癌の治療のためのＣＤＣＰ１に対する抗体
本発明は、癌の治療のためのＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合するヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療のための、ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合するヒトＣＤＣＰ１に対する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＣＤＣＰ１（（ＣＵＢドメイン含有タンパク質１、Ｂ３４５、ＣＤ３１８、ＳＩＭＡ１３５、ＴＲＡＳＫ；配列番号：１及び変異Ｒ５２５Ｑ（つまり、配列番号：１のアミノ酸位置５２５におけるアルギニン（Ｒ）のグルタミン（Ｑ）との置換）及び／又は変異Ｇ７０９Ｄ（つまり、配列番号：１のアミノ酸位置７０９におけるグリセリン（Ｇ）のアスパラギン酸（Ｄ）との置換)を含む変異体)は３つの細胞外ＣＵＢドメインを含む膜貫通タンパク質である。このタンパク質は乳癌、結腸癌及び肺癌において過剰発現することが見出されている。その発現レベルは癌細胞の転移能と相関している。それは癌細胞株においてチロシンリン酸化されることが示されている。（国際公開第2002/004508号; Scherl-Mostageer, M.等, Oncogene 20 (2001) 4402-8; Hooper, J., D.等, Oncogene 22 (2003) 1783-94; Perry, S., E.等 FEBS Lett. 581 (2007) 1137-42；Brown, T., A.等 J. Biol. Chem. 279 (2004) 14772-14783；Ota, T.等, Nat. Genet. 36 (2004) 40-45）。区別されるアイソフォームをコードする選択的スプライシング転写変異体が報告されている。
【０００３】
国際公開第２００２／００４５０８号は腫瘍関連抗原Ｂ３４５としてＣＤＣＰ１に言及している。国際公開第２００４／０７４４８１号は転移性腫瘍細胞に発現された糖タンパク質抗原ＳＩＭＡ１３５としてのＣＤＣＰ１に関している。国際公開第２００５／０４２１０２号は卵巣癌に関与するタンパク質としてのＣＤＣＰ１に関している。国際公開第２００７／００５５０２号はＣＤＣＰ１を標的とする疾患の治療方法及び組成物に関している。
【０００４】
米国特許出願公開第２００４／００５３３４３号（及びConze, T.等, Ann. N. Y. Acad. Sci. 996 (2003) 222-6及びBuehring, H.J.等, Stem Cells 22 (2004) 334-43）は同定のため及び／又はある種の幹細胞集団のためのＣＤＣＰ１抗体に関する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一態様は、癌の治療のためのＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。
【０００６】
本発明は、癌の治療のためのＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とし、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：７であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：８であり、
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：１５であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：１６であり、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：２３であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：２４であり、又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号：３１であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：３２である
ことを更に特徴とする抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【０００７】
本発明は、癌の治療のためのＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とし、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：９のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１０のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１１のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：１２のＣＤＲＬ１領域、配列番号：１３のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：１４のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：１７のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１８のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１９のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２０のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２１のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：２２のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：２５のＣＤＲＨ１領域、配列番号：２６のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：２７のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２８のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２９のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：３０のＣＤＲＬ３領域を含む
ことを更に特徴とする抗体を更に含む。
【０００８】
本発明は、上記抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする本発明に係る抗体を更に含む。
【０００９】
本発明の他の態様は、癌の治療のための、ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体を含有する薬学的組成物である。
【００１０】
本発明の他の態様は、癌の治療のための医薬の調製における、ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体の使用である。
【００１１】
本発明の他の態様は、癌に罹患している患者を、治療を必要とする該患者にＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体を投与することによって治療する方法である。
【００１２】
本発明は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：１５であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：１６であり、又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：２３であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：２４であり、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：３１であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：３２である
ことを特徴とする本発明に係る抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００１３】
本発明は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：９のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１０のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１１のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：１２のＣＤＲＬ１領域、配列番号：１３のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：１４のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：１７のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１８のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１９のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２０のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２１のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：２２のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：２５のＣＤＲＨ１領域、配列番号：２６のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：２７のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２８のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２９のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：３０のＣＤＲＬ３領域を含む
ことを特徴とする本発明に係る抗体を更に含む。
【００１４】
好ましくは、上記抗体は、上記抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする。本発明は上記抗体を含有する薬学的組成物を更に含む。本発明は、癌の治療のための医薬の調製のための上記抗体を更に含む。本発明は、癌に罹患している患者を、治療を必要とする上記患者に上記抗体を投与することによって治療する方法を更に含む。
【００１５】
本発明は本発明に係る抗体をコードする核酸を提供する。本発明は、原核生物又は真核生物宿主細胞中に上記核酸を発現可能な本発明に係る核酸を含む発現ベクター、及び本発明に係る抗体の組換え生産のためにかかるベクターを含む宿主細胞を更に提供する。
【００１６】
本発明は本発明に係るベクターを含む原核生物又は真核生物宿主細胞を更に含む。
【００１７】
本発明は、原核生物又は真核生物宿主細胞中に本発明に係る核酸を発現させ、上記細胞又は細胞培養上清から上記抗体を回収することを特徴とする、本発明に係る組換え抗体の製造方法を更に含む。本発明はかかる組換え方法によって得られる抗体を更に含む。
【００１８】
驚いたことに、ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体が、例えばＣＵＢ１（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５６９）のようなＣＤＣＰ１の他のエピトープに結合するＣＤＣＰ１抗体と比較して癌の治療に特に有用であることが今見出された。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
ＣＵＢ４抗体は、配列番号：７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号：８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有するＤＥ１０２４２１４６（ＥＰ１３９６５０１、ＵＳ７５４１０３０）からの寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１で寄託された抗体を意味する。上記ＣＵＢ４抗体はヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する。（番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１（ＤＳＭＺ）の寄託はEberhard-Karls-University Tuebingen, Univcrsitaetsklinikum Tuebingen, Geissweg 3 72076 Tuebingenによってなされた。）
【００２０】
本発明は、癌の治療のためのＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体を含む。
【００２１】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：７で、軽鎖可変ドメインが配列番号：８であることを特徴とする本発明に係る抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００２２】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：１５で、軽鎖可変ドメインが配列番号：１６であることを特徴とする本発明に係る抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００２３】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：２３で、軽鎖可変ドメインが配列番号：２４であることを特徴とする本発明に係る抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００２４】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：３１で、軽鎖可変ドメインが配列番号：３２であることを特徴とする本発明に係る抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００２５】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：９のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１０のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１１のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：１２のＣＤＲＬ１領域、配列番号：１３のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：１４のＣＤＲＬ３領域を含むことを特徴とする本発明に係る抗体を更に含み、又は
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：１７のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１８のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１９のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２０のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２１のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：２２のＣＤＲＬ３領域を含むことを特徴とする本発明に係る抗体を更に含み、又は
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：２５のＣＤＲＨ１領域、配列番号：２６のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：２７のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２８のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２９のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：３０のＣＤＲＬ３領域を含むことを特徴とする本発明に係る抗体を更に含む。
【００２６】
「抗体」なる用語は、限定されないが、全抗体、抗体断片を含む様々な形態の抗体構造を包含する。本発明に係る抗体は、好ましくは、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は本発明に係る特徴的性質が保持される限り更に遺伝子操作された抗体である。「抗体断片」は、完全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例は、ダイアボディ、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHuston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88に記載されている。加えて、抗体断片は、機能的抗原結合部位に対して、ＶＨドメインの、すなわちＶＬドメインと共にアセンブルし得、又はＣＤＣＰ１に結合するＶＬドメインの、すなわちＶＨドメインと共にアセンブルし得、それによって本発明に係る抗体の性質をもたらす特性を有する一本鎖ポリペプチドを含む。ここで使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」なる用語は単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を意味する。「ヒト化抗体」又は「抗体のヒト化型」なる用語は、フレームワーク及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのものと比較して異なった種の免疫グロブリンのＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）を含むように改変された抗体を意味する。好ましい実施態様では、マウスＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）がヒト抗体のフレームワーク領域中にグラフトされて、「ヒト化抗体」が調製される（例えばRiechmann, L.等, Nature 332 (1988) 323-327；及びNeuberger, M. S.等, Nature 314 (1985) 268-270を参照）。
【００２７】
ここで使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を意味する。
【００２８】
「キメラ抗体」なる用語は、通常は組換えＤＮＡ技術によって調製される、マウス由来の可変領域、すなわち結合領域と、異なる供給源又は種由来の定常領域の少なくとも一部を含むモノクローナル抗体を意味する。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。そのようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明によって包含される「キメラ抗体」の他の形態は、クラス又はサブクラスが元の抗体のものから改変され又は変化されたものである。そのような「キメラ」抗体はまた「クラススイッチ抗体」と称される。キメラ抗体を生産するための方法は、今は当該技術分野においてよく知られている一般的な組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を含む（例えば、Morrison, S.L.等, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５２０２２３８号及び第５２０４２４４号を参照のこと）。
【００２９】
ヒトＣＤＣＰ１（（ＣＵＢドメイン含有タンパク質１、Ｂ３４５、ＣＤ３１８、ＳＩＭＡ１３５、ＴＲＡＳＫ；配列番号：１及び変異Ｒ５２５Ｑ（つまり、配列番号：１のアミノ酸位置５２５におけるアルギニン（Ｒ）のグルタミン（Ｑ）での置換）及び／又は変異Ｇ７０９Ｄ（つまり、配列番号：１のアミノ酸位置７０９におけるグリセリン（Ｇ）のアスパラギン酸（Ｄ）での置換)を含む変異体)は３つの細胞外ＣＵＢドメインを含む膜貫通タンパク質である。このタンパク質は乳癌、結腸癌及び肺癌において過剰発現することが見出されている。その発現レベルは癌細胞の転移能と相関している。それは癌細胞株においてチロシンリン酸化されることが示されている。（国際公開第2002/004508号; Scherl-Mostageer, M.等, Oncogene 20 (2001) 4402-8; Hooper, J., D.等, Oncogene 22 (2003) 1783-94; Perry, S., E.等 FEBS Lett. 581 (2007) 1137-42; Brown, T., A.等 J. Biol. Chem. 279 (2004) 14772-14783; Ota, T.等, Nat. Genet. 36 (2004) 40-45）。区別されるアイソフォームをコードする選択的スプライシング転写変異体が報告されている。
【００３０】
「Ｋａｂａｔ番号付け」又は「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「ＥＵインデックス」なる用語は、別の記載がない限り、Kabat等（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）におけるＥＵインデックスを使用する、例えばＩｇＧ抗体中における、残基の番号付けとして定義される。
【００３１】
ここで使用される場合、「ヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する」とは、ヒトＣＤＣＰ１抗原に特異的に結合する抗体を意味する。結合親和性は、１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、好ましくは１．０×１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値のものである。結合親和性は、標準的な結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴技術（Biacore(登録商標)）を用いて決定される。よって、ここで使用される「ヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体」は、１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ（例えば１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ−１．０×１０−１３ｍｏｌ／ｌ、好ましくは１．０×１０−９ｍｏｌ／ｌ−１．０×１０−１２ｍｏｌ／ｌのＫＤ）の結合親和性をもってヒトＣＤＣＰ１抗原に結合する抗体を意味する。
【００３２】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：１５で、軽鎖可変ドメインが配列番号：１６であることを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００３３】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：２３で、軽鎖可変ドメインが配列番号：２４であることを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００３４】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：３１で、軽鎖可変ドメインが配列番号：３２であることを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００３５】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：９のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１０のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１１のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：１２のＣＤＲＬ１領域、配列番号：１３のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：１４のＣＤＲＬ３領域を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体を更に含む。
【００３６】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：１７のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１８のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１９のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２０のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２１のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：２２のＣＤＲＬ３領域を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体を更に含む。
【００３７】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：２５のＣＤＲＨ１領域、配列番号：２６のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：２７のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２８のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２９のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：３０のＣＤＲＬ３領域を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体を更に含む。
【００３８】
「エピトープ」なる用語は、抗体への特異的結合が可能であるヒトＣＤＣＰ１のタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピングからなり、通常はエピトープは特異的な三次元構造特性、並びに特異的な電荷特性を有する。コンフォメーション及び非コンフォメーションエピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われることで識別される。
【００３９】
ここで使用される「ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合する」なる用語は、抗体ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）が結合するＣＤＣＰ１上の同じエピトープに結合する本発明の抗ＣＤＣＰ１抗体を意味する。本発明の抗ＣＤＣＰ１抗体のエピトープ結合特性は当該技術分野で知られた技術を使用して決定されうる。ＣＤＣＰ１抗体はＣＤＣＰ１に対する試験抗体の結合を阻害する抗体ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の能力を決定するためにインビトロ競合結合阻害アッセイにおいて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって２５℃で測定される（図２を参照）。ＣＵＢ４と同じエピトープに結合する抗体の結合が阻害され、試験抗体の添加後に結合シグナルは検出されない。（例えば試験抗体の注入時（＝０秒）から１００秒後に、結合シグナルは注入時におけるシグナルほど高くない；シグナルはＲＵ（相対単位）で測定される）（例えばＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２、ＣＤＣＰ１−０１５，図３ａを参照）。ＣＵＢ４とは異なったエピトープに対する結合する抗体の結合は阻害されず、結合シグナルは試験抗体の添加後に検出される（例えば注入時（＝０秒）から１００秒後に、結合シグナルは注入時におけるシグナルより高い；シグナルはＲＵ（相対単位）で測定される）。これは、例えば実施例２に記載するように、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）によって調べることができる。
【００４０】
ここで使用される「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、抗体を抗原に結合させることに直接関与する軽鎖及び重鎖の対のそれぞれを示す。可変軽鎖及び重鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、配列が広く保存され、３個の「高頻度可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって連結される、４個のフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを採り、ＣＤＲは、βシート構造を連結するループを形成しうる。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって三次元構造に保持され、もう一方の鎖由来のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、よって本発明の更なる目的を提供する。
【００４１】
ここで使用される場合の「抗体の抗原結合部分」なる用語は、抗原結合が起因する抗体のアミノ酸残基を意味する。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。本発明の抗体の「抗原結合部分」なる用語は、抗原に対する結合部位の親和性に様々な度合いで寄与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含みうる。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲｓ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲｓ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲｓ）の度合いは、その領域が配列間の可変性に従って定義されているアミノ酸配列の編集されたデータベースとの比較によって決められる。
【００４２】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、ここで定義された高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端までドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)の標準的な定義に従って決定され、及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基である。
【００４３】
「核酸」又は「核酸分子」なる用語は、ここで使用される場合、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖でありうるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００４４】
この出願内で使用される「アミノ酸」なる用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を意味する。
【００４５】
本発明に係る抗体は、定常領域がヒト由来のものであり、好ましくはヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする。定常領域は、抗体の重鎖及び軽鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、及び場合によってはサブクラスＩｇＥの抗体の場合、抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含む。軽鎖定常領域は抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）はκ（カッパ）又はλ（ラムダ）でありうる。そのような定常鎖は従来からよく知られており、例えばKabat, E.A.によって記載されている (例えばJohnson, G.及びWu, T., T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照のこと)。例えば、ＩｇＧ１サブクラスの有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号：３のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号：４のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み；他の有用なヒト軽鎖定常領域は配列番号：５のλ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【００４６】
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗原への抗体の結合に直接的には関与していないが、様々なエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は当業者にはよく知られた用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体又は免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭというクラスに分類され、これらの幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分類されうる。重鎖定常領域によれば、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００４７】
抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＦｃレセプター結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞傷害性）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）に直接的に関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、殆どのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合によって開始される。補体系に対する抗体の影響はある種の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分において定義された結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は従来から知られており、例えばBoakle, R.J.等, Nature 282 (1979) 742-743；Lukas, T.J.等, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560；Brunhouse, R.及びCebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917；Burton, D.R.等, Nature 288 (1980) 338-344； Thommesen, J.E.等, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004；Idusogie, E.E.等, J. Immunol.164 (2000) 4178-4184；Hezareh, M.等, J. Virology 75 (2001) 12161-12168；Morgan, A.等, Immunology 86 (1995) 319-324; EP0307434によって記載されている。このような結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（Kabat, E.A.のＥＵインデックスによる番号付け、以下を参照）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は、通常、補体活性化及びＣ１ｑ及びＣ３結合を示す一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。
【００４８】
本発明に係る抗体は、ヒト起源由来のＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域の全ての他の部分を含む。ここで使用される場合、「ヒト起源由来のＦｃ部分」なる用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、好ましくは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラス由来の変異Ｆｃ部分（好ましくはＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａの変異を持つもの）、ヒトＩｇＧ４サブクラス由来のＦｃ部分又はヒトＩｇＧ４サブクラス由来の変異Ｆｃ部分（好ましくはＳ２２８Ｐの変異を持つもの）を示す。最も好ましいものは、ヒトＩｇＧサブクラス（例えば配列番号：３を参照）、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧサブクラス、ヒトＩｇＧサブクラス（例えば配列番号：６を参照）、又は変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラスのヒト重鎖定常領域である。
【００４９】
「抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）」なる用語は、エフェクター細胞の存在下での本発明に係る抗体によるヒト標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣは、好ましくは、新鮮に単離されたＰＢＭＣのようなエフェクター細胞又は単球もしくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は永久に増殖するＮＫ細胞株のようなバフィコート由来の精製エフェクター細胞の存在下でＣＤＣＰ１発現細胞調製物を本発明に係る抗体で処理することによって測定される。
【００５０】
「補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）」なる用語は、殆どのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始されるプロセスを意味する。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位における定まったタンパク質間相互作用によって引き起こされる。このようなＦｃ部分結合部位は従来から知られている（上記を参照）。このようなＦｃ部分結合部位は、例えばアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって特徴付けられる。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２，及びＩｇＧ３の抗体は、Ｃ１ｑ及びＣ３結合を含む補体活性化を通常示す一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化させず、Ｃ１ｑ及び／又はＣ３に結合しない。
【００５１】
モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能は、例えば、Umana, P. 等, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、及び米国特許第６６０２６８４号に記載されているように、それらのオリゴ糖成分を操作することにより亢進せしめることができる。ＩｇＧ１型抗体は、最も一般的に使用される治療用抗体であり、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に保存されたＮ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合する２つの二分複合オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋め込まれ、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成し、それらの存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）等のエフェクター機能を媒介する上で必須である（Lifely, M.R.等, Glycobiology 5 (1995) 813-822；Jefferis, R. 等, Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76；Wright, A.及び Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32）。Umana, P. 等（Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び国際公開第99/54342号は、二分オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における過剰発現が、抗体のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増大させることを示している。Ａｓｎ２９７糖鎖の組成の改変又はその消失は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑに対する結合にも影響を与える（Umana, P. 等, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180；Davies, J. 等, Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294；Mimura, Y. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547；Radaev, S. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483；Shields, R.L. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604；Shields, R.L. 等, J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740；Simmons, L.C. 等, J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147）。
【００５２】
モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能を亢進せしめる方法は、例えば国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Umana, P.等, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、国際公開第９９／１５４３４２号、国際公開第２００５／０１８５７２号、国際公開第２００６／１１６２６０号、国際公開第２００６／１１４７００号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００５／０１１７３５号、国際公開第２００５／０２７９６６号、国際公開第１９９７／０２８２６７号、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号、米国特許出願公開第２００５／００５４０４８号、米国特許出願公開第２００５／０１５２８９４号、国際公開第２００３／０３５８３５号及び国際公開第２０００／０６１７３９号又は例えばNiwa, R.等, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160；Shinkawa, T.等, J. Biol. Chem. 278 (2003) 3466-3473；国際公開第０３／０５５９９３号及び米国特許出願公開第２００５／０２４９７２２号に報告されている。
【００５３】
よって、本発明の一実施態様では、本発明に係る抗体は、（もしそれがＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのＦｃ部分を含むならば）Ａｓｎ２９７での糖鎖で（Ｋａｂａｔによる番号付け）上記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であるようにグリコシル化されている。他の実施態様では、上記糖鎖内のフコースの量は５％〜６５％、好ましくは２０％〜４０％である。別の実施態様では、フコースの量はＡｓｎ２９７におけるＦｃ領域のオリゴ糖の０％である。本発明において「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域のおよそ２９７位に位置するアミノ酸アスパラギンを意味する。抗体の軽微な配列変異に基づいて、Ａｓｎ２９７は、幾つかのアミノ酸（通常は、±３アミノ酸以下）を隔てて２９７位の上流又は下流に、つまり、２９４位と３００位の間に位置する場合がある。一実施態様では、本発明に係るグリコシル化抗体において、ＩｇＧサブクラスは、ヒトＩｇＧ１サブクラス、又はＩｇＧ３サブクラスのものである。更なる実施態様では、上記糖類内において、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）量は１％以下、及び／又はＮ末端α−１，３−ガラクトースの量は１％以下である。糖鎖は、好ましくはＣＨＯ細胞で組換的に発現される抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ結合型グリカンの特徴を示す。
【００５４】
「ＣＨＯ細胞で組換的に発現される抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ結合型グリカンの特徴を示す」という用語は、本発明に係る抗体のＡｓｎ２９７における糖鎖が、フコース残基を除き、例えば国際公開第２００６／１０３１００号に報告されたもののように、未修飾ＣＨＯ細胞に発現された同じ抗体のものとオース残基を除いて同じ構造及び糖残基を有していることを示している。
【００５５】
この出願中に使用される「ＮＧＮＡ」なる用語は、糖残基Ｎ−グリコリルノイラミン酸を意味する。
【００５６】
コアがフコシル化された二分岐複合オリゴ糖グリコシル化が２個までのＧａｌ残基で終端するので、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化はＡｓｎ２９７で生じる。ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのヒト重鎖定常領域は、上掲のKabat, E.A.等、及び Bruggemann, M. 等, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361；Love, T.W.等, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527に詳細に報告されている。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に依存して、Ｇ０、Ｇ１（α−１，６−又はα−１，３−）、又はＧ２グリカン残基と命名される（Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53）。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯ型のグリコシル化は、例えばRoutier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207に記載されている。非糖修飾ＣＨＯ宿主細胞に組換的に発現される抗体は、通常、Ａｓｎ２９７において、少なくとも８５％の量でフコシル化されている。抗体の修飾オリゴ糖はハイブリッド又は複合でありうる。好ましくは、二分岐の還元／非フコシル化オリゴ糖はハイブリッドである。他の実施態様では、二分岐の還元／非フコシル化オリゴ糖は複合である。
【００５７】
本発明によれば、「フコースの量」とは、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析法によって測定され、平均値として算出されるＡｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合、ハイブリッド及び高マンノース構造)の合計に関連した、Ａｓｎ２９７での糖鎖内の前記糖の量を意味する（例えば国際公開第２００８／０７７５４６号を参照）。フコースの相対量は、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦによる、Ｎ−グリコシダーゼＦで処理したサンプル中で同定された全ての糖鎖構造（例えば、複合、ハイブリッド及び高マンノース構造それぞれ）に対するフコース含有構造の割合である。
【００５８】
本発明に係る抗体は好ましくは組換え手段によって生産される。このような方法は従来から広く知られており、原核及び真核細胞におけるタンパク質の発現と続く抗体ポリペプチドの単離及び通常は薬物学的に許容可能な純度までの精製を含む。タンパク質の発現のためには、軽鎖及び重鎖をコードする核酸又はその断片が標準的な方法によって発現ベクター中に挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、又は大腸菌細胞等の適切な原核又は真核宿主細胞において実施され、抗体は細胞（上清又は溶解後の細胞）から回収される。
【００５９】
抗体の組換え生産は従来からよく知られており、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S.等, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880という概説論文に記載されている。
【００６０】
抗体は、全細胞中に、細胞可溶化物中に、又は部分的に精製され又は実質的な純粋な形態で存在しうる。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ分染法、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動法、及び当該技術分野でよく知られた他のものを含む標準的な技術によって、他の細胞性成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞性核酸又はタンパク質を除去するために実施される（Ausubel, F.等.(編), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照）。
【００６１】
ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M.等, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M.等, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270によって記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y.等, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9によって記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;及びNorderhaug, L.等, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87によって記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.J.,及びChristensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83及びSchlaeger, E.J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199によって記載されている。
【００６２】
原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核生物細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを使用することが知られている。
【００６３】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係で配されている場合、「作用可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に連結されており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に連結されており；又は、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されている場合、コード配列に作用可能に連結されている。一般に、「作用可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合は、近接し、かつ読み枠にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接していなくてもよい。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、一般的な手法に従って使用される。
【００６４】
モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等、一般的な免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、一般的な手順を使用し、容易に単離し配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源となりうる。ひとたび単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に挿入され得、これがついで宿主細胞、例えばそうでないと免疫グロブリンタンパク質を生産しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞に形質移入され、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成が達成される。
【００６５】
ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」という表現は相互に交換可能に用いられ、全てのそのような標記は子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語句は、初代対象細胞及び何度培養が継代されたかに関わらず初代のものから誘導された培養を含む。また、全ての子孫が、意図的な変異あるいは意図しない変異の影響で、ＤＮＡ含有物において正確に同一であるわけではないことも理解される。元々の形質転換細胞についてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。区別される標記が意図される場合は、文脈から明らかであろう。
【００６６】
ここで使用される「形質転換」なる用語は、宿主細胞中へのベクター／核酸のトランスファープロセスを意味する。恐るべき細胞壁障壁のない細胞が宿主細胞として使用される場合、形質移入は、例えばGraham, F., L.,及びvan der Eb, Virology 52 (1973) 456-467により記載されるようなリン酸カルシウム沈殿法により実施される。しかしながら、核注入又はプロトプラスト融合等による細胞中へのＤＮＡの導入のための他の方法がまた使用されうる。原核生物細胞又は実質的な細胞壁構成を含む細胞が使用される場合、例えば一つの形質移入法は、Cohen, S.N.等, PNAS 69 (1972) 2110-2114により記載される塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。
【００６７】
ここで使用される場合、「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡ（また、転写物とも称される）がその後ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。転写物及びコードされたポリペプチドは、集合的には、遺伝子産物と称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核生物細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【００６８】
「ベクター」とは、挿入される核酸分子を、宿主細胞中及び／又は宿主細胞間にトランスファーする核酸分子、特に自己複製する核酸分子である。該用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡの細胞中への挿入（例えば、染色体組込み）のために主に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。一を越える記載された機能を提供するベクターもまた含まれる。
【００６９】
「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞中に導入されると、転写され、ポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」とは、所望される発現産物を生じせしめるように機能しうる発現ベクターから構成される適切な宿主細胞を通常意味する。
【００７０】
本発明の一態様は、本発明に係る抗体を含有する薬学的組成物である。本発明の他の態様は、薬学的組成物の製造のための本発明に係る抗体の使用である。本発明の更なる態様は、本発明に係る抗体を含有する薬学的組成物の製造方法である。他の態様では、本発明は、薬学的担体と共に処方されて本発明に係る抗原結合タンパク質を含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。
【００７１】
ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する上記抗体は、例えばＣＵＢ１抗体（ＤＥ１０２４２１４６（ＥＰ１３９６５０１、ＵＳ７５４１０３０）からの寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５６９で寄託された抗体）のような他の抗ＣＤＣＰ１抗体と比較して癌の治療に対して特に有用であることが分かった。
【００７２】
従って、本発明の一態様は、癌の治療のための上記薬学的組成物である。
本発明の他の態様は、癌の治療のための医薬の製造のための本発明に係るヒト化抗体の使用である。
【００７３】
本発明の他の態様は、癌に罹患している患者を、かかる治療を必要とする上記患者に本発明に係るヒト化抗体を投与することにより治療する方法である。
【００７４】
ここで使用される場合、「薬学的な担体」は、生理学的に適合性のある任意の全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延化剤等を含む。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与（例えば注射又は注入による）に適している。
【００７５】
本発明の組成物は当該技術分野において知られている様々な方法によって投与することができる。当業者に理解されるように、投与の経路及び／又は態様は所望される結果に応じて変わる。ある投与経路によって本発明の化合物を投与するためには、その不活性化を防止するための材料で化合物を被覆し、又はそれと共に化合物を同時投与することが必要である場合がある。例えば、化合物はリポソーム又は希釈剤等の適切な担体で被験者に投与されうる。薬物学的に許容可能な希釈剤は、生理食塩水及び緩衝水溶液を含む。薬物学的な担体は、滅菌水溶液又は分散体、及び滅菌注射用溶液又は分散体の即時調製のための滅菌パウダーを含む。薬物学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は当該技術分野で知られている。
【００７６】
ここで使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」なる語句は、通常は注射による、経腸と局所投与以外の投与態様を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外、胸骨内への注射及び注入を含む。
【００７７】
ここで使用される「癌」なる用語は、例えば、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部もしくは頚部の癌、皮膚もしくは眼内メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌（stomach cancer、gastric cancer）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓もしくは尿道の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄腹腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病、例えば上記癌の何れかの難治性型、又は上記癌の一又は複数の組み合わせでありうる。好ましくは、そのような癌は、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌又は前立腺癌であり、より好ましくは肺癌である。好ましくは、そのような癌は、ＣＤＣＰ１発現又は過剰発現によって、より好ましくはＣＤＣＰ１過剰発現によって更に特徴付けられる。
【００７８】
これらの組成物は、アジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤をまた含みうる。上記の滅菌手順と、様々な抗菌剤や抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の添加の双方によって、微生物の存在を確実に防止できる。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を組成物中に含めることが望ましい場合がある。加えて、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有せしめることにより、注射可能な薬学的形態の長期吸収がもたらされうる。
【００７９】
選択される投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用されてもよい本発明の化合物、及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られた一般的な方法により、薬学的に許容可能な投薬形態に製剤化される。
【００８０】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して毒性とならないで、特定の患者、組成物、投与態様に対して、所望の治療応答を達成するのに効果的な活性成分量が得られるように変化させうる。選択される投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、投与経路、投与時間、用いられる特定化合物の排出率、治療期間、他の薬剤、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康及び先の医療歴、及び医学分野でよく知られた類似の要因を含む様々な薬物動態学的因子に依存するであろう。
【００８１】
組成物は、無菌で、組成物がシリンジにより送達可能な程度に流動的でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは等張緩衝生理食塩水である。
【００８２】
適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散体の場合は要求される粒子サイズを維持することにより、また界面活性剤を使用することにより維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマニトール又はソルビトール、及び塩化ナトリウムを含めることが好ましい。
【００８３】
次の実施例、配列表及び図面は本発明の理解を助けるために提供されるもので、発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神を逸脱しないで記載された手順に変更をなすことができることが理解される。
【００８４】
配列表の説明
配列番号：１ ヒトＣＤＣＰ１
配列番号：２ ヒトＣＤＣＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）含有断片：
配列番号：３ ヒト由来のＩｇＧ１定常重鎖領域
配列番号：４ ヒト由来のκ定常軽鎖領域
配列番号：５ ヒト由来のλ定常軽鎖領域
配列番号：６ ヒト由来のＩｇＧ４定常重鎖領域
配列番号：７ 重鎖可変ドメインＶＨ，ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）
配列番号：８ 軽鎖可変ドメインＶＬ，ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）
配列番号：９ 重鎖ＣＤＲＨ１，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１０ 重鎖ＣＤＲＨ２，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１１ 重鎖ＣＤＲＨ３，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１２ 軽鎖ＣＤＲＬ１，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１３ 軽鎖ＣＤＲＬ２，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１４ 軽鎖ＣＤＲＬ３，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１５ 重鎖可変ドメインＶＨ，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１６ 軽鎖可変ドメインＶＬ，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１７ 重鎖ＣＤＲＨ１，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：１８ 重鎖ＣＤＲＨ２，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：１９ 重鎖ＣＤＲＨ３，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：２０ 軽鎖ＣＤＲＬ１，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：２１ 軽鎖ＣＤＲＬ２，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：２２ 軽鎖ＣＤＲＬ３，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：２３ 重鎖可変ドメインＶＨ，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：２４ 軽鎖可変ドメインＶＬ，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：２５ 重鎖ＣＤＲＨ１，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
配列番号：２６ 重鎖ＣＤＲＨ２，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
配列番号：２７ 重鎖ＣＤＲＨ３，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
配列番号：２８ 軽鎖ＣＤＲＬ１，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５１０
配列番号：２９ 軽鎖ＣＤＲＬ２，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
配列番号：３０ 軽鎖ＣＤＲＬ３，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
配列番号：３１ 重鎖可変ドメインＶＨ，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
配列番号：３２ 軽鎖可変ドメインＶＬ，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４及びＣＵＢ１のヒト肺癌Ｈ３２２Ｍ異種移植片におけるインビボ腫瘍増殖阻害。
【図２】固定されたＣＵＢ４抗体、ＣＤＣＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、及び更なる抗ＣＤＣＰ１試験抗体（例えばＣＵＢ１及びＣＵＢ３）での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ−）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））の概略アッセイフォーマット。
【図３ａ】固定されたＣＵＢ４抗体、ＣＤＣＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、及び抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ１及びＣＵＢ３のＢｉａｃｏｒｅセンサグラム（ｘ軸＝時間；ｙ軸＝相対単位での応答（ＲＵ））。図３ａ：ＣＵＢ４抗体と同じＣＤＣＰ１上のエピトープへのＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２及びＣＤＣＰ１−０１５抗体の結合が示される。
【図３ｂ】固定されたＣＵＢ４抗体、ＣＤＣＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、及び抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ１及びＣＵＢ３のＢｉａｃｏｒｅセンサグラム（ｘ軸＝時間；ｙ軸＝相対単位での応答（ＲＵ））。図３ｂ：ＣＵＢ４抗体とは別のＣＤＣＰ１上のエピトープへのＣＵＢ１及びＣＵＢ３抗体の結合が示される。
【図４】ヒトＣＤＣＰ１細胞外ドメイン（ＣＤＣＰ１−ＥＣＤ）及びヒトＣＤＣＰ１−ＥＣＤのサブドメインに対する本発明に係るＣＤＣＰ１抗体の結合。
【図５ａ】ＨＣＴ１１６細胞におけるＣＤＣＰ１リン酸化の刺激。
【図５ｂ】ＨＣＴ１１６細胞におけるＣＤＣＰ１リン酸化の刺激。
【図６ａ】ＭＤＡＭＢ−２３１細胞におけるＣＤＣＰ１内部移行及びリン酸化の刺激。
【図６ｂ】ＭＤＡＭＢ−２３１細胞におけるＣＤＣＰ１内部移行及びリン酸化の刺激。
【図６ｃ】ＭＤＡＭＢ−２３１細胞におけるＣＤＣＰ１内部移行及びリン酸化の刺激。
【実施例】
【００８６】
実施例１
ＣＵＢ１抗体と比較した抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４のインビボ腫瘍増殖阻害
研究名：ＣＤＣＰ１＿ＰＺ＿Ｈ３２２Ｍ＿００２
本インビボ研究は、例えばＣＵＢ１のような他のエピトープに結合する抗体と抗ＣＤＣＰ１特異的抗体ＣＵＢ４の効能を比較するために実施した。
Ｈ３２２Ｍ非小細胞肺癌細胞は元々はＮＣＩコレクションから取得し、増殖後、Ｒｏｃｈｅ細胞バンク，Ｐｅｎｚｂｅｒｇに寄託した。腫瘍細胞株は５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下３７℃で、１０％の仔ウシ血清及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で常套的に培養した。継代４を細胞移植に使用した。
ヒト非小細胞肺癌細胞株Ｈ３２２Ｍをマウスの右側腹部中にマトリゲルと共に皮下的に接種した（５×１０６細胞）。
動物処置は細胞移植から１７日後のランダム化の日に開始した。抗体は、１０ｍｇ／ｋｇの示された投薬量で実験終了の６２日目に腹腔内でｑ７ｄで投与した。また対応するビヒクルを同じ日に投与した。投与体積は１０ｍｌ／ｋｇであった。
群：
処置群１：ビヒクル
処置群２：マウスＣＵＢ４ １０ｍｇ／ｋｇ腹腔内；
処置群３：マウスＣＵＢ１ １０ｍｇ／ｋｇ腹腔内；
【００８７】
ＴＧＩ（％での腫瘍増殖阻害）
次の表は、それぞれ平均及び中央値に基づいて各群及び時点に対して、１００−平均（Ｔ＿処置［ｘ日］−Ｔ＿処置［ベースライン］）／平均（Ｔ＿参照［ｘ日］−Ｔ＿参照［ベースライン］）＊１００として計算される腫瘍増殖阻害の値を示している。ＴＧＩ計算のための参照は「ビヒクル」群が選択された。結果をまた図１に示す。
【００８８】
ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）は、驚いたことに、ＣＵＢ１抗体（ＤＥ１０２４２１４６（ＥＰ１３９６５０１、ＵＳ７５４１０３０）からの寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５６９で寄託された抗体）よりも明らかに高い腫瘍増殖阻害を示している。
同様に、本発明に係る抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＤＣＰ１＿００４、ＣＤＣＰ１＿０１２及びＣＤＣＰ１＿０１５のインビボ腫瘍増殖阻害を決定することができる。
【００８９】
実施例２
エピトープ結合アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ）
異なった試験抗ＣＤＣＰ１抗体のエピトープ領域を決定するために、ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）を、アミンカップリング化学を使用してＣＭ５バイオセンサーチップの表面に固定した。フローセルを、０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び０．４Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの１：１混合物を用いて５μｌ／分の流量で活性化させた。抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）を、１２分、１０−３０μｇ／ｍｌで酢酸ナトリウムｐＨ４．５−５．０で注入し、これがおよそ１５０００ＲＵの表面密度を生じた。表面を、１Ｍのエタノールアミン／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を注入してブロックした。ヒトＣＤＣＰ１（配列番号：２）（分析物１）及び抗ＣＤＣＰ１抗体（分析物２）の可溶型ＥＣＤをＰＢＳＴ＋０．８ＭのＮａＣｌで希釈し、３０μｌ／分の流量で注入した。接触時間（結合相）は２５０ｎＭ−５００ｎＭの濃度でのヒトＣＤＣＰ１のＥＣＤに対して１５０−２００秒、１００ｎＭの濃度で抗ＣＤＣＰ１抗体に対して３００秒であった。ついで、チップ表面をＰＢＳＴ＋０．８ＭのＮａＣｌで３分間洗浄した（解離相）。全ての相互作用は正確に２５℃（標準温度）で実施した。１０ｍＭのグリセリンの再生溶液（ｐＨ２．０）を６０−１５０秒間注入して、各結合サイクル後の非共有結合タンパク質を除去した。秒当たり一シグナルの検出速度でシグナルを検出した。
【００９０】
抗ＣＤＣＰ１抗体がヒトＣＤＣＰ１のＣＵＢ４と同じ又は異なったエピトープに結合するかどうかを決定するために、ヒトＣＤＣＰ１のＥＣＤを注入し、固定抗体に結合させた。結合の直ぐ後に、未知のエピトープを持つ抗体を注入した。注入後に結合シグナルの増加を示さない試験抗ＣＤＣＰ１−抗体（つまり、例えば試験抗体の注入時間（＝０秒）の１００秒後に、結合シグナルは注入時のシグナル程は高くなく；シグナルはＲＵ（相対単位）で測定される）は、ＣＵＢ４と同じエピトープに結合している。結合シグナルの増加を示す試験抗ＣＤＣＰ１−抗体は、ＣＵＢ４とは異なったエピトープに結合している（例えば注入時間（＝０秒）の１００秒後に、結合シグナルは注入時のシグナルより高く；シグナルはＲＵ（相対単位）で測定される）。
【００９１】
３通りの定量の結果を図３ａ及び３ｂに示す。抗体ＣＵＢ３、ＣＵＢ１（図３ｂを参照）はＣＵＢ４とは異なったエピトープに結合することが見出される一方、抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２及びＣＤＣＰ１−０１５はＣＵＢ４と同じエピトープに結合するものとして同定された（表２及び図３ａを参照，全て３通りの実験）。抗体ＣＵＢ３及びＣＵＢ１はそれぞれＣＵＢ４とは別のエピトープに結合することが見出され、互いに異なっている（ＣＵＢ１≠ＣＵＢ３）。（表２及び図３ｂを参照，全て３通りの実験）。ＣＵＢ４及び希釈バッファーを負のコントロールとして用いたコントロール実験は結合シグナルの増加を示さなかった。
【００９２】
ＣＵＢ１は、アミン結合Ｍａｂ ＣＵＢ３からなる予め形成された複合体ではサンドウィッチ複合体形成もその逆も示さなかった（データは示さず）。
ＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２及びＣＤＣＰ１−０１５は、Ｍａｂ ＣＵＢ１又はＭａｂ ＣＵＢ３それぞれとアンチジーンからなる双方の予め形成された複合体ではサンドウィッチ複合体形成を示した（データは示さず）。
【００９３】
別のＢｉａｃｏｒｅ実験では、固定されたｈＣＤＣＰ１−ＥＣＤに対する抗ＣＤＣＰ１抗体の結合定数及び親和性を次のようにして定量した：
ｋａ：結合速度定数，ｋｄ解離速度定数，ＫＤ解離平衡定数（結合親和性），ｔ1/2：複合体の半減期。
【００９４】
実施例３
アンチジーン特異的ＥＬＩＳＡ
それぞれストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）（配列番号：２）に融合させた可溶型ＣＤＣＰ１細胞外ドメイン（ＣＤＣＰ１−ＥＣＤ）（配列番号：２）、並びにＣＤＣＰ１細胞外ドメインのアミノ酸１−２１６及びＣＤＣＰ１細胞外ドメインの１−３６１を包含するＳｈｏｒｔ１（ｈｕＣＤＣＰ１＿ＳＨ１＿ＥＣＤ ａａ１−２１６）＿ＳＢＰ）及びＳｈｏｒｔ５（ｈｕ＿ＣＤＣＰ１＿ＳＨ５＿ＥＣＤ（ａａ１−３６１）＿ＳＢＰ）をストレプトアビジンプレートに捕捉させた。ＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−ＥＣＤ、ＳＢＰ−ＣＤＣＰ１ Ｓｈｏｒｔ１及びＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−Ｓｈｏｒｔ５に対する抗体の最適な結合を定めるために、９６ウェルのポリスチレンプレート（Roche，ストレプトアビジン被覆，ID-No.1989685）を純粋な又は１：４希釈された（１０％の仔ウシ血清Pan Biotech ID-No 3302-P251116を含有するダルベッコ改変イーグル培地PAN Biotechに溶解した）ＨＥＫ２９３上清で被覆した。標準的なコーティングに対しては、未希釈のＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−Ｓｈｏｒｔ１及びＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−ＥＣＤ上清とは対照的にＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−Ｓｈｏｒｔ５含有ＨＥＫ２９３上清を希釈し（１：４）、２−８℃で一晩インキュベートした（６０μｌ）。マイクロタイタープレートの集中的な洗浄が、残りの未結合のＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−ＥＣＤ、ＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−Ｓｈｏｒｔ１及びＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−Ｓｈｏｒｔ５を除去するために必要である。
【００９５】
２５０μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡのブロッキング試薬（Roche11112589）を使用して１時間のブロッキング工程を実施することによって被覆ウェルをブロックした。
【００９６】
１：５００希釈（１％のＢＳＡ画分Ｖ，ＳｉｇｍａＡ３０５９を含む０μｌのＰＢＳに希釈した０．１μｇ抗体）を使用して、抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）及びＣＤＣＰ１＿００４、ＣＤＣＰ１＿０１２及びＣＤＣＰ１＿０１５を試験した。各試料に対してウェル当たり５０μｌを室温で６０分インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ２０，Ｆｌｕｋａ＃０８０５７）を使用する集中的な洗浄後に、５０μｌのＨＲＰに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢｉｏＲａｄ＃１７０６５１６，希釈１：１０００）を加え、室温で１時間インキュベートした。集中的な洗浄後に、抗体の結合を５０μｌのＢＭブルーＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ１１４８４２８１００１）で検出した。３７０ｎｍ／４９２ｎｍでの吸光度を、標準的な光度計を使用して測定した。
【００９７】
抗体ＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２、ＣＤＣＰ１−０１５及びＣＵＢ４の結合領域は、ＣＤＣＰ１の細胞外ドメイン中のａａ１及び２１６内に位置している。その結果、全てのこれらの抗体は、ＣＤＣＰ１の完全なＥＣＤ及びａａ１−３６１を含むコンストラクト（ｓｈｏｒｔ５）をまた認識する（図４参照）。
【００９８】
実施例４
ＭＤＡＭＢ−２３１又はＨＣＴ１１６細胞におけるＣＤＣＰ１内部移行及びリン酸化の刺激
６ウェル当たり７×１０５のＭＤＡＭＢ−２３１細胞をＤＭＥＭ＋Ｌ−グルタミン、＋ピルビン酸塩（Gibco, 41966）、１０％のＦＣＳ（PAN Biotech ID-No3302-P251116）、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（PAA, P0832100）中で一晩培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を１０μｇ／の異なった抗体：マウスＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）及び抗体ＣＤＣＰ１＿００４、ＣＤＣＰ１＿０１２及びＣＤＣＰ１＿０１５で１０分及び５時間処理した。ＨＣＴ１１６細胞を２０μｇ／の異なった抗体：マウスＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）、マウスＣＵＢ１及びマウスＣＵＢ３で１０分及び５時間処理した。新鮮に調製した、１ｍＭのエタノール中のＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、０．４ｍＭのバナジン酸塩を含む氷冷ＲＩＰＡ溶解バッファー（Thermo Scientific, #89901）で細胞を可溶化した。氷上で１５分後、細胞可溶化物を１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。可溶化物を標準的なプロトコルによってＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロット法によってニトロセルロースに移した。ウェスタンブロットは抗ＣＤＣＰ１抗体（細胞シグナル伝達＃４１１５）、抗ホスホＣＤＣＰ１抗体又はＨＣＴ１１６の場合はＰＹ４Ｇ１０によって検出した。
【００９９】
未処理ＨＣＴ１１６細胞中に存在するＣＤＣＰ１のリン酸化レベルは、１０分又は５時間の時点では変わらない。ＣＵＢ４は、ＣＵＢ１と比較して１０分の細胞のインキュベーション後にＣＤＣＰ１の強いリン酸化を媒介する。ＣＤＣＰ１のリン酸化及び発現低下（データは示さず）の阻害は、ＣＵＢ１と比較してＣＵＢ４によって更により明白になる。ＣＵＢ３インキュベーションはＣＤＣＰ１リン酸化の弱い刺激を生じ、タンパク質の発現低下を媒介することができない（データは示さず）。結果を図５ａ及びｂに示す。
【０１００】
未処理のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞中に存在するＣＤＣＰ１の発現レベルは１０分又は５時間の時点では変わらない。ＣＵＢ４インキュベーション並びにＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２及びＣＤＣＰ１−００１５抗体を伴った５時間の細胞のインキュベーションは少なくともＣＤＣＰ１タンパク質の部分的な分解を生じる。ＣＤＣＰ１のリン酸化は未処理細胞では検出が難しい。ＣＵＢ４又は抗体ＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２及びＣＤＣＰ１−００１５での１０分間の細胞の処理はチロシン７３４でのＣＤＣＰ１リン酸化の増加を生じる。これらの抗体での５時間の処理後、ＣＤＣＰ１発現低下の結果、ＣＤＣＰ１中のチロシン７３４のリン酸化はかろうじて検出される。結果を図６ａからｃに示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療のための、ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合するヒトＣＤＣＰ１に対する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＣＤＣＰ１（（ＣＵＢドメイン含有タンパク質１、Ｂ３４５、ＣＤ３１８、ＳＩＭＡ１３５、ＴＲＡＳＫ；配列番号：１及び変異Ｒ５２５Ｑ（つまり、配列番号：１のアミノ酸位置５２５におけるアルギニン（Ｒ）のグルタミン（Ｑ）との置換）及び／又は変異Ｇ７０９Ｄ（つまり、配列番号：１のアミノ酸位置７０９におけるグリセリン（Ｇ）のアスパラギン酸（Ｄ）との置換)を含む変異体)は３つの細胞外ＣＵＢドメインを含む膜貫通タンパク質である。このタンパク質は乳癌、結腸癌及び肺癌において過剰発現することが見出されている。その発現レベルは癌細胞の転移能と相関している。それは癌細胞株においてチロシンリン酸化されることが示されている。（国際公開第2002/004508号; Scherl-Mostageer, M.等, Oncogene 20 (2001) 4402-8; Hooper, J., D.等, Oncogene 22 (2003) 1783-94; Perry, S., E.等 FEBS Lett. 581 (2007) 1137-42；Brown, T., A.等 J. Biol. Chem. 279 (2004) 14772-14783；Ota, T.等, Nat. Genet. 36 (2004) 40-45）。区別されるアイソフォームをコードする選択的スプライシング転写変異体が報告されている。
【０００３】
国際公開第２００２／００４５０８号は腫瘍関連抗原Ｂ３４５としてＣＤＣＰ１に言及している。国際公開第２００４／０７４４８１号は転移性腫瘍細胞に発現された糖タンパク質抗原ＳＩＭＡ１３５としてのＣＤＣＰ１に関している。国際公開第２００５／０４２１０２号は卵巣癌に関与するタンパク質としてのＣＤＣＰ１に関している。国際公開第２００７／００５５０２号はＣＤＣＰ１を標的とする疾患の治療方法及び組成物に関している。
【０００４】
米国特許出願公開第２００４／００５３３４３号（及びConze, T.等, Ann. N. Y. Acad. Sci. 996 (2003) 222-6及びBuehring, H.J.等, Stem Cells 22 (2004) 334-43）は同定のため及び／又はある種の幹細胞集団のためのＣＤＣＰ１抗体に関する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一態様は、癌の治療のためのＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。
【０００６】
本発明は、癌の治療のためのＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とし、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：７であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：８であり、
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：１５であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：１６であり、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：２３であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：２４であり、又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号：３１であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：３２である
ことを更に特徴とする抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【０００７】
本発明は、癌の治療のためのＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とし、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：９のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１０のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１１のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：１２のＣＤＲＬ１領域、配列番号：１３のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：１４のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：１７のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１８のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１９のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２０のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２１のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：２２のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：２５のＣＤＲＨ１領域、配列番号：２６のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：２７のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２８のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２９のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：３０のＣＤＲＬ３領域を含む
ことを更に特徴とする抗体を更に含む。
【０００８】
本発明は、上記抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする本発明に係る抗体を更に含む。
【０００９】
本発明の他の態様は、癌の治療のための、ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体を含有する薬学的組成物である。
【００１０】
本発明の他の態様は、癌の治療のための医薬の調製における、ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体の使用である。
【００１１】
本発明の他の態様は、癌に罹患している患者を、治療を必要とする該患者にＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体を投与することによって治療する方法である。
【００１２】
本発明は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：１５であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：１６であり、又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：２３であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：２４であり、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：３１であり、軽鎖可変ドメインが配列番号：３２である
ことを特徴とする本発明に係る抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００１３】
本発明は、
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：９のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１０のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１１のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：１２のＣＤＲＬ１領域、配列番号：１３のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：１４のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：１７のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１８のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１９のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２０のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２１のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：２２のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：２５のＣＤＲＨ１領域、配列番号：２６のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：２７のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２８のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２９のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：３０のＣＤＲＬ３領域を含む
ことを特徴とする本発明に係る抗体を更に含む。
【００１４】
好ましくは、上記抗体は、上記抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする。本発明は上記抗体を含有する薬学的組成物を更に含む。本発明は、癌の治療のための医薬の調製のための上記抗体を更に含む。本発明は、癌に罹患している患者を、治療を必要とする上記患者に上記抗体を投与することによって治療する方法を更に含む。
【００１５】
本発明は本発明に係る抗体をコードする核酸を提供する。本発明は、原核生物又は真核生物宿主細胞中に上記核酸を発現可能な本発明に係る核酸を含む発現ベクター、及び本発明に係る抗体の組換え生産のためにかかるベクターを含む宿主細胞を更に提供する。
【００１６】
本発明は本発明に係るベクターを含む原核生物又は真核生物宿主細胞を更に含む。
【００１７】
本発明は、原核生物又は真核生物宿主細胞中に本発明に係る核酸を発現させ、上記細胞又は細胞培養上清から上記抗体を回収することを特徴とする、本発明に係る組換え抗体の製造方法を更に含む。本発明はかかる組換え方法によって得られる抗体を更に含む。
【００１８】
驚いたことに、ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体が、例えばＣＵＢ１（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５６９）のようなＣＤＣＰ１の他のエピトープに結合するＣＤＣＰ１抗体と比較して癌の治療に特に有用であることが今見出された。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
ＣＵＢ４抗体は、配列番号：７の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号：８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有するＤＥ１０２４２１４６（ＥＰ１３９６５０１、ＵＳ７５４１０３０）からの寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１で寄託された抗体を意味する。上記ＣＵＢ４抗体はヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する。（番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１（ＤＳＭＺ）の寄託はEberhard-Karls-University Tuebingen, Univcrsitaetsklinikum Tuebingen, Geissweg 3 72076 Tuebingenによってなされた。）
【００２０】
本発明は、癌の治療のためのＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体を含む。
【００２１】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：７で、軽鎖可変ドメインが配列番号：８であることを特徴とする本発明に係る抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００２２】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：１５で、軽鎖可変ドメインが配列番号：１６であることを特徴とする本発明に係る抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００２３】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：２３で、軽鎖可変ドメインが配列番号：２４であることを特徴とする本発明に係る抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００２４】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：３１で、軽鎖可変ドメインが配列番号：３２であることを特徴とする本発明に係る抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００２５】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：９のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１０のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１１のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：１２のＣＤＲＬ１領域、配列番号：１３のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：１４のＣＤＲＬ３領域を含むことを特徴とする本発明に係る抗体を更に含み、又は
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：１７のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１８のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１９のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２０のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２１のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：２２のＣＤＲＬ３領域を含むことを特徴とする本発明に係る抗体を更に含み、又は
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：２５のＣＤＲＨ１領域、配列番号：２６のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：２７のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２８のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２９のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：３０のＣＤＲＬ３領域を含むことを特徴とする本発明に係る抗体を更に含む。
【００２６】
「抗体」なる用語は、限定されないが、全抗体、抗体断片を含む様々な形態の抗体構造を包含する。本発明に係る抗体は、好ましくは、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は本発明に係る特徴的性質が保持される限り更に遺伝子操作された抗体である。「抗体断片」は、完全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例は、ダイアボディ、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHuston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88に記載されている。加えて、抗体断片は、機能的抗原結合部位に対して、ＶＨドメインの、すなわちＶＬドメインと共にアセンブルし得、又はＣＤＣＰ１に結合するＶＬドメインの、すなわちＶＨドメインと共にアセンブルし得、それによって本発明に係る抗体の性質をもたらす特性を有する一本鎖ポリペプチドを含む。ここで使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」なる用語は単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を意味する。「ヒト化抗体」又は「抗体のヒト化型」なる用語は、フレームワーク及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのものと比較して異なった種の免疫グロブリンのＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）を含むように改変された抗体を意味する。好ましい実施態様では、マウスＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）がヒト抗体のフレームワーク領域中にグラフトされて、「ヒト化抗体」が調製される（例えばRiechmann, L.等, Nature 332 (1988) 323-327；及びNeuberger, M. S.等, Nature 314 (1985) 268-270を参照）。
【００２７】
ここで使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を意味する。
【００２８】
「キメラ抗体」なる用語は、通常は組換えＤＮＡ技術によって調製される、マウス由来の可変領域、すなわち結合領域と、異なる供給源又は種由来の定常領域の少なくとも一部を含むモノクローナル抗体を意味する。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。そのようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明によって包含される「キメラ抗体」の他の形態は、クラス又はサブクラスが元の抗体のものから改変され又は変化されたものである。そのような「キメラ」抗体はまた「クラススイッチ抗体」と称される。キメラ抗体を生産するための方法は、今は当該技術分野においてよく知られている一般的な組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を含む（例えば、Morrison, S.L.等, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５２０２２３８号及び第５２０４２４４号を参照のこと）。
【００２９】
ヒトＣＤＣＰ１（（ＣＵＢドメイン含有タンパク質１、Ｂ３４５、ＣＤ３１８、ＳＩＭＡ１３５、ＴＲＡＳＫ；配列番号：１及び変異Ｒ５２５Ｑ（つまり、配列番号：１のアミノ酸位置５２５におけるアルギニン（Ｒ）のグルタミン（Ｑ）での置換）及び／又は変異Ｇ７０９Ｄ（つまり、配列番号：１のアミノ酸位置７０９におけるグリセリン（Ｇ）のアスパラギン酸（Ｄ）での置換)を含む変異体)は３つの細胞外ＣＵＢドメインを含む膜貫通タンパク質である。このタンパク質は乳癌、結腸癌及び肺癌において過剰発現することが見出されている。その発現レベルは癌細胞の転移能と相関している。それは癌細胞株においてチロシンリン酸化されることが示されている。（国際公開第2002/004508号; Scherl-Mostageer, M.等, Oncogene 20 (2001) 4402-8; Hooper, J., D.等, Oncogene 22 (2003) 1783-94; Perry, S., E.等 FEBS Lett. 581 (2007) 1137-42; Brown, T., A.等 J. Biol. Chem. 279 (2004) 14772-14783; Ota, T.等, Nat. Genet. 36 (2004) 40-45）。区別されるアイソフォームをコードする選択的スプライシング転写変異体が報告されている。
【００３０】
「Ｋａｂａｔ番号付け」又は「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「ＥＵインデックス」なる用語は、別の記載がない限り、Kabat等（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）におけるＥＵインデックスを使用する、例えばＩｇＧ抗体中における、残基の番号付けとして定義される。
【００３１】
ここで使用される場合、「ヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する」とは、ヒトＣＤＣＰ１抗原に特異的に結合する抗体を意味する。結合親和性は、１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、好ましくは１．０×１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値のものである。結合親和性は、標準的な結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴技術（Biacore(登録商標)）を用いて決定される。よって、ここで使用される「ヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体」は、１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ（例えば１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ−１．０×１０−１３ｍｏｌ／ｌ、好ましくは１．０×１０−９ｍｏｌ／ｌ−１．０×１０−１２ｍｏｌ／ｌのＫＤ）の結合親和性をもってヒトＣＤＣＰ１抗原に結合する抗体を意味する。
【００３２】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：１５で、軽鎖可変ドメインが配列番号：１６であることを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００３３】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：２３で、軽鎖可変ドメインが配列番号：２４であることを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００３４】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：３１で、軽鎖可変ドメインが配列番号：３２であることを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体、又はそのヒト化型を更に含む。
【００３５】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：９のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１０のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１１のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：１２のＣＤＲＬ１領域、配列番号：１３のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：１４のＣＤＲＬ３領域を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体を更に含む。
【００３６】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：１７のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１８のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１９のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２０のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２１のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：２２のＣＤＲＬ３領域を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体を更に含む。
【００３７】
本発明は、
重鎖可変ドメインが配列番号：２５のＣＤＲＨ１領域、配列番号：２６のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：２７のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２８のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２９のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：３０のＣＤＲＬ３領域を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体を更に含む。
【００３８】
「エピトープ」なる用語は、抗体への特異的結合が可能であるヒトＣＤＣＰ１のタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピングからなり、通常はエピトープは特異的な三次元構造特性、並びに特異的な電荷特性を有する。コンフォメーション及び非コンフォメーションエピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われることで識別される。
【００３９】
ここで使用される「ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合する」なる用語は、抗体ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）が結合するＣＤＣＰ１上の同じエピトープに結合する本発明の抗ＣＤＣＰ１抗体を意味する。本発明の抗ＣＤＣＰ１抗体のエピトープ結合特性は当該技術分野で知られた技術を使用して決定されうる。ＣＤＣＰ１抗体はＣＤＣＰ１に対する試験抗体の結合を阻害する抗体ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の能力を決定するためにインビトロ競合結合阻害アッセイにおいて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって２５℃で測定される（図２を参照）。ＣＵＢ４と同じエピトープに結合する抗体の結合が阻害され、試験抗体の添加後に結合シグナルは検出されない。（例えば試験抗体の注入時（＝０秒）から１００秒後に、結合シグナルは注入時におけるシグナルほど高くない；シグナルはＲＵ（相対単位）で測定される）（例えばＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２、ＣＤＣＰ１−０１５，図３ａを参照）。ＣＵＢ４とは異なったエピトープに対する結合する抗体の結合は阻害されず、結合シグナルは試験抗体の添加後に検出される（例えば注入時（＝０秒）から１００秒後に、結合シグナルは注入時におけるシグナルより高い；シグナルはＲＵ（相対単位）で測定される）。これは、例えば実施例２に記載するように、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）によって調べることができる。
【００４０】
ここで使用される「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、抗体を抗原に結合させることに直接関与する軽鎖及び重鎖の対のそれぞれを示す。可変軽鎖及び重鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、配列が広く保存され、３個の「高頻度可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって連結される、４個のフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを採り、ＣＤＲは、βシート構造を連結するループを形成しうる。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって三次元構造に保持され、もう一方の鎖由来のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、よって本発明の更なる目的を提供する。
【００４１】
ここで使用される場合の「抗体の抗原結合部分」なる用語は、抗原結合が起因する抗体のアミノ酸残基を意味する。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。本発明の抗体の「抗原結合部分」なる用語は、抗原に対する結合部位の親和性に様々な度合いで寄与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含みうる。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲｓ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲｓ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲｓ）の度合いは、その領域が配列間の可変性に従って定義されているアミノ酸配列の編集されたデータベースとの比較によって決められる。
【００４２】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、ここで定義された高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端までドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)の標準的な定義に従って決定され、及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基である。
【００４３】
「核酸」又は「核酸分子」なる用語は、ここで使用される場合、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖でありうるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００４４】
この出願内で使用される「アミノ酸」なる用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を意味する。
【００４５】
本発明に係る抗体は、定常領域がヒト由来のものであり、好ましくはヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする。定常領域は、抗体の重鎖及び軽鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、及び場合によってはサブクラスＩｇＥの抗体の場合、抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含む。軽鎖定常領域は抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）はκ（カッパ）又はλ（ラムダ）でありうる。そのような定常鎖は従来からよく知られており、例えばKabat, E.A.によって記載されている (例えばJohnson, G.及びWu, T., T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照のこと)。例えば、ＩｇＧ１サブクラスの有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号：３のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号：４のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み；他の有用なヒト軽鎖定常領域は配列番号：５のλ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【００４６】
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗原への抗体の結合に直接的には関与していないが、様々なエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は当業者にはよく知られた用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体又は免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭというクラスに分類され、これらの幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分類されうる。重鎖定常領域によれば、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００４７】
抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＦｃレセプター結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞傷害性）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）に直接的に関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、殆どのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合によって開始される。補体系に対する抗体の影響はある種の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分において定義された結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は従来から知られており、例えばBoakle, R.J.等, Nature 282 (1979) 742-743；Lukas, T.J.等, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560；Brunhouse, R.及びCebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917；Burton, D.R.等, Nature 288 (1980) 338-344； Thommesen, J.E.等, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004；Idusogie, E.E.等, J. Immunol.164 (2000) 4178-4184；Hezareh, M.等, J. Virology 75 (2001) 12161-12168；Morgan, A.等, Immunology 86 (1995) 319-324; EP0307434によって記載されている。このような結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（Kabat, E.A.のＥＵインデックスによる番号付け、以下を参照）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は、通常、補体活性化及びＣ１ｑ及びＣ３結合を示す一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。
【００４８】
本発明に係る抗体は、ヒト起源由来のＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域の全ての他の部分を含む。ここで使用される場合、「ヒト起源由来のＦｃ部分」なる用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、好ましくは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラス由来の変異Ｆｃ部分（好ましくはＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａの変異を持つもの）、ヒトＩｇＧ４サブクラス由来のＦｃ部分又はヒトＩｇＧ４サブクラス由来の変異Ｆｃ部分（好ましくはＳ２２８Ｐの変異を持つもの）を示す。最も好ましいものは、ヒトＩｇＧサブクラス（例えば配列番号：３を参照）、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧサブクラス、ヒトＩｇＧサブクラス（例えば配列番号：６を参照）、又は変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラスのヒト重鎖定常領域である。
【００４９】
「抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）」なる用語は、エフェクター細胞の存在下での本発明に係る抗体によるヒト標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣは、好ましくは、新鮮に単離されたＰＢＭＣのようなエフェクター細胞又は単球もしくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は永久に増殖するＮＫ細胞株のようなバフィコート由来の精製エフェクター細胞の存在下でＣＤＣＰ１発現細胞調製物を本発明に係る抗体で処理することによって測定される。
【００５０】
「補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）」なる用語は、殆どのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始されるプロセスを意味する。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位における定まったタンパク質間相互作用によって引き起こされる。このようなＦｃ部分結合部位は従来から知られている（上記を参照）。このようなＦｃ部分結合部位は、例えばアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって特徴付けられる。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２，及びＩｇＧ３の抗体は、Ｃ１ｑ及びＣ３結合を含む補体活性化を通常示す一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化させず、Ｃ１ｑ及び／又はＣ３に結合しない。
【００５１】
モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能は、例えば、Umana, P. 等, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、及び米国特許第６６０２６８４号に記載されているように、それらのオリゴ糖成分を操作することにより亢進せしめることができる。ＩｇＧ１型抗体は、最も一般的に使用される治療用抗体であり、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に保存されたＮ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合する２つの二分複合オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋め込まれ、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成し、それらの存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）等のエフェクター機能を媒介する上で必須である（Lifely, M.R.等, Glycobiology 5 (1995) 813-822；Jefferis, R. 等, Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76；Wright, A.及び Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32）。Umana, P. 等（Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び国際公開第99/54342号は、二分オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における過剰発現が、抗体のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増大させることを示している。Ａｓｎ２９７糖鎖の組成の改変又はその消失は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑに対する結合にも影響を与える（Umana, P. 等, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180；Davies, J. 等, Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294；Mimura, Y. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547；Radaev, S. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483；Shields, R.L. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604；Shields, R.L. 等, J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740；Simmons, L.C. 等, J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147）。
【００５２】
モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能を亢進せしめる方法は、例えば国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Umana, P.等, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、国際公開第９９／１５４３４２号、国際公開第２００５／０１８５７２号、国際公開第２００６／１１６２６０号、国際公開第２００６／１１４７００号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００５／０１１７３５号、国際公開第２００５／０２７９６６号、国際公開第１９９７／０２８２６７号、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号、米国特許出願公開第２００５／００５４０４８号、米国特許出願公開第２００５／０１５２８９４号、国際公開第２００３／０３５８３５号及び国際公開第２０００／０６１７３９号又は例えばNiwa, R.等, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160；Shinkawa, T.等, J. Biol. Chem. 278 (2003) 3466-3473；国際公開第０３／０５５９９３号及び米国特許出願公開第２００５／０２４９７２２号に報告されている。
【００５３】
よって、本発明の一実施態様では、本発明に係る抗体は、（もしそれがＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのＦｃ部分を含むならば）Ａｓｎ２９７での糖鎖で（Ｋａｂａｔによる番号付け）上記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であるようにグリコシル化されている。他の実施態様では、上記糖鎖内のフコースの量は５％〜６５％、好ましくは２０％〜４０％である。別の実施態様では、フコースの量はＡｓｎ２９７におけるＦｃ領域のオリゴ糖の０％である。本発明において「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域のおよそ２９７位に位置するアミノ酸アスパラギンを意味する。抗体の軽微な配列変異に基づいて、Ａｓｎ２９７は、幾つかのアミノ酸（通常は、±３アミノ酸以下）を隔てて２９７位の上流又は下流に、つまり、２９４位と３００位の間に位置する場合がある。一実施態様では、本発明に係るグリコシル化抗体において、ＩｇＧサブクラスは、ヒトＩｇＧ１サブクラス、又はＩｇＧ３サブクラスのものである。更なる実施態様では、上記糖類内において、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）量は１％以下、及び／又はＮ末端α−１，３−ガラクトースの量は１％以下である。糖鎖は、好ましくはＣＨＯ細胞で組換的に発現される抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ結合型グリカンの特徴を示す。
【００５４】
「ＣＨＯ細胞で組換的に発現される抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ結合型グリカンの特徴を示す」という用語は、本発明に係る抗体のＡｓｎ２９７における糖鎖が、フコース残基を除き、例えば国際公開第２００６／１０３１００号に報告されたもののように、未修飾ＣＨＯ細胞に発現された同じ抗体のものとオース残基を除いて同じ構造及び糖残基を有していることを示している。
【００５５】
この出願中に使用される「ＮＧＮＡ」なる用語は、糖残基Ｎ−グリコリルノイラミン酸を意味する。
【００５６】
コアがフコシル化された二分岐複合オリゴ糖グリコシル化が２個までのＧａｌ残基で終端するので、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化はＡｓｎ２９７で生じる。ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのヒト重鎖定常領域は、上掲のKabat, E.A.等、及び Bruggemann, M. 等, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361；Love, T.W.等, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527に詳細に報告されている。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に依存して、Ｇ０、Ｇ１（α−１，６−又はα−１，３−）、又はＧ２グリカン残基と命名される（Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53）。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯ型のグリコシル化は、例えばRoutier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207に記載されている。非糖修飾ＣＨＯ宿主細胞に組換的に発現される抗体は、通常、Ａｓｎ２９７において、少なくとも８５％の量でフコシル化されている。抗体の修飾オリゴ糖はハイブリッド又は複合でありうる。好ましくは、二分岐の還元／非フコシル化オリゴ糖はハイブリッドである。他の実施態様では、二分岐の還元／非フコシル化オリゴ糖は複合である。
【００５７】
本発明によれば、「フコースの量」とは、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析法によって測定され、平均値として算出されるＡｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合、ハイブリッド及び高マンノース構造)の合計に関連した、Ａｓｎ２９７での糖鎖内の前記糖の量を意味する（例えば国際公開第２００８／０７７５４６号を参照）。フコースの相対量は、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦによる、Ｎ−グリコシダーゼＦで処理したサンプル中で同定された全ての糖鎖構造（例えば、複合、ハイブリッド及び高マンノース構造それぞれ）に対するフコース含有構造の割合である。
【００５８】
本発明に係る抗体は好ましくは組換え手段によって生産される。このような方法は従来から広く知られており、原核及び真核細胞におけるタンパク質の発現と続く抗体ポリペプチドの単離及び通常は薬物学的に許容可能な純度までの精製を含む。タンパク質の発現のためには、軽鎖及び重鎖をコードする核酸又はその断片が標準的な方法によって発現ベクター中に挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、又は大腸菌細胞等の適切な原核又は真核宿主細胞において実施され、抗体は細胞（上清又は溶解後の細胞）から回収される。
【００５９】
抗体の組換え生産は従来からよく知られており、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S.等, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880という概説論文に記載されている。
【００６０】
抗体は、全細胞中に、細胞可溶化物中に、又は部分的に精製され又は実質的な純粋な形態で存在しうる。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ分染法、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動法、及び当該技術分野でよく知られた他のものを含む標準的な技術によって、他の細胞性成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞性核酸又はタンパク質を除去するために実施される（Ausubel, F.等.(編), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照）。
【００６１】
ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M.等, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M.等, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270によって記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y.等, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9によって記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;及びNorderhaug, L.等, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87によって記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.J.,及びChristensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83及びSchlaeger, E.J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199によって記載されている。
【００６２】
原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核生物細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを使用することが知られている。
【００６３】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係で配されている場合、「作用可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に連結されており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に連結されており；又は、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されている場合、コード配列に作用可能に連結されている。一般に、「作用可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合は、近接し、かつ読み枠にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接していなくてもよい。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、一般的な手法に従って使用される。
【００６４】
モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等、一般的な免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、一般的な手順を使用し、容易に単離し配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源となりうる。ひとたび単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に挿入され得、これがついで宿主細胞、例えばそうでないと免疫グロブリンタンパク質を生産しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞に形質移入され、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成が達成される。
【００６５】
ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」という表現は相互に交換可能に用いられ、全てのそのような標記は子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語句は、初代対象細胞及び何度培養が継代されたかに関わらず初代のものから誘導された培養を含む。また、全ての子孫が、意図的な変異あるいは意図しない変異の影響で、ＤＮＡ含有物において正確に同一であるわけではないことも理解される。元々の形質転換細胞についてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。区別される標記が意図される場合は、文脈から明らかであろう。
【００６６】
ここで使用される「形質転換」なる用語は、宿主細胞中へのベクター／核酸のトランスファープロセスを意味する。恐るべき細胞壁障壁のない細胞が宿主細胞として使用される場合、形質移入は、例えばGraham, F., L.,及びvan der Eb, Virology 52 (1973) 456-467により記載されるようなリン酸カルシウム沈殿法により実施される。しかしながら、核注入又はプロトプラスト融合等による細胞中へのＤＮＡの導入のための他の方法がまた使用されうる。原核生物細胞又は実質的な細胞壁構成を含む細胞が使用される場合、例えば一つの形質移入法は、Cohen, S.N.等, PNAS 69 (1972) 2110-2114により記載される塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。
【００６７】
ここで使用される場合、「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡ（また、転写物とも称される）がその後ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。転写物及びコードされたポリペプチドは、集合的には、遺伝子産物と称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核生物細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【００６８】
「ベクター」とは、挿入される核酸分子を、宿主細胞中及び／又は宿主細胞間にトランスファーする核酸分子、特に自己複製する核酸分子である。該用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡの細胞中への挿入（例えば、染色体組込み）のために主に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。一を越える記載された機能を提供するベクターもまた含まれる。
【００６９】
「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞中に導入されると、転写され、ポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」とは、所望される発現産物を生じせしめるように機能しうる発現ベクターから構成される適切な宿主細胞を通常意味する。
【００７０】
本発明の一態様は、本発明に係る抗体を含有する薬学的組成物である。本発明の他の態様は、薬学的組成物の製造のための本発明に係る抗体の使用である。本発明の更なる態様は、本発明に係る抗体を含有する薬学的組成物の製造方法である。他の態様では、本発明は、薬学的担体と共に処方されて本発明に係る抗原結合タンパク質を含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。
【００７１】
ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する上記抗体は、例えばＣＵＢ１抗体（ＤＥ１０２４２１４６（ＥＰ１３９６５０１、ＵＳ７５４１０３０）からの寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５６９で寄託された抗体）のような他の抗ＣＤＣＰ１抗体と比較して癌の治療に対して特に有用であることが分かった。
【００７２】
従って、本発明の一態様は、癌の治療のための上記薬学的組成物である。
本発明の他の態様は、癌の治療のための医薬の製造のための本発明に係るヒト化抗体の使用である。
【００７３】
本発明の他の態様は、癌に罹患している患者を、かかる治療を必要とする上記患者に本発明に係るヒト化抗体を投与することにより治療する方法である。
【００７４】
ここで使用される場合、「薬学的な担体」は、生理学的に適合性のある任意の全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延化剤等を含む。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与（例えば注射又は注入による）に適している。
【００７５】
本発明の組成物は当該技術分野において知られている様々な方法によって投与することができる。当業者に理解されるように、投与の経路及び／又は態様は所望される結果に応じて変わる。ある投与経路によって本発明の化合物を投与するためには、その不活性化を防止するための材料で化合物を被覆し、又はそれと共に化合物を同時投与することが必要である場合がある。例えば、化合物はリポソーム又は希釈剤等の適切な担体で被験者に投与されうる。薬物学的に許容可能な希釈剤は、生理食塩水及び緩衝水溶液を含む。薬物学的な担体は、滅菌水溶液又は分散体、及び滅菌注射用溶液又は分散体の即時調製のための滅菌パウダーを含む。薬物学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は当該技術分野で知られている。
【００７６】
ここで使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」なる語句は、通常は注射による、経腸と局所投与以外の投与態様を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外、胸骨内への注射及び注入を含む。
【００７７】
ここで使用される「癌」なる用語は、例えば、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部もしくは頚部の癌、皮膚もしくは眼内メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌（stomach cancer、gastric cancer）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓もしくは尿道の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄腹腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病、例えば上記癌の何れかの難治性型、又は上記癌の一又は複数の組み合わせでありうる。好ましくは、そのような癌は、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌又は前立腺癌であり、より好ましくは肺癌である。好ましくは、そのような癌は、ＣＤＣＰ１発現又は過剰発現によって、より好ましくはＣＤＣＰ１過剰発現によって更に特徴付けられる。
【００７８】
これらの組成物は、アジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤をまた含みうる。上記の滅菌手順と、様々な抗菌剤や抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の添加の双方によって、微生物の存在を確実に防止できる。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を組成物中に含めることが望ましい場合がある。加えて、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有せしめることにより、注射可能な薬学的形態の長期吸収がもたらされうる。
【００７９】
選択される投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用されてもよい本発明の化合物、及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られた一般的な方法により、薬学的に許容可能な投薬形態に製剤化される。
【００８０】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して毒性とならないで、特定の患者、組成物、投与態様に対して、所望の治療応答を達成するのに効果的な活性成分量が得られるように変化させうる。選択される投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、投与経路、投与時間、用いられる特定化合物の排出率、治療期間、他の薬剤、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康及び先の医療歴、及び医学分野でよく知られた類似の要因を含む様々な薬物動態学的因子に依存するであろう。
【００８１】
組成物は、無菌で、組成物がシリンジにより送達可能な程度に流動的でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは等張緩衝生理食塩水である。
【００８２】
適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散体の場合は要求される粒子サイズを維持することにより、また界面活性剤を使用することにより維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマニトール又はソルビトール、及び塩化ナトリウムを含めることが好ましい。
【００８３】
次の実施例、配列表及び図面は本発明の理解を助けるために提供されるもので、発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神を逸脱しないで記載された手順に変更をなすことができることが理解される。
【００８４】
配列表の説明
配列番号：１ ヒトＣＤＣＰ１
配列番号：２ ヒトＣＤＣＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）含有断片：
配列番号：３ ヒト由来のＩｇＧ１定常重鎖領域
配列番号：４ ヒト由来のκ定常軽鎖領域
配列番号：５ ヒト由来のλ定常軽鎖領域
配列番号：６ ヒト由来のＩｇＧ４定常重鎖領域
配列番号：７ 重鎖可変ドメインＶＨ，ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）
配列番号：８ 軽鎖可変ドメインＶＬ，ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）
配列番号：９ 重鎖ＣＤＲＨ１，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１０ 重鎖ＣＤＲＨ２，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１１ 重鎖ＣＤＲＨ３，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１２ 軽鎖ＣＤＲＬ１，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１３ 軽鎖ＣＤＲＬ２，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１４ 軽鎖ＣＤＲＬ３，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１５ 重鎖可変ドメインＶＨ，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１６ 軽鎖可変ドメインＶＬ，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−００４
配列番号：１７ 重鎖ＣＤＲＨ１，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：１８ 重鎖ＣＤＲＨ２，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：１９ 重鎖ＣＤＲＨ３，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：２０ 軽鎖ＣＤＲＬ１，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：２１ 軽鎖ＣＤＲＬ２，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：２２ 軽鎖ＣＤＲＬ３，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：２３ 重鎖可変ドメインＶＨ，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：２４ 軽鎖可変ドメインＶＬ，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１２
配列番号：２５ 重鎖ＣＤＲＨ１，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
配列番号：２６ 重鎖ＣＤＲＨ２，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
配列番号：２７ 重鎖ＣＤＲＨ３，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
配列番号：２８ 軽鎖ＣＤＲＬ１，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５１０
配列番号：２９ 軽鎖ＣＤＲＬ２，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
配列番号：３０ 軽鎖ＣＤＲＬ３，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
配列番号：３１ 重鎖可変ドメインＶＨ，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
配列番号：３２ 軽鎖可変ドメインＶＬ，Ｍａｂ ＣＤＣＰ１−０１５
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４及びＣＵＢ１のヒト肺癌Ｈ３２２Ｍ異種移植片におけるインビボ腫瘍増殖阻害。
【図２】固定されたＣＵＢ４抗体、ＣＤＣＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、及び更なる抗ＣＤＣＰ１試験抗体（例えばＣＵＢ１及びＣＵＢ３）での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ−）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））の概略アッセイフォーマット。
【図３ａ】固定されたＣＵＢ４抗体、ＣＤＣＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、及び抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ１及びＣＵＢ３のＢｉａｃｏｒｅセンサグラム（ｘ軸＝時間；ｙ軸＝相対単位での応答（ＲＵ））。図３ａ：ＣＵＢ４抗体と同じＣＤＣＰ１上のエピトープへのＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２及びＣＤＣＰ１−０１５抗体の結合が示される。
【図３ｂ】固定されたＣＵＢ４抗体、ＣＤＣＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、及び抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ１及びＣＵＢ３のＢｉａｃｏｒｅセンサグラム（ｘ軸＝時間；ｙ軸＝相対単位での応答（ＲＵ））。図３ｂ：ＣＵＢ４抗体とは別のＣＤＣＰ１上のエピトープへのＣＵＢ１及びＣＵＢ３抗体の結合が示される。
【図４】ヒトＣＤＣＰ１細胞外ドメイン（ＣＤＣＰ１−ＥＣＤ）及びヒトＣＤＣＰ１−ＥＣＤのサブドメインに対する本発明に係るＣＤＣＰ１抗体の結合。
【図５ａ】ＨＣＴ１１６細胞におけるＣＤＣＰ１リン酸化の刺激。
【図５ｂ】ＨＣＴ１１６細胞におけるＣＤＣＰ１リン酸化の刺激。
【図６ａ】ＭＤＡＭＢ−２３１細胞におけるＣＤＣＰ１内部移行及びリン酸化の刺激。
【図６ｂ】ＭＤＡＭＢ−２３１細胞におけるＣＤＣＰ１内部移行及びリン酸化の刺激。
【図６ｃ】ＭＤＡＭＢ−２３１細胞におけるＣＤＣＰ１内部移行及びリン酸化の刺激。
【実施例】
【００８６】
実施例１
ＣＵＢ１抗体と比較した抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４のインビボ腫瘍増殖阻害
研究名：ＣＤＣＰ１＿ＰＺ＿Ｈ３２２Ｍ＿００２
本インビボ研究は、例えばＣＵＢ１のような他のエピトープに結合する抗体と抗ＣＤＣＰ１特異的抗体ＣＵＢ４の効能を比較するために実施した。
Ｈ３２２Ｍ非小細胞肺癌細胞は元々はＮＣＩコレクションから取得し、増殖後、Ｒｏｃｈｅ細胞バンク，Ｐｅｎｚｂｅｒｇに寄託した。腫瘍細胞株は５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下３７℃で、１０％の仔ウシ血清及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で常套的に培養した。継代４を細胞移植に使用した。
ヒト非小細胞肺癌細胞株Ｈ３２２Ｍをマウスの右側腹部中にマトリゲルと共に皮下的に接種した（５×１０６細胞）。
動物処置は細胞移植から１７日後のランダム化の日に開始した。抗体は、１０ｍｇ／ｋｇの示された投薬量で実験終了の６２日目に腹腔内でｑ７ｄで投与した。また対応するビヒクルを同じ日に投与した。投与体積は１０ｍｌ／ｋｇであった。
群：
処置群１：ビヒクル
処置群２：マウスＣＵＢ４ １０ｍｇ／ｋｇ腹腔内；
処置群３：マウスＣＵＢ１ １０ｍｇ／ｋｇ腹腔内；
【００８７】
ＴＧＩ（％での腫瘍増殖阻害）
次の表は、それぞれ平均及び中央値に基づいて各群及び時点に対して、１００−平均（Ｔ＿処置［ｘ日］−Ｔ＿処置［ベースライン］）／平均（Ｔ＿参照［ｘ日］−Ｔ＿参照［ベースライン］）＊１００として計算される腫瘍増殖阻害の値を示している。ＴＧＩ計算のための参照は「ビヒクル」群が選択された。結果をまた図１に示す。
【００８８】
ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）は、驚いたことに、ＣＵＢ１抗体（ＤＥ１０２４２１４６（ＥＰ１３９６５０１、ＵＳ７５４１０３０）からの寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５６９で寄託された抗体）よりも明らかに高い腫瘍増殖阻害を示している。
同様に、本発明に係る抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＤＣＰ１＿００４、ＣＤＣＰ１＿０１２及びＣＤＣＰ１＿０１５のインビボ腫瘍増殖阻害を決定することができる。
【００８９】
実施例２
エピトープ結合アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ）
異なった試験抗ＣＤＣＰ１抗体のエピトープ領域を決定するために、ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）を、アミンカップリング化学を使用してＣＭ５バイオセンサーチップの表面に固定した。フローセルを、０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び０．４Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの１：１混合物を用いて５μｌ／分の流量で活性化させた。抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）を、１２分、１０−３０μｇ／ｍｌで酢酸ナトリウムｐＨ４．５−５．０で注入し、これがおよそ１５０００ＲＵの表面密度を生じた。表面を、１Ｍのエタノールアミン／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を注入してブロックした。ヒトＣＤＣＰ１（配列番号：２）（分析物１）及び抗ＣＤＣＰ１抗体（分析物２）の可溶型ＥＣＤをＰＢＳＴ＋０．８ＭのＮａＣｌで希釈し、３０μｌ／分の流量で注入した。接触時間（結合相）は２５０ｎＭ−５００ｎＭの濃度でのヒトＣＤＣＰ１のＥＣＤに対して１５０−２００秒、１００ｎＭの濃度で抗ＣＤＣＰ１抗体に対して３００秒であった。ついで、チップ表面をＰＢＳＴ＋０．８ＭのＮａＣｌで３分間洗浄した（解離相）。全ての相互作用は正確に２５℃（標準温度）で実施した。１０ｍＭのグリセリンの再生溶液（ｐＨ２．０）を６０−１５０秒間注入して、各結合サイクル後の非共有結合タンパク質を除去した。秒当たり一シグナルの検出速度でシグナルを検出した。
【００９０】
抗ＣＤＣＰ１抗体がヒトＣＤＣＰ１のＣＵＢ４と同じ又は異なったエピトープに結合するかどうかを決定するために、ヒトＣＤＣＰ１のＥＣＤを注入し、固定抗体に結合させた。結合の直ぐ後に、未知のエピトープを持つ抗体を注入した。注入後に結合シグナルの増加を示さない試験抗ＣＤＣＰ１−抗体（つまり、例えば試験抗体の注入時間（＝０秒）の１００秒後に、結合シグナルは注入時のシグナル程は高くなく；シグナルはＲＵ（相対単位）で測定される）は、ＣＵＢ４と同じエピトープに結合している。結合シグナルの増加を示す試験抗ＣＤＣＰ１−抗体は、ＣＵＢ４とは異なったエピトープに結合している（例えば注入時間（＝０秒）の１００秒後に、結合シグナルは注入時のシグナルより高く；シグナルはＲＵ（相対単位）で測定される）。
【００９１】
３通りの定量の結果を図３ａ及び３ｂに示す。抗体ＣＵＢ３、ＣＵＢ１（図３ｂを参照）はＣＵＢ４とは異なったエピトープに結合することが見出される一方、抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２及びＣＤＣＰ１−０１５はＣＵＢ４と同じエピトープに結合するものとして同定された（表２及び図３ａを参照，全て３通りの実験）。抗体ＣＵＢ３及びＣＵＢ１はそれぞれＣＵＢ４とは別のエピトープに結合することが見出され、互いに異なっている（ＣＵＢ１≠ＣＵＢ３）。（表２及び図３ｂを参照，全て３通りの実験）。ＣＵＢ４及び希釈バッファーを負のコントロールとして用いたコントロール実験は結合シグナルの増加を示さなかった。
【００９２】
ＣＵＢ１は、アミン結合Ｍａｂ ＣＵＢ３からなる予め形成された複合体ではサンドウィッチ複合体形成もその逆も示さなかった（データは示さず）。
ＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２及びＣＤＣＰ１−０１５は、Ｍａｂ ＣＵＢ１又はＭａｂ ＣＵＢ３それぞれとアンチジーンからなる双方の予め形成された複合体ではサンドウィッチ複合体形成を示した（データは示さず）。
【００９３】
別のＢｉａｃｏｒｅ実験では、固定されたｈＣＤＣＰ１−ＥＣＤに対する抗ＣＤＣＰ１抗体の結合定数及び親和性を次のようにして定量した：
ｋａ：結合速度定数，ｋｄ解離速度定数，ＫＤ解離平衡定数（結合親和性），ｔ1/2：複合体の半減期。
【００９４】
実施例３
アンチジーン特異的ＥＬＩＳＡ
それぞれストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）（配列番号：２）に融合させた可溶型ＣＤＣＰ１細胞外ドメイン（ＣＤＣＰ１−ＥＣＤ）（配列番号：２）、並びにＣＤＣＰ１細胞外ドメインのアミノ酸１−２１６及びＣＤＣＰ１細胞外ドメインの１−３６１を包含するＳｈｏｒｔ１（ｈｕＣＤＣＰ１＿ＳＨ１＿ＥＣＤ ａａ１−２１６）＿ＳＢＰ）及びＳｈｏｒｔ５（ｈｕ＿ＣＤＣＰ１＿ＳＨ５＿ＥＣＤ（ａａ１−３６１）＿ＳＢＰ）をストレプトアビジンプレートに捕捉させた。ＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−ＥＣＤ、ＳＢＰ−ＣＤＣＰ１ Ｓｈｏｒｔ１及びＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−Ｓｈｏｒｔ５に対する抗体の最適な結合を定めるために、９６ウェルのポリスチレンプレート（Roche，ストレプトアビジン被覆，ID-No.1989685）を純粋な又は１：４希釈された（１０％の仔ウシ血清Pan Biotech ID-No 3302-P251116を含有するダルベッコ改変イーグル培地PAN Biotechに溶解した）ＨＥＫ２９３上清で被覆した。標準的なコーティングに対しては、未希釈のＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−Ｓｈｏｒｔ１及びＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−ＥＣＤ上清とは対照的にＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−Ｓｈｏｒｔ５含有ＨＥＫ２９３上清を希釈し（１：４）、２−８℃で一晩インキュベートした（６０μｌ）。マイクロタイタープレートの集中的な洗浄が、残りの未結合のＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−ＥＣＤ、ＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−Ｓｈｏｒｔ１及びＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−Ｓｈｏｒｔ５を除去するために必要である。
【００９５】
２５０μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡのブロッキング試薬（Roche11112589）を使用して１時間のブロッキング工程を実施することによって被覆ウェルをブロックした。
【００９６】
１：５００希釈（１％のＢＳＡ画分Ｖ，ＳｉｇｍａＡ３０５９を含む０μｌのＰＢＳに希釈した０．１μｇ抗体）を使用して、抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）及びＣＤＣＰ１＿００４、ＣＤＣＰ１＿０１２及びＣＤＣＰ１＿０１５を試験した。各試料に対してウェル当たり５０μｌを室温で６０分インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ２０，Ｆｌｕｋａ＃０８０５７）を使用する集中的な洗浄後に、５０μｌのＨＲＰに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢｉｏＲａｄ＃１７０６５１６，希釈１：１０００）を加え、室温で１時間インキュベートした。集中的な洗浄後に、抗体の結合を５０μｌのＢＭブルーＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ１１４８４２８１００１）で検出した。３７０ｎｍ／４９２ｎｍでの吸光度を、標準的な光度計を使用して測定した。
【００９７】
抗体ＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２、ＣＤＣＰ１−０１５及びＣＵＢ４の結合領域は、ＣＤＣＰ１の細胞外ドメイン中のａａ１及び２１６内に位置している。その結果、全てのこれらの抗体は、ＣＤＣＰ１の完全なＥＣＤ及びａａ１−３６１を含むコンストラクト（ｓｈｏｒｔ５）をまた認識する（図４参照）。
【００９８】
実施例４
ＭＤＡＭＢ−２３１又はＨＣＴ１１６細胞におけるＣＤＣＰ１内部移行及びリン酸化の刺激
６ウェル当たり７×１０５のＭＤＡＭＢ−２３１細胞をＤＭＥＭ＋Ｌ−グルタミン、＋ピルビン酸塩（Gibco, 41966）、１０％のＦＣＳ（PAN Biotech ID-No3302-P251116）、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（PAA, P0832100）中で一晩培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を１０μｇ／の異なった抗体：マウスＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）及び抗体ＣＤＣＰ１＿００４、ＣＤＣＰ１＿０１２及びＣＤＣＰ１＿０１５で１０分及び５時間処理した。ＨＣＴ１１６細胞を２０μｇ／の異なった抗体：マウスＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）、マウスＣＵＢ１及びマウスＣＵＢ３で１０分及び５時間処理した。新鮮に調製した、１ｍＭのエタノール中のＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、０．４ｍＭのバナジン酸塩を含む氷冷ＲＩＰＡ溶解バッファー（Thermo Scientific, #89901）で細胞を可溶化した。氷上で１５分後、細胞可溶化物を１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。可溶化物を標準的なプロトコルによってＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロット法によってニトロセルロースに移した。ウェスタンブロットは抗ＣＤＣＰ１抗体（細胞シグナル伝達＃４１１５）、抗ホスホＣＤＣＰ１抗体又はＨＣＴ１１６の場合はＰＹ４Ｇ１０によって検出した。
【００９９】
未処理ＨＣＴ１１６細胞中に存在するＣＤＣＰ１のリン酸化レベルは、１０分又は５時間の時点では変わらない。ＣＵＢ４は、ＣＵＢ１と比較して１０分の細胞のインキュベーション後にＣＤＣＰ１の強いリン酸化を媒介する。ＣＤＣＰ１のリン酸化及び発現低下（データは示さず）の阻害は、ＣＵＢ１と比較してＣＵＢ４によって更により明白になる。ＣＵＢ３インキュベーションはＣＤＣＰ１リン酸化の弱い刺激を生じ、タンパク質の発現低下を媒介することができない（データは示さず）。結果を図５ａ及びｂに示す。
【０１００】
未処理のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞中に存在するＣＤＣＰ１の発現レベルは１０分又は５時間の時点では変わらない。ＣＵＢ４インキュベーション並びにＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２及びＣＤＣＰ１−００１５抗体を伴った５時間の細胞のインキュベーションは少なくともＣＤＣＰ１タンパク質の部分的な分解を生じる。ＣＤＣＰ１のリン酸化は未処理細胞では検出が難しい。ＣＵＢ４又は抗体ＣＤＣＰ１−００４、ＣＤＣＰ１−０１２及びＣＤＣＰ１−００１５での１０分間の細胞の処理はチロシン７３４でのＣＤＣＰ１リン酸化の増加を生じる。これらの抗体での５時間の処理後、ＣＤＣＰ１発現低下の結果、ＣＤＣＰ１中のチロシン７３４のリン酸化はかろうじて検出される。結果を図６ａからｃに示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療のためのＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：７で、軽鎖可変ドメインが配列番号：８であり、
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：１５で、軽鎖可変ドメインが配列番号：１６であり、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：２３で、軽鎖可変ドメインが配列番号：２４であり、又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号：３１で、軽鎖可変ドメインが配列番号：３２である
ことを特徴とする請求項１に記載の抗体又はそのヒト化型。
【請求項３】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：９のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１０のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１１のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：１２のＣＤＲＬ１領域、配列番号：１３のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：１４のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：１７のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１８のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１９のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２０のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２１のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：２２のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：２５のＣＤＲＨ１領域、配列番号：２６のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：２７のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２８のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２９のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：３０のＣＤＲＬ３領域を含む
ことを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
上記抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
癌の治療のための、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体を含有する薬学的組成物。
【請求項６】
癌の治療のための医薬の調製のための、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項７】
癌に罹患している患者を、治療を必要とする該患者に請求項１から４の何れか一項に記載の抗体を投与することによって治療する方法。
【請求項８】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：１５で、軽鎖可変ドメインが配列番号：１６であり、又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：２３で、軽鎖可変ドメインが配列番号：２４であり、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：３１で、軽鎖可変ドメインが配列番号：３２である
ことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体、又はそのヒト化型。
【請求項９】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：９のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１０のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１１のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：１２のＣＤＲＬ１領域、配列番号：１３のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：１４のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：１７のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１８のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１９のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２０のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２１のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：２２のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：２５のＣＤＲＨ１領域、配列番号：２６のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：２７のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２８のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２９のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：３０のＣＤＲＬ３領域を含む
ことを特徴とする請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
上記抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする請求項８又は９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項８から１０に記載の抗体を含有する薬学的組成物。
【請求項１２】
癌の治療のための医薬の調製のための請求項８から１０の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１３】
癌に罹患している患者を、治療を必要とする上記患者に請求項８から１０の何れか一項に記載の抗体を投与することによって治療する方法。
【請求項１４】
請求項８から１０に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１５】
原核生物又は真核生物宿主細胞中に核酸を発現可能な、請求項１４に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含む原核生物又は真核生物宿主細胞。
【請求項１７】
原核生物又は真核生物宿主細胞中に請求項１４に記載の核酸を発現させ、上記細胞又は細胞培養上清から上記抗体を回収することを特徴とする、請求項８から１０に記載の組換え抗体の製造方法。
【請求項１】
癌の治療のためのＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）と同じエピトープに結合することを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：７で、軽鎖可変ドメインが配列番号：８であり、
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：１５で、軽鎖可変ドメインが配列番号：１６であり、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：２３で、軽鎖可変ドメインが配列番号：２４であり、又は
ｄ）重鎖可変ドメインが配列番号：３１で、軽鎖可変ドメインが配列番号：３２である
ことを特徴とする請求項１に記載の抗体又はそのヒト化型。
【請求項３】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：９のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１０のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１１のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：１２のＣＤＲＬ１領域、配列番号：１３のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：１４のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：１７のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１８のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１９のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２０のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２１のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：２２のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：２５のＣＤＲＨ１領域、配列番号：２６のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：２７のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２８のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２９のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：３０のＣＤＲＬ３領域を含む
ことを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
上記抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
癌の治療のための、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体を含有する薬学的組成物。
【請求項６】
癌の治療のための医薬の調製のための、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項７】
癌に罹患している患者を、治療を必要とする該患者に請求項１から４の何れか一項に記載の抗体を投与することによって治療する方法。
【請求項８】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：１５で、軽鎖可変ドメインが配列番号：１６であり、又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：２３で、軽鎖可変ドメインが配列番号：２４であり、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：３１で、軽鎖可変ドメインが配列番号：３２である
ことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体、又はそのヒト化型。
【請求項９】
ａ）重鎖可変ドメインが配列番号：９のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１０のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１１のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：１２のＣＤＲＬ１領域、配列番号：１３のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：１４のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｂ）重鎖可変ドメインが配列番号：１７のＣＤＲＨ１領域、配列番号：１８のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：１９のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２０のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２１のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：２２のＣＤＲＬ３領域を含み、又は
ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号：２５のＣＤＲＨ１領域、配列番号：２６のＣＤＲＨ２領域、及び配列番号：２７のＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２８のＣＤＲＬ１領域、配列番号：２９のＣＤＲＬ２領域、及び配列番号：３０のＣＤＲＬ３領域を含む
ことを特徴とする請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
上記抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする請求項８又は９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項８から１０に記載の抗体を含有する薬学的組成物。
【請求項１２】
癌の治療のための医薬の調製のための請求項８から１０の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１３】
癌に罹患している患者を、治療を必要とする上記患者に請求項８から１０の何れか一項に記載の抗体を投与することによって治療する方法。
【請求項１４】
請求項８から１０に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１５】
原核生物又は真核生物宿主細胞中に核酸を発現可能な、請求項１４に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含む原核生物又は真核生物宿主細胞。
【請求項１７】
原核生物又は真核生物宿主細胞中に請求項１４に記載の核酸を発現させ、上記細胞又は細胞培養上清から上記抗体を回収することを特徴とする、請求項８から１０に記載の組換え抗体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【公表番号】特表２０１３−５０２９０５（Ｐ２０１３−５０２９０５Ａ）
【公表日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２５９３３（Ｐ２０１２−５２５９３３）
【出願日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００５２４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２３３９０
【国際公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【出願人】（３０６０２１１９２）エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト (58)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００５２４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２３３９０
【国際公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【出願人】（３０６０２１１９２）エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト (58)
【Ｆターム（参考）】
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