癌に対する素因についてのマーカーとしてのＭＩＴＦ
本発明は、癌の発生に対する素因についてのマーカーとして有用であるＭＩＴＦの突然変異体ならびに診断及び予防的処置におけるその使用に関し、ＳＵＭＯ化はこの突然変異体において低下している又は存在しない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、医学の分野に、特に、癌の発生に対する素因を決定するものに関する。
【０００２】
癌の約５%において、オンコジーンを活性化する又は腫瘍抑制遺伝子（主要遺伝子又は強い効果遺伝子として公知である）を不活性化する構成的突然変異は、それらを保有する個人に癌を発生する高いリスク（＞５０%の生涯リスク）を与え、癌の家族性形態、若年齢発症を伴う癌、又は複数の原発癌に関与する。疾患の発現は、他の遺伝因子（修飾因子又は弱い効果遺伝子として公知である）又は環境因子の影響下で変動しうる。リスクのある個人を特定することは、それらに、予防及び早期検出を目的としたサーベイランスから利益を与える。一部の場合において、構成的な生殖系列突然変異は、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２生殖系列突然変異を伴う患者における抗ＰＡＲＰ処置の場合のように、抗癌治療を導くことができる（Hennessy B.T.J., JCO, 2010, 28, 3570-3576）。
【０００３】
黒色腫は、メラノサイトの悪性腫瘍である。それは皮膚癌の最も稀な形態の１つであるが、しかし、皮膚癌での死亡の大半を占める。長年の集中的な研究にもかかわらず、唯一の効果的な処置は、それが１mmを超える厚さに達する前での原発腫瘍の外科的切除である。ＷＨＯ報告によると、１年当たり約４８，０００例の黒色腫での死亡がある。一部の試験では、皮膚黒色腫を伴う患者は、乳癌、リンパ腫、又は腎臓癌を発生する増加リスクを有しうると推測されている。
【０００４】
黒色腫において、２つの強い効果遺伝子が今までに同定されている：ｐ１６ＩＮＫ４Ａ及びｐ１４ＡＲＦタンパク質をコードするＣＤＫＮ２Ａ、ならびにＣＤＫ４。主要な環境因子はＵＶ曝露である。公知の弱い効果遺伝子は、主に、皮膚色素沈着に関与するタンパク質をコードするものであり、ＭＣ１Ｒが今までに最も広く試験されている。３つの黒色腫症例を伴う家族の５０%において、感受性遺伝子は同定されていない。
【０００５】
この状況において、本発明者らは、黒色腫に対する素因となる候補遺伝子として、ＭＩＴＦ遺伝子、メラノサイトの主要な調節遺伝子（１）及びオンコジーン（２，３）を試験してきた。ＭＩＴＦは、メラノサイトの生存及び成長において主要な役割を果たすｂＨＬＨ−ＬＺファミリーからの転写因子である。ＭＩＴＦは、メラニン形成の調節に関与する。ＭＩＴＦの役割は、それが細胞増殖を誘導及び抑止する点で普通ではない。実際に、この因子は、一方では、終末メラノサイト分化及び／又は色素沈着のために、他方では、細胞増殖を誘導することによる悪性挙動のために必要である。ＭＩＴＦ遺伝子の構成的「機能喪失」突然変異は、常染色体優性疾患、例えばワーデンバーグ症候群及びティーツェ症候群など（聴覚喪失ならびに皮膚、髪、及び／又は虹彩の色素沈着異常により特徴付けられる）に関連付けられる。
【０００６】
ＭＩＴＦ遺伝子は、９つのエクソンを含む。６つのＭＩＴＦアイソフォームが同定されている。ヒトにおいて、それらは、一般的には、アイソフォーム１〜６として言及され、アイソフォーム４は、より一般には、アイソフォームＭとして公知である。マウスにおいて、文字の命名法を代わりに使用する。これらのアイソフォームは、特異的プロモーターにより転写される。また、それらは、それらのＮ末端領域により区別することができ、全てがエクソン２〜９を含むのに対し、エクソン１は各々のアイソフォームに特異的である（１）。アイソフォーム４は、より一般には、ＭＩＴＦ−Ｍとして公知であり、６個のアミノ酸の挿入により他のアイソフォームとは異なる。このアイソフォームは、メラノサイト又はｉｎ ｖｉｖｏ形質転換細胞（母斑、黒色腫など）又はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞株だけで検出されている。他のアイソフォームは、多くの組織及び細胞株において発現し、時折、組織特異性も伴う。
【０００７】
ＷＯ ００／４７７６５は、ＭＩＴＦ遺伝子の選択的スプライシングが、ｍｉｔｆ＋転写物及びｍｉｔｆ＋における６つの追加のアミノ酸の挿入により異なるタンパク質をコードするｍｉｔｆ−転写物を産生することを教示する。ｍｉｔｆ＋及びｍｉｔｆ−はそれぞれ健常及び腫瘍細胞において主に発現する。この特許出願は、従って、黒色腫のリスク及び処置を評価、予測、又はモニターするための半定量的方法を開示する。ＷＯ ０５／１１６２４９は、また、これらのＭＩＴＦスプライシングバリアントに基づく定量的方法を記載する。
【０００８】
本発明において、本発明者らは、ＭＩＴＦ遺伝子において再発性の生殖系列突然変異を同定し、本明細書においてＥ３１８Ｋ（アイソフォーム４の命名法に基づく）と名付けられ、それは癌に対する素因についてのマーカーとして有用である。
【０００９】
ＭＩＴＦ遺伝子（小眼球症関連転写因子）は当業者に周知であり、データベース（例えばＵＮＩＧＥＮＥ（Ｈｓ．１６６０１７）、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（４８９２）、及びＧｅｎｅＩＤ（４２８６）など）におけるその参照により特徴付けることができる。それは、また、ＭＩ、ＷＳ２Ａ、又はｂＨＬＨｅ３２と呼ばれる。
【００１０】
前記Ｅ３１８Ｋ突然変異は、ＭＩＴＦ遺伝子のエクソン９に、特にＨＧＶＳ命名法に従ったアイソフォームＭの位置９５２にマッピングされる。それは、コード配列におけるヌクレオチドＡによるヌクレオチドＧの置換（ｃ．９５２Ｇ＞Ａ）に対応し、リジンによるグルタミン酸の置換（ｐ．Ｇｌｕ３１８Ｌｙｓ）をもたらす。エクソン９は、全てのＭＩＴＦスプライシングバリアントに共通である。ＭＩＴＦ−Ｍアイソフォームにおいて、この残基は転写物の位置９５２にあり、位置３１８においてアミノ酸の突然変異をもたらす。用語「Ｅ３１８Ｋ突然変異」は、ＭＩＴＦアイソフォームにおけるその位置にかかわらず、突然変異を指定する。特に、突然変異ヌクレオチドの位置及び異なるスプライシングバリアント中のアミノ酸を以下に示す。
【００１１】
【表１】
【００１２】
ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の転写の活性化で野生型ＭＩＴＦよりも強力であり、腎臓発癌おいて主要な役割を果たすことが公知である（腎臓癌に対する素因となる遺伝子（例えばＶＨＬ、ＦＨ、ＳＤＨＢなど）の「機能喪失」突然変異を伴い二次的に活性化される）。さらに、この突然変異はＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下させて、それにより、恐らく、タンパク質の安定性又は標的遺伝子によりコードされるタンパク質の量に影響を与えることが示されている。実際に、アミノ酸Ｅ３１８は、ＭＩＴＦタンパク質中の２つのＳＵＭＯ化部位の１つの部分である。ＭＩＴＦ遺伝子は転写因子をコードするため、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体タンパク質は、その標的遺伝子の一部を持続的に活性化しうる。その突然変異は、ＭＩＴＦタンパク質の局在化又はその核−細胞質比率を変化させることも可能である。
【００１３】
本発明者らは、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体が、皮膚悪性黒色腫及び随伴性腎臓癌を伴う患者においてより高頻度であることを発見している。突然変異は、また、皮膚悪性黒色腫及び腎臓癌を発生した個人において、あるいは、親類における黒色腫及び腎臓癌の既往、又は、皮膚黒色腫及び別の癌、特に赤血球増加症もしくはリンパ腫を伴う家族においてより高頻度であると考えられる。この突然変異体は、健常なコントロール被験者において非常に低い頻度（２／２８４６被験者、即ち、第１コホートにおける０．０００７のヘテロ接合体の頻度、及び１１／１８２４被験者、即ち、第２コホートにおける０．００３のヘテロ接合体の頻度）で存在する。本発明者らは、ＭＩＴＦの非ＳＵＭＯ化形態が、あまり分化していないメラノサイト及びより高度な増殖細胞に導くことを示している。
【００１４】
さらに、この突然変異体は、また、神経堤において生じる１つ又は複数の腫瘍（例えば神経内分泌癌、肉腫、神経芽細胞腫、又は神経系腫瘍（ＮＳＴ）など）、あるいは、本発明者らの予備的結果に従った他の型の癌（例えばリンパ腫、肺癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、小児腫瘍、造血器悪性腫瘍、胃腸癌、赤血球増加症、又はこれらの型の癌の組み合わせなど）を発生している被験者においてより高頻度である可能性が高い。ＳＵＭＯ化部位は、古典的には、Ｗ−Ｋ−Ｘ−Ｅコンセンサスモチーフを含み、それにおいてＷは疎水性アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸である。ＭＩＴＦは、２つのＳＵＭＯ化部位を持つ：第１部位は配列ＩＫＲＥ（アイソフォーム１、２、３、４、５、及び６中のそれぞれ位置２８９、２７３、２８８、１８２、１８２、及び１２６におけるＫを伴う）を有し、第２部位は配列ＩＫＱＥ（アイソフォーム１、２、３、４、５、及び６中のそれぞれ位置４１７、４０１、４１６、３１６、３１０、及び２５４におけるＫを伴う）を有する。Ｋ１８２及びＫ３１６突然変異は、標的遺伝子メラスタチン／ＴＲＰＭの転写を増加させるが、しかし、タンパク質のＤＮＡ結合、局在化、又は安定性には影響しない（Miller AJ et al., JBC, 2005, 280: 146-155）。
【００１５】
本発明のＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体に関する教示は、ＳＵＭＯ化部位の１つで又は両方の部位でＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化を低下又は消失させる任意のＭＩＴＦ突然変異に一般化されうる。
【００１６】
従って、本発明は、被験者が、以下：皮膚悪性黒色腫、腎臓癌、甲状腺癌、肉腫、神経芽細胞腫、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される癌を発生する素因又は感受性を有するか否かを決定するための方法に関し、被験者からの生物学的サンプルにおいて、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させるＭＩＴＦ突然変異（小眼球症関連転写因子）の存在を決定することを含み、前記突然変異の存在は、被験者がそのような癌を発生する素因又は感受性を有することを示す。特定の実施態様において、著しくは、ＭＩＴＦ突然変異がＥ３１８Ｋ（すなわち、アイソフォーム４におけるＥ３１８Ｋ又はＬｙｓ残基による他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応するＧｌｕ残基の置換）である場合、癌は、皮膚悪性黒色腫、又は皮膚悪性黒色腫及び別の癌、特に、神経内分泌癌、肉腫、神経芽細胞腫又は神経系腫瘍（ＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、小児腫瘍、造血器悪性腫瘍、胃腸癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される癌との組み合わせである。癌は、また、腎臓癌、甲状腺癌、肉腫、神経芽細胞腫、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせの間より選択してもよい。特定の実施態様において、組み合わせは、皮膚悪性黒色腫及び腎臓癌の組み合わせである。
【００１７】
好ましくは、突然変異は、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化部位の１つ又は両方の部位のリジン残基及び／又はグルタミン酸残基の置換である。例えば、突然変異は、他の１９アミノ酸のいずれかによる、以下の表より選択される残基の置換である。
【００１８】
【表２】
【００１９】
より具体的には、リジン残基が他の１９アミノ酸のいずれかにより置換されてもよく；及び／又は、グルタミン酸残基が他の１９アミノ酸のいずれかにより置換されてもよい。
【００２０】
好ましくは、この方法は、他の１９アミノ酸のいずれかによる、「Ｋ３１６」残基（すなわち、アイソフォーム４におけるＫ３１６又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応するＬｙｓ残基）及び／又は「Ｅ３１８」残基（すなわち、アイソフォーム４におけるＥ３１８又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応するＧｌｕ残基）の置換を検出することを含む。
【００２１】
好ましい実施態様において、この方法は、他の１９アミノ酸のいずれかによる、「Ｅ３１８」残基（すなわち、アイソフォーム４におけるＥ３１８又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応するＧｌｕ残基）の置換を検出することを含む。さらにより好ましい実施態様において、この方法は、「Ｅ３１８Ｋ」突然変異（すなわち、アイソフォーム４におけるＥ３１８Ｋ又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおけるＬｙｓ残基による対応するＧｌｕ残基の置換）を検出することを含む。
【００２２】
突然変異は、タンパク質又は核酸レベルで検出してもよい。ＭＩＴＦ遺伝子又はその転写物（ｍＲＮＡ）において以前に定義されたような突然変異を同定するための方法は、当業者に周知であり、特に、限定しないが、配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、及び／又は選択的増幅を含む。核酸レベルでは、検出は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡのサンプルで行ってもよい。
【００２３】
特に、ＭＩＴＦの配列決定は、完全又は部分的でありうる。実際に、この方法は、単に、突然変異していると疑われる残基を含む領域の配列決定及びさらにこの特定の残基だけの配列決定を含みうる。
【００２４】
選択的ハイブリダイゼーションは、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡが、突然変異体ＭＩＴＦに特異的なプローブ、及び、場合により、前記突然変異を持たないＭＩＴＦ又は野生型ＭＩＴＦに特異的なプローブの存在において配列されることを意味すると理解される。プローブは、懸濁液中にありうる又は基質上に固定化されうる。典型的には、プローブは、より簡単な検出のために標識される。特に、プローブは、８〜１０００ヌクレオチド、好ましくは１０〜８００又は１５〜５０ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。
【００２５】
核酸は、突然変異の検出前に増幅してもよい。例えば、検出される突然変異の位置に隣接する（すなわち、上流又は下流）領域に特異的なプライマー対を構築する。典型的には、プライマーは、５〜６０ヌクレオチド、好ましくは８〜２５ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。完全な相補性が好ましい。なぜなら、それによって高い特異性が確実になるからである。しかし、一部のミスマッチが許容されうる。一度、ＭＩＴＦ遺伝子又は突然変異を含むエクソン、あるいはその転写物のその他の１つが増幅されれば、アンプリコンは、配列決定又は特異的ハイブリダイゼーションにより、あるいは当業者に公知の任意の他の適した方法により突然変異の存在を検出するために使用される。突然変異は、また、融解曲線分析により検出されうる（例えば、ＷＯ２００７／０３５８０６を参照のこと）。
【００２６】
突然変異の存在は、また、突然変異体の選択的増幅により検出されうる。例えば、プライマー対を調製し、プライマーの１つは、検出される突然変異を保有する配列と特異的にハイブリダイズする。前記プライマーは、配列が突然変異ヌクレオチドを保有する場合にだけ、増幅を開始する、又は、その標的にハイブリダイズすることができる。その結果、アンプリコンの存在は、ＭＩＴＦがテストされた突然変異を持つことを示しうるのに対し、前記アンプリコンの非存在は、ＭＩＴＦがこの突然変異を持たないことを示しうる。
【００２７】
これらの方法は、ＳＵＭＯ化部位のいくつかの突然変異と同時に又は並列して検出するために当業者により容易に適応されうることを理解しなければならない。このように、この方法は、ＭＩＴＦアイソフォーム４におけるＫ１８２、Ｅ１８４、Ｋ３１６、及びＥ３１８からなる群より選択される残基又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応する残基の置換をコードする１つ又は複数の突然変異の検出を許しうる。
【００２８】
突然変異をタンパク質レベルで検出する場合、この方法では、検出される突然変異を持つＭＩＴＦ及び前記突然変異を持たないＭＩＴＦの間で区別することができる抗体が使用される。特に、生物学的サンプルを、検出される突然変異を持つＭＩＴＦに対して向けられる抗体と接触させ、免疫複合体の存在を検出する。様々な方法が前記免疫複合体の検出を可能にする（例えばＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）など）。「抗体」は、また、この突然変異を持たないＭＩＴＦと比較して、検出されるＭＩＴＦ突然変異体に特異的に結合する能力を保存している任意の抗体フラグメント及び誘導体を指す。ここで再び、これらの方法は、１つ又は複数のＳＵＭＯ化部位のいくつかの突然変異と同時の又は並列した検出のために当業者により簡単に適応されうる。このように、この方法は、ＭＩＴＦアイソフォーム４におけるＫ１８２、Ｅ１８４、Ｋ３１６、及びＥ３１８からなる群より選択される残基又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応する残基の１つ又は複数の置換の検出を可能にしうるが、例えば、これらの置換の１つ又は複数を持つ各ＭＩＴＦ突然変異体について特異的な抗体の組み合わせの助けを用いる。
【００２９】
あるいは、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させる突然変異は、間接的な様式においてタンパク質レベルで検出されうる。例えば、突然変異の存在は、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化、野生型ＭＩＴＦタンパク質と比べた、ＳＵＭＯ化の低下（突然変異の存在を示す）を測定することにより検出されうる。実施例では、前記ＳＵＭＯ化をどのように測定するのかを記載する。同様に、ＳＵＭＯ化を低下させる突然変異は、突然変異体ＭＩＴＦタンパク質が安定化され、従って、免疫組織化学又は免疫蛍光により組織切片において検出可能である。突然変異の又はＳＵＭＯ化の存在／非存在の検出は、また、質量分析（ＷＯ／２００５／００３３９０）により行ってもよい。
【００３０】
本発明の特に興味深い実施態様において、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化は、免疫組織化学又は免疫蛍光により検出したＭＩＴＦの細胞局在を決定することにより間接的に測定される。実際には、驚くべきかつ高度に独創的な様式において、ＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化の低下は、腫瘍細胞における免疫組織化学により目に見えるＭＩＴＦタンパク質の細胞局在の変化を起こす。野生型タンパク質は核だけに又は主に核に位置するのに対し、タンパク質のＳＵＭＯ化を低下させる突然変異（特にＥ３１８Ｋ突然変異）を持つタンパク質は、核及び細胞質の両方に位置する。このように、本発明は、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下させる突然変異が、免疫組織化学によりＭＩＴＦの細胞局在を決定することにより検出される方法に関し、核局在は野生型ＭＩＴＦタンパク質を示し、細胞質局在はＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下させる突然変異を持つＭＩＴＦタンパク質（特にＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体）を示す。突然変異は、また、組織における免疫組織化学又は免疫蛍光によりＭＩＴＦタンパク質の検出を可能にしうるが、ここで、野生型タンパク質はこれらの同じ方法により検出不可能である。
【００３１】
突然変異は、任意のＭＩＴＦアイソフォームにおいて検出されうる。特定の実施態様において、突然変異はアイソフォーム４において検出される。
【００３２】
本発明の精神において、用語「被験者」は哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【００３３】
本発明の精神において、用語「生物学的サンプル」は、健常組織又は腫瘍組織のサンプル、例えば、生検及び特に、皮膚、腎臓、甲状腺、肺の生検、あるいは生物学的液体、例えば、血液、脳脊髄液、尿、又はリンパ液のサンプルを指す。好ましくは、生物学的サンプルは血液サンプルである。本発明の方法は、生物学的サンプルを回収する予備工程を含みうる。
【００３４】
本発明の方法は、また、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させる突然変異の検出に加えて、癌に対する素因についての他のマーカーの検出を包含することを理解しなければならない。
【００３５】
本発明は、また、被験者が、以下のリストより選択される癌を発生する素因又は感受性を有するか否かを決定するための診断キットを調製するためにＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させる突然変異を検出するための手段の使用に関する：皮膚悪性黒色腫、神経内分泌癌、肉腫、神経芽細胞腫又は神経系腫瘍（ＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、小児腫瘍、造血器悪性腫瘍、胃腸癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせ（前記突然変異の存在は、被験者がそのような癌を発生する素因又は感受性を有することを示す）。特定の実施態様において、癌は、皮膚悪性黒色腫、腎臓癌、甲状腺癌、肉腫、神経芽細胞腫、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましい様式において、癌は、皮膚悪性黒色腫、腎臓癌、及びそれらの組み合わせの間より選択される。検出の方法は、検出される突然変異を持つＭＩＴＦに特異的なプローブ、検出される突然変異を含むヌクレオチドセグメントの増幅を可能にするプライマー対、プライマー対（その１つが、検出される突然変異を保有する配列に特異的にハイブリダイズする）（それにより検出されるＭＩＴＦ突然変異体の選択的増幅を可能にする）、検出されるＭＩＴＦ突然変異体に対して向けられた抗体、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を検出及び測定するための手段、検出される突然変異を保有しないＭＩＴＦを検出するためのネガティブコントロール、又はそれらの組み合わせを含みうる又はそれらにある。特定の実施態様において、著しくは、ＭＩＴＦ突然変異がＥ３１８Ｋ（すなわち、アイソフォーム４におけるＥ３１８Ｋ又はＬｙｓ残基による他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応するＧｌｕ残基の置換）である場合、癌は、皮膚悪性黒色腫、又は皮膚悪性黒色腫及び別の癌、特に、神経内分泌癌、肉腫、神経芽細胞腫又は神経系腫瘍（ＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、小児腫瘍、造血器悪性腫瘍、胃腸癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される癌との組み合わせである。特定の実施態様において、癌は、皮膚悪性黒色腫、腎臓癌、甲状腺癌、肉腫、神経芽細胞腫、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましい様式において、癌は、皮膚悪性黒色腫、腎臓癌、及びそれらの組み合わせの間より選択される。
【００３６】
癌に対する素因又は感受性を検出することの関心は、被験者が臨床モニタリング又はサーベイランスから利益を得ることができ、早期段階での癌の検出を可能にし、従って、治癒の可能性を増加させることである。さらに、突然変異の検出は、患者の治療アルゴリズムを導く及び／又は処置の効力を増強することを可能にしうる。さらに、そのようにして同定された被験者は、また、予防的処置から利益を得ることができる。前記処置では、癌の発生を予防又は遅延させることが意図される。
【００３７】
このように、本発明は、また、予防的処置又は医学的サーベイランスから利益を得うる患者を選択するための方法に関し、本発明の方法により癌に対する患者の感受性を決定すること、及び、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させる突然変異を提示する被験者を選択することを含む。
【００３８】
問題の予防的処置は、ポリフェノール化合物を投与することを含みうる。実際に、特に、発酵した米殻からのポリフェノール化合物が、ＭＩＴＦタンパク質のレベルを低下させることが示されている（５）。このように、前記処置は、ＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化の低下及びその標的遺伝子に対するその機能的効果を相殺しうる（ＭＩＴＦは転写因子である）。さらに、紅茶からのポリフェノールは、細胞周期停止により及びプロアポトーシス機構により生じうる化学予防作用を有する（６）。従って、本発明は、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させるＭＩＴＦ突然変異を保有する被験者における癌の予防的処置における使用のためのポリフェノール化合物、及び、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させるＭＩＴＦ突然変異を保有する被験者における癌の予防的処置（化学予防）を意図する薬物を調製するためのポリフェノール化合物の使用に関する。本発明は、さらに、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させるＭＩＴＦ突然変異を保有する被験者にポリフェノール化合物の効果的な治療的用量を投与することを含む処置の方法に関し、それにより癌の発生を予防又は遅延させる。好ましくは、ポリフェノール化合物は、発酵させた米殻からのポリフェノール化合物又は紅茶からのポリフェノールである。特許出願ＷＯ０５／０９９７２１には、また、特にその抗酸化効果を通じた癌の予防のために有用な多くの他のポリフェノール化合物が記載されている。
【００３９】
本発明は、以下の実施例においてより明らかになり、それらは例証の目的のために与えられるが、しかし、限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１ａ】（図１ａ）ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋバリアントが同定された複数の黒色腫症例を伴う最初の家族の家系；（図１ｂ）黒色腫及び腎臓癌を伴う人における生殖系列突然変異（血液）の電気泳動図（図１ｂ）。
【図１ｂ】（図１ａ）ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋバリアントが同定された複数の黒色腫症例を伴う最初の家族の家系；（図１ｂ）黒色腫及び腎臓癌を伴う人における生殖系列突然変異（血液）の電気泳動図（図１ｂ）。
【図２】野生型ＭＩＴＦタンパク質と比較した、Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つＭＩＴＦタンパク質の存在におけるＨＩＦ１Ａ（しかし、ＭＥＴプロモーターではない）の転写活性化。
【図３】３１８Ｋ突然変異を持つＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化の低下。
【図４ａ】Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化を低下させる。図４ａ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１又はｐＳＧ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞を沸騰バッファー中に溶解し、各レーンの十分なローディングのためのコントロールに対してＭＩＴＦ及びＥＲＫ２についてウェスタンブロットによりテストした。図４ｂ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ２又はｐＳＧ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞をＭＩＴＦ及びＥＲＫ２についてのウェスタンブロットによりテストした。図４ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１又はｐＳｇ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞ライセートをＮｉ−ＮＴＡカラムで精製し、ＭＩＴＦについてのウェスタンブロットにより分析した（上パネル）。下パネルは、コントロールＭＩＴＦ発現及び各レーンの十分なローディングに対する、精製前の細胞ライセートのウェスタンブロットを示す。
【図４ｂ】Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化を低下させる。図４ａ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１又はｐＳＧ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞を沸騰バッファー中に溶解し、各レーンの十分なローディングのためのコントロールに対してＭＩＴＦ及びＥＲＫ２についてウェスタンブロットによりテストした。図４ｂ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ２又はｐＳＧ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞をＭＩＴＦ及びＥＲＫ２についてのウェスタンブロットによりテストした。図４ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１又はｐＳｇ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞ライセートをＮｉ−ＮＴＡカラムで精製し、ＭＩＴＦについてのウェスタンブロットにより分析した（上パネル）。下パネルは、コントロールＭＩＴＦ発現及び各レーンの十分なローディングに対する、精製前の細胞ライセートのウェスタンブロットを示す。
【図４ｃ】Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化を低下させる。図４ａ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１又はｐＳＧ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞を沸騰バッファー中に溶解し、各レーンの十分なローディングのためのコントロールに対してＭＩＴＦ及びＥＲＫ２についてウェスタンブロットによりテストした。図４ｂ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ２又はｐＳＧ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞をＭＩＴＦ及びＥＲＫ２についてのウェスタンブロットによりテストした。図４ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１又はｐＳｇ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞ライセートをＮｉ−ＮＴＡカラムで精製し、ＭＩＴＦについてのウェスタンブロットにより分析した（上パネル）。下パネルは、コントロールＭＩＴＦ発現及び各レーンの十分なローディングに対する、精製前の細胞ライセートのウェスタンブロットを示す。
【図５ａ】Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦの細胞局在に影響を与え、その転写活性を変えうる。図５ａ）ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし、抗ｍｙｃ抗体を用いて染色し、次にAlexafluor 594標識抗マウス抗体を用いて二次染色したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光分析。細胞核を、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。バーは１０μmを表す。図５ｂ）抗ＭＩＴＦ抗体を用いた黒色腫及び腎腫瘍組織の免疫組織化学染色（×２００）。野生型ＭＩＴＦを持つ黒色腫は核染色を示し、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ黒色腫は核及び細胞質染色を示す。野生型ＭＩＴＦを持つ腎臓癌組織は染色されないのに対し、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ腎臓癌組織は核及び細胞質染色を示す。図５ｃ）ＨＥＬ２９３細胞を、合成３×Ｍ−ボックスルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、及び、突然変異体もしくは野生型ＭＩＴＦ ｐＣＤＮＡ３コンストラクト又は空ｐＣＤＮＡ３ベクターを用いて一過性にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性をβガラクトシダーゼ活性に対して標準化し、その結果を無刺激細胞についての基礎ルシフェラーゼ活性を上回る倍刺激として表現した。
【図５ｂ】Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦの細胞局在に影響を与え、その転写活性を変えうる。図５ａ）ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし、抗ｍｙｃ抗体を用いて染色し、次にAlexafluor 594標識抗マウス抗体を用いて二次染色したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光分析。細胞核を、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。バーは１０μmを表す。図５ｂ）抗ＭＩＴＦ抗体を用いた黒色腫及び腎腫瘍組織の免疫組織化学染色（×２００）。野生型ＭＩＴＦを持つ黒色腫は核染色を示し、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ黒色腫は核及び細胞質染色を示す。野生型ＭＩＴＦを持つ腎臓癌組織は染色されないのに対し、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ腎臓癌組織は核及び細胞質染色を示す。図５ｃ）ＨＥＬ２９３細胞を、合成３×Ｍ−ボックスルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、及び、突然変異体もしくは野生型ＭＩＴＦ ｐＣＤＮＡ３コンストラクト又は空ｐＣＤＮＡ３ベクターを用いて一過性にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性をβガラクトシダーゼ活性に対して標準化し、その結果を無刺激細胞についての基礎ルシフェラーゼ活性を上回る倍刺激として表現した。
【図５ｃ】Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦの細胞局在に影響を与え、その転写活性を変えうる。図５ａ）ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし、抗ｍｙｃ抗体を用いて染色し、次にAlexafluor 594標識抗マウス抗体を用いて二次染色したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光分析。細胞核を、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。バーは１０μmを表す。図５ｂ）抗ＭＩＴＦ抗体を用いた黒色腫及び腎腫瘍組織の免疫組織化学染色（×２００）。野生型ＭＩＴＦを持つ黒色腫は核染色を示し、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ黒色腫は核及び細胞質染色を示す。野生型ＭＩＴＦを持つ腎臓癌組織は染色されないのに対し、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ腎臓癌組織は核及び細胞質染色を示す。図５ｃ）ＨＥＬ２９３細胞を、合成３×Ｍ−ボックスルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、及び、突然変異体もしくは野生型ＭＩＴＦ ｐＣＤＮＡ３コンストラクト又は空ｐＣＤＮＡ３ベクターを用いて一過性にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性をβガラクトシダーゼ活性に対して標準化し、その結果を無刺激細胞についての基礎ルシフェラーゼ活性を上回る倍刺激として表現した。
【図６】突然変異体メラノサイトはより明るい色素沈着を示す。細胞ペレット及び２人の健常ドナーのメラノサイトにおけるメラニン測定は、Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ患者の皮膚生検から単離されたメラノサイトと比較して（＊＊＊）有意差を示す（ｐ＜０．００１）。２人のドナー及び突然変異体保有者はコーカソイドであった。
【図７】Ｅ３１８Ｋ突然変異が成長の利点を与える。ｍｅｌａｎ−ａ不死化マウスからのメラノサイト（左）、ヒト転移性黒色腫Ａ３７５細胞株（中央）、及びヒト腎臓癌ＲＣＣ４細胞（右）を、空ベクター、又は野生型ＭＩＴＦ（Ｍｉ−ＷＴ）もしくは突然変異体ＭＩＴＦ（Ｍｉ−Ｅ３１８Ｋ）をコードするベクターを用いてトランスフェクトした。２週目の写真（上）及びクローンのクリスタルバイオレット染色／脱染後の吸光度を示す。
【００４１】
実施例
実施例１
本発明者らは、ＭＩＴＦ遺伝子（オンコジーン、従って、候補遺伝子と考えられる）を試験した。本発明者らは、最初に、全てのアイソフォームを配列決定することにより、黒色腫家族においてＭＩＴＦ遺伝子（３ｐ１４）中にカスパーゼ切断部位（抗アポトーシス効果）で突然変異があるか否かを試験した（４）。それらの予備結果によって、複数の黒色腫症例（２つの腎臓癌、３つの中枢神経系腫瘍、１つの肺癌及び１つの胃癌、母方の側からＥ３１８Ｋ突然変異が生じた）を伴い、１ｐ２２ハプロタイプの父方伝達を伴う、スペインバスクの家族（ＴＲＹ）におけるＭＩＴＦ−Ｍ ｃ．９５２Ｇ＞Ａ， ｐ．Ｇｌｕ３１８Ｌｙｓ（Ｅ３１８Ｋ）の生殖系列バリアントの存在が明らかになった。このバリアントは、１８０人のフランス人／コーカソイドの及び９６人のスペインバスクのコントロールにおいて存在しなかった（図１ａ及びｂ）。
【００４２】
Ｂ１６マウス黒色腫細胞において、本発明者らは、ＭＩＴＦバリアントｃ．９５２Ｇ＞Ａ，ｐ．Ｇｌｕ３１８Ｌｙｓ（Ｅ３１８Ｋ）が、ＨＩＦ１ａ遺伝子（しかし、ＭＥＴ遺伝子ではない）の転写を誘導する際に、野生型形態よりも活性であることを示した（図２）。本発明者らは、従って、ＨＩＦは、低酸素条件において、ＶＨＬの非存在における腎細胞の形質転換因子であると仮定した；ＶＨＬ（腫瘍抑制遺伝子の機能喪失突然変異）及びＭＥＴ（オンコジーンの活性化突然変異）は、腎臓癌に対する素因となる２つの遺伝子である；ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体により活性化されたＨＩ１ａＦは、従って、ＶＨＬの非存在と同じ効果を有しうる。本発明者らは、従って、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異が、ＭＥＬＡＲＩＳＫコホートの「黒色腫及び腎臓癌（散発症例）」サブグループの４／５５患者において存在し、２７６のコントロールにおいては存在しない（ｐ＝０．０００７）ことを示した。本発明者らは、次に、ＩＧＲ（Institut Gustave Roussy, Villejuif, France）の異なる生物学的サンプルのコレクションにおいてＥ３１８Ｋ突然変異体の頻度を研究した。この突然変異の他の保有者が同定された：若年性ＴＦＥ３転座関連腎臓癌を発生した女性（その母親が乳癌を有し、黒色腫が続いた）；３つの黒色腫及びリンパ腫を発生した女性；複数の黒色腫症例を伴う家族の指標症例；いくつかの黒色腫を発生した指標症例；結節性黒色腫を発生した２人の男性；黒色腫を発生した女性（その叔父の１人がＣＮＳＴを有した）；腎乳頭癌を発生した２人の男性；赤血球増加症を伴う男性。実際に、ＶＨＬは赤血球増加症に対する素因となる３つの遺伝子の１つである。
【００４３】
【表３】
【００４４】
実施例２
黒色腫及び腎細胞癌を伴う患者におけるＭＩＴＦ生殖系列突然変異の同定
共存する黒色腫及び腎臓癌に関連付けられる、ミスセンス置換ｐ．Ｅ３１８Ｋ（ＭＩＴＦアイソフォームＭ、ＮＭ＿０００２４８中のｃ．９５２Ｇ＞Ａ）に起因するＭＩＴＦバリアントの同定を確認するために、本発明者らは、共存する黒色腫及び腎細胞癌を伴う患者６２人における遺伝子の全コード配列、イントロン−エクソンの境界、及び８つの選択的プロモーターを配列決定した。この置換は６２人の患者中５人において観察された。このバリアントの頻度は、１８２４人の被験者のコントロール集団よりも有意に高い（４%対０．３%、ｐ＝９．７ｘ１０−５）。このように、ｐ．Ｅ３１８Ｋ保有者は、黒色腫及び腎細胞癌の両方を発生する１４倍高いリスクを有する（オッズ比＝１４．４６［９５%信頼区間：３．７９−４６．８２］）（表２）。このバリアントが黒色腫単独への感受性に影響を与えることを確認するために、本発明者らは、黒色腫を伴う７０４人の患者（黒色腫に対する素因であるＣＤＫＮ２Ａ及びＣＤＫ４突然変異について陰性であった）（黒色腫の家族歴を伴う４２２の独立した症例、多発性原発黒色腫を伴う２４２の散発症例、及び４０の散発性の結節性黒色腫を含む）を遺伝子型決定した（表２）。後者の症例をテストした。なぜなら、黒色腫及び腎細胞癌の両方を伴い、ｐ．Ｅ３１８Ｋ突然変異を保有する５人の患者中４人が少なくとも１つの結節性黒色腫（黒色腫の最も稀な組織型）を有したからである。ｐ．Ｅ３１８Ｋの頻度は、コントロールと比較して、黒色腫単独を伴う全ての患者において有意に高かった（１．３%対０．３%、ｐ＝４．５ｘ１０−５）。ｐ．Ｅ３１８Ｋ保有者は、黒色腫を発生する４倍を上回る増加リスク有した（オッズ比＝４．５７［９５%信頼区間：２．０５−１０．６８］）。この増加リスクは、散発性の多発性原発黒色腫患者に主に起因するように見えるのに対し（オッズ比＝７．１０［９５%信頼区間：２．６７−１８．６２］）、ｐ．Ｅ３１８Ｋの効果は、黒色腫家族からの黒色腫患者について（オッズ比＝２．７８［９５%信頼区間：０．９−７．９０］）又は結節性黒色腫を伴う患者について（オッズ比＝８．６７［９５%信頼区間：０．９１−４１．７０］）は有意ではなかった（表３）。しかし、これらの３つの群にわたるｐ．Ｅ３１８Ｋ対立遺伝子の頻度の均一性のテストでは、わずかにだけ有意であった（ｐ＝０．０６）。生物学的材料は、発端者がバリアントを保有した７つの黒色腫家族の３つにおける追加の罹患家族員について入手可能であった。これらの家族の各々において、ｐ．Ｅ３１８Ｋは黒色腫と同時分離した。あるいは、腎臓癌への感受性に対するｐ．Ｅ３１８Ｋの効果を検証するために、本発明者らは、腎細胞癌を伴う１８７人の患者においてこのバリアントを遺伝子型決定した。ｐ．Ｅ３１８Ｋの頻度もコントロールより腎臓癌を伴う患者において高く（１．３%対０．３%、ｐ＝０．０１）、ｐ．Ｅ３１８Ｋに関連付けられる腎臓癌のリスクにおける増加は、黒色腫単独について見られるものと同様であった（オッズ比＝４．５３［９５%信頼区間：１．２２−１４．３０］）（表２）。ｐ．Ｅ３１８Ｋ対立遺伝子頻度の不均一性の有意な実証は、患者の３群にわたりなかった（黒色腫＋腎細胞癌、黒色腫単独、腎細胞癌単独；ｐ＝０．０８）。全ての患者群を組み合わせることで、症例とコントロールの間でのｐ．Ｅ３１８Ｋ対立遺伝子頻度における差の有意性の程度が増加した（１．５%対０．３%、ｐ＝２．５ｘ１０−７）。全体的に、ｐ．Ｅ３１８Ｋ突然変異の保有者は、黒色腫、腎細胞癌、又はその両方を発生する５倍を上回る増加リスクを有した（オッズ比＝５．１７［９５%信頼区間：２．４９−１１．５２］）。
【００４５】
ｐ．Ｅ３１８Ｋが黒色腫及び腎臓癌以外の別の癌の同時発生に対する素因となるか否かを決定するために、研究者らは黒色腫及び別の原発腫瘍を伴う１７２人の患者を遺伝子型決定したが、しかし、いずれもｐ．Ｅ３１８Ｋ突然変異を保有しなかった（表２）。ｐ．Ｅ３１８Ｋと別の原発腫瘍との関連は稀な事象であるため、本発明者らは、より大きな系列を試験することを計画する。
【００４６】
【表４】
ＯＲ＝オッズ比；９５%ＣＩ＝９５%信頼区間；ｐ値＝テストの臨界確率；ＣＭ＝皮膚黒色腫；ＲＣＣ＝腎細胞癌。
＊全ての保有者はｐ．Ｅ３１８Ｋバリアントについてヘテロ接合である。
ａ５人の患者が明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）を発生し、５人の患者中４人が少なくとも１つの結節性黒色腫を発生し、５番目の患者が表在拡大型黒色腫（ＳＳＭ）を発生した。ｂ家族性黒色腫（特に、家族において少なくとも２人の確認された黒色腫症例を伴う）、４２２例；多発性原発黒色腫（ＭＰＭ）を伴う散発例、２４２例；散発性の結節性黒色腫、４０例。
ｃ１９人の保有者の内、７人は家族性症例であり、９人は散発性ＭＰＭ症例であり、２人は散発性の結節性黒色腫症例である。
ｄ明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）、５４の散発例；乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣ）、５５例（Ｉ型を伴う２２例、ＩＩ型を伴う３０例、及び不明の組織学的サブタイプを伴う３例）；混合性の腎細胞癌表現型（特に、乳頭状及び明細胞）、２例；小児腎細胞癌、５例；不明の組織学的サブタイプを伴う腎細胞癌、７１例。
ｅ５人の保有者の内、１人は明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）であり、２人はＩＩ型乳頭状腎細胞癌であり、１人は体細胞転座ｔ（Ｘ；１７）（ｐ１１；ｑ２５）を伴う若年性癌であり、１人はＩ型乳頭状腎細胞癌である。
ｆ乳癌、９７例；脳癌、２７例；甲状腺非髄様癌、２８例；結腸癌、１０例；他の癌（精巣、子宮、卵巣、前立腺、肉腫、及び子宮内膜）、１０例。
黒色腫単独、腎細胞癌単独、及び２つの組み合わせの間での対立遺伝子頻度の均一性のテスト：ｐ＝０．０７８（直接検定）
【００４７】
【表５】
黒色腫単独の３つのカテゴリー（家族性、ＭＰＭ、結節性）の間での対立遺伝子頻度の均一性のテスト：ｐ＝０．０６５（直接検定）。家族性対ＭＰＭを比較する均一性のテスト：ｐ＝０．０７２（直接検定）
【００４８】
実施例３
ＭＩＴＦ ｐ．Ｅ３１８Ｋ突然変異の機能的効果
このＥ３１８Ｋ突然変異は、タンパク質の２つのＳＵＭＯ化部位（ＷＫＸＥモチーフ、２つの部位Ｋ１８２及びＫ３１６）の１つに位置付けられる。本発明者らは、Ｅ３１８Ｋ突然変異の存在におけるＭＩＴＦのＳＵＭＯ化における低下を実証している（図３）。
【００４９】
より具体的には、本発明者らは、部位特異的突然変異誘発によりＥ３１８Ｋバリアントを産生している。また、本発明者らは、Ｋ１８２Ｒバリアント及びＫ１８２Ｒ：Ｅ３１８Ｋ二重突然変異体も調製している。
【００５０】
Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−１と野生型ＭＩＴＦとの共発現後、抗ＭＩＴＦ抗体を使用した全抽出物でのウェスタンブロットは、１２０kDバンド及び二本の約９０kDの存在を明らかにし、ＭＩＴＦが、その分子量を増加させるＳＵＭＯ化を受けることを示唆する（図４Ａ）。外因性ＳＵＭＯタンパク質の添加は、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化の全体的なレベルを増加させたが、ウェスタンブロットでは、ＭＩＴＦは基礎条件においてもＳＵＭＯ化されることが明らかになり、９０kDの二本を示し、それにより、ＳＵＭＯ過剰発現の非特異的な効果が除かれる。Ｋ１８２Ｒ突然変異は、ＭＩＴＦのより高分子量の形態の完全な消失に導いたが、しかし、９０kDバンドに対する効果はほとんど有さなかった。コドン３１８がリジンに突然変異した場合、本発明者らは、ＭＩＴＦの全ての高分子量バンドのレベルにおけるかなりの低下を観察した。最後に、ＭＩＴＦの高分子量形態は、二重突然変異体を使用した場合には観察されなかった。同様の結果が、ＨＡ−ＳＵＭＯ−２の共発現を用いて見られ（図４Ｂ）、野生型ＭＩＴＦがＳＵＭＯ−１又はＳＵＭＯ−２により修飾されること及びＥ３１８Ｋ突然変異がＳＵＭＯ−１及びＳＵＭＯ−２の両方の修飾に影響を与えることを実証している。ＭＩＴＦへのＳＵＭＯ−１結合を確認するために、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−１プラスミドを、単独で、又はＭＩＴＦコンストラクトを用いてトランスフェクトした。次に、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−１を含むタンパク質をＮｉ−ＴＦＡカラムで精製した。野生型ＭＩＴＦを用いてトランスフェクトした細胞において、抗ＭＩＴＦ抗体を用いたウェスタンブロットによって、約９０〜１２０kDで移動するＭＩＴＦのＳＵＭＯ化形態が明らかになった（図４Ｃ）。Ｋ１８２Ｒ突然変異がＭＩＴＦの１２０kDのＳＵＭＯ化形態に主に影響を与えたのに対し、ＳＵＭＯ化形態はＥ３１８Ｋ又は二重突然変異体を用いては見出されなかった。一緒に、これらの結果は、コドン３１６がＭＩＴＦ中の主要なＳＵＭＯアクセプター部位であること及びＥ３１８Ｋ突然変異がＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を劇的に低下させることを示す。
【００５１】
実施例４
Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦの局在を変化させ得、そしてその転写活性を変える
ＳＵＭＯ化は、部分的には、核−細胞質シグナル伝達及び転写を制御することにより、多くの細胞プロセスを組織化する。本発明者らは、低下したＳＵＭＯ化を伴うＥ３１８Ｋ突然変異体がＭＩＴＦの細胞局在を変化させうるか否かを研究した（図５Ａ）。抗ＭＩＴＦ抗体を用いた免疫蛍光染色では、Ｅ３１８Ｋ突然変異体、しかし、また、Ｋ１８２Ｒ及びＫ１８２Ｒ：Ｅ３１８Ｋ突然変異体が黒色腫細胞の核において検出されることが示されたが、それは野生型ＭＩＴＦの核局在と一致する。しかし、黒色腫及び腎臓癌細胞での免疫組織化学実験では、Ｅ３１８Ｋ突然変異体が核及び細胞質の両方の染色を示すことが明らかになった（図５Ｂ）。
【００５２】
【表６】
【００５３】
本発明者らは、また、ＳＶ４０最小プロモーターに連結されている３コピーのＭボックスを含む合成レポーターで、野生型対Ｅ３１８Ｋ突然変異体の活性を比較することにより、ＭＩＴＦの転写活性に対するＥ３１８Ｋ置換の可能性のある効果を探索した。Ｅ３１８Ｋ突然変異体は野生型よりも２〜３倍高い転写活性を有した（図５Ｃ）。二重突然変異体はＥ３１８Ｋ突然変異体よりもさらに活性であったが、単一突然変異体Ｋ１８２Ｒは野生型と同様の活性を有した。これらのデータは、ＳＵＭＯ化がＭＩＴＦの転写活性を低下させることを示す。本発明者らは、次に、ＭＥＴ及びＨＩＦ１Ａ（メラノサイト及び腎発癌に関与する２つのＭＩＴＦ標的遺伝子）に焦点を当て、生理学的プロモーターに対するＥ３１８Ｋ突然変異の効果をチェックした。野生型ＭＩＴＦ及びＥ３１８Ｋ突然変異体が、ＭＥＴプロモーターに対して同様の転写活性を有したのに対し（図２）、Ｅ３１８Ｋ突然変異体はＨＩＦ１Ａプロモーターに対して野生型よりも高い転写活性を有した。従って、ｐ．Ｅ３１８Ｋ突然変異は、ＨＩＦ１Ａの転写アップレギュレーションを通じてその発癌効果を発揮しうる。
【００５４】
実施例５
Ｅ３１８Ｋ突然変異は、あまり分化していない、より高度な増殖細胞の表現型を与える
【００５５】
色素の産生は、あまり分化していない増殖表現型と密接に相関する弱く着色した細胞とは対照的に、より遅い成長により特徴付けられるメラノサイト分化の特性の１つである。また、低酸素症及びＨＩＦ１Ａは、メラノサイトの生存、増殖、及び形質転換ならびに黒色腫の進行を維持する。したがって、本発明者らは、生殖系列突然変異を伴う患者の皮膚生検から単離されたメラノサイトが、２人の健常な突然変異陰性ドナーからのメラノサイトほど高度に着色していないことを見出した（その全て３人がコーカソイドであった）（図６）。ＭＩＴＦ転写は、２つの受容体シグナル伝達経路（メラノコルチン−１受容体（ＭＣ１Ｒ）を含む）により修飾される。最後に、野生型ＭＩＴＦと比較して、Ｅ３１８Ｋの発現は、不死化メラノサイト（図７Ａ、Ｍｅｌａｎ−ａ）、黒色腫細胞（図７Ｂ、Ａ３７５）、及びＶＨＬ欠損腎臓癌細胞（図７Ｃ、ＲＣＣ４）の成長を刺激した。一緒にすると、データは、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体が構成的成長の利点を与えることを示唆する。
【００５６】
材料及び方法
Melariskは、黒色腫傾向のある家族の固有レジストリ（ＭＥＬＡＲＩＳＫ）であり、１９８５年にInstitut Gustave Roussy（Avril教授）及びINSERM（Florence Demenais, U946）により開始され、皮膚科医（特に、２００５年以降、Cochin University Hospital Center、Avril教授及びHospices Civils de Lyon、Thomas教授）及び癌遺伝学者の参加を伴った。生物学的材料は、ＩＧＦ癌感受性Biobankに保存されている（血液、凍結リンパ球、Genethonにより樹立されたリンパ芽球細胞株、ＤＮＡ）。黒色腫についての家族、人口統計学的、臨床的及びリスク因子のデータが数年にわたり収集されており、ＩＮＳＥＲＭユニットＵ９４６においてＭｙＳＱＬデータベース中に保存されている。
【００５７】
ＭＩＴＦの直接配列決定
ＭＩＴＦを配列決定するために使用されるプライマーを、以下の表に示す。増幅プロトコールは３５サイクル（９４℃、６０℃、及び７２℃での３０秒温度段階を伴う）から成った。
【００５８】
ＰＣＲ産物を、"Big Dye Terminator", version 3.0（Applied Biosystems, Foster City, California）を用いて、ABI Prism（登録商標） 3730 Genetic Analyzer（Applied Biosystems, Foster City, California）で配列決定した。
【００５９】
【表７】
【００６０】
MGB Taqmanプライマーを用いたＰＣＲによるＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異の遺伝子型決定
ＰＣＲ反応は、１０ngのゲノムＤＮＡを用いて、０．２μmol/LのMGB TaqManプライマー、野生型ＭＩＴＦ配列と完全に一致する（５′−ＶＩＣ−ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＡＡ ＧＡＡ ＣＣＣ Ｇ−３′−配列番号２９）又はＥ３１８Ｋ突然変異をコードするＭＩＴＦ配列と完全に一致する（５’−６−ＦＡＭ−ＣＡＡ ＧＣＡ ＡＡＡ ＡＣＣ ＣＧ−３’−配列番号３０）のいずれかの存在において行った。他の試薬の最終濃度は以下の通りであった：１ｘUniversal Master Mix（Applied）、０．４μmol/Lのセンスプライマー（５′−ＴＧＣＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴＣＧ−３′−配列番号３１）、０．４μmol/Lのアンチセンスプライマー（５′−ＧＧＴＣＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＣＡＡ−３′−配列番号３２）。ＰＣＲアンプリコンのサイズは６７bpであった。ＰＣＲサイクルを、ABI（商標）2720サーモサイクラーで以下の通りに行った：９５℃で１５分間；９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の３０サイクル。対立遺伝子識別はABI（商標）7900HT Fast Real Time PCRシステムでの最終的な蛍光測定により実施し、ABI（商標）SDS V2.3ソフトウェアを用いて分析した。野生型又はＥ３１８ＫのいずれかのＤＮＡサンプルが、各遺伝子型決定実験においてコントロールとして含まれた。遺伝子型決定した突然変異体サンプルを、ＭＩＴＦのエクソン９について、上に記載するプロトコール及びプライマーを使用した直接配列決定によりチェックした。
【００６１】
プラスミド
ＭＩＴＦ Ｍ形態コンストラクトｐＣＤＮＡ３−Ｍｉは以前に記載されている（７）。Ｋ１８２Ｒ及び／又はＥ３１８ＫでのＭＩＴＦの突然変異は、QuickChange方法（Stratagene）を使用し、それらの逆相補体を伴う以下のセンスプライマーを使用して生成した。Ｍｉ−Ｋ１８２Ｒ ５’−ｃｔｔｃｃｃａａｃａｔａａｇａａｇｇｇａｇｃｔｃａｃａｇｃ−３’（配列番号３３）；ＭＩ−Ｅ３１８Ｋ ５’−ｇｇａｔｃａｔｃａａｇｃａａａａａｃｃａｇｔｔｃｔｔｇａｇ−３’（配列番号３４）。突然変異の存在を配列決定により確認した。
【００６２】
Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１及びＨｉｓ−ＨＡ−ＳＵＭＯ２はM. A. Dejeanによりご厚意で提供され、以下の刊行物に記載されている（８）。
【００６３】
コトランスフェクション及びイムノブロット
６ウェルディッシュ中で成長させたＨＥＫ２９３細胞（１０４個細胞／ウェル）を、FuGENE 6（商標）（Roche Applied Science）を使用して、示したプラスミド（２μgの全ＤＮＡ／ウェル）を用いてトランスフェクションした。４８時間後、細胞をＰＢＳ中でリンスし、１×ローディングバッファー（４１．６mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１．５%ＳＤＳ、６．７%グリセロール）における９５℃での溶解が続き、追加の５分間にわたり煮沸した。
【００６４】
タンパク質を１０%ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動により分離し、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした。タンパク質を、ＥＣＬ（Amersham）及び抗ＭＩＴＦ（Abcam）、抗ＨＡタグ（Abcam）、抗ＳＵＭＯ１（Santa Cruz Biotech）、又は抗ＥＲＫ２（Santa Cruz Biotech）抗体を使用して検出した。
【００６５】
レポーターアッセイ
ヒト５０１ｍｅｌ及びマウスＢ１６細胞を２４ウェルプレート中に蒔き（２５ｘ１０３個細胞／ウェル）、次の日、細胞を、０．３μgのレポータープラスミド（ｐＨＩＦ１α及びｐＭｅｔ）、０．０５μgのｐＣＤＮＡ２ ＭＩＴＦ又は空ｐＣＤＮＡ２ベクター、２μgのリポフェクトアミン試薬（Invitrogen）、及び０．０５μgのｐＣＭＶβＧａｌ（トランスフェクション効率の変動を制御するため）を用いて一過性にトランスフェクションした。細胞を４８時間後に溶解し、ルシフェラーゼ及びβガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。トランスフェクションを少なくとも３通りに実施した。
【００６６】
免疫蛍光
ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルディッシュ中のガラスカバースリップ上に蒔き（１００ｘ１０３個細胞）、１０μlのリポフェクトアミンを使用して、３μgのｐＣＤＮＡ３ ＭＩＴＦ又は空ｐｃＤＮＡ３ベクターを用いてトランスフェクションした。４８時間後、細胞を、ＰＢＳ中の４%パラホルムアルデヒドを用いて１０分間にわたり固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、０．１%Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１%ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて２分間にわたり透過処理した。次に、サンプルをＰＢＳ中で１回洗浄し、５０mM ＮＨ４Ｃｌを用いて２分間にわたり処理し、次に、ＰＢＳ中で３回洗浄し、１%ＢＳＡ／ＰＢＳ中の抗ＭＩＴＦ抗体（Abcam）を用いて１時間にわたり染色した。サンプルを次にＰＢＳを用いて５分間にわたり３回洗浄し、１%ＢＳＡ中のAlexa-488結合ヤギ抗マウス抗体（Molcular Probes）を用いて１時間にわたり二次染色した。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて対比染色し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、Fluromount-G（Southern Biotech, Birmingham AL）を使用してマウントした。細胞を、落射蛍光照明を伴うZeiss Axiophot顕微鏡下で検証した。
【００６７】
メラニン含量の決定
約６ｘ１０６個のメラノサイトを、１０００gで５分間にわたる遠心分離によりペレット化し、リン酸緩衝液中で２回洗浄した。ペレットの画分を８０℃で１時間にわたり０．５%ＮａＯＨ中に溶解し、光学密度を４０５nmで測定した。他の画分を使用して、ＢＣＡ（商標）方法（Pierce）によりタンパク質含有量を決定した。メラニン含量をタンパク質濃度について補正し、コントロール細胞のパーセンテージ（１００%）として表した。
【００６８】
コロニー形成のテスト
ヒト黒色腫Ａ３７５細胞及びヒト腎臓癌ＲＣＣ４細胞（８０，０００個／ウェル）を、Fugene（Roche）を使用して、合計３μg ＤＮＡ／ウェル（野生型ＭＩＴＦ又はＥ３１８Ｋ）及び１０%ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏを用いてトランスフェクションした。ピューロマイシン（１μg/ml）を、トランスフェクションから４８時間後に培地に加えた。１４日後、細胞を固定し、０．４%クリスタルバイオレットを用いて染色し、プレートを写真撮影した。細胞を、また、ＰＢＳ中の１０%酢酸を用いて脱色し、細胞数を６１０nmの吸光度を測定することにより決定した。
【００６９】
免疫組織化学
カバースリップを脱蝋し、ホットAntigen Unmasking溶液（Vector Laboratories）中で抗原をアンマスキングした後、切片を０．３% Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳ中で１５分間にわたり透過処理し、次にＰＢＳ中で迅速にリンスした。内因性ペルオキシダーゼをブロックした後、切片を、ＰＢＳ／１%ＢＳＡ／５%ヤギ血清中で３０分間にわたり飽和させ、次に、ＰＢＳ／１% ＢＳＡ中の第１抗ＭＩＴＦ抗体クローンＣ５（１：１０又は１：１００希釈）を用いて４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ中でのリンス後、切片を、ＰＢＳ／１% ＢＳＡ中の第２ビオチン化抗体を用いて室温で１時間にわたりインキュベートした。切片を次にＰＢＳ中でリンスし、ＨＲＰアビジン／ビオチン溶液（ABC Elite kit, Vector Laboratories）中でインキュベートした。ＰＢＳ中でのリンス後、切片をペルオキシダーゼ基質（ＶＩＰキット、Vector Laboratories）の存在において明らかにした。最後に、スライドを、Mountex（Cell Path）を使用してマウントした。
【００７０】
【表８】
【技術分野】
【０００１】
本願は、医学の分野に、特に、癌の発生に対する素因を決定するものに関する。
【０００２】
癌の約５%において、オンコジーンを活性化する又は腫瘍抑制遺伝子（主要遺伝子又は強い効果遺伝子として公知である）を不活性化する構成的突然変異は、それらを保有する個人に癌を発生する高いリスク（＞５０%の生涯リスク）を与え、癌の家族性形態、若年齢発症を伴う癌、又は複数の原発癌に関与する。疾患の発現は、他の遺伝因子（修飾因子又は弱い効果遺伝子として公知である）又は環境因子の影響下で変動しうる。リスクのある個人を特定することは、それらに、予防及び早期検出を目的としたサーベイランスから利益を与える。一部の場合において、構成的な生殖系列突然変異は、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２生殖系列突然変異を伴う患者における抗ＰＡＲＰ処置の場合のように、抗癌治療を導くことができる（Hennessy B.T.J., JCO, 2010, 28, 3570-3576）。
【０００３】
黒色腫は、メラノサイトの悪性腫瘍である。それは皮膚癌の最も稀な形態の１つであるが、しかし、皮膚癌での死亡の大半を占める。長年の集中的な研究にもかかわらず、唯一の効果的な処置は、それが１mmを超える厚さに達する前での原発腫瘍の外科的切除である。ＷＨＯ報告によると、１年当たり約４８，０００例の黒色腫での死亡がある。一部の試験では、皮膚黒色腫を伴う患者は、乳癌、リンパ腫、又は腎臓癌を発生する増加リスクを有しうると推測されている。
【０００４】
黒色腫において、２つの強い効果遺伝子が今までに同定されている：ｐ１６ＩＮＫ４Ａ及びｐ１４ＡＲＦタンパク質をコードするＣＤＫＮ２Ａ、ならびにＣＤＫ４。主要な環境因子はＵＶ曝露である。公知の弱い効果遺伝子は、主に、皮膚色素沈着に関与するタンパク質をコードするものであり、ＭＣ１Ｒが今までに最も広く試験されている。３つの黒色腫症例を伴う家族の５０%において、感受性遺伝子は同定されていない。
【０００５】
この状況において、本発明者らは、黒色腫に対する素因となる候補遺伝子として、ＭＩＴＦ遺伝子、メラノサイトの主要な調節遺伝子（１）及びオンコジーン（２，３）を試験してきた。ＭＩＴＦは、メラノサイトの生存及び成長において主要な役割を果たすｂＨＬＨ−ＬＺファミリーからの転写因子である。ＭＩＴＦは、メラニン形成の調節に関与する。ＭＩＴＦの役割は、それが細胞増殖を誘導及び抑止する点で普通ではない。実際に、この因子は、一方では、終末メラノサイト分化及び／又は色素沈着のために、他方では、細胞増殖を誘導することによる悪性挙動のために必要である。ＭＩＴＦ遺伝子の構成的「機能喪失」突然変異は、常染色体優性疾患、例えばワーデンバーグ症候群及びティーツェ症候群など（聴覚喪失ならびに皮膚、髪、及び／又は虹彩の色素沈着異常により特徴付けられる）に関連付けられる。
【０００６】
ＭＩＴＦ遺伝子は、９つのエクソンを含む。６つのＭＩＴＦアイソフォームが同定されている。ヒトにおいて、それらは、一般的には、アイソフォーム１〜６として言及され、アイソフォーム４は、より一般には、アイソフォームＭとして公知である。マウスにおいて、文字の命名法を代わりに使用する。これらのアイソフォームは、特異的プロモーターにより転写される。また、それらは、それらのＮ末端領域により区別することができ、全てがエクソン２〜９を含むのに対し、エクソン１は各々のアイソフォームに特異的である（１）。アイソフォーム４は、より一般には、ＭＩＴＦ−Ｍとして公知であり、６個のアミノ酸の挿入により他のアイソフォームとは異なる。このアイソフォームは、メラノサイト又はｉｎ ｖｉｖｏ形質転換細胞（母斑、黒色腫など）又はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞株だけで検出されている。他のアイソフォームは、多くの組織及び細胞株において発現し、時折、組織特異性も伴う。
【０００７】
ＷＯ ００／４７７６５は、ＭＩＴＦ遺伝子の選択的スプライシングが、ｍｉｔｆ＋転写物及びｍｉｔｆ＋における６つの追加のアミノ酸の挿入により異なるタンパク質をコードするｍｉｔｆ−転写物を産生することを教示する。ｍｉｔｆ＋及びｍｉｔｆ−はそれぞれ健常及び腫瘍細胞において主に発現する。この特許出願は、従って、黒色腫のリスク及び処置を評価、予測、又はモニターするための半定量的方法を開示する。ＷＯ ０５／１１６２４９は、また、これらのＭＩＴＦスプライシングバリアントに基づく定量的方法を記載する。
【０００８】
本発明において、本発明者らは、ＭＩＴＦ遺伝子において再発性の生殖系列突然変異を同定し、本明細書においてＥ３１８Ｋ（アイソフォーム４の命名法に基づく）と名付けられ、それは癌に対する素因についてのマーカーとして有用である。
【０００９】
ＭＩＴＦ遺伝子（小眼球症関連転写因子）は当業者に周知であり、データベース（例えばＵＮＩＧＥＮＥ（Ｈｓ．１６６０１７）、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（４８９２）、及びＧｅｎｅＩＤ（４２８６）など）におけるその参照により特徴付けることができる。それは、また、ＭＩ、ＷＳ２Ａ、又はｂＨＬＨｅ３２と呼ばれる。
【００１０】
前記Ｅ３１８Ｋ突然変異は、ＭＩＴＦ遺伝子のエクソン９に、特にＨＧＶＳ命名法に従ったアイソフォームＭの位置９５２にマッピングされる。それは、コード配列におけるヌクレオチドＡによるヌクレオチドＧの置換（ｃ．９５２Ｇ＞Ａ）に対応し、リジンによるグルタミン酸の置換（ｐ．Ｇｌｕ３１８Ｌｙｓ）をもたらす。エクソン９は、全てのＭＩＴＦスプライシングバリアントに共通である。ＭＩＴＦ−Ｍアイソフォームにおいて、この残基は転写物の位置９５２にあり、位置３１８においてアミノ酸の突然変異をもたらす。用語「Ｅ３１８Ｋ突然変異」は、ＭＩＴＦアイソフォームにおけるその位置にかかわらず、突然変異を指定する。特に、突然変異ヌクレオチドの位置及び異なるスプライシングバリアント中のアミノ酸を以下に示す。
【００１１】
【表１】
【００１２】
ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の転写の活性化で野生型ＭＩＴＦよりも強力であり、腎臓発癌おいて主要な役割を果たすことが公知である（腎臓癌に対する素因となる遺伝子（例えばＶＨＬ、ＦＨ、ＳＤＨＢなど）の「機能喪失」突然変異を伴い二次的に活性化される）。さらに、この突然変異はＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下させて、それにより、恐らく、タンパク質の安定性又は標的遺伝子によりコードされるタンパク質の量に影響を与えることが示されている。実際に、アミノ酸Ｅ３１８は、ＭＩＴＦタンパク質中の２つのＳＵＭＯ化部位の１つの部分である。ＭＩＴＦ遺伝子は転写因子をコードするため、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体タンパク質は、その標的遺伝子の一部を持続的に活性化しうる。その突然変異は、ＭＩＴＦタンパク質の局在化又はその核−細胞質比率を変化させることも可能である。
【００１３】
本発明者らは、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体が、皮膚悪性黒色腫及び随伴性腎臓癌を伴う患者においてより高頻度であることを発見している。突然変異は、また、皮膚悪性黒色腫及び腎臓癌を発生した個人において、あるいは、親類における黒色腫及び腎臓癌の既往、又は、皮膚黒色腫及び別の癌、特に赤血球増加症もしくはリンパ腫を伴う家族においてより高頻度であると考えられる。この突然変異体は、健常なコントロール被験者において非常に低い頻度（２／２８４６被験者、即ち、第１コホートにおける０．０００７のヘテロ接合体の頻度、及び１１／１８２４被験者、即ち、第２コホートにおける０．００３のヘテロ接合体の頻度）で存在する。本発明者らは、ＭＩＴＦの非ＳＵＭＯ化形態が、あまり分化していないメラノサイト及びより高度な増殖細胞に導くことを示している。
【００１４】
さらに、この突然変異体は、また、神経堤において生じる１つ又は複数の腫瘍（例えば神経内分泌癌、肉腫、神経芽細胞腫、又は神経系腫瘍（ＮＳＴ）など）、あるいは、本発明者らの予備的結果に従った他の型の癌（例えばリンパ腫、肺癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、小児腫瘍、造血器悪性腫瘍、胃腸癌、赤血球増加症、又はこれらの型の癌の組み合わせなど）を発生している被験者においてより高頻度である可能性が高い。ＳＵＭＯ化部位は、古典的には、Ｗ−Ｋ−Ｘ−Ｅコンセンサスモチーフを含み、それにおいてＷは疎水性アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸である。ＭＩＴＦは、２つのＳＵＭＯ化部位を持つ：第１部位は配列ＩＫＲＥ（アイソフォーム１、２、３、４、５、及び６中のそれぞれ位置２８９、２７３、２８８、１８２、１８２、及び１２６におけるＫを伴う）を有し、第２部位は配列ＩＫＱＥ（アイソフォーム１、２、３、４、５、及び６中のそれぞれ位置４１７、４０１、４１６、３１６、３１０、及び２５４におけるＫを伴う）を有する。Ｋ１８２及びＫ３１６突然変異は、標的遺伝子メラスタチン／ＴＲＰＭの転写を増加させるが、しかし、タンパク質のＤＮＡ結合、局在化、又は安定性には影響しない（Miller AJ et al., JBC, 2005, 280: 146-155）。
【００１５】
本発明のＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体に関する教示は、ＳＵＭＯ化部位の１つで又は両方の部位でＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化を低下又は消失させる任意のＭＩＴＦ突然変異に一般化されうる。
【００１６】
従って、本発明は、被験者が、以下：皮膚悪性黒色腫、腎臓癌、甲状腺癌、肉腫、神経芽細胞腫、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される癌を発生する素因又は感受性を有するか否かを決定するための方法に関し、被験者からの生物学的サンプルにおいて、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させるＭＩＴＦ突然変異（小眼球症関連転写因子）の存在を決定することを含み、前記突然変異の存在は、被験者がそのような癌を発生する素因又は感受性を有することを示す。特定の実施態様において、著しくは、ＭＩＴＦ突然変異がＥ３１８Ｋ（すなわち、アイソフォーム４におけるＥ３１８Ｋ又はＬｙｓ残基による他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応するＧｌｕ残基の置換）である場合、癌は、皮膚悪性黒色腫、又は皮膚悪性黒色腫及び別の癌、特に、神経内分泌癌、肉腫、神経芽細胞腫又は神経系腫瘍（ＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、小児腫瘍、造血器悪性腫瘍、胃腸癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される癌との組み合わせである。癌は、また、腎臓癌、甲状腺癌、肉腫、神経芽細胞腫、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせの間より選択してもよい。特定の実施態様において、組み合わせは、皮膚悪性黒色腫及び腎臓癌の組み合わせである。
【００１７】
好ましくは、突然変異は、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化部位の１つ又は両方の部位のリジン残基及び／又はグルタミン酸残基の置換である。例えば、突然変異は、他の１９アミノ酸のいずれかによる、以下の表より選択される残基の置換である。
【００１８】
【表２】
【００１９】
より具体的には、リジン残基が他の１９アミノ酸のいずれかにより置換されてもよく；及び／又は、グルタミン酸残基が他の１９アミノ酸のいずれかにより置換されてもよい。
【００２０】
好ましくは、この方法は、他の１９アミノ酸のいずれかによる、「Ｋ３１６」残基（すなわち、アイソフォーム４におけるＫ３１６又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応するＬｙｓ残基）及び／又は「Ｅ３１８」残基（すなわち、アイソフォーム４におけるＥ３１８又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応するＧｌｕ残基）の置換を検出することを含む。
【００２１】
好ましい実施態様において、この方法は、他の１９アミノ酸のいずれかによる、「Ｅ３１８」残基（すなわち、アイソフォーム４におけるＥ３１８又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応するＧｌｕ残基）の置換を検出することを含む。さらにより好ましい実施態様において、この方法は、「Ｅ３１８Ｋ」突然変異（すなわち、アイソフォーム４におけるＥ３１８Ｋ又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおけるＬｙｓ残基による対応するＧｌｕ残基の置換）を検出することを含む。
【００２２】
突然変異は、タンパク質又は核酸レベルで検出してもよい。ＭＩＴＦ遺伝子又はその転写物（ｍＲＮＡ）において以前に定義されたような突然変異を同定するための方法は、当業者に周知であり、特に、限定しないが、配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、及び／又は選択的増幅を含む。核酸レベルでは、検出は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡのサンプルで行ってもよい。
【００２３】
特に、ＭＩＴＦの配列決定は、完全又は部分的でありうる。実際に、この方法は、単に、突然変異していると疑われる残基を含む領域の配列決定及びさらにこの特定の残基だけの配列決定を含みうる。
【００２４】
選択的ハイブリダイゼーションは、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡが、突然変異体ＭＩＴＦに特異的なプローブ、及び、場合により、前記突然変異を持たないＭＩＴＦ又は野生型ＭＩＴＦに特異的なプローブの存在において配列されることを意味すると理解される。プローブは、懸濁液中にありうる又は基質上に固定化されうる。典型的には、プローブは、より簡単な検出のために標識される。特に、プローブは、８〜１０００ヌクレオチド、好ましくは１０〜８００又は１５〜５０ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。
【００２５】
核酸は、突然変異の検出前に増幅してもよい。例えば、検出される突然変異の位置に隣接する（すなわち、上流又は下流）領域に特異的なプライマー対を構築する。典型的には、プライマーは、５〜６０ヌクレオチド、好ましくは８〜２５ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。完全な相補性が好ましい。なぜなら、それによって高い特異性が確実になるからである。しかし、一部のミスマッチが許容されうる。一度、ＭＩＴＦ遺伝子又は突然変異を含むエクソン、あるいはその転写物のその他の１つが増幅されれば、アンプリコンは、配列決定又は特異的ハイブリダイゼーションにより、あるいは当業者に公知の任意の他の適した方法により突然変異の存在を検出するために使用される。突然変異は、また、融解曲線分析により検出されうる（例えば、ＷＯ２００７／０３５８０６を参照のこと）。
【００２６】
突然変異の存在は、また、突然変異体の選択的増幅により検出されうる。例えば、プライマー対を調製し、プライマーの１つは、検出される突然変異を保有する配列と特異的にハイブリダイズする。前記プライマーは、配列が突然変異ヌクレオチドを保有する場合にだけ、増幅を開始する、又は、その標的にハイブリダイズすることができる。その結果、アンプリコンの存在は、ＭＩＴＦがテストされた突然変異を持つことを示しうるのに対し、前記アンプリコンの非存在は、ＭＩＴＦがこの突然変異を持たないことを示しうる。
【００２７】
これらの方法は、ＳＵＭＯ化部位のいくつかの突然変異と同時に又は並列して検出するために当業者により容易に適応されうることを理解しなければならない。このように、この方法は、ＭＩＴＦアイソフォーム４におけるＫ１８２、Ｅ１８４、Ｋ３１６、及びＥ３１８からなる群より選択される残基又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応する残基の置換をコードする１つ又は複数の突然変異の検出を許しうる。
【００２８】
突然変異をタンパク質レベルで検出する場合、この方法では、検出される突然変異を持つＭＩＴＦ及び前記突然変異を持たないＭＩＴＦの間で区別することができる抗体が使用される。特に、生物学的サンプルを、検出される突然変異を持つＭＩＴＦに対して向けられる抗体と接触させ、免疫複合体の存在を検出する。様々な方法が前記免疫複合体の検出を可能にする（例えばＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）など）。「抗体」は、また、この突然変異を持たないＭＩＴＦと比較して、検出されるＭＩＴＦ突然変異体に特異的に結合する能力を保存している任意の抗体フラグメント及び誘導体を指す。ここで再び、これらの方法は、１つ又は複数のＳＵＭＯ化部位のいくつかの突然変異と同時の又は並列した検出のために当業者により簡単に適応されうる。このように、この方法は、ＭＩＴＦアイソフォーム４におけるＫ１８２、Ｅ１８４、Ｋ３１６、及びＥ３１８からなる群より選択される残基又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応する残基の１つ又は複数の置換の検出を可能にしうるが、例えば、これらの置換の１つ又は複数を持つ各ＭＩＴＦ突然変異体について特異的な抗体の組み合わせの助けを用いる。
【００２９】
あるいは、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させる突然変異は、間接的な様式においてタンパク質レベルで検出されうる。例えば、突然変異の存在は、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化、野生型ＭＩＴＦタンパク質と比べた、ＳＵＭＯ化の低下（突然変異の存在を示す）を測定することにより検出されうる。実施例では、前記ＳＵＭＯ化をどのように測定するのかを記載する。同様に、ＳＵＭＯ化を低下させる突然変異は、突然変異体ＭＩＴＦタンパク質が安定化され、従って、免疫組織化学又は免疫蛍光により組織切片において検出可能である。突然変異の又はＳＵＭＯ化の存在／非存在の検出は、また、質量分析（ＷＯ／２００５／００３３９０）により行ってもよい。
【００３０】
本発明の特に興味深い実施態様において、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化は、免疫組織化学又は免疫蛍光により検出したＭＩＴＦの細胞局在を決定することにより間接的に測定される。実際には、驚くべきかつ高度に独創的な様式において、ＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化の低下は、腫瘍細胞における免疫組織化学により目に見えるＭＩＴＦタンパク質の細胞局在の変化を起こす。野生型タンパク質は核だけに又は主に核に位置するのに対し、タンパク質のＳＵＭＯ化を低下させる突然変異（特にＥ３１８Ｋ突然変異）を持つタンパク質は、核及び細胞質の両方に位置する。このように、本発明は、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下させる突然変異が、免疫組織化学によりＭＩＴＦの細胞局在を決定することにより検出される方法に関し、核局在は野生型ＭＩＴＦタンパク質を示し、細胞質局在はＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下させる突然変異を持つＭＩＴＦタンパク質（特にＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体）を示す。突然変異は、また、組織における免疫組織化学又は免疫蛍光によりＭＩＴＦタンパク質の検出を可能にしうるが、ここで、野生型タンパク質はこれらの同じ方法により検出不可能である。
【００３１】
突然変異は、任意のＭＩＴＦアイソフォームにおいて検出されうる。特定の実施態様において、突然変異はアイソフォーム４において検出される。
【００３２】
本発明の精神において、用語「被験者」は哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【００３３】
本発明の精神において、用語「生物学的サンプル」は、健常組織又は腫瘍組織のサンプル、例えば、生検及び特に、皮膚、腎臓、甲状腺、肺の生検、あるいは生物学的液体、例えば、血液、脳脊髄液、尿、又はリンパ液のサンプルを指す。好ましくは、生物学的サンプルは血液サンプルである。本発明の方法は、生物学的サンプルを回収する予備工程を含みうる。
【００３４】
本発明の方法は、また、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させる突然変異の検出に加えて、癌に対する素因についての他のマーカーの検出を包含することを理解しなければならない。
【００３５】
本発明は、また、被験者が、以下のリストより選択される癌を発生する素因又は感受性を有するか否かを決定するための診断キットを調製するためにＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させる突然変異を検出するための手段の使用に関する：皮膚悪性黒色腫、神経内分泌癌、肉腫、神経芽細胞腫又は神経系腫瘍（ＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、小児腫瘍、造血器悪性腫瘍、胃腸癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせ（前記突然変異の存在は、被験者がそのような癌を発生する素因又は感受性を有することを示す）。特定の実施態様において、癌は、皮膚悪性黒色腫、腎臓癌、甲状腺癌、肉腫、神経芽細胞腫、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましい様式において、癌は、皮膚悪性黒色腫、腎臓癌、及びそれらの組み合わせの間より選択される。検出の方法は、検出される突然変異を持つＭＩＴＦに特異的なプローブ、検出される突然変異を含むヌクレオチドセグメントの増幅を可能にするプライマー対、プライマー対（その１つが、検出される突然変異を保有する配列に特異的にハイブリダイズする）（それにより検出されるＭＩＴＦ突然変異体の選択的増幅を可能にする）、検出されるＭＩＴＦ突然変異体に対して向けられた抗体、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を検出及び測定するための手段、検出される突然変異を保有しないＭＩＴＦを検出するためのネガティブコントロール、又はそれらの組み合わせを含みうる又はそれらにある。特定の実施態様において、著しくは、ＭＩＴＦ突然変異がＥ３１８Ｋ（すなわち、アイソフォーム４におけるＥ３１８Ｋ又はＬｙｓ残基による他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応するＧｌｕ残基の置換）である場合、癌は、皮膚悪性黒色腫、又は皮膚悪性黒色腫及び別の癌、特に、神経内分泌癌、肉腫、神経芽細胞腫又は神経系腫瘍（ＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、小児腫瘍、造血器悪性腫瘍、胃腸癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される癌との組み合わせである。特定の実施態様において、癌は、皮膚悪性黒色腫、腎臓癌、甲状腺癌、肉腫、神経芽細胞腫、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましい様式において、癌は、皮膚悪性黒色腫、腎臓癌、及びそれらの組み合わせの間より選択される。
【００３６】
癌に対する素因又は感受性を検出することの関心は、被験者が臨床モニタリング又はサーベイランスから利益を得ることができ、早期段階での癌の検出を可能にし、従って、治癒の可能性を増加させることである。さらに、突然変異の検出は、患者の治療アルゴリズムを導く及び／又は処置の効力を増強することを可能にしうる。さらに、そのようにして同定された被験者は、また、予防的処置から利益を得ることができる。前記処置では、癌の発生を予防又は遅延させることが意図される。
【００３７】
このように、本発明は、また、予防的処置又は医学的サーベイランスから利益を得うる患者を選択するための方法に関し、本発明の方法により癌に対する患者の感受性を決定すること、及び、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させる突然変異を提示する被験者を選択することを含む。
【００３８】
問題の予防的処置は、ポリフェノール化合物を投与することを含みうる。実際に、特に、発酵した米殻からのポリフェノール化合物が、ＭＩＴＦタンパク質のレベルを低下させることが示されている（５）。このように、前記処置は、ＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化の低下及びその標的遺伝子に対するその機能的効果を相殺しうる（ＭＩＴＦは転写因子である）。さらに、紅茶からのポリフェノールは、細胞周期停止により及びプロアポトーシス機構により生じうる化学予防作用を有する（６）。従って、本発明は、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させるＭＩＴＦ突然変異を保有する被験者における癌の予防的処置における使用のためのポリフェノール化合物、及び、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させるＭＩＴＦ突然変異を保有する被験者における癌の予防的処置（化学予防）を意図する薬物を調製するためのポリフェノール化合物の使用に関する。本発明は、さらに、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させるＭＩＴＦ突然変異を保有する被験者にポリフェノール化合物の効果的な治療的用量を投与することを含む処置の方法に関し、それにより癌の発生を予防又は遅延させる。好ましくは、ポリフェノール化合物は、発酵させた米殻からのポリフェノール化合物又は紅茶からのポリフェノールである。特許出願ＷＯ０５／０９９７２１には、また、特にその抗酸化効果を通じた癌の予防のために有用な多くの他のポリフェノール化合物が記載されている。
【００３９】
本発明は、以下の実施例においてより明らかになり、それらは例証の目的のために与えられるが、しかし、限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１ａ】（図１ａ）ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋバリアントが同定された複数の黒色腫症例を伴う最初の家族の家系；（図１ｂ）黒色腫及び腎臓癌を伴う人における生殖系列突然変異（血液）の電気泳動図（図１ｂ）。
【図１ｂ】（図１ａ）ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋバリアントが同定された複数の黒色腫症例を伴う最初の家族の家系；（図１ｂ）黒色腫及び腎臓癌を伴う人における生殖系列突然変異（血液）の電気泳動図（図１ｂ）。
【図２】野生型ＭＩＴＦタンパク質と比較した、Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つＭＩＴＦタンパク質の存在におけるＨＩＦ１Ａ（しかし、ＭＥＴプロモーターではない）の転写活性化。
【図３】３１８Ｋ突然変異を持つＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化の低下。
【図４ａ】Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化を低下させる。図４ａ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１又はｐＳＧ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞を沸騰バッファー中に溶解し、各レーンの十分なローディングのためのコントロールに対してＭＩＴＦ及びＥＲＫ２についてウェスタンブロットによりテストした。図４ｂ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ２又はｐＳＧ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞をＭＩＴＦ及びＥＲＫ２についてのウェスタンブロットによりテストした。図４ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１又はｐＳｇ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞ライセートをＮｉ−ＮＴＡカラムで精製し、ＭＩＴＦについてのウェスタンブロットにより分析した（上パネル）。下パネルは、コントロールＭＩＴＦ発現及び各レーンの十分なローディングに対する、精製前の細胞ライセートのウェスタンブロットを示す。
【図４ｂ】Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化を低下させる。図４ａ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１又はｐＳＧ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞を沸騰バッファー中に溶解し、各レーンの十分なローディングのためのコントロールに対してＭＩＴＦ及びＥＲＫ２についてウェスタンブロットによりテストした。図４ｂ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ２又はｐＳＧ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞をＭＩＴＦ及びＥＲＫ２についてのウェスタンブロットによりテストした。図４ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１又はｐＳｇ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞ライセートをＮｉ−ＮＴＡカラムで精製し、ＭＩＴＦについてのウェスタンブロットにより分析した（上パネル）。下パネルは、コントロールＭＩＴＦ発現及び各レーンの十分なローディングに対する、精製前の細胞ライセートのウェスタンブロットを示す。
【図４ｃ】Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦタンパク質のＳＵＭＯ化を低下させる。図４ａ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１又はｐＳＧ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞を沸騰バッファー中に溶解し、各レーンの十分なローディングのためのコントロールに対してＭＩＴＦ及びＥＲＫ２についてウェスタンブロットによりテストした。図４ｂ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ２又はｐＳＧ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞をＭＩＴＦ及びＥＲＫ２についてのウェスタンブロットによりテストした。図４ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミド及びｐＳＧ５Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１又はｐＳｇ５空ベクターを用いてコトランスフェクトした。細胞ライセートをＮｉ−ＮＴＡカラムで精製し、ＭＩＴＦについてのウェスタンブロットにより分析した（上パネル）。下パネルは、コントロールＭＩＴＦ発現及び各レーンの十分なローディングに対する、精製前の細胞ライセートのウェスタンブロットを示す。
【図５ａ】Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦの細胞局在に影響を与え、その転写活性を変えうる。図５ａ）ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし、抗ｍｙｃ抗体を用いて染色し、次にAlexafluor 594標識抗マウス抗体を用いて二次染色したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光分析。細胞核を、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。バーは１０μmを表す。図５ｂ）抗ＭＩＴＦ抗体を用いた黒色腫及び腎腫瘍組織の免疫組織化学染色（×２００）。野生型ＭＩＴＦを持つ黒色腫は核染色を示し、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ黒色腫は核及び細胞質染色を示す。野生型ＭＩＴＦを持つ腎臓癌組織は染色されないのに対し、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ腎臓癌組織は核及び細胞質染色を示す。図５ｃ）ＨＥＬ２９３細胞を、合成３×Ｍ−ボックスルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、及び、突然変異体もしくは野生型ＭＩＴＦ ｐＣＤＮＡ３コンストラクト又は空ｐＣＤＮＡ３ベクターを用いて一過性にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性をβガラクトシダーゼ活性に対して標準化し、その結果を無刺激細胞についての基礎ルシフェラーゼ活性を上回る倍刺激として表現した。
【図５ｂ】Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦの細胞局在に影響を与え、その転写活性を変えうる。図５ａ）ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし、抗ｍｙｃ抗体を用いて染色し、次にAlexafluor 594標識抗マウス抗体を用いて二次染色したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光分析。細胞核を、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。バーは１０μmを表す。図５ｂ）抗ＭＩＴＦ抗体を用いた黒色腫及び腎腫瘍組織の免疫組織化学染色（×２００）。野生型ＭＩＴＦを持つ黒色腫は核染色を示し、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ黒色腫は核及び細胞質染色を示す。野生型ＭＩＴＦを持つ腎臓癌組織は染色されないのに対し、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ腎臓癌組織は核及び細胞質染色を示す。図５ｃ）ＨＥＬ２９３細胞を、合成３×Ｍ−ボックスルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、及び、突然変異体もしくは野生型ＭＩＴＦ ｐＣＤＮＡ３コンストラクト又は空ｐＣＤＮＡ３ベクターを用いて一過性にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性をβガラクトシダーゼ活性に対して標準化し、その結果を無刺激細胞についての基礎ルシフェラーゼ活性を上回る倍刺激として表現した。
【図５ｃ】Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦの細胞局在に影響を与え、その転写活性を変えうる。図５ａ）ｍｙｃタグ付き野生型又は突然変異体ＭＩＴＦ（Ｋ１８２Ｒ；Ｅ３１８Ｋ；Ｋ１８２Ｒ／Ｅ３１８Ｋ Ｅ３１８Ｋ）をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし、抗ｍｙｃ抗体を用いて染色し、次にAlexafluor 594標識抗マウス抗体を用いて二次染色したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光分析。細胞核を、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。バーは１０μmを表す。図５ｂ）抗ＭＩＴＦ抗体を用いた黒色腫及び腎腫瘍組織の免疫組織化学染色（×２００）。野生型ＭＩＴＦを持つ黒色腫は核染色を示し、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ黒色腫は核及び細胞質染色を示す。野生型ＭＩＴＦを持つ腎臓癌組織は染色されないのに対し、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ腎臓癌組織は核及び細胞質染色を示す。図５ｃ）ＨＥＬ２９３細胞を、合成３×Ｍ−ボックスルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、及び、突然変異体もしくは野生型ＭＩＴＦ ｐＣＤＮＡ３コンストラクト又は空ｐＣＤＮＡ３ベクターを用いて一過性にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性をβガラクトシダーゼ活性に対して標準化し、その結果を無刺激細胞についての基礎ルシフェラーゼ活性を上回る倍刺激として表現した。
【図６】突然変異体メラノサイトはより明るい色素沈着を示す。細胞ペレット及び２人の健常ドナーのメラノサイトにおけるメラニン測定は、Ｅ３１８Ｋ突然変異を持つ患者の皮膚生検から単離されたメラノサイトと比較して（＊＊＊）有意差を示す（ｐ＜０．００１）。２人のドナー及び突然変異体保有者はコーカソイドであった。
【図７】Ｅ３１８Ｋ突然変異が成長の利点を与える。ｍｅｌａｎ−ａ不死化マウスからのメラノサイト（左）、ヒト転移性黒色腫Ａ３７５細胞株（中央）、及びヒト腎臓癌ＲＣＣ４細胞（右）を、空ベクター、又は野生型ＭＩＴＦ（Ｍｉ−ＷＴ）もしくは突然変異体ＭＩＴＦ（Ｍｉ−Ｅ３１８Ｋ）をコードするベクターを用いてトランスフェクトした。２週目の写真（上）及びクローンのクリスタルバイオレット染色／脱染後の吸光度を示す。
【００４１】
実施例
実施例１
本発明者らは、ＭＩＴＦ遺伝子（オンコジーン、従って、候補遺伝子と考えられる）を試験した。本発明者らは、最初に、全てのアイソフォームを配列決定することにより、黒色腫家族においてＭＩＴＦ遺伝子（３ｐ１４）中にカスパーゼ切断部位（抗アポトーシス効果）で突然変異があるか否かを試験した（４）。それらの予備結果によって、複数の黒色腫症例（２つの腎臓癌、３つの中枢神経系腫瘍、１つの肺癌及び１つの胃癌、母方の側からＥ３１８Ｋ突然変異が生じた）を伴い、１ｐ２２ハプロタイプの父方伝達を伴う、スペインバスクの家族（ＴＲＹ）におけるＭＩＴＦ−Ｍ ｃ．９５２Ｇ＞Ａ， ｐ．Ｇｌｕ３１８Ｌｙｓ（Ｅ３１８Ｋ）の生殖系列バリアントの存在が明らかになった。このバリアントは、１８０人のフランス人／コーカソイドの及び９６人のスペインバスクのコントロールにおいて存在しなかった（図１ａ及びｂ）。
【００４２】
Ｂ１６マウス黒色腫細胞において、本発明者らは、ＭＩＴＦバリアントｃ．９５２Ｇ＞Ａ，ｐ．Ｇｌｕ３１８Ｌｙｓ（Ｅ３１８Ｋ）が、ＨＩＦ１ａ遺伝子（しかし、ＭＥＴ遺伝子ではない）の転写を誘導する際に、野生型形態よりも活性であることを示した（図２）。本発明者らは、従って、ＨＩＦは、低酸素条件において、ＶＨＬの非存在における腎細胞の形質転換因子であると仮定した；ＶＨＬ（腫瘍抑制遺伝子の機能喪失突然変異）及びＭＥＴ（オンコジーンの活性化突然変異）は、腎臓癌に対する素因となる２つの遺伝子である；ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体により活性化されたＨＩ１ａＦは、従って、ＶＨＬの非存在と同じ効果を有しうる。本発明者らは、従って、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異が、ＭＥＬＡＲＩＳＫコホートの「黒色腫及び腎臓癌（散発症例）」サブグループの４／５５患者において存在し、２７６のコントロールにおいては存在しない（ｐ＝０．０００７）ことを示した。本発明者らは、次に、ＩＧＲ（Institut Gustave Roussy, Villejuif, France）の異なる生物学的サンプルのコレクションにおいてＥ３１８Ｋ突然変異体の頻度を研究した。この突然変異の他の保有者が同定された：若年性ＴＦＥ３転座関連腎臓癌を発生した女性（その母親が乳癌を有し、黒色腫が続いた）；３つの黒色腫及びリンパ腫を発生した女性；複数の黒色腫症例を伴う家族の指標症例；いくつかの黒色腫を発生した指標症例；結節性黒色腫を発生した２人の男性；黒色腫を発生した女性（その叔父の１人がＣＮＳＴを有した）；腎乳頭癌を発生した２人の男性；赤血球増加症を伴う男性。実際に、ＶＨＬは赤血球増加症に対する素因となる３つの遺伝子の１つである。
【００４３】
【表３】
【００４４】
実施例２
黒色腫及び腎細胞癌を伴う患者におけるＭＩＴＦ生殖系列突然変異の同定
共存する黒色腫及び腎臓癌に関連付けられる、ミスセンス置換ｐ．Ｅ３１８Ｋ（ＭＩＴＦアイソフォームＭ、ＮＭ＿０００２４８中のｃ．９５２Ｇ＞Ａ）に起因するＭＩＴＦバリアントの同定を確認するために、本発明者らは、共存する黒色腫及び腎細胞癌を伴う患者６２人における遺伝子の全コード配列、イントロン−エクソンの境界、及び８つの選択的プロモーターを配列決定した。この置換は６２人の患者中５人において観察された。このバリアントの頻度は、１８２４人の被験者のコントロール集団よりも有意に高い（４%対０．３%、ｐ＝９．７ｘ１０−５）。このように、ｐ．Ｅ３１８Ｋ保有者は、黒色腫及び腎細胞癌の両方を発生する１４倍高いリスクを有する（オッズ比＝１４．４６［９５%信頼区間：３．７９−４６．８２］）（表２）。このバリアントが黒色腫単独への感受性に影響を与えることを確認するために、本発明者らは、黒色腫を伴う７０４人の患者（黒色腫に対する素因であるＣＤＫＮ２Ａ及びＣＤＫ４突然変異について陰性であった）（黒色腫の家族歴を伴う４２２の独立した症例、多発性原発黒色腫を伴う２４２の散発症例、及び４０の散発性の結節性黒色腫を含む）を遺伝子型決定した（表２）。後者の症例をテストした。なぜなら、黒色腫及び腎細胞癌の両方を伴い、ｐ．Ｅ３１８Ｋ突然変異を保有する５人の患者中４人が少なくとも１つの結節性黒色腫（黒色腫の最も稀な組織型）を有したからである。ｐ．Ｅ３１８Ｋの頻度は、コントロールと比較して、黒色腫単独を伴う全ての患者において有意に高かった（１．３%対０．３%、ｐ＝４．５ｘ１０−５）。ｐ．Ｅ３１８Ｋ保有者は、黒色腫を発生する４倍を上回る増加リスク有した（オッズ比＝４．５７［９５%信頼区間：２．０５−１０．６８］）。この増加リスクは、散発性の多発性原発黒色腫患者に主に起因するように見えるのに対し（オッズ比＝７．１０［９５%信頼区間：２．６７−１８．６２］）、ｐ．Ｅ３１８Ｋの効果は、黒色腫家族からの黒色腫患者について（オッズ比＝２．７８［９５%信頼区間：０．９−７．９０］）又は結節性黒色腫を伴う患者について（オッズ比＝８．６７［９５%信頼区間：０．９１−４１．７０］）は有意ではなかった（表３）。しかし、これらの３つの群にわたるｐ．Ｅ３１８Ｋ対立遺伝子の頻度の均一性のテストでは、わずかにだけ有意であった（ｐ＝０．０６）。生物学的材料は、発端者がバリアントを保有した７つの黒色腫家族の３つにおける追加の罹患家族員について入手可能であった。これらの家族の各々において、ｐ．Ｅ３１８Ｋは黒色腫と同時分離した。あるいは、腎臓癌への感受性に対するｐ．Ｅ３１８Ｋの効果を検証するために、本発明者らは、腎細胞癌を伴う１８７人の患者においてこのバリアントを遺伝子型決定した。ｐ．Ｅ３１８Ｋの頻度もコントロールより腎臓癌を伴う患者において高く（１．３%対０．３%、ｐ＝０．０１）、ｐ．Ｅ３１８Ｋに関連付けられる腎臓癌のリスクにおける増加は、黒色腫単独について見られるものと同様であった（オッズ比＝４．５３［９５%信頼区間：１．２２−１４．３０］）（表２）。ｐ．Ｅ３１８Ｋ対立遺伝子頻度の不均一性の有意な実証は、患者の３群にわたりなかった（黒色腫＋腎細胞癌、黒色腫単独、腎細胞癌単独；ｐ＝０．０８）。全ての患者群を組み合わせることで、症例とコントロールの間でのｐ．Ｅ３１８Ｋ対立遺伝子頻度における差の有意性の程度が増加した（１．５%対０．３%、ｐ＝２．５ｘ１０−７）。全体的に、ｐ．Ｅ３１８Ｋ突然変異の保有者は、黒色腫、腎細胞癌、又はその両方を発生する５倍を上回る増加リスクを有した（オッズ比＝５．１７［９５%信頼区間：２．４９−１１．５２］）。
【００４５】
ｐ．Ｅ３１８Ｋが黒色腫及び腎臓癌以外の別の癌の同時発生に対する素因となるか否かを決定するために、研究者らは黒色腫及び別の原発腫瘍を伴う１７２人の患者を遺伝子型決定したが、しかし、いずれもｐ．Ｅ３１８Ｋ突然変異を保有しなかった（表２）。ｐ．Ｅ３１８Ｋと別の原発腫瘍との関連は稀な事象であるため、本発明者らは、より大きな系列を試験することを計画する。
【００４６】
【表４】
ＯＲ＝オッズ比；９５%ＣＩ＝９５%信頼区間；ｐ値＝テストの臨界確率；ＣＭ＝皮膚黒色腫；ＲＣＣ＝腎細胞癌。
＊全ての保有者はｐ．Ｅ３１８Ｋバリアントについてヘテロ接合である。
ａ５人の患者が明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）を発生し、５人の患者中４人が少なくとも１つの結節性黒色腫を発生し、５番目の患者が表在拡大型黒色腫（ＳＳＭ）を発生した。ｂ家族性黒色腫（特に、家族において少なくとも２人の確認された黒色腫症例を伴う）、４２２例；多発性原発黒色腫（ＭＰＭ）を伴う散発例、２４２例；散発性の結節性黒色腫、４０例。
ｃ１９人の保有者の内、７人は家族性症例であり、９人は散発性ＭＰＭ症例であり、２人は散発性の結節性黒色腫症例である。
ｄ明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）、５４の散発例；乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣ）、５５例（Ｉ型を伴う２２例、ＩＩ型を伴う３０例、及び不明の組織学的サブタイプを伴う３例）；混合性の腎細胞癌表現型（特に、乳頭状及び明細胞）、２例；小児腎細胞癌、５例；不明の組織学的サブタイプを伴う腎細胞癌、７１例。
ｅ５人の保有者の内、１人は明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）であり、２人はＩＩ型乳頭状腎細胞癌であり、１人は体細胞転座ｔ（Ｘ；１７）（ｐ１１；ｑ２５）を伴う若年性癌であり、１人はＩ型乳頭状腎細胞癌である。
ｆ乳癌、９７例；脳癌、２７例；甲状腺非髄様癌、２８例；結腸癌、１０例；他の癌（精巣、子宮、卵巣、前立腺、肉腫、及び子宮内膜）、１０例。
黒色腫単独、腎細胞癌単独、及び２つの組み合わせの間での対立遺伝子頻度の均一性のテスト：ｐ＝０．０７８（直接検定）
【００４７】
【表５】
黒色腫単独の３つのカテゴリー（家族性、ＭＰＭ、結節性）の間での対立遺伝子頻度の均一性のテスト：ｐ＝０．０６５（直接検定）。家族性対ＭＰＭを比較する均一性のテスト：ｐ＝０．０７２（直接検定）
【００４８】
実施例３
ＭＩＴＦ ｐ．Ｅ３１８Ｋ突然変異の機能的効果
このＥ３１８Ｋ突然変異は、タンパク質の２つのＳＵＭＯ化部位（ＷＫＸＥモチーフ、２つの部位Ｋ１８２及びＫ３１６）の１つに位置付けられる。本発明者らは、Ｅ３１８Ｋ突然変異の存在におけるＭＩＴＦのＳＵＭＯ化における低下を実証している（図３）。
【００４９】
より具体的には、本発明者らは、部位特異的突然変異誘発によりＥ３１８Ｋバリアントを産生している。また、本発明者らは、Ｋ１８２Ｒバリアント及びＫ１８２Ｒ：Ｅ３１８Ｋ二重突然変異体も調製している。
【００５０】
Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−１と野生型ＭＩＴＦとの共発現後、抗ＭＩＴＦ抗体を使用した全抽出物でのウェスタンブロットは、１２０kDバンド及び二本の約９０kDの存在を明らかにし、ＭＩＴＦが、その分子量を増加させるＳＵＭＯ化を受けることを示唆する（図４Ａ）。外因性ＳＵＭＯタンパク質の添加は、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化の全体的なレベルを増加させたが、ウェスタンブロットでは、ＭＩＴＦは基礎条件においてもＳＵＭＯ化されることが明らかになり、９０kDの二本を示し、それにより、ＳＵＭＯ過剰発現の非特異的な効果が除かれる。Ｋ１８２Ｒ突然変異は、ＭＩＴＦのより高分子量の形態の完全な消失に導いたが、しかし、９０kDバンドに対する効果はほとんど有さなかった。コドン３１８がリジンに突然変異した場合、本発明者らは、ＭＩＴＦの全ての高分子量バンドのレベルにおけるかなりの低下を観察した。最後に、ＭＩＴＦの高分子量形態は、二重突然変異体を使用した場合には観察されなかった。同様の結果が、ＨＡ−ＳＵＭＯ−２の共発現を用いて見られ（図４Ｂ）、野生型ＭＩＴＦがＳＵＭＯ−１又はＳＵＭＯ−２により修飾されること及びＥ３１８Ｋ突然変異がＳＵＭＯ−１及びＳＵＭＯ−２の両方の修飾に影響を与えることを実証している。ＭＩＴＦへのＳＵＭＯ−１結合を確認するために、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−１プラスミドを、単独で、又はＭＩＴＦコンストラクトを用いてトランスフェクトした。次に、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−１を含むタンパク質をＮｉ−ＴＦＡカラムで精製した。野生型ＭＩＴＦを用いてトランスフェクトした細胞において、抗ＭＩＴＦ抗体を用いたウェスタンブロットによって、約９０〜１２０kDで移動するＭＩＴＦのＳＵＭＯ化形態が明らかになった（図４Ｃ）。Ｋ１８２Ｒ突然変異がＭＩＴＦの１２０kDのＳＵＭＯ化形態に主に影響を与えたのに対し、ＳＵＭＯ化形態はＥ３１８Ｋ又は二重突然変異体を用いては見出されなかった。一緒に、これらの結果は、コドン３１６がＭＩＴＦ中の主要なＳＵＭＯアクセプター部位であること及びＥ３１８Ｋ突然変異がＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を劇的に低下させることを示す。
【００５１】
実施例４
Ｅ３１８Ｋ突然変異はＭＩＴＦの局在を変化させ得、そしてその転写活性を変える
ＳＵＭＯ化は、部分的には、核−細胞質シグナル伝達及び転写を制御することにより、多くの細胞プロセスを組織化する。本発明者らは、低下したＳＵＭＯ化を伴うＥ３１８Ｋ突然変異体がＭＩＴＦの細胞局在を変化させうるか否かを研究した（図５Ａ）。抗ＭＩＴＦ抗体を用いた免疫蛍光染色では、Ｅ３１８Ｋ突然変異体、しかし、また、Ｋ１８２Ｒ及びＫ１８２Ｒ：Ｅ３１８Ｋ突然変異体が黒色腫細胞の核において検出されることが示されたが、それは野生型ＭＩＴＦの核局在と一致する。しかし、黒色腫及び腎臓癌細胞での免疫組織化学実験では、Ｅ３１８Ｋ突然変異体が核及び細胞質の両方の染色を示すことが明らかになった（図５Ｂ）。
【００５２】
【表６】
【００５３】
本発明者らは、また、ＳＶ４０最小プロモーターに連結されている３コピーのＭボックスを含む合成レポーターで、野生型対Ｅ３１８Ｋ突然変異体の活性を比較することにより、ＭＩＴＦの転写活性に対するＥ３１８Ｋ置換の可能性のある効果を探索した。Ｅ３１８Ｋ突然変異体は野生型よりも２〜３倍高い転写活性を有した（図５Ｃ）。二重突然変異体はＥ３１８Ｋ突然変異体よりもさらに活性であったが、単一突然変異体Ｋ１８２Ｒは野生型と同様の活性を有した。これらのデータは、ＳＵＭＯ化がＭＩＴＦの転写活性を低下させることを示す。本発明者らは、次に、ＭＥＴ及びＨＩＦ１Ａ（メラノサイト及び腎発癌に関与する２つのＭＩＴＦ標的遺伝子）に焦点を当て、生理学的プロモーターに対するＥ３１８Ｋ突然変異の効果をチェックした。野生型ＭＩＴＦ及びＥ３１８Ｋ突然変異体が、ＭＥＴプロモーターに対して同様の転写活性を有したのに対し（図２）、Ｅ３１８Ｋ突然変異体はＨＩＦ１Ａプロモーターに対して野生型よりも高い転写活性を有した。従って、ｐ．Ｅ３１８Ｋ突然変異は、ＨＩＦ１Ａの転写アップレギュレーションを通じてその発癌効果を発揮しうる。
【００５４】
実施例５
Ｅ３１８Ｋ突然変異は、あまり分化していない、より高度な増殖細胞の表現型を与える
【００５５】
色素の産生は、あまり分化していない増殖表現型と密接に相関する弱く着色した細胞とは対照的に、より遅い成長により特徴付けられるメラノサイト分化の特性の１つである。また、低酸素症及びＨＩＦ１Ａは、メラノサイトの生存、増殖、及び形質転換ならびに黒色腫の進行を維持する。したがって、本発明者らは、生殖系列突然変異を伴う患者の皮膚生検から単離されたメラノサイトが、２人の健常な突然変異陰性ドナーからのメラノサイトほど高度に着色していないことを見出した（その全て３人がコーカソイドであった）（図６）。ＭＩＴＦ転写は、２つの受容体シグナル伝達経路（メラノコルチン−１受容体（ＭＣ１Ｒ）を含む）により修飾される。最後に、野生型ＭＩＴＦと比較して、Ｅ３１８Ｋの発現は、不死化メラノサイト（図７Ａ、Ｍｅｌａｎ−ａ）、黒色腫細胞（図７Ｂ、Ａ３７５）、及びＶＨＬ欠損腎臓癌細胞（図７Ｃ、ＲＣＣ４）の成長を刺激した。一緒にすると、データは、ＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体が構成的成長の利点を与えることを示唆する。
【００５６】
材料及び方法
Melariskは、黒色腫傾向のある家族の固有レジストリ（ＭＥＬＡＲＩＳＫ）であり、１９８５年にInstitut Gustave Roussy（Avril教授）及びINSERM（Florence Demenais, U946）により開始され、皮膚科医（特に、２００５年以降、Cochin University Hospital Center、Avril教授及びHospices Civils de Lyon、Thomas教授）及び癌遺伝学者の参加を伴った。生物学的材料は、ＩＧＦ癌感受性Biobankに保存されている（血液、凍結リンパ球、Genethonにより樹立されたリンパ芽球細胞株、ＤＮＡ）。黒色腫についての家族、人口統計学的、臨床的及びリスク因子のデータが数年にわたり収集されており、ＩＮＳＥＲＭユニットＵ９４６においてＭｙＳＱＬデータベース中に保存されている。
【００５７】
ＭＩＴＦの直接配列決定
ＭＩＴＦを配列決定するために使用されるプライマーを、以下の表に示す。増幅プロトコールは３５サイクル（９４℃、６０℃、及び７２℃での３０秒温度段階を伴う）から成った。
【００５８】
ＰＣＲ産物を、"Big Dye Terminator", version 3.0（Applied Biosystems, Foster City, California）を用いて、ABI Prism（登録商標） 3730 Genetic Analyzer（Applied Biosystems, Foster City, California）で配列決定した。
【００５９】
【表７】
【００６０】
MGB Taqmanプライマーを用いたＰＣＲによるＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異の遺伝子型決定
ＰＣＲ反応は、１０ngのゲノムＤＮＡを用いて、０．２μmol/LのMGB TaqManプライマー、野生型ＭＩＴＦ配列と完全に一致する（５′−ＶＩＣ−ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＡＡ ＧＡＡ ＣＣＣ Ｇ−３′−配列番号２９）又はＥ３１８Ｋ突然変異をコードするＭＩＴＦ配列と完全に一致する（５’−６−ＦＡＭ−ＣＡＡ ＧＣＡ ＡＡＡ ＡＣＣ ＣＧ−３’−配列番号３０）のいずれかの存在において行った。他の試薬の最終濃度は以下の通りであった：１ｘUniversal Master Mix（Applied）、０．４μmol/Lのセンスプライマー（５′−ＴＧＣＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴＣＧ−３′−配列番号３１）、０．４μmol/Lのアンチセンスプライマー（５′−ＧＧＴＣＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＣＡＡ−３′−配列番号３２）。ＰＣＲアンプリコンのサイズは６７bpであった。ＰＣＲサイクルを、ABI（商標）2720サーモサイクラーで以下の通りに行った：９５℃で１５分間；９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の３０サイクル。対立遺伝子識別はABI（商標）7900HT Fast Real Time PCRシステムでの最終的な蛍光測定により実施し、ABI（商標）SDS V2.3ソフトウェアを用いて分析した。野生型又はＥ３１８ＫのいずれかのＤＮＡサンプルが、各遺伝子型決定実験においてコントロールとして含まれた。遺伝子型決定した突然変異体サンプルを、ＭＩＴＦのエクソン９について、上に記載するプロトコール及びプライマーを使用した直接配列決定によりチェックした。
【００６１】
プラスミド
ＭＩＴＦ Ｍ形態コンストラクトｐＣＤＮＡ３−Ｍｉは以前に記載されている（７）。Ｋ１８２Ｒ及び／又はＥ３１８ＫでのＭＩＴＦの突然変異は、QuickChange方法（Stratagene）を使用し、それらの逆相補体を伴う以下のセンスプライマーを使用して生成した。Ｍｉ−Ｋ１８２Ｒ ５’−ｃｔｔｃｃｃａａｃａｔａａｇａａｇｇｇａｇｃｔｃａｃａｇｃ−３’（配列番号３３）；ＭＩ−Ｅ３１８Ｋ ５’−ｇｇａｔｃａｔｃａａｇｃａａａａａｃｃａｇｔｔｃｔｔｇａｇ−３’（配列番号３４）。突然変異の存在を配列決定により確認した。
【００６２】
Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ１及びＨｉｓ−ＨＡ−ＳＵＭＯ２はM. A. Dejeanによりご厚意で提供され、以下の刊行物に記載されている（８）。
【００６３】
コトランスフェクション及びイムノブロット
６ウェルディッシュ中で成長させたＨＥＫ２９３細胞（１０４個細胞／ウェル）を、FuGENE 6（商標）（Roche Applied Science）を使用して、示したプラスミド（２μgの全ＤＮＡ／ウェル）を用いてトランスフェクションした。４８時間後、細胞をＰＢＳ中でリンスし、１×ローディングバッファー（４１．６mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１．５%ＳＤＳ、６．７%グリセロール）における９５℃での溶解が続き、追加の５分間にわたり煮沸した。
【００６４】
タンパク質を１０%ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動により分離し、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした。タンパク質を、ＥＣＬ（Amersham）及び抗ＭＩＴＦ（Abcam）、抗ＨＡタグ（Abcam）、抗ＳＵＭＯ１（Santa Cruz Biotech）、又は抗ＥＲＫ２（Santa Cruz Biotech）抗体を使用して検出した。
【００６５】
レポーターアッセイ
ヒト５０１ｍｅｌ及びマウスＢ１６細胞を２４ウェルプレート中に蒔き（２５ｘ１０３個細胞／ウェル）、次の日、細胞を、０．３μgのレポータープラスミド（ｐＨＩＦ１α及びｐＭｅｔ）、０．０５μgのｐＣＤＮＡ２ ＭＩＴＦ又は空ｐＣＤＮＡ２ベクター、２μgのリポフェクトアミン試薬（Invitrogen）、及び０．０５μgのｐＣＭＶβＧａｌ（トランスフェクション効率の変動を制御するため）を用いて一過性にトランスフェクションした。細胞を４８時間後に溶解し、ルシフェラーゼ及びβガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。トランスフェクションを少なくとも３通りに実施した。
【００６６】
免疫蛍光
ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルディッシュ中のガラスカバースリップ上に蒔き（１００ｘ１０３個細胞）、１０μlのリポフェクトアミンを使用して、３μgのｐＣＤＮＡ３ ＭＩＴＦ又は空ｐｃＤＮＡ３ベクターを用いてトランスフェクションした。４８時間後、細胞を、ＰＢＳ中の４%パラホルムアルデヒドを用いて１０分間にわたり固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、０．１%Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１%ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて２分間にわたり透過処理した。次に、サンプルをＰＢＳ中で１回洗浄し、５０mM ＮＨ４Ｃｌを用いて２分間にわたり処理し、次に、ＰＢＳ中で３回洗浄し、１%ＢＳＡ／ＰＢＳ中の抗ＭＩＴＦ抗体（Abcam）を用いて１時間にわたり染色した。サンプルを次にＰＢＳを用いて５分間にわたり３回洗浄し、１%ＢＳＡ中のAlexa-488結合ヤギ抗マウス抗体（Molcular Probes）を用いて１時間にわたり二次染色した。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて対比染色し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、Fluromount-G（Southern Biotech, Birmingham AL）を使用してマウントした。細胞を、落射蛍光照明を伴うZeiss Axiophot顕微鏡下で検証した。
【００６７】
メラニン含量の決定
約６ｘ１０６個のメラノサイトを、１０００gで５分間にわたる遠心分離によりペレット化し、リン酸緩衝液中で２回洗浄した。ペレットの画分を８０℃で１時間にわたり０．５%ＮａＯＨ中に溶解し、光学密度を４０５nmで測定した。他の画分を使用して、ＢＣＡ（商標）方法（Pierce）によりタンパク質含有量を決定した。メラニン含量をタンパク質濃度について補正し、コントロール細胞のパーセンテージ（１００%）として表した。
【００６８】
コロニー形成のテスト
ヒト黒色腫Ａ３７５細胞及びヒト腎臓癌ＲＣＣ４細胞（８０，０００個／ウェル）を、Fugene（Roche）を使用して、合計３μg ＤＮＡ／ウェル（野生型ＭＩＴＦ又はＥ３１８Ｋ）及び１０%ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏを用いてトランスフェクションした。ピューロマイシン（１μg/ml）を、トランスフェクションから４８時間後に培地に加えた。１４日後、細胞を固定し、０．４%クリスタルバイオレットを用いて染色し、プレートを写真撮影した。細胞を、また、ＰＢＳ中の１０%酢酸を用いて脱色し、細胞数を６１０nmの吸光度を測定することにより決定した。
【００６９】
免疫組織化学
カバースリップを脱蝋し、ホットAntigen Unmasking溶液（Vector Laboratories）中で抗原をアンマスキングした後、切片を０．３% Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳ中で１５分間にわたり透過処理し、次にＰＢＳ中で迅速にリンスした。内因性ペルオキシダーゼをブロックした後、切片を、ＰＢＳ／１%ＢＳＡ／５%ヤギ血清中で３０分間にわたり飽和させ、次に、ＰＢＳ／１% ＢＳＡ中の第１抗ＭＩＴＦ抗体クローンＣ５（１：１０又は１：１００希釈）を用いて４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ中でのリンス後、切片を、ＰＢＳ／１% ＢＳＡ中の第２ビオチン化抗体を用いて室温で１時間にわたりインキュベートした。切片を次にＰＢＳ中でリンスし、ＨＲＰアビジン／ビオチン溶液（ABC Elite kit, Vector Laboratories）中でインキュベートした。ＰＢＳ中でのリンス後、切片をペルオキシダーゼ基質（ＶＩＰキット、Vector Laboratories）の存在において明らかにした。最後に、スライドを、Mountex（Cell Path）を使用してマウントした。
【００７０】
【表８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が、皮膚悪性黒色腫、神経内分泌癌、肉腫、神経芽細胞腫又は神経系腫瘍（ＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、小児腫瘍、造血器悪性腫瘍、胃腸癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される癌を発生する素因又は感受性を有するか否かを決定するための方法であって、被験者からの生物学的サンプルにおいて、ＭＩＴＦ（小眼球症関連転写因子）のＳＵＭＯ化を低下又は消失させるＭＩＴＦにおける突然変異の存在を決定することを含み、該突然変異の存在は、被験者がそのような癌を発生する素因又は感受性を有することを示す、方法。
【請求項２】
ＭＩＴＦ突然変異がＭＩＴＦのＳＵＭＯ化部位の１つ又は両方の部位のリジン残基及び／又はグルタミン酸残基の置換である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
突然変異が他の１９アミノ酸のいずれかによる、以下の表
【表９】
より選択される残基の置換である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
突然変異がアイソフォーム４のＫ３１６又はＥ３１８のあるいは他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応する残基の置換である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
突然変異がアイソフォーム４のＥ３１８の又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応する残基の、好ましくはリジン残基による置換である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
突然変異がタンパク質又は核酸レベルで検出される、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
突然変異がＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を測定することにより間接的に検出され、野生型ＭＩＴＦタンパク質と比べたＳＵＭＯ化の低下がＥ３１８Ｋ突然変異の存在を示す、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
突然変異が免疫組織化学によりＭＩＴＦの細胞局在を決定することにより検出され、核局在が野生型ＭＩＴＦタンパク質を示しており、核及び細胞質局在がＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体タンパク質を示している、請求項７記載の方法。
【請求項９】
癌が、皮膚悪性黒色腫ならびに腎細胞癌、赤血球増加症、及びリンパ腫、好ましくは皮膚悪性黒色腫及び腎細胞癌の組み合わせの間より選択される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
癌の予防的処置又は癌の早期検出のための医学的サーベイランスから利益を得うる患者を選択するための方法であって、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法により癌に対する患者の感受性を決定すること、及び、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させる突然変異を保有する被験者を選択することを含む、方法。
【請求項１１】
癌の予防的処置がポリフェノール化合物を投与することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させる突然変異を保有する被験者における癌の予防的処置における使用のためのポリフェノール化合物。
【請求項１３】
ポリフェノール化合物が発酵させた米殻からのポリフェノール化合物又は紅茶からのポリフェノールである、請求項１１記載の方法又は請求項１２記載の化合物。
【請求項１】
被験者が、皮膚悪性黒色腫、神経内分泌癌、肉腫、神経芽細胞腫又は神経系腫瘍（ＮＳＴ）、リンパ腫、肺癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、小児腫瘍、造血器悪性腫瘍、胃腸癌、赤血球増加症、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される癌を発生する素因又は感受性を有するか否かを決定するための方法であって、被験者からの生物学的サンプルにおいて、ＭＩＴＦ（小眼球症関連転写因子）のＳＵＭＯ化を低下又は消失させるＭＩＴＦにおける突然変異の存在を決定することを含み、該突然変異の存在は、被験者がそのような癌を発生する素因又は感受性を有することを示す、方法。
【請求項２】
ＭＩＴＦ突然変異がＭＩＴＦのＳＵＭＯ化部位の１つ又は両方の部位のリジン残基及び／又はグルタミン酸残基の置換である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
突然変異が他の１９アミノ酸のいずれかによる、以下の表
【表９】
より選択される残基の置換である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
突然変異がアイソフォーム４のＫ３１６又はＥ３１８のあるいは他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応する残基の置換である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
突然変異がアイソフォーム４のＥ３１８の又は他のＭＩＴＦアイソフォームにおける対応する残基の、好ましくはリジン残基による置換である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
突然変異がタンパク質又は核酸レベルで検出される、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
突然変異がＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を測定することにより間接的に検出され、野生型ＭＩＴＦタンパク質と比べたＳＵＭＯ化の低下がＥ３１８Ｋ突然変異の存在を示す、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
突然変異が免疫組織化学によりＭＩＴＦの細胞局在を決定することにより検出され、核局在が野生型ＭＩＴＦタンパク質を示しており、核及び細胞質局在がＭＩＴＦ Ｅ３１８Ｋ突然変異体タンパク質を示している、請求項７記載の方法。
【請求項９】
癌が、皮膚悪性黒色腫ならびに腎細胞癌、赤血球増加症、及びリンパ腫、好ましくは皮膚悪性黒色腫及び腎細胞癌の組み合わせの間より選択される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
癌の予防的処置又は癌の早期検出のための医学的サーベイランスから利益を得うる患者を選択するための方法であって、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法により癌に対する患者の感受性を決定すること、及び、ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させる突然変異を保有する被験者を選択することを含む、方法。
【請求項１１】
癌の予防的処置がポリフェノール化合物を投与することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＭＩＴＦのＳＵＭＯ化を低下又は消失させる突然変異を保有する被験者における癌の予防的処置における使用のためのポリフェノール化合物。
【請求項１３】
ポリフェノール化合物が発酵させた米殻からのポリフェノール化合物又は紅茶からのポリフェノールである、請求項１１記載の方法又は請求項１２記載の化合物。
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５ａ】
【図７】
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図６】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５ａ】
【図７】
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図６】
【公表番号】特表２０１３−５１４７９８（Ｐ２０１３−５１４７９８Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４５３８８（Ｐ２０１２−５４５３８８）
【出願日】平成２２年１２月２１日（２０１０．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５２８５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８３２５３
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５９９０２９５４５）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＧＵＳＴＡＶＥ ＲＯＵＳＳＹ
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【出願人】（５１２１６３３６９）ユニヴェルシテ・ニース・ソフィア・アンティポリス (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＮＩＣＥ ＳＯＰＨＩＡ ＡＮＴＩＰＯＬＩＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２１日（２０１０．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５２８５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８３２５３
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５９９０２９５４５）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＧＵＳＴＡＶＥ ＲＯＵＳＳＹ
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【出願人】（５１２１６３３６９）ユニヴェルシテ・ニース・ソフィア・アンティポリス (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＮＩＣＥ ＳＯＰＨＩＡ ＡＮＴＩＰＯＬＩＳ
【Ｆターム（参考）】
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