癌の治療薬のスクリーニング方法及び癌の治療薬
【課題】Unc5H4の機能を解析し、そこから導かれる様々な疾患の治療薬のスクリーニング方法及び治療薬を提供することを目的とする。
【解決手段】被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞におけるUnc5H4の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量が被検化合物の非存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量よりも多い場合に、当該被検化合物を癌の治療薬と判定する工程と、を備える、癌の治療薬のスクリーニング方法。
【解決手段】被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞におけるUnc5H4の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量が被検化合物の非存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量よりも多い場合に、当該被検化合物を癌の治療薬と判定する工程と、を備える、癌の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌の治療薬のスクリーニング方法及び癌の治療薬に関し、特に、神経芽腫のスクリーニング方法及び神経芽腫の治療薬に関する。
【背景技術】
【0002】
Unc5H4(GenBank Accession:AB055056;別名Unc5D)は、ヒト脳由来のcDNAライブラリーから同定されたUnc遺伝子ファミリーの一つである(特許文献1)。
【0003】
また、神経芽腫の予後良好群及び予後不良群を比較した場合に、予後良好群でUnc5H4の発現が高いことを、本発明者らは報告している(特許文献2)。
【0004】
【特許文献1】特開2002−153290
【特許文献2】国際公開第01/066733号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、Unc5H4の機能は解明されておらず、Unc5H4の機能を解析することで様々な疾患の治療薬の開発につながる可能性がある。したがって、本発明の目的はUnc5H4の機能を解析することにある。さらに、機能解析から導かれる様々な疾患の治療薬のスクリーニング方法及び治療薬を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、Unc5H4がp53の標的分子であり、Unc5H4はカスペース3を活性化することで細胞死を誘導すること、また神経芽腫の予後診断のマーカーとなることを見出した。さらに、神経芽腫の自然退縮の分子機構に深く関与することが示唆された。すなわち、Unc5H4は細胞の生死をスイッチングする重要な受容体であり、多くの癌において分子標的となる可能性が高く、癌の治療薬の開発に役立つことを本発明者らは明らかにし、本発明を完成するに至った。
【0007】
すなわち、本発明は、
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞におけるUnc5H4の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量が被検化合物の非存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量よりも多い場合に、当該被検化合物を癌の治療薬と判定する工程と、
を備える、癌の治療薬のスクリーニング方法
を提供する。本スクリーニング方法は、p53の標的分子であるUnc5H4がカスペース3を活性化することで細胞死を誘導するという分子メカニズムを応用したものである。かかる分子メカニズムは本発明者らが新たに見出したものであり、したがって、今までとは作用機序が全く異なる癌の治療薬を本スクリーニング方法により得ることが可能である。 本発明は、また、配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなる癌の治療薬を提供する。配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質はヒトUnc5H4タンパク質に相当する。
【0008】
本発明は、さらに、配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなる癌の治療薬を提供する。ここで、核酸は配列番号17に示す核酸配列からなる核酸であることが好ましい。配列番号17に示す核酸配列からなる核酸はヒトUnc5H4遺伝子に相当する。
【0009】
本発明において、癌は神経芽腫であることが好ましい。
【発明の効果】
【0010】
本発明の癌の治療薬のスクリーニング方法によれば、新たな作用機序の癌の治療薬を得ることが可能である。また、本発明の癌の治療薬は新たな作用機序に基づくものであり、癌治療の選択肢を広げることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0011】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【0012】
(癌の治療薬のスクリーニング方法)
本発明の癌の治療薬のスクリーニング方法は、
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞におけるUnc5H4の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量が被検化合物の非存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量よりも多い場合に、当該被検化合物を癌の治療薬と判定する工程と、
を備えることを特徴とする。
【0013】
被検化合物は、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸(DNA、RNA、PNA等)などが挙げられるが、これらに限定しない。また、スクリーニングには、任意のスクリーニング用化合物ライブラリーを用いてもよい。なお、使用する細胞の種類、細胞の培養条件及び被検化合物の処理条件は、当業者であれば、適宜調整することが可能である。
【0014】
Unc5H4の発現量とは、Unc5H4遺伝子の転写産物であるmRNAの発現量及び/又はその翻訳産物であるUnc5H4タンパク質の発現量を指す。mRNAの発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、具体的には、定量的RT−PCR法、定量的リアルタイムRT−PCR法、定量的ノザンブロッティング法、定量的リボヌクレアーゼプロテクション法などが挙げられる。タンパク質の発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、例えば、定量的ウエスタンブロッティング法、ELISA法などが挙げられる。これら方法を用いることによって、Unc5H4の発現量を測定することが可能である。
【0015】
被検化合物の存在下のUnc5H4の発現量が被検化合物の非存在下のUnc5H4の発現量よりも多い被検化合物を癌の治療薬と判定することができる。これは、Unc5H4がカスペース3を活性化し、その結果、細胞死を誘導するという本発明者らが見出した知見に基づくものである。
【0016】
(癌の治療薬)
本発明の癌の治療薬は、配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなることを特徴とする。配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質はヒトUnc5H4タンパク質に相当する。本発明者らが見出した分子メカニズムによれば、Unc5H4はカスペース3を活性化し、その結果、細胞死を誘導する。したがって、本発明の癌治療薬を癌細胞、癌組織又は癌患者に接触又は投与することにより、癌の抑制・治療を行うことが可能である。ここで、癌は神経芽腫であることが好ましい。
【0017】
また、本発明の癌の治療薬は、配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなることを特徴とする。ここで、核酸は配列番号17に示す核酸配列からなることが好ましい。配列番号17に示す核酸配列からなる核酸はヒトUnc5H4遺伝子に相当する。本発明者らが見出した分子メカニズムによれば、Unc5H4はカスペース3を活性化し、その結果、細胞死を誘導する。したがって、本発明の癌治療薬を適切なベクターに組み込み、ベクターを癌細胞、癌組織又は癌患者に接触又は投与することにより、癌の抑制・治療を行うことが可能である。ここで、癌は神経芽腫であることが好ましい。
【0018】
ベクターは当業者にとって公知なベクターを利用することが可能であり、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスを改変したウイルスベクターなどが挙げられ、リポソーム等の非ウイルスベクター等も挙げられる。
【実施例】
【0019】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0020】
(実験材料)
ヒト組織RNAはClontech社、アドリアマイシンはSigma社から購入した。抗Unc5H4抗体はR&D Systems社又はBML社に特注したものを使用した。抗p53抗体はCalbiochem社、抗βアクチン抗体はシグマ社から購入した。リアルタイムPCRキットはApplied Biosystems社から購入した。カスペース3活性キットはR&D Systems社から購入した。
【0021】
PCRに用いた各種プライマーは以下の通りである。
Unc5H1:5'-agacgggcacagatttgaac-3'
5'-gtgaagctgtggtgttggtg-3'
Unc5H2:5'-GTTGCCTCTCCTCCTCCTCT-3'
5'-TAAAACCCATGGAACCCAGA-3'
Unc5H3:5'-ATGCCCACTTTACTCGGAGA-3'
5'-CGTCCACAGCTTCAACTTCA-3'
Unc5H4:5'-TGAACTGCAGATGCCATAGG-3'
5'-GGTTTCAGGGACACTGTGGT-3'
p53:5'-ATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGA-3'
5'-ACCCTTTTTGGACTTCAGGTGGCTGGAGT-3'
p21WAF1:5'-GACACCACTGGAGGGTGACT-3'
5'-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAA-3'
BAX:5'-TCTGACGGCAACTTCAACAC-3'
5'-GAGGAGTCTCACCCAACCAC-3'
GAPDH:5'-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3'
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'
【0022】
(実験方法)
RT−PCR法、ウエスタンブロット解析及びルシフェラーゼレポーターアッセイは、Ando et al., J. Biol. Chem., 279: 25549-25561, 2004に記載の方法と同様の方法で行った。リアルタイムPCR法は、Kawamoto et al., Med. Pediatr. Oncol., 35: 628-631, 2000に記載の方法と同様の方法で行った。in situハイブリダイゼーション法は、Machida et al., Oncogene, 23: 1931-1942, 2006に記載の方法と同様の方法で行った。
【0023】
(実施例1) COS7細胞におけるUnc5H4タンパク質の発現
COS7細胞にUnc5H4をコードする発現プラスミド(コントロールとしてpcDNA3を使用した)を導入した。48時間後に細胞からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロット法によりUnc5H4タンパク質の発現解析を行った。図1にウエスタンブロット法による解析結果を示す。図1から明らかなように、Unc5H4タンパク質の発現が認められ、導入したUnc5H4はタンパク質に翻訳されることが確認された。
【0024】
(実施例2) ヒト組織におけるUnc5Hの発現解析
ヒトの様々な組織からRNAを抽出し、RT−PCR法によりUnc5Hファミリーの発現解析を行った。図2にRT−PCR法による解析結果を示す。Unc5H1は、心臓、肺、結腸、脾臓、小脳、胎児の脳および副腎で、Unc5H2は主に肺、前立腺および小脳で、Unc5H3は肺、結腸、脾臓、精巣、前立腺、脳、小脳、肝臓、胎児の脳および副腎で、Unc5H4は主に前立腺、脳、小脳および胎児の脳で発現が高かった。
【0025】
(実施例3) in situハイブリダイゼーション法によるUnc5H4の発現解析
11日目のマウス胎児を用いて、in situハイブリダイゼーション法によりUnc5H4の発現解析を行った。図3から分かるように、Unc5H4は前肢、後肢及び後根神経節で発現が認められた。
【0026】
(実施例4) Unc5H4が細胞増殖能に及ぼす影響
H1299細胞(p53ヌル)にUnc5H4遺伝子を導入し、細胞の増殖速度を検討した。図4から分かるように、空ベクター(pcDNA3)を導入した細胞に比べて、Unc5H4遺伝子を導入した細胞は細胞増殖速度が遅かった。
【0027】
(実施例5) Unc5H4がカスペース3活性に及ぼす影響
Hela細胞にUnc5H4遺伝子(2μg)を導入し、24時間後にNetrin−1(250ng/ml)を加えた。その後、カスペース3活性を測定した。図5に示したように、Unc5H4遺伝子を導入した細胞は、カスペース3の活性が約2倍に上昇したが、Netrin−1の添加により、その活性は抑制された。
【0028】
(実施例6) 神経芽腫の予後とUnc5Hの発現との関係
神経芽腫の予後良好群及び予後不良群のサンプルを用いてUnc5Hファミリー(5H1、5H2、5H3及び5H4)の発現をRT−PCR法により解析した。図6に示したように、Unc5H1及びUnc5H4の発現は、予後良好群で高かった。
【0029】
(実施例7) リアルタイムPCR法によるUnc5H4の発現解析
神経芽腫の予後良好群(n=56)及び予後不良群(n=62)のサンプルを用いてリアルタイムPCR法によりUnc5H4の発現解析を行った。結果を図7及び表1に示す。図7及び表1から分かるように、予後良好群においてUnc5H4の高発現が認められた。
【0030】
【表1】
【0031】
(実施例8) Unc5H4の発現と神経芽腫患者の生存率
神経芽腫の予後良好群及び予後不良群について、Unc5H4の発現と生存率の関係をKaplan−Meier法により解析した。解析結果を図8に示す。Unc5H4の発現が高いほど生存率は高かった。
【0032】
(実施例9) Unc5H4の発現と予後不良な神経芽腫患者の生存率
神経芽腫の予後不良群について、Unc5H4の発現と生存率の関係をKaplan−Meier法により解析した。解析結果を図9に示す。Unc5H4の発現が高いほど生存率は高かった。
【0033】
(実施例10) Unc5H4の発現と神経芽腫患者(N−myc増幅)の生存率
神経芽腫のN−myc増幅症例について、Unc5H4の発現と生存率の関係をKaplan−Meier法により解析した。解析結果を図10及び表2に示す。Unc5H4の発現が高いほど生存率は高かった。
【0034】
【表2】
【0035】
(実施例11) p53過剰発現によるUnc5H4の誘導
H1299細胞にp53を過剰発現させ、RT−PCR法によりUnc5H4の発現を解析した。また、同時にp21WAF1及びBaxの発現も調べた。結果を図11に示す。p53の発現に伴い、Unc5H4の発現は増加した。このとき、p21WAF1及びBaxの発現も誘導された。
【0036】
(実施例12) アドリアマイシン処理によるUnc5H4の誘導
H1299細胞及びU2OS細胞(p53野生型)にアドリアマイシン(1μg/ml)を加え、所定時間経過後に細胞からRNAを抽出し、RT−PCR法によりUnc5H4の発現を解析した。結果を図12に示す。p53を発現しているU2OS細胞では、アドリアマイシン処理によりUnc5H4の発現が増加したが、p53を発現していないH1299細胞ではアドリアマイシン処理によってUnc5H4の発現に変化は認められなかった。
【0037】
(実施例13) p53過剰発現によるUnc5H4タンパク質の誘導
実施例11と同様にH1299細胞にp53を過剰発現させ、ウエスタンブロット法によりUnc5H4タンパク質の発現解析を行った。結果を図13に示す。p53の過剰発現によりタンパク質レベルにおいてもUnc5H4の発現が増加することが確認された。
【0038】
(実施例14) p53過剰発現による切断されたUnc5H4タンパク質の誘導
実施例11と同様にH1299細胞にp53を過剰発現させ、ウエスタンブロット法により切断されたUnc5H4タンパク質の発現解析を行った。結果を図14に示す。p53の発現に伴い切断されたUnc5H4タンパク質が発現することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】COS7細胞からのタンパク質をウエスタンブロット解析した結果を表す図である。Aは抗Unc5H4抗体を使用した時の結果を表し、Bは抗Flag抗体を使用したときの結果を表す。
【図2】ヒト組織からのRNAをRT−PCR解析した結果を表す図である。
【図3】11日目のマウス胎児のホールマウントin situハイブリダイゼーションの結果を表す図である。Aはアンチセンスプローブを、Bはセンスプローブを用いた結果を表す。
【図4】遺伝子導入したH1299細胞の細胞増殖速度を表す図である。
【図5】Hela細胞のカスペース3活性を表す図である。
【図6】予後良好な、及び予後不良な神経芽腫におけるUnc5Hファミリーの発現をRT−PCRで解析した結果を表す図である。
【図7】Unc5H4の発現をリアルタイムPCRで解析した結果を表す図である。
【図8】Unc5H4の発現と神経芽腫患者の生存率の関係をKaplan−Meier法により解析した結果を表す図である。
【図9】Unc5H4の発現と予後不良な神経芽腫患者の生存率の関係をKaplan−Meier法により解析した結果を表す図である。
【図10】Unc5H4の発現と神経芽腫患者(N−myc増幅)の生存率の関係をKaplan−Meier法により解析した結果を表す図である。
【図11】p53過剰発現によるUnc5H4の誘導をRT−PCRで解析した結果を表す図である。
【図12】アドリアマイシン処理によるUnc5H4の誘導をRT−PCRで解析した結果を表す図である。
【図13】p53過剰発現によるUnc5H4タンパク質の誘導をウエスタンブロット法で解析した結果を表す図である。
【図14】p53過剰発現による切断されたUnc5H4タンパク質の誘導をウエスタンブロット法で解析した結果を表す図である。
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌の治療薬のスクリーニング方法及び癌の治療薬に関し、特に、神経芽腫のスクリーニング方法及び神経芽腫の治療薬に関する。
【背景技術】
【0002】
Unc5H4(GenBank Accession:AB055056;別名Unc5D)は、ヒト脳由来のcDNAライブラリーから同定されたUnc遺伝子ファミリーの一つである(特許文献1)。
【0003】
また、神経芽腫の予後良好群及び予後不良群を比較した場合に、予後良好群でUnc5H4の発現が高いことを、本発明者らは報告している(特許文献2)。
【0004】
【特許文献1】特開2002−153290
【特許文献2】国際公開第01/066733号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、Unc5H4の機能は解明されておらず、Unc5H4の機能を解析することで様々な疾患の治療薬の開発につながる可能性がある。したがって、本発明の目的はUnc5H4の機能を解析することにある。さらに、機能解析から導かれる様々な疾患の治療薬のスクリーニング方法及び治療薬を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、Unc5H4がp53の標的分子であり、Unc5H4はカスペース3を活性化することで細胞死を誘導すること、また神経芽腫の予後診断のマーカーとなることを見出した。さらに、神経芽腫の自然退縮の分子機構に深く関与することが示唆された。すなわち、Unc5H4は細胞の生死をスイッチングする重要な受容体であり、多くの癌において分子標的となる可能性が高く、癌の治療薬の開発に役立つことを本発明者らは明らかにし、本発明を完成するに至った。
【0007】
すなわち、本発明は、
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞におけるUnc5H4の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量が被検化合物の非存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量よりも多い場合に、当該被検化合物を癌の治療薬と判定する工程と、
を備える、癌の治療薬のスクリーニング方法
を提供する。本スクリーニング方法は、p53の標的分子であるUnc5H4がカスペース3を活性化することで細胞死を誘導するという分子メカニズムを応用したものである。かかる分子メカニズムは本発明者らが新たに見出したものであり、したがって、今までとは作用機序が全く異なる癌の治療薬を本スクリーニング方法により得ることが可能である。 本発明は、また、配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなる癌の治療薬を提供する。配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質はヒトUnc5H4タンパク質に相当する。
【0008】
本発明は、さらに、配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなる癌の治療薬を提供する。ここで、核酸は配列番号17に示す核酸配列からなる核酸であることが好ましい。配列番号17に示す核酸配列からなる核酸はヒトUnc5H4遺伝子に相当する。
【0009】
本発明において、癌は神経芽腫であることが好ましい。
【発明の効果】
【0010】
本発明の癌の治療薬のスクリーニング方法によれば、新たな作用機序の癌の治療薬を得ることが可能である。また、本発明の癌の治療薬は新たな作用機序に基づくものであり、癌治療の選択肢を広げることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0011】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【0012】
(癌の治療薬のスクリーニング方法)
本発明の癌の治療薬のスクリーニング方法は、
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞におけるUnc5H4の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量が被検化合物の非存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量よりも多い場合に、当該被検化合物を癌の治療薬と判定する工程と、
を備えることを特徴とする。
【0013】
被検化合物は、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸(DNA、RNA、PNA等)などが挙げられるが、これらに限定しない。また、スクリーニングには、任意のスクリーニング用化合物ライブラリーを用いてもよい。なお、使用する細胞の種類、細胞の培養条件及び被検化合物の処理条件は、当業者であれば、適宜調整することが可能である。
【0014】
Unc5H4の発現量とは、Unc5H4遺伝子の転写産物であるmRNAの発現量及び/又はその翻訳産物であるUnc5H4タンパク質の発現量を指す。mRNAの発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、具体的には、定量的RT−PCR法、定量的リアルタイムRT−PCR法、定量的ノザンブロッティング法、定量的リボヌクレアーゼプロテクション法などが挙げられる。タンパク質の発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、例えば、定量的ウエスタンブロッティング法、ELISA法などが挙げられる。これら方法を用いることによって、Unc5H4の発現量を測定することが可能である。
【0015】
被検化合物の存在下のUnc5H4の発現量が被検化合物の非存在下のUnc5H4の発現量よりも多い被検化合物を癌の治療薬と判定することができる。これは、Unc5H4がカスペース3を活性化し、その結果、細胞死を誘導するという本発明者らが見出した知見に基づくものである。
【0016】
(癌の治療薬)
本発明の癌の治療薬は、配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなることを特徴とする。配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質はヒトUnc5H4タンパク質に相当する。本発明者らが見出した分子メカニズムによれば、Unc5H4はカスペース3を活性化し、その結果、細胞死を誘導する。したがって、本発明の癌治療薬を癌細胞、癌組織又は癌患者に接触又は投与することにより、癌の抑制・治療を行うことが可能である。ここで、癌は神経芽腫であることが好ましい。
【0017】
また、本発明の癌の治療薬は、配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなることを特徴とする。ここで、核酸は配列番号17に示す核酸配列からなることが好ましい。配列番号17に示す核酸配列からなる核酸はヒトUnc5H4遺伝子に相当する。本発明者らが見出した分子メカニズムによれば、Unc5H4はカスペース3を活性化し、その結果、細胞死を誘導する。したがって、本発明の癌治療薬を適切なベクターに組み込み、ベクターを癌細胞、癌組織又は癌患者に接触又は投与することにより、癌の抑制・治療を行うことが可能である。ここで、癌は神経芽腫であることが好ましい。
【0018】
ベクターは当業者にとって公知なベクターを利用することが可能であり、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスを改変したウイルスベクターなどが挙げられ、リポソーム等の非ウイルスベクター等も挙げられる。
【実施例】
【0019】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0020】
(実験材料)
ヒト組織RNAはClontech社、アドリアマイシンはSigma社から購入した。抗Unc5H4抗体はR&D Systems社又はBML社に特注したものを使用した。抗p53抗体はCalbiochem社、抗βアクチン抗体はシグマ社から購入した。リアルタイムPCRキットはApplied Biosystems社から購入した。カスペース3活性キットはR&D Systems社から購入した。
【0021】
PCRに用いた各種プライマーは以下の通りである。
Unc5H1:5'-agacgggcacagatttgaac-3'
5'-gtgaagctgtggtgttggtg-3'
Unc5H2:5'-GTTGCCTCTCCTCCTCCTCT-3'
5'-TAAAACCCATGGAACCCAGA-3'
Unc5H3:5'-ATGCCCACTTTACTCGGAGA-3'
5'-CGTCCACAGCTTCAACTTCA-3'
Unc5H4:5'-TGAACTGCAGATGCCATAGG-3'
5'-GGTTTCAGGGACACTGTGGT-3'
p53:5'-ATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGA-3'
5'-ACCCTTTTTGGACTTCAGGTGGCTGGAGT-3'
p21WAF1:5'-GACACCACTGGAGGGTGACT-3'
5'-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAA-3'
BAX:5'-TCTGACGGCAACTTCAACAC-3'
5'-GAGGAGTCTCACCCAACCAC-3'
GAPDH:5'-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3'
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'
【0022】
(実験方法)
RT−PCR法、ウエスタンブロット解析及びルシフェラーゼレポーターアッセイは、Ando et al., J. Biol. Chem., 279: 25549-25561, 2004に記載の方法と同様の方法で行った。リアルタイムPCR法は、Kawamoto et al., Med. Pediatr. Oncol., 35: 628-631, 2000に記載の方法と同様の方法で行った。in situハイブリダイゼーション法は、Machida et al., Oncogene, 23: 1931-1942, 2006に記載の方法と同様の方法で行った。
【0023】
(実施例1) COS7細胞におけるUnc5H4タンパク質の発現
COS7細胞にUnc5H4をコードする発現プラスミド(コントロールとしてpcDNA3を使用した)を導入した。48時間後に細胞からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロット法によりUnc5H4タンパク質の発現解析を行った。図1にウエスタンブロット法による解析結果を示す。図1から明らかなように、Unc5H4タンパク質の発現が認められ、導入したUnc5H4はタンパク質に翻訳されることが確認された。
【0024】
(実施例2) ヒト組織におけるUnc5Hの発現解析
ヒトの様々な組織からRNAを抽出し、RT−PCR法によりUnc5Hファミリーの発現解析を行った。図2にRT−PCR法による解析結果を示す。Unc5H1は、心臓、肺、結腸、脾臓、小脳、胎児の脳および副腎で、Unc5H2は主に肺、前立腺および小脳で、Unc5H3は肺、結腸、脾臓、精巣、前立腺、脳、小脳、肝臓、胎児の脳および副腎で、Unc5H4は主に前立腺、脳、小脳および胎児の脳で発現が高かった。
【0025】
(実施例3) in situハイブリダイゼーション法によるUnc5H4の発現解析
11日目のマウス胎児を用いて、in situハイブリダイゼーション法によりUnc5H4の発現解析を行った。図3から分かるように、Unc5H4は前肢、後肢及び後根神経節で発現が認められた。
【0026】
(実施例4) Unc5H4が細胞増殖能に及ぼす影響
H1299細胞(p53ヌル)にUnc5H4遺伝子を導入し、細胞の増殖速度を検討した。図4から分かるように、空ベクター(pcDNA3)を導入した細胞に比べて、Unc5H4遺伝子を導入した細胞は細胞増殖速度が遅かった。
【0027】
(実施例5) Unc5H4がカスペース3活性に及ぼす影響
Hela細胞にUnc5H4遺伝子(2μg)を導入し、24時間後にNetrin−1(250ng/ml)を加えた。その後、カスペース3活性を測定した。図5に示したように、Unc5H4遺伝子を導入した細胞は、カスペース3の活性が約2倍に上昇したが、Netrin−1の添加により、その活性は抑制された。
【0028】
(実施例6) 神経芽腫の予後とUnc5Hの発現との関係
神経芽腫の予後良好群及び予後不良群のサンプルを用いてUnc5Hファミリー(5H1、5H2、5H3及び5H4)の発現をRT−PCR法により解析した。図6に示したように、Unc5H1及びUnc5H4の発現は、予後良好群で高かった。
【0029】
(実施例7) リアルタイムPCR法によるUnc5H4の発現解析
神経芽腫の予後良好群(n=56)及び予後不良群(n=62)のサンプルを用いてリアルタイムPCR法によりUnc5H4の発現解析を行った。結果を図7及び表1に示す。図7及び表1から分かるように、予後良好群においてUnc5H4の高発現が認められた。
【0030】
【表1】
【0031】
(実施例8) Unc5H4の発現と神経芽腫患者の生存率
神経芽腫の予後良好群及び予後不良群について、Unc5H4の発現と生存率の関係をKaplan−Meier法により解析した。解析結果を図8に示す。Unc5H4の発現が高いほど生存率は高かった。
【0032】
(実施例9) Unc5H4の発現と予後不良な神経芽腫患者の生存率
神経芽腫の予後不良群について、Unc5H4の発現と生存率の関係をKaplan−Meier法により解析した。解析結果を図9に示す。Unc5H4の発現が高いほど生存率は高かった。
【0033】
(実施例10) Unc5H4の発現と神経芽腫患者(N−myc増幅)の生存率
神経芽腫のN−myc増幅症例について、Unc5H4の発現と生存率の関係をKaplan−Meier法により解析した。解析結果を図10及び表2に示す。Unc5H4の発現が高いほど生存率は高かった。
【0034】
【表2】
【0035】
(実施例11) p53過剰発現によるUnc5H4の誘導
H1299細胞にp53を過剰発現させ、RT−PCR法によりUnc5H4の発現を解析した。また、同時にp21WAF1及びBaxの発現も調べた。結果を図11に示す。p53の発現に伴い、Unc5H4の発現は増加した。このとき、p21WAF1及びBaxの発現も誘導された。
【0036】
(実施例12) アドリアマイシン処理によるUnc5H4の誘導
H1299細胞及びU2OS細胞(p53野生型)にアドリアマイシン(1μg/ml)を加え、所定時間経過後に細胞からRNAを抽出し、RT−PCR法によりUnc5H4の発現を解析した。結果を図12に示す。p53を発現しているU2OS細胞では、アドリアマイシン処理によりUnc5H4の発現が増加したが、p53を発現していないH1299細胞ではアドリアマイシン処理によってUnc5H4の発現に変化は認められなかった。
【0037】
(実施例13) p53過剰発現によるUnc5H4タンパク質の誘導
実施例11と同様にH1299細胞にp53を過剰発現させ、ウエスタンブロット法によりUnc5H4タンパク質の発現解析を行った。結果を図13に示す。p53の過剰発現によりタンパク質レベルにおいてもUnc5H4の発現が増加することが確認された。
【0038】
(実施例14) p53過剰発現による切断されたUnc5H4タンパク質の誘導
実施例11と同様にH1299細胞にp53を過剰発現させ、ウエスタンブロット法により切断されたUnc5H4タンパク質の発現解析を行った。結果を図14に示す。p53の発現に伴い切断されたUnc5H4タンパク質が発現することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】COS7細胞からのタンパク質をウエスタンブロット解析した結果を表す図である。Aは抗Unc5H4抗体を使用した時の結果を表し、Bは抗Flag抗体を使用したときの結果を表す。
【図2】ヒト組織からのRNAをRT−PCR解析した結果を表す図である。
【図3】11日目のマウス胎児のホールマウントin situハイブリダイゼーションの結果を表す図である。Aはアンチセンスプローブを、Bはセンスプローブを用いた結果を表す。
【図4】遺伝子導入したH1299細胞の細胞増殖速度を表す図である。
【図5】Hela細胞のカスペース3活性を表す図である。
【図6】予後良好な、及び予後不良な神経芽腫におけるUnc5Hファミリーの発現をRT−PCRで解析した結果を表す図である。
【図7】Unc5H4の発現をリアルタイムPCRで解析した結果を表す図である。
【図8】Unc5H4の発現と神経芽腫患者の生存率の関係をKaplan−Meier法により解析した結果を表す図である。
【図9】Unc5H4の発現と予後不良な神経芽腫患者の生存率の関係をKaplan−Meier法により解析した結果を表す図である。
【図10】Unc5H4の発現と神経芽腫患者(N−myc増幅)の生存率の関係をKaplan−Meier法により解析した結果を表す図である。
【図11】p53過剰発現によるUnc5H4の誘導をRT−PCRで解析した結果を表す図である。
【図12】アドリアマイシン処理によるUnc5H4の誘導をRT−PCRで解析した結果を表す図である。
【図13】p53過剰発現によるUnc5H4タンパク質の誘導をウエスタンブロット法で解析した結果を表す図である。
【図14】p53過剰発現による切断されたUnc5H4タンパク質の誘導をウエスタンブロット法で解析した結果を表す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞におけるUnc5H4の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量が被検化合物の非存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量よりも多い場合に、当該被検化合物を癌の治療薬と判定する工程と、
を備える、癌の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項2】
癌が神経芽腫である、請求項1に記載のスクリーニング方法。
【請求項3】
配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなる癌の治療薬。
【請求項4】
配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなる癌の治療薬。
【請求項5】
前記核酸が配列番号17に示す核酸配列からなる核酸である請求項4に記載の治療薬。
【請求項6】
癌が神経芽腫である、請求項3−5いずれか一項に記載の治療薬。
【請求項1】
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞におけるUnc5H4の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量が被検化合物の非存在下で培養した細胞のUnc5H4の発現量よりも多い場合に、当該被検化合物を癌の治療薬と判定する工程と、
を備える、癌の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項2】
癌が神経芽腫である、請求項1に記載のスクリーニング方法。
【請求項3】
配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなる癌の治療薬。
【請求項4】
配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなる癌の治療薬。
【請求項5】
前記核酸が配列番号17に示す核酸配列からなる核酸である請求項4に記載の治療薬。
【請求項6】
癌が神経芽腫である、請求項3−5いずれか一項に記載の治療薬。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【公開番号】特開2008−29293(P2008−29293A)
【公開日】平成20年2月14日(2008.2.14)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−208699(P2006−208699)
【出願日】平成18年7月31日(2006.7.31)
【出願人】(000160522)久光製薬株式会社 (121)
【出願人】(591014710)千葉県 (49)
【上記1名の代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
【Fターム(参考)】
【公開日】平成20年2月14日(2008.2.14)
【国際特許分類】
【出願日】平成18年7月31日(2006.7.31)
【出願人】(000160522)久光製薬株式会社 (121)
【出願人】(591014710)千葉県 (49)
【上記1名の代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
【Fターム(参考)】
[ Back to top ]