本発明は、プロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体を自然には発現しない細胞内で、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現させるための方法および組成物を提供する。さらに、本発明は、そのような細胞内で、ウイルス、例えば、インフルエンザウイルスを産生する方法も提供する。また、本発明は、そのような異種プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する細胞内で生育したインフルエンザウイルスの力価を増加させるための方法も提供する。その上、本発明は、本方法および本組成物に有用な、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)からのプロテアーゼも提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体（pro-protease）をコードする核酸を含む宿主細胞であって、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸が、宿主細胞のゲノム内に組み込まれており、かつプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体は、前記細胞内では通常発現していない、上記宿主細胞。
【請求項２】
プロテアーゼを発現する、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
プロテアーゼが、セリンプロテアーゼである、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
プロテアーゼが、プロテアーゼ前駆体である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項５】
プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現が、誘導性プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項６】
プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現が、恒常的に活性のあるプロモーターの制御下にある、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項７】
核酸が、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の分泌を指示する分泌シグナルを含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項８】
哺乳動物細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項９】
哺乳動物細胞が、ヒト細胞、霊長類細胞、イヌ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞またはラット細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
鳥類細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
懸濁状態で順応なしで増殖する、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
インフルエンザウイルスを生成する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の宿主細胞をインフルエンザウイルスに感染させるか、または該宿主細胞にインフルエンザゲノムをコードする核酸をトランスフェクションすることによって、該宿主細胞内にインフルエンザゲノムを導入するステップと、
（ｂ）前記細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能にする条件下で培養するステップと、
（ｃ）インフルエンザウイルスを細胞培養から収集するステップと
を含む、上記方法。
【請求項１３】
宿主細胞がプロテアーゼ前駆体（pro-protease）を発現し、外因性のプロテアーゼを培地に添加するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
外因性のプロテアーゼを、約０．１μｇ／ｍｌの最大濃度まで添加する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
外因的に添加するプロテアーゼの非存在下でインフルエンザウイルスを複製させる方法であって、
（ａ）請求項１に記載の宿主細胞をインフルエンザウイルスに感染させるか、または該宿主細胞にインフルエンザゲノムをコードする核酸をトランスフェクションすることによって、該宿主細胞内にインフルエンザゲノムを導入するステップと、
（ｂ）前記細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能にする条件下で培養するステップであって、前記条件が外因的に添加するプロテアーゼを含まないステップと、
（ｃ）インフルエンザウイルスを細胞培養から収集するステップと
を含む、上記方法。
【請求項１６】
細胞培養で増殖したインフルエンザウイルスの力価を上昇させる方法であって、インフルエンザウイルスを細胞培養で培養するステップを含み、細胞培養の細胞は、（ｉ）前記細胞と異種であり、かつ（ｉｉ）インフルエンザウイルスの赤血球凝集素を切断する、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を安定して発現し、それによって、異種プロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体を発現しない細胞内でインフルエンザウイルスを培養することよって得た力価と比較して、前記細胞培養で増殖したインフルエンザウイルスの力価を上昇させる、上記方法。
【請求項１７】
インフルエンザの複製を支援することができる宿主細胞内で異種プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を生成するための方法であって、通常は該細胞内で発現していないプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を含む細胞を、前記のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現を可能にする条件下で培養するステップを含み、それによって、細胞内でプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を生成させる、上記方法。
【請求項１８】
細胞が、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する宿主細胞の培養で増殖したウイルスの力価を上昇させるのに十分な量のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１を含む単離核酸。
【請求項２０】
配列番号２のアミノ酸を含む単離ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１９に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の発現ベクターを含む単離細胞。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【公表番号】特表２００８−５４６４０８（Ｐ２００８−５４６４０８Ａ）
【公表日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１８２８６（Ｐ２００８−５１８２８６）
【出願日】平成１８年６月２０日（２００６．６．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２３８６６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００２００７
【国際公開日】平成１９年１月４日（２００７．１．４）
【出願人】（５０５３９６２２４）メッドイミューン　バクシーンズ，インコーポレイティド (13)
【Ｆターム（参考）】