疼痛治療
本発明は広く疼痛の治療及び予防に関するものである。本発明はＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが疼痛の治療に有効であることを提示する。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体を含むがこれに限定されるものではない。本発明はさらに、特定の疾患モデルのアンタゴニスト検査に有用なＧＭ−ＣＳＦノックアウトマウスのような遺伝子組み換え動物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年１２月２２日出願の米国暫定出願第６１／１３９，６８７号及び２００９年３月３０日出願の米国暫定出願第６１／１６４，４９１号の利益を主張し、そこに記載されたその全内容を援用するものである。
【０００２】
本発明は、概して疼痛の治療及び予防法に関するものである。本発明によると、疼痛治療において、ＧＭ−ＣＳＦのアンタゴニストが効果的であることが提案されている。ＧＭ−ＣＳＦのアンタゴニストは、ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体を含むものであるが、これに限定されるものではない。本発明はさらに、特定の疾患モデルにおいてアンタゴニストの検査に有用なＧＭ−ＣＳＦノックアウトマウスなどの遺伝子組み換え動物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
［疼痛］
様々な種類の疼痛が、米国の医師への相談において最も高頻度の理由であり、毎年全アメリカ人の半数が医療的ケアを求めている。それは、内科的疾患において、人間の生活の質及び一般的な機能を著しく妨げる主要な症状である。診断は、持続時間、強度、種類（鈍い、焼けるような又は刺すような）、原因又は体の位置により、色々な方法で疼痛を特徴的付けることに基づいている。一般に疼痛は治療をせずに治まり、又は休息や鎮痛剤服用などの簡単な対策に反応するものであり、それはその後急性疼痛と言われる。しかし、疼痛がもはや症状ではなく、疼痛そのものが病気である慢性疼痛と呼ばれる難治性の進行性の状態になる場合もある。
【０００４】
疼痛は、多くのスキームや状況によって分類される。疼痛には二つの基本タイプ：急性と慢性がある。急性疼痛は短い期間生じ、一時的な疾患に関連する。しかし、これは通常どこか悪いところがあるとの警告である。慢性疼痛は、継続的で再発性のものである。これは慢性的な病気に関連しており、それらの症状の一つである。疼痛の強さは、それを生じさせた刺激の種類だけでなく、疼痛の主観的な知覚によっても左右される。主観的な知覚は幅広いが、以下に基づいて疼痛の種類をいくつかに分類する：
・疼痛を生じさせた刺激
・疼痛の持続時間
・疼痛の特徴（強さ、場所、等）
【０００５】
もう一つの分類システムは、以下の通りである。
・絶え間ない疼痛。一定の強さが連続する。通常運動することによって悪化する。
・ズキズキする疼痛。片頭痛の典型である。脳の血管の拡張と収縮が原因である。
・突き刺すような疼痛。強く激しい疼痛である。機械的刺激が原因である。
・焼けるような疼痛。例えば胸焼けのような、絶えず焼けるような感覚である。
・圧迫されるような疼痛。血管又は筋肉の収縮が原因である。
【０００６】
特殊な種類の疼痛もある。
・筋肉の疼痛。筋肉痛として知られており、筋肉に作用し過度の運動の後や炎症時に生じる。
・疝痛。月経期間の子宮のように特定の器官の筋肉収縮が原因である。
・関連痛。体から受けた情報を脳がどのように解釈するかにより、実際に生じた場所ではない場所で痛みが生じる。
・外科的手術後又は手術後の疼痛。外科的手術後に生じ、外科的措置の損傷によるものである。
・骨肉腫の疼痛。前立腺、乳房、又は他の軟部組織の腫瘍といった特定の種類の癌は、転移性骨疾患として知られる骨の痛みを伴う疾患に進行する場合がある。
【０００７】
［疼痛治療の標準療法］
疼痛治療には、多くの方法がある。疼痛の原因によって治療が変わる。主な治療は以下の通りである。
・アセトアミノフェノン：タイレノール（アセトアミノフェン）は、疼痛を治療するのに用いられている。他のいくつかの疼痛用の薬物とは違い、タイレノールは抗炎症作用がない。しかし、慢性疼痛であって疼痛の部位に炎症がない場合は、しばしばタイレノールは適切な治療の選択となりうる。タイレノールは、適切に使用すれば安全であるが、過度に使用すると危険な場合がある。さらに、タイレノールは、他の特定の薬物と共に使用すると、望ましくない効果をもたらすことがある。
・非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）：ＮＳＡＩＤｓ（イブプロフェン、モトリン、アリーブ等のような）は、急性疼痛又は慢性疼痛の患者が再発した場合に最も有益である。ＮＳＡＩＤｓはまた、腱炎、滑液包炎、及び関節炎などの炎症性疾患の治療にも優れている。胃の疾患の進行を懸念して、一般に、ＮＳＡＩＤは慢性疼痛を患う患者に使用を限定している。セレブレックスなどＣＯＸ−２阻害剤と呼ばれる新商品が、この合併症を回避する目的で作られたが、これらの薬を長期間にわたり使用する際には、依然として注意が必要である。
・コルチコステロイド：ＮＳＡＩＤｓと同様に、コルチコステロイドは、強力な抗炎症薬であり、急性疼痛又は慢性炎症疾患の再発の使用に最適である。コルチコステロイドは、経口投与（メドロール、プレドニゾン等）か、軟部組織又は関節へ注入（コルチゾン注射）が可能である。
・麻薬：麻薬を使用しないと疼痛が制御できない場合に麻薬の使用を考慮すべきである。多くの麻薬は、危険であり中毒になる。麻薬の投与は、急性疼痛に有用であるが、重大な副作用も有している。これらの薬の短時間作用型は、乱用と耐性を生じさせることがある。長時間作用型の選択は副作用が少なく、慢性疼痛を制御するのにより優れている。麻薬は、投与量を徐々に減らさずに長期間使用したり、疼痛以外の理由で薬を摂取した場合に中毒になる場合がある。
・抗けいれん誘発剤：抗けいれん誘発剤は、神経痛を緩和するカテゴリーの薬剤である。これらの薬は、神経や脳に送られる信号の機能を変化させる。神経痛の抗けいれん誘発剤で最も一般的に処方されているのは、Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ（ガバペンチン）と呼ばれるものである。線維筋痛治療専用で近年浮上している別の選択は、リリカ（プレガバリン）と呼ばれるものである。
・局所麻酔薬：局所麻酔薬はある部位の一時的な疼痛を軽減する。慢性疼痛に使用するときに、局所麻酔薬はしばしば局所パッチとして疼痛部位に貼付される。リドダームは、皮膚に貼付し、この部位の感度を低下させるパッチとして販売されている。
【０００８】
上記治療の選択はいずれも、欠点、副作用があり、又は特定の疼痛の種類に使用が制限されている。従って、依然として疼痛治療に対して不十分な医療の強い要求がある。
【０００９】
［ＧＭ−ＣＳＦ］
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、白血球成長因子として機能するサイトカインである。ＧＭ−ＣＳＦは、幹細胞を刺激して顆粒球（好中球、好酸球、及び好塩基球）と単球を生成する。単球は、血液循環を出て、組織に移動するとすぐに成熟してマクロファージになる。これは、少数のマクロファージを活性化し、その数を急速に増加させる自然免疫／炎症カスケードの一部であり、感染症と戦う不可欠な過程である。活性化型ＧＭ−ＣＳＦは、細胞外でホモ二量体として存在する。特に、ＧＭ−ＣＳＦは、炎症性サイトカイン、ケモカイン、及びプロテアーゼを増産させ、それにより最終的に関節破壊をもたらす、リウマチ（ＲＡ）のような自己免疫疾患の炎症性メディエータとして同定される。
【００１０】
ＧＭ−ＣＳＦは、ヒトや動物の体内の様々なプロセスに関与するサイトカインである。近年、炎症性疾患などの特定の疾患や病状がＧＭ−ＣＳＦに関連しており、ＧＭ−ＣＳＦが発明の潜在的なポイントとして示唆されてきた。本発明は初めてＧＭ−ＣＳＦが疼痛治療の有効なターゲットになることを開示した。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦが疼痛治療の有効なターゲットであることを初めて示したものである。この発見は新規なものであり、従来の技術は、疼痛治療に関与するそのようなポイントのいかなる論理的根拠も教示、示唆、又は提供するものではない。本発明は、例えば対象の疼痛治療の方法を提供し、この方法はその対象に効果的な量のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与するステップから成る。
【００１２】
別の態様において本発明は、対象の疼痛予防の方法を企図しており、この方法は、その対象に効果的な量のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与するステップを含む。
【００１３】
別の態様において本発明は、疼痛を患う又は疼痛を患う疑いのある対象の細胞の成長及び／又は生存を活性化、増殖、誘導するＧＭ−ＣＳＦの能力に拮抗するＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを具える合成物に関するもので、この合成物は、一又はそれ以上の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤をさらに具えるものである。
【００１４】
別の態様において本発明は、疼痛治治療に有用なＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを具える合成物に関するもので、この合成物は、一又はそれ以上の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤をさらに具えるものである。
【００１５】
本発明の具体的な態様では、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストはＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体である。
【００１６】
本発明の代替の態様では、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストはＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体である。
【００１７】
他の態様において本発明は、疼痛治療の薬剤の調合においてＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用に関するものである。
【００１８】
他に実施例において本発明は、疼痛治療用のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを提供するものである。
【００１９】
本発明の特定の態様において、疼痛は外科的手術後の疼痛である。本発明の代替の態様においては、疼痛は骨肉腫の疼痛である。さらに本発明の代替の態様では、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは鎮痛効果を有する。
【００２０】
本発明の特定の態様において、疼痛は炎症性疼痛である。
【００２１】
本発明の別の態様において、ＧＭ−ＣＳＦ−／−遺伝子型を有する遺伝子組み換えされた哺乳類を提供する。
【００２２】
本明細書全体を通して、文脈上別の解釈が必要とされない限り、用語「具える」、「有する」、並びに「含む」、及び「具えている」、「有している」、「含んでいる」などのそれら変形は、記載された要素、完全体、要素群、又は複数の完全対を含むものであり、いかなる他の要素、完全対、要素群、又は複数の完全体を排除するものではないと解される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、変形性関節症のマウスモデルにおけるＧＭ−ＣＳＦ抗体を用いた療法的治療の膝関節組織学的スコアを示したものである。Ｌａｔ．は外側を表し、Ｍｅｄ．は中央を表している。結果は、平均値±標準誤差として表す。中央大腿骨を除く全ての部位で、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を投与したマウスは、コントロールのマウスと比較してより低い疾患が観察された。
【図２】図２は、インキャパシタンスメータにおける後ろ足の体重配分評価の実験結果を示す。グラフに示すように、変形性関節症を誘発してから２７日以降のデータは顕著（対応のないｔ−検定）である。
【図３】図３は、炎症疾患（ｍＢＳＡ／ＩＬ１で誘発された単関節関節炎）の治療におけるＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの有効性を証明した実験結果を示す。治療後７日での膝関節の臨床スコアが描かれている。黒塗りの棒は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの記録結果、白抜きの棒は、ＧＭ−ＣＳＦノックアウトマウスの結果を示す。左はインドメタシンで治療したマウスである。右はインドメタシンの治療を受けていないマウスである。
【図４】図４は、炎症性疼痛（ｍＢＳＡ／ＩＬ１で誘発された単関節関節炎）の治療におけるＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの有効性を証明する実験結果を示す。ｍＢＳＡ／ＩＬ−１で誘発された単関節関節炎を患うマウスの疼痛測定として、インキャパシタンスメータで測定した体重配分を示す。結果は、注入された後ろ足／コントロール後ろ足＊１００として表現した。
【図５】図５は、炎症性疼痛の治療におけるＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの有効性を証明する実験結果を示す。左（Ｌ）の足蹠にＣＦＡを注入した後の足の厚さの変化を測定した炎症のレベルを示す。右（Ｒ）の足蹠は標準である。「＋インドメタシン」グループは、それぞれ読み取りの１時間前に、腹腔内をインドメタシン（１ｍｇ／ｋｇ）で治療したものである。Ｎは１２マウス／グループを示す。
【図６】図６は、炎症性疼痛の治療におけるＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの有効性を証明する実験結果を示す。左の足蹠にＣＦＡを注入した後の疼痛の測定としてインキャパシタンスメータで測定した体重配分を示す。「＋インドメタシン」グループは、それぞれ読み取りの１時間前に、腹腔内をインドメタシン（１ｍｇ／ｋｇ）で治療したものである。結果は注入された後足／コントロール後足×１００で表す。Ｎは１２マウス／グループを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦは、疼痛治療の有効なターゲットであることを示している。この点について本発明は、一態様において疼痛分野で予防的又は療法的利益をもたらすＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを用いた方法を提供する。
【００２５】
本発明は、このような治療を必要とする対象に、治療に効果的な量のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与する治療方法を提供する。ここで使用される「治療に効果的な量」又は「効果的な量」は、所望の生物学的反応を導き出すのに必要なＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの量をいう。本発明で治療に効果的な量とは、疼痛の治療及び／又は予防に必要なＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの量をいう。
【００２６】
特定の態様で本発明は、外科的手術後の疼痛の治療方法を提供する。他の態様で本発明は、骨肉腫の疼痛の治療方法を提供する。さらに別の態様で本発明は、鎮痛効果を有するＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを提供する。さらに別の態様で本発明は、関節リウマチ痛の治療方法を提供する。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、関節リウマチに関連する疼痛を阻害又は阻止することができる。別の態様で本発明は、関節リウマチ痛の発生率を減少させる、関節リウマチ痛を改善する、関節リウマチ痛を鎮静させる、関節リウマチ痛を緩和する、及び／又は対象の関節リウマチの発症、進行、又は発展を遅らせる方法を提供し、この方法は、対象にＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを効果的な量投与することを具えている。別の態様で本発明は、個人にＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを効果的な量投与することにより、個人の変形性関節症を予防又は治療する方法を提供する。別の態様で本発明は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを効果的な量投与することを具える個人の関節リウマチに関連する炎症性悪液質（体重減少）の治療方法を提供する。別の態様で本発明は、個人で、変形性関節症痛の発生率を減少させる、変形性関節症痛を改善する、変形性関節症痛を鎮静させる、変形性関節症痛を緩和する、及び／又は変形性関節症痛の発症、進行、発展を遅らせる方法を提供し、この方法は、個人に対してＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを効果的な量投与することを具えている。
【００２７】
疼痛又は一若しくはそれ以上の疼痛（関節リウマチ痛又は変形性関節症痛など）の症状を「緩和」とは、本発明ではＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストで治療した個人又は個人の集団における手術後の疼痛の一又はそれ以上の所望の臨床症状の程度を緩和すること意味する。
【００２８】
特定の態様で本発明は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与した２４時間以内に疼痛が軽減される。別の態様においては、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニスト投与の４日後以内に疼痛が軽減される。
【００２９】
ここで使用される「ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニスト」は、最も広い意味でのＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを含み、ＧＭ−ＣＳＦの活性又は機能を阻害する任意の分子又はＧＭ−ＣＳＦに治療的な効果を発揮するその他の方法も含む。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの用語は、ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な阻害核酸、又はＧＭ−ＣＳＦに特異的な有機小分子を含むものであるが、これに限定されるものではない。ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的に結合する抗体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な阻害核酸、又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な有機小分子は、用語ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの意味範囲内にある。
【００３０】
阻害核酸は、アンチセンスＤＮＡ、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、外部ガイド配列、低分子干渉ＲＮＡ、及びミクロＲＮＡを含むがこれに限定されるものではない。有用な阻害核酸は、ＧＭ−ＣＳＦをコードするＲＮＡの発現を、コントロールと比較して少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は９５パーセント減少させるものを含む。阻害核酸及びそれらの生成方法は、従来よりよく知られている。低分子干渉ＲＮＡ設計ソフトウエアは市販されている。
【００３１】
ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な有機小分子（ＳＭＯＬｓ）は、天然物スクリーニング又は化学ライブラリのスクニーニングにより同定される。一般にＳＭＯＬｓの分子量は５００ダルトン以下であり、より具体的には１６０ダルトンから４８０ダルトンである。ＳＭＯＬｓの他の一般的な特性は、以下の１つ又はそれ以上を有する。
・分子係数ｌｏｇＰが、−０．４から＋５．６の範囲である。
・モル屈折率が、４０から１３０である。
・原子数が２０から７０である。
【００３２】
検討のためゴーズら、「Ｊ Ｃｏｍｂｉｎ Ｃｈｅｍ：１」、５５−６８頁、１９９９年とリピンスキーら、「Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖ：２３」、３−２５頁、１９９７年を参照されたい。
【００３３】
本発明で使用されるＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体である。そのような抗体は、マウス、ラット、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体などの、任意の種類の抗体であってもよい。ここでは「ヒト」抗体又は機能性ヒト抗体断片を、キメラではなく（例えば「ヒト化」ではない）、かつ非ヒト種由来（全体あるいは一部に拘わらず）ではないものと定義する。ヒト抗体又は機能性抗体断片は、ヒト由来又は合成ヒト抗体でもよい。ここでは「合成ヒト抗体」を、既知のヒト抗体配列の分析に基づきシリコン内で合成された合成配列由来の配列を全体又は一部に有する抗体と定義する。シリコン内でのヒト抗体配列又はその抗体の設計は、例えばヒト抗体又は抗体断片の配列のデータベースを分析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を構築することにより得られる。ヒト抗体又は機能性抗体断片の別の例は、ヒト由来の抗体配列ライブラリ（例えばヒトなど天然ソース由来の抗体に基づくライブラリ）から単離された核酸でコードされたものである。
【００３４】
ここでは「ヒト化抗体」又は機能性ヒト化抗体断片を、（Ｉ）非ヒトソース（例えば異種免疫系を担う遺伝子組み換えマウス）由来のヒト生殖系配列の基づく抗体、（ＩＩ）可変領域は非ヒト由来であり、定常領域はヒト由来であるキメラ、又は（ＩＩＩ）可変領域のＣＤＲｓが非ヒト由来であり、可変領域の一又はそれ以上のフレームワークがヒト由来であり、定常領域（もしあれば）がヒト由来である移植ＣＤＲと定義する。
【００３５】
ここでは用語「キメラ抗体」又は機能性キメラ抗体断片を、一つの種に見られる配列に由来又は対応する定常抗体領域を有する抗体分子及びもう一つの種に由来する可変抗体領域を有する抗体分子と定義する。定常抗体領域は、例えばヒト生殖系又は体細胞のようなヒトに見られる配列に由来又は対応し、可変抗体領域（例えばＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ又はＦＲ領域）は、例えばマウス、ラット、又はハムスターのような非ヒト動物に見られる配列に由来するものが好ましい。
【００３６】
ここで使用される、抗体が抗原に「特異的に結合する」とは、このような抗体が、このような抗原と一又はそれ以上の関連する抗原を区別しうる場合に、特異的な結合は絶対的なものではなく相対的な特性であるため、抗原（ここでは、ＧＭ−ＣＳＦ又は代替としてＧＭ−ＣＳＦ受容体）「に／に対して特異的」又は抗原を「特異的に認識する」ことである。標準抗原は、１又はそれ以上の例えばＩＬ３、ＩＬ５、ＩＬ−４、ＩＬ１３、又はＭ−ＣＳＦなどの標準点として使用される、近い関係の抗原である。最も一般的な形式（及び何も言及されていないときは）は、「特異的な結合」は、例えば下記の方法にしたがって、抗体の対象の抗原と無関係の抗原を識別する能力をいう。このような方法には、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ−、ＲＩＡ−、ＥＣＬ−、ＩＲＭＡ−検定を含むがこれに限定されるものではない。例えば、標準ＥＬＩＳＡ分析が行われる。スコアは、標準発色により行われる（例えば西洋ワサビペルオキシターゼ及び過酸化水素が添加されたテトラメチルベンジンを有した二次抗体）。特定のウェル中での反応は、例えば４５０ｎｍで光学密度により計測される。一般的なバックグランド（＝陰性反応）は０．１ＯＤであり、典型的な陽性反応は１ＯＤである。これは陰性／陽性の違いは１０倍以上であることを示している。一般に特異的な結合を判定するときは、単一の標準抗原を使用せず、粉ミルク、ＢＳＡ、トランスフェリン、又は同様なものなどの約３から５の無関係の抗原を使用する。さらに、「特異的な結合」は、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、又は１又はそれ以上のアミノ酸残基の鍵又はＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体のアミノ酸残基の伸長の異なるドメイン又は領域などターゲット抗原の異なる部分を識別する抗体の能力に関連する。
【００３７】
また、本書において「免疫グロブリン」（Ｉｇ）を、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、又はＩｇＤのクラス（又は任意のそのサブクラス）に属し、従来より知られた抗体及びその機能性断片を全て含むタンパク質と定義する。ここでは抗体／免疫グロブリンの「機能性断片」を、抗原結合領域を保持する抗体／免疫グロブリン（例えばＩｇＧの可変領域）断片と定義する。抗体の「抗原結合領域」は、通常抗体の一又はそれ以上の超可変領域、即ちＣＤＲ−１、−２、及び／又は−３領域に見られるが、可変「フレームワーク」領域はまた、ＣＤＲｓの足場を提供するという抗原結合で重要な役割を果たすことができる。「抗原結合領域」は、少なくとも可変軽（ＶＬ）鎖の４から１０３アミノ酸残基及び可変重（ＶＨ）鎖の５から１０９アミノ酸残基を具えるのが好ましく、ＶＬの３から１０７アミノ酸残基及びＶＨの４から１１１アミノ酸残基を具えるのがさらに好ましく、ＶＬ及びＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸位置１から１０９及びＶＨのアミノ酸位置１から１１３；番号はＷＯ９７／０８３２０に従う）を完全に具えるのが特に好ましい。本発明で使用する免疫グロブリンの好ましいクラスはＩｇＧである。本発明の「機能性断片」はＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖの領域、又は例えば単一の重鎖可変領域又は単一の軽鎖可変領域といった単一の免疫グロブリン可変領域又は単一の領域抗体ポリペプチド具える構成体を含んでいる。Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂは、ＣＨ１とＣＬ領域間に生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小化する又は完全に除去するよう設計されている。
【００３８】
本発明の抗体は、シリコン内で設計されたアミノ酸配列に基づいて合成的に作られた核酸でコードされた組み換え体抗体ライブラリ由来のものであってもよい。シリコン内での抗体の設計は、例えばヒト抗体のデータベースを分析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を構築することにより得ることができる。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２９６」、５７頁、２０００年、Ｋｒｅｂｓら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５４」、６７頁、２００１年、Ｒｏｔｈｅら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７６」、１１８２頁、２００８年、及び参照によりその全体が組み込まれる２０００年にＫｎａｐｐｉｋらに発行された米国特許第６，３００，０６４号にシリコン内で作製された配列の設計及び取得方法が開示されている。
【００３９】
ＧＭ−ＣＳＦに特異的な任意の抗体を本発明で使用してもよい。典型的な抗体が、その全内容を援用するＵＳ１１／９１４，５９９に開示されている。別の典型的な抗体は、配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体由来の抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体として同じ特異性を有する及び／又は同じエピトープに結合する抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号１に示す配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％相同である重鎖可変領域を具える抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号２に示す配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有する重鎖可変領域を具える抗体を含む。
【００４０】
【００４１】
【００４２】
本発明で用いることができる代替の典型的な抗体は、配列番号３に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は配列番号４に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体である。別の典型的な抗体は、配列番号３に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は配列番号４に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体由来の抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号３に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は配列番号４に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体として同じ特異性を有する及び／又は同じエピトープに結合する抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号３に示す配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有する重鎖可変領域を具える抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号４に示される配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有する重鎖可変領域を具える抗体を含む。
【００４３】
【００４４】
本発明で用いることができる代替の例示的な抗体は、以下から選択されたＨ−ＣＤＲ３配列を具える抗体である。
【００４５】
【００４６】
配列番号５−１６のいずれか一つから選択されたＨ−ＣＤＲ３配列を具える抗体が、さらに以下のＨ−ＣＤＲ１配列を具えるのが好ましい。
【００４７】
【００４８】
本発明で用いることができる代替の例示的な抗体は、以下のＬ−ＣＤＲ１配列を具える。
【００４９】
【００５０】
前記抗体が、配列番号２２−２７のＣＲＤｓの全てを具えるのが好ましい。
【００５１】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体は、エリスロポエチン受容体スーパーファミリーの要素である。それは、アルファ及びベータサブユットから成るヘテロ二量体性である。ベータサブユニットがＩＬ３とＩＬ５を含むサイトカイン受容体と共有されるのに対し、アルファサブユニットはＧＭ−ＣＳＦに高い特異性を有する。これは、ベータ受容体サブユニットのより広範な組織分布で反映される。アルファサブユットであるＧＭ−ＣＳＦＲαは、好中球、マクロファージ、好酸球、樹枝状細胞、内皮細胞、及び呼吸上皮細胞といった骨髄性細胞及び非造血細胞に最初に発現する。ＧＭ−ＣＳＦＲαの全長は、Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーに属する４００アミノ酸のＩ型膜糖タンパク質であり、２２アミノ酸のシグナルペプチド（位置１−２２）、２９８アミノ酸の細胞外領域（位置２３−３２０）、位置３２１−３４５の膜貫通領域、及び短い５５アミノ酸の細胞内領域から成る。シグナルペプチドは、３７８アミノ酸のタンパク質としてＧＭ−ＣＳＦαの成熟形を提供するために切断される。ヒト及びネズミのＧＭ−ＣＳＦＲαのｃＤＮＡクローンは市販されており、タンパク質レベルで受容体サブユニットは３６％の同一性を有する。ＧＭ−ＣＳＦは、単独で相対的に低い親和性のαサブユニット（Ｋｄ１−５ｎＭ）に結合することができるが、βサブユニットには単独で結合することはない。しかし、α及びβサブユット両方が存在すると、高い親和性のリガンド受容体複合体（Ｋｄ＞＞１００ｐＭ）になる。ＧＭ−ＣＳＦシグナル伝達は、ＧＭ−ＣＳＦＲα鎖への初期結合によって生じ、次いでＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路をリン酸化して共通のβ鎖に高い親和性相互作用を生じさせ、より大きなサブユニットとの架橋結合によって生じる。
【００５２】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な任意の抗体を、本発明で使用してもよい。典型的な抗体は、配列番号２８−４６のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３配列のアミノ酸配列を具える抗体を含む。別の典型的な抗体は、配列番号２８−４６のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３配列のアミノ酸配列を具える抗体由来の抗体を含む。さらに別の典型的な抗体は、配列番号２８−４６のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を具える抗体として同じ特異性を有する及び／又は同じエピトープに結合する抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号２８−４６のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有するＨ−ＣＤＲ３配列を具える抗体を含む。
【００５３】
【００５４】
ある特定の態様において、本発明は対象の疼痛の治療方法を提供し、この方法は、対象にＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与するステップを具える。この文脈で使用される「対象」とは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、赤毛猿（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）又はヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）といった霊長類や、マウス又はラットといったげっ歯動物を含む任意の哺乳類をいう。対象は、霊長類が好ましく、最も好ましいのはヒトである。
【００５５】
ある特定の態様において本発明は、疼痛を患う又は疼痛を患う疑いのある対象の細胞の成長及び／又は生存を活性化、増殖、誘導するＧＭ−ＣＳＦの能力に拮抗するＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを具える合成物に関するもので、この合成物は、一又はそれ以上の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤をさらに具えるものである。本発明の抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体は、疼痛におけるＧＭ−ＣＳＦの役割のいずれかに拮抗することができる。
【００５６】
他の態様において本発明は、対象の疼痛の予防方法を提供し、この方法は、対象にＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与することを具えるものである。この文脈で使用される「予防」とは、疾患の発症を防止したり、疾患の発症を遅らせたりすることを目的とする方法をいう。
【００５７】
他の態様において本発明は、疼痛治療に有用なＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを具える合成物に関するもので、この合成物は、一又はそれ以上の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤をさらに具えるものである。
【００５８】
別の態様において本発明は、疼痛治療の薬剤の調合においてＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用に関するものである。
【００５９】
別の態様において本発明は、疼痛治療用のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを提供するものである。
【００６０】
本発明の疼痛治療用の合成物は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニスト及び薬学的に許容な担体、希釈剤、又は添加剤を具える薬学的な合成物であるのが好ましい。この担体、希釈剤、及び添加剤は、その技術分野で知られおり、当業者は、本発明のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを用いて対象を治療するにあたり最も適した処方や投与の手段を見つけられるだろう。
【００６１】
他の態様において本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ−／−遺伝子型を有する遺伝子組み換えされた哺乳類を提供する。特別な態様において、その哺乳類はマウスである。用語「ノックアウト」マウス（又は哺乳類）、ある遺伝子が「破壊された」マウス（又は哺乳類）、及び「−／−遺伝子型」を有するマウス（又は哺乳類）は、本発明では同じ意味で使用され、当該分野で認識されている。動物はそれぞれ、染色体の両対立遺伝子上でそれぞれ遺伝子、ここではＧＭ−ＣＳＦを欠損している。
【実施例１】
【００６２】
［ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスの生成］
ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスの生成は、スタンレーら、（１９９４）、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１」５５９２頁に記載されている。簡単にいうと、分裂したＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を有する１２９／ＯＬＡ由来のＥＳ細胞（Ｈ−２ｂ）をＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）宿主胚盤胞にマイクロインジェクションして、キメラマウスを生成する。変異ＧＭ−ＣＳＦ対立遺伝子の生殖細胞系伝達物質は、１１世代にわたりＣ５７ＢＬ／６マウスと交配され、実験用のＧＭ−ＣＳＦ−／−、ＧＭ−ＣＳＦ＋／−、及びＧＭ−ＣＳＦ＋／＋を生み出すために異種交配されたＧＭ−ＣＳＦ＋／−マウスを与える。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子型の状態は、テールＤＮＡをＰＣＲ分析することにより決定する。動物は、標準的なげっ歯動物用の飼料と水が適宜与えられ、おがくずが並べられたケージの中で同性の同腹子と収容された。オス、メス共に生後８−１５週のマウスが実験の対象とされた。
【実施例２】
【００６３】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは外科的手術後の疼痛の治療において有効である］
疼痛モデルは、外科的手術後に生じる疼痛のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを用いた治療の有効性を評価するために用いられる。
【００６４】
［動物］
体重２２０−２４０グラムのオスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを外科的手術前１週間、動物施設に順応させる。
【００６５】
［外科的手術］
外科的手術は、Ｂｒｅｎｎａｎら、「Ｐａｉｎ６４」、４９３−５０１頁、１９９６年、に記載された手順に従った。動物を、ノーズコーンを通じて外科的手術の間維持した空気混合中の２％のイソフルレンで麻酔した。右後ろ足の足底表面をポビドンヨードパッドを用いて調整し、皮膚と筋膜を貫通するように１ｃｍ中心長さの切開をし、踵の端０．５ｃｍからつま先に向かって広げた。測定は屈曲位に保った足に定規を用いて行った。足底の筋肉を湾曲した鉗子を用いて持ち上げて縦方向に切開した。基点から差し込み部分の間、その深さを貫通するように筋肉を切開した。外科的手術の間、ガーゼパッドを通して圧迫することにより出血をコントロールした。創傷は、２本の縫合糸（５−０エチロンブラックモノフィラメント糸）で閉じた。これらの縫合糸は５−６回結び、最初の結び目は緩く結んだ。創傷部位をバシトラシン溶液で消毒した。行動実験を開始する前に２時間又はそれ以上動物を清潔なケージ内で休ませ、回復させた。
【００６６】
［安静時の疼痛評価］
累積的な疼痛スコアを、体重負荷に関連する疼痛を評価するために使用した。土台を高くした（ｈ：１８”）清潔なプラスチックのケージのプラスチックメッシュ（格子：８ｍｍ２）上に動物を置き、足の底裏面を検診した。２０分の順応時間の後、体重負荷を０から２のスケールで評価した。０スコアは、足が白くなったか、メッシュに押し付けられたときに与え、これは、完全な体重負荷を示している。１スコアは、メッシュに触れているだけの皮膚で足がかばわれており、足が白くなってないか皮膚の圧痕がないときに与えた。２スコアは、足がメッシュから完全に離れて保たれている場合に与えた。ラットがまだ休んでいる場合には躊躇無く足を２とみなした。各動物を数分間にわたり５分おきに１分間観察した。１／２時間に得られた６つのスコアの和（０−１２）を使用して、切開した足の疼痛を評価した。２スコアの頻度も計算し、動物による激痛の発生率又は足の全体的な防御を評価するのに使用した。各動物を外科的手術の２４時間前（ベースライン）、並びに手術２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に検査した。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストで治療された動物は、コントロールの動物と比較して累積の安静時の疼痛が著しく減少したことをこの実験の結果は示している。体重負荷は、動物がどれくらい足を使用する意思があるかにかなり相関するので、疼痛緩和の効果的な測定である。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的であるＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体であるのが好ましい。これらの抗体を、切開１５時間前に様々の濃度の抗体を（例えば、動物の体重キログラムあたり０．００４、０．０１、０．０２、０．１、０．６、及び１ｍｇ）腹腔注入した。陰性対照グループには、抗体を投与せず生理食塩水を腹腔に注入した。外科的手術の２４時間後の検査開始３０分前に０．０１ｍｇ／ｋｇのフェンタニルを、陽性対照として腹腔に注入した。各実験は、各条件について８匹の動物（グループあたりｎ＝８）を含め、コントロールグループは５６匹とした。外科的手術を行い、累積疼痛スコアの測定を上記の通り行った。安静時の疼痛を外科的手術の２４時間後に評価した。
【００６７】
外科的手術後にＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを０．０２ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ用量投与すると、安静時の疼痛が著しく軽減する。
【００６８】
別の実験では、外科的手術後に投与して外科的手術後の疼痛を減らすことにおけるＧＭ−ＣＳＦの有効性を検査した。ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体を、外科的手術の２時間後に静脈注射する。コントロールグループは、抗体を投与されず生理食塩水が腹腔注入される。外科的手術を行って現れる安静時の疼痛を累積的な疼痛スコアとして、外科的手術の２４時間後に評価した。切開の２時間後に抗体を投与すると、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが切開の２４時間後の安静時の疼痛を著しく減少させる。これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦを外科的手術後に投与した場合、外科的手術後の疼痛を効率よく緩和したことを示している。
【００６９】
［温熱性知覚過敏の評価］
温熱性知覚過敏を、下記のハーグリーブスらにより変更された方法（１９８８）である、ラットの足底表面検査（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、イタリア）により評価する。ラットは、ガラス製のテーブルの上にある４つの個々のプレキシガラスの箱から成る装置で順応させられる。モバイル放射熱源は、テーブルの下に配置されており、後ろ足に焦点を当てる。動物が寝てないが動いていないときに、コントロール箱上のボタンを押すと、放射熱源が作動し、動物が熱源から足を引っ込めるに要する時間を自動的に記録する。この足撤退待ち時間（ＰＯＯＬ）は、放射源の反射率の変化によりラットの足の動きを感知する放射熱源に内臓された光検出器によって検出される。足撤退待ち時間（ＰＷＬ）は、数秒で記録される。組織の損傷を防止するため、２２．５秒の自動カットオフポイントを設けている。各動物の両後ろ足のＰＷＬを３−４回計り、その平均を右及び左後ろ足のベースラインとする。結果は右足（外科的手術の部位）と左足において測定されたスコアの比として表示する。約６秒の正常のＰＷＬを与えるために、装置は１度（調査開始時点）調整され、４０の強度に設定される。各動物を外科的手術の２４時間前（ベースライン）、並びに手術の３時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に検査した。温熱性知覚過敏の測定は、接触性アロディニアの測定後に行われる。
【実施例３】
【００７０】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは骨肉腫疼痛の治療において有効である］
ＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体は、又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体は、骨転移に関連する骨肉腫疼痛の治療に有効である。
【００７１】
ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストによる治療の有効性を評価するためネズミの骨肉腫疼痛モデルを使用する。このネズミモデルは、溶骨性肉腫細胞をマウスの大腿骨に随内注入し、次いで腫瘍を骨に閉じ込めるために針の穴を歯科用アマルガムで充填することにより行われる（Ｓｃｈｗｅｉら「Ｊ：Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９」、１０８８６−１０８９７頁、１９９９年及びＬｕｇｅｒら、「Ｐａｉｎ ９９」、３９７−４０６頁、２００２年を参照されたい）。実験は、成体オスＣ３Ｈ／ＨｅＪで行われる。０日目に、ペントバルビタームナトリウム（腹腔内（ｉ．ｐ．）に５０ｍｇ／ｋｇ）による全身麻酔誘導後に関節切開が行われる。肉腫細胞のための経路を作るために、針が延髄管に挿入される。次いで、押圧が空気圧式歯科用高速ハンドピースを用いて行われる。未治験の動物（ｎ＝５）に加え、シャム動物（ｎ＝５）は、最小必須培地（２０μｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を大腿骨の随内スペース（シャム用）に注入することにより生成され、一方で肉腫動物（ｎ＝５、各条件で検査された）に、１０５ ２４７２溶骨肉腫細胞（肉腫細胞又はｓａｒｃ用）を含む媒体（２０μｌ、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）が注入される。すべての動物は、注入部位を細胞又は注入した媒体を髄液管内に閉じ込めるために歯科用アマルガムプラグで密閉し、その後滅菌水（低張液）で洗浄した。最後に創傷クリップにより切開を閉鎖する。クリップは行動実験を妨害しないよう５日目に取り外される。肉腫注入動物の第２グループは、６日目と１３日目にＧＭ−ＣＳＦ特異抗体又はＧＭ−ＣＳＦ受容体特異抗体（例えば１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で治療される。
【００７２】
［行動分析］
動物の腫瘍移植１０日及び１４日後の疼痛関連行動を検査する。以下の検査を用いて動物の行動検査を行う。継続的な疼痛（自発的防御及び収縮）、歩行時の疼痛（足の使用や回転）、及び運動により誘発された疼痛（触診により誘発された防御及び触診により誘発された収縮）。動物は、ワイヤメッシュの床を有する透明なプラスチックの観察箱に配置され、３０分間順応させられる。順応後、オープンフィールドでの通常の歩行時に自発的に防御、自発的な収縮、足の使用、及び歩行を強制された時の防御を評価する。触診により誘発された防御及び収縮は、肉腫及びシャム注入動物の大腿遠位の正常な非有害触診の２分後に測定される。
【００７３】
侵害受容を表す、防御に費やす自発的収縮の回数と時間は、観察期間２分の間で同時に記録される。歩行時の収縮が動物が足を上方に上げる回数を指すのに対し、防御とは、後ろ足を上方に上げる時間を指すものである。正常な足の使用は自発的な歩行時は、５から０のスケールでスコアされる。（５）は正常な足の使用で（０）は、完全に足の使用を欠いている場合である。
【００７４】
歩行を強制されたときの防御は、ロータロッド（Ｃｌｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、オハイオ州）を用いて判定される。回転機械は、回転ロッドを有しており、速度、加速度、及び感度が制御されている。動物は、速度×４、加速度８．０、及び感度２．５のロッドに配置される。歩行を強制されたときの防御は、５から０のスケールで評価される。（５）は正常な使用で、（０）が使用を完全に欠いている場合である。２分間にわたり１秒ごとに動物の大腿遠位を正常に非有害の触診をした後に、動物を観察箱に配置し、触診により誘発される防御及び触診により誘発される収縮をさらに２分間測定する。
【００７５】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストによる治療］
６日目と１３日目に、肉腫注入動物に、抗ＧＭ−ＣＳＦ又は抗ＧＭ−ＣＳＦ受容体抗体（ｎ＝５）のようなＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注入し、又は肉腫及びシャム注入動物に、腹腔内（ｉ．ｐ．）に生理的食塩水を注入した（ｎ＝５、各条件で）。１０日目と１４日目に全ての動物の行動面における分析を行う。
【００７６】
［継続的な疼痛行動の評価］
肉腫注入動物は（生理的食塩水が投与された）は、シャム注入動物（生理的食塩水が投与された）と比較して自発的防御及び自発的により評価すると統計的に著しい持続性疼痛行動を示す。
【００７７】
肉腫移植の１０日と１４日後に肉腫注入マウスにＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与すると、生理的食塩水を投与された肉腫注入マウスと比較して、自発的防御と自発的収縮が著しく減少する。これらの結果はＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが、肉腫注入マウスの持続性疼痛を減少させることを示している。
【００７８】
［歩行時の疼痛行動の評価］
肉腫注入動物（生理的食塩水が投与された）は、シャム注入動物（生理的食塩水が投与された）と比較して、足の使用及び歩行を強制されたときの防御（ロータロッド）により評価すると、歩行時に疼痛行動を示す。肉腫移植の１０日と１４日後に肉腫注入マウスにＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与すると、生理的食塩水を投与された肉腫注入マウスと比較して、足の使用スコアと歩行を強制されたときの防御のスコアが著しく増加する。これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが肉腫注入マウスの歩行時の疼痛を減少させることを示している。
【００７９】
［接触により誘発される疼痛行動の評価］
肉腫注入動物（生理的食塩水が投与された）は、シャム注入動物（生理的食塩水が投与された）と比較して、触診により誘発される防御及び触診により誘発される収縮により評価すると、接触により誘発された疼痛行動を示す。肉腫移植の１０日と１４日後に肉腫注入マウスにＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与すると、生理的食塩水を投与された肉腫注入マウスと比較して、触診により誘発される防御及び触診により誘発される収縮が著しく減少する。これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが肉腫注入マウスの接触により誘発される疼痛を減少させることを示している。
【実施例４】
【００８０】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの鎮痛効果］
完全フロイドアジュバント（ＣＦＡ）により誘発されるラットの慢性関節炎のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの鎮痛効果を基準物質として使用したインドメタシンと比較して、発声検査を用いて研究する。
【００８１】
実験期間の開始時に体重１５０ｇから２２０ｇの５０匹のオスのＬｅｗｉｓラット（ＬＥＷＩＳ ＬＥＷ／Ｃｒｌ Ｉｃｏ）をこの研究に含める。全ての動物を実験の前少なくとも５日間飼育し、研究の間中は濾過した水道水と標準的なペレット状の研究室用の食餌を無制限に摂取できるようにし、一定の温度（１９．５−２４．５℃）、相対湿度（４５〜６５％）で、１２時間の明／暗のサイクルに制御した室内で飼育した。動物を尾で個々に識別した。
【００８２】
０日目（Ｄ０）に、鉱油（１０ｍｇ／ｍｌ）中のウシ型結核死菌の懸濁液０．０５ｍｌを、尾に皮内注射することによりラットにおいて関節炎を誘発した。１４日目（Ｄ１４）に、関節炎のラットを、後足の軽い屈曲の際に声を発する彼らの能力にしたがって、及びそれぞれ後足についての炎症スコアを使用して評価したそれらの関節炎指数にしたがって本研究に含めた（Ｋｕｚｕｎａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）２３：１１８４−１１９１頁、１９７５年、Ｐｅａｒｓｏｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２、４４０−４５９頁、１９５９年、を参照されたい）。
【００８３】
動物を以下の、スコア０：正常な挙動、スコア１：紅斑、スコア２：わずかな浮腫を伴う紅斑、スコア３：硬直は伴わない強い炎症、スコア４：硬直、の基準に基づきスコアした。軽い屈曲の際に声を発することができ、２または３のスコアを示した動物のみを、研究に含めた。
【００８４】
１０匹のラットの４つのグループを本研究に含めた。グループ１（媒体）は、１４日目（Ｄ１４）に選択後、媒体（生理食塩水）をラットに静脈内投与した。１８日目（Ｄ１８）に侵害刺激反応の強さを後足の軽い屈曲によって評価し、発声のレベルの強さを個々の動物について記録した。グループ２（４日）は、１４日目（Ｄ１４）に選択後、ラットにＧＭ−ＣＳＦ特異抗体を静脈内投与した。１８日目（Ｄ１８）に、侵害刺激反応の強さを後足の軽い屈曲によって評価し、発声のレベルの強さを個々の動物について記録した。グループ３（２４時間）については、ＣＦＡの注入後１７日目に、ラットにＧＭ−ＣＳＦ特異抗体又はＧＭ−ＣＳＦ受容体特異抗体を静脈内投与した。２４時間後に、侵害刺激反応の強さを後足の軽い屈曲によって評価し、発声のレベルの強さを個々の動物について記録した。グループ４（インドメタシン）については、１８日目（Ｄ１８）に、インドメタシンの経口投与（１０ｍｇ／ｋｇ）の１時間後に、侵害刺激反応の強さを後足の軽い屈曲によって評価した。発声のレベルの強さもまた個々の動物について記録した。検査物質は５ｍｌ／ｋｇの容量で静脈内経路によってブラインドかつランダム形式で投与したが、インドメタシンは１０ｍｌ／ｋｇの容量を経口経路により投与した。
【００８５】
ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、顕著な鎮痛効果を示す。治療を受けたグループと媒体グループ間の統計的有意性を、一元配置分散分析後に残差分散を用いることにより決定する。ＧＭ−ＣＳＦ特異抗体又はＧＭ−ＣＳＦ受容体特異抗体は、抗体の単回投与の２４時間後又は４日後に、関節リウマチのラットモデルの疼痛を著しく減少させる。
【実施例５】
【００８６】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、変形性関節症の治療に有効である］
この実験では、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが変形性関節症の治療に効果があることを明らかにすべく、ＧＭ−ＣＳＦに特異的なモノクローナル抗体を使用した。
【００８７】
［コラーゲンにより誘発される変形性関節症のマウスモデル］
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに関節不安定性を誘発させるため、０日目と２日目に右膝にコラゲナーゼＶＩＩ型を１ユニット関節内投与した（Ｂｌｏｍら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．１２、６２７−３５頁、２００４年を参照されたい）。
【００８８】
［抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体治療］
２０匹のマウスを不規則に２つのグループに分けた（１０匹／グループ）。
グループ１（ｎ＝１０）：抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（２２Ｅ９）
グループ２（ｎ＝１０）：ＩｇＧ２ａコントロール抗体
【００８９】
マウスを、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（２２Ｅ９）又はＩｇＧ２ａコントロール抗体、２５０μｇ／匹／処置の条件で６週にわたり１週間に３回腹腔内で処置した。処置は変形性関節症が誘発される４日前に開始され（予防）、すなわちマウスは（最初にコラゲナーゼが注入される日の）４日前、２日前、０日に、次いで（実験が終わるまでの６週間）１週間に３回、処置される。２週、４週、及び６週において、マウスは出血した。コントロール抗体と抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体はともに、１０エンドトキシンＵｎｉｔｓ／ｍｌを含有するように精製した。
【００９０】
典型的な抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体として抗体２２Ｅ９を使用した。ＩｇＧ２ａアイソタイプである２２Ｅ９は、ラット抗マウスＧＭ−ＣＳＦ特異抗体である。２２Ｅ９は、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｓｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０２３５０１）から購入できた。代替として、例えばｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１４−７３３１）が供給者として存在している。
【００９１】
［組織構造］
最終注入の６週後に組織構造はマウスの膝関節に形成された。膝関節を回収、固定、脱石灰化し、パラフィン内に包埋し、ミクロトームで７μｍにカットした。スライドをサフラン−Ｏ／ファストグリーン、ヘマトキシン、及びエオシンで染色し、関節病変を明らかにした。研究された病変は、軟骨損傷、滑膜炎、骨棘変形、及び関節変形を伴っていた。
【００９２】
以下のスコアシステムを軟骨病変に用いる。
グレード
０ 正常
１ 無傷だがムラがある
１．５ 粗い表面でムラがある
２ 表面細動
２．５ 軟骨内の細胞減少を伴う表面細動
３ 垂直な亀裂
３．５ 分岐した及び／又は水平な亀裂、タイドマーク、裂け目
４ タイドマークに達していない軟骨欠損
４．５ タイドマークに達した軟骨欠損
５ 骨に達してないが、タイドマークを超えた軟骨欠損
５．５ 骨に達した軟骨欠損
６ 骨の欠損／再形成／変形
ステージ
１ ＜１０％の領域が損傷
２ １０−２５％の領域が損傷
３ ２５−５０％の領域が損傷
４ ５０−７５％の領域が損傷
【００９３】
グレードかけるステージでスコアが算出される。
【００９４】
このスコアシステムは、臨床及び実験的変形性関節症において、変形性関節症を組織学的に評価するのに広く認められている方法に基づいている。Ｐｒｉｔｚｋｅｒら、「Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ １４」１３−２９頁、２００６年を参照されたい。グレードは、軟骨への変形性関節症の深度進行により定義される。ステージは、軟骨病変の水平的な広がり、すなわち軟骨の罹患程度により定義される。変形性関節症の重傷度と範囲の併用評価を示すために、グレードにステージをかけて、スコア、全体のスコアを算出する。マウス１匹につき最大６セクションまでスコアされる。
【００９５】
グレードかけるステージでスコアが算出される。
【００９６】
以下のスコアシステムを滑膜炎に用いる（滑膜層スコアシステム）。
０ 正常な関節と比較して変化なし
１ 滑膜表面の肥厚及び炎症細胞の一部流入
２ 滑膜表面の肥厚及び炎症細胞の中間流入
３ 滑膜表面の重度肥厚及び炎症細胞の最大流入
【００９７】
［疼痛測定］
変形性関節症モデルの疼痛指標は、インキャパシタンスメータ（Ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ Ｍｅｔｅｒ）を用いて測定される体重分配の差異である。この器具は、手術された後ろ足と、反対側のすなわち手術されていない後ろ足の間の体重分配の変化を計測する。マウスは、実験前に３回、装置に順応させられる。各後ろ足が体重をかけた場所を５秒にわたって測定した。マウス１匹につき各時点で３回別個に測定し、次いで平均をとる。測定は、実験の間、１週間に２回行われた。結果は、コラゲナーゼを注入した足／コントロールの足×１００として表示する。
【００９８】
［結果］
組織構造において分析されたすべての領域（中央大腿骨を除く）、すなわち外側大腿骨、外側脛骨、及び中央脛骨では、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体で治療されたマウスの疾患が少ない明確な傾向がある。結果は図１に示されている。
【００９９】
関節炎に関連する疼痛の測定としての体重分配の評価は、ｍＡｂで治療されたコントロールグループと比較して、ｍＡｂで治療された抗ＧＭ−ＣＳＦグループは、２７日以降関節炎の膝からの体重移動を顕著に示した。結果は、図２に示されている。
【０１００】
ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストで治療したマウスは、コントロール抗体で治療されたマウスと比較すると、疾患が少ないことは明らかである。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストで治療したマウスは、コントロール抗体で治療されたマウスと比較すると、疾患の最終局面で疼痛が顕著に少ないことも明らかである。アイソタイプのコントロール抗体で治療したマウスは、ＧＭ−ＣＳＦ特異抗体を投与されたマウスと比較すると、変形性関節症の兆候が顕著に多いことを示している。これは、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが変形性関節症の治療に有効であることを示す。
【実施例６】
【０１０１】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは炎症性疼痛／ｍＢＳＡモデルの治療に有効である］
以下に実験は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが炎症性疼痛の治療にも有効であることを示す。ＧＭ−ＣＳＦノックアウトマウス及びコントロールのマウスにｍＢＳＡ／ＩＬ−１単関節関節炎が誘発された。疼痛は、インドメタシン、疼痛緩和物質の投与にかかわらず、インキャパシタンス検査装置を用いて様々な時点で評価された。
【０１０２】
［マウス］
２４匹のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス及び２４匹のオスのＧＭ−ＣＳＦ−／−マウス（実施例１を参照されたい）が４つの治療グループで用いられる。
グループ１：ＧＭ−ＣＳＦ ＫＯ（ｎ＝１２）：メチル化ＢＳＡ／ＩＬ−１
グループ２：ＧＭ−ＣＳＦ ＫＯ（ｎ＝１２）：メチル化ｍＢＳＡ／ＩＬ−１＋インドメタシン
グループ３：Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ｎ＝１２）：メチル化ＢＳＡ／ＩＬ−１
グループ４：Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ｎ＝１２）：メチル化ＢＳＡ／ＩＬ−１＋インドメタシン
【０１０３】
［単関節痛関節炎の誘発］
単関節痛関節炎は、生理食塩水中のｍＢＳＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ膝関節に、生理食塩水１０μｌを対側の膝関節に関節内注射することにより誘発される。ＩＬ−１β２０μｌ（２５０ｎｇ）を、３日間毎日皮下投与された。一般に、ｍＢＳＡ注入の４日及び７日後に反応が現れ、２８日後に消散する。２、３、４、５、及び７日目にインキャパシタンスの検査をした。
【０１０４】
インドメタシン（Ｓｉｇｍａ）は、非ステロイド系抗炎症性薬物であり、一般に熱、疼痛、こり、及び腫れを軽減させるために用いられる。これは、プラスタグランジンの生成を阻害することことによって作用する。１ｍｇ／ｋｇのインドメタシンを、インキャパシタンスを用いて評価する１時間前にグループ２とグループ４に腹腔内に投与した。
【０１０５】
［疼痛の読み取り］
インキャパシタンステスター（Ｄｕａｌ Ｗｅｉｇｈｔ Ａｖｅｒａｇｅｒ）は、２本の後ろ足における体重分配を測定することで、鎮痛効果を自動的に再現性よく評価するのに使用した。使用者が選択した期間にわたり、各足によってもたらされる力（グラム単位で測定）の平均をとり、動物の片方の足からもう片方の足に体重移動する傾向を提示し、インキャパシタンスの定量的測定を提供する。
【０１０６】
各後ろ足にかけられた体重は、５秒にわたって測定される。マウス１匹につき各時点で３回別個に測定し、次いで平均をとる。結果は、注入された後足／コントロール後足×１００で表す。１００の値は、右足と左足にかけられた体重が等しいことを意味する。１００以下の値は、コントロールの足（右）と比較すると、注入された足（左）に体重がかけられていないことを意味する。
【０１０７】
［結果］
このモデルは、ｍＢＳＡを注入されることにより、膝関節に滑膜炎が誘発される。７日目に膝関節は、視覚的に検査され、０（正常）から３（重度の炎症）のスコアが与えられる（図３を参照）。ｍＢＳＡが注入された左の膝は、右の膝（生理食塩水が注入された）と比較して、著しい炎症を起こした（ｐ＞０．００１ Ｃ５７マウス及びｐ＝０．０２ ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウス）（図３参照）。実際、生理食塩水が注入された任意の右膝は、スコア０だった。インドメタシンで治療したマウスとそれらで治療しない間には、損傷に顕著な違いはみられなかった。
【０１０８】
ｍＢＳＡ／ＩＬ−１単関節痛関節炎が誘発されたとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスと比較して、著しい疼痛（ｍＢＳＡを注入した膝からの体重を移動を計測することにより）を示した（図４参照）。これは４日目以降から顕著になる。
【０１０９】
インドメタシンで治療されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、インドメタシンで治療されないマウスと比較して、ｍＢＳＡ／ＩＬ−１単関節痛関節炎が誘発された後の疼痛が著しく軽いことを示し（図４参照）、この表示は、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスと類似する。ＧＭ−ＣＳＦ−／−は、疼痛を示さないので、インドメタシン治療は効果を有さない。
【０１１０】
有意水準は以下の通りである。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス：インドメタシンで治療されたグループ ｖｓ．治療されないグループ（グループ４ ｖｓ．グループ３）：
４日 ｐ＜０．０００１、５日 ｐ＜０．００１、７日 ｐ＝０．００７
ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウス ｖｓ．Ｃ５７ＢＬ／６マウス（グループ１ ｖｓ．グループ３）：
４日 ｐ＜０．０００１、５日 ｐ＜０．０００１、７日 ｐ＝０．０２２
【０１１１】
これらの結果は、ｍＢＳＡ／ＩＬ−１単関節痛関節炎モデルにおいて、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスは、全く疼痛の兆候を示さないのに対し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは４日目以降に著しい疼痛を示した。したがって、ＧＭ−ＣＳＦのアンタゴニストは、炎症性疼痛の治療に顕著な効果を有することは明らかである。
【実施例７】
【０１１２】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは炎症性疼痛／ＣＦＡモデルの治療に有効である］
以下の実験は、炎症性疼痛の治療において、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの有効性を明らかにする追加の実験である。ここで炎症性疼痛は、完全フロイドアジュバントで誘発されるものである。実施例５のように、疼痛をインドメタシン、疼痛緩和物質の投与にかかわらず、インキャパシタンス検査装置を用いて様々な時点で評価した。
【０１１３】
［マウス］
１２匹のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス及び１２匹のオスのＧＭ−ＣＳＦ−／−マウス（実施例１を参照されたい）がそれぞれ３つの治療グループで使用された。
グループ１：Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ｎ＝１２）：ＣＦＡ
グループ２：Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ｎ＝１２）：ＣＦＡ＋インドメタシン
グループ３：ＧＭ−ＣＳＦ ＫＯ（ｎ＝１２）：ＣＦＡ
【０１１４】
［炎症性疼痛の誘発］
完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）は、１ｍｇ／ｍｌの濃度の鉱油中に、熱滅菌したヒト型結核菌株、Ｈ３７Ｒａを含む。熱滅菌したバクテリアが完全に懸濁液に組み込まれるように、ボルテックスしてＣＦＡを完全に混合した（Ｋａｍａｌａ Ｔ Ｈｏｃｋ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ ｈｕｍａｎｅ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ｆｏｏｔｐａｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２８：２０４−２１４、２００７）。ボルテックス後すぐに、アジュバントは、１９ゲージ針を用いるガラスシリンジに吸い込まれた。気泡をシリンジから丁寧に取り除いてから、針を除去した。各マウスは、ＣＦＡエマルション２０μｌを左後ろ足（足蹠）に皮下注射された。疼痛評価１時間前にグループ２のマウスの腹腔内に、１ｍｇ／ｋｇのインドメタシン（実施例５参照されたい）を投与した。
【０１１５】
［疼痛の読み取り］
実施例５にあるように、インキャパシタンステスター（Ｄｕａｌ Ｗｅｉｇｈｔ Ａｖｅｒａｇｅｒ）を、２本の後ろ足の体重分配を計測することで自動的で再現性のある鎮痛効果の評価をするために使用した。各後ろ足が体重をかけた場所を５秒にわたって測定した。マウス１匹につき各時点で３回別個に測定し、次いで平均をとった。結果は、注入した足／コントロールの足×１００として表示する。１００の値は、右足と左足にかけられた体重が等しいことを意味する。１００以下の値は、コントロールの足（右）と比較すると、注入された足（左）に体重がかけられていないことを意味する。ＣＦＡ注入の２４、４８、７２時間後にインキャパシタンスによる検査をした。
【０１１６】
［結果］
左の足蹠にＣＦＡを皮下注射した後、Ｃ５７ＢＬ／６（グループ１）とＧＭ−ＣＳＦ−／−（グループ３）マウスと同様な大きさの腫れが、左の足蹠に示された。インドメタシンで治療されたＣ５７ＢＬ／６マウス（グループ２）も、腫れの程度に違いはなかった（図５を参照されたい）。いずれのグループも対側（右）の足に腫れは見られなかった。
【０１１７】
疼痛の測定としての体重分配評価は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、徐々に疼痛を示し、ＣＦＡ注入の４８時間（ｐ＝０．０３）及び７２時間（ｐ＝０．０００９）後にＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスより顕著になる（図６参照）。ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスは、全く疼痛を示さなかった。インドメタシンで治療されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、疼痛が緩和され、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスと違いがなかった（図６参照）。ＣＦＡ注入の７２時間後に、インドメタシンで治療されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、インドメタシンで治療されないＣ５７ＢＬ／６マウスより著しく疼痛が少なかった（ｐ＝０．０５）。
【０１１８】
有意水準の概要：
４８時間：
グループ３ｖｓ．グループ１−ｐ＝０．０３
グループ２ｖｓ．グループ１−ｐ＝０．０９
７２時間：
グループ３ｖｓ．グループ１−ｐ＝０．０００９
グループ２ｖｓ．グループ１−ｐ＝０．０５
【０１１９】
ＣＦＡ注入後に起こる足蹠の腫れの範囲は、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスでは、違いがなかった。さらに、インドメタシンで治療されたＣ５７ＢＬ／６マウスに腫れへの影響はなく、これはおそらくインキャパシタンス読み取りの１時間前にみ与えられたからである。腫れの大部分が、最初のインドメタシン注入の２４時間前に既に形成されていた。
【０１２０】
一方、ＣＦＡ注入後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、インドメタシンにより軽減された疼痛が、顕著に示された。その一方で、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスは、疼痛の兆候を全く示さなかった。従って、これらの実験結果は、ＣＦＡ注入の後の全てのマウスの足蹠に炎症が見られたのに、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスには、疼痛の兆候が全く見られなかった。
【実施例８】
【０１２１】
［配列番号１又は２を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体の治療の有効性］
実施例２−７によると、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、配列番号１に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む又は配列番号２に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体が用いられる。マウスとは別の種が用いられてもよく、特にこの実験で用いられる抗体は交差反応性である。この実験で特に好ましい動物種は、ラットである。
【０１２２】
コントロール抗体で治療された動物は、配列番号１に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む又は配列番号２に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体を投与された動物と比較して著しい疼痛の兆候を示した。これは、疼痛の治療の抗体の有効性を明らかにした。
【実施例９】
【０１２３】
［配列番号３又は４を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体の治療の有効性］
実施例２−７を繰り返す。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、配列番号３に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む又は配列番号４に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体が用いられる。マウスとは別の種が用いられてもよく、特にこの実験で用いられる抗体は交差反応性である。この実験で特に好ましい動物種はラットである。
【０１２４】
コントロール抗体で治療された動物、例えばラットは配列番号３に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む又は配列番号４に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体を投与された動物と比較して著しい疼痛の兆候を示した。これは、疼痛の治療の抗体の有効性を明らかにした。
【実施例１０】
【０１２５】
［配列番号５−２０を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体の治療の有効性］
実施例２−７を繰り返す。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、配列番号５−１６のいずれかから選択されるＨ−ＣＤＲ３配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体が使用される。前記抗体はさらに配列番号１６のＨ−ＣＤＲ１配列、及び／又は配列番号１８の配列Ｈ−ＣＤＲ２、及び／又は配列番号１９のＬ−ＣＤＲ１配列、及び／又は配列番号２０のＬ−ＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号２１のＬ−ＣＤＲ３配列を含むのが好ましい。マウスとは別の種が用いられてもよく、特にこの実験で用いられる抗体は、交差反応性である。この実験で特に好ましい動物種は、ラットである。
【０１２６】
本実施例によるとコントロール抗体で治療された動物、例えばラットはＧＭ−ＣＳＦ特異抗体を投与された動物と比較して著しい疼痛の兆候を示した。これは、疼痛の治療の抗体の有効性を明らかにした。
【実施例１１】
【０１２７】
［配列番号２１−２６を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体の治療の有効性］
実施例２−７を繰り返す。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、配列番号２２のＬ−ＣＤＲ１配列、及び／又は配列番号２３のＬ−ＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号２４のＬ−ＣＤＲ３配列、及び／又は配列番号２５のＨ−ＣＤＲ１配列、及び／又は配列番号２６のＨ−ＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号２７のＨ−ＣＤＲ３配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体である。抗体は、配列番号２２−２８のＣＲＤｓを全て含むのが好ましい。マウスとは別の種が用いられてもよく、特にこの実験で用いられる抗体は交差反応性である。この実験で特に好ましい動物種はラットである。
【０１２８】
本実施例によるとコントロール抗体で治療された動物、例えばラットはＧＭ−ＣＳＦ特異抗体を投与された動物と比較して著しい疼痛の兆候を示した。これは、疼痛の治療の抗体の有効性を明らかにした。
【実施例１２】
【０１２９】
［ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体の治療の有効性］
実施例２−７を繰り返す。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、配列番号２８−４６のいずれかに示されるＨ−ＣＤＲ３配列のアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦ受容体特異抗体が使用される。マウスとは別の種が用いられてもよく、特にこの実験で用いられる抗体は、交差反応性である。この実験で特に好ましい動物種は、ラットである。
【０１３０】
動物、例えばラットは、本実施例によるとコントロール抗体で治療された動物は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体特異抗体を投与された動物と比較して著しい疼痛の兆候を示した。これは、疼痛の治療の抗体の有効性を明らかにした。
【０１３１】
当業者は、具体的にここに記載された発明を変形及び変更できることを理解すべきである。本発明は、このような変形及び変更を含む含むものと解釈すべきである。本発明は、個々又は集団で、明細書のステップ、特徴、組成物、並びに化合物、及び前記特徴又は特徴の任意の２又はそれ以上のいかなる組み合わせも含めるものとする。
【０１３２】
［参考文献］
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【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年１２月２２日出願の米国暫定出願第６１／１３９，６８７号及び２００９年３月３０日出願の米国暫定出願第６１／１６４，４９１号の利益を主張し、そこに記載されたその全内容を援用するものである。
【０００２】
本発明は、概して疼痛の治療及び予防法に関するものである。本発明によると、疼痛治療において、ＧＭ−ＣＳＦのアンタゴニストが効果的であることが提案されている。ＧＭ−ＣＳＦのアンタゴニストは、ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体を含むものであるが、これに限定されるものではない。本発明はさらに、特定の疾患モデルにおいてアンタゴニストの検査に有用なＧＭ−ＣＳＦノックアウトマウスなどの遺伝子組み換え動物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
［疼痛］
様々な種類の疼痛が、米国の医師への相談において最も高頻度の理由であり、毎年全アメリカ人の半数が医療的ケアを求めている。それは、内科的疾患において、人間の生活の質及び一般的な機能を著しく妨げる主要な症状である。診断は、持続時間、強度、種類（鈍い、焼けるような又は刺すような）、原因又は体の位置により、色々な方法で疼痛を特徴的付けることに基づいている。一般に疼痛は治療をせずに治まり、又は休息や鎮痛剤服用などの簡単な対策に反応するものであり、それはその後急性疼痛と言われる。しかし、疼痛がもはや症状ではなく、疼痛そのものが病気である慢性疼痛と呼ばれる難治性の進行性の状態になる場合もある。
【０００４】
疼痛は、多くのスキームや状況によって分類される。疼痛には二つの基本タイプ：急性と慢性がある。急性疼痛は短い期間生じ、一時的な疾患に関連する。しかし、これは通常どこか悪いところがあるとの警告である。慢性疼痛は、継続的で再発性のものである。これは慢性的な病気に関連しており、それらの症状の一つである。疼痛の強さは、それを生じさせた刺激の種類だけでなく、疼痛の主観的な知覚によっても左右される。主観的な知覚は幅広いが、以下に基づいて疼痛の種類をいくつかに分類する：
・疼痛を生じさせた刺激
・疼痛の持続時間
・疼痛の特徴（強さ、場所、等）
【０００５】
もう一つの分類システムは、以下の通りである。
・絶え間ない疼痛。一定の強さが連続する。通常運動することによって悪化する。
・ズキズキする疼痛。片頭痛の典型である。脳の血管の拡張と収縮が原因である。
・突き刺すような疼痛。強く激しい疼痛である。機械的刺激が原因である。
・焼けるような疼痛。例えば胸焼けのような、絶えず焼けるような感覚である。
・圧迫されるような疼痛。血管又は筋肉の収縮が原因である。
【０００６】
特殊な種類の疼痛もある。
・筋肉の疼痛。筋肉痛として知られており、筋肉に作用し過度の運動の後や炎症時に生じる。
・疝痛。月経期間の子宮のように特定の器官の筋肉収縮が原因である。
・関連痛。体から受けた情報を脳がどのように解釈するかにより、実際に生じた場所ではない場所で痛みが生じる。
・外科的手術後又は手術後の疼痛。外科的手術後に生じ、外科的措置の損傷によるものである。
・骨肉腫の疼痛。前立腺、乳房、又は他の軟部組織の腫瘍といった特定の種類の癌は、転移性骨疾患として知られる骨の痛みを伴う疾患に進行する場合がある。
【０００７】
［疼痛治療の標準療法］
疼痛治療には、多くの方法がある。疼痛の原因によって治療が変わる。主な治療は以下の通りである。
・アセトアミノフェノン：タイレノール（アセトアミノフェン）は、疼痛を治療するのに用いられている。他のいくつかの疼痛用の薬物とは違い、タイレノールは抗炎症作用がない。しかし、慢性疼痛であって疼痛の部位に炎症がない場合は、しばしばタイレノールは適切な治療の選択となりうる。タイレノールは、適切に使用すれば安全であるが、過度に使用すると危険な場合がある。さらに、タイレノールは、他の特定の薬物と共に使用すると、望ましくない効果をもたらすことがある。
・非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）：ＮＳＡＩＤｓ（イブプロフェン、モトリン、アリーブ等のような）は、急性疼痛又は慢性疼痛の患者が再発した場合に最も有益である。ＮＳＡＩＤｓはまた、腱炎、滑液包炎、及び関節炎などの炎症性疾患の治療にも優れている。胃の疾患の進行を懸念して、一般に、ＮＳＡＩＤは慢性疼痛を患う患者に使用を限定している。セレブレックスなどＣＯＸ−２阻害剤と呼ばれる新商品が、この合併症を回避する目的で作られたが、これらの薬を長期間にわたり使用する際には、依然として注意が必要である。
・コルチコステロイド：ＮＳＡＩＤｓと同様に、コルチコステロイドは、強力な抗炎症薬であり、急性疼痛又は慢性炎症疾患の再発の使用に最適である。コルチコステロイドは、経口投与（メドロール、プレドニゾン等）か、軟部組織又は関節へ注入（コルチゾン注射）が可能である。
・麻薬：麻薬を使用しないと疼痛が制御できない場合に麻薬の使用を考慮すべきである。多くの麻薬は、危険であり中毒になる。麻薬の投与は、急性疼痛に有用であるが、重大な副作用も有している。これらの薬の短時間作用型は、乱用と耐性を生じさせることがある。長時間作用型の選択は副作用が少なく、慢性疼痛を制御するのにより優れている。麻薬は、投与量を徐々に減らさずに長期間使用したり、疼痛以外の理由で薬を摂取した場合に中毒になる場合がある。
・抗けいれん誘発剤：抗けいれん誘発剤は、神経痛を緩和するカテゴリーの薬剤である。これらの薬は、神経や脳に送られる信号の機能を変化させる。神経痛の抗けいれん誘発剤で最も一般的に処方されているのは、Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ（ガバペンチン）と呼ばれるものである。線維筋痛治療専用で近年浮上している別の選択は、リリカ（プレガバリン）と呼ばれるものである。
・局所麻酔薬：局所麻酔薬はある部位の一時的な疼痛を軽減する。慢性疼痛に使用するときに、局所麻酔薬はしばしば局所パッチとして疼痛部位に貼付される。リドダームは、皮膚に貼付し、この部位の感度を低下させるパッチとして販売されている。
【０００８】
上記治療の選択はいずれも、欠点、副作用があり、又は特定の疼痛の種類に使用が制限されている。従って、依然として疼痛治療に対して不十分な医療の強い要求がある。
【０００９】
［ＧＭ−ＣＳＦ］
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、白血球成長因子として機能するサイトカインである。ＧＭ−ＣＳＦは、幹細胞を刺激して顆粒球（好中球、好酸球、及び好塩基球）と単球を生成する。単球は、血液循環を出て、組織に移動するとすぐに成熟してマクロファージになる。これは、少数のマクロファージを活性化し、その数を急速に増加させる自然免疫／炎症カスケードの一部であり、感染症と戦う不可欠な過程である。活性化型ＧＭ−ＣＳＦは、細胞外でホモ二量体として存在する。特に、ＧＭ−ＣＳＦは、炎症性サイトカイン、ケモカイン、及びプロテアーゼを増産させ、それにより最終的に関節破壊をもたらす、リウマチ（ＲＡ）のような自己免疫疾患の炎症性メディエータとして同定される。
【００１０】
ＧＭ−ＣＳＦは、ヒトや動物の体内の様々なプロセスに関与するサイトカインである。近年、炎症性疾患などの特定の疾患や病状がＧＭ−ＣＳＦに関連しており、ＧＭ−ＣＳＦが発明の潜在的なポイントとして示唆されてきた。本発明は初めてＧＭ−ＣＳＦが疼痛治療の有効なターゲットになることを開示した。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦが疼痛治療の有効なターゲットであることを初めて示したものである。この発見は新規なものであり、従来の技術は、疼痛治療に関与するそのようなポイントのいかなる論理的根拠も教示、示唆、又は提供するものではない。本発明は、例えば対象の疼痛治療の方法を提供し、この方法はその対象に効果的な量のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与するステップから成る。
【００１２】
別の態様において本発明は、対象の疼痛予防の方法を企図しており、この方法は、その対象に効果的な量のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与するステップを含む。
【００１３】
別の態様において本発明は、疼痛を患う又は疼痛を患う疑いのある対象の細胞の成長及び／又は生存を活性化、増殖、誘導するＧＭ−ＣＳＦの能力に拮抗するＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを具える合成物に関するもので、この合成物は、一又はそれ以上の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤をさらに具えるものである。
【００１４】
別の態様において本発明は、疼痛治治療に有用なＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを具える合成物に関するもので、この合成物は、一又はそれ以上の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤をさらに具えるものである。
【００１５】
本発明の具体的な態様では、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストはＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体である。
【００１６】
本発明の代替の態様では、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストはＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体である。
【００１７】
他の態様において本発明は、疼痛治療の薬剤の調合においてＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用に関するものである。
【００１８】
他に実施例において本発明は、疼痛治療用のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを提供するものである。
【００１９】
本発明の特定の態様において、疼痛は外科的手術後の疼痛である。本発明の代替の態様においては、疼痛は骨肉腫の疼痛である。さらに本発明の代替の態様では、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは鎮痛効果を有する。
【００２０】
本発明の特定の態様において、疼痛は炎症性疼痛である。
【００２１】
本発明の別の態様において、ＧＭ−ＣＳＦ−／−遺伝子型を有する遺伝子組み換えされた哺乳類を提供する。
【００２２】
本明細書全体を通して、文脈上別の解釈が必要とされない限り、用語「具える」、「有する」、並びに「含む」、及び「具えている」、「有している」、「含んでいる」などのそれら変形は、記載された要素、完全体、要素群、又は複数の完全対を含むものであり、いかなる他の要素、完全対、要素群、又は複数の完全体を排除するものではないと解される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、変形性関節症のマウスモデルにおけるＧＭ−ＣＳＦ抗体を用いた療法的治療の膝関節組織学的スコアを示したものである。Ｌａｔ．は外側を表し、Ｍｅｄ．は中央を表している。結果は、平均値±標準誤差として表す。中央大腿骨を除く全ての部位で、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を投与したマウスは、コントロールのマウスと比較してより低い疾患が観察された。
【図２】図２は、インキャパシタンスメータにおける後ろ足の体重配分評価の実験結果を示す。グラフに示すように、変形性関節症を誘発してから２７日以降のデータは顕著（対応のないｔ−検定）である。
【図３】図３は、炎症疾患（ｍＢＳＡ／ＩＬ１で誘発された単関節関節炎）の治療におけるＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの有効性を証明した実験結果を示す。治療後７日での膝関節の臨床スコアが描かれている。黒塗りの棒は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの記録結果、白抜きの棒は、ＧＭ−ＣＳＦノックアウトマウスの結果を示す。左はインドメタシンで治療したマウスである。右はインドメタシンの治療を受けていないマウスである。
【図４】図４は、炎症性疼痛（ｍＢＳＡ／ＩＬ１で誘発された単関節関節炎）の治療におけるＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの有効性を証明する実験結果を示す。ｍＢＳＡ／ＩＬ−１で誘発された単関節関節炎を患うマウスの疼痛測定として、インキャパシタンスメータで測定した体重配分を示す。結果は、注入された後ろ足／コントロール後ろ足＊１００として表現した。
【図５】図５は、炎症性疼痛の治療におけるＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの有効性を証明する実験結果を示す。左（Ｌ）の足蹠にＣＦＡを注入した後の足の厚さの変化を測定した炎症のレベルを示す。右（Ｒ）の足蹠は標準である。「＋インドメタシン」グループは、それぞれ読み取りの１時間前に、腹腔内をインドメタシン（１ｍｇ／ｋｇ）で治療したものである。Ｎは１２マウス／グループを示す。
【図６】図６は、炎症性疼痛の治療におけるＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの有効性を証明する実験結果を示す。左の足蹠にＣＦＡを注入した後の疼痛の測定としてインキャパシタンスメータで測定した体重配分を示す。「＋インドメタシン」グループは、それぞれ読み取りの１時間前に、腹腔内をインドメタシン（１ｍｇ／ｋｇ）で治療したものである。結果は注入された後足／コントロール後足×１００で表す。Ｎは１２マウス／グループを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦは、疼痛治療の有効なターゲットであることを示している。この点について本発明は、一態様において疼痛分野で予防的又は療法的利益をもたらすＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを用いた方法を提供する。
【００２５】
本発明は、このような治療を必要とする対象に、治療に効果的な量のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与する治療方法を提供する。ここで使用される「治療に効果的な量」又は「効果的な量」は、所望の生物学的反応を導き出すのに必要なＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの量をいう。本発明で治療に効果的な量とは、疼痛の治療及び／又は予防に必要なＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの量をいう。
【００２６】
特定の態様で本発明は、外科的手術後の疼痛の治療方法を提供する。他の態様で本発明は、骨肉腫の疼痛の治療方法を提供する。さらに別の態様で本発明は、鎮痛効果を有するＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを提供する。さらに別の態様で本発明は、関節リウマチ痛の治療方法を提供する。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、関節リウマチに関連する疼痛を阻害又は阻止することができる。別の態様で本発明は、関節リウマチ痛の発生率を減少させる、関節リウマチ痛を改善する、関節リウマチ痛を鎮静させる、関節リウマチ痛を緩和する、及び／又は対象の関節リウマチの発症、進行、又は発展を遅らせる方法を提供し、この方法は、対象にＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを効果的な量投与することを具えている。別の態様で本発明は、個人にＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを効果的な量投与することにより、個人の変形性関節症を予防又は治療する方法を提供する。別の態様で本発明は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを効果的な量投与することを具える個人の関節リウマチに関連する炎症性悪液質（体重減少）の治療方法を提供する。別の態様で本発明は、個人で、変形性関節症痛の発生率を減少させる、変形性関節症痛を改善する、変形性関節症痛を鎮静させる、変形性関節症痛を緩和する、及び／又は変形性関節症痛の発症、進行、発展を遅らせる方法を提供し、この方法は、個人に対してＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを効果的な量投与することを具えている。
【００２７】
疼痛又は一若しくはそれ以上の疼痛（関節リウマチ痛又は変形性関節症痛など）の症状を「緩和」とは、本発明ではＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストで治療した個人又は個人の集団における手術後の疼痛の一又はそれ以上の所望の臨床症状の程度を緩和すること意味する。
【００２８】
特定の態様で本発明は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与した２４時間以内に疼痛が軽減される。別の態様においては、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニスト投与の４日後以内に疼痛が軽減される。
【００２９】
ここで使用される「ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニスト」は、最も広い意味でのＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを含み、ＧＭ−ＣＳＦの活性又は機能を阻害する任意の分子又はＧＭ−ＣＳＦに治療的な効果を発揮するその他の方法も含む。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの用語は、ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗体、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な阻害核酸、又はＧＭ−ＣＳＦに特異的な有機小分子を含むものであるが、これに限定されるものではない。ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的に結合する抗体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な阻害核酸、又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な有機小分子は、用語ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの意味範囲内にある。
【００３０】
阻害核酸は、アンチセンスＤＮＡ、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、外部ガイド配列、低分子干渉ＲＮＡ、及びミクロＲＮＡを含むがこれに限定されるものではない。有用な阻害核酸は、ＧＭ−ＣＳＦをコードするＲＮＡの発現を、コントロールと比較して少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は９５パーセント減少させるものを含む。阻害核酸及びそれらの生成方法は、従来よりよく知られている。低分子干渉ＲＮＡ設計ソフトウエアは市販されている。
【００３１】
ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な有機小分子（ＳＭＯＬｓ）は、天然物スクリーニング又は化学ライブラリのスクニーニングにより同定される。一般にＳＭＯＬｓの分子量は５００ダルトン以下であり、より具体的には１６０ダルトンから４８０ダルトンである。ＳＭＯＬｓの他の一般的な特性は、以下の１つ又はそれ以上を有する。
・分子係数ｌｏｇＰが、−０．４から＋５．６の範囲である。
・モル屈折率が、４０から１３０である。
・原子数が２０から７０である。
【００３２】
検討のためゴーズら、「Ｊ Ｃｏｍｂｉｎ Ｃｈｅｍ：１」、５５−６８頁、１９９９年とリピンスキーら、「Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖ：２３」、３−２５頁、１９９７年を参照されたい。
【００３３】
本発明で使用されるＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体である。そのような抗体は、マウス、ラット、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体などの、任意の種類の抗体であってもよい。ここでは「ヒト」抗体又は機能性ヒト抗体断片を、キメラではなく（例えば「ヒト化」ではない）、かつ非ヒト種由来（全体あるいは一部に拘わらず）ではないものと定義する。ヒト抗体又は機能性抗体断片は、ヒト由来又は合成ヒト抗体でもよい。ここでは「合成ヒト抗体」を、既知のヒト抗体配列の分析に基づきシリコン内で合成された合成配列由来の配列を全体又は一部に有する抗体と定義する。シリコン内でのヒト抗体配列又はその抗体の設計は、例えばヒト抗体又は抗体断片の配列のデータベースを分析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を構築することにより得られる。ヒト抗体又は機能性抗体断片の別の例は、ヒト由来の抗体配列ライブラリ（例えばヒトなど天然ソース由来の抗体に基づくライブラリ）から単離された核酸でコードされたものである。
【００３４】
ここでは「ヒト化抗体」又は機能性ヒト化抗体断片を、（Ｉ）非ヒトソース（例えば異種免疫系を担う遺伝子組み換えマウス）由来のヒト生殖系配列の基づく抗体、（ＩＩ）可変領域は非ヒト由来であり、定常領域はヒト由来であるキメラ、又は（ＩＩＩ）可変領域のＣＤＲｓが非ヒト由来であり、可変領域の一又はそれ以上のフレームワークがヒト由来であり、定常領域（もしあれば）がヒト由来である移植ＣＤＲと定義する。
【００３５】
ここでは用語「キメラ抗体」又は機能性キメラ抗体断片を、一つの種に見られる配列に由来又は対応する定常抗体領域を有する抗体分子及びもう一つの種に由来する可変抗体領域を有する抗体分子と定義する。定常抗体領域は、例えばヒト生殖系又は体細胞のようなヒトに見られる配列に由来又は対応し、可変抗体領域（例えばＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ又はＦＲ領域）は、例えばマウス、ラット、又はハムスターのような非ヒト動物に見られる配列に由来するものが好ましい。
【００３６】
ここで使用される、抗体が抗原に「特異的に結合する」とは、このような抗体が、このような抗原と一又はそれ以上の関連する抗原を区別しうる場合に、特異的な結合は絶対的なものではなく相対的な特性であるため、抗原（ここでは、ＧＭ−ＣＳＦ又は代替としてＧＭ−ＣＳＦ受容体）「に／に対して特異的」又は抗原を「特異的に認識する」ことである。標準抗原は、１又はそれ以上の例えばＩＬ３、ＩＬ５、ＩＬ−４、ＩＬ１３、又はＭ−ＣＳＦなどの標準点として使用される、近い関係の抗原である。最も一般的な形式（及び何も言及されていないときは）は、「特異的な結合」は、例えば下記の方法にしたがって、抗体の対象の抗原と無関係の抗原を識別する能力をいう。このような方法には、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ−、ＲＩＡ−、ＥＣＬ−、ＩＲＭＡ−検定を含むがこれに限定されるものではない。例えば、標準ＥＬＩＳＡ分析が行われる。スコアは、標準発色により行われる（例えば西洋ワサビペルオキシターゼ及び過酸化水素が添加されたテトラメチルベンジンを有した二次抗体）。特定のウェル中での反応は、例えば４５０ｎｍで光学密度により計測される。一般的なバックグランド（＝陰性反応）は０．１ＯＤであり、典型的な陽性反応は１ＯＤである。これは陰性／陽性の違いは１０倍以上であることを示している。一般に特異的な結合を判定するときは、単一の標準抗原を使用せず、粉ミルク、ＢＳＡ、トランスフェリン、又は同様なものなどの約３から５の無関係の抗原を使用する。さらに、「特異的な結合」は、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、又は１又はそれ以上のアミノ酸残基の鍵又はＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体のアミノ酸残基の伸長の異なるドメイン又は領域などターゲット抗原の異なる部分を識別する抗体の能力に関連する。
【００３７】
また、本書において「免疫グロブリン」（Ｉｇ）を、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、又はＩｇＤのクラス（又は任意のそのサブクラス）に属し、従来より知られた抗体及びその機能性断片を全て含むタンパク質と定義する。ここでは抗体／免疫グロブリンの「機能性断片」を、抗原結合領域を保持する抗体／免疫グロブリン（例えばＩｇＧの可変領域）断片と定義する。抗体の「抗原結合領域」は、通常抗体の一又はそれ以上の超可変領域、即ちＣＤＲ−１、−２、及び／又は−３領域に見られるが、可変「フレームワーク」領域はまた、ＣＤＲｓの足場を提供するという抗原結合で重要な役割を果たすことができる。「抗原結合領域」は、少なくとも可変軽（ＶＬ）鎖の４から１０３アミノ酸残基及び可変重（ＶＨ）鎖の５から１０９アミノ酸残基を具えるのが好ましく、ＶＬの３から１０７アミノ酸残基及びＶＨの４から１１１アミノ酸残基を具えるのがさらに好ましく、ＶＬ及びＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸位置１から１０９及びＶＨのアミノ酸位置１から１１３；番号はＷＯ９７／０８３２０に従う）を完全に具えるのが特に好ましい。本発明で使用する免疫グロブリンの好ましいクラスはＩｇＧである。本発明の「機能性断片」はＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖの領域、又は例えば単一の重鎖可変領域又は単一の軽鎖可変領域といった単一の免疫グロブリン可変領域又は単一の領域抗体ポリペプチド具える構成体を含んでいる。Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂは、ＣＨ１とＣＬ領域間に生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小化する又は完全に除去するよう設計されている。
【００３８】
本発明の抗体は、シリコン内で設計されたアミノ酸配列に基づいて合成的に作られた核酸でコードされた組み換え体抗体ライブラリ由来のものであってもよい。シリコン内での抗体の設計は、例えばヒト抗体のデータベースを分析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を構築することにより得ることができる。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２９６」、５７頁、２０００年、Ｋｒｅｂｓら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５４」、６７頁、２００１年、Ｒｏｔｈｅら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７６」、１１８２頁、２００８年、及び参照によりその全体が組み込まれる２０００年にＫｎａｐｐｉｋらに発行された米国特許第６，３００，０６４号にシリコン内で作製された配列の設計及び取得方法が開示されている。
【００３９】
ＧＭ−ＣＳＦに特異的な任意の抗体を本発明で使用してもよい。典型的な抗体が、その全内容を援用するＵＳ１１／９１４，５９９に開示されている。別の典型的な抗体は、配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体由来の抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体として同じ特異性を有する及び／又は同じエピトープに結合する抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号１に示す配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％相同である重鎖可変領域を具える抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号２に示す配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有する重鎖可変領域を具える抗体を含む。
【００４０】
【００４１】
【００４２】
本発明で用いることができる代替の典型的な抗体は、配列番号３に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は配列番号４に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体である。別の典型的な抗体は、配列番号３に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は配列番号４に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体由来の抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号３に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列又は配列番号４に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列を具える抗体として同じ特異性を有する及び／又は同じエピトープに結合する抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号３に示す配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有する重鎖可変領域を具える抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号４に示される配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有する重鎖可変領域を具える抗体を含む。
【００４３】
【００４４】
本発明で用いることができる代替の例示的な抗体は、以下から選択されたＨ−ＣＤＲ３配列を具える抗体である。
【００４５】
【００４６】
配列番号５−１６のいずれか一つから選択されたＨ−ＣＤＲ３配列を具える抗体が、さらに以下のＨ−ＣＤＲ１配列を具えるのが好ましい。
【００４７】
【００４８】
本発明で用いることができる代替の例示的な抗体は、以下のＬ−ＣＤＲ１配列を具える。
【００４９】
【００５０】
前記抗体が、配列番号２２−２７のＣＲＤｓの全てを具えるのが好ましい。
【００５１】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体は、エリスロポエチン受容体スーパーファミリーの要素である。それは、アルファ及びベータサブユットから成るヘテロ二量体性である。ベータサブユニットがＩＬ３とＩＬ５を含むサイトカイン受容体と共有されるのに対し、アルファサブユニットはＧＭ−ＣＳＦに高い特異性を有する。これは、ベータ受容体サブユニットのより広範な組織分布で反映される。アルファサブユットであるＧＭ−ＣＳＦＲαは、好中球、マクロファージ、好酸球、樹枝状細胞、内皮細胞、及び呼吸上皮細胞といった骨髄性細胞及び非造血細胞に最初に発現する。ＧＭ−ＣＳＦＲαの全長は、Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーに属する４００アミノ酸のＩ型膜糖タンパク質であり、２２アミノ酸のシグナルペプチド（位置１−２２）、２９８アミノ酸の細胞外領域（位置２３−３２０）、位置３２１−３４５の膜貫通領域、及び短い５５アミノ酸の細胞内領域から成る。シグナルペプチドは、３７８アミノ酸のタンパク質としてＧＭ−ＣＳＦαの成熟形を提供するために切断される。ヒト及びネズミのＧＭ−ＣＳＦＲαのｃＤＮＡクローンは市販されており、タンパク質レベルで受容体サブユニットは３６％の同一性を有する。ＧＭ−ＣＳＦは、単独で相対的に低い親和性のαサブユニット（Ｋｄ１−５ｎＭ）に結合することができるが、βサブユニットには単独で結合することはない。しかし、α及びβサブユット両方が存在すると、高い親和性のリガンド受容体複合体（Ｋｄ＞＞１００ｐＭ）になる。ＧＭ−ＣＳＦシグナル伝達は、ＧＭ−ＣＳＦＲα鎖への初期結合によって生じ、次いでＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路をリン酸化して共通のβ鎖に高い親和性相互作用を生じさせ、より大きなサブユニットとの架橋結合によって生じる。
【００５２】
ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な任意の抗体を、本発明で使用してもよい。典型的な抗体は、配列番号２８−４６のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３配列のアミノ酸配列を具える抗体を含む。別の典型的な抗体は、配列番号２８−４６のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３配列のアミノ酸配列を具える抗体由来の抗体を含む。さらに別の典型的な抗体は、配列番号２８−４６のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を具える抗体として同じ特異性を有する及び／又は同じエピトープに結合する抗体を含む。さらに典型的な抗体は、配列番号２８−４６のいずれかに示すＨ−ＣＤＲ３配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有するＨ−ＣＤＲ３配列を具える抗体を含む。
【００５３】
【００５４】
ある特定の態様において、本発明は対象の疼痛の治療方法を提供し、この方法は、対象にＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与するステップを具える。この文脈で使用される「対象」とは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、赤毛猿（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）又はヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）といった霊長類や、マウス又はラットといったげっ歯動物を含む任意の哺乳類をいう。対象は、霊長類が好ましく、最も好ましいのはヒトである。
【００５５】
ある特定の態様において本発明は、疼痛を患う又は疼痛を患う疑いのある対象の細胞の成長及び／又は生存を活性化、増殖、誘導するＧＭ−ＣＳＦの能力に拮抗するＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを具える合成物に関するもので、この合成物は、一又はそれ以上の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤をさらに具えるものである。本発明の抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体は、疼痛におけるＧＭ−ＣＳＦの役割のいずれかに拮抗することができる。
【００５６】
他の態様において本発明は、対象の疼痛の予防方法を提供し、この方法は、対象にＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与することを具えるものである。この文脈で使用される「予防」とは、疾患の発症を防止したり、疾患の発症を遅らせたりすることを目的とする方法をいう。
【００５７】
他の態様において本発明は、疼痛治療に有用なＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを具える合成物に関するもので、この合成物は、一又はそれ以上の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤をさらに具えるものである。
【００５８】
別の態様において本発明は、疼痛治療の薬剤の調合においてＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用に関するものである。
【００５９】
別の態様において本発明は、疼痛治療用のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを提供するものである。
【００６０】
本発明の疼痛治療用の合成物は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニスト及び薬学的に許容な担体、希釈剤、又は添加剤を具える薬学的な合成物であるのが好ましい。この担体、希釈剤、及び添加剤は、その技術分野で知られおり、当業者は、本発明のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを用いて対象を治療するにあたり最も適した処方や投与の手段を見つけられるだろう。
【００６１】
他の態様において本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ−／−遺伝子型を有する遺伝子組み換えされた哺乳類を提供する。特別な態様において、その哺乳類はマウスである。用語「ノックアウト」マウス（又は哺乳類）、ある遺伝子が「破壊された」マウス（又は哺乳類）、及び「−／−遺伝子型」を有するマウス（又は哺乳類）は、本発明では同じ意味で使用され、当該分野で認識されている。動物はそれぞれ、染色体の両対立遺伝子上でそれぞれ遺伝子、ここではＧＭ−ＣＳＦを欠損している。
【実施例１】
【００６２】
［ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスの生成］
ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスの生成は、スタンレーら、（１９９４）、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１」５５９２頁に記載されている。簡単にいうと、分裂したＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を有する１２９／ＯＬＡ由来のＥＳ細胞（Ｈ−２ｂ）をＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）宿主胚盤胞にマイクロインジェクションして、キメラマウスを生成する。変異ＧＭ−ＣＳＦ対立遺伝子の生殖細胞系伝達物質は、１１世代にわたりＣ５７ＢＬ／６マウスと交配され、実験用のＧＭ−ＣＳＦ−／−、ＧＭ−ＣＳＦ＋／−、及びＧＭ−ＣＳＦ＋／＋を生み出すために異種交配されたＧＭ−ＣＳＦ＋／−マウスを与える。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子型の状態は、テールＤＮＡをＰＣＲ分析することにより決定する。動物は、標準的なげっ歯動物用の飼料と水が適宜与えられ、おがくずが並べられたケージの中で同性の同腹子と収容された。オス、メス共に生後８−１５週のマウスが実験の対象とされた。
【実施例２】
【００６３】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは外科的手術後の疼痛の治療において有効である］
疼痛モデルは、外科的手術後に生じる疼痛のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを用いた治療の有効性を評価するために用いられる。
【００６４】
［動物］
体重２２０−２４０グラムのオスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを外科的手術前１週間、動物施設に順応させる。
【００６５】
［外科的手術］
外科的手術は、Ｂｒｅｎｎａｎら、「Ｐａｉｎ６４」、４９３−５０１頁、１９９６年、に記載された手順に従った。動物を、ノーズコーンを通じて外科的手術の間維持した空気混合中の２％のイソフルレンで麻酔した。右後ろ足の足底表面をポビドンヨードパッドを用いて調整し、皮膚と筋膜を貫通するように１ｃｍ中心長さの切開をし、踵の端０．５ｃｍからつま先に向かって広げた。測定は屈曲位に保った足に定規を用いて行った。足底の筋肉を湾曲した鉗子を用いて持ち上げて縦方向に切開した。基点から差し込み部分の間、その深さを貫通するように筋肉を切開した。外科的手術の間、ガーゼパッドを通して圧迫することにより出血をコントロールした。創傷は、２本の縫合糸（５−０エチロンブラックモノフィラメント糸）で閉じた。これらの縫合糸は５−６回結び、最初の結び目は緩く結んだ。創傷部位をバシトラシン溶液で消毒した。行動実験を開始する前に２時間又はそれ以上動物を清潔なケージ内で休ませ、回復させた。
【００６６】
［安静時の疼痛評価］
累積的な疼痛スコアを、体重負荷に関連する疼痛を評価するために使用した。土台を高くした（ｈ：１８”）清潔なプラスチックのケージのプラスチックメッシュ（格子：８ｍｍ２）上に動物を置き、足の底裏面を検診した。２０分の順応時間の後、体重負荷を０から２のスケールで評価した。０スコアは、足が白くなったか、メッシュに押し付けられたときに与え、これは、完全な体重負荷を示している。１スコアは、メッシュに触れているだけの皮膚で足がかばわれており、足が白くなってないか皮膚の圧痕がないときに与えた。２スコアは、足がメッシュから完全に離れて保たれている場合に与えた。ラットがまだ休んでいる場合には躊躇無く足を２とみなした。各動物を数分間にわたり５分おきに１分間観察した。１／２時間に得られた６つのスコアの和（０−１２）を使用して、切開した足の疼痛を評価した。２スコアの頻度も計算し、動物による激痛の発生率又は足の全体的な防御を評価するのに使用した。各動物を外科的手術の２４時間前（ベースライン）、並びに手術２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に検査した。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストで治療された動物は、コントロールの動物と比較して累積の安静時の疼痛が著しく減少したことをこの実験の結果は示している。体重負荷は、動物がどれくらい足を使用する意思があるかにかなり相関するので、疼痛緩和の効果的な測定である。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的であるＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体であるのが好ましい。これらの抗体を、切開１５時間前に様々の濃度の抗体を（例えば、動物の体重キログラムあたり０．００４、０．０１、０．０２、０．１、０．６、及び１ｍｇ）腹腔注入した。陰性対照グループには、抗体を投与せず生理食塩水を腹腔に注入した。外科的手術の２４時間後の検査開始３０分前に０．０１ｍｇ／ｋｇのフェンタニルを、陽性対照として腹腔に注入した。各実験は、各条件について８匹の動物（グループあたりｎ＝８）を含め、コントロールグループは５６匹とした。外科的手術を行い、累積疼痛スコアの測定を上記の通り行った。安静時の疼痛を外科的手術の２４時間後に評価した。
【００６７】
外科的手術後にＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを０．０２ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ用量投与すると、安静時の疼痛が著しく軽減する。
【００６８】
別の実験では、外科的手術後に投与して外科的手術後の疼痛を減らすことにおけるＧＭ−ＣＳＦの有効性を検査した。ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体を、外科的手術の２時間後に静脈注射する。コントロールグループは、抗体を投与されず生理食塩水が腹腔注入される。外科的手術を行って現れる安静時の疼痛を累積的な疼痛スコアとして、外科的手術の２４時間後に評価した。切開の２時間後に抗体を投与すると、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが切開の２４時間後の安静時の疼痛を著しく減少させる。これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦを外科的手術後に投与した場合、外科的手術後の疼痛を効率よく緩和したことを示している。
【００６９】
［温熱性知覚過敏の評価］
温熱性知覚過敏を、下記のハーグリーブスらにより変更された方法（１９８８）である、ラットの足底表面検査（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、イタリア）により評価する。ラットは、ガラス製のテーブルの上にある４つの個々のプレキシガラスの箱から成る装置で順応させられる。モバイル放射熱源は、テーブルの下に配置されており、後ろ足に焦点を当てる。動物が寝てないが動いていないときに、コントロール箱上のボタンを押すと、放射熱源が作動し、動物が熱源から足を引っ込めるに要する時間を自動的に記録する。この足撤退待ち時間（ＰＯＯＬ）は、放射源の反射率の変化によりラットの足の動きを感知する放射熱源に内臓された光検出器によって検出される。足撤退待ち時間（ＰＷＬ）は、数秒で記録される。組織の損傷を防止するため、２２．５秒の自動カットオフポイントを設けている。各動物の両後ろ足のＰＷＬを３−４回計り、その平均を右及び左後ろ足のベースラインとする。結果は右足（外科的手術の部位）と左足において測定されたスコアの比として表示する。約６秒の正常のＰＷＬを与えるために、装置は１度（調査開始時点）調整され、４０の強度に設定される。各動物を外科的手術の２４時間前（ベースライン）、並びに手術の３時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後に検査した。温熱性知覚過敏の測定は、接触性アロディニアの測定後に行われる。
【実施例３】
【００７０】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは骨肉腫疼痛の治療において有効である］
ＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体は、又はＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体は、骨転移に関連する骨肉腫疼痛の治療に有効である。
【００７１】
ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストによる治療の有効性を評価するためネズミの骨肉腫疼痛モデルを使用する。このネズミモデルは、溶骨性肉腫細胞をマウスの大腿骨に随内注入し、次いで腫瘍を骨に閉じ込めるために針の穴を歯科用アマルガムで充填することにより行われる（Ｓｃｈｗｅｉら「Ｊ：Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９」、１０８８６−１０８９７頁、１９９９年及びＬｕｇｅｒら、「Ｐａｉｎ ９９」、３９７−４０６頁、２００２年を参照されたい）。実験は、成体オスＣ３Ｈ／ＨｅＪで行われる。０日目に、ペントバルビタームナトリウム（腹腔内（ｉ．ｐ．）に５０ｍｇ／ｋｇ）による全身麻酔誘導後に関節切開が行われる。肉腫細胞のための経路を作るために、針が延髄管に挿入される。次いで、押圧が空気圧式歯科用高速ハンドピースを用いて行われる。未治験の動物（ｎ＝５）に加え、シャム動物（ｎ＝５）は、最小必須培地（２０μｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を大腿骨の随内スペース（シャム用）に注入することにより生成され、一方で肉腫動物（ｎ＝５、各条件で検査された）に、１０５ ２４７２溶骨肉腫細胞（肉腫細胞又はｓａｒｃ用）を含む媒体（２０μｌ、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）が注入される。すべての動物は、注入部位を細胞又は注入した媒体を髄液管内に閉じ込めるために歯科用アマルガムプラグで密閉し、その後滅菌水（低張液）で洗浄した。最後に創傷クリップにより切開を閉鎖する。クリップは行動実験を妨害しないよう５日目に取り外される。肉腫注入動物の第２グループは、６日目と１３日目にＧＭ−ＣＳＦ特異抗体又はＧＭ−ＣＳＦ受容体特異抗体（例えば１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で治療される。
【００７２】
［行動分析］
動物の腫瘍移植１０日及び１４日後の疼痛関連行動を検査する。以下の検査を用いて動物の行動検査を行う。継続的な疼痛（自発的防御及び収縮）、歩行時の疼痛（足の使用や回転）、及び運動により誘発された疼痛（触診により誘発された防御及び触診により誘発された収縮）。動物は、ワイヤメッシュの床を有する透明なプラスチックの観察箱に配置され、３０分間順応させられる。順応後、オープンフィールドでの通常の歩行時に自発的に防御、自発的な収縮、足の使用、及び歩行を強制された時の防御を評価する。触診により誘発された防御及び収縮は、肉腫及びシャム注入動物の大腿遠位の正常な非有害触診の２分後に測定される。
【００７３】
侵害受容を表す、防御に費やす自発的収縮の回数と時間は、観察期間２分の間で同時に記録される。歩行時の収縮が動物が足を上方に上げる回数を指すのに対し、防御とは、後ろ足を上方に上げる時間を指すものである。正常な足の使用は自発的な歩行時は、５から０のスケールでスコアされる。（５）は正常な足の使用で（０）は、完全に足の使用を欠いている場合である。
【００７４】
歩行を強制されたときの防御は、ロータロッド（Ｃｌｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、オハイオ州）を用いて判定される。回転機械は、回転ロッドを有しており、速度、加速度、及び感度が制御されている。動物は、速度×４、加速度８．０、及び感度２．５のロッドに配置される。歩行を強制されたときの防御は、５から０のスケールで評価される。（５）は正常な使用で、（０）が使用を完全に欠いている場合である。２分間にわたり１秒ごとに動物の大腿遠位を正常に非有害の触診をした後に、動物を観察箱に配置し、触診により誘発される防御及び触診により誘発される収縮をさらに２分間測定する。
【００７５】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストによる治療］
６日目と１３日目に、肉腫注入動物に、抗ＧＭ−ＣＳＦ又は抗ＧＭ−ＣＳＦ受容体抗体（ｎ＝５）のようなＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注入し、又は肉腫及びシャム注入動物に、腹腔内（ｉ．ｐ．）に生理的食塩水を注入した（ｎ＝５、各条件で）。１０日目と１４日目に全ての動物の行動面における分析を行う。
【００７６】
［継続的な疼痛行動の評価］
肉腫注入動物は（生理的食塩水が投与された）は、シャム注入動物（生理的食塩水が投与された）と比較して自発的防御及び自発的により評価すると統計的に著しい持続性疼痛行動を示す。
【００７７】
肉腫移植の１０日と１４日後に肉腫注入マウスにＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与すると、生理的食塩水を投与された肉腫注入マウスと比較して、自発的防御と自発的収縮が著しく減少する。これらの結果はＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが、肉腫注入マウスの持続性疼痛を減少させることを示している。
【００７８】
［歩行時の疼痛行動の評価］
肉腫注入動物（生理的食塩水が投与された）は、シャム注入動物（生理的食塩水が投与された）と比較して、足の使用及び歩行を強制されたときの防御（ロータロッド）により評価すると、歩行時に疼痛行動を示す。肉腫移植の１０日と１４日後に肉腫注入マウスにＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与すると、生理的食塩水を投与された肉腫注入マウスと比較して、足の使用スコアと歩行を強制されたときの防御のスコアが著しく増加する。これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが肉腫注入マウスの歩行時の疼痛を減少させることを示している。
【００７９】
［接触により誘発される疼痛行動の評価］
肉腫注入動物（生理的食塩水が投与された）は、シャム注入動物（生理的食塩水が投与された）と比較して、触診により誘発される防御及び触診により誘発される収縮により評価すると、接触により誘発された疼痛行動を示す。肉腫移植の１０日と１４日後に肉腫注入マウスにＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与すると、生理的食塩水を投与された肉腫注入マウスと比較して、触診により誘発される防御及び触診により誘発される収縮が著しく減少する。これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが肉腫注入マウスの接触により誘発される疼痛を減少させることを示している。
【実施例４】
【００８０】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの鎮痛効果］
完全フロイドアジュバント（ＣＦＡ）により誘発されるラットの慢性関節炎のＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの鎮痛効果を基準物質として使用したインドメタシンと比較して、発声検査を用いて研究する。
【００８１】
実験期間の開始時に体重１５０ｇから２２０ｇの５０匹のオスのＬｅｗｉｓラット（ＬＥＷＩＳ ＬＥＷ／Ｃｒｌ Ｉｃｏ）をこの研究に含める。全ての動物を実験の前少なくとも５日間飼育し、研究の間中は濾過した水道水と標準的なペレット状の研究室用の食餌を無制限に摂取できるようにし、一定の温度（１９．５−２４．５℃）、相対湿度（４５〜６５％）で、１２時間の明／暗のサイクルに制御した室内で飼育した。動物を尾で個々に識別した。
【００８２】
０日目（Ｄ０）に、鉱油（１０ｍｇ／ｍｌ）中のウシ型結核死菌の懸濁液０．０５ｍｌを、尾に皮内注射することによりラットにおいて関節炎を誘発した。１４日目（Ｄ１４）に、関節炎のラットを、後足の軽い屈曲の際に声を発する彼らの能力にしたがって、及びそれぞれ後足についての炎症スコアを使用して評価したそれらの関節炎指数にしたがって本研究に含めた（Ｋｕｚｕｎａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）２３：１１８４−１１９１頁、１９７５年、Ｐｅａｒｓｏｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２、４４０−４５９頁、１９５９年、を参照されたい）。
【００８３】
動物を以下の、スコア０：正常な挙動、スコア１：紅斑、スコア２：わずかな浮腫を伴う紅斑、スコア３：硬直は伴わない強い炎症、スコア４：硬直、の基準に基づきスコアした。軽い屈曲の際に声を発することができ、２または３のスコアを示した動物のみを、研究に含めた。
【００８４】
１０匹のラットの４つのグループを本研究に含めた。グループ１（媒体）は、１４日目（Ｄ１４）に選択後、媒体（生理食塩水）をラットに静脈内投与した。１８日目（Ｄ１８）に侵害刺激反応の強さを後足の軽い屈曲によって評価し、発声のレベルの強さを個々の動物について記録した。グループ２（４日）は、１４日目（Ｄ１４）に選択後、ラットにＧＭ−ＣＳＦ特異抗体を静脈内投与した。１８日目（Ｄ１８）に、侵害刺激反応の強さを後足の軽い屈曲によって評価し、発声のレベルの強さを個々の動物について記録した。グループ３（２４時間）については、ＣＦＡの注入後１７日目に、ラットにＧＭ−ＣＳＦ特異抗体又はＧＭ−ＣＳＦ受容体特異抗体を静脈内投与した。２４時間後に、侵害刺激反応の強さを後足の軽い屈曲によって評価し、発声のレベルの強さを個々の動物について記録した。グループ４（インドメタシン）については、１８日目（Ｄ１８）に、インドメタシンの経口投与（１０ｍｇ／ｋｇ）の１時間後に、侵害刺激反応の強さを後足の軽い屈曲によって評価した。発声のレベルの強さもまた個々の動物について記録した。検査物質は５ｍｌ／ｋｇの容量で静脈内経路によってブラインドかつランダム形式で投与したが、インドメタシンは１０ｍｌ／ｋｇの容量を経口経路により投与した。
【００８５】
ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、顕著な鎮痛効果を示す。治療を受けたグループと媒体グループ間の統計的有意性を、一元配置分散分析後に残差分散を用いることにより決定する。ＧＭ−ＣＳＦ特異抗体又はＧＭ−ＣＳＦ受容体特異抗体は、抗体の単回投与の２４時間後又は４日後に、関節リウマチのラットモデルの疼痛を著しく減少させる。
【実施例５】
【００８６】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、変形性関節症の治療に有効である］
この実験では、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが変形性関節症の治療に効果があることを明らかにすべく、ＧＭ−ＣＳＦに特異的なモノクローナル抗体を使用した。
【００８７】
［コラーゲンにより誘発される変形性関節症のマウスモデル］
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに関節不安定性を誘発させるため、０日目と２日目に右膝にコラゲナーゼＶＩＩ型を１ユニット関節内投与した（Ｂｌｏｍら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．１２、６２７−３５頁、２００４年を参照されたい）。
【００８８】
［抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体治療］
２０匹のマウスを不規則に２つのグループに分けた（１０匹／グループ）。
グループ１（ｎ＝１０）：抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（２２Ｅ９）
グループ２（ｎ＝１０）：ＩｇＧ２ａコントロール抗体
【００８９】
マウスを、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（２２Ｅ９）又はＩｇＧ２ａコントロール抗体、２５０μｇ／匹／処置の条件で６週にわたり１週間に３回腹腔内で処置した。処置は変形性関節症が誘発される４日前に開始され（予防）、すなわちマウスは（最初にコラゲナーゼが注入される日の）４日前、２日前、０日に、次いで（実験が終わるまでの６週間）１週間に３回、処置される。２週、４週、及び６週において、マウスは出血した。コントロール抗体と抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体はともに、１０エンドトキシンＵｎｉｔｓ／ｍｌを含有するように精製した。
【００９０】
典型的な抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体として抗体２２Ｅ９を使用した。ＩｇＧ２ａアイソタイプである２２Ｅ９は、ラット抗マウスＧＭ−ＣＳＦ特異抗体である。２２Ｅ９は、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｓｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０２３５０１）から購入できた。代替として、例えばｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１４−７３３１）が供給者として存在している。
【００９１】
［組織構造］
最終注入の６週後に組織構造はマウスの膝関節に形成された。膝関節を回収、固定、脱石灰化し、パラフィン内に包埋し、ミクロトームで７μｍにカットした。スライドをサフラン−Ｏ／ファストグリーン、ヘマトキシン、及びエオシンで染色し、関節病変を明らかにした。研究された病変は、軟骨損傷、滑膜炎、骨棘変形、及び関節変形を伴っていた。
【００９２】
以下のスコアシステムを軟骨病変に用いる。
グレード
０ 正常
１ 無傷だがムラがある
１．５ 粗い表面でムラがある
２ 表面細動
２．５ 軟骨内の細胞減少を伴う表面細動
３ 垂直な亀裂
３．５ 分岐した及び／又は水平な亀裂、タイドマーク、裂け目
４ タイドマークに達していない軟骨欠損
４．５ タイドマークに達した軟骨欠損
５ 骨に達してないが、タイドマークを超えた軟骨欠損
５．５ 骨に達した軟骨欠損
６ 骨の欠損／再形成／変形
ステージ
１ ＜１０％の領域が損傷
２ １０−２５％の領域が損傷
３ ２５−５０％の領域が損傷
４ ５０−７５％の領域が損傷
【００９３】
グレードかけるステージでスコアが算出される。
【００９４】
このスコアシステムは、臨床及び実験的変形性関節症において、変形性関節症を組織学的に評価するのに広く認められている方法に基づいている。Ｐｒｉｔｚｋｅｒら、「Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ １４」１３−２９頁、２００６年を参照されたい。グレードは、軟骨への変形性関節症の深度進行により定義される。ステージは、軟骨病変の水平的な広がり、すなわち軟骨の罹患程度により定義される。変形性関節症の重傷度と範囲の併用評価を示すために、グレードにステージをかけて、スコア、全体のスコアを算出する。マウス１匹につき最大６セクションまでスコアされる。
【００９５】
グレードかけるステージでスコアが算出される。
【００９６】
以下のスコアシステムを滑膜炎に用いる（滑膜層スコアシステム）。
０ 正常な関節と比較して変化なし
１ 滑膜表面の肥厚及び炎症細胞の一部流入
２ 滑膜表面の肥厚及び炎症細胞の中間流入
３ 滑膜表面の重度肥厚及び炎症細胞の最大流入
【００９７】
［疼痛測定］
変形性関節症モデルの疼痛指標は、インキャパシタンスメータ（Ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ Ｍｅｔｅｒ）を用いて測定される体重分配の差異である。この器具は、手術された後ろ足と、反対側のすなわち手術されていない後ろ足の間の体重分配の変化を計測する。マウスは、実験前に３回、装置に順応させられる。各後ろ足が体重をかけた場所を５秒にわたって測定した。マウス１匹につき各時点で３回別個に測定し、次いで平均をとる。測定は、実験の間、１週間に２回行われた。結果は、コラゲナーゼを注入した足／コントロールの足×１００として表示する。
【００９８】
［結果］
組織構造において分析されたすべての領域（中央大腿骨を除く）、すなわち外側大腿骨、外側脛骨、及び中央脛骨では、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体で治療されたマウスの疾患が少ない明確な傾向がある。結果は図１に示されている。
【００９９】
関節炎に関連する疼痛の測定としての体重分配の評価は、ｍＡｂで治療されたコントロールグループと比較して、ｍＡｂで治療された抗ＧＭ−ＣＳＦグループは、２７日以降関節炎の膝からの体重移動を顕著に示した。結果は、図２に示されている。
【０１００】
ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストで治療したマウスは、コントロール抗体で治療されたマウスと比較すると、疾患が少ないことは明らかである。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストで治療したマウスは、コントロール抗体で治療されたマウスと比較すると、疾患の最終局面で疼痛が顕著に少ないことも明らかである。アイソタイプのコントロール抗体で治療したマウスは、ＧＭ−ＣＳＦ特異抗体を投与されたマウスと比較すると、変形性関節症の兆候が顕著に多いことを示している。これは、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが変形性関節症の治療に有効であることを示す。
【実施例６】
【０１０１】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは炎症性疼痛／ｍＢＳＡモデルの治療に有効である］
以下に実験は、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが炎症性疼痛の治療にも有効であることを示す。ＧＭ−ＣＳＦノックアウトマウス及びコントロールのマウスにｍＢＳＡ／ＩＬ−１単関節関節炎が誘発された。疼痛は、インドメタシン、疼痛緩和物質の投与にかかわらず、インキャパシタンス検査装置を用いて様々な時点で評価された。
【０１０２】
［マウス］
２４匹のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス及び２４匹のオスのＧＭ−ＣＳＦ−／−マウス（実施例１を参照されたい）が４つの治療グループで用いられる。
グループ１：ＧＭ−ＣＳＦ ＫＯ（ｎ＝１２）：メチル化ＢＳＡ／ＩＬ−１
グループ２：ＧＭ−ＣＳＦ ＫＯ（ｎ＝１２）：メチル化ｍＢＳＡ／ＩＬ−１＋インドメタシン
グループ３：Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ｎ＝１２）：メチル化ＢＳＡ／ＩＬ−１
グループ４：Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ｎ＝１２）：メチル化ＢＳＡ／ＩＬ−１＋インドメタシン
【０１０３】
［単関節痛関節炎の誘発］
単関節痛関節炎は、生理食塩水中のｍＢＳＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ膝関節に、生理食塩水１０μｌを対側の膝関節に関節内注射することにより誘発される。ＩＬ−１β２０μｌ（２５０ｎｇ）を、３日間毎日皮下投与された。一般に、ｍＢＳＡ注入の４日及び７日後に反応が現れ、２８日後に消散する。２、３、４、５、及び７日目にインキャパシタンスの検査をした。
【０１０４】
インドメタシン（Ｓｉｇｍａ）は、非ステロイド系抗炎症性薬物であり、一般に熱、疼痛、こり、及び腫れを軽減させるために用いられる。これは、プラスタグランジンの生成を阻害することことによって作用する。１ｍｇ／ｋｇのインドメタシンを、インキャパシタンスを用いて評価する１時間前にグループ２とグループ４に腹腔内に投与した。
【０１０５】
［疼痛の読み取り］
インキャパシタンステスター（Ｄｕａｌ Ｗｅｉｇｈｔ Ａｖｅｒａｇｅｒ）は、２本の後ろ足における体重分配を測定することで、鎮痛効果を自動的に再現性よく評価するのに使用した。使用者が選択した期間にわたり、各足によってもたらされる力（グラム単位で測定）の平均をとり、動物の片方の足からもう片方の足に体重移動する傾向を提示し、インキャパシタンスの定量的測定を提供する。
【０１０６】
各後ろ足にかけられた体重は、５秒にわたって測定される。マウス１匹につき各時点で３回別個に測定し、次いで平均をとる。結果は、注入された後足／コントロール後足×１００で表す。１００の値は、右足と左足にかけられた体重が等しいことを意味する。１００以下の値は、コントロールの足（右）と比較すると、注入された足（左）に体重がかけられていないことを意味する。
【０１０７】
［結果］
このモデルは、ｍＢＳＡを注入されることにより、膝関節に滑膜炎が誘発される。７日目に膝関節は、視覚的に検査され、０（正常）から３（重度の炎症）のスコアが与えられる（図３を参照）。ｍＢＳＡが注入された左の膝は、右の膝（生理食塩水が注入された）と比較して、著しい炎症を起こした（ｐ＞０．００１ Ｃ５７マウス及びｐ＝０．０２ ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウス）（図３参照）。実際、生理食塩水が注入された任意の右膝は、スコア０だった。インドメタシンで治療したマウスとそれらで治療しない間には、損傷に顕著な違いはみられなかった。
【０１０８】
ｍＢＳＡ／ＩＬ−１単関節痛関節炎が誘発されたとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスと比較して、著しい疼痛（ｍＢＳＡを注入した膝からの体重を移動を計測することにより）を示した（図４参照）。これは４日目以降から顕著になる。
【０１０９】
インドメタシンで治療されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、インドメタシンで治療されないマウスと比較して、ｍＢＳＡ／ＩＬ−１単関節痛関節炎が誘発された後の疼痛が著しく軽いことを示し（図４参照）、この表示は、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスと類似する。ＧＭ−ＣＳＦ−／−は、疼痛を示さないので、インドメタシン治療は効果を有さない。
【０１１０】
有意水準は以下の通りである。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス：インドメタシンで治療されたグループ ｖｓ．治療されないグループ（グループ４ ｖｓ．グループ３）：
４日 ｐ＜０．０００１、５日 ｐ＜０．００１、７日 ｐ＝０．００７
ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウス ｖｓ．Ｃ５７ＢＬ／６マウス（グループ１ ｖｓ．グループ３）：
４日 ｐ＜０．０００１、５日 ｐ＜０．０００１、７日 ｐ＝０．０２２
【０１１１】
これらの結果は、ｍＢＳＡ／ＩＬ−１単関節痛関節炎モデルにおいて、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスは、全く疼痛の兆候を示さないのに対し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは４日目以降に著しい疼痛を示した。したがって、ＧＭ−ＣＳＦのアンタゴニストは、炎症性疼痛の治療に顕著な効果を有することは明らかである。
【実施例７】
【０１１２】
［ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは炎症性疼痛／ＣＦＡモデルの治療に有効である］
以下の実験は、炎症性疼痛の治療において、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストの有効性を明らかにする追加の実験である。ここで炎症性疼痛は、完全フロイドアジュバントで誘発されるものである。実施例５のように、疼痛をインドメタシン、疼痛緩和物質の投与にかかわらず、インキャパシタンス検査装置を用いて様々な時点で評価した。
【０１１３】
［マウス］
１２匹のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス及び１２匹のオスのＧＭ−ＣＳＦ−／−マウス（実施例１を参照されたい）がそれぞれ３つの治療グループで使用された。
グループ１：Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ｎ＝１２）：ＣＦＡ
グループ２：Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ｎ＝１２）：ＣＦＡ＋インドメタシン
グループ３：ＧＭ−ＣＳＦ ＫＯ（ｎ＝１２）：ＣＦＡ
【０１１４】
［炎症性疼痛の誘発］
完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）は、１ｍｇ／ｍｌの濃度の鉱油中に、熱滅菌したヒト型結核菌株、Ｈ３７Ｒａを含む。熱滅菌したバクテリアが完全に懸濁液に組み込まれるように、ボルテックスしてＣＦＡを完全に混合した（Ｋａｍａｌａ Ｔ Ｈｏｃｋ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ ｈｕｍａｎｅ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ｆｏｏｔｐａｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２８：２０４−２１４、２００７）。ボルテックス後すぐに、アジュバントは、１９ゲージ針を用いるガラスシリンジに吸い込まれた。気泡をシリンジから丁寧に取り除いてから、針を除去した。各マウスは、ＣＦＡエマルション２０μｌを左後ろ足（足蹠）に皮下注射された。疼痛評価１時間前にグループ２のマウスの腹腔内に、１ｍｇ／ｋｇのインドメタシン（実施例５参照されたい）を投与した。
【０１１５】
［疼痛の読み取り］
実施例５にあるように、インキャパシタンステスター（Ｄｕａｌ Ｗｅｉｇｈｔ Ａｖｅｒａｇｅｒ）を、２本の後ろ足の体重分配を計測することで自動的で再現性のある鎮痛効果の評価をするために使用した。各後ろ足が体重をかけた場所を５秒にわたって測定した。マウス１匹につき各時点で３回別個に測定し、次いで平均をとった。結果は、注入した足／コントロールの足×１００として表示する。１００の値は、右足と左足にかけられた体重が等しいことを意味する。１００以下の値は、コントロールの足（右）と比較すると、注入された足（左）に体重がかけられていないことを意味する。ＣＦＡ注入の２４、４８、７２時間後にインキャパシタンスによる検査をした。
【０１１６】
［結果］
左の足蹠にＣＦＡを皮下注射した後、Ｃ５７ＢＬ／６（グループ１）とＧＭ−ＣＳＦ−／−（グループ３）マウスと同様な大きさの腫れが、左の足蹠に示された。インドメタシンで治療されたＣ５７ＢＬ／６マウス（グループ２）も、腫れの程度に違いはなかった（図５を参照されたい）。いずれのグループも対側（右）の足に腫れは見られなかった。
【０１１７】
疼痛の測定としての体重分配評価は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、徐々に疼痛を示し、ＣＦＡ注入の４８時間（ｐ＝０．０３）及び７２時間（ｐ＝０．０００９）後にＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスより顕著になる（図６参照）。ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスは、全く疼痛を示さなかった。インドメタシンで治療されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、疼痛が緩和され、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスと違いがなかった（図６参照）。ＣＦＡ注入の７２時間後に、インドメタシンで治療されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、インドメタシンで治療されないＣ５７ＢＬ／６マウスより著しく疼痛が少なかった（ｐ＝０．０５）。
【０１１８】
有意水準の概要：
４８時間：
グループ３ｖｓ．グループ１−ｐ＝０．０３
グループ２ｖｓ．グループ１−ｐ＝０．０９
７２時間：
グループ３ｖｓ．グループ１−ｐ＝０．０００９
グループ２ｖｓ．グループ１−ｐ＝０．０５
【０１１９】
ＣＦＡ注入後に起こる足蹠の腫れの範囲は、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスでは、違いがなかった。さらに、インドメタシンで治療されたＣ５７ＢＬ／６マウスに腫れへの影響はなく、これはおそらくインキャパシタンス読み取りの１時間前にみ与えられたからである。腫れの大部分が、最初のインドメタシン注入の２４時間前に既に形成されていた。
【０１２０】
一方、ＣＦＡ注入後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、インドメタシンにより軽減された疼痛が、顕著に示された。その一方で、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスは、疼痛の兆候を全く示さなかった。従って、これらの実験結果は、ＣＦＡ注入の後の全てのマウスの足蹠に炎症が見られたのに、ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスには、疼痛の兆候が全く見られなかった。
【実施例８】
【０１２１】
［配列番号１又は２を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体の治療の有効性］
実施例２−７によると、ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、配列番号１に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む又は配列番号２に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体が用いられる。マウスとは別の種が用いられてもよく、特にこの実験で用いられる抗体は交差反応性である。この実験で特に好ましい動物種は、ラットである。
【０１２２】
コントロール抗体で治療された動物は、配列番号１に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む又は配列番号２に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体を投与された動物と比較して著しい疼痛の兆候を示した。これは、疼痛の治療の抗体の有効性を明らかにした。
【実施例９】
【０１２３】
［配列番号３又は４を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体の治療の有効性］
実施例２−７を繰り返す。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、配列番号３に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む又は配列番号４に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体が用いられる。マウスとは別の種が用いられてもよく、特にこの実験で用いられる抗体は交差反応性である。この実験で特に好ましい動物種はラットである。
【０１２４】
コントロール抗体で治療された動物、例えばラットは配列番号３に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む又は配列番号４に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体を投与された動物と比較して著しい疼痛の兆候を示した。これは、疼痛の治療の抗体の有効性を明らかにした。
【実施例１０】
【０１２５】
［配列番号５−２０を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体の治療の有効性］
実施例２−７を繰り返す。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、配列番号５−１６のいずれかから選択されるＨ−ＣＤＲ３配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体が使用される。前記抗体はさらに配列番号１６のＨ−ＣＤＲ１配列、及び／又は配列番号１８の配列Ｈ−ＣＤＲ２、及び／又は配列番号１９のＬ−ＣＤＲ１配列、及び／又は配列番号２０のＬ−ＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号２１のＬ−ＣＤＲ３配列を含むのが好ましい。マウスとは別の種が用いられてもよく、特にこの実験で用いられる抗体は、交差反応性である。この実験で特に好ましい動物種は、ラットである。
【０１２６】
本実施例によるとコントロール抗体で治療された動物、例えばラットはＧＭ−ＣＳＦ特異抗体を投与された動物と比較して著しい疼痛の兆候を示した。これは、疼痛の治療の抗体の有効性を明らかにした。
【実施例１１】
【０１２７】
［配列番号２１−２６を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体の治療の有効性］
実施例２−７を繰り返す。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、配列番号２２のＬ−ＣＤＲ１配列、及び／又は配列番号２３のＬ−ＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号２４のＬ−ＣＤＲ３配列、及び／又は配列番号２５のＨ−ＣＤＲ１配列、及び／又は配列番号２６のＨ−ＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号２７のＨ−ＣＤＲ３配列を含むＧＭ−ＣＳＦ特異抗体である。抗体は、配列番号２２−２８のＣＲＤｓを全て含むのが好ましい。マウスとは別の種が用いられてもよく、特にこの実験で用いられる抗体は交差反応性である。この実験で特に好ましい動物種はラットである。
【０１２８】
本実施例によるとコントロール抗体で治療された動物、例えばラットはＧＭ−ＣＳＦ特異抗体を投与された動物と比較して著しい疼痛の兆候を示した。これは、疼痛の治療の抗体の有効性を明らかにした。
【実施例１２】
【０１２９】
［ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特異的な抗体の治療の有効性］
実施例２−７を繰り返す。ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、配列番号２８−４６のいずれかに示されるＨ−ＣＤＲ３配列のアミノ酸配列を含むＧＭ−ＣＳＦ受容体特異抗体が使用される。マウスとは別の種が用いられてもよく、特にこの実験で用いられる抗体は、交差反応性である。この実験で特に好ましい動物種は、ラットである。
【０１３０】
動物、例えばラットは、本実施例によるとコントロール抗体で治療された動物は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体特異抗体を投与された動物と比較して著しい疼痛の兆候を示した。これは、疼痛の治療の抗体の有効性を明らかにした。
【０１３１】
当業者は、具体的にここに記載された発明を変形及び変更できることを理解すべきである。本発明は、このような変形及び変更を含む含むものと解釈すべきである。本発明は、個々又は集団で、明細書のステップ、特徴、組成物、並びに化合物、及び前記特徴又は特徴の任意の２又はそれ以上のいかなる組み合わせも含めるものとする。
【０１３２】
［参考文献］
Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ，Ｐａｉｎ ６４：４９３−５０１，１９９６
Ｇｈｏｓｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｏｍｂｉｎ Ｃｈｅｍ：１：５５−６８，１９９９
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ ｅｔ ａｌ，１９８８
Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７，２０００
Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５４：６７，２００１
Ｋｕｚｕｎａ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）２３：１１８４−１１９１，１９７５
Ｌｉｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ Ｒｅｖ：２３：３−２５，１９９７
Ｌｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐａｉｎ ９９：３９７−４０６，２００２
Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２：４４０−４５９，１９５９
Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７６：１１８２，２００８
Ｓｃｈｗｅｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ：Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９：１０８８６−１０８９７，１９９９
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを対象に投与することを含む対象の疼痛治療方法。
【請求項２】
前記対象が、ヒトであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンタゴニストが、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アンタゴニストが、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特的な抗体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疼痛が、外科的手術後の疼痛であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記疼痛が、骨肉腫の疼痛であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記疼痛が、関節リウマチ痛であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記疼痛が、変形性関節症痛であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記疼痛が、炎症性疼痛であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１】
ＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストを対象に投与することを含む対象の疼痛治療方法。
【請求項２】
前記対象が、ヒトであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンタゴニストが、ＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アンタゴニストが、ＧＭ−ＣＳＦ受容体に特的な抗体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疼痛が、外科的手術後の疼痛であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記疼痛が、骨肉腫の疼痛であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記疼痛が、関節リウマチ痛であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記疼痛が、変形性関節症痛であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記疼痛が、炎症性疼痛であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５１２８１４（Ｐ２０１２−５１２８１４Ａ）
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４１０２９（Ｐ２０１１−５４１０２９）
【出願日】平成２１年１２月２１日（２００９．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００９／００１６７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７１９２３
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５９１１４３８６９）ザ ユニバーシティー オブ メルボルン (9)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２１日（２００９．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００９／００１６７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７１９２３
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５９１１４３８６９）ザ ユニバーシティー オブ メルボルン (9)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ
【Ｆターム（参考）】
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