌物における最も強い発現。
【図９】外科的妊娠中絶（ＳＴＯＰ）、流産の外科的処置及び異所性妊娠の外科的処置を受けている女性からの子宮脱落膜における相対的ＳＬＰＩ（Ａ）及びエラフィン（Ｂ）ｍＲＮＡ発現のグラフによる表示。
【図１０】異所性妊娠の外科的処置、流産の外科的処置、及び外科的妊娠中絶（ＳＴＯＰ）を受けている女性からの子宮脱落膜における免疫組織化学によって実証されたＳＬＰＩ及びエラフィンタンパク質の発現。異所性妊娠の外科的処置（Ａ及びＢ）及び流産の外科的処置（Ｃ）を受けている女性からの子宮脱落膜の白血球（Ｌ）及び上皮腺（Ｇ）におけるＳＬＰＩタンパク質の発現。異所性妊娠の外科的処置（Ｄ）、流産の外科的処置（Ｅ）、及び外科的妊娠中絶（Ｆ）を受けている女性の脱落膜の白血球（Ｌ）集団におけるエラフィンタンパク質の発現。上皮腺における膜性エラフィンタンパク質の発現（Ｍ）は、Ｄでも見られる。ＳＬＰＩ及びエラフィンの陰性対照は、それぞれＧ及びＨに示される（双方とも、異所性妊娠の外科的処置を受けている女性からの子宮脱落膜）。スケール・バー＝５０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本発明は、添付の図面を参照して詳細に記載されているであろう。
【実施例】
【００７３】
実施例１
材料及び方法
組織の収集
この研究の倫理的な認可を、ロウジアン（Ｌｏｔｈｉａｎ）研究倫理委員会から得て、試料を収集する前に全患者から文書でのインフォームドコンセントを得た。外科的妊娠中絶（ＴＯＰ、ｎ＝８、第１群、平均妊娠期間５８．７日）、胎性喪失（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｍｉｓｓｅｄ）流産の外科的処置（ｎ＝６、第２群、平均妊娠期間５７．７日）及び卵管妊娠の外科的処置（ｎ＝１１、第３群、平均妊娠期間５８．１日）を受けている女性（年齢１８〜４５歳）から、妊娠三期のうちの第１期の脱落膜化した子宮内膜を得た。卵管異所性妊娠の外科的処置を受けた如何なる女性も、血流力学的ショックを実際に示さず、診断に先立って連続血清ベータ−ＨＣＧ及び超音波モニタリングを全て必要とした。脱落膜化した子宮内膜及び栄養膜は、第１群及び第２群から吸引掻爬術によって得た。脱落膜化した子宮内膜を、第３群から吸引子宮内膜生検（Ｐｉｐｅｌｌｅ（登録商標）、クランリー、ユーロサージカル社、英国）によって得た。脱落膜化した子宮内膜を、顕微鏡下で栄養膜から単離した。脱落膜化した子宮内膜を、（ａ）４℃にて一晩ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（アンビオン、テキサス、米国）中に浸漬し、次いで−７０℃で瞬間凍結し、（ｂ）４℃にて一晩、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、７０％エタノール中で保存し、ヘマトキシリン及びエオシン並びに免疫組織化学で染色するためにワックス包埋した。栄養膜の存在は、形態学的に、及び既報（１４）のようにサイトケラチンについての免疫組織化学染色の使用により除外した。子宮内膜試料を、定期的な月経周期（２８〜３５日）を有し、かつ妊娠していない女性（１８〜４５歳）から、良性の婦人科状態についての子宮摘出により得た（１５）。子宮内膜試料を室温で回収し、ＲＰＭＩ（ライフテクノロジーズ、米国）中で実験室に移し、以下に記載されるように子宮内膜間質細胞の単離のために処理した。
【００７４】
ＲＮＡの抽出
製造元のプロトコル（キアゲン、ウエストサセックス、英国）で詳説されたように全ＲＮＡを脱落膜化した子宮内膜から抽出した。アジレント・バイオアナライザを用いて、抽出したＲＮＡの濃度及び品質を評価した。品質管理のための全試料を標準化し、ＲＮＡ完全性番号（ＲＩＮ）を割り当てた。７．５の平均ＲＩＮ値が得られた場合、ＲＮＡは良好な品質であるとみなした（１６）。
【００７５】
マイクロアレイ解析
手短には、各試料から４μｇの全ＲＮＡを用いて、１サイクルｃＤＮＡ合成キット（アフィメトリクス、英国）を用いて二本鎖のｃＤＮＡを生成し、次いでジーンチップ・サンプル・クリーンアップ・モジュール（アフィメトリクス、英国）によって精製した。ビオチン標識ｃＲＮＡを生じるジーンチップＩＶＴ標識キット（アフィメトリクス、英国）を用いたインビトロ転写に、二本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いた。清浄化及び分光光度分析による定量に続いて、次いで精製されたビオチン化標的ｃＲＮＡを短い配列に断片化した。ハイブリダイゼーション・カクテルは、真核細胞ハイブリダイゼーション対照でスパイクされた１５μｇの断片化されたビオチン標識ｃＲＮＡからなるものであった。その後、８０μＬのハイブリダイゼーション・カクテルを、試験チップとハイブリダイズさせ、ｃＲＮＡの完全性をチェックし、システムの正確性を評価した。その後、ヒトＨＧ−Ｕ１３３プラス２．０マイクロアレイ（アフィメトリクス、英国）を、２００μＬのハイブリダイゼーション・カクテルで直接的にロードし、４５℃にて６０ｒｐｍで回転するジーンチップ・ハイブリダイゼーション・オーブン６４０（アフィメトリクス、英国）に１６時間入れた。ハイブリダイゼーションの後、ジーンチップ流体ステーション４５０（アフィメトリクス、英国）上でアレイを洗浄し、製造元のプロトコルに従ってジーンチップ・スキャナ３０００（アフィメトリクス、英国）を用いて走査した。試料標識処理の品質及び一貫性並びにアレイのハイブリダイゼーションを確実にするために、全２６アレイの対照情報を照合し、データ解析の前に見直したところ、全てがアフィメトリクスの推奨に一致することが判った。Ｒ統計プログラム環境へのバイオコンダクター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）拡張で実施されるロバストマルチアレイ平均アルゴリズム（１７）を用いて発現を計算した（１８）。ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）は、測定のｌｏｇ２スケール上で、バックグランドを補正し、かつ変位値をノーマライズした、発現の測定基準（１９）を生成する。アレイハイブリダイゼーションの性能をさらに検討するために、Ｒ統計プログラム環境へのバイオコンダクターへの拡張にて１つおきで各アレイを比較する散乱プロットを生成した。これらのプロットは、アレイ間の線形分布を裏づけ、低シグナル値から高シグナル値まで動的な連続した範囲の発現値を示した。箱髭図による視覚化によっても、データが匹敵する分布を有し、さらなる解析に十分な品質であることが確認された。データ及びプロトコルは、公にアクセスできるＭＩＡＭＥ対応のデータベース「ＧＰＸ」（ｗｗｗ．ｇｔｉ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ＧＰＸ、アクセス番号ＧＰＸ−００００６７．１）からダウンロードして利用できる。ＲＭＡによるデータのノーマライゼーションに続いて、６４という任意のシグナル強度閾値の値を用いて、データをフィルターにかけ、その後の統計解析で複数の試験誤差に寄与する不変転写物を除いた。試験解析に続いて、厳密な統計的アプローチを活用して、差示的に発現された遺伝子のサブセットを同定した。手短には、ｔ−検定による比較、次いでベンジャミニ・ホックベルグの偽発見検出法を用いた複数試験補正（２０）を用いて、子宮内妊娠試料と異所性妊娠試料との間で差示的に発現された遺伝子を同定した。次いで、＞２の倍率変化閾値、及び＜０．０５の補正ｐ値を用いて遺伝子リストを作成した。
【００７６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＱ１ ＤＮＡ分解酵素（プロメガ、サウサンプトン、英国）を用いてＤＮＡ分解酵素で処理した後、ランダムヘキサマー（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。次いでＴａｑｍａｎＱ−ＲＴ−ＰＣＲを用いて、プロラクチン及びインスリン様増殖因子結合タンパク質−１（ＩＧＦＢＰ１）、並びにインヒビンβＡサブユニット（Ｍ１３４３６）、インヒビンβＢサブユニット（Ｍ１３４３７）及びインヒビンαサブユニット（Ｍ１３１４４）について、アプライドバイオシステムズが事前に検証した「ａｓｓａｙ−ｏｎ−ｄｅｍａｎａｄ」特異的プライマー及びプローブ（ユーロゲンテック、サウサンプトン、英国）を用いて遺伝子のレベルを測定し（２１）、レベルをリボソーム１８Ｓ内部対照（アプライドバイオシステムズ）に関連付けた。試料は全て２つ一組で扱い、適当な対照組織のｃＤＮＡに対する相対的な比較を行った。２−△△Ｃｔ法を用いて、ｍＲＮＡの発現結果を１８Ｓに対してノーマライズし、対照（ＴＯＰ試料群）と比べた倍率変化として表した。
【００７７】
免疫組織化学
手短には、それぞれ英国オックスフォードのオックスフォードブルークス大学のＮ．Ｇｒｏｏｍｅ教授及び英国エディンバラのＭＲＣヒト生殖科学ユニットのＡｌａｎ ＭｃＮｅｉｌｌｙ教授によって開発され、かつ快く提供された抗体を用いて、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット及びα−インヒビンの免疫局在化を行なった。制御され、かつ容易に反復可能な様式で実験を行うために、Ｂｏｎｄ−Ｘ自動免疫染色機（ビジョンバイオシステムズ、ニューキャッスル、英国）を利用した。子宮脱落膜の５ミクロンのパラフィン切片を作製し、脱ワックス（ｄｅｗａｘ）し、再水和を行い、Ｂｏｎｄ−Ｘ機に載せる前に、０．０１モルの１−１クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて圧力調理抗原修復に供した。Ｂｏｎｄ−Ｘ自動機におけるこの方法は、特定のポリマーの高い対比プログラムを利用する。スライドを、ペルオキシダーゼで５分間ブロックし、供給された希釈剤で１：５００に希釈された一次抗体（４６Ａ／ＦβＢ：インヒビンβＢサブユニットに対するマウスモノクローナル抗体（２２））及びＡＳＭＲ１５０：α−インヒビンに対するウサギポリクローナル抗体（２３））と共に２時間インキュベートし、次いで一次後試薬と共に１５分間インキュベートした。抗体の特異性を確認するために、希釈剤のみと共に、又は供給された希釈剤中の一次抗体と同じ濃度に希釈された非特異的免疫グロブリンと共に、対照の切片をインキュベートした。次いでＤＡＢ検出に先立って、切片をポリマー試薬と共に１５分間インキュベートして検出の感度を高めた。ヘマトキシリンで５分間、切片を対比染色した。次いでスライドを機械から取り出し、脱水し、Ｐｅｒｔｅｘを用いて標本にした。
【００７８】
子宮内膜間質細胞の単離と培養
３７℃にて２時間のコラゲナーゼ／ＤＮＡ分解酵素（シグマ−アルドリッチ、米国）による消化に子宮内膜組織を供した。消化の後、間質を分散させたが、上皮構造はほとんど無傷のままであった。既報（２４）のように、ヒト子宮内膜の間質細胞を、サイズを基準に分離した。既報（Ｉｒｗｉｎら、１９９１）のように、２％ウシ胎児血清、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシンを伴ったＲＰＭＩ中で２．４×１０５個／ウェルの密度にて子宮内膜の間質細胞を６穴の標準培養プレートに入れた。酢酸メドロキシプロゲステロン（１０−６Ｍ）、エストラジオール（１０−７Ｍ）及び８−ブロモｃＡＭＰ（０．１ｍｇ／ｍｌ）によって２４、４８、７２、９６及び１２０時間、細胞を処理した。ＲＮＡ抽出のために各時点で細胞を回収した。
【００７９】
血清のアッセイ
標準の放射性免疫学的アッセイ（１５）を用いて血清のプロゲステロン濃度を測定した。試料のＳＤＳ及び熱による予備処理と共にモノクローナル抗体４６Ａ／Ｆ（捕捉及び検出双方の抗体として）（２２）の使用を組み入れるアクチビンＢのＥＬＩＳＡを用いてアクチビンＢの濃度を測定した（Ｌｕｄｌｏｗら、投稿準備中）。血清は希釈せずに試験し、アッセイは、１９ｐｇ／ｍＬのさらに低い検出限界を有した。
【００８０】
切片の分析
子宮内膜の変化の程度に従って、婦人科を専門分科とする病理学者によって、脱落膜化した子宮内膜の試料を盲検的に分類した。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎらの分類（２５）を用いて、腺上皮の分泌変化（非存在／初期、高及び枯渇（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ））及び間質の分化（非脱落膜化、脱落膜前、集密的脱落膜変化）をスコア付けした。集密的な間質の脱落膜化を伴った枯渇した腺性変化を持つ試料を全体として脱落膜化（＋）として分類し、非存在／初期の分泌変化及び非脱落膜の間質を伴う試料を脱落膜化（−）として分類し、その他の試料を脱落膜化（＋／−）として分類した。
【００８１】
統計的解析（マイクロアレイの解析以外の全データについて）
データが正常に分布した場合、ボンフェローニ・ペアワイズ比較と共にＡＮＯＶＡによって解析した。２つの群は、ｔ−検定によって解析した。データが正規分布しなかった場合、ダン・ペアワイズ比較と共にクラスカル・ウォリス検定を用いて３つの群を比較した。カイ２乗検定を用いて比率を比較し、スピアマン（ノンパラメトリック）又はピアソン（パラメトリック）の係数を用いて線形の相関を評価した。使用した統計的検定は、本文及び図の説明に提供するが、ｐ＜０．０５レベルで有意とした。
【００８２】
結果
脱落膜化した子宮内膜のマイクロアレイ解析
子宮内妊娠（ｎ＝１４）と卵管妊娠（ｎ＝１１）の女性からの脱落膜化した子宮内膜における遺伝子発現の比較は、６６９の遺伝子が差示的に発現することを明らかにした（ＦＣ＞±２、ｐ＜０．０５）。この解析で強調された注目に値する遺伝子の１つは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニットであった。これは、卵管異所性妊娠の女性の脱落膜化した子宮内膜で２．３４の倍率低下で下方調節された。定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、流産（ｐ＜０．０１）及び妊娠中絶（ｐ＜０．０１）群（図１ａ）と比べた場合、卵管妊娠からの脱落膜化した子宮内膜で低下した発現が確認された。
【００８３】
脱落膜化した子宮内膜におけるインヒビン／アクチビンのサブユニット
細胞から分泌されるために、βＢサブユニットは二量体を形成しなければならない。それはそれ自体と一緒になってアクチビンＢを形成し、インヒビンαサブユニットと一緒になってインヒビンＢを形成し、アクチビンβＡサブユニットと一緒になってアクチビンＡＢを形成するので、α及びβＡサブユニットの発現も検討した。βＡサブユニットの発現は、同じパターンに従わず（図１ｂ）、群間に有意な差異はなかった。群間におけるインヒビンαサブユニットの発現における変化は、あまり顕著ではなかったが（図１ｃ）、流産に比べて異所性妊娠の脱落膜化した子宮内膜で低かった（ｐ＜０．０５）。
【００８４】
脱落膜化した子宮内膜におけるインヒビンαとβＢのサブユニットの局在
脱落膜化した子宮内膜におけるインヒビンのαとβＢサブユニットをさらに検討するために、免疫組織化学を用いてそれらを局在させた。これらタンパク質双方に特異的な免疫染色は、脱落膜化した子宮内膜の腺領域及び間質領域で検出することができた（図２ａ〜ｄ）。しかしながら、患者間での脱落膜間質において染色の変化があり、βＢサブユニットについて特に顕著だった（図２ｅｈ）。子宮内膜があまり脱落膜化しておらず、さらに増殖性の表現型を有する場合（図２ｅ）、染色は腺性であることが注目された。子宮内膜がさらに分泌性の表現型を有した場合（図２ｆ）、染色は、明るい間質の関与を伴って主として腺性であった。しかしながら、十分に脱落膜化した試料では（図２ｇ）、顕著な間質の免疫染色があった。
【００８５】
脱落膜化の間のインヒビンαとβのサブユニットの発現
妊娠初期の子宮内膜の間質区画におけるβＢサブユニットの局在は、脱落膜化のレベルと共に変化するという傾向があったので、ヒト子宮内膜の線維芽細胞をインビトロで試験した。インビトロで脱落膜化刺激に曝すと、時間依存様式においてインヒビン／アクチビンβＢサブユニットの発現が高まった（ｐ＜０．０５）（図３ａ）。インビトロにおける間質線維芽細胞の脱落膜化の間、αサブユニットでは有意ではあるが、さほど顕著ではない増加があった（ｐ＜０．０５）（図３ｂ）ものの、インヒビンβＡサブユニットの発現に関して変化はなかった（図３ｃ）。
【００８６】
異所性妊娠、流産及び生存妊娠における脱落膜の形態学
βＢサブユニットの発現は間質の脱落膜化に関係すると思われ、異所性妊娠の脱落膜化した子宮内膜で低かったので、組織の正体に対して盲検化した子宮内膜病理の専門家によってヘマトキシリン及びエオシン染色切片にて、各組織試料における腺性及び間質区画の形態を評価した。子宮内妊娠と比べると、腺性区画は、より程度の低い分泌変化を示し（ｐ＜０．０５）、間質区画は、脱落膜化は少なかった（ｐ＜０．０５）（図４ａ）。さらに、子宮内膜の脱落膜化の全体的なレベルは、ＴＯＰや流産よりも異所性妊娠で低かった（ｐ＜０．０５）（図４ｂ）。形態学的な脱落膜化の全体的な程度に基づいて試料を階層化した場合（図４ｃ）、インヒビンβＢサブユニット発現との明瞭な相関もあった（ｐ＝０．０００５）。
【００８７】
妊娠初期の脱落膜化した子宮内膜における脱落膜化のその他のマーカーの発現
これらの検討は、異所性妊娠の子宮内膜では脱落膜化があまり進行しないことを示唆したので、脱落膜化に関与することが分かっている遺伝子発現も組織試料にて検討した。ＩＧＦＢＰ１（図５ａ）の発現は、流産（ｐ＜０．０１）及び妊娠中絶（ｐ＜０．０５）のそれと比較した場合、異所性妊娠の脱落膜で低下していた。プロラクチン（図５ｂ）の発現も、妊娠中絶（ｐ＜０．０５）のそれと比較した場合、異所性妊娠の脱落膜で低下していた。
【００８８】
血清アクチビンＢ濃度
インヒビン／アクチビンβＢサブユニットの脱落膜での発現の変化を全身性に検出することができるかどうかを判定するために、血清のアクチビンＢ濃度を試験した。アクチビンＢの濃度は、プロゲステロン（ｐ＜０．０５）と同様に、分析した群間で異なっていた（ｐ＝０．００１）（図６ａ）。しかしながら、アクチビンＢは、血清プロゲステロン濃度（図６ｅ）とは異なって、生存子宮内妊娠（図６ｄ）よりも異所性妊娠の女性の血清で低かった（ｐ＜０．０１）。さらに、血清アクチビンＢと脱落膜化の程度との間に明瞭な相関があったが（ｐ＝０．００５）、これは、プロゲステロンを分析した場合見られなかった（図６ｆ）。
【００８９】
考察
本研究は、同様の妊娠期間の卵管異所性妊娠と子宮内妊娠における脱落膜化した子宮内膜の機能に差異があることを実証する。我々は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニットの発現が子宮内膜の脱落膜化の程度に関係し、卵管異所性妊娠で低下することを示した。さらに、この差異を全身的に評価することができた。血清アクチビンＢは卵管異所性妊娠で低下し、血清濃度は形態学的な脱落膜化の程度と相関し、その差異は、血清プロゲステロン濃度で見られるものより顕著であった。局所で産生された増殖因子が子宮内膜の発生に主な役割を有することは明らかである（２６）。実際、形質転換増殖因子−βスーパーファミリーのメンバーは、子宮内膜で豊富に発現している。インヒビン／アクチビンのα、βＡ及びβＢのサブユニットは、月経周期の全体にわたって子宮内膜に発現し、かつ妊娠初期の脱落膜に発現することが以前示されている（２７）。それらの機能は、月経後のリモデリングや組織の修復を促進することであるという感触が得られている（２７）。しかしながら、それらの発現は妊娠初期で高められるので、それらは、妊娠に対する子宮内膜の応答において役割を有する可能性がある（２８）。アクチビン自体が子宮内膜の機能に影響を及ぼし得ることに疑いはない。アクチビンの受容体は子宮内膜の間質細胞に存在し（２９）、その発現は脱落膜化の間に高まる（３０）。実際、アクチビンＡによる子宮内膜の間質細胞の処理は、脱落膜化を促進し、プロラクチンのような脱落膜のマーカーの発現を促進したが（３１）、ホリスタチンによる処理は脱落膜の応答を有意に遅らせた（３１、３２）。アクチビンＡとインヒビンＡは、間質マトリクスメタロプロテイナーゼの発現を差示的に調節し、このことが、着床及び胎児と母体の相互作用に関連するリモデリングにおけるアクチビンのシグナル伝達のための役割を示唆することも示されている（３０、３３）。脱落膜化を促進する役割を有することと同様に、アクチビンサブユニットの発現自体が脱落膜化の間に高まる（２７、３４）。この調節は明らかではないが、インビボでは、着床している栄養膜とのダイアログであると思われる。胚盤胞が付着する間、脱落膜内でインヒビン／アクチビンβＡの発現の局在が変化することは、パラクリン調節を示唆している（３５）。従って、アクチビンが子宮内膜機能のマーカーとして機能し得、子宮内妊娠で差示的に調節され得ることは驚くべきことではない。以前の報告はほとんどβＡサブユニットの発現に関するものであり、脱落膜化におけるアクチビンＡの鍵となる役割を示唆しているけれども、それは、本研究で差示的に発現されたβＢサブユニットだった。脱落膜化した子宮内膜におけるβＢの発現は以前報告されたが（２７）、アクチビンＢの役割、調節及び効果は未だに評価されていない。確かに、本研究では、子宮内膜βＢサブユニットの発現と血清アクチビンＢの双方が子宮内膜の脱落膜化の程度と高く相関する。近隣の栄養膜細胞によってそれが直接影響を受けるかどうかは分かっていない。卵管異所性妊娠では、プロゲステロンの分泌は維持されるが、栄養膜と脱落膜化された子宮内膜との直接的な物理的相互作用はない。我々は、対照的に、子宮内妊娠では、栄養膜の相互作用が子宮内膜の機能に影響するので、脱落膜マーカーは卵管異所性妊娠の診断に有用であるという仮説を立てた。以前評価されたマーカーは、異所性着床（血清クレアチンキナーゼ（１５））、ｈＣＧ動態のマーカーとしての黄体機能（血清プロゲステロン（３６））又は双方のマーカー（血清ＶＥＧＦ（３７））に集中していた。これらの試験は異所性妊娠の診断において特定の臨床的用途があることが証明されていない。異所性妊娠のマーカーとしてのアクチビンとインヒビンの概念は新しいものではない。初期の研究では、インヒビンＡと遊離で循環するＰｒｏαＣインヒビンが検討され、卵管異所性妊娠を鑑別しないことが判った（１１）。最近の研究は、アクチビンＡ自体が異所性妊娠のマーカーとして機能し得ることを示唆している（３８）。血清アクチビンＡは異所性妊娠で低かった（３８）。異所性妊娠と黄体の双方がβＢサブユニットではなくβＡサブユニットを発現する（３９、４０）ので、アクチビンＡの供給源は明らかではない。アクチビンＢの供給源が脱落膜であるというのはありそうなことだと思われ、これが、脱落膜化と異所性妊娠の補助的マーカーとして機能することができるかどうかは将来の研究で評価されるべきである。血清アクチビンの低い濃度と関連した、卵管異所性妊娠の女性の脱落膜化した子宮内膜でのインヒビン／アクチビンβＢの低い発現の実証は、臨床的に重要である。脱落膜化におけるアクチビンＢの役割と調節を取り扱って、この過程における栄養膜とプロゲステロンの役割をさらに分析すべきである。さらに、異所性妊娠の診断における脱落膜評価又はアクチビンＢの測定の役割をさらに検討すべきである。我々は、子宮の脱落膜化と関連する分泌性タンパク質に着目することによって卵管妊娠のさらに可能性のある生体マーカーを発見し得ると考えている。
【００９０】
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２１．Ｃａｓａｇｒａｎｄｉ Ｄ，Ｂｅａｒｆｉｅｌｄ Ｃ，Ｇｅａｒｙ Ｊ，Ｒｅｄｍａｎ ＣＷ，Ｍｕｔｔｕｋｒｉｓｈｎａ Ｓ ２００３ Ｉｎｈｉｂｉｎ，ａｃｔｉｖｉｎ，ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ，ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｂｅｔａ−ｇｌｙｃａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ９：１９９−２０３
【０１１１】
２２．Ｌｕｄｌｏｗ Ｈ，Ｍｕｔｔｕｋｒｉｓｈｎａ Ｓ，Ｈｙｖｏｎｅｎ Ｍ，Ｇｒｏｏｍｅ ＮＰ ２００８ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｈｉｂｉｎ／ａｃｔｉｖｉｎ ｂｅｔａＢ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎｈｉｂｉｎ Ｂ ＥＬＩＳＡｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９：１０２−１１１
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２４．Ｋｉｒｋ Ｄ，Ｉｒｗｉｎ ＪＣ １９８０ Ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２１Ｂ：５１−７７
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２５．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｇ，Ｂａｉｅｒ Ｄ，Ｍａｊｅｒ Ｊ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｈ ２００３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ ｈＣＧ ａｎｄ ａｌｐｈａ ＣＧ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｈＣＧ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｅｃｉｄｕａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｕｂａｌ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ９：８１−８９
【０１１５】
２６．Ｄｉｍｉｔｒｉａｄｉｓ Ｅ，Ｗｈｉｔｅ ＣＡ，Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ ２００５ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｐｄａｔｅ １１：６１３−６３０
【０１１６】
２７．Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ，Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙ ＨＯ，Ｒｏｇｅｒｓ ＰＡ，Ａｆｆａｎｄｉ Ｂ，Ｆｉｎｄｌａｙ ＪＫ ２０００ Ｉｎｈｉｂｉｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｃｙｃｌｅ，ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ａｎｄ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ−ｏｎｌｙ ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ６：１１０７−１１１７
【０１１７】
２８．Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｆｉｎｄｌａｙ ＪＫ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ ２００６ Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ．Ａｕｓｔ Ｎ Ｚ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ ４６：２４５−２４９
【０１１８】
２９．Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ，Ｚｈａｏ ＹＣ，Ｅｔｈｉｅｒ ＪＦ，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＡＥ，Ｆｉｎｄｌａｙ ＪＫ ２００２ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ａｎｄ ｂｅｔａｇｌｙｃａｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ；ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ８：３６３−３７４
【０１１９】
３０．Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｆｉｎｄｌａｙ ＪＫ，Ｆａｒｎｗｏｒｔｈ ＰＧ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＤＭ，Ｗａｌｌａｃｅ Ｅ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ ２００６ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｎ Ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｈｕｍａｎ ｕｔｅｒｉｎｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４７：７２４−７３２
【０１２０】
３１．Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ，Ｆｉｎｄｌａｙ ＪＫ ２００２ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８７：４００１−４００４
【０１２１】
３２．Ｔｉｅｒｎｅｙ ＥＰ，Ｇｉｕｄｉｃｅ ＬＣ ２００４ Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ａｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ８１ Ｓｕｐｐｌ １：８９９−９０３
【０１２２】
３３．Ｓｔｒａｋｏｖａ Ｚ，Ｓｚｍｉｄｔ Ｍ，Ｓｒｉｓｕｐａｒｐ Ｓ，Ｆａｚｌｅａｂａｓ ＡＴ ２００３ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｂｏｏｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４４：５３３９−５３４６
【０１２３】
３４．Ｏｔａｎｉ Ｔ，Ｍｉｎａｍｉ Ｓ，Ｋｏｋａｗａ Ｋ，Ｓｈｉｋｏｎｅ Ｔ，Ｙａｍｏｔｏ Ｍ，Ｎａｋａｎｏ Ｒ １９９８ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ９１：６８５−６９２
【０１２４】
３５．Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｓｔｏｉｋｏｓ Ｃ，Ｆｉｎｄｌａｙ ＪＫ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ ２００６ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ ａｎｄ ｐｌａｃｅｎｔａ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １３２：２１７−２３２
【０１２５】
３６．Ｌｅｄｇｅｒ ＷＬ，Ｓｗｅｅｔｉｎｇ ＶＭ，Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ Ｓ １９９４ Ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｅｃｔｏｐｉｃ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｉｎ ａｎ ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ ｓｅｒｖｉｃｅ−−ａｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ，ｉｎｔａｃｔ ａｎｄ ｆｒｅｅ ｂｅｔａ ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ ｈｅｌｐｆｕｌ？ Ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ９：１５７−１６０
【０１２６】
３７．Ｆｅｌｅｍｂａｎ Ａ，Ｓａｍｍｏｕｒ Ａ，Ｔｕｌａｎｄｉ Ｔ ２００２ Ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １７：４９０−４９２
【０１２７】
３８．Ｆｌｏｒｉｏ，Ｐ，Ｓｅｖｅｒｉ ＦＭ，Ｂｏｃｃｈｉ Ｃ，Ｌｕｉｓｉ Ｓ，Ｍａｚｚｉｎｉ Ｍ，Ｄａｎｅｒｏ Ｓ，Ｔｏｒｒｉｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｐｅｔｒａｇｌｉａ Ｆ ２００７ Ｓｉｎｇｌｅ ｓｅｒｕｍ ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｅｃｔｏｐｉｃ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ９２：１７４８−１７５３
【０１２８】
３９．Ｒｅｆａａｔ Ｂ，Ａｍｅｒ Ｓ，Ｏｌａ Ｂ，Ｃｈａｐｍａｎ Ｎ，Ｌｅｄｇｅｒ Ｗ ２００７ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｎ βＡ− ａｎｄ βＢ−ｓｕｂｕｎｉｔｓ，ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅｓ ｂｅａｒｉｎｇ ａｎ ｅｃｔｏｐｉｃ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，印刷物に先んじた電子刊行物
【０１２９】
４０．Ｆｒａｓｅｒ ＨＭ，Ｌｕｎｎ ＳＦ，Ｃｏｗｅｎ ＧＭ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ ＰＴ １９９３ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｎ／ａｃｔｉｖｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ ｍＲＮＡｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｌｕｔｅａｌ ｐｈａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｔｅ ｏｖａｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １０：２４５−２５７
【０１３０】
実施例２
材料及び方法
この研究の倫理的な認可は、ロウジアン研究倫理委員会から得た（０４／Ｓ１１０３／２０）。試料を収集する前に全患者から文書でのインフォームドコンセントを得た。外科的妊娠中絶（ＳＴＯＰ、ｎ＝８、第１群）、流産の外科的処置（ｎ＝６、第２群）及び卵管妊娠の外科的処置（ｎ＝１１、第３群）を受けている女性（年齢１８〜４５歳）から子宮の脱落膜を得た。脱落膜及び栄養膜は、第１群及び第２群から吸引掻爬術によって得た。脱落膜は、Ｐｉｐｅｌｌｅ（登録商標）子宮内膜生検によって第３群から得た。顕微鏡下で栄養膜から脱落膜を単離した。脱落膜生検を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（アンビオン、テキサス、米国）中に４℃にて一晩浸漬し、次いで−７０℃で瞬間凍結した。製造元のプロトコル（キアゲン、ウエストサセックス、英国）で詳説されたように全ＲＮＡを脱落膜生検から抽出した。
【０１３１】
ＲＮＡ ＱＣ
全ＲＮＡは、アジレント２１００バイオアナライザにてＲＮＡ６０００ナノチップ上で確認された品質だった。非常に高い品質のＲＮＡ（ＲＩＮ＞７．５）調製物のみをマイクロアレイスクリーニングのために検討した。ＲＮＡの濃度は、ナノドロップ分光光度計（ナノドロップテクノロジーズ、米国）にて分光光度解析によって確認した。
【０１３２】
マイクロアレイ解析
手短には、各試料からの４μｇの全ＲＮＡを用いて、１サイクルのｃＤＮＡ合成キット（アフィメトリクス、英国）を用いて二本鎖のｃＤＮＡを生成し、次いでジーンチップ・・サンプル・クリーンアップ・モジュール（アフィメトリクス、英国）によって精製した。ビオチン標識ｃＲＮＡを生じるジーンチップＩＶＴ標識キット（アフィメトリクス、英国）を用いたインビトロの転写に、二本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いた。清浄化及び分光光度分析による定量に続いて、次いで精製されたビオチン化標的ｃＲＮＡを短い配列に断片化した。ハイブリダイゼーション・カクテルは、真核細胞ハイブリダイゼーション対照でスパイクされた１５μｇの断片化されたビオチン標識ｃＲＮＡからなるものであった。先ず、８０μＬのハイブリダイゼーション・カクテルを試験チップとハイブリダイゼーションさせ、ｃＲＮＡの完全性をチェックし、システムの信憑性を評価した。その後、ヒトＨＧ−Ｕ１３３プラス２．０マイクロアレイ（アフィメトリクス、英国）を、２００μＬのハイブリダイゼーション・カクテル溶液で直接的にロードし、４５℃にて６０ｒｐｍで回転するジーンチップ・ハイブリダイゼーション・オーブン６４０（アフィメトリクス、英国）に１６時間入れた。ハイブリダイゼーションの後、ジーンチップ流体ステーション４５０（アフィメトリクス、英国）でアレイを洗浄し、製造元のプロトコルに従ってジーンチップ・スキャナ３０００（アフィメトリクス、英国）を用いて走査した。
【０１３３】
試料標識処理の品質及び一貫性並びにアレイのハイブリダイゼーションを確実にするために、全２５アレイの対照情報を照合し、データ解析の前に見直したところ、全てがアフィメトリクスの推奨に一致することが判った。
【０１３４】
Ｒ統計プログラム環境へのバイオコンダクター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）拡張で実施されるロバストマルチアレイ平均アルゴリズム（８）を用いて発現を計算した（９）。ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）は、測定のｌｏｇ２スケール上で、バックグランドを補正し、かつ変位値をノーマライズした、発現の測定基準（１０）を生成する。アレイハイブリダイゼーションの性能をさらに検討するために、Ｒ統計プログラム環境へのバイオコンダクターへの拡張にて１つおきで各アレイを比較する散乱プロットを生成した。これらのプロットはアレイ間の線形分布を裏づけ、低シグナル値から高シグナル値まで動的に連続した範囲の発現を示した。箱髭図による視覚化によっても、データが匹敵する分布を有し、さらなる解析に十分な品質であることが確認された（オンラインで利用可能な補充データを参照のこと）。
【０１３５】
データ及びプロトコルは、公にアクセスできるＭＩＡＭＥ対応のデータベース「ＧＰＸ」（ｗｗｗ．ｇｔｉ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ＧＰＸ、アクセス番号ＧＰＸ−００００６７．１）からダウンロードして利用できる。
【０１３６】
ＲＭＡによるデータのノーマライゼーションに続いて、６４という任意のシグナル強度閾値の値を用いて、データをフィルターにかけ、その後の統計的解析で複数の試験誤差に寄与する不変転写物を除き、すなわち、試料アレイの５０％（１２アレイ）で６４未満の強度の絶対値を示した場合に、その転写物をさらなる解析から除いた。
【０１３７】
試験的解析に続いて、厳密な統計的アプローチを活用して、子宮内の試料と子宮外の試料の間での発現レベルという点で有意差があった遺伝子を同定した。経験ベイズ試験の形態で推定試験をデータに適用した。このあと、ベンジャミニ・ホックベルグの偽発見検出法を用いた複数試験補正を行った（１１）。次いで、＞１．５の倍率変化閾値、及び＜０．０５の補正ｐ値を用いて遺伝子リストを創った。
【０１３８】
この統計的解析の結果及び遺伝子リストの妥当性を確認するために、最大の倍率変化があった遺伝子のうち２つの定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。製造元の指示書に従ってアプライドバイオシステムズのＲＴキット（アプライドバイオシステムズ、チェシャー、英国）を用いてＲＮＡを逆転写した。次いでＴａｑｍａｎＱ−ＲＴ−ＰＣＲを用いて、アプライドバイオシステムズが事前に検証した「ａｓｓａｙ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ」２０Ｘ Ｔａｑｍａｎプライマー及びプローブ、並びに標準的な反応ミックス（ＲＮＡローディングのための内部標準としてのリボソーム１８Ｓプライマー及びプローブを含む）を用いて遺伝子レベルを測定した。標準条件を用いてＡＢＩプリズム７９００にて試料を解析した。２−△△Ｃｔ法を用いてｍＲＮＡの発現結果を１８Ｓに対してノーマライズし、対照（ＳＴＯＰ試料群、ｎ＝８）と比べた倍率変化として表した。次いで、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）及び最小有意差事後多重比較を用いて発現における差異が有意であるかどうかを決定した（ＳＰＳＳ社、シカゴ、イリノイ州）。
【０１３９】
標準的な免疫組織化学プロトコルも用いて、各患者群からのパラフィン包埋脱落膜における遺伝子のうちの１つについてタンパク質の発現を試験した。
【０１４０】
結果
試験的解析に続いて、経験ベイズ法によって向上させた一般線形モデルを用いて、子宮内（第２群及び第３群の組合せにおいてｎ＝１４）試料と子宮外（第１群、ｎ＝１１）試料との間での統計的に有意な差示的発現について試験した。平均倍率変化（ＦＣ）を計算し、ベンジャミニ・ホックベルグの偽発見検出法を用いた多重試験についてｐ値を調整した。異所性妊娠群において１０６１個の遺伝子が差示的に発現される（ＦＣ＞１．５、調整されたｐ値＜０．０５）ことが見出された。具体的には、２つの遺伝子が可能性のある生体マーカーとして同定された：子宮内の群と比較して子宮外の群では、システイン−リッチ分泌型タンパク質３（ＣＲＩＳＰ３）は、９．１３倍増加し（ｐ＝０．００５）、カルボキシペプチダーゼＢ１（ＣＰＢ１）は、２６．５２倍減少した（ｐ＝０．００５）。このことはＲＴ−ＰＣＴによって確認された（図１を参照のこと）。ＣＲＩＳＰ３タンパク質の発現はまた、各患者群の脱落膜の腺及びマクロファージにおける免疫組織化学によって実証された（図２を参照のこと）。免疫組織化学のレベルでは、ＣＲＩＳＰ３の分布に差異はなかった。
【０１４１】
考察
子宮外着床の我々の理解を進めることと同様に、異所性妊娠の被験体において過剰発現又は過少発現される、例えば、ＣＲＩＳＰ３及びＣＰＢ１のような遺伝子産物の検出は、臨床的に非常に重要である。それは、子宮脱落膜等の試料を単に調べることによって、診断が不確定である初期妊娠不全の任意の被験体における異所性妊娠を診断する手段を臨床病理医に提供する。例えば、血液、血清、血漿及び／又は子宮脱落膜のような試料は、容易に得ることができ、例えば、子宮脱落膜の試料は、患者を全身麻酔に供することなく、子宮からの生検によって得られ得る。さらに、これは、入院や侵襲的検査を回避する可能性を患者に提供する。そのような遺伝子の同定はまた、異所性妊娠のための信頼できる血液検査を開発する可能性を提供する。これは、異所性妊娠の診断に現在必要とされている高価かつ時間がかかる検査の数を減らすであろう。
【０１４２】
参考文献
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【０１４３】
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【０１４４】
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【０１４６】
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【０１４７】
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【０１４８】
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８．Ｉｒｉｚａｒｒｙ ＲＡ，Ｈｏｂｂｓ Ｂ，Ｃｏｌｌｉｎ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｓｕｍｍａｒｉｅｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙ ｐｒｏｂｅ ｌｅｖｅｌ ｄａｔａ．Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２００３；４：２４９−６４．
【０１５０】
９．Ｉｈａｋａ Ｒ，Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ Ｒ．Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ｆｏｒ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｇｒａｐｈ Ｓｔａｔ １９９６；５：２９９−３１４．
【０１５１】
１０．Ｂｏｌｓｔａｄ ＢＭ，Ｉｒｉｚａｒｒｙ ＲＡ，Ａｓｔｒａｎｄ Ｍ，Ｓｐｅｅｄ ＴＰ．Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙ ｄａｔａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎｄ ｂｉａｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００３；１９：１８５−９３
【０１５２】
１１．Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，Ｙ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｆｕｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １９９５；５７：２８９−３００．
【０１５３】
実施例３
炎症の間、免疫の多数のメディエータやエフェクターが動員されて解決を助けるが、活発又は長引く応答は、結果的に組織に損傷を生じ得る。なかでも、そのような組織の損傷に関与するメディエータは、生来の免疫応答の一部として機能するプロテアーゼである（Ｄａｌｌｅｇｒｉ及びＯｔｔｏｎｅｌｌｏ １９９７）。宿主の応答には、プロテアーゼの作用に対抗し、それにより宿主組織への結果的な損傷を防ぐための、例えば、抗菌物質、分泌型白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）及びエラフィンのような、多数の重要な抗プロテアーゼの産生が挙げられる（Ｓａｌｌｅｎａｖｅら １９９４；Ｓａｌｌｅｎａｖｅ ２０００；Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋら １９９９）。ＳＬＰＩは、好中球エラスターゼ、トリプシン及びカテプシンＧを含む多数のプロテアーゼを阻害する一方で、エラフィンは、調節性好中球エラスターゼとプロテイナーゼ３に限定されるようである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ及びＯｈｌｓｓｏｎ，１９８６、Ｗｉｅｄｏｗら １９９１、Ｓａｌｌｅｎａｖｅ及びＲｙｌｅ １９９１）。
【０１５４】
ＳＬＰＩ及びエラフィンは、女性の生殖器の至る箇所で発現されている（Ｋｉｎｇら ２０００、Ｋｉｎｇら ２００３ｂ）。ヒトの子宮内膜上皮は、周期の分泌期の間においてＳＬＰＩを発現し、子宮内膜における好中球は、月経の間におけるエラフィンの特に豊富な供給源である（Ｋｉｎｇら ２００３ａ）。ＳＬＰＩ及びエラフィンの発現はまた、子宮頚部及び脱落膜化した子宮内膜において実証されている（Ｈｅｌｍｉｇら １９９５、Ｐｆｕｎｄｔら １９９６、Ｋｉｎｇら ２０００、Ｋｉｎｇら ２００３ａ）。月経周期の間のＳＬＰＩ及びエラフィンの発現は、組織のリモデリング及び「創傷」治癒における役割を示し得る（ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎら １９９６；Ｗｉｎｇｅｎｓら １９９８；Ａｓｈｃｒｏｆｔら ２０００；Ｚｈｕら ２００２；Ａｎｇｅｌｏｖら ２００４）。他の女性の生殖器に共通して、卵管の形態は、エストロゲン及びプロゲステロンの影響下で周期的な変化を受け（ＳｕＩｚら １９９８）、ＳＬＰＩ及びエラフィンの発現は、卵管から子宮内膜にかけて同様の一時的な発現パターンを有することが示されている（Ｄａｌｇｅｔｔｙら ２００６）。
【０１５５】
しかしながら、卵管着床の背景で起きるＳＬＰＩ及びエラフィンの発現の変化は、実証されていない。２つの着床部位の解剖学的な差異によって卵管部位と子宮内部位を直接比較するのは難しい。しかしながら、子宮内妊娠への子宮内膜の応答に類似して、卵管での妊娠に伴って、普通は卵管ではなく子宮腔で脱落膜反応がある（Ｓｔｏｃｋ １９９１）。子宮内膜の上皮及び間質の脱落膜化は、着床が上手く行く鍵となる免疫学的要素である（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら ２００２）。子宮の脱落膜は、生来の免疫の白血球、例えば、ＣＤ５６＋ナチュラルキラー（ｕＮＫ）細胞、マクロファージ及び肥満細胞を含む（Ｂｕｌｍｅｒら １９８８；Ｋｉｎｇ及びＬｏｋｅ １９９１；Ｈｕｎｔ １９９４；Ｃｌａｒｋ １９９５；Ｍａｒｘら １９９９）。従って、我々は、進行中の子宮内妊娠（外科的妊娠中絶を受けている女性）、不全の子宮内妊娠（流産の女性）及び卵管妊娠の女性の子宮脱落膜におけるＳＬＰＩ及びエラフィンの発現を比較した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫組織化学を用いて、それぞれｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を実証した。
【０１５６】
材料及び方法
組織の収集
この研究の倫理的な認可は、ロウジアン研究倫理委員会から得た（０４／Ｓ１１０３／２０）。試料を収集する前に全患者から文書でのインフォームドコンセントを得た。外科的妊娠中絶（ＳＴＯＰ、ｎ＝７、第１群）、胎性喪失流産の外科的処置（ｎ＝６、第２群）及び卵管妊娠の外科的処置（ｎ＝１０、第３群）を受けている女性（年齢１８〜４５歳）から子宮脱落膜及び血清の試料を得た。卵管異所性妊娠の外科的処置を受けた女性で血流力学ショックを実際に示したものはなく、診断に先立って、全て連続血清ベータ−ＨＣＧ及び超音波モニタリングを必要とした。脱落膜及び栄養膜は、第１群及び第２群から吸引掻爬術によって得た。脱落膜は、Ｐｉｐｅｌｌｅ（登録商標）子宮内膜生検によって第３群から得た。顕微鏡下で栄養膜から脱落膜を単離した。脱落膜生検を、（ａ）ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（アンビオン、テキサス、米国）中に４℃にて一晩浸漬し、次いで−７０℃で瞬間凍結し、（ｂ）１０％の中性緩衝ホルマリンで４℃にて一晩固定し、７０％エタノール中で保存し、免疫組織化学用にワックス包埋した。血清試料は、プロゲステロンのレベルの分析用に保存した。
【０１５７】
ＰＣＲによるクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の検出
製造元のプロトコル（キアゲン、ウエストサセックス、英国）で詳説されたように脱落膜生検からＤＮＡを抽出した。ＰＣＲプロトコルは、社内のプラスミドベースの方法を用いた。
【０１５８】
定量的リアルタイムＰＣＲ
製造元のプロトコル（キアゲン、ウエストサセックス、英国）で詳説されたように全ＲＮＡを脱落膜生検から抽出した。アジレント・バイオアナライザを用いて、抽出したＲＮＡの濃度及び品質を評価した。品質管理のための全試料を標準化し、ＲＮＡ完全性番号（ＲＩＮ）を割り当てた。７．５の平均ＲＩＮ値が得られた場合、ＲＮＡは、良好な品質であるとみなした（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら ２００６）。定量的リアルタイムＰＣＲによってＳＬＰＩ及びエラフィンのレベルを決定した。この技術は、存在するＲＮＡの量について対照とするリボゾーム１８Ｓのレベルに対する、存在するＳＬＰＩ及びエラフィンのｍＲＮＡの量に関する。ＲＴ及びＰＣＲの詳細は、ほかに完全に詳説されている（Ｋｉｎｇら ２０００）。使用したエラフィンとＳＬＰＩのプライマーとプローブは、ＰＲＩＭＥＲエクスプレス・ソフトウエア（ＰＥバイオシステムズ、フォスターシティ、米国）を用いて我々の研究室で以前設計された（Ｋｉｎｇら ２０００及び２００３）。エラフィンのプライマー及びプローブは、以下のとおりであった：正方向プライマー５’−ＴＧＧＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＡＴＴＡＴＣ−３’、逆方向プライマー５’−ＣＡＧＴＡＴＣＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＧＧＴＴＡＧ−３’、プローブ５’−ＡＴＣＣＧＧＴＧＣＧＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＴＣＣ−３’。ＳＬＰＩのプライマー及びプローブは、以下のとおりであった：正方向プライマー５’−ＧＣＡＴＣＡＡＡＴＧＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴ−３’、逆方向プライマー５’−ＧＣＡＴＣＡＡＡＣＡＴＴＧＧＣＣＡＴＡＡＧＴＣ−３’、プローブ５’−ＴＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＧＧ−３’。アッセイ内のＰＣＲ測定の変動は、６回の反復物から計算した。逆転写工程の変動性は、１つのＲＮＡ試料を８回逆転写することによって決定した。次いで８個のｃＤＮＡ試料を１回のＰＣＲの実行に含め、（ＳＤに対する）変動性を計算した。ゲノムＤＮＡの混入の可能性は、ＤＮＡ分解酵素処理によって及びＲＮＡ試料（逆転写していない）におけるβ−アクチンのレベルの測定によって除外した。各臨床群からの試料の相対平均値を記録し、ＡＮＯＶＡによって、次いでチューキー事後（Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔｈｏｃ）分析によって解析した。
【０１５９】
エラフィンの免疫組織化学
キシレンにて組織切片を脱ワックスし、漸減勾配のアルコールによって再水和した。室温にて１０分間、蒸留水中の２％過酸化水素（シグマアルドリッチ、プール、英国）によって非特異的な内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックした。希釈した正常ヤギ血清（リン酸緩衝生理食塩水中２０％ｖ／ｖ）（ダイアグノスティックス・スコットランド、エディンバラ、英国）を全組織切片に室温にて２０分間適用した。交互に５分間、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄して、アビジン−ビオチンとタンパク質のブロックをそれぞれ室温にて２０分間、組織切片にさらに適用した。次いで、抗体希釈剤（ダコ、イーリー、英国）で１：７００に希釈したウサギ抗エラフィンポリクローナル抗体（Ｓａｌｌｅｎａｖｅら １９９４）と共に４℃にて一晩、切片をインキュベートした。陰性対照の切片では、適当な同等のＩｇ濃度のウサギＩｇＧ（ＲＩｇＧ：ベクターラボラトリーズ、ピーターバラ、英国）によって一次抗体を置き換えた。ビオチン化ヤギ抗ウサギ（ベクター）と共に切片をインキュベートし、次いでアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ検出系（ベクター；双方共室温にて３０分間インキュベートした）に供した。ペルオキシダーゼの基質であるジアミノベンジジンを用いて陽性の免疫染色を同定した。ハリスヘマトキシリン（パイオニア・リサーチ・ケミカルズ、コールチェスター、英国）によって切片を対比染色し、漸増勾配のアルコールで脱水し、キシレンからＰｅｒｔｅｘにて標本にした（セル−パス、ヘメル・ヘムステッド、英国）。
【０１６０】
ＳＬＰＩの免疫組織化学
使用した方法は、以下の例外を伴って、エラフィンの免疫組織化学プロトコルと同一であった。非免疫ブロックは、希釈したウマ血清（ベクター）によって室温にて２０分間行った。一次抗体は、抗体希釈剤（ダコ）で１：２０に希釈したマウス抗ＳＬＰＩ（ハイカルト・バイオテクノロジー、ウーデン、オランダ）であった。陰性対照は、等モル濃度のマウスＩｇＧ（ＭＩｇＧ）と共にインキュベートし、二次抗体は、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇ（ベクター）であった。
【０１６１】
結果
血清プロゲステロンのレベル
各患者について血清プロゲステロンのレベルを分析した。クラスカル・ウォリス、次いでダン事後（Ｄｕｎｎ’ｓ ｐｏｓｔｈｏｃ）分析を用いて各群間で実証された統計的な有意差はなかった（表１を参照のこと）。
【０１６２】
【表１】
【０１６３】
栄養膜からの脱落膜の分離
サイトケラチンについてのヘマトキシリンとエオシンによる染色及び免疫組織化学は、生理食塩水中における顕微鏡下での分離による栄養膜からの脱落膜の明瞭な単離を実証した。試料の炎症の状態も判定した−壊死の存在、及びリンパ球と多形性浸潤について各試料を試験した。これらの特徴は様々な程度で存在したが、明白な統計的差異はなかった（データは示さず）。染色された組織切片は全て、熟練した組織病理学者が試験した。
【０１６４】
クラミジアの血清学
クラミジア・トラコマティス感染について脱落膜生検全てをスクリーニングしたところ、陰性であることが分かった。
【０１６５】
子宮内及び子宮外の妊娠に由来する子宮脱落膜におけるＳＬＰＩ及びエラフィンのｍＲＮＡの発現
各臨床群の子宮脱落膜においてＳＬＰＩ及びエラフィンのｍＲＮＡを検出した。ＳＬＰＩのｍＲＮＡの相対的な発現は、ＳＴＯＰ（４．８ ＋／− １．４５）及び流産の外科的処置（５．０９ ＋／− ２．２２）を受けている女性の脱落膜と比べると卵管妊娠（１２．３７ ＋／− ２．６６）の女性の子宮脱落膜の方が高かった（表１、図９Ａ）。記録されたデータのＡＮＯＶＡ解析によって、卵管妊娠群と流産群との間の統計的な有意差（全体でｐ＜０．０１８５、チューキー事後分析ｐ＜０．０５）が実証された。エラフィンのｍＲＮＡの発現も流産（９．００ ＋／− ２．５３）及び外科的妊娠中絶（４．６ ＋／− １．３８）を受けている女性と比べると卵管妊娠（７３．５７ ＋／− ３５．２９）の女性の脱落膜の方が高かった（表１、図９Ｂ）。しかしながら、この所見は、ＡＮＯＶＡ又は正常のデータ又は記録されたデータのノンパラメトリック統計的解析を用いても有意ではなかった。これは、卵管妊娠群の発現の高い変動性に起因した。エラフィンについてのその相対的なｍＲＮＡの値が、その他の試料の平均値の標準偏差の２倍より大きかったので、２つの試料（１つは、ＳＴＯＰを受けている患者由来、及び１つは、妊娠三期のうちの第１期の流産の患者由来）を解析から除外した。
【０１６６】
子宮内及び子宮外の妊娠に由来する子宮脱落膜におけるエラフィン及びＳＬＰＩのタンパク質の免疫組織化学的な局在
免疫組織化学によって子宮脱落膜中のエラフィン及びＳＬＰＩのタンパク質の発現及び分布を実証した（図１０Ａ〜Ｆ）。臨床群のいずれにおいてもエラフィン及びＳＬＰＩのタンパク質の発現パターンに明白な差異はなかった。ＳＬＰＩタンパク質の発現は、上皮（図１０Ａ及び図１０Ｂを参照のこと）及び脱落膜の白血球（図１０Ｃを参照のこと）で実証された。ＳＬＰＩタンパク質の発現は上皮腺の細胞質で特に強かった（図１０Ｂを参照のこと）。エラフィンタンパク質の発現は脱落膜の白血球集団に限定された（図１０Ｅ及び図１０Ｆを参照のこと）。しかしながら、場合によっては、上皮腺における膜性エラフィンタンパク質の発現の証拠があった（図１０Ｄ）。エラフィン及びＳＬＰＩの免疫発現に関する陰性対照は、陽性染色の証拠を示さなかった（それぞれ図１０Ｇ及び図１０Ｈ）。染色された組織切片全てにて、熟練した病理学者によって定性的分析が行われた。乏しい再現性と、免疫組織化学のスコア化についての観察者間の合意のために定量的分析は行わなかった（Ｔａｙｌｏｒ １９９４）。
【０１６７】
考察
我々の知る限り、我々は、子宮内妊娠のものと比べた、卵管妊娠の女性から集めた子宮脱落膜における天然の抗菌ペプチド（ＳＬＰＩ及びエラフィン）の遺伝子発現の新規の差異を報告する。この研究はまた、ＳＬＰＩのｍＲＮＡの発現が不全の子宮内妊娠（流産）と比べて卵管妊娠の女性の子宮脱落膜で有意に高い（ｐ＜０．０５）ことを実証する。以前の研究では、特に白血球集団に着目して子宮脱落膜の細胞性組成のみを比較し、子宮外妊娠と子宮内妊娠との間に明白な区別を見出さなかった（Ｂｕｌｍｅｒら １９８７；Ｓｔｅｗａｒｔ−Ａｋｅｒｓら １９９７）。
【０１６８】
卵管妊娠群と子宮内妊娠群との間の脱落膜の最も明白な差異は栄養膜の非存在である。我々の知る限り、栄養膜のシグナルによってＳＬＰＩ及びエラフィンの発現が調節されることを示唆する公表されたデータはない。そうは言うものの、機能的ゲノミクスのアプローチを用いた最近のインビトロの研究では、炎症誘発性サイトカイン及び細胞の有意な誘導を起こすことによって、栄養膜からのコンディショナル培地が脱落膜の局所免疫の環境を変化させ、胚の着床を促進することが示された（Ｈｅｓｓら ２００７）。このことは、我々の研究で認められた変化について、興味深い潜在的メカニズムを提供する。
【０１６９】
あるいは、子宮の環境が本当に卵管の環境を反映するのであれば、子宮脱落膜におけるＳＬＰＩの異常な発現は、単に子宮外着床の結末であるのかもしれない。卵管では、正常な卵管上皮が上行性の病原体を認識し、かつ応答する能力を有する一方で、上皮バリアを破壊し得る不要な炎症状態を同時に回避することが必須である。外来の病原体は、例えば、膜性Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のような、卵管細胞に存在するパターン認識受容体によって認識される（Ｄａｒｖｉｌｌｅら ２００３；Ｐｉｏｌｉら ２００４）。結合は、シグナル伝達のカスケードを開始させ、ＮＦ−κＢの活性化並びにそれに続く炎症誘発性及び免疫調節性のサイトカイン、ケモカイン及び同時刺激性分子（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ）の産生をもたらす（Ｂｏｗｉｅら ２０００）。ＮＦ−κＢは、これらの炎症性分子を上方調節することを介して間接的にＳＬＰＩの発現を高めるのかもしれない（Ｂｉｎｇｌｅら ２００１；Ｋｉｎｇら ２００２）。卵管着床部位の周辺には急性炎症の証拠がないことがしばしばある（Ｋｕｔｌｕａｙら １９９４）。異所性妊娠では、胚の着床の間のＳＬＰＩの卵管での発現は、プロテアーゼの作用を阻害することによって、炎症応答及びその後の初期の卵管損傷を軽減するのかもしれない。ＳＬＰＩは、肺気腫及び肺線維症のモデルで組織の損傷を軽減することが示されており、研究によって、ヘリコバクター・ピロリを持つ患者の胃粘膜におけるＳＬＰＩのレベルの低下が胃炎を誘発することが示された（Ｈｒｉｔｚら ２００６；Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉら １９９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎｅｔら １９９３；Ｒｕｄｏｌｐｈｕｓら １９９３；Ｗｅｘら ２００４ａ；Ｗｅｘら ２００４ｂ；Ｗｅｘら ２００６）。異所性着床の事象におけるＳＬＰＩレベルの上昇が、急性炎症の所見を欠くことを説明するために役立つのかもしれない。
【０１７０】
しかしながら、ＳＬＰＩの異常な発現は、卵管妊娠の結末ではなく、卵管妊娠の素因であり得る可能性がある。英国で最も一般的な性的に伝染する感染細菌である、クラミジア・トラコマティスは、卵管妊娠の主要なリスク因子であることが分かっている（Ｆａｒｑｕｈａｒ ２００５、Ｃａｓｓｅｌｌら ２００６）。それでもやはり、クラミジア感染が卵管損傷の主な原因の１つであることが示唆されている（Ｏｄｌａｎｄら １９９３）が、クラミジア感染から卵管妊娠をもたらす病原性事象は不明である。インビトロの研究によって、クラミジアが子宮頚部上皮及び栄養膜にてＳＬＰＩの発現を誘導することが実証された（Ｗｈｅｅｌｈｏｕｓｅら、投稿準備中）。クラミジアが上記のシグナル伝達カスケードを経由してＮＦ−κＢを介して作用すること、並びに持続又は反復した感染が子宮及び卵管におけるＳＬＰＩの異常な発現を引き起こし、卵管着床への感受性をもたらすことが可能性としてある。しかしながら、我々の研究で試験した検体はいずれもクラミジア感染では陽性ではなかった。
【０１７１】
子宮内妊娠と比べて異所性妊娠の女性でＳＬＰＩのｍＲＮＡ発現パターンが変化していることを実証したことは、胚の着床についての我々の現在の知識にさらに寄与する。免疫組織化学によってエラフィン及びＳＬＰＩのタンパク質の発現の分布パターンには明白な差異がないことが実証されたが、我々は、この技術を用いて分泌型タンパク質を正確に測定する困難さを認め、さらなる定量的なタンパク質の分析及び機能的な研究が必要であることを承知している。
【０１７２】
参考文献
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【０１７３】
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【０１７４】
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Ｃａｓｓｅｌｌ ＪＡ，Ｍｅｒｃｅｒ ＣＨ，Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ Ｌ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｉ，Ｉｓｌａｍ Ａ，Ｂｒｏｏｋ ＭＧ，Ｒｏｓｓ ＪＤ，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ ＧＲ，Ｓｉｍｍｓ Ｉ，Ｈｕｇｈｅｓ Ｇ，Ｍａｊｅｅｄ Ａ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ ＪＭ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＭ，Ｈａｙｗａｒｄ ＡＣ（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ １９９０−２０００：ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ ｕｓｉｎｇ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＵＫ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄａｔａｂａｓｅ．ＢＭＪ ３３２（７５３７），３３２−４．
【０１８１】
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Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ Ｈ，Ａｓａｎｏ Ｓ，Ｎｏｎａｋａ Ｔ，Ｈａｍａｍｕｒａ Ｉ，Ｍａｓｕｄａ Ｋ，Ｋｉｙｏｋｉ Ｍ（１９９６）Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １５３（１），３６９−７４．
【０２０６】
Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＭＳ，Ｄｅｓｒｏｃｈｅｒｓ ＰＥ，Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ ＡＭ，Ｇｉｂｂｓ ＤＦ，Ｖａｒａｎｉ Ｊ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＫＪ，Ｗｅｉｓｓ ＳＪ（１９９３）Ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｌｖｅｏｌｉｔｉｓ ｂｙ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ２．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９０（２４），１１５２３−７．
【０２０７】
Ｐｆｕｎｄｔ Ｒ，ｖａｎ Ｒｕｉｓｓｅｎ Ｆ，ｖａｎ Ｖｌｉｊｍｅｎ−Ｗｉｌｌｅｍｓ ＩＭ，Ａｌｋｅｍａｄｅ ＨＡ，Ｚｅｅｕｗｅｎ ＰＬ，Ｊａｐ ＰＨ，Ｄｉｊｋｍａｎ Ｈ，Ｆｒａｎｓｅｎ Ｊ，Ｃｒｏｅｓ Ｈ，ｖａｎ Ｅｒｐ ＰＥ，Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ Ｊ（１９９６）Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＫＡＬＰ／ｅｌａｆｉｎ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｎｔｉ−ｅｌａｓｔａｓｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９８（６），１３８９−９９．
【０２０８】
Ｐｉｏｌｉ ＰＡ，Ａｍｉｅｌ Ｅ，Ｓｃｈａｅｆｅｒ ＴＭ，Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ＪＥ，Ｗｉｒａ ＣＲ，Ｇｕｙｒｅ ＰＭ（２００４）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ２ ａｎｄ ４ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｆｅｍａｌｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２（１０），５７９９−８０６．
【０２０９】
Ｒｕｄｏｌｐｈｕｓ Ａ，Ｓｔｏｌｋ Ｊ，Ｄｉｊｋｍａｎ ＪＨ，Ｋｒａｍｐｓ ＪＡ（１９９３）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｍｐｈｙｓｅｍａ ｂｙ ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｌｙ ｉｎｓｔｉｌｌｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ １４７（２），４４２−７．
【０２１０】
Ｓａｌｌｅｎａｖｅ ａｎｄ ＲｙＩｅ（１９９１）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌａｓｔａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｍｕｃｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ ３７２（１），１３−２１．
【０２１１】
Ｓａｌｌｅｎａｖｅ ＪＭ，Ｓｈｕｌｍａｎｎ Ｊ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ Ｊ，Ｊｏｒｄａｎａ Ｍ，Ｇａｕｌｄｉｅ Ｊ（１９９４）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＬＰＩ） ａｎｄ ｅｌａｓｔａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＥＳＩ／ｅｌａｆｉｎ） ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ １１（６），７３３−４１．
【０２１２】
Ｓａｌｌｅｎａｖｅ ＪＭ（２０００）Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｅｌａｆｉｎ（ｅｌａｓｔａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｔｉｌｅｕｋｏｐｒｏｔｅａｓｅ） ａｓ ａｌａｒｍ ａｎｔｉｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ １（２），８７−９２．
【０２１３】
Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ Ｊ，Ｗｉｅｄｏｗ Ｏ，Ｈｉｒｏｓｅ Ｓ（１９９９）Ｔｈｅ ｔｒａｐｐｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ：ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ａｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ａ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｃｏｒｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３４０（Ｐｔ ３），５６９−７７．
【０２１４】
Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ａ，Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｏ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｓ，Ｓａｌｏｗｓｋｙ Ｒ，Ｌｅｉｂｅｒ Ｍ，Ｇａｓｓｍａｎｎ Ｍ，Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ Ｓ，Ｍｅｎｚｅｌ Ｗ，Ｇｒａｎｚｏｗ Ｍ，Ｒａｇｇ Ｔ（２００６）Ｔｈｅ ＲＩＮ：ａｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ ｆｏｒ ａｓｓｉｇｎｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｖａｌｕｅｓ ｔｏ ＲＮＡ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．ＢＭＣ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ７，３．
【０２１５】
Ｓｔｅｗａｒｔ−Ａｋｅｒｓ ＡＭ，Ｋｒａｓｎｏｗ ＪＳ，ＤｅＬｏｉａ ＪＡ（１９９７）Ｄｅｃｉｄｕａｌ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅｃｔｏｐｉｃ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ ６８（６），１１０３−７．
【０２１６】
Ｓｔｏｃｋ ＲＪ（１９９１）Ｔｕｂａｌ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １８（１），７３−９４．
【０２１７】
ＳｕＩｚ Ｌ，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ＪＰ，Ｓａｌｖａｔｉｅｒｒａ ＡＭ，Ｏｒｔｉｚ ＭＥ，Ｃｒｏｘａｔｔｏ ＨＢ（１９９８）Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ（ｖ） ａｎｄ ｂｅｔａ３ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ Ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｔｕｂａｌ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ．Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １３（１Ｏ），２９１６−２０．
【０２１８】
Ｔａｙｌｏｒ ＣＲ．Ａｎ ｅｘａｌｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｔｓ：ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｅｆｆｏｒｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ １９９４；１：１−１１．
【０２１９】
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＲＣ，Ｏｈｌｓｓｏｎ Ｋ（１９８６）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｅｌａｓｔａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３（１８）：６６９２−６．
【０２２０】
ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ＢＨ，Ａｎｄｒｉｅｓｓｅｎ ＭＰ，Ｓｐｒｕｉｊｔ ＫＩ，ｖａｎ ｄｅ Ｋｅｒｋｈｏｆ ＰＣ，Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ Ｊ（１９９６）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＫＡＬＰ／ｅｌａｆｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ．Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ．２８８（８），４５８−６２．
【０２２１】
Ｗｅｘ Ｔ，Ｔｒｅｉｂｅｒ Ｇ，Ｎｉｌｉｕｓ Ｍ，Ｖｉｅｔｈ Ｍ，Ｒｏｅｓｓｎｅｒ Ａ，Ｍａｌｆｅｒｔｈｅｉｎｅｒ Ｐ（２００４ａ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇａｓｔｒｉｔｉｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｌｏｃａｌ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｒｕｍ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２（４），２３８３−５．
【０２２２】
Ｗｅｘ Ｔ，Ｓｏｋｉｃ−Ｍｉｌｕｔｉｎｏｖｉｃ Ａ，Ｔｏｄｏｒｏｖｉｃ Ｖ，Ｂｊｅｌｏｖｉｃ Ｍ，Ｍｉｌｏｓａｖｌｊｅｖｉｃ Ｔ，Ｐｅｓｋｏ Ｐ，Ｍａｌｆｅｒｔｈｅｉｎｅｒ Ｐ（２００４ｂ）Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｏｓａ ｉｓ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｉｎ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇａｓｔｒｏｄｕｏｄｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｄｉｇ Ｄｉｓ ２２（４），３９０−５．
【０２２３】
Ｗｅｘ Ｔ，Ｙｅ Ｓ，Ｔｒｅｉｂｅｒ Ｇ，Ｖｉｅｔｈ Ｍ，Ｒｏｅｓｓｎｅｒ Ａ， Ｍａｌｆｅｒｔｈｅｉｎｅｒ Ｐ（２００６）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｏｗ−ｄｏｓｅ ａｓｐｉｒｉｎ，ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａ ｌｏｃａｌ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｄｕｏｄｅｎａｌ ｍｕｃｏｓａ．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ １１（１），３１−８．
【０２２４】
Ｗｈｅｅｌｈｏｕｓｅ Ｎ，Ｗａｔｔｅｇｅｄｅｒａ Ｓ，Ｆｌｅｍｉｎｇ Ｄ，Ｆｉｔｃｈ Ｐ，Ｋｅｌｌｙ Ｒ，Ｅｎｔｒｉｃａｎ Ｇ．Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ａｎｄ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｂｏｒｔｕｓ ｉｎｄｕｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＬＰＩ） ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｍａｌｅ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ．原稿執筆中。
【０２２５】
Ｗｉｅｄｏｗ Ｏ，Ｌｕａｄｅｍａｎｎ Ｊ，Ｕｔｅｃｈｔ Ｂ（１９９１）Ｅｌａｆｉｎ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １７４（１），６−１０．
【０２２６】
Ｗｉｎｇｅｎｓ Ｍ，ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ＢＨ，Ｈｉｅｍｓｔｒａ ＰＳ，Ｍｅｉｓ ＪＦ，ｖａｎ Ｖｌｉｊｍｅｎ−Ｗｉｌｌｅｍｓ ＩＭ，Ｚｅｅｕｗｅｎ ＰＬ，Ｍｕｌｄｅｒ Ｊ，Ｋｒａｍｐｓ ＨＡ，ｖａｎ Ｒｕｉｓｓｅｎ Ｆ，Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ Ｊ（１９９８）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＬＰＩ（ＡＬＰ／ＨＵＳＨ） ｉｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１１（６），９９６−１００２．
【０２２７】
Ｚｈｕ Ｊ，Ｎａｔｈａｎ Ｃ，Ｊｉｎ Ｗ，Ｓｉｍ Ｄ，Ａｓｈｃｒｏｆｔ ＧＳ，Ｗａｈｌ ＳＭ，Ｌａｃｏｍｉｓ Ｌ，Ｅｒｄｊｕｍｅｎｔ−Ｂｒｏｍａｇｅ Ｈ，Ｔｅｍｐｓｔ Ｐ，Ｗｒｉｇｈｔ ＣＤ，Ｄｉｎｇ Ａ（２００２）Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｎ ｔｏ ｅｐｉｔｈｅｌｉｎｓ：ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＳＬＰＩ ａｎｄ ｅｌａｓｔａｓｅ ｉｎ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ．Ｃｅｌｌ １１１（６），８６７−７８．
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮外（又は異所性）妊娠を同定する方法に関するものであり、子宮外妊娠のマーカーであることが今や知られるに至った特定の分子の存在について試料をスクリーニングすることを含む。
【背景技術】
【０００２】
妊娠の全てのうちのわずかな比率のものが子宮外の位置で起き、別名では異所性妊娠として知られている。英国では年間およそ１２，０００症例の異所性妊娠がある（１）。
【０００３】
子宮外または異所性の妊娠は、免疫学的かつ形態学的に正常な胚が異常に着床した場合に起きる。典型的には、受精した胚の着床は、子宮の外側で起き、これには、卵管内の着床（卵管妊娠）が含まれ得るが、着床は他の位置でも起こる可能性がある。
【０００４】
子宮外の着床の素因である病原性事象は依然として不明である。卵管のような異所性部位での胚の着床は、外来病原体に対する正常な宿主免疫応答が破壊された結果のようである。脱落膜化（妊娠と共に起きる子宮内膜の変化）は、妊娠の成功の鍵となる免疫学的要素である。子宮外妊娠に伴って、子宮腔では脱落膜反応があるが、普通、卵管ではそれはない。
【０００５】
異所性妊娠の誤診は、結果的に死につながる可能性がある。現在、異所性妊娠は、患者の一般症状（出血及び痛みの存在を特に重視）、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の繰り返し（連続）試験、並びに経膣超音波（子宮内妊娠があるかどうかの確定のため）の評価によって診断される。これらの存在は、時間がかかり、国民医療サービスにとって財政的に、及び患者にとって心理的に犠牲が大きい。さらに、それらはしばしば、診断を確定するために、腹腔鏡検査（キーホール手術）についての不要な必要性を生じ、その固有の危険性を伴う（４）。さらに、異所性妊娠全てのうちの半分は、診断されないか、又は誤診されるかのいずれかである。初期の診断が、卵管の完全性の最適な保存（将来の受精能を失わないように）のために、及び生命を脅かす腹部出血の可能性を防ぐために必須である（２）。従って、新しい診断法を確立する重要な意欲がある。
【０００６】
プレゲノム時代では、一つずつの科学的なアプローチは、異所性妊娠に血液検査として使用され得るマーカーの解明に成功しなかった（５〜７）（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｒｋｈａｈｎ ＲＨら、Ａｎｎ Ｅｍｅｒｇ Ｍｅｄ ２００１ ３８（６）：６２８−３２．
【非特許文献２】Ｗｅｇｎｅｒ ＮＴら、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２００１ １８４（６）：１０７４−６．
【非特許文献３】Ｄｅｖｅｌｉｏｇｌｕ ＯＨら、Ｂｒｉｔ Ｊ Ｏｂｓ Ｇｙｎ ２００２ １０９（２）：１２１−８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、前述の問題のうちの少なくとも１つを取り除く又は軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、異所性又は子宮外妊娠、特に例えば、卵管妊娠を同定する改善された方法を提供する。具体的には、この方法は、被験体によって提供された試料中の特定の遺伝子及び／又はタンパク質のレベルを同定し、それらの遺伝子及び／又はタンパク質のレベルが異所性妊娠の指標であるかどうかを決定することを必要とする。
【００１０】
従って、第１の態様では、本発明は異所性妊娠を同定する方法を提供し、本方法は、
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）試料中の以下の１以上のレベルを同定する工程とを含み、
（ｉ）インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子
（ｉｉ）アクチビンＢ
（ｉｉｉ）システイン−リッチ分泌型タンパク質３（ＣＲＩＳＰ−３）及び／又は
（ｉｖ）カルボキシペプチダーゼ−Ｂ１（ＣＰＢ１）
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である。
【００１１】
本明細書で使用されるとき、用語「インヒビン／アクチビンβＢサブユニット」及び／又は「アクチビンＢ」は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニットをコードする遺伝子及び／又はそのタンパク質産物（即ち、アクチビンＢ）のいずれかを指し示すことを意図することが理解されるべきである。さらに、用語「レベル」又は「量」は、遺伝子及び／又はタンパク質発現のレベル又は量に関係すると理解すべきであることが理解されるべきである。
【００１２】
さらに、本明細書で使用されるとき、用語「ＣＲＩＳＰ−３」及び／又は「ＣＰＢ１」は、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする遺伝子及び／又はそのタンパク質産物（即ち、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１）のいずれかを指し示すことを意図することが理解されるべきである。ＣＲＩＳＰ−３は、別名では、２８ｋＤａの特異的顆粒タンパク質（ＳＧＰ２８）として知られ得ることに留意することが重要である。それは、精漿、前立腺、膵臓、好中球、唾液、汗及び血液で見出されているが、そのタンパク質の機能についてはほとんど知られておらず、作用の一般的様式も記載されていない（Ｂｊａｒｔｅｌｌ Ａら Ｐｒｏｓｔａｔｅ．２００６ ６６（６）：５９１−６０３；Ｕｄｂｙ Ｌら Ｊ Ａｎｄｒｏｌ．２００５ ２６（３）：３３３−４２）。ＣＰＢ１又はカルボキシペプチダーゼＢ１は、膵臓傷害に関連して研究されてきた（Ａｐｐｅｌｒｏｓ Ｓら Ｇｕｔ．１９９８ ４２：９７−１０２；Ａｐｐｅｌｒｏｓ Ｓら Ｂｒ Ｊ Ｓｕｒｇ ２００１ ８８：２１６−７）。それは、炎症応答を刺激すると考えられており、血漿及び尿中に見出されている。
【００１３】
異所性妊娠を同定するために、当業者が、被験体によって提供された試料中の、本明細書中に記載された物質（遺伝子及び／又はタンパク質）のいずれか１つのレベルを同定することを選択し得ることが理解されるべきである。あるいは、被験体によって提供された同じ又は多数の異なる試料中の前述の物質のいずれか２以上のレベルを同定してもよい。
【００１４】
実施態様の１つでは、被験体によって提供される試料は、例えば、全血、血漿、血清、唾液、汗及び／又は尿を含んでいてもよい。好ましくは、試料は、全血、血清及び／又は血漿を含む。さらに、又は代わりに、試料は、特定の組織に由来する生検、小片又は塗抹標本を含んでいてもよい。例示としては、及び実施態様の１つでは、試料は、子宮脱落膜を含んでいてもよい。さらなる実施態様では、試料は、分泌物又は洗浄物を含んでいてもよい。例えば、試料は、膣又は子宮の分泌物を含んでいてもよい。
【００１５】
本発明は、哺乳類の被験体、特にヒトにおける異所性妊娠の同定において特定の適用を有する。
【００１６】
本明細書中に記載される方法によって試験される被験体は、最初に、特定の症状を示していてもよく、従って、異所性妊娠を有することが疑われていてもよい。異所性妊娠の指標である症状としては、例えば、軽い／激しい痛み、軽い／激しい膣出血、超音波にて検知できない子宮内妊娠、及び異常なレベルの連続的血清ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）レベル（例、４８時間にわたって倍増しない）が挙げられる。あるいは、被験体は、無症状であってもよく、さらなる実施態様では、被験体は、異所性妊娠を発生するリスクがあってもよく、又はその素因があってもよい。
【００１７】
異所性妊娠を有すると同定された被験体では、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体のいずれかにおけるインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現のレベルと比較した場合、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現のレベルが低下することが理解されるべきである。同様に、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体のいずれかに存在するアクチビンＢのレベル（例えば、全身性のレベル）と比較した場合、アクチビンＢのレベル（特に、全身性のレベル）は低下する。
【００１８】
異所性妊娠を有すると同定された被験体では、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体のいずれかに存在するＣＲＩＳＰ−３のレベルと比較した場合、ＣＲＩＳＰ−３のレベルは上昇し得る。さらに、異所性妊娠を有すると同定された被験体におけるＣＰＢ１のレベルは、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体のいずれかに存在するＣＰＢ１のレベルと比較した場合、低下する。
【００１９】
従って、異所性妊娠を同定するために、当業者は、本明細書中に記載される方法のいずれかから得られた結果（即ち、被験体によって提供された試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベル）を、参照又は対照試料中の同じタンパク質及び／又は遺伝子のレベルと、又は参照値と比較してもよい。
【００２０】
従って、実施態様の１つでは、本発明は、異所性妊娠を同定する方法を提供し、本方法は、
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）試料中の以下の１以上のレベルを同定する工程と、
（ｉ）インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子
（ｉｉ）アクチビンＢ
（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰ−３及び／又は
（ｉｖ）ＣＰＢ１
（ｃ）試料中で同定されたインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを、参照試料中で同定されたインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベル、又は参照値と比較する工程とを含み、
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である。
【００２１】
「参照試料」は、妊娠していない被験体、又は正常な、即ち、進行中の子宮内妊娠を有する（超音波により子宮腔内に胎児性心臓および胎児性ポール（ｆｏｅｔａｌ ｐｏｌｅ）が見られる）、若しくは不全の子宮内妊娠を有する（子宮腔内に胎児性心臓はないが、胎児性ポールはある）被験体（参照被験体）に由来する試料であるとみなされ得る。好ましくは、参照試料は、被験体に由来する試料と同じ種類の試料であるべきである。例えば、被験体によって提供される試料が血液血漿を含む又はそれからなる場合には、参照試料もそのようにあるべきである。有利なことには、被験体により提供される試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルは、それぞれ異なる参照被験体に由来する多数の参照試料中の同じタンパク質及び／又は遺伝子のレベルと比較されてもよい。
【００２２】
参照値は、参照試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを表すとみなされ得る。有利なことには、参照値は、多数の異なる参照被験体に由来する多数の参照試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルの平均値を表してもよい。
【００２３】
実施態様の１つでは、被験体によって提供された試料で同定されたインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルはまた、異所性妊娠を有することが把握されている被験体に由来する試料中の同じタンパク質及び／又は遺伝子のレベルと比較されてもよい。このような試料は、別名では、陽性対照として知られ得る。
【００２４】
要約すれば、参照試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現レベルよりも低いインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現レベルを示す試料は、子宮外妊娠を有する被験体に由来し得る。参照試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現レベルと同等以上であるインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現のレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有さない被験体に由来し得る。参照試料中に存在するアクチビンＢのレベルよりも低いアクチビンＢのレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有する被験体に由来し得る。参照試料中に存在するアクチビンＢのレベルと同等以上のアクチビンＢのレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有さない被験体に由来し得る。
【００２５】
例示としては、参照試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現レベルと比べた場合、試験した試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現の量における約１％の低下が、子宮外妊娠を示してもよい。好ましくは、試験した試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現の量における約２％、さらに好ましくは約５％、一層さらに好ましくは約１０％の低下が、子宮外妊娠を示してもよい。他の場合には、少なくとも約１５％〜約１００％の低下が子宮外妊娠の指標である。
【００２６】
参照試料中に存在するアクチビンＢのレベルと比べた場合、試験した試料中のアクチビンＢの量における約１％の低下が、子宮外妊娠を示してもよい。好ましくは、試験した試料中のアクチビンＢの量における約２％、さらに好ましくは約５％、一層さらに好ましくは約１０％、尚一層好ましくは約２０％の低下が、子宮外妊娠を示してもよい。他の場合には、アクチビンＢの量における少なくとも約３０％〜約１００％の低下が、子宮外妊娠の指標である。
【００２７】
参照試料中に存在するＣＲＩＳＰ−３のレベルより高いＣＲＩＳＰ−３のレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有する被験体に由来し得る。参照試料中に存在するＣＲＩＳＰ−３のレベルと同等以下であるＣＲＩＳＰ−３のレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有さない被験体に由来し得る。参照試料中に存在するＣＢＰ１のレベルより低いＣＢＰ−１のレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有する被験体に由来し得る。参照試料中に存在するＣＢＰ１のレベルと同等以上であるＣＢＰ−１のレベルを示す試料は、子宮外妊娠を有さない被験体に由来し得る。
【００２８】
例示としては、参照試料中に存在するＣＲＩＳＰ−３のレベルと比べた場合、試験した試料中のＣＲＩＳＰ−３の量における約１％の増加が、子宮外妊娠を示してもよい。好ましくは、試験した試料中のＣＲＩＳＰ−３の量における約１０％、さらに好ましくは約１００％、一層さらに好ましくは約１０００％の増加が、子宮外妊娠を示してもよい。典型的には、少なくとも約１０％〜約１０００％の増加が、子宮外妊娠の指標である。
【００２９】
参照試料中に存在するＣＰＢ１のレベルと比べた場合、試験した試料中のＣＰＢ１の量における約１％の低下が、子宮外妊娠を示してもよい。好ましくは、試験した試料中のＣＲＩＳＰ−３の量における約１０％、さらに好ましくは約１００％、一層さらに好ましくは約１０００％、尚一層さらに好ましくは約３０００％の低下が、子宮外妊娠を示してもよい。
【００３０】
当業者は、上記で列記されたもののような試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のようなタンパク質及び／又は遺伝子のレベルの同定に使用され得る技術に精通しているであろう。
【００３１】
実施態様の１つでは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤を利用する、免疫学的技術のような技術によって同定されてもよい。そのような方法は特に、特定のタンパク質のレベルを同定するために適する。
【００３２】
実施態様の１つでは、本発明は、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の基材への会合、相互作用、結合及び／又は固定を可能にする条件下で、試験されるべき試料に、前記基材（又はその一部）を接触させる工程を含む方法を提供してもよい。
【００３３】
好適な基材としては、例えば、ガラス、ニトロセルロース、紙、アガロース及び／又はプラスチックが挙げることができる。例えば、プラスチック材料のような基材はマイクロタイタープレートの形態を取ってもよい。当業者は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１からなる群のうちの２以上のレベルを試料中で同定すべき場合、１以上の基材を使用してもよいことを理解するであろう。例えば、物質の前述の群の２つのレベルを同定すべき場合、２つの基材を使用してもよく、検出される各物質につき１つを使用してもよい。
【００３４】
あるいは、試験されるべき試料に接触される基材は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤を含んでいてもよい。好ましくは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤は、基材（又はその少なくとも一部）に結合される。好適な結合剤には、例えば、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得るモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のような抗体（又はその抗原結合断片）、オリゴヌクレオチド及び／又はその他の種類のペプチド又は低分子が挙げられてもよい。この定義は、本明細書中で言及されるあらゆる種類の結合剤に適用されることが理解されるべきである。従って、基材（又はその一部）は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤と、試料中に存在する任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１との間の結合又は相互作用を可能にする条件下で、試験されるべき試料に接触されてもよい。
【００３５】
基材に結合した任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１、又はインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得るさらなる剤（本明細書では以降、「一次結合剤」と呼ぶ）の使用によって検出されてもよい。さらに、又は代わりに、一次結合剤は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１と基材との複合体、あるいはインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１と、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る前述の剤とを含む複合体に対して、親和性を有してもよく、又は結合してもよい。
【００３６】
一次結合剤は、その検出を可能にする部分（本明細書では以降、「検出可能部分」と呼ぶ）に結合し得る。例えば、一次剤は、比色化学発光反応を介してレベルを伝え得る酵素に結合し得る。そのような結合される酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＫＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、又は代わりに、一次結合剤は、例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン又はテキサスレッドのような蛍光体（特にオリゴヌクレオチドの標識に有用）のような蛍光分子に結合し得る。結合剤に結合してもよいその他の種類の分子には、放射性標識部分が挙げられる。
【００３７】
あるいは、基材に結合した任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１、あるいはインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤は、一次結合剤に対して親和性を有する、なおさらなる結合剤（本明細書では以降、「二次結合剤」と呼ぶ）によって検出されてもよい。好ましくは、二次結合剤は、検出可能部分に結合される。
【００３８】
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１に結合した一次結合剤（又はそれに結合した二次結合剤）の量は、試験された試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを表し得る。
【００３９】
実施態様の１つでは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを同定する前述の方法は、「浸漬スティック（ｄｉｐ−ｓｔｉｃｋ）」試験の形態を取ってもよく、その際、１以上の基材（又はその一部）が、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の基材又はそれに結合した若しくは固定された結合剤への結合を可能にする条件下で、試験されるべき１以上の試料に接触される。
【００４０】
さらなる実施態様では、方法は、例えば、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような免疫学的アッセイの形態を取ってもよい。ＥＬＩＳＡは、「捕捉」ＥＬＩＳＡの形態を取ってもよく、その際、試験されるべき試料が、基材に接触され、そして試料中に存在する任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１が、基材に結合された又は固定された（インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る）結合剤によって、「補足される」又は結合される。あるいは、試料は、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１と基材との間で「直接」結合を可能にする条件下で、基材に接触されてもよい。
【００４１】
上記のＥＬＩＳＡ法のそれぞれが、「直接」のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の検出工程、又は「間接」の同定工程を含んでいてもよい。そのような工程を利用するＥＬＩＳＡは、「直接」ＥＬＩＳＡ又は「間接」ＥＬＩＳＡとして知られてもよい。
【００４２】
「直接」ＥＬＩＳＡには、試料中に存在する任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の基材及び／又はそれに結合した結合剤への結合を可能にする条件下で、試験されるべき試料を基材に接触させることが含まれてもよい。任意のブロッキング工程の後、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤（すなわち、一次結合剤）を手段として、結合させたインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を検出してもよい。好ましくは、一次結合剤は、検出可能部分に結合させる。
【００４３】
「間接」ＥＬＩＳＡは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を一次結合剤と接触させた後、一次結合剤に親和性又は特異性を持つさらなる結合剤（二次結合剤）を用いるさらなる工程を含んでいてもよい。好ましくは、二次結合剤は、検出可能部分に結合させてもよい。
【００４４】
試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを同定するために使用してもよいその他の免疫学的技術には、例えば、免疫組織化学が挙げられ、その際、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１と、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１との間での結合を可能にする条件下で、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る抗体のような結合剤を、試料、好ましくは組織試料と接触させる。典型的には、試料を結合剤と接触させるのに先立って、例えば、トリトンＸ１００のような界面活性剤で試料を処理する。そのような技術は、「直接」免疫組織化学染色と呼ばれ得る。
【００４５】
あるいは、試験されるべき試料を、間接免疫組織化学染色プロトコルに供してもよく、その際、試料を、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の結合剤に接触させた後、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１結合剤に特異性がある、親和性がある又はそれを結合し得るさらなる結合剤（二次結合剤）を用いて、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１と結合剤との複合体を検出する。
【００４６】
熟練者は、直接及び間接双方の免疫組織化学技術において、結合剤又は二次結合剤を検出可能部分に結合させてもよいことを理解するであろう。好ましくは、結合剤又は二次結合剤は、比色化学発光反応を介して、結合した結合剤又は二次結合剤のレベルを伝えることが可能である部分に結合される。
【００４７】
試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを同定するために、免疫組織化学染色の結果を、参照試料で実施した免疫組織化学染色の結果と比較してもよい。例示としては、参照試料よりも結合したインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子結合剤（又は二次結合剤）が少ないことを示す試料は、異所性妊娠の被験体によって提供されたものであってもよい。参照試料よりも結合したアクチビンＢ結合剤（又は二次結合剤）が少ないことを示す試料は、異所性妊娠の被験体によって提供されたものであってもよい。参照試料よりも結合したＣＲＩＳＰ−３結合剤（又は二次結合剤）が多いことを示す試料は、異所性妊娠の被験体によって提供されたものであってもよい。参照試料よりも結合したＣＢＰ１結合剤（又は二次結合剤）が少ないことを示す試料は、異所性妊娠を有さない被験体によって提供されたものであってもよい。
【００４８】
参照試料で同定された結合剤（又は二次結合剤）の量と同等以上であるインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子結合剤（又は二次結合剤）の量を示す試料は、異所性妊娠を有さない被験体に由来したものであってもよい。参照試料で同定された結合剤（又は二次結合剤）の量と同等以上であるアクチビンＢ結合剤（又は二次結合剤）の量を示す試料は、異所性妊娠を有さない被験体に由来したものであってもよい。参照試料で同定された結合剤（又は二次結合剤）の量と同等以下であるＣＲＩＳＰ−３結合剤（又は二次結合剤）の量を示す試料は、異所性妊娠を有さない被験体に由来したものであってもよい。参照試料で同定された結合剤（又は二次結合剤）の量と同等以上であるＣＢＰ１結合剤（又は二次結合剤）の量を示す試料は、異所性妊娠を有さない被験体に由来したものであってもよい。
【００４９】
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤の使用を活用するその他の技術には、例えば、ウエスタンブロット又はドットブロットのような技術が挙げられる。ウエスタンブロットには、例えば、試料のタンパク様成分及び／又は核酸成分のような成分を分離又は分解するために、試料を電気泳動に供することが含まれる。次いで分解された成分を、例えば、ニトロセルロースのような基材上に移してもよい。試料中に存在する任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を同定するために、試料中に存在する任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１と、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤との間の結合を可能にする条件下で、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る結合剤に基材を接触させてもよい。
【００５０】
有利なことには、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る剤を、検出可能部分に結合させてもよい。
【００５１】
あるいは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１を結合し得る結合剤に親和性を有するさらなる結合剤に基材を接触させてもよい。有利なことには、さらなる結合剤を、検出可能部分に結合させてもよい。
【００５２】
ドットブロットの場合、試料中に存在する任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１が基材上に結合されるように、又は基材上に固定されるように、試料又はその一部を、基材に接触させてもよい。結合された又は固定された任意のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の同定は、上述のように行われてもよい。
【００５３】
前述の技術のいずれにおいても、検出される一次又は二次の結合剤の量は、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の量を表すか、又はそれに比例する。
【００５４】
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを同定するために使用してもよいその他の技術には、例えば、リアルタイムＰＣＲ（別名では定量的ＰＣＲとして知られる）のようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技術が挙げられる。そのような技術を用いて、特定の核酸配列が試料中に存在するのかどうか、及びその核酸の発現のレベルを決定してもよい。この場合、リアルタイムＰＣＲを用いて、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子の核酸配列、又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする核酸配列が試料中に存在するのかどうか、及びそれらの核酸配列の発現のレベルを決定してもよい。典型的には、及び特定の核酸配列の発現のレベルを定量するために、逆転写酵素ＰＣＲを用いて、関連するｍＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写してもよい。好ましくは、逆転写酵素のプロトコルは、目的のｍＲＮＡ配列を特異的に増幅するように設計されたプライマーを使用してもよい。その後、ＰＣＲを用いて、逆転写によって生成されたｃＤＮＡを増幅してもよい。
【００５５】
典型的には、特定の配列と特異的にハイブリダイゼーションを行うように設計されたプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅し、ＰＣＲに使用されるヌクレオチドを、蛍光化合物又は放射性標識された化合物で標識してもよい。
【００５６】
当業者は、ＰＣＲの間に生成されたＤＮＡの量を定量することを可能にする標識ヌクレオチドを用いる技術に精通するであろう。手短には、及び例示としては、標識され増幅された核酸の量を、ＰＣＲサイクル中に取り込まれた標識ヌクレオチドの量をモニターすることによって決定してもよい。
【００５７】
好ましくは、得られた結果を、参照試料から得られた結果と比較してもよい。
【００５８】
本明細書で記載されるＰＣＲに基づく技術のさらなる情報は、例えば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃａｒｌ Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｇａｂｒｉｅｌａ Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編による、実験室マニュアル（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｄａｖｉｄ Ｒｕｓｓｅｌｌによる実験室マニュアル、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に見出され得る。
【００５９】
試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを決定するために使用してもよいその他の技術には、例えば、ノザンブロット法及び／又はサザンブロット法が挙げられる。ノザンブロットを用いて試料中に存在する特定のｍＲＮＡの量を決定し得るので、それを用いて、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする核酸の量を決定してもよい。簡単に言えば、当業者に既知の技術を用いて試料からｍＲＮＡを抽出し、電気泳動に供してもよい。次いで、目的のｍＲＮＡ（この場合、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子に由来するｍＲＮＡ又はアクチビンＢタンパク質をコードするｍＲＮＡ）にハイブリッドする（すなわち、それに相補的である）ように設計された核酸プローブを用いて試料中に存在する特定のｍＲＮＡを検出し、その量を定量してもよい。有利なことには、得られた結果を、参照試料から得られた結果と比較してもよい。
【００６０】
同様に、サザンブロットを用いて、試料中の任意の所定のＤＮＡ配列の存在及び量を検出してもよく、それを用いて、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子の配列、及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする核酸配列を検出してもよい。簡単に言えば、試料から核酸を抽出し、断片化プロトコルに供し、電気泳動によって分離し、核酸プローブによって特定配列の存在について探査してもよい。この場合、核酸プローブは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子の核酸配列、及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする核酸の配列とハイブリダイゼーションしてもよい（すなわち相補的）。有利なことには、得られた結果を、参照試料から得られた結果と比較してもよい。
【００６１】
追加的に、又は交換的に、試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルは、マイクロアレイ解析の手段によって同定されてもよい。そのような方法には、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子に由来する核酸及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする核酸を含むＤＮＡのマイクロアレイの使用が含まれる。試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１のレベルを同定するために、当業者は、試料から核酸、好ましくはｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素ＰＣＲのような増幅プロトコルにそれを供し、ｃＤＮＡを生成してもよい。好ましくは、特定のｍＲＮＡ配列（この場合、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子の配列及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする配列）に特異的なプライマーを使用してもよい。
【００６２】
増幅された（インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする遺伝子）ｃＤＮＡは、必要に応じて、標識ヌクレオチド（上述のような）の存在下で、さらなる増幅工程に供されてもよい。その後、マイクロアレイのＤＮＡとの結合を可能にする条件下にて、必要に応じて標識され、増幅されたｃＤＮＡを、マイクロアレイと接触させてもよい。このように、試験された試料中に存在するインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現レベル及び／又はアクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１をコードする遺伝子発現レベルを同定することが可能であってもよい。有利なことには、得られた結果を、参照試料から得られた結果と比較してもよい。
【００６３】
上述の技術に関するさらなる情報は、例えば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃａｒｌ Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｇａｂｒｉｅｌａ Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編による、実験室マニュアル（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｄａｖｉｄ Ｒｕｓｓｅｌｌによる実験室マニュアル、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に見出され得る。
【００６４】
実施態様の１つでは、異所性妊娠を同定するさらに信頼できる方法を提供するために、本発明によって提供される方法を、既存の診断法と組み合わせてもよい。例えば、本方法を、連続ｈＣＧアッセイ、超音波法及び／又は腹腔鏡検査と組み合わせてもよい。
【００６５】
当業者は、本明細書で記載される方法が多数のアッセイを提供し、そのそれぞれが異所性妊娠を同定し、及び／又は診断するために使用されてもよいことを十分に理解するであろう。任意の所定のアッセイがインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１からなる群より選択される１つの物質のレベルの同定を含んでいてもよい一方で、ユーザーは、前述の物質の２以上のレベルの同定を含むアッセイを実施したいと考え得ることが理解されるべきである。当業者は、２以上の前述の物質（すなわち、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１）のレベルを同定するアッセイが異所性妊娠をさらに迅速及び／又は正確に同定及び／又は診断し得る方法を提供し得ることを十分に理解するであろう。
【００６６】
上記に加えて、インヒビンαサブユニットの発現レベルにおける変化も異所性妊娠の指標であり得ることが理解されるべきである。従って、本明細書中に記載される方法及び手順のそれぞれはインヒビンαのレベルとも関係し、異所性妊娠の場合、そのレベルは、低下したレベル（対照、又は上述のような参照試料との比較）で検出されてもよい。さらに、インヒビンαのレベルの同定を含む方法は、例えば、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３及び／又はＣＰＢ１の同定に関する、本明細書で記載される方法のいずれか又は全てと組み合わせられてもよいことが理解されるべきである。
【００６７】
本発明者らはまた、天然の抗菌ペプチドである分泌型白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）及びエラフィンのレベルが異所性妊娠又は卵管妊娠の被験体で上昇することを発見した。従って、本明細書中に記載される方法及び／又は技術のいずれかは、被験体によって提供される試料中のＳＬＰＩ及び／又はエラフィンのレベルを同定することを含む異所性妊娠を同定する方法を包含する（又はそれに関して必要とされる）ようにさらに拡大されてもよく、その際、試料中のＳＬＰＩ及び／又はエラフィンのレベルは、異所性妊娠の指標である。当業者は、被験体から得られた試料中のタンパク質を同定するために好適な、本明細書中に記載される技術のいずれか（例えば、免疫学的技術及び／又はＰＣＲに基づいた技術）を用いてＳＬＰＩ及び／又はエラフィンのレベルを同定してもよいことを十分に理解するであろう。さらに、ＳＬＰＩ及び／又はエラフィンのレベルの同定を含む方法は、例えば、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１及び／又はインヒビンαの同定に関する、本明細書で記載される方法のいずれか又は全てと組み合わせられてもよいことが理解されるべきである。
【００６８】
上記に加えて、本発明者らは、異所性妊娠又は卵管妊娠の被験体でプロラクチンのレベルが低下することに気付いた。従って、本明細書中に記載される方法及び／又は技術のいずれかは、被験体によって提供される試料中のプロラクチンのレベルを同定することを含む異所性妊娠を同定する方法を包含する（又はそれに関して必要とされる）ようにさらに拡大されてもよく、その際、試料中のプロラクチンのレベルは、異所性妊娠の指標である。当業者は、被験体から得られた試料中のタンパク質を同定するために好適な、本明細書中に記載される技術のいずれか（例えば、免疫学的技術及び／又はＰＣＲに基づいた技術）を用いてプロラクチンのレベルを同定してもよいことを十分に理解するであろう。さらに、プロラクチンのレベルの同定を含む方法は、例えば、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ及び／又はエラフィンの同定に関する、本明細書で記載される方法のいずれか又は全てと組み合わせられてもよいことが理解されるべきである。
【００６９】
例示としては、及び実施態様の１つでは、異所性妊娠を同定する方法は、被験体由来の１以上の試料を提供し、前記試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンの１以上のレベルを同定する工程を含んでいてもよい。
【００７０】
上記に加えて、及び本明細書で言及された物質（遺伝子及びタンパク質）のレベルが妊娠、特に異常な妊娠に関連付けられるという事実を考慮すると、本明細書に記載された方法のいずれかを用いて妊娠及び／又は異常な妊娠を同定する及び／又は診断することが可能であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】子宮脱落膜におけるインヒビン／アクチビンサブユニットｍＲＮＡの発現：ａ）βＢサブユニットは、差示的に発現する（ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。流産の外科的処置（Ｍｉｓｃ）（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）及び外科的妊娠中絶（ＴＯＰ）（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）を受けている女性のものと比べた場合、卵管異所性妊娠（異所性）の女性ではそれは低下している。ｂ）これらの群でβＡの発現には差異はなかった（ＡＮＯＶＡ）。ｃ）αサブユニットは、群で差示的に発現し（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）、流産よりも異所性妊娠で発現は低かった（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。
【図２】インヒビン／アクチビンのαサブユニットとβＡサブユニットについての免疫組織化学：ａ）妊娠顆粒膜黄体細胞（ＧＬＣ）における局在（茶色）及び周辺の間質（Ｓｔ）における非染色を示す陽性対照としての、αサブユニットについて免疫染色されたヒト黄体。ｂ）間質（Ｓ）におけるより明るい染色を伴う、脱落膜化した組織（Ｇ）の子宮内膜腺におけるαサブユニットについての染色。ｃ）近隣の卵胞膜細胞（ｔｃ）における弱い染色を伴う、顆粒膜細胞（ｇｃ）における顕著な染色（茶色）を示す陽性対照としての、βＢサブユニットについて免疫染色されたヒト卵胞。ｄ）幾らかの腺（Ｇ）及び間質（Ｓ）局在を示す脱落膜におけるβＢサブユニットについての染色。ｅ）腺上皮（Ｇ）における細胞質染色及び間質細胞（Ｓ）における最小染色を示す卵管異所性妊娠の女性からの脱落膜βＢサブユニットの局在。ｆ）間質細胞（Ｓ）におけるより強い免疫染色の証拠を伴う、腺における同様の発現パターンを示す流産の外科的処置を受けている女性からの子宮脱落膜。ｇ）腺上皮（Ｇ）及び間質細胞（Ｓ）の双方でのβＢ免疫局在を示すＴＯＰを受けている女性からの子宮脱落膜。腺（Ｇ）又は間質（Ｓ）における特異的な免疫染色を示さない（ｇ）の陰性対照部分。スケール・バー＝５０μｍ（１００μｍであるｃ）を除く）。
【図３】インビトロにおける子宮内膜間質細胞の脱落膜化の間のインヒビン／アクチビンのサブユニットｍＲＮＡの発現。ａ）βＢの発現は、脱落膜化の間に増加した（ｐ＜０．０５）（ＡＮＯＶＡ、ピアソン相関）。ｂ）αサブユニットの発現も増加した（ｐ＜０．０５）が、顕著な程度ではない（ＡＮＯＶＡ、ピアソン相関）。ｃ）βＡサブユニットの発現には差異はなかった（ＡＮＯＶＡ、ピアソン相関）。Ｔ１＝０時間、Ｔ２＝２４時間、Ｔ３＝４８時間、Ｔ４＝７２時間、Ｔ５＝９６時間、Ｔ６＝１２０時間。
【図４】インビボにおける子宮内膜の脱落膜化の程度の形態学的評価。ａ）流産の外科的処置（Ｍｉｓｃ）、妊娠中絶（ＴＯＰ）及び卵管異所性妊娠（異所性）から回収した子宮内膜における腺上皮の分泌変化及び間質の脱落膜化のレベルのスコア化。ｂ）生検脱落膜化の形態学的程度の分類（＋、＋／−、−）は、異所性妊娠の子宮内膜があまり脱落膜化されないことを示した（ｐ＜０．０５、カイ２乗）。ｃ）脱落膜化のレベル（−、＋／−、＋）と脱落膜のインヒビン／アクチビンβＢ発現との間の相関（ｐ＝０．０００５、スピアマン相関）。
【図５】脱落膜化の鍵となるマーカーの発現。ａ）ＩＧＦＢＰ１の発現は、群間で異なっていた（ｐ＜０．００５、クラスカル・ウォリス）。流産（Ｍｉｓｃ）（ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス）又は妊娠中絶（ＴＯＰ）（ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス）と比べた場合、それは、卵管異所性妊娠（異所性）でさらに低かった。ｂ）プロラクチンの発現も、群間で異なる（ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス）。妊娠中絶と比べた場合、それは、異所性妊娠でさらに低かった（ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス）。
【図６】血清アクチビンＢ及びプロゲステロン濃度。ａ）流産（Ｍｉｓｃ）及び妊娠中絶（ＴＯＰ）と比べた場合、血清アクチビンＢは、卵管異所性妊娠（異所性）で最も低い（ｐ＝０．００１、ＡＮＯＶＡ）。ｂ）血清アクチビンＢは、子宮内妊娠（ＩＵＰ）より卵管妊娠（ＥＰ）のほうが低い（ｐ＜０．００５、ｔ−検定）。ｃ）アクチビンＢと脱落膜化の程度（＋、＋／−、−）との間に相関がある（ｐ＝０．００５、スピアマン相関）。ｄ）血清プロゲステロンは、流産で最も低い（ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス）。ｅ）子宮内妊娠を卵管妊娠と比べた場合、プロゲステロン濃度に差異はなかった（ｔ−検定）。ｆ）脱落膜化の程度と血清プロゲステロンの濃度との間に相関はなかった（スピアマン相関）。
【図７】子宮内（ＳＴＯＰ及び流産）妊娠、並びに子宮外（卵管）妊娠の女性からの子宮脱落膜におけるＣＲＩＳＰ−３（図７ａ）及びＣＰＢ１（図７ｂ）のレベルを実証する定量的ＲＴ−ＰＣＲ。
【図８】卵管妊娠の子宮脱落膜におけるＣＲＩＳＰ３についての免疫組織化学。腺上皮及び分泌物における最も強い発現。
【図９】外科的妊娠中絶（ＳＴＯＰ）、流産の外科的処置及び異所性妊娠の外科的処置を受けている女性からの子宮脱落膜における相対的ＳＬＰＩ（Ａ）及びエラフィン（Ｂ）ｍＲＮＡ発現のグラフによる表示。
【図１０】異所性妊娠の外科的処置、流産の外科的処置、及び外科的妊娠中絶（ＳＴＯＰ）を受けている女性からの子宮脱落膜における免疫組織化学によって実証されたＳＬＰＩ及びエラフィンタンパク質の発現。異所性妊娠の外科的処置（Ａ及びＢ）及び流産の外科的処置（Ｃ）を受けている女性からの子宮脱落膜の白血球（Ｌ）及び上皮腺（Ｇ）におけるＳＬＰＩタンパク質の発現。異所性妊娠の外科的処置（Ｄ）、流産の外科的処置（Ｅ）、及び外科的妊娠中絶（Ｆ）を受けている女性の脱落膜の白血球（Ｌ）集団におけるエラフィンタンパク質の発現。上皮腺における膜性エラフィンタンパク質の発現（Ｍ）は、Ｄでも見られる。ＳＬＰＩ及びエラフィンの陰性対照は、それぞれＧ及びＨに示される（双方とも、異所性妊娠の外科的処置を受けている女性からの子宮脱落膜）。スケール・バー＝５０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本発明は、添付の図面を参照して詳細に記載されているであろう。
【実施例】
【００７３】
実施例１
材料及び方法
組織の収集
この研究の倫理的な認可を、ロウジアン（Ｌｏｔｈｉａｎ）研究倫理委員会から得て、試料を収集する前に全患者から文書でのインフォームドコンセントを得た。外科的妊娠中絶（ＴＯＰ、ｎ＝８、第１群、平均妊娠期間５８．７日）、胎性喪失（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｍｉｓｓｅｄ）流産の外科的処置（ｎ＝６、第２群、平均妊娠期間５７．７日）及び卵管妊娠の外科的処置（ｎ＝１１、第３群、平均妊娠期間５８．１日）を受けている女性（年齢１８〜４５歳）から、妊娠三期のうちの第１期の脱落膜化した子宮内膜を得た。卵管異所性妊娠の外科的処置を受けた如何なる女性も、血流力学的ショックを実際に示さず、診断に先立って連続血清ベータ−ＨＣＧ及び超音波モニタリングを全て必要とした。脱落膜化した子宮内膜及び栄養膜は、第１群及び第２群から吸引掻爬術によって得た。脱落膜化した子宮内膜を、第３群から吸引子宮内膜生検（Ｐｉｐｅｌｌｅ（登録商標）、クランリー、ユーロサージカル社、英国）によって得た。脱落膜化した子宮内膜を、顕微鏡下で栄養膜から単離した。脱落膜化した子宮内膜を、（ａ）４℃にて一晩ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（アンビオン、テキサス、米国）中に浸漬し、次いで−７０℃で瞬間凍結し、（ｂ）４℃にて一晩、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、７０％エタノール中で保存し、ヘマトキシリン及びエオシン並びに免疫組織化学で染色するためにワックス包埋した。栄養膜の存在は、形態学的に、及び既報（１４）のようにサイトケラチンについての免疫組織化学染色の使用により除外した。子宮内膜試料を、定期的な月経周期（２８〜３５日）を有し、かつ妊娠していない女性（１８〜４５歳）から、良性の婦人科状態についての子宮摘出により得た（１５）。子宮内膜試料を室温で回収し、ＲＰＭＩ（ライフテクノロジーズ、米国）中で実験室に移し、以下に記載されるように子宮内膜間質細胞の単離のために処理した。
【００７４】
ＲＮＡの抽出
製造元のプロトコル（キアゲン、ウエストサセックス、英国）で詳説されたように全ＲＮＡを脱落膜化した子宮内膜から抽出した。アジレント・バイオアナライザを用いて、抽出したＲＮＡの濃度及び品質を評価した。品質管理のための全試料を標準化し、ＲＮＡ完全性番号（ＲＩＮ）を割り当てた。７．５の平均ＲＩＮ値が得られた場合、ＲＮＡは良好な品質であるとみなした（１６）。
【００７５】
マイクロアレイ解析
手短には、各試料から４μｇの全ＲＮＡを用いて、１サイクルｃＤＮＡ合成キット（アフィメトリクス、英国）を用いて二本鎖のｃＤＮＡを生成し、次いでジーンチップ・サンプル・クリーンアップ・モジュール（アフィメトリクス、英国）によって精製した。ビオチン標識ｃＲＮＡを生じるジーンチップＩＶＴ標識キット（アフィメトリクス、英国）を用いたインビトロ転写に、二本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いた。清浄化及び分光光度分析による定量に続いて、次いで精製されたビオチン化標的ｃＲＮＡを短い配列に断片化した。ハイブリダイゼーション・カクテルは、真核細胞ハイブリダイゼーション対照でスパイクされた１５μｇの断片化されたビオチン標識ｃＲＮＡからなるものであった。その後、８０μＬのハイブリダイゼーション・カクテルを、試験チップとハイブリダイズさせ、ｃＲＮＡの完全性をチェックし、システムの正確性を評価した。その後、ヒトＨＧ−Ｕ１３３プラス２．０マイクロアレイ（アフィメトリクス、英国）を、２００μＬのハイブリダイゼーション・カクテルで直接的にロードし、４５℃にて６０ｒｐｍで回転するジーンチップ・ハイブリダイゼーション・オーブン６４０（アフィメトリクス、英国）に１６時間入れた。ハイブリダイゼーションの後、ジーンチップ流体ステーション４５０（アフィメトリクス、英国）上でアレイを洗浄し、製造元のプロトコルに従ってジーンチップ・スキャナ３０００（アフィメトリクス、英国）を用いて走査した。試料標識処理の品質及び一貫性並びにアレイのハイブリダイゼーションを確実にするために、全２６アレイの対照情報を照合し、データ解析の前に見直したところ、全てがアフィメトリクスの推奨に一致することが判った。Ｒ統計プログラム環境へのバイオコンダクター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）拡張で実施されるロバストマルチアレイ平均アルゴリズム（１７）を用いて発現を計算した（１８）。ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）は、測定のｌｏｇ２スケール上で、バックグランドを補正し、かつ変位値をノーマライズした、発現の測定基準（１９）を生成する。アレイハイブリダイゼーションの性能をさらに検討するために、Ｒ統計プログラム環境へのバイオコンダクターへの拡張にて１つおきで各アレイを比較する散乱プロットを生成した。これらのプロットは、アレイ間の線形分布を裏づけ、低シグナル値から高シグナル値まで動的な連続した範囲の発現値を示した。箱髭図による視覚化によっても、データが匹敵する分布を有し、さらなる解析に十分な品質であることが確認された。データ及びプロトコルは、公にアクセスできるＭＩＡＭＥ対応のデータベース「ＧＰＸ」（ｗｗｗ．ｇｔｉ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ＧＰＸ、アクセス番号ＧＰＸ−００００６７．１）からダウンロードして利用できる。ＲＭＡによるデータのノーマライゼーションに続いて、６４という任意のシグナル強度閾値の値を用いて、データをフィルターにかけ、その後の統計解析で複数の試験誤差に寄与する不変転写物を除いた。試験解析に続いて、厳密な統計的アプローチを活用して、差示的に発現された遺伝子のサブセットを同定した。手短には、ｔ−検定による比較、次いでベンジャミニ・ホックベルグの偽発見検出法を用いた複数試験補正（２０）を用いて、子宮内妊娠試料と異所性妊娠試料との間で差示的に発現された遺伝子を同定した。次いで、＞２の倍率変化閾値、及び＜０．０５の補正ｐ値を用いて遺伝子リストを作成した。
【００７６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＱ１ ＤＮＡ分解酵素（プロメガ、サウサンプトン、英国）を用いてＤＮＡ分解酵素で処理した後、ランダムヘキサマー（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。次いでＴａｑｍａｎＱ−ＲＴ−ＰＣＲを用いて、プロラクチン及びインスリン様増殖因子結合タンパク質−１（ＩＧＦＢＰ１）、並びにインヒビンβＡサブユニット（Ｍ１３４３６）、インヒビンβＢサブユニット（Ｍ１３４３７）及びインヒビンαサブユニット（Ｍ１３１４４）について、アプライドバイオシステムズが事前に検証した「ａｓｓａｙ−ｏｎ−ｄｅｍａｎａｄ」特異的プライマー及びプローブ（ユーロゲンテック、サウサンプトン、英国）を用いて遺伝子のレベルを測定し（２１）、レベルをリボソーム１８Ｓ内部対照（アプライドバイオシステムズ）に関連付けた。試料は全て２つ一組で扱い、適当な対照組織のｃＤＮＡに対する相対的な比較を行った。２−△△Ｃｔ法を用いて、ｍＲＮＡの発現結果を１８Ｓに対してノーマライズし、対照（ＴＯＰ試料群）と比べた倍率変化として表した。
【００７７】
免疫組織化学
手短には、それぞれ英国オックスフォードのオックスフォードブルークス大学のＮ．Ｇｒｏｏｍｅ教授及び英国エディンバラのＭＲＣヒト生殖科学ユニットのＡｌａｎ ＭｃＮｅｉｌｌｙ教授によって開発され、かつ快く提供された抗体を用いて、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット及びα−インヒビンの免疫局在化を行なった。制御され、かつ容易に反復可能な様式で実験を行うために、Ｂｏｎｄ−Ｘ自動免疫染色機（ビジョンバイオシステムズ、ニューキャッスル、英国）を利用した。子宮脱落膜の５ミクロンのパラフィン切片を作製し、脱ワックス（ｄｅｗａｘ）し、再水和を行い、Ｂｏｎｄ−Ｘ機に載せる前に、０．０１モルの１−１クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて圧力調理抗原修復に供した。Ｂｏｎｄ−Ｘ自動機におけるこの方法は、特定のポリマーの高い対比プログラムを利用する。スライドを、ペルオキシダーゼで５分間ブロックし、供給された希釈剤で１：５００に希釈された一次抗体（４６Ａ／ＦβＢ：インヒビンβＢサブユニットに対するマウスモノクローナル抗体（２２））及びＡＳＭＲ１５０：α−インヒビンに対するウサギポリクローナル抗体（２３））と共に２時間インキュベートし、次いで一次後試薬と共に１５分間インキュベートした。抗体の特異性を確認するために、希釈剤のみと共に、又は供給された希釈剤中の一次抗体と同じ濃度に希釈された非特異的免疫グロブリンと共に、対照の切片をインキュベートした。次いでＤＡＢ検出に先立って、切片をポリマー試薬と共に１５分間インキュベートして検出の感度を高めた。ヘマトキシリンで５分間、切片を対比染色した。次いでスライドを機械から取り出し、脱水し、Ｐｅｒｔｅｘを用いて標本にした。
【００７８】
子宮内膜間質細胞の単離と培養
３７℃にて２時間のコラゲナーゼ／ＤＮＡ分解酵素（シグマ−アルドリッチ、米国）による消化に子宮内膜組織を供した。消化の後、間質を分散させたが、上皮構造はほとんど無傷のままであった。既報（２４）のように、ヒト子宮内膜の間質細胞を、サイズを基準に分離した。既報（Ｉｒｗｉｎら、１９９１）のように、２％ウシ胎児血清、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシンを伴ったＲＰＭＩ中で２．４×１０５個／ウェルの密度にて子宮内膜の間質細胞を６穴の標準培養プレートに入れた。酢酸メドロキシプロゲステロン（１０−６Ｍ）、エストラジオール（１０−７Ｍ）及び８−ブロモｃＡＭＰ（０．１ｍｇ／ｍｌ）によって２４、４８、７２、９６及び１２０時間、細胞を処理した。ＲＮＡ抽出のために各時点で細胞を回収した。
【００７９】
血清のアッセイ
標準の放射性免疫学的アッセイ（１５）を用いて血清のプロゲステロン濃度を測定した。試料のＳＤＳ及び熱による予備処理と共にモノクローナル抗体４６Ａ／Ｆ（捕捉及び検出双方の抗体として）（２２）の使用を組み入れるアクチビンＢのＥＬＩＳＡを用いてアクチビンＢの濃度を測定した（Ｌｕｄｌｏｗら、投稿準備中）。血清は希釈せずに試験し、アッセイは、１９ｐｇ／ｍＬのさらに低い検出限界を有した。
【００８０】
切片の分析
子宮内膜の変化の程度に従って、婦人科を専門分科とする病理学者によって、脱落膜化した子宮内膜の試料を盲検的に分類した。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎらの分類（２５）を用いて、腺上皮の分泌変化（非存在／初期、高及び枯渇（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ））及び間質の分化（非脱落膜化、脱落膜前、集密的脱落膜変化）をスコア付けした。集密的な間質の脱落膜化を伴った枯渇した腺性変化を持つ試料を全体として脱落膜化（＋）として分類し、非存在／初期の分泌変化及び非脱落膜の間質を伴う試料を脱落膜化（−）として分類し、その他の試料を脱落膜化（＋／−）として分類した。
【００８１】
統計的解析（マイクロアレイの解析以外の全データについて）
データが正常に分布した場合、ボンフェローニ・ペアワイズ比較と共にＡＮＯＶＡによって解析した。２つの群は、ｔ−検定によって解析した。データが正規分布しなかった場合、ダン・ペアワイズ比較と共にクラスカル・ウォリス検定を用いて３つの群を比較した。カイ２乗検定を用いて比率を比較し、スピアマン（ノンパラメトリック）又はピアソン（パラメトリック）の係数を用いて線形の相関を評価した。使用した統計的検定は、本文及び図の説明に提供するが、ｐ＜０．０５レベルで有意とした。
【００８２】
結果
脱落膜化した子宮内膜のマイクロアレイ解析
子宮内妊娠（ｎ＝１４）と卵管妊娠（ｎ＝１１）の女性からの脱落膜化した子宮内膜における遺伝子発現の比較は、６６９の遺伝子が差示的に発現することを明らかにした（ＦＣ＞±２、ｐ＜０．０５）。この解析で強調された注目に値する遺伝子の１つは、インヒビン／アクチビンβＢサブユニットであった。これは、卵管異所性妊娠の女性の脱落膜化した子宮内膜で２．３４の倍率低下で下方調節された。定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、流産（ｐ＜０．０１）及び妊娠中絶（ｐ＜０．０１）群（図１ａ）と比べた場合、卵管妊娠からの脱落膜化した子宮内膜で低下した発現が確認された。
【００８３】
脱落膜化した子宮内膜におけるインヒビン／アクチビンのサブユニット
細胞から分泌されるために、βＢサブユニットは二量体を形成しなければならない。それはそれ自体と一緒になってアクチビンＢを形成し、インヒビンαサブユニットと一緒になってインヒビンＢを形成し、アクチビンβＡサブユニットと一緒になってアクチビンＡＢを形成するので、α及びβＡサブユニットの発現も検討した。βＡサブユニットの発現は、同じパターンに従わず（図１ｂ）、群間に有意な差異はなかった。群間におけるインヒビンαサブユニットの発現における変化は、あまり顕著ではなかったが（図１ｃ）、流産に比べて異所性妊娠の脱落膜化した子宮内膜で低かった（ｐ＜０．０５）。
【００８４】
脱落膜化した子宮内膜におけるインヒビンαとβＢのサブユニットの局在
脱落膜化した子宮内膜におけるインヒビンのαとβＢサブユニットをさらに検討するために、免疫組織化学を用いてそれらを局在させた。これらタンパク質双方に特異的な免疫染色は、脱落膜化した子宮内膜の腺領域及び間質領域で検出することができた（図２ａ〜ｄ）。しかしながら、患者間での脱落膜間質において染色の変化があり、βＢサブユニットについて特に顕著だった（図２ｅｈ）。子宮内膜があまり脱落膜化しておらず、さらに増殖性の表現型を有する場合（図２ｅ）、染色は腺性であることが注目された。子宮内膜がさらに分泌性の表現型を有した場合（図２ｆ）、染色は、明るい間質の関与を伴って主として腺性であった。しかしながら、十分に脱落膜化した試料では（図２ｇ）、顕著な間質の免疫染色があった。
【００８５】
脱落膜化の間のインヒビンαとβのサブユニットの発現
妊娠初期の子宮内膜の間質区画におけるβＢサブユニットの局在は、脱落膜化のレベルと共に変化するという傾向があったので、ヒト子宮内膜の線維芽細胞をインビトロで試験した。インビトロで脱落膜化刺激に曝すと、時間依存様式においてインヒビン／アクチビンβＢサブユニットの発現が高まった（ｐ＜０．０５）（図３ａ）。インビトロにおける間質線維芽細胞の脱落膜化の間、αサブユニットでは有意ではあるが、さほど顕著ではない増加があった（ｐ＜０．０５）（図３ｂ）ものの、インヒビンβＡサブユニットの発現に関して変化はなかった（図３ｃ）。
【００８６】
異所性妊娠、流産及び生存妊娠における脱落膜の形態学
βＢサブユニットの発現は間質の脱落膜化に関係すると思われ、異所性妊娠の脱落膜化した子宮内膜で低かったので、組織の正体に対して盲検化した子宮内膜病理の専門家によってヘマトキシリン及びエオシン染色切片にて、各組織試料における腺性及び間質区画の形態を評価した。子宮内妊娠と比べると、腺性区画は、より程度の低い分泌変化を示し（ｐ＜０．０５）、間質区画は、脱落膜化は少なかった（ｐ＜０．０５）（図４ａ）。さらに、子宮内膜の脱落膜化の全体的なレベルは、ＴＯＰや流産よりも異所性妊娠で低かった（ｐ＜０．０５）（図４ｂ）。形態学的な脱落膜化の全体的な程度に基づいて試料を階層化した場合（図４ｃ）、インヒビンβＢサブユニット発現との明瞭な相関もあった（ｐ＝０．０００５）。
【００８７】
妊娠初期の脱落膜化した子宮内膜における脱落膜化のその他のマーカーの発現
これらの検討は、異所性妊娠の子宮内膜では脱落膜化があまり進行しないことを示唆したので、脱落膜化に関与することが分かっている遺伝子発現も組織試料にて検討した。ＩＧＦＢＰ１（図５ａ）の発現は、流産（ｐ＜０．０１）及び妊娠中絶（ｐ＜０．０５）のそれと比較した場合、異所性妊娠の脱落膜で低下していた。プロラクチン（図５ｂ）の発現も、妊娠中絶（ｐ＜０．０５）のそれと比較した場合、異所性妊娠の脱落膜で低下していた。
【００８８】
血清アクチビンＢ濃度
インヒビン／アクチビンβＢサブユニットの脱落膜での発現の変化を全身性に検出することができるかどうかを判定するために、血清のアクチビンＢ濃度を試験した。アクチビンＢの濃度は、プロゲステロン（ｐ＜０．０５）と同様に、分析した群間で異なっていた（ｐ＝０．００１）（図６ａ）。しかしながら、アクチビンＢは、血清プロゲステロン濃度（図６ｅ）とは異なって、生存子宮内妊娠（図６ｄ）よりも異所性妊娠の女性の血清で低かった（ｐ＜０．０１）。さらに、血清アクチビンＢと脱落膜化の程度との間に明瞭な相関があったが（ｐ＝０．００５）、これは、プロゲステロンを分析した場合見られなかった（図６ｆ）。
【００８９】
考察
本研究は、同様の妊娠期間の卵管異所性妊娠と子宮内妊娠における脱落膜化した子宮内膜の機能に差異があることを実証する。我々は、インヒビン／アクチビンβＢサブユニットの発現が子宮内膜の脱落膜化の程度に関係し、卵管異所性妊娠で低下することを示した。さらに、この差異を全身的に評価することができた。血清アクチビンＢは卵管異所性妊娠で低下し、血清濃度は形態学的な脱落膜化の程度と相関し、その差異は、血清プロゲステロン濃度で見られるものより顕著であった。局所で産生された増殖因子が子宮内膜の発生に主な役割を有することは明らかである（２６）。実際、形質転換増殖因子−βスーパーファミリーのメンバーは、子宮内膜で豊富に発現している。インヒビン／アクチビンのα、βＡ及びβＢのサブユニットは、月経周期の全体にわたって子宮内膜に発現し、かつ妊娠初期の脱落膜に発現することが以前示されている（２７）。それらの機能は、月経後のリモデリングや組織の修復を促進することであるという感触が得られている（２７）。しかしながら、それらの発現は妊娠初期で高められるので、それらは、妊娠に対する子宮内膜の応答において役割を有する可能性がある（２８）。アクチビン自体が子宮内膜の機能に影響を及ぼし得ることに疑いはない。アクチビンの受容体は子宮内膜の間質細胞に存在し（２９）、その発現は脱落膜化の間に高まる（３０）。実際、アクチビンＡによる子宮内膜の間質細胞の処理は、脱落膜化を促進し、プロラクチンのような脱落膜のマーカーの発現を促進したが（３１）、ホリスタチンによる処理は脱落膜の応答を有意に遅らせた（３１、３２）。アクチビンＡとインヒビンＡは、間質マトリクスメタロプロテイナーゼの発現を差示的に調節し、このことが、着床及び胎児と母体の相互作用に関連するリモデリングにおけるアクチビンのシグナル伝達のための役割を示唆することも示されている（３０、３３）。脱落膜化を促進する役割を有することと同様に、アクチビンサブユニットの発現自体が脱落膜化の間に高まる（２７、３４）。この調節は明らかではないが、インビボでは、着床している栄養膜とのダイアログであると思われる。胚盤胞が付着する間、脱落膜内でインヒビン／アクチビンβＡの発現の局在が変化することは、パラクリン調節を示唆している（３５）。従って、アクチビンが子宮内膜機能のマーカーとして機能し得、子宮内妊娠で差示的に調節され得ることは驚くべきことではない。以前の報告はほとんどβＡサブユニットの発現に関するものであり、脱落膜化におけるアクチビンＡの鍵となる役割を示唆しているけれども、それは、本研究で差示的に発現されたβＢサブユニットだった。脱落膜化した子宮内膜におけるβＢの発現は以前報告されたが（２７）、アクチビンＢの役割、調節及び効果は未だに評価されていない。確かに、本研究では、子宮内膜βＢサブユニットの発現と血清アクチビンＢの双方が子宮内膜の脱落膜化の程度と高く相関する。近隣の栄養膜細胞によってそれが直接影響を受けるかどうかは分かっていない。卵管異所性妊娠では、プロゲステロンの分泌は維持されるが、栄養膜と脱落膜化された子宮内膜との直接的な物理的相互作用はない。我々は、対照的に、子宮内妊娠では、栄養膜の相互作用が子宮内膜の機能に影響するので、脱落膜マーカーは卵管異所性妊娠の診断に有用であるという仮説を立てた。以前評価されたマーカーは、異所性着床（血清クレアチンキナーゼ（１５））、ｈＣＧ動態のマーカーとしての黄体機能（血清プロゲステロン（３６））又は双方のマーカー（血清ＶＥＧＦ（３７））に集中していた。これらの試験は異所性妊娠の診断において特定の臨床的用途があることが証明されていない。異所性妊娠のマーカーとしてのアクチビンとインヒビンの概念は新しいものではない。初期の研究では、インヒビンＡと遊離で循環するＰｒｏαＣインヒビンが検討され、卵管異所性妊娠を鑑別しないことが判った（１１）。最近の研究は、アクチビンＡ自体が異所性妊娠のマーカーとして機能し得ることを示唆している（３８）。血清アクチビンＡは異所性妊娠で低かった（３８）。異所性妊娠と黄体の双方がβＢサブユニットではなくβＡサブユニットを発現する（３９、４０）ので、アクチビンＡの供給源は明らかではない。アクチビンＢの供給源が脱落膜であるというのはありそうなことだと思われ、これが、脱落膜化と異所性妊娠の補助的マーカーとして機能することができるかどうかは将来の研究で評価されるべきである。血清アクチビンの低い濃度と関連した、卵管異所性妊娠の女性の脱落膜化した子宮内膜でのインヒビン／アクチビンβＢの低い発現の実証は、臨床的に重要である。脱落膜化におけるアクチビンＢの役割と調節を取り扱って、この過程における栄養膜とプロゲステロンの役割をさらに分析すべきである。さらに、異所性妊娠の診断における脱落膜評価又はアクチビンＢの測定の役割をさらに検討すべきである。我々は、子宮の脱落膜化と関連する分泌性タンパク質に着目することによって卵管妊娠のさらに可能性のある生体マーカーを発見し得ると考えている。
【００９０】
参考文献
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１５．Ｄｕｎｃａｎ ＷＣ，ＭｃＮｅｉｌｌｙ ＡＳ，Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ ＰＪ １９９８ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｕｔｅａｌ ‘‘ｒｅｓｃｕｅ’’ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｐｕｓ ｌｕｔｅｕｍ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８３：２４７０−２４７８
【０１０５】
１６．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ａ，Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｏ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｓ，Ｓａｌｏｗｓｋｙ Ｒ，Ｌｅｉｂｅｒ Ｍ，Ｇａｓｓｍａｎｎ Ｍ，Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ Ｓ，Ｍｅｎｚｅｌ Ｗ，Ｇｒａｎｚｏｗ Ｍ，Ｒａｇｇ Ｔ ２００６ Ｔｈｅ ＲＩＮ：ａｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ ｆｏｒ ａｓｓｉｇｎｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｖａｌｕｅｓ ｔｏ ＲＮＡ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．ＢＭＣ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ７：３
【０１０６】
１７．Ｉｒｉｚａｒｒｙ ＲＡ，Ｈｏｂｂｓ Ｂ，Ｃｏｌｌｉｎ Ｆ，Ｂｅａｚｅｒ−Ｂａｒｃｌａｙ ＹＤ，Ａｎｔｏｎｅｌｌｉｓ ＫＪ，Ｓｃｈｅｒｆ Ｕ，Ｓｐｅｅｄ ＴＰ ２００３ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｕｍｍａｒｉｅｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙ ｐｒｏｂｅ ｌｅｖｅｌ ｄａｔａ．Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ４：２４９−２６４
【０１０７】
１８．Ｉｈａｋａ Ｒ，Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ Ｒ １９９６ Ｒ：ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ｆｏｒ ｇｒａｐｈ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｇｒａｐｈｉｃｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ５：２９９−３１４
【０１０８】
１９．Ｂｏｌｓｔａｄ ＢＭ，Ｉｒｉｚａｒｒｙ ＲＡ，Ａｓｔｒａｎｄ Ｍ，Ｓｐｅｅｄ ＴＰ ２００３ Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙ ｄａｔａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎｄ ｂｉａｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：１８５−１９３
【０１０９】
２０．Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ Ｙ，Ｈｏｃｈｂｅｒｇ Ｙ １９９５ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｅｓｔｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｙａｌ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｏｃｉｅｔｙ Ｂ ５７：２８９−３００
【０１１０】
２１．Ｃａｓａｇｒａｎｄｉ Ｄ，Ｂｅａｒｆｉｅｌｄ Ｃ，Ｇｅａｒｙ Ｊ，Ｒｅｄｍａｎ ＣＷ，Ｍｕｔｔｕｋｒｉｓｈｎａ Ｓ ２００３ Ｉｎｈｉｂｉｎ，ａｃｔｉｖｉｎ，ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ，ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｂｅｔａ−ｇｌｙｃａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ９：１９９−２０３
【０１１１】
２２．Ｌｕｄｌｏｗ Ｈ，Ｍｕｔｔｕｋｒｉｓｈｎａ Ｓ，Ｈｙｖｏｎｅｎ Ｍ，Ｇｒｏｏｍｅ ＮＰ ２００８ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｈｉｂｉｎ／ａｃｔｉｖｉｎ ｂｅｔａＢ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎｈｉｂｉｎ Ｂ ＥＬＩＳＡｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９：１０２−１１１
【０１１２】
２３．ＭｃＮｅｉｌｌｙ ＡＳ，Ｓｗａｎｓｔｏｎ ＩＡ，Ｃｒｏｗ Ｗ，Ｔｓｏｎｉｓ ＣＧ，Ｂａｉｒｄ ＤＴ １９８９ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｓｈｅｅｐ ｏｅｓｔｒｏｕｓ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ＦＳＨ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２０：２９５−３０５
【０１１３】
２４．Ｋｉｒｋ Ｄ，Ｉｒｗｉｎ ＪＣ １９８０ Ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２１Ｂ：５１−７７
【０１１４】
２５．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｇ，Ｂａｉｅｒ Ｄ，Ｍａｊｅｒ Ｊ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｈ ２００３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ ｈＣＧ ａｎｄ ａｌｐｈａ ＣＧ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｈＣＧ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｅｃｉｄｕａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｕｂａｌ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ９：８１−８９
【０１１５】
２６．Ｄｉｍｉｔｒｉａｄｉｓ Ｅ，Ｗｈｉｔｅ ＣＡ，Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ ２００５ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｐｄａｔｅ １１：６１３−６３０
【０１１６】
２７．Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ，Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙ ＨＯ，Ｒｏｇｅｒｓ ＰＡ，Ａｆｆａｎｄｉ Ｂ，Ｆｉｎｄｌａｙ ＪＫ ２０００ Ｉｎｈｉｂｉｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｃｙｃｌｅ，ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ａｎｄ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ−ｏｎｌｙ ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ６：１１０７−１１１７
【０１１７】
２８．Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｆｉｎｄｌａｙ ＪＫ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ ２００６ Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ．Ａｕｓｔ Ｎ Ｚ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ ４６：２４５−２４９
【０１１８】
２９．Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ，Ｚｈａｏ ＹＣ，Ｅｔｈｉｅｒ ＪＦ，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＡＥ，Ｆｉｎｄｌａｙ ＪＫ ２００２ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ａｎｄ ｂｅｔａｇｌｙｃａｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ；ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ８：３６３−３７４
【０１１９】
３０．Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｆｉｎｄｌａｙ ＪＫ，Ｆａｒｎｗｏｒｔｈ ＰＧ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＤＭ，Ｗａｌｌａｃｅ Ｅ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ ２００６ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｎ Ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｈｕｍａｎ ｕｔｅｒｉｎｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４７：７２４−７３２
【０１２０】
３１．Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ，Ｆｉｎｄｌａｙ ＪＫ ２００２ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８７：４００１−４００４
【０１２１】
３２．Ｔｉｅｒｎｅｙ ＥＰ，Ｇｉｕｄｉｃｅ ＬＣ ２００４ Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ａｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ８１ Ｓｕｐｐｌ １：８９９−９０３
【０１２２】
３３．Ｓｔｒａｋｏｖａ Ｚ，Ｓｚｍｉｄｔ Ｍ，Ｓｒｉｓｕｐａｒｐ Ｓ，Ｆａｚｌｅａｂａｓ ＡＴ ２００３ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｂｏｏｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４４：５３３９−５３４６
【０１２３】
３４．Ｏｔａｎｉ Ｔ，Ｍｉｎａｍｉ Ｓ，Ｋｏｋａｗａ Ｋ，Ｓｈｉｋｏｎｅ Ｔ，Ｙａｍｏｔｏ Ｍ，Ｎａｋａｎｏ Ｒ １９９８ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ９１：６８５−６９２
【０１２４】
３５．Ｊｏｎｅｓ ＲＬ，Ｓｔｏｉｋｏｓ Ｃ，Ｆｉｎｄｌａｙ ＪＫ，Ｓａｌａｍｏｎｓｅｎ ＬＡ ２００６ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ ａｎｄ ｐｌａｃｅｎｔａ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １３２：２１７−２３２
【０１２５】
３６．Ｌｅｄｇｅｒ ＷＬ，Ｓｗｅｅｔｉｎｇ ＶＭ，Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ Ｓ １９９４ Ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｅｃｔｏｐｉｃ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｉｎ ａｎ ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ ｓｅｒｖｉｃｅ−−ａｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ，ｉｎｔａｃｔ ａｎｄ ｆｒｅｅ ｂｅｔａ ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ ｈｅｌｐｆｕｌ？ Ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ９：１５７−１６０
【０１２６】
３７．Ｆｅｌｅｍｂａｎ Ａ，Ｓａｍｍｏｕｒ Ａ，Ｔｕｌａｎｄｉ Ｔ ２００２ Ｓｅｒｕｍ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｓ ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １７：４９０−４９２
【０１２７】
３８．Ｆｌｏｒｉｏ，Ｐ，Ｓｅｖｅｒｉ ＦＭ，Ｂｏｃｃｈｉ Ｃ，Ｌｕｉｓｉ Ｓ，Ｍａｚｚｉｎｉ Ｍ，Ｄａｎｅｒｏ Ｓ，Ｔｏｒｒｉｃｅｌｌｉ Ｍ，Ｐｅｔｒａｇｌｉａ Ｆ ２００７ Ｓｉｎｇｌｅ ｓｅｒｕｍ ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｅｃｔｏｐｉｃ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ９２：１７４８−１７５３
【０１２８】
３９．Ｒｅｆａａｔ Ｂ，Ａｍｅｒ Ｓ，Ｏｌａ Ｂ，Ｃｈａｐｍａｎ Ｎ，Ｌｅｄｇｅｒ Ｗ ２００７ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｎ βＡ− ａｎｄ βＢ−ｓｕｂｕｎｉｔｓ，ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅｓ ｂｅａｒｉｎｇ ａｎ ｅｃｔｏｐｉｃ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，印刷物に先んじた電子刊行物
【０１２９】
４０．Ｆｒａｓｅｒ ＨＭ，Ｌｕｎｎ ＳＦ，Ｃｏｗｅｎ ＧＭ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ ＰＴ １９９３ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｎ／ａｃｔｉｖｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ ｍＲＮＡｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｌｕｔｅａｌ ｐｈａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｔｅ ｏｖａｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １０：２４５−２５７
【０１３０】
実施例２
材料及び方法
この研究の倫理的な認可は、ロウジアン研究倫理委員会から得た（０４／Ｓ１１０３／２０）。試料を収集する前に全患者から文書でのインフォームドコンセントを得た。外科的妊娠中絶（ＳＴＯＰ、ｎ＝８、第１群）、流産の外科的処置（ｎ＝６、第２群）及び卵管妊娠の外科的処置（ｎ＝１１、第３群）を受けている女性（年齢１８〜４５歳）から子宮の脱落膜を得た。脱落膜及び栄養膜は、第１群及び第２群から吸引掻爬術によって得た。脱落膜は、Ｐｉｐｅｌｌｅ（登録商標）子宮内膜生検によって第３群から得た。顕微鏡下で栄養膜から脱落膜を単離した。脱落膜生検を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（アンビオン、テキサス、米国）中に４℃にて一晩浸漬し、次いで−７０℃で瞬間凍結した。製造元のプロトコル（キアゲン、ウエストサセックス、英国）で詳説されたように全ＲＮＡを脱落膜生検から抽出した。
【０１３１】
ＲＮＡ ＱＣ
全ＲＮＡは、アジレント２１００バイオアナライザにてＲＮＡ６０００ナノチップ上で確認された品質だった。非常に高い品質のＲＮＡ（ＲＩＮ＞７．５）調製物のみをマイクロアレイスクリーニングのために検討した。ＲＮＡの濃度は、ナノドロップ分光光度計（ナノドロップテクノロジーズ、米国）にて分光光度解析によって確認した。
【０１３２】
マイクロアレイ解析
手短には、各試料からの４μｇの全ＲＮＡを用いて、１サイクルのｃＤＮＡ合成キット（アフィメトリクス、英国）を用いて二本鎖のｃＤＮＡを生成し、次いでジーンチップ・・サンプル・クリーンアップ・モジュール（アフィメトリクス、英国）によって精製した。ビオチン標識ｃＲＮＡを生じるジーンチップＩＶＴ標識キット（アフィメトリクス、英国）を用いたインビトロの転写に、二本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いた。清浄化及び分光光度分析による定量に続いて、次いで精製されたビオチン化標的ｃＲＮＡを短い配列に断片化した。ハイブリダイゼーション・カクテルは、真核細胞ハイブリダイゼーション対照でスパイクされた１５μｇの断片化されたビオチン標識ｃＲＮＡからなるものであった。先ず、８０μＬのハイブリダイゼーション・カクテルを試験チップとハイブリダイゼーションさせ、ｃＲＮＡの完全性をチェックし、システムの信憑性を評価した。その後、ヒトＨＧ−Ｕ１３３プラス２．０マイクロアレイ（アフィメトリクス、英国）を、２００μＬのハイブリダイゼーション・カクテル溶液で直接的にロードし、４５℃にて６０ｒｐｍで回転するジーンチップ・ハイブリダイゼーション・オーブン６４０（アフィメトリクス、英国）に１６時間入れた。ハイブリダイゼーションの後、ジーンチップ流体ステーション４５０（アフィメトリクス、英国）でアレイを洗浄し、製造元のプロトコルに従ってジーンチップ・スキャナ３０００（アフィメトリクス、英国）を用いて走査した。
【０１３３】
試料標識処理の品質及び一貫性並びにアレイのハイブリダイゼーションを確実にするために、全２５アレイの対照情報を照合し、データ解析の前に見直したところ、全てがアフィメトリクスの推奨に一致することが判った。
【０１３４】
Ｒ統計プログラム環境へのバイオコンダクター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）拡張で実施されるロバストマルチアレイ平均アルゴリズム（８）を用いて発現を計算した（９）。ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）は、測定のｌｏｇ２スケール上で、バックグランドを補正し、かつ変位値をノーマライズした、発現の測定基準（１０）を生成する。アレイハイブリダイゼーションの性能をさらに検討するために、Ｒ統計プログラム環境へのバイオコンダクターへの拡張にて１つおきで各アレイを比較する散乱プロットを生成した。これらのプロットはアレイ間の線形分布を裏づけ、低シグナル値から高シグナル値まで動的に連続した範囲の発現を示した。箱髭図による視覚化によっても、データが匹敵する分布を有し、さらなる解析に十分な品質であることが確認された（オンラインで利用可能な補充データを参照のこと）。
【０１３５】
データ及びプロトコルは、公にアクセスできるＭＩＡＭＥ対応のデータベース「ＧＰＸ」（ｗｗｗ．ｇｔｉ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ＧＰＸ、アクセス番号ＧＰＸ−００００６７．１）からダウンロードして利用できる。
【０１３６】
ＲＭＡによるデータのノーマライゼーションに続いて、６４という任意のシグナル強度閾値の値を用いて、データをフィルターにかけ、その後の統計的解析で複数の試験誤差に寄与する不変転写物を除き、すなわち、試料アレイの５０％（１２アレイ）で６４未満の強度の絶対値を示した場合に、その転写物をさらなる解析から除いた。
【０１３７】
試験的解析に続いて、厳密な統計的アプローチを活用して、子宮内の試料と子宮外の試料の間での発現レベルという点で有意差があった遺伝子を同定した。経験ベイズ試験の形態で推定試験をデータに適用した。このあと、ベンジャミニ・ホックベルグの偽発見検出法を用いた複数試験補正を行った（１１）。次いで、＞１．５の倍率変化閾値、及び＜０．０５の補正ｐ値を用いて遺伝子リストを創った。
【０１３８】
この統計的解析の結果及び遺伝子リストの妥当性を確認するために、最大の倍率変化があった遺伝子のうち２つの定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。製造元の指示書に従ってアプライドバイオシステムズのＲＴキット（アプライドバイオシステムズ、チェシャー、英国）を用いてＲＮＡを逆転写した。次いでＴａｑｍａｎＱ−ＲＴ−ＰＣＲを用いて、アプライドバイオシステムズが事前に検証した「ａｓｓａｙ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ」２０Ｘ Ｔａｑｍａｎプライマー及びプローブ、並びに標準的な反応ミックス（ＲＮＡローディングのための内部標準としてのリボソーム１８Ｓプライマー及びプローブを含む）を用いて遺伝子レベルを測定した。標準条件を用いてＡＢＩプリズム７９００にて試料を解析した。２−△△Ｃｔ法を用いてｍＲＮＡの発現結果を１８Ｓに対してノーマライズし、対照（ＳＴＯＰ試料群、ｎ＝８）と比べた倍率変化として表した。次いで、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）及び最小有意差事後多重比較を用いて発現における差異が有意であるかどうかを決定した（ＳＰＳＳ社、シカゴ、イリノイ州）。
【０１３９】
標準的な免疫組織化学プロトコルも用いて、各患者群からのパラフィン包埋脱落膜における遺伝子のうちの１つについてタンパク質の発現を試験した。
【０１４０】
結果
試験的解析に続いて、経験ベイズ法によって向上させた一般線形モデルを用いて、子宮内（第２群及び第３群の組合せにおいてｎ＝１４）試料と子宮外（第１群、ｎ＝１１）試料との間での統計的に有意な差示的発現について試験した。平均倍率変化（ＦＣ）を計算し、ベンジャミニ・ホックベルグの偽発見検出法を用いた多重試験についてｐ値を調整した。異所性妊娠群において１０６１個の遺伝子が差示的に発現される（ＦＣ＞１．５、調整されたｐ値＜０．０５）ことが見出された。具体的には、２つの遺伝子が可能性のある生体マーカーとして同定された：子宮内の群と比較して子宮外の群では、システイン−リッチ分泌型タンパク質３（ＣＲＩＳＰ３）は、９．１３倍増加し（ｐ＝０．００５）、カルボキシペプチダーゼＢ１（ＣＰＢ１）は、２６．５２倍減少した（ｐ＝０．００５）。このことはＲＴ−ＰＣＴによって確認された（図１を参照のこと）。ＣＲＩＳＰ３タンパク質の発現はまた、各患者群の脱落膜の腺及びマクロファージにおける免疫組織化学によって実証された（図２を参照のこと）。免疫組織化学のレベルでは、ＣＲＩＳＰ３の分布に差異はなかった。
【０１４１】
考察
子宮外着床の我々の理解を進めることと同様に、異所性妊娠の被験体において過剰発現又は過少発現される、例えば、ＣＲＩＳＰ３及びＣＰＢ１のような遺伝子産物の検出は、臨床的に非常に重要である。それは、子宮脱落膜等の試料を単に調べることによって、診断が不確定である初期妊娠不全の任意の被験体における異所性妊娠を診断する手段を臨床病理医に提供する。例えば、血液、血清、血漿及び／又は子宮脱落膜のような試料は、容易に得ることができ、例えば、子宮脱落膜の試料は、患者を全身麻酔に供することなく、子宮からの生検によって得られ得る。さらに、これは、入院や侵襲的検査を回避する可能性を患者に提供する。そのような遺伝子の同定はまた、異所性妊娠のための信頼できる血液検査を開発する可能性を提供する。これは、異所性妊娠の診断に現在必要とされている高価かつ時間がかかる検査の数を減らすであろう。
【０１４２】
参考文献
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【０１４３】
２．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｔｉａｌ Ｅｎｑｕｉｒｙ ｉｎｔｏ Ｍａｔｅｒｎａｌ Ｄｅａｔｈｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ．Ｗｈｙ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ｄｉｅ １９９７−１９９９．
【０１４４】
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【０１４５】
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【０１４６】
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【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５２】
１１．Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，Ｙ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｆｕｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １９９５；５７：２８９−３００．
【０１５３】
実施例３
炎症の間、免疫の多数のメディエータやエフェクターが動員されて解決を助けるが、活発又は長引く応答は、結果的に組織に損傷を生じ得る。なかでも、そのような組織の損傷に関与するメディエータは、生来の免疫応答の一部として機能するプロテアーゼである（Ｄａｌｌｅｇｒｉ及びＯｔｔｏｎｅｌｌｏ １９９７）。宿主の応答には、プロテアーゼの作用に対抗し、それにより宿主組織への結果的な損傷を防ぐための、例えば、抗菌物質、分泌型白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）及びエラフィンのような、多数の重要な抗プロテアーゼの産生が挙げられる（Ｓａｌｌｅｎａｖｅら １９９４；Ｓａｌｌｅｎａｖｅ ２０００；Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋら １９９９）。ＳＬＰＩは、好中球エラスターゼ、トリプシン及びカテプシンＧを含む多数のプロテアーゼを阻害する一方で、エラフィンは、調節性好中球エラスターゼとプロテイナーゼ３に限定されるようである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ及びＯｈｌｓｓｏｎ，１９８６、Ｗｉｅｄｏｗら １９９１、Ｓａｌｌｅｎａｖｅ及びＲｙｌｅ １９９１）。
【０１５４】
ＳＬＰＩ及びエラフィンは、女性の生殖器の至る箇所で発現されている（Ｋｉｎｇら ２０００、Ｋｉｎｇら ２００３ｂ）。ヒトの子宮内膜上皮は、周期の分泌期の間においてＳＬＰＩを発現し、子宮内膜における好中球は、月経の間におけるエラフィンの特に豊富な供給源である（Ｋｉｎｇら ２００３ａ）。ＳＬＰＩ及びエラフィンの発現はまた、子宮頚部及び脱落膜化した子宮内膜において実証されている（Ｈｅｌｍｉｇら １９９５、Ｐｆｕｎｄｔら １９９６、Ｋｉｎｇら ２０００、Ｋｉｎｇら ２００３ａ）。月経周期の間のＳＬＰＩ及びエラフィンの発現は、組織のリモデリング及び「創傷」治癒における役割を示し得る（ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎら １９９６；Ｗｉｎｇｅｎｓら １９９８；Ａｓｈｃｒｏｆｔら ２０００；Ｚｈｕら ２００２；Ａｎｇｅｌｏｖら ２００４）。他の女性の生殖器に共通して、卵管の形態は、エストロゲン及びプロゲステロンの影響下で周期的な変化を受け（ＳｕＩｚら １９９８）、ＳＬＰＩ及びエラフィンの発現は、卵管から子宮内膜にかけて同様の一時的な発現パターンを有することが示されている（Ｄａｌｇｅｔｔｙら ２００６）。
【０１５５】
しかしながら、卵管着床の背景で起きるＳＬＰＩ及びエラフィンの発現の変化は、実証されていない。２つの着床部位の解剖学的な差異によって卵管部位と子宮内部位を直接比較するのは難しい。しかしながら、子宮内妊娠への子宮内膜の応答に類似して、卵管での妊娠に伴って、普通は卵管ではなく子宮腔で脱落膜反応がある（Ｓｔｏｃｋ １９９１）。子宮内膜の上皮及び間質の脱落膜化は、着床が上手く行く鍵となる免疫学的要素である（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら ２００２）。子宮の脱落膜は、生来の免疫の白血球、例えば、ＣＤ５６＋ナチュラルキラー（ｕＮＫ）細胞、マクロファージ及び肥満細胞を含む（Ｂｕｌｍｅｒら １９８８；Ｋｉｎｇ及びＬｏｋｅ １９９１；Ｈｕｎｔ １９９４；Ｃｌａｒｋ １９９５；Ｍａｒｘら １９９９）。従って、我々は、進行中の子宮内妊娠（外科的妊娠中絶を受けている女性）、不全の子宮内妊娠（流産の女性）及び卵管妊娠の女性の子宮脱落膜におけるＳＬＰＩ及びエラフィンの発現を比較した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫組織化学を用いて、それぞれｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を実証した。
【０１５６】
材料及び方法
組織の収集
この研究の倫理的な認可は、ロウジアン研究倫理委員会から得た（０４／Ｓ１１０３／２０）。試料を収集する前に全患者から文書でのインフォームドコンセントを得た。外科的妊娠中絶（ＳＴＯＰ、ｎ＝７、第１群）、胎性喪失流産の外科的処置（ｎ＝６、第２群）及び卵管妊娠の外科的処置（ｎ＝１０、第３群）を受けている女性（年齢１８〜４５歳）から子宮脱落膜及び血清の試料を得た。卵管異所性妊娠の外科的処置を受けた女性で血流力学ショックを実際に示したものはなく、診断に先立って、全て連続血清ベータ−ＨＣＧ及び超音波モニタリングを必要とした。脱落膜及び栄養膜は、第１群及び第２群から吸引掻爬術によって得た。脱落膜は、Ｐｉｐｅｌｌｅ（登録商標）子宮内膜生検によって第３群から得た。顕微鏡下で栄養膜から脱落膜を単離した。脱落膜生検を、（ａ）ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（アンビオン、テキサス、米国）中に４℃にて一晩浸漬し、次いで−７０℃で瞬間凍結し、（ｂ）１０％の中性緩衝ホルマリンで４℃にて一晩固定し、７０％エタノール中で保存し、免疫組織化学用にワックス包埋した。血清試料は、プロゲステロンのレベルの分析用に保存した。
【０１５７】
ＰＣＲによるクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の検出
製造元のプロトコル（キアゲン、ウエストサセックス、英国）で詳説されたように脱落膜生検からＤＮＡを抽出した。ＰＣＲプロトコルは、社内のプラスミドベースの方法を用いた。
【０１５８】
定量的リアルタイムＰＣＲ
製造元のプロトコル（キアゲン、ウエストサセックス、英国）で詳説されたように全ＲＮＡを脱落膜生検から抽出した。アジレント・バイオアナライザを用いて、抽出したＲＮＡの濃度及び品質を評価した。品質管理のための全試料を標準化し、ＲＮＡ完全性番号（ＲＩＮ）を割り当てた。７．５の平均ＲＩＮ値が得られた場合、ＲＮＡは、良好な品質であるとみなした（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら ２００６）。定量的リアルタイムＰＣＲによってＳＬＰＩ及びエラフィンのレベルを決定した。この技術は、存在するＲＮＡの量について対照とするリボゾーム１８Ｓのレベルに対する、存在するＳＬＰＩ及びエラフィンのｍＲＮＡの量に関する。ＲＴ及びＰＣＲの詳細は、ほかに完全に詳説されている（Ｋｉｎｇら ２０００）。使用したエラフィンとＳＬＰＩのプライマーとプローブは、ＰＲＩＭＥＲエクスプレス・ソフトウエア（ＰＥバイオシステムズ、フォスターシティ、米国）を用いて我々の研究室で以前設計された（Ｋｉｎｇら ２０００及び２００３）。エラフィンのプライマー及びプローブは、以下のとおりであった：正方向プライマー５’−ＴＧＧＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＡＴＴＡＴＣ−３’、逆方向プライマー５’−ＣＡＧＴＡＴＣＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＧＧＴＴＡＧ−３’、プローブ５’−ＡＴＣＣＧＧＴＧＣＧＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＴＣＣ−３’。ＳＬＰＩのプライマー及びプローブは、以下のとおりであった：正方向プライマー５’−ＧＣＡＴＣＡＡＡＴＧＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴ−３’、逆方向プライマー５’−ＧＣＡＴＣＡＡＡＣＡＴＴＧＧＣＣＡＴＡＡＧＴＣ−３’、プローブ５’−ＴＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＧＧ−３’。アッセイ内のＰＣＲ測定の変動は、６回の反復物から計算した。逆転写工程の変動性は、１つのＲＮＡ試料を８回逆転写することによって決定した。次いで８個のｃＤＮＡ試料を１回のＰＣＲの実行に含め、（ＳＤに対する）変動性を計算した。ゲノムＤＮＡの混入の可能性は、ＤＮＡ分解酵素処理によって及びＲＮＡ試料（逆転写していない）におけるβ−アクチンのレベルの測定によって除外した。各臨床群からの試料の相対平均値を記録し、ＡＮＯＶＡによって、次いでチューキー事後（Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔｈｏｃ）分析によって解析した。
【０１５９】
エラフィンの免疫組織化学
キシレンにて組織切片を脱ワックスし、漸減勾配のアルコールによって再水和した。室温にて１０分間、蒸留水中の２％過酸化水素（シグマアルドリッチ、プール、英国）によって非特異的な内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックした。希釈した正常ヤギ血清（リン酸緩衝生理食塩水中２０％ｖ／ｖ）（ダイアグノスティックス・スコットランド、エディンバラ、英国）を全組織切片に室温にて２０分間適用した。交互に５分間、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄して、アビジン−ビオチンとタンパク質のブロックをそれぞれ室温にて２０分間、組織切片にさらに適用した。次いで、抗体希釈剤（ダコ、イーリー、英国）で１：７００に希釈したウサギ抗エラフィンポリクローナル抗体（Ｓａｌｌｅｎａｖｅら １９９４）と共に４℃にて一晩、切片をインキュベートした。陰性対照の切片では、適当な同等のＩｇ濃度のウサギＩｇＧ（ＲＩｇＧ：ベクターラボラトリーズ、ピーターバラ、英国）によって一次抗体を置き換えた。ビオチン化ヤギ抗ウサギ（ベクター）と共に切片をインキュベートし、次いでアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ検出系（ベクター；双方共室温にて３０分間インキュベートした）に供した。ペルオキシダーゼの基質であるジアミノベンジジンを用いて陽性の免疫染色を同定した。ハリスヘマトキシリン（パイオニア・リサーチ・ケミカルズ、コールチェスター、英国）によって切片を対比染色し、漸増勾配のアルコールで脱水し、キシレンからＰｅｒｔｅｘにて標本にした（セル−パス、ヘメル・ヘムステッド、英国）。
【０１６０】
ＳＬＰＩの免疫組織化学
使用した方法は、以下の例外を伴って、エラフィンの免疫組織化学プロトコルと同一であった。非免疫ブロックは、希釈したウマ血清（ベクター）によって室温にて２０分間行った。一次抗体は、抗体希釈剤（ダコ）で１：２０に希釈したマウス抗ＳＬＰＩ（ハイカルト・バイオテクノロジー、ウーデン、オランダ）であった。陰性対照は、等モル濃度のマウスＩｇＧ（ＭＩｇＧ）と共にインキュベートし、二次抗体は、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇ（ベクター）であった。
【０１６１】
結果
血清プロゲステロンのレベル
各患者について血清プロゲステロンのレベルを分析した。クラスカル・ウォリス、次いでダン事後（Ｄｕｎｎ’ｓ ｐｏｓｔｈｏｃ）分析を用いて各群間で実証された統計的な有意差はなかった（表１を参照のこと）。
【０１６２】
【表１】
【０１６３】
栄養膜からの脱落膜の分離
サイトケラチンについてのヘマトキシリンとエオシンによる染色及び免疫組織化学は、生理食塩水中における顕微鏡下での分離による栄養膜からの脱落膜の明瞭な単離を実証した。試料の炎症の状態も判定した−壊死の存在、及びリンパ球と多形性浸潤について各試料を試験した。これらの特徴は様々な程度で存在したが、明白な統計的差異はなかった（データは示さず）。染色された組織切片は全て、熟練した組織病理学者が試験した。
【０１６４】
クラミジアの血清学
クラミジア・トラコマティス感染について脱落膜生検全てをスクリーニングしたところ、陰性であることが分かった。
【０１６５】
子宮内及び子宮外の妊娠に由来する子宮脱落膜におけるＳＬＰＩ及びエラフィンのｍＲＮＡの発現
各臨床群の子宮脱落膜においてＳＬＰＩ及びエラフィンのｍＲＮＡを検出した。ＳＬＰＩのｍＲＮＡの相対的な発現は、ＳＴＯＰ（４．８ ＋／− １．４５）及び流産の外科的処置（５．０９ ＋／− ２．２２）を受けている女性の脱落膜と比べると卵管妊娠（１２．３７ ＋／− ２．６６）の女性の子宮脱落膜の方が高かった（表１、図９Ａ）。記録されたデータのＡＮＯＶＡ解析によって、卵管妊娠群と流産群との間の統計的な有意差（全体でｐ＜０．０１８５、チューキー事後分析ｐ＜０．０５）が実証された。エラフィンのｍＲＮＡの発現も流産（９．００ ＋／− ２．５３）及び外科的妊娠中絶（４．６ ＋／− １．３８）を受けている女性と比べると卵管妊娠（７３．５７ ＋／− ３５．２９）の女性の脱落膜の方が高かった（表１、図９Ｂ）。しかしながら、この所見は、ＡＮＯＶＡ又は正常のデータ又は記録されたデータのノンパラメトリック統計的解析を用いても有意ではなかった。これは、卵管妊娠群の発現の高い変動性に起因した。エラフィンについてのその相対的なｍＲＮＡの値が、その他の試料の平均値の標準偏差の２倍より大きかったので、２つの試料（１つは、ＳＴＯＰを受けている患者由来、及び１つは、妊娠三期のうちの第１期の流産の患者由来）を解析から除外した。
【０１６６】
子宮内及び子宮外の妊娠に由来する子宮脱落膜におけるエラフィン及びＳＬＰＩのタンパク質の免疫組織化学的な局在
免疫組織化学によって子宮脱落膜中のエラフィン及びＳＬＰＩのタンパク質の発現及び分布を実証した（図１０Ａ〜Ｆ）。臨床群のいずれにおいてもエラフィン及びＳＬＰＩのタンパク質の発現パターンに明白な差異はなかった。ＳＬＰＩタンパク質の発現は、上皮（図１０Ａ及び図１０Ｂを参照のこと）及び脱落膜の白血球（図１０Ｃを参照のこと）で実証された。ＳＬＰＩタンパク質の発現は上皮腺の細胞質で特に強かった（図１０Ｂを参照のこと）。エラフィンタンパク質の発現は脱落膜の白血球集団に限定された（図１０Ｅ及び図１０Ｆを参照のこと）。しかしながら、場合によっては、上皮腺における膜性エラフィンタンパク質の発現の証拠があった（図１０Ｄ）。エラフィン及びＳＬＰＩの免疫発現に関する陰性対照は、陽性染色の証拠を示さなかった（それぞれ図１０Ｇ及び図１０Ｈ）。染色された組織切片全てにて、熟練した病理学者によって定性的分析が行われた。乏しい再現性と、免疫組織化学のスコア化についての観察者間の合意のために定量的分析は行わなかった（Ｔａｙｌｏｒ １９９４）。
【０１６７】
考察
我々の知る限り、我々は、子宮内妊娠のものと比べた、卵管妊娠の女性から集めた子宮脱落膜における天然の抗菌ペプチド（ＳＬＰＩ及びエラフィン）の遺伝子発現の新規の差異を報告する。この研究はまた、ＳＬＰＩのｍＲＮＡの発現が不全の子宮内妊娠（流産）と比べて卵管妊娠の女性の子宮脱落膜で有意に高い（ｐ＜０．０５）ことを実証する。以前の研究では、特に白血球集団に着目して子宮脱落膜の細胞性組成のみを比較し、子宮外妊娠と子宮内妊娠との間に明白な区別を見出さなかった（Ｂｕｌｍｅｒら １９８７；Ｓｔｅｗａｒｔ−Ａｋｅｒｓら １９９７）。
【０１６８】
卵管妊娠群と子宮内妊娠群との間の脱落膜の最も明白な差異は栄養膜の非存在である。我々の知る限り、栄養膜のシグナルによってＳＬＰＩ及びエラフィンの発現が調節されることを示唆する公表されたデータはない。そうは言うものの、機能的ゲノミクスのアプローチを用いた最近のインビトロの研究では、炎症誘発性サイトカイン及び細胞の有意な誘導を起こすことによって、栄養膜からのコンディショナル培地が脱落膜の局所免疫の環境を変化させ、胚の着床を促進することが示された（Ｈｅｓｓら ２００７）。このことは、我々の研究で認められた変化について、興味深い潜在的メカニズムを提供する。
【０１６９】
あるいは、子宮の環境が本当に卵管の環境を反映するのであれば、子宮脱落膜におけるＳＬＰＩの異常な発現は、単に子宮外着床の結末であるのかもしれない。卵管では、正常な卵管上皮が上行性の病原体を認識し、かつ応答する能力を有する一方で、上皮バリアを破壊し得る不要な炎症状態を同時に回避することが必須である。外来の病原体は、例えば、膜性Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のような、卵管細胞に存在するパターン認識受容体によって認識される（Ｄａｒｖｉｌｌｅら ２００３；Ｐｉｏｌｉら ２００４）。結合は、シグナル伝達のカスケードを開始させ、ＮＦ−κＢの活性化並びにそれに続く炎症誘発性及び免疫調節性のサイトカイン、ケモカイン及び同時刺激性分子（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ）の産生をもたらす（Ｂｏｗｉｅら ２０００）。ＮＦ−κＢは、これらの炎症性分子を上方調節することを介して間接的にＳＬＰＩの発現を高めるのかもしれない（Ｂｉｎｇｌｅら ２００１；Ｋｉｎｇら ２００２）。卵管着床部位の周辺には急性炎症の証拠がないことがしばしばある（Ｋｕｔｌｕａｙら １９９４）。異所性妊娠では、胚の着床の間のＳＬＰＩの卵管での発現は、プロテアーゼの作用を阻害することによって、炎症応答及びその後の初期の卵管損傷を軽減するのかもしれない。ＳＬＰＩは、肺気腫及び肺線維症のモデルで組織の損傷を軽減することが示されており、研究によって、ヘリコバクター・ピロリを持つ患者の胃粘膜におけるＳＬＰＩのレベルの低下が胃炎を誘発することが示された（Ｈｒｉｔｚら ２００６；Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉら １９９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎｅｔら １９９３；Ｒｕｄｏｌｐｈｕｓら １９９３；Ｗｅｘら ２００４ａ；Ｗｅｘら ２００４ｂ；Ｗｅｘら ２００６）。異所性着床の事象におけるＳＬＰＩレベルの上昇が、急性炎症の所見を欠くことを説明するために役立つのかもしれない。
【０１７０】
しかしながら、ＳＬＰＩの異常な発現は、卵管妊娠の結末ではなく、卵管妊娠の素因であり得る可能性がある。英国で最も一般的な性的に伝染する感染細菌である、クラミジア・トラコマティスは、卵管妊娠の主要なリスク因子であることが分かっている（Ｆａｒｑｕｈａｒ ２００５、Ｃａｓｓｅｌｌら ２００６）。それでもやはり、クラミジア感染が卵管損傷の主な原因の１つであることが示唆されている（Ｏｄｌａｎｄら １９９３）が、クラミジア感染から卵管妊娠をもたらす病原性事象は不明である。インビトロの研究によって、クラミジアが子宮頚部上皮及び栄養膜にてＳＬＰＩの発現を誘導することが実証された（Ｗｈｅｅｌｈｏｕｓｅら、投稿準備中）。クラミジアが上記のシグナル伝達カスケードを経由してＮＦ−κＢを介して作用すること、並びに持続又は反復した感染が子宮及び卵管におけるＳＬＰＩの異常な発現を引き起こし、卵管着床への感受性をもたらすことが可能性としてある。しかしながら、我々の研究で試験した検体はいずれもクラミジア感染では陽性ではなかった。
【０１７１】
子宮内妊娠と比べて異所性妊娠の女性でＳＬＰＩのｍＲＮＡ発現パターンが変化していることを実証したことは、胚の着床についての我々の現在の知識にさらに寄与する。免疫組織化学によってエラフィン及びＳＬＰＩのタンパク質の発現の分布パターンには明白な差異がないことが実証されたが、我々は、この技術を用いて分泌型タンパク質を正確に測定する困難さを認め、さらなる定量的なタンパク質の分析及び機能的な研究が必要であることを承知している。
【０１７２】
参考文献
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【０１７８】
Ｂｒｏｓｅｎｓ ＪＪ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｎ，Ｗｈｉｔｅ ＪＯ（１９９９）Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｄｅｃｉｄｕａｌ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０（１０），４８０９−２０．
【０１７９】
Ｂｕｌｍｅｒ ＪＮ，Ｐａｃｅ Ｄ，Ｒｉｔｓｏｎ Ａ（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｅｃｉｄｕａ：ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｒｅｐｒｏｄ Ｎｕｔｒ Ｄｅｖ ２８（６Ｂ），１５９９−６１３．
【０１８０】
Ｃａｓｓｅｌｌ ＪＡ，Ｍｅｒｃｅｒ ＣＨ，Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ Ｌ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｉ，Ｉｓｌａｍ Ａ，Ｂｒｏｏｋ ＭＧ，Ｒｏｓｓ ＪＤ，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ ＧＲ，Ｓｉｍｍｓ Ｉ，Ｈｕｇｈｅｓ Ｇ，Ｍａｊｅｅｄ Ａ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ ＪＭ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＭ，Ｈａｙｗａｒｄ ＡＣ（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ １９９０−２０００：ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ ｕｓｉｎｇ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＵＫ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄａｔａｂａｓｅ．ＢＭＪ ３３２（７５３７），３３２−４．
【０１８１】
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｍ，Ｍａｋ Ｉ，Ｗｈｉｔｅ ＪＯ，Ｂｒｏｓｅｎｓ ＪＪ（２００２）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｄｅｃｉｄｕａｌｉｓａｔｉｏｎ．Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ ４（補遺）３，２４−３０．
【０１８２】
Ｃｌａｒｋ ＤＡ，Ｖｉｎｃｅ Ｇ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ ＫＣ，Ｈｉｒｔｅ Ｈ，Ｓｔａｒｋｅｙ Ｐ（１９９４）ＣＤ５６＋ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｉｒｓｔ ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｄｅｃｉｄｕａ ａｓ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ ２−ｒｅｌａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ９（１２），２２７０−７．
【０１８３】
Ｄａｌｌｅｇｒｉ Ｆ，Ｏｔｔｏｎｅｌｌｏ Ｌ（１９９７）Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｉｎｆｌａｍｍ Ｒｅｓ ４６（１０），３８２−９１．
【０１８４】
Ｄａｌｇｅｔｔｙ ＤＭ，Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙ ＨＯＤ，Ｓａｌｌｅｎａｖｅ Ｊ−Ｍ， Ｃｏｍｅｓ Ｐ ａｎｄ Ｈｏｍｅ ＡＷ（２００６）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｏｖｉｄｕｃｔ．Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ １２ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ａｎｄ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ，Ａｔｈｅｎｓ．
【０１８５】
Ｄａｒｖｉｌｌｅ Ｔ，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ＪＭ，Ａｎｄｒｅｗｓ ＣＷ Ｊｒ，Ｎａｇａｒａｊａｎ ＵＭ，Ｓｔａｈｌ Ｌ，Ｏｊｃｉｕｓ ＤＭ（２００３）Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２， ｂｕｔ ｎｏｔ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−４， ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｏｖｉｄｕｃｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｇｅｎｉｔａｌ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１（１１），６１８７−９７．
【０１８６】
Ｅａｒｌ Ｕ，Ｗｅｌｌｓ Ｍ，Ｂｕｌｍｅｒ ＪＮ（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｅｃｔｏｐｉｃ ｔｕｂａｌ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ５（２），１３２−４２．
【０１８７】
Ｆａｒｑｕｈａｒ ＣＭ（２００５）Ｅｃｔｏｐｉｃ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｌａｎｃｅｔ ３６６（９４８５），５８３−９１．
【０１８８】
Ｆｉｎｎ ＣＡ（１９９４）Ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｅｎｓｔｒｕａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｍｅａｎｉｎｇ ｏｆ ｍｅｎｓｔｒｕａｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ９（７），１２０２−４．
【０１８９】
Ｈｅｌｍｉｇ Ｒ，Ｕｌｄｂｊｅｒｇ Ｎ，Ｏｈｌｓｓｏｎ Ｋ（１１９５）Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｍｕｃｕｓ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｔａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｌ ５９（１），９５−１０１．
【０１９０】
Ｈｅｓｓ ＡＰ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＡＥ，Ｔａｌｂｉ Ｓ，Ｄｏｓｉｏｕ Ｃ，Ｎｙｅｇａａｒｄ Ｍ，Ｎａｙａｋ Ｎ，Ｇｅｎｂｅｃｅｖ−Ｋｒｔｏｌｉｃａ Ｏ，Ｍａｖｒｏｇｉａｎｉｓ Ｐ，Ｆｅｒｒｅｒ Ｋ，Ｋｒｕｅｓｓｅｌ Ｊ，Ｆａｚｌｅａｂａｓ ＡＴ，Ｆｉｓｈｅｒ ＳＪ，Ｇｉｕｄｉｃｅ ＬＣ（２００７）Ｄｅｃｉｄｕａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ７６（１）：１０２−１７．
【０１９１】
Ｈｏｅｂｅ Ｋ，Ｊａｎｓｓｅｎ Ｅ，Ｂｅｕｔｌｅｒ Ｂ（２００４）Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５（１０），９７１−４．
【０１９２】
Ｈｒｉｔｚ Ｉ，Ｋｕｅｓｔｅｒ Ｄ，Ｖｉｅｔｈ Ｍ，Ｈｅｒｓｚｅｎｙｉ Ｌ，Ｓｔｏｌｔｅ Ｍ，Ｒｏｅｓｓｎｅｒ Ａ，Ｔｕｌａｓｓａｙ Ｚ，Ｗｅｘ Ｔ，Ｍａｌｆｅｒｔｈｅｉｎｅｒ Ｐ（２００６）Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｔｉｓ：ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．１８（３），２７７−８２．
【０１９３】
Ｈｕｎｔ ＪＳ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｔｅｒｕｓ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．１９９４ ５０（３）：４６１−６．
【０１９４】
Ｋｉｎｇ Ａ，Ｌｏｋｅ ＹＷ（１９９１）Ｏｎ ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｔｅｒｉｎｅ ｇｒａｎｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １２（１２），４３２−５．
【０１９５】
Ｋｉｎｇ ＡＥ，Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙ ＨＯ，Ｋｅｌｌｙ ＲＷ（２０００）Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ ａｎｄ ｆｉｒｓｔ ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ ｄｅｃｉｄｕａ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａｎ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ．ＭｏＩ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ６（２），１９１−６．
【０１９６】
Ｋｉｎｇ ＡＥ，Ｆｌｅｍｉｎｇ ＤＣ，Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙ ＨＯ，Ｋｅｌｌｙ ＲＷ（２００２）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ａｎｄ ｍｉｍｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．ＭｏＩ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ８（４），３４１−９．
【０１９７】
Ｋｉｎｇ ＡＥ，Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙ ＨＯ，Ｋｅｌｌｙ ＲＷ（２００３ａ）Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １，１１６．
【０１９８】
Ｋｉｎｇ ＡＥ，Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙ ＨＯ，Ｓａｌｌｅｎａｖｅ ＪＭ，Ｋｅｌｌｙ ＲＷ（２００３ｂ）Ｅｌａｆｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ：ａｎ ａｎｔｉｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｍｅｎｓｔｒｕａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ８８（９），４４２６−３１．
【０１９９】
Ｋｕｔｌｕａｙ Ｌ，Ｖｉｃｄａｎ Ｋ，Ｔｕｒａｎ Ｃ，Ｂａｔｉｏｇｌｕ Ｓ，Ｏｇｕｚ Ｓ，Ｇｏｋｍｅｎ Ｏ（１９９４）Ｔｕｂａｌ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｅｃｔｏｐｉｃ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｌ ５７（２），９１−４．
【０２００】
Ｌｏｋｅ ＹＷ，Ｋｉｎｇ Ａ（１９９５）Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｌｏｋｅ ＹＷ ａｎｄ Ｋｉｎｇ Ａ）．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １０２−１２９．
【０２０１】
Ｍａｒｘ Ｌ，Ａｒｃｋ Ｐ，Ｋａｐｐ Ｍ，Ｋｉｅｓｌｉｃｈ Ｃ，Ｄｉｅｔｌ Ｊ（１９９９）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ，ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｅｕｔｏｐｉｃ ａｎｄ ｅｃｔｏｐｉｃ ｆｉｒｓｔ ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ ｈｕｍａｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １４（４），１１１１−７．
【０２０２】
Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒ，Ｊａｎｅｗａｙ Ｃ Ｊｒ（２０００）Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４３（５），３３８−４４．
【０２０３】
Ｏｄｌａｎｄ ＪＯ，Ａｎｅｓｔａｄ Ｇ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ｓ，Ｌｕｎｄｇｒｅｎ Ｒ，Ｄａｌａｋｅｒ Ｋ（１９９３）Ｅｃｔｏｐｉｃ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ａｎｄ ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｓｅｒｏｌｏｇｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ ４３（３），２７１−５．
【０２０４】
Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒ（２００１）Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １（２），１３５−４５．
【０２０５】
Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ Ｈ，Ａｓａｎｏ Ｓ，Ｎｏｎａｋａ Ｔ，Ｈａｍａｍｕｒａ Ｉ，Ｍａｓｕｄａ Ｋ，Ｋｉｙｏｋｉ Ｍ（１９９６）Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １５３（１），３６９−７４．
【０２０６】
Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＭＳ，Ｄｅｓｒｏｃｈｅｒｓ ＰＥ，Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ ＡＭ，Ｇｉｂｂｓ ＤＦ，Ｖａｒａｎｉ Ｊ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＫＪ，Ｗｅｉｓｓ ＳＪ（１９９３）Ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｌｖｅｏｌｉｔｉｓ ｂｙ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ２．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９０（２４），１１５２３−７．
【０２０７】
Ｐｆｕｎｄｔ Ｒ，ｖａｎ Ｒｕｉｓｓｅｎ Ｆ，ｖａｎ Ｖｌｉｊｍｅｎ−Ｗｉｌｌｅｍｓ ＩＭ，Ａｌｋｅｍａｄｅ ＨＡ，Ｚｅｅｕｗｅｎ ＰＬ，Ｊａｐ ＰＨ，Ｄｉｊｋｍａｎ Ｈ，Ｆｒａｎｓｅｎ Ｊ，Ｃｒｏｅｓ Ｈ，ｖａｎ Ｅｒｐ ＰＥ，Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ Ｊ（１９９６）Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＫＡＬＰ／ｅｌａｆｉｎ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｎｔｉ−ｅｌａｓｔａｓｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９８（６），１３８９−９９．
【０２０８】
Ｐｉｏｌｉ ＰＡ，Ａｍｉｅｌ Ｅ，Ｓｃｈａｅｆｅｒ ＴＭ，Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ＪＥ，Ｗｉｒａ ＣＲ，Ｇｕｙｒｅ ＰＭ（２００４）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ２ ａｎｄ ４ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｆｅｍａｌｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２（１０），５７９９−８０６．
【０２０９】
Ｒｕｄｏｌｐｈｕｓ Ａ，Ｓｔｏｌｋ Ｊ，Ｄｉｊｋｍａｎ ＪＨ，Ｋｒａｍｐｓ ＪＡ（１９９３）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｍｐｈｙｓｅｍａ ｂｙ ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｌｙ ｉｎｓｔｉｌｌｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ １４７（２），４４２−７．
【０２１０】
Ｓａｌｌｅｎａｖｅ ａｎｄ ＲｙＩｅ（１９９１）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌａｓｔａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｍｕｃｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ ３７２（１），１３−２１．
【０２１１】
Ｓａｌｌｅｎａｖｅ ＪＭ，Ｓｈｕｌｍａｎｎ Ｊ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ Ｊ，Ｊｏｒｄａｎａ Ｍ，Ｇａｕｌｄｉｅ Ｊ（１９９４）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＬＰＩ） ａｎｄ ｅｌａｓｔａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＥＳＩ／ｅｌａｆｉｎ） ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ １１（６），７３３−４１．
【０２１２】
Ｓａｌｌｅｎａｖｅ ＪＭ（２０００）Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｅｌａｆｉｎ（ｅｌａｓｔａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｔｉｌｅｕｋｏｐｒｏｔｅａｓｅ） ａｓ ａｌａｒｍ ａｎｔｉｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ １（２），８７−９２．
【０２１３】
Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ Ｊ，Ｗｉｅｄｏｗ Ｏ，Ｈｉｒｏｓｅ Ｓ（１９９９）Ｔｈｅ ｔｒａｐｐｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ：ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ａｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ａ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｃｏｒｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３４０（Ｐｔ ３），５６９−７７．
【０２１４】
Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ａ，Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｏ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｓ，Ｓａｌｏｗｓｋｙ Ｒ，Ｌｅｉｂｅｒ Ｍ，Ｇａｓｓｍａｎｎ Ｍ，Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ Ｓ，Ｍｅｎｚｅｌ Ｗ，Ｇｒａｎｚｏｗ Ｍ，Ｒａｇｇ Ｔ（２００６）Ｔｈｅ ＲＩＮ：ａｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ ｆｏｒ ａｓｓｉｇｎｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｖａｌｕｅｓ ｔｏ ＲＮＡ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．ＢＭＣ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ７，３．
【０２１５】
Ｓｔｅｗａｒｔ−Ａｋｅｒｓ ＡＭ，Ｋｒａｓｎｏｗ ＪＳ，ＤｅＬｏｉａ ＪＡ（１９９７）Ｄｅｃｉｄｕａｌ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅｃｔｏｐｉｃ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ ６８（６），１１０３−７．
【０２１６】
Ｓｔｏｃｋ ＲＪ（１９９１）Ｔｕｂａｌ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １８（１），７３−９４．
【０２１７】
ＳｕＩｚ Ｌ，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ＪＰ，Ｓａｌｖａｔｉｅｒｒａ ＡＭ，Ｏｒｔｉｚ ＭＥ，Ｃｒｏｘａｔｔｏ ＨＢ（１９９８）Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ（ｖ） ａｎｄ ｂｅｔａ３ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ Ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｔｕｂａｌ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ．Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １３（１Ｏ），２９１６−２０．
【０２１８】
Ｔａｙｌｏｒ ＣＲ．Ａｎ ｅｘａｌｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｔｓ：ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｅｆｆｏｒｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ １９９４；１：１−１１．
【０２１９】
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＲＣ，Ｏｈｌｓｓｏｎ Ｋ（１９８６）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｅｌａｓｔａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３（１８）：６６９２−６．
【０２２０】
ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ＢＨ，Ａｎｄｒｉｅｓｓｅｎ ＭＰ，Ｓｐｒｕｉｊｔ ＫＩ，ｖａｎ ｄｅ Ｋｅｒｋｈｏｆ ＰＣ，Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ Ｊ（１９９６）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＫＡＬＰ／ｅｌａｆｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ．Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ．２８８（８），４５８−６２．
【０２２１】
Ｗｅｘ Ｔ，Ｔｒｅｉｂｅｒ Ｇ，Ｎｉｌｉｕｓ Ｍ，Ｖｉｅｔｈ Ｍ，Ｒｏｅｓｓｎｅｒ Ａ，Ｍａｌｆｅｒｔｈｅｉｎｅｒ Ｐ（２００４ａ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇａｓｔｒｉｔｉｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｌｏｃａｌ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｒｕｍ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２（４），２３８３−５．
【０２２２】
Ｗｅｘ Ｔ，Ｓｏｋｉｃ−Ｍｉｌｕｔｉｎｏｖｉｃ Ａ，Ｔｏｄｏｒｏｖｉｃ Ｖ，Ｂｊｅｌｏｖｉｃ Ｍ，Ｍｉｌｏｓａｖｌｊｅｖｉｃ Ｔ，Ｐｅｓｋｏ Ｐ，Ｍａｌｆｅｒｔｈｅｉｎｅｒ Ｐ（２００４ｂ）Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｏｓａ ｉｓ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｉｎ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇａｓｔｒｏｄｕｏｄｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｄｉｇ Ｄｉｓ ２２（４），３９０−５．
【０２２３】
Ｗｅｘ Ｔ，Ｙｅ Ｓ，Ｔｒｅｉｂｅｒ Ｇ，Ｖｉｅｔｈ Ｍ，Ｒｏｅｓｓｎｅｒ Ａ， Ｍａｌｆｅｒｔｈｅｉｎｅｒ Ｐ（２００６）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｏｗ−ｄｏｓｅ ａｓｐｉｒｉｎ，ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａ ｌｏｃａｌ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｄｕｏｄｅｎａｌ ｍｕｃｏｓａ．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ １１（１），３１−８．
【０２２４】
Ｗｈｅｅｌｈｏｕｓｅ Ｎ，Ｗａｔｔｅｇｅｄｅｒａ Ｓ，Ｆｌｅｍｉｎｇ Ｄ，Ｆｉｔｃｈ Ｐ，Ｋｅｌｌｙ Ｒ，Ｅｎｔｒｉｃａｎ Ｇ．Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ａｎｄ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｂｏｒｔｕｓ ｉｎｄｕｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＬＰＩ） ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｍａｌｅ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ．原稿執筆中。
【０２２５】
Ｗｉｅｄｏｗ Ｏ，Ｌｕａｄｅｍａｎｎ Ｊ，Ｕｔｅｃｈｔ Ｂ（１９９１）Ｅｌａｆｉｎ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １７４（１），６−１０．
【０２２６】
Ｗｉｎｇｅｎｓ Ｍ，ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ＢＨ，Ｈｉｅｍｓｔｒａ ＰＳ，Ｍｅｉｓ ＪＦ，ｖａｎ Ｖｌｉｊｍｅｎ−Ｗｉｌｌｅｍｓ ＩＭ，Ｚｅｅｕｗｅｎ ＰＬ，Ｍｕｌｄｅｒ Ｊ，Ｋｒａｍｐｓ ＨＡ，ｖａｎ Ｒｕｉｓｓｅｎ Ｆ，Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ Ｊ（１９９８）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＬＰＩ（ＡＬＰ／ＨＵＳＨ） ｉｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１１（６），９９６−１００２．
【０２２７】
Ｚｈｕ Ｊ，Ｎａｔｈａｎ Ｃ，Ｊｉｎ Ｗ，Ｓｉｍ Ｄ，Ａｓｈｃｒｏｆｔ ＧＳ，Ｗａｈｌ ＳＭ，Ｌａｃｏｍｉｓ Ｌ，Ｅｒｄｊｕｍｅｎｔ−Ｂｒｏｍａｇｅ Ｈ，Ｔｅｍｐｓｔ Ｐ，Ｗｒｉｇｈｔ ＣＤ，Ｄｉｎｇ Ａ（２００２）Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｎ ｔｏ ｅｐｉｔｈｅｌｉｎｓ：ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＳＬＰＩ ａｎｄ ｅｌａｓｔａｓｅ ｉｎ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ．Ｃｅｌｌ １１１（６），８６７−７８．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現及び／又はアクチビンＢのレベルを同定する工程とを含み、
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現及び／又はアクチビンＢの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項２】
試料中のＣＲＩＳＰ−３のレベルを同定する工程をさらに含み、ＣＲＩＳＰ−３の該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料中のＣＰＢ１のレベルを同定する工程をさらに含み、ＣＰＢ１の該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中のＣＲＩＳＰ−３のレベルを同定する工程とを含み、
ＣＲＩＳＰ−３の該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項５】
試料中のＣＰＢ１のレベルを同定する工程をさらに含み、ＣＰＢ１の該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中のＣＰＢ１のレベルを同定する工程とを含み、
ＣＰＢ１の該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項７】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中のインヒビンαのレベルを同定する工程とを含み、
インヒビンαの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項８】
試料中のインヒビンαのレベルを同定する工程をさらに含み、インヒビンαの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１〜６記載の方法。
【請求項９】
参照試料又は対照試料と比べた、試料中のアクチビンの量における約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％〜１００％の低下が、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中の分泌型白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）のレベルを同定する工程とを含み、
ＳＬＰＩの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項１１】
試料中のＳＬＰＩのレベルを同定する工程をさらに含み、ＳＬＰＩの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１〜９記載の方法。
【請求項１２】
参照試料又は対照試料と比べた、試料中に存在するＳＬＰＩのレベルにおける約１、２、３、４、５、１０、２０、３０又は４０倍の上昇が、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１０及び１１記載の方法。
【請求項１３】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中のエラフィンのレベルを同定する工程とを含み、
エラフィンの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項１４】
試料中のエラフィンのレベルを同定する工程をさらに含み、エラフィンの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１〜１２記載の方法。
【請求項１５】
参照試料又は対照試料と比べた、試料中に存在するエラフィンのレベルにおける約１、２、３、４、５、１０、２０、３０又は４０倍の上昇が、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１３及び１４記載の方法。
【請求項１６】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中のプロラクチンのレベルを同定する工程とを含み、
プロラクチンの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項１７】
試料中のプロラクチンのレベルを同定する工程をさらに含み、プロラクチンの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１〜１５記載の方法。
【請求項１８】
参照試料又は対照試料と比べた、試料中のプロラクチンの量における約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、７０、８０又は１００％の低下が、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１５及び１６記載の方法。
【請求項１９】
被験体によって提供される試料が、全血、血漿、血清、唾液、汗、尿、及び組織又は分泌物の生検／小片／交換物／洗浄物からなる群より選択される１以上の試料を含む、前記請求項のいずれかの方法。
【請求項２０】
試料が子宮脱落膜を含む、前記請求項のいずれかの方法。
【請求項２１】
異所性妊娠が、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体に由来する試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現及び／又はアクチビンＢのレベルと比較した、試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現及び／又はアクチビンＢのレベルの低下によって同定される、請求項１〜３、８、９、１１、１２、１４及び１５記載の方法。
【請求項２２】
異所性妊娠が、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体に由来する試料中に存在するＣＲＩＳＰ−３のレベルと比較した、試料中のＣＲＩＳＰ−３のレベルの上昇によって同定される、請求項２〜５、８、９、１１、１２、１４及び１５記載の方法。
【請求項２３】
異所性妊娠が、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体に由来する試料中に存在するＣＰＢ１のレベルと比較した、試料中のＣＰＢ１のレベルの上昇によって同定される、請求項３、５又は６、８、９、１１、１２、１４及び１５記載の方法。
【請求項２４】
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンを結合し得る剤を利用する技術によって、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンのレベルが同定される、前記請求項のいずれかの方法。
【請求項２５】
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンを結合し得る剤を利用する技術が免疫学的技術である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
免疫学的技術が、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロット及びドットブロットからなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する技術によって、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンのレベルが同定される、請求項１〜２３記載の方法。
【請求項２８】
ノザンブロット及び／又はサザンブロットによって、ｉインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンのレベルが同定される、請求項１〜２３記載の方法。
【請求項２９】
マイクロアレイ解析によって、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンのレベルが同定される、請求項１〜２３記載の方法。
【請求項１】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現及び／又はアクチビンＢのレベルを同定する工程とを含み、
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現及び／又はアクチビンＢの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項２】
試料中のＣＲＩＳＰ−３のレベルを同定する工程をさらに含み、ＣＲＩＳＰ−３の該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料中のＣＰＢ１のレベルを同定する工程をさらに含み、ＣＰＢ１の該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中のＣＲＩＳＰ−３のレベルを同定する工程とを含み、
ＣＲＩＳＰ−３の該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項５】
試料中のＣＰＢ１のレベルを同定する工程をさらに含み、ＣＰＢ１の該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中のＣＰＢ１のレベルを同定する工程とを含み、
ＣＰＢ１の該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項７】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中のインヒビンαのレベルを同定する工程とを含み、
インヒビンαの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項８】
試料中のインヒビンαのレベルを同定する工程をさらに含み、インヒビンαの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１〜６記載の方法。
【請求項９】
参照試料又は対照試料と比べた、試料中のアクチビンの量における約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％〜１００％の低下が、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中の分泌型白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）のレベルを同定する工程とを含み、
ＳＬＰＩの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項１１】
試料中のＳＬＰＩのレベルを同定する工程をさらに含み、ＳＬＰＩの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１〜９記載の方法。
【請求項１２】
参照試料又は対照試料と比べた、試料中に存在するＳＬＰＩのレベルにおける約１、２、３、４、５、１０、２０、３０又は４０倍の上昇が、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１０及び１１記載の方法。
【請求項１３】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中のエラフィンのレベルを同定する工程とを含み、
エラフィンの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項１４】
試料中のエラフィンのレベルを同定する工程をさらに含み、エラフィンの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１〜１２記載の方法。
【請求項１５】
参照試料又は対照試料と比べた、試料中に存在するエラフィンのレベルにおける約１、２、３、４、５、１０、２０、３０又は４０倍の上昇が、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１３及び１４記載の方法。
【請求項１６】
異所性妊娠を同定する方法であって、該方法が
（ａ）被験体由来の試料を提供する工程と、
（ｂ）該試料中のプロラクチンのレベルを同定する工程とを含み、
プロラクチンの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、方法。
【請求項１７】
試料中のプロラクチンのレベルを同定する工程をさらに含み、プロラクチンの該レベルが、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１〜１５記載の方法。
【請求項１８】
参照試料又は対照試料と比べた、試料中のプロラクチンの量における約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、７０、８０又は１００％の低下が、異所性妊娠に関連付けられる、又は異所性妊娠の指標である、請求項１５及び１６記載の方法。
【請求項１９】
被験体によって提供される試料が、全血、血漿、血清、唾液、汗、尿、及び組織又は分泌物の生検／小片／交換物／洗浄物からなる群より選択される１以上の試料を含む、前記請求項のいずれかの方法。
【請求項２０】
試料が子宮脱落膜を含む、前記請求項のいずれかの方法。
【請求項２１】
異所性妊娠が、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体に由来する試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現及び／又はアクチビンＢのレベルと比較した、試料中のインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現及び／又はアクチビンＢのレベルの低下によって同定される、請求項１〜３、８、９、１１、１２、１４及び１５記載の方法。
【請求項２２】
異所性妊娠が、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体に由来する試料中に存在するＣＲＩＳＰ−３のレベルと比較した、試料中のＣＲＩＳＰ−３のレベルの上昇によって同定される、請求項２〜５、８、９、１１、１２、１４及び１５記載の方法。
【請求項２３】
異所性妊娠が、妊娠していない被験体又は正常な子宮内妊娠の被験体に由来する試料中に存在するＣＰＢ１のレベルと比較した、試料中のＣＰＢ１のレベルの上昇によって同定される、請求項３、５又は６、８、９、１１、１２、１４及び１５記載の方法。
【請求項２４】
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンを結合し得る剤を利用する技術によって、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンのレベルが同定される、前記請求項のいずれかの方法。
【請求項２５】
インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンを結合し得る剤を利用する技術が免疫学的技術である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
免疫学的技術が、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロット及びドットブロットからなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する技術によって、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンのレベルが同定される、請求項１〜２３記載の方法。
【請求項２８】
ノザンブロット及び／又はサザンブロットによって、ｉインヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンのレベルが同定される、請求項１〜２３記載の方法。
【請求項２９】
マイクロアレイ解析によって、インヒビン／アクチビンβＢサブユニット遺伝子発現、アクチビンＢ、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＰＢ１、インヒビンα、ＳＬＰＩ、エラフィン及び／又はプロラクチンのレベルが同定される、請求項１〜２３記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【公表番号】特表２０１０−５３１９９１（Ｐ２０１０−５３１９９１Ａ）
【公表日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１４１２１（Ｐ２０１０−５１４１２１）
【出願日】平成２０年７月２日（２００８．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００２２８２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００４３４０
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５０５０６６３４９）ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２日（２００８．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００２２８２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００４３４０
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５０５０６６３４９）ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラ (6)
【Ｆターム（参考）】
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