癌を治療するための、Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドに特異的なモノクローナル抗体の使用
本発明は、Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識するモノクローナル抗体または前記抗体の断片の、細胞がＯ−アセチル化ＧＤ２を発現する癌の診断および治療のための使用に関し、前記抗体または前記断片は、診断の特異性を向上し、治療の毒性を低減するために、腫瘍細胞が発現するＯ−アセチル化ＧＤ２分子を認識し、末梢神経の表面で発現するＧＤ２分子は認識しない。本発明はまた、細胞がＯ−アセチル化ＧＤ２を発現する癌を治療および診断するために有利に使用される人工修飾抗体に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞を有する癌の診断および治療のための新規な方法を提供する。これら方法は、Ｏ−アセチル化ＧＤ２を認識し、健康細胞および末梢神経系の神経線維は認識しない、組換えモノクローナル抗体またはその断片の使用を本質的に含む。この新規な方法は、既に癌の治療に使用されている抗体および誘導体に比べて、癌細胞への特異的がより高く、治療の毒性を低減しうる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞の表面には多くの抗原決定基がある。これらの抗原決定基の一部は腫瘍に特異的な抗原である。この腫瘍抗原は、主にまたはもっぱら癌細胞表面で発現する。
【０００３】
これらのヒト腫瘍抗原は、マウス等の異なる種の免疫系によって、抗体として知られる分子の産生を誘導する。この抗体には、抗体自身が由来する抗原分子を特異的に認識するという特徴がある。
【０００４】
モノクローナル抗体とそのヒト腫瘍抗原との間のこの特異的認識は、癌の免疫ターゲッティングに特に利点がある。実際、これによって、腫瘍を診断するための検出剤または治療するための毒性薬剤を患部組織または患部臓器に集中させることができる。これらの検出剤または毒性薬剤としては、その投与の前または後に抗体に人工的に連結された、必要に応じて放射性の、化学化合物、または生体化合物が含まれ得る。これらの薬剤はまた、抗体によって腫瘍細胞へと集まる、患者に天然に存在する生体化合物（補体成分、ケモカイン、サイトカイン、細胞毒性細胞（例えばＴまたはＮＫリンパ球））であってもよい。
【０００５】
ガングリオシドは細胞膜の構成成分であり、その一部は腫瘍抗原として特徴付けられている。ＧＤ２ガングリオシドは、特に黒色腫、膠芽腫、小細胞肺性癌、神経芽細胞腫等の神経外胚葉起源のヒトの癌で多く発現していることが示され得る。上記の腫瘍病理のリストは網羅的ではない。網膜芽細胞腫および骨肉腫もＧＤ２ガングリオシドを発現する。一部の卵巣癌もＧＤ２ガングリオシドを発現する。ＧＤ２ガングリオシドは、セラミドが、グルコース・ガラクトース・Ｎ−アセチル−ガラクトサミンの配列を有するオリゴ糖と組み合わさって形成される糖脂質酸（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ａｃｉｄ）である。ガラクトース分子には２分子のシアル酸が結合している。末端シアル酸にＯ−アセチル部分を加えてＯ−アセチル化ＧＤ２が生成されるように修飾することができる。ＧＤ２に特異的でありかつそのＯ−アセチル化型も認識する抗体を用いることで、特定の種類のがん、特に神経外胚葉起源の腫瘍が、ＧＤ２およびそのＯ−アセチル化型であるＯ−アセチル化ＧＤ２を様々な比率で発現していることを示すことができるであろう。
【０００６】
マウスで産生された、数種のモノクローナル抗ＧＤ２抗体が報告されている。抗ＧＤ２モノクローナル抗体である１４．Ｇ２ａおよび３Ｆ８（それぞれクラスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３マウス免疫グロブリンに属する）の治療における使用が臨床研究で試験されてきた。
【０００７】
これらの研究から、マウスモノクローナル抗体に固有な複数の悪性副作用が指摘されてきた。
【０００８】
そのような副作用の１つは、マウス抗体に対して人間が起こす免疫応答によって生じるアレルギー反応またはアナフィラキシー反応である。
【０００９】
マウスで産生されたモノクローナル抗体のこのような免疫原性の問題を解決するために、遺伝子工学技術を用いてキメラ抗体を製造することが可能である。「キメラ」抗体とは、マウス抗体をコードする遺伝情報の幾分重要な部分をヒト抗体の対応する部分を用いて遺伝的に改変された抗体を意味する。一般的に、マウス抗体の重鎖および軽鎖（ＶＨおよびＶＬ）の可変領域が保存され、抗体分子の残りの部分がヒト抗体に由来する。このキメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に固有の腫瘍抗原特異的な認識を維持する一方で、ヒト抗体に固有の生理学的性質およびエフェクター特性を有する。それゆえ、臨床研究から、キメラ抗体ｃｈ．ｌ４Ｇ２ａおよびｃｈ．１４．１８は、それらが由来するマウスモノクローナル抗体と比較して低い免疫原性および長い血清半減期を有することが示されている。さらに、マウス抗ＧＤ２モノクローナル抗体は、キメラ化されたときにより強くヒトエフェクター細胞をリクルートする能力を示し、一方マウス抗体がこれらのヒトエフェクター細胞をリクルートする能力は限定的であることが示されている。
【００１０】
さらにマウス抗体をヒト抗体に同定するには、抗体の特異性を決定する抗原付着部位を含むいわゆるＣＤＲ領域または「相補性決定領域」中のアミノ酸のみをマウス抗体から保存することで行うことができる。「ヒト化」抗体とは、最初のマウス抗体のＣＤＲのアミノ酸のみ（所望により、さらにこのＣＤＲ領域近くの数アミノ酸）が保存され、分子の残りの部分がヒト抗体に由来する、遺伝的に改変された抗体を意味する。
【００１１】
先行技術の不利
治療または診断のためのインビボでのモノクローナル抗体の使用のためには、後者が特定の特異性、親和性、および非毒性という要件を満たす必要がある。しかし、モノクローナルおよびキメラ抗ＧＤ２抗体について行われた臨床研究から、キメラ化またはヒト化で解決されない大きな悪性副作用である抗ＧＤ２抗体による神経毒性が立証された。実際、抗ＧＤ２抗体を投与された神経外胚葉起源の癌患者は、抗体を投与されている間痛みに苦しみ、これらの患者の一部は末梢神経系の神経障害を発症した。この作用は、末梢系の神経線維細胞の表面にＧＤ２ガングリオシドが存在することで説明される。
【００１２】
したがって、抗ＧＤ２抗体の使用に固有のこの神経毒性が、この抗体を用いた免疫療法の臨床開発を制限してきたことは明確である。しかし、依然として非常に多くのＧＤ２抗原標的が、神経外胚葉起源の癌の免疫ターゲッティングにとって非常に重要な要素である。
【００１３】
この神経毒性の問題を解決する助けとなるであろう１つのアプローチは、ＧＤ２ガングリオシドとは異なる神経外胚葉起源の癌に関係する腫瘍抗原を認識し、かつ末梢系神経線維を認識しない抗体の使用であると考えられる。
【００１４】
数年前、本発明者らは、抗ＧＤ２抗体を製造するために、一連のマウスの免疫化を行った。それによって複数の抗ＧＤ２抗体を単離し、その特徴解析の結果、特に、Ｏ−アセチル部分が存在するようにわずかに修飾されたＧＤ２ガングリオシド分子を特異的に認識する、８Ｂ６と称するマウスＩｇＧ３クラスの抗体を同定した。この研究および特に８Ｂ６抗体については、引用することにより本明細書の一部とされる文献（Variable Region Gene Segments of Nine Monoclonal Antibodies Specific to Disialoganglisosides (GD2, GD3) and their O-Acetylated Derivative;Cerato et al., Hybridoma Volume 16, Number 4, 1997, 307-316
）に記載されている。
【００１５】
この抗体の構造が調べられたが、その先の展開は行われなかった。実際、当時、公知の抗ＧＤ２抗体に比べてこの新規の抗体に特別な興味が払われることはなかった。非アセチル化型のＧＤ２とは対照的に、Ｏ−アセチル化ＧＤ２の人間内での組織分布については、アセチル化型ＧＤ２に特異的なモノクローナル抗体の使用に基づく方法等の感度のよい検出方法がないために、未だに明確に実証されていない。したがって、この新規の抗体を臨床使用すれば、抗ＧＤ２モノクローナル抗体を使用した場合と同じ神経毒性の問題を生じるであろうと予想されていた。さらに、８Ｂ６抗体は細胞毒性活性が実証されておらず、ＩｇＧ３抗体は凝集しやすいために扱いが容易ではない。
【００１６】
発明の目的
ＧＤ２ガングリオシドを認識せず、Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドに特異的なモノクローナル抗体は、末梢神経線維を認識せず、そのため神経毒性を生じないという利点を有し得る。したがって、このような抗体は抗ＧＤ２モノクローナル抗体と比較して、ＧＤ２ガングリオシドをＯ−アセチル化型で発現する神経外胚葉起源のヒトの癌等の特定の種類の癌の免疫ターゲッティングに大きな利点を有し得る。
【００１７】
このような抗体は当業者に公知の種々の技術で得ることができる。これらの技術では、最初に動物、特にマウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ラマ等のラクダ科の免疫化が含まれている。免疫原性材料、すなわち、それに対して抗体が産生される抗原を含む製剤は、精製された糖脂質自体または未精製物もしくは一部精製混合物に含まれる糖脂質であってもよく、あるいは、糖脂質またはその部分（特にグリコシル化された親水性部分）の１つであってもよく、必要に応じて、免疫応答を刺激するための「キャリア」としてのタンパク質または脂質に共有結合されていてもよい。別の免疫化プロセスでは、免疫原性材料は、抗原を発現する細胞から調製することができ、そのような細胞は、腫瘍サンプルから得られる腫瘍細胞または初代細胞の株の細胞培養により得られる。有用な株としては、特に、マウスまたはヒトのＥＬ−４胸腺腫、例えば、ヒトＩＭＲ３２神経芽細胞腫、ヒトＵ８７ＭＧ膠芽腫、ＨＣＩ−Ｈ８２小細胞肺性癌、およびヒトＭ２１黒色腫等の動物細胞株が包含される。次いでこれらの細胞を全体（生細胞または固定細胞）として投与するか、分画して例えば細胞膜または細胞質成分を含む一部精製画分のみを注射することができる。
【００１８】
これらの免疫原性材料は、種々の経路、特に皮下、腹腔内、または筋肉内で、単独またはアジュバント（特にミョウバンまたはフロイントアジュバント）存在下で動物に投与することができる。免疫化は、数日から数ヶ月の頻度で繰り返すことができる。
【００１９】
一般的な３つの方法で、産業用途で使用できる抗体を提供することができる。第１の方法には、免疫化した動物から血液試料を採取し、当業者に公知のプロセスで、この血液試料からある程度（ｍｏｒｅ ｏｒ ｌｅｓｓ）精製された抗体（血清または血漿、全免疫グロブリン）を含む画分を抽出することが含まれてなる。この抗体をクロマトグラフィー技術または免疫吸着によってさらに精製してもよい。第２の方法では、抗体を合成することができる脾臓またはリンパ節細胞等の細胞を採取し、特に、当業者に公知のプロセスに従うウイルス形質転換または体細胞ハイブリダイゼーションにより、それらを不死化することが含まれてなる。不死化細胞の中から、クローニングによって、目的の抗体を産生する細胞のスクリーニングが可能になり、細胞培養することで、これらの抗体を培養液上清から単離し、それらを大量精製することが可能になる。最後に第３の方法には、抗体を合成することができる細胞、特に動物（免疫化されているか否かに関わらず）またはヒトから採取した脾臓、リンパ節、または末梢リンパ球細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡライブラリーを編集し、そこから当業者に公知の方法に基づくスクリーニング、特にファージディスプレイ発現系としても知られるバクテリオファージ表面でのライブラリー発現によって、目的の抗体の配列を選択することが含まれている。ＶＨ領域とＶＬ領域を連結する「単鎖」断片（「単鎖Ｆｖ」、ｓｃＦｖ）の形態またはＶＨ−ＣＨ１ペプチドセグメント（後者は定常領域の第１ドメインに相当）に関連する軽鎖からなるＦ（ａｂ）断片の形態で繊維状ファージの表面で発現される（「ファージディスプレイ」）、ヒトのＶＨ領域とＶＬ領域を組み合わせたライブラリーの構築。
【００２０】
本発明の抗体は、前述の方法のいずれかで得られた抗体から、Ｏ−アセチル化ＧＤ２抗原を認識し、非Ｏ−アセチル化ＧＤ２抗原は認識しないという点で選択することができ、この特徴を必要な特異性という。この選択は、抗体単離プロセスの間に、例えば必要な特異性を有する抗体産生細胞のみを増殖させることで行うことができる。あるいは、この特異性を有する抗体を選択するために、既に単離されている抗体を探索することもできるであろう。この目的のために、種々の方法を、特に間接免疫螢光法を、Ｏ−アセチル化ＧＤ２を発現することが知られている細胞（特にＩＭＲ３２）を認識する抗体を、ＧＤ２は発現するがＯ−アセチル化ＧＤ２は発現しない細胞（特にＮｅｕｒｏ２Ａ）も認識するであろう抗体から識別するために細胞に対して使用することができる。Ｏ−アセチル化ＧＤ２を発現する細胞のみに結合し、ＧＤ２のみを発現する細胞には結合しない抗体を選択するために、乾燥細胞にＥＬＩＳＡ免疫酵素アッセイを使用することもできるであろう。Ｏ−アセチル化ＧＤ２およびＧＤ２の両方を発現する細胞（特にＩＭＲ３２）の糖脂質成分を分離するシリカ薄層クロマトグラフィーを用いて、Ｏ−アセチル化ＧＤ２に相当するバンドのみを標識する抗体だけを得ることによっても、必要な特異性を有する抗体を選択することができるであろう。この結果は、脂質抽出物中のＯ−アセチル化ＧＤ２をアルカリ処理で分解し、標識が効果的に消失されることを調べることで確認することができるであろう。本発明の抗体の特異性を確認するためのこれらの技術の実例は、以下の本発明の詳細な説明に記載されている。同じ目的のために当業者はその他の方法を開発することもできる。
【００２１】
本発明の抗体は、種々の用途に好適なものにするために、当業者に公知の種々の技術で修飾することができる。したがって、単鎖ｓｃＦｖ抗体、および抗原結合能を維持している種々の融合タンパク質を製造するために、従来技術で公知の種々の方法を用いることができる。特に、例えば抗原認識能を失うことなくマウス定常領域をヒトの定常領域と交換するために、抗体のいわゆる定常領域を全体的に修飾することが知られている。キメラ抗体の構築には、マウスモノクローナル抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡの単離すること並びにそれをヒト免疫グロブリンの定常領域ＨおよびＬをコードするＤＮＡに結合させることが含まれてなる。このような遺伝的構築は、ヒトにおいて定常部分の免疫原性が全くないか非常に低いヒトハイブリッド抗体（一般的にヒトＩｇＧｌの定常部とヒトＣκ領域）を提供する。さらに、抗原認識に必要な領域、いわゆる超可変領域、相補性決定領域またはＣＤＲのみを保存し、実施のためにその他全部を置換することは公知であり、これは「ヒト化」として知られている。得られたこれらのタンパク質の混合物を、記述を簡単にするために「人工修飾抗体（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語で呼ぶ。
【００２２】
これらのタンパク質のいくつかは本発明の抗体にとって特に興味深い。例えば、ＧＤ２ガングリオシドを認識せずＯ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドの認識が保存された人工修飾Ｏ−アセチル化抗ＧＤ２抗体は、マウスＯ−アセチル化抗ＧＤ２モノクローナル抗体と比べて、より優れた物理的特徴およびエフェクター特徴を有するかもしれないという点で、大きな利点を有し得る。
【００２３】
Ｏ−アセチル化ＧＤ２に特異的な人工修飾抗体は、毒性物質または治療物質を健康な組織または細胞内に送達することのある上記抗体の拡散を可能な限り防止するために、対応する抗原に対して十分な親和性を有するべきである。本発明の範囲内では、ＧＤ２ガングリオシドに対する親和性は１０−７ｍｏｌ／リットルを超えるべきである。これらの抗体の親和性は当業者に公知の技術により高めることができる。したがって、バクテリオファージ表面で抗体断片の発現は、所与のｓｃＦｖから高親和性変異体を探索するのに役立つツールを構成する。したがって、免疫応答発生中に観察される親和性成熟を模倣することも可能である。したがって、ランダム変異または標的変異とその後の免疫吸着／溶出サイクルの繰り返しによる選択のための技術の使用が成功しており、最初の断片の約１０倍の親和性を有する抗体断片が得られてきた。
【００２４】
本発明の特別な目的は、この例に限定されるべきではないが、必要な特異性を示すことが知られている８Ｂ６抗体から製造された人工修飾抗体、および配列番号３〜８に示す相補性決定領域の配列を使用した組換えタンパク質に関する。
【００２５】
本発明の目的はまた、特定の癌の診断または治療に有用な性質を抗体に提供するための、必要な特異性を有する抗体の修飾を提供することである。これらの応用においては、抗体またはその誘導体をいくつかの癌状態を患っている患者に注射することが必要である。この場合、ヒト抗体の配列により密接に関連する配列を有する誘導体が好ましい。なぜならそれらは、処置された患者が注射された分子に対して抗体を産生するのを抑え、許容度を高くし、反復投与を可能にするからである。さらにそのような誘導体は、注射した抗体に特異的な特定の決定基に対する抗体応答（治療的価値があると言われているいわゆる抗イディオタイプ抗体）にとっても有利に働く可能性がある。
【００２６】
治療用途には、標的抗原（本件の場合はＯ−アセチル化ＧＤ２）を発現する腫瘍細胞に対して細胞毒性活性を提供する修飾が好ましい。
【００２７】
一部のクラスの免疫グロブリンのみが、補体を活性化する性質または細胞媒介性の細胞毒性を誘導する性質を有することが知られている。例として、８Ｂ６抗体はＯ−アセチル化ＧＤ２を認識するが、この細胞毒性を十分効果的に誘導することはできない。したがって、本発明の別の目的は、Ｏ−アセチル化ＧＤ２を認識し、細胞毒性活性を有する抗体を提供することである。これは特に、この細胞毒性を誘発することができる抗体の定常領域（クラス１ヒト免疫グロブリンの定常領域等）で抗体定常領域を置換することで行うことができる。その後、細胞毒性能をさらに高めることができ、これは特に、特別にグリコシル化（低フコシル化を含む）された抗体を、例えば特別に選択されたまたは形質転換された細胞を用いて製造することで行われるだろう。文献に記載の具体的な変異を、同じ目的のために本抗体配列に導入することもできる。
【００２８】
本発明に基づく治療抗体を製造する別の方法は、必要な特異性を有する抗体誘導体に細胞毒性薬剤を組み合わせることである。前記細胞毒性薬剤は、毒性化学物質；タキサン類、ニチニチソウアルカロイド類、それらの誘導体等の細胞毒性抗腫瘍薬等の、アンチセンスＲＮＡ；アントラサイクリン系薬剤、アルキル化剤；リシンもしくはシュードモナス毒素等の植物または細菌の毒素等の、生物学的毒性薬剤；または、１３１−ヨウ素、９０−イットリウム、１７７−ルテチウム、１８６−レニウム、６７−銅等のベータ粒子を放出する放射性同位元素；または１１１−インジウム等のオージェ電子を放出する放射性同位元素；またはさらに、２１３−ビスマス、２１２−ビスマス、２１１−アスタチン等のアルファ粒子を放出する放射性同位元素であってもよい。これらの例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。抗体はまた、当業者に公知の分子工学的方法で、サイトカインと組み合わせた融合タンパク質の形態で製造することもできる。使用されるサイトカインは基本的に、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、およびＩＬ−１８等のインターロイキンファミリーの一員；ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）またはＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）等の造血成長因子；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およびケモカインである。得られた抗体−サイトカイン融合タンパク質は、それが由来する抗体の特異性とサイトカインの生物学的性質を有する。
【００２９】
本発明の抗体はまた、当業者に公知の任意の技術の後で、細胞または生体液試料中のＯ−アセチル化ＧＤ２抗原の存在を検出するためにインビトロで診断を行うにしても、あるいは公知の医療イメージング技術（すなわちシンチグラフィーまたは陽電子放射断層撮影法）の１つで検出可能になるように修飾された抗体誘導体の投与によってインビボで行うにしても、診断に有利に適用することができる。その場合、抗体誘導体は、シンチグラフィー・イメージングまたは単一光子断層撮影法については、１３１−ヨウ素、１２３−ヨウ素、１１１−インジウム、または９９ｍ−テクネチウム等のガンマ光子を放出する放射性同位元素と組み合わされるか、あるいは陽電子放射断層撮影法については、１８−フッ素、１２４−ヨウ素、８６−イットリウム、６４−銅、４４−スカンジウム等の陽電子放出同位元素と組み合わされる。これらの例も本発明の範囲を限定するものではない。
【００３０】
本発明の抗体は、毒性または放射性の化合物と組み合わせることができる。毒性物は、エステル結合、アミド結合、ジスルフィド結合、またはチオエーテル結合等の種々の化学結合で化学的に、または共有結合で抗体に結合される。放射性原子は、求電子置換（ヨウ素同位体元素の場合）または求核置換（１８−フッ素の場合）で直接結合されるか、またはヨウ素同位元素の場合であればＢｏｌｔｏｎ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ試薬のような放射標識された反応性シントンを介して結合されるか、またはヨウ素同位元素もしくは２１１−アスタチンの場合であればスタニル化された活性エステルを介して結合されるか、あるいは放射性金属の場合であればキレート剤を用いて結合される。後者の場合、キレート剤の中から、どれが生体液中で金属と共に高い安定性を有する錯体を提供するか選ぶことは、当業者の知識範囲に含まれる。従って、ＤＴＰＡを１１１−インジウムと有利に使用することができるが、９０−イットリウムでの標識にはＤＯＴＡが好ましいであろう。
【００３１】
本発明の抗体は、毒性薬剤または検出可能な薬剤が抗体に直接結合されているのではなく、むしろ患者に抗体誘導体を投与した後の第２ステージで投与される低分子量分子（抗体誘導体はこの小分子をインビボで認識することができる）に結合している、当業者に公知の方法で使用することができる。この場合、抗体誘導体は特に二重特異性抗体もしくは免疫コンジュゲートであるか、または抗体誘導体とアビジンの融合タンパク質である。このアプローチは、インビボでの腫瘍の診断および治療に本発明の抗体と有利に使用することができる。
【００３２】
したがって、本発明の抗体および「誘導体」、「抗体誘導体」または「誘導体材料」は、そのような腫瘍の診断または治療に有利に使用することができる。これらには、黒色腫、小細胞肺癌、神経膠腫、神経芽細胞腫等の神経外胚葉起源の腫瘍が包含される。本発明の生成物は、これらの腫瘍の検出および治療に、特に腫瘍が散在しているかまたは既存の処置に反応しない場合に、有利に適用することができる。
【発明の概要】
【００３３】
本発明は、黒色腫、膠芽腫、小細胞肺性癌、神経芽細胞腫等をはじめとする神経外胚葉起源のヒトの癌の免疫ターゲッティングのための抗体の使用を開示する。
【００３４】
上述の本発明の種々の態様の全てにおいて、特に驚くべきことに、Ｏ−アセチル化ＧＤ２に特異的なモノクローナル抗体が、ＧＤ２ガングリオシドおよびそのＯ−アセチル化型を発現する腫瘍細胞を認識する一方で、ＧＤ２を発現する神経線維には付着しないことが明らかとなった。したがって、このような抗体は、末梢神経線維を認識しない、神経外胚葉起源の腫瘍細胞に限定された特異性を有する。この特異性の向上は、治療への適用における毒性の低減につながり、これは特に、ＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体で観察される正常末梢神経組織への付着がないことによるものである。したがって本発明は、このような抗体の、ＧＤ２を認識する抗体と比べて特異性が向上され、毒性が低下した、癌の診断および治療のための使用を包含する。
【００３５】
本発明の抗体は、その認識する腫瘍細胞に対する細胞毒性活性を有し、これは、内因性のものであるか（これが本発明の抗体をキメラ化またはヒト化する理由の１つである）、または抗体が毒性薬剤、特に放射性薬剤のベクターとして働くためである。
【００３６】
したがって、本発明は、Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する任意のモノクローナルキメラ抗体またはモノクローナルヒト化抗体、またはこの抗体の断片を包含し、前記抗体または前記断片は、末梢神経表面で発現するＧＤ２分子は認識せず、腫瘍細胞が発現するＯ−アセチル化ＧＤ２分子を認識する。
【００３７】
本発明はまた、特に元の抗体の性質を修飾するため、特にその免疫原性を低減させるため、またはその毒性活性を増大させるため、または注入後のクリアランスを早めるもしくは遅らせるため、当業者に公知の分子遺伝学的技術を用いて数個のアミノ酸が別のアミノ酸で置換された抗体を提供する。
【００３８】
有利には、本発明の人工修飾モノクローナル抗体またはその断片は、Ｏ−アセチル化ＧＤ２に対して１０−７ｍｏｌ／リットルを超える親和性を有し、ＧＤ２自体には１０分の１未満の親和性を有するκ−ＩｇＧであり、前記抗体または前記断片が単一特異性または二重特異性であることを特徴とする。
【００３９】
特に本発明は、限定されるものではないが、Ｈ鎖可変領域の相補性決定領域が配列番号３、配列番号４および配列番号５で表されるアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖可変領域の相補性決定領域が配列番号６、配列番号７および配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する、任意の人工修飾モノクローナル抗体またはその断片を提供する。
【００４０】
特に本発明は、限定されるものではないが、非ヒト抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡをヒト免疫グロブリンの定常領域をコードするｃＤＮＡに連結することで得られる重鎖を有し、同じ非ヒト抗体の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡをヒト免疫グロブリンの軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡに連結することで得られる軽鎖を有する人工修飾モノクローナル抗体またはその断片において、前記非ヒト抗体がマウス８Ｂ６モノクローナル抗体であり、前記人工修飾抗体がＯ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドに対して産生されたものであり末梢神経繊維を認識しないことを特徴とする、任意の人工修飾モノクローナル抗体またはその断片を提供する。
【００４１】
特に本発明は、限定されるものではないが、配列番号１で表されるアミノ酸推定配列の重鎖可変領域を有し、配列番号２で表されるアミノ酸推定配列の軽鎖可変領域を有する、任意の人工修飾モノクローナル抗体またはその断片を提供する。
【００４２】
請求項５に記載の人工修飾モノクローナル抗体またはその断片は、ＣＨＯ細胞株を用いて得られるＫＭ８Ｂ６抗体またはその断片であることが好ましい。
【００４３】
本発明はまた、本発明の人工修飾抗体またはその断片に由来する医薬分子であって、抗体またはその断片が、分子Ｘ（ここでＸは毒性分子、薬、プロドラッグ、または特異性に無関係な二次抗体である）に結合している任意の医薬分子を提供する。
【００４４】
一つの態様によれば、上記毒性分子は、毒性の化学分子、生物学的分子、または放射性分子であって、上記分子は、Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する腫瘍細胞を死滅させることを意図したものである。
【００４５】
本発明の医薬分子の標的になる前記腫瘍細胞は、神経芽細胞腫、黒色腫、膠芽腫、または小細胞肺癌の細胞であることが好ましい。
【００４６】
本発明の医薬分子は、糖の付加によってＦｃ領域が変異しており、したがって、免疫細胞および補体系分子の活性化を調節するものであることが好ましい。
【００４７】
本発明はまた、腫瘍細胞表面でＯ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドの発現を示す癌の診断のための任意の分子を提供し、前記分子は本発明の人工修飾抗体またはその断片に由来し、前記抗体または前記断片は、この抗体または前記断片を蛍光または放射活性で検出するための薬剤に結合している。
【００４８】
したがって、本発明は、Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞を有する癌を治療処置するための薬の製造、またはそのような癌を診断するための製品の製造のための、本発明の人工修飾抗体もしくはその断片および／または本発明の分子の任意の使用に関する。
【００４９】
さらに、本発明は、医薬分子の製造における８Ｂ６モノクローナル抗体（論文’Variable Region Gene Segments of Nine Monoclonal Antibodies Specific to Disialoganglisosides (GD2, GD3) and their O-Actylated Derivatives‘, Cerato et al., Hybridoma Volume 16, n°4, 1997, 307-316’に記載されている）の任意の使用を提供し、前記抗体は毒性の化学物質、生物学的薬剤、または放射性薬剤に結合しており、ここで前記分子はＯ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する腫瘍細胞を死滅させることを意図したものである。
【００５０】
特に本発明は、限定されるものではないが、前記細胞が神経芽細胞腫、黒色腫、膠芽腫、または小細胞肺癌の細胞であるような使用を提供する。
【００５１】
特に本発明は、限定されるものではないが、前記治療分子が糖の付加によってＦｃ領域が変異しており、従って免疫細胞および補体系分子の活性化を調節する使用を提供する。
【００５２】
本発明はまた、腫瘍細胞の表面にＯ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する癌を診断するための分子の製造のための、８Ｂ６モノクローナル抗体の任意の使用を提供し、前記分子は前記抗体に由来し、ここで前記抗体は蛍光または放射活性によって抗体を検出するための薬剤に結合している。
【００５３】
本発明はまた、本発明の人工修飾抗体をコードするＤＮＡの任意の配列、およびプロモーターに機能的に連結されたそのようなＤＮＡ配列を含む任意の発現ベクターを提供する。
【００５４】
本発明はまた、そのような発現ベクターを含む任意の細胞、特に動物細胞、および本発明の人工修飾抗体を産生する任意の非ヒト形質転換体を提供する。
【００５５】
最後に、本発明は、Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドに対する人工修飾抗体を製造するための任意の方法を提供し、前記プロセスは、好適な条件下における細胞または非ヒト形質転換体中でのＤＮＡ配列の発現、および抗体の回収を含んでなる。
【００５６】
細胞または形質転換体は、抗体が蓄積する条件下で培養することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】プラスミドｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬの構築を示す図である。
【図２】プラスミドｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌの構築を示す図である。
【図３】プラスミドｐｃＤＮＡ３（登録商標）ＫＭ８Ｂ６Ｌの構築を示す図である。
【図４】人工修飾抗体ＫＭ８Ｂ６の軽鎖の塩基配列およびアミノ酸推定配列を示す図である。
【図５】プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨの構築を示す図である。
【図６】プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ ＳＫ（＋）ＫＭ６０Ｃ３−Ｈの構築を示す図である。
【図７】プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ ＳＫ（＋）ＫＭ８Ｂ６−Ｈの構築を示す図である。
【図８】プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（著作権）（＋）ＫＭ８Ｂ６−Ｈの構築を示す図である。
【図９】人工修飾抗体の重鎖ＫＭ８Ｂ６の塩基配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１０】精製した抗Ｏ−アセチル化ＧＤ２人工修飾抗体ＫＭ８Ｂ６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。分析は、還元条件下（左側）および非還元条件下（右側）で行った。左から順に、分子量マーカー、ＫＭ８Ｂ６、ＩｇＧ３ ８Ｂ６（還元条件）、高分子量マーカー、ＫＭ８Ｂ６、およびＩｇＧ３ ８Ｂ６（非還元条件）。
【図１１】免疫蛍光で測定した、ＩＭＲ３２およびＮｅｕｒｏＡ細胞（それぞれＯ−アセチル化ＧＤ２抗原ありまたはなし）上の８Ｂ６抗体およびＫＭ８Ｂ６抗体の反応性を示すグラフである。縦軸は検出された細胞数、横軸は蛍光強度を示す。青色のプロットは、基準となる反応性に相当し、赤色のプロットは生成物の反応性に相当する。
【図１２】ＥＬＩＳＡアッセイで試験した、ＩＭＲ３２細胞およびＮｅｕｒｏＡ細胞上の８Ｂ６抗体およびＫＭ８Ｂ６抗体の反応性を示すグラフである。
【図１３】シリカ薄層クロマトグラフィーで分離したラット脳ガングリオシドについてＫＭ８Ｂ６抗体を用いて得られた免疫染色のプロフィールを示す図である。バンドＡ：種々のラット脳ガングリオシドの遊走のレゾルシノール染色。
【図１４】神経芽細胞腫細胞およびヒト神経繊維の免疫組織化学的アッセイの結果を示す図である。
【図１５】毒性試験（ＡＤＣＣ）の結果を示す図である。人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体およびそれが由来するマウス８Ｂ６ ｍＡｂのパーセントＡＤＣＣ活性を示す。＊リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））：ネガティブコントロールとして使用した抗ＣＤ２０抗体。
【図１６】マウスにおける、Ｏ−アセチル化ＧＤ２抗原を発現するマウスＥＬ４胸腺腫に対する８Ｂ６ ｍＡｂの抗腫瘍効果のインビボ試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体の製造
【００５９】
１．マウスモノクローナル抗体６０Ｃ３の可変Ｌ−ＶＬ領域をコードするｃＤＮＡの調製
【００６０】
（ａ）モノクローナル６０Ｃ３抗体を産生する６０Ｃ３ハイブリドーマからの全ＲＮＡの抽出
【００６１】
ＲＮＡｂｌｅ試薬（ＥＵＲＯＢＩＯ社、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、指数増殖期の１０６ ６０Ｃ３ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出する。２６０ｎｍでの吸光度を測定して全ＲＮＡ濃度を決定する。
【００６２】
（ｂ）．６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡの塩基配列の獲得
【００６３】
６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ可変領域をコードするｃＤＮＡをＲＡＣＥ−ＰＣＲによってメッセンジャーＲＮＡから遺伝子増幅し、可変領域（ＶＬ）と組み合わされたシグナルペプチド（Ｌ）をコードする塩基配列を得た。この増幅は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（サンノゼ、カリフォルニア州、米国）から入手したＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットをメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。逆転写に使用する全ＲＮＡ量は１μｇである。反応産物を、メーカーから入手可能なトリシンＥＤＴＡ緩衝液１００μＬ中に希釈した。体積２．５μＬの希釈産物を遺伝子増幅に使用した。使用した６０Ｃ３ ＶＬのｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプローブは、５’−６０Ｃ３ ＶＬ：５’−ＴＴＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＡＧＣ −３’（配列番号９）である。増幅は、反応混合液をＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（ＰＥ）ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＷＥＬＬＥＳＬＥＹ社、マサチューセッツ州、米国）で以下の条件でインキュベートすることで行った：（９４℃５秒、７２℃３分）を５サイクル；その後（９４℃５秒、次いで７０℃１０秒、その後７２℃３分）を５サイクル、および（９４℃５秒、次いで６９℃１０秒、および７２℃３分）を２５サイクル。ＲＡＣＥ−ＰＣＲの反応産物を、泳動用緩衝液にトリスＥＤＴＡ（ｐＨ８；４０ｍＭのトリス塩基（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ製））、２５ｍＭのＥＤＴＡ（ＩＮＥＲＣＨＩＭ社、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、フランス）、２０ｍＭの酢酸（イタリア、ＲｏｄａｎｏのＣＡＲＬＯ ＥＲＢＡ ＲＥＡＧＥＮＴＩ ＳＰＡ社、Ｒｏｄａｎｏ、ＭＩ、イタリア）を用い、１％アガロースゲル電気泳動（Ｑ．ＢＩＯＧＥＮＥ社、モーガンアーバイン、カリフォルニア州、米国）で分析する。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、予想される分子量を有する産物を精製する。６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ領域をコードするｃＤＮＡ配列を確認するための得られた精製産物の核酸配列の決定は、ＧＥＮＯＭＥ ＥＸＰＲＥＳＳ社（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）が行った。６０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域と組み合わされたシグナルペプチドに相当する配列をこうして決定し、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬのｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングするためのプローブを設計した。
【００６４】
（ｃ）．６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡの増幅
【００６５】
６０Ｃ３ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡ抽出物から、ＲＴ−ＰＣＲによって６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを増幅させた。反応混合液は以下の通りである：０．５μｇのオリゴｄ（Ｔ）１８（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、１μｇのＲＮＡ、および０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）、これらを滅菌水で１２μＬにする（ｑｓｐ１２μＬ）。この混合液を６５℃（乾燥制御された浴）で５分間、その後４℃（氷水）で２分間インキュベートしてＲＮＡを変性させる。この反応混合液に、４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ溶液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０ｍＭのＤＴＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１６０ＵのＲｎａｓｉｎｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、および８００Ｕの逆転写酵素（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を加える。得られた混合液を３７℃で１時間、その後反応を停止させるために７０℃で１５分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ遺伝子増幅によって、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡのコピーを得る；５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ：５’−ＡＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＡＴ−３’（センスプローブ、配列番号１０）および３’−ＸｈｏＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ：５’−ＴＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＡＧＣ ＡＣＣ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号１１）。
【００６６】
使用した合成プローブはＤＮＡ配列にサイレント変異を導入し、この変異は、アミノ酸配列は変化させない一方で、ベクターへのクローニングに必要なＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を導入する。
【００６７】
反応媒体は以下の組成を有する：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧａ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−Ｘｈｏｌ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬおよびプローブ５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３。
【００６８】
この増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＰＥＬＴＩＥＲ ＴＨＥＲＭＡＬ ＣＹＣＬＥＲ）を用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。
【００６９】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動分析で確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを精製する。
【００７０】
２．６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを有する組換えプラスミドの構築：ｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ
【００７１】
（ａ）．ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）および６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡの消化、並びに消化したベクターの脱リン酸化
【００７２】
制限酵素で消化し、目的のｃＤＮＡを挿入するために必要な付着末端を有する直鎖状ベクターを得る。この消化は、以下の条件で行われる：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）または６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡ（１（μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｈｏＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。消化したベクターおよびインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いでベクターをＣＩＰ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。反応混合液の組成は以下の通りである：１０×ＮＥＢ３緩衝剤（５μＬ）、ベクター（１μｇ）、ＣＩＰ（１μＬ）。この反応は、ベクターのセルフライゲーションの割合を減少させることでライゲーション収率を高める。実際、遊離端部の５’端および３’端のリン酸部分を消化して抑制すると、ベクターの自発的な閉鎖が妨げられる。
【００７３】
（ｂ）．ライゲーション反応
【００７４】
Ｔ４リガーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を使用してライゲーションすることで、消化および脱リン酸化されたベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）中に、消化された６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡが挿入される。この反応はさらに１６℃の水浴中で１６時間、以下の反応媒体中で行われる：ライゲーション緩衝液 ５×（４μＬ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、２００ｎｇの消化および脱リン酸化されたベクター、Ｔ４リガーゼ（４００Ｕ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、（１ｋｂのインサートについて）１７０ｎｇの精製ｃＤＮＡ。インサート：ベクターのモル比は３：１である。
【００７５】
（ｃ）．コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換
【００７６】
ライゲーション反応産物２０μＬをコンピテント細菌懸濁液１００μＬに加える。得られた混合液を４℃で３０分間インキュベートする。次いでこの細菌に４２℃で２分間ヒートショックを与え、続いて４℃に２分間置く。次いで、体積１ｍＬのＬＢ培地を加え、この細菌を撹拌（２５０ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間インキュベートする。４０００×ｇ、４℃で５分間遠心して細菌を回収する。細菌ペレットを１０μＬのＬＢ培地にとり、その後１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）を含む２ＸＴＹ寒天培地の入ったペトリ皿に蒔く。３７℃で一晩インキュベートした後、抵抗性のコロニーが発達する。
【００７７】
（ｄ）．ＰＣＲによる、ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）中にインサート６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬの存在の確認
【００７８】
単離したコロニーを、換気フード内で無菌条件下にて以下のＰＣＲ反応混合液を含むチューブにそれぞれ入れる：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＸｈｏＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬおよびプローブ５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３。
【００７９】
この増幅はＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。増幅されたＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンだけで、予想されるサイズのＰＣＲ産物が得られる。
【００８０】
（ｅ）．目的のプラスミドｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬの製造
【００８１】
滅菌つまようじを使用し、コロニーを採取した後、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）を含む５ｍＬのＬＢ選択液体培地に加え、３７℃で１６時間インキュベートする。次いで、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。
【００８２】
３．ヒトＰ３Ｎｏｎ２モノクローナル抗体の定常領域ｈｕ−ＣκをコードするｃＤＮＡの調製
【００８３】
（ａ）．Ｐ３Ｎｏｎ２モノクローナル抗体を産生するＰ３Ｎｏｎ２ハイブリドーマからの全ＲＮＡの抽出
【００８４】
ＲＮＡｂｌｅ試薬（フランス、ＣｏｕｒｔａｂｏｅｕｆのＥＵＲＯＢＩＯ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、指数増殖期の１０６ Ｐ３Ｎｏｎ２ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出する。２６０ｎｍでの吸光度を測定することで、全ＲＮＡ濃度を決定する。
【００８５】
（ｂ）．ｈｕ−ＣκｃＤＮＡの増幅
【００８６】
ｈｕ−ＣκのｃＤＮＡの増幅は、Ｐ３Ｎｏｎ２ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡ抽出物をＲＴ−ＰＣＲすることで行った。反応混合液は以下の通りである：０．５μｇのオリゴｄ（Ｔ）１８（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、１μｇのＲＮＡ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）、これらを滅菌水で１２μＬにした（ｑｓｐ１２μＬ）。この混合液を６５℃（乾燥制御された浴）で５分間、次いで４℃（氷水）で２分間インキュベートし、ＲＮＡを変性させる。次いでこの反応混合液に、４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ溶液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０ｍＭのＤＴＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１６０ＵのＲｎａｓｉｎｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、および８００Ｕの逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を加える。得られた混合液を３７℃で１時間、次いで反応を停止させるために７０℃で１５分間インキュベートする。６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡのコピーを、以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ遺伝子増幅で得る；５’−ＸｈｏＩ ｈｕ−Ｃκ：５’−ＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＡ Ｃ−３’（センスプローブ、配列番号１２）および３’−ＸｂａＩ ｈｕ−Ｃκ：５’−ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＴＴ ＧＡ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号１３）。
【００８７】
使用の合成プローブはＤＮＡ配列にサイレント変異を導入し、この変異は、アミノ酸配列は変化させない一方で、ベクターにクローニングするために必要なＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を導入する。
【００８８】
反応媒体は以下の組成を有する：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＸｂａＩ ｈｕ−Ｃκおよびプローブ５’−ＸｈｏＩ ｈｕ−Ｃκ。
【００８９】
この増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＰＥＬＴＩＥＲ ＴＨＥＲＭＡＬ ＣＹＣＬＥＲ）を用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。
【００９０】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動分析で確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、ｈｕ−ＣκｃＤＮＡを精製する。
【００９１】
４．人工修飾抗体ＫＭ６０Ｃ３の軽鎖の発現ベクターの構築：ｐｃＤＮＡ３（登録商標）ＫＭ６０Ｃ３−Ｌ
【００９２】
（ａ）．ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬおよびｈｕ−ＣκｃＤＮＡの消化、および消化したベクターの脱リン酸化
【００９３】
消化は以下の条件下で行う：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬまたはｈｕ−ＣκｃＤＮＡ（１μｇ）、制限酵素ＸｈｏＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｂａＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続けた。消化したベクターおよびインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いで、ベクターをＣＩＰ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ３１０×緩衝剤（５μＬ）、ベクター（１μｇ）、ＣＩＰ（１μＬ）。
【００９４】
（ｂ）．ライゲーション反応
【００９５】
Ｔ４リガーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を使用してライゲーションすることで、消化および脱リン酸化されたベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ中に、消化されたｃＤＮＡであるｈｕ−ＣκｃＤＮＡが挿入される。この反応はさらに１６℃の水浴中で１６時間、以下の反応媒体中で行われる：ライゲーション緩衝液 ５×（４μＬ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、２００ｎｇの消化および脱リン酸化されたベクター、Ｔ４リガーゼ（４００Ｕ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、（１ｋｂのインサートについて）１７０ｎｇの精製ｃＤＮＡ。インサート：ベクターのモル比は３：１である。ライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換に使用する。
【００９６】
（ｃ）．ＰＣＲによる、ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ中にインサートｈｕ−Ｃκの存在の確認
【００９７】
単離した抵抗性のコロニーを、換気フード内で無菌条件下にて以下のＰＣＲ反応混合液を含むチューブに入れる：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＸｂａＩ ｈｕ−Ｃκおよびプローブ５’−ＸｈｏＩ ｈｕ−Ｃκ。増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。増幅されたＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのＰＣＲ産物が得られる。
【００９８】
（ｄ）．目的のプラスミドｐｃＤＮＡ３（登録商標）ＫＭ６０Ｃ３−Ｌの製造
【００９９】
滅菌つまようじを使用し、コロニーを採取した後、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）を含む５ｍＬのＬＢ選択液体培地に加え、３７℃で１６時間インキュベートする。次いで、ＱｌＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。
【０１００】
５．人工修飾抗体ＫＭ ８Ｂ６の軽鎖の発現ベクターの構築：ｐｃＤＮＡ３（登録商標）８Ｂ６−Ｌ
【０１０１】
（ａ）．ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）ｈｕ−Ｃκの獲得
【０１０２】
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化することで、ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）ＫＭ６０Ｃ３−ＬからベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）ｈｕ−Ｃκを調製した。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ２１０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクター（１μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｈｏＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。消化したベクターを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いでベクターをＣＩＰ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ３緩衝剤１０×（５μＬ）、ベクター（１μｇ）、ＣＩＰ（１μＬ）。
【０１０３】
（ｂ）．８Ｂ６モノクローナル抗体を産生する８Ｂ６ハイブリドーマからの全ＲＮＡの抽出
【０１０４】
ＲＮＡｂｌｅ試薬（フランス、ＣｏｕｒｔａｂｏｅｕｆのＥＵＲＯＢＩＯ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、指数増殖期の１０６ ８Ｂ６ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出する。２６０ｎｍでの吸光度を測定して全ＲＮＡ濃度を決定する。
【０１０５】
（ｃ）．８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡの塩基配列の獲得
【０１０６】
可変領域８Ｂ６ Ｌ−ＶＬをコードするｃＤＮＡをＲＡＣＥ−ＰＣＲによってメッセンジャーＲＮＡから遺伝子増幅し、可変領域（ＶＬ）と組み合わされたシグナルペプチド（Ｌ）をコードする塩基配列を得た。この増幅は、ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社（サンノゼ、カリフォルニア州、米国）から入手したＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットをメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。逆転写に使用する全ＲＮＡ量は１μｇである。反応産物を、メーカーから入手可能なトリシンＥＤＴＡ緩衝液１００μＬ中に希釈した。体積２．５μＬの希釈産物を遺伝子増幅に使用した。使用した８Ｂ６ ＶＬ ｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプローブは以下の通りである：κ型マウス抗体軽鎖の定常部ｍｕＣκをコードするｃＤＮＡとハイブリダイズする３’−ｍｕＣκ：５’−ｇｔｔ ｃａｔ ａｃｔ ｃｇｔ ｃｃｔ ｔｇｇ ｔｃａ ａｃｇ ｔｇａ ｇｇｇ−３’。増幅は、反応混合液をＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（ＰＥ）ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＷＥＬＬＥＳＬＥＹ社、マサチューセッツ州、米国）で以下の条件でインキュベートすることで行った：（９４℃５秒、７２℃３分）を５サイクル、次いで（９４℃５秒、次いで７０℃１０秒、その後７２℃３分）を５サイクル、（９４℃５秒、６９℃１０秒、７２℃３分）を２５サイクル。ＲＡＣＥ−ＰＣＲ反応産物を、泳動用緩衝液にトリスＥＤＴＡ（ｐＨ８；４０ｍＭのトリス塩基（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社））、２５ｍＭのＥＤＴＡ（ＩＮＥＲＣＨＩＭ社、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、フランス）、２０ｍＭの酢酸（ＣＡＲＬＯ ＥＲＢＡ ＲＥＡＧＥＮＴＩ ＳＰＡ社、Ｒｏｄａｎｏ、ＭＩ、イタリア）を用い、１％アガロースゲル電気泳動（Ｑ．ＢＩＯＧＥＮＥ社、モーガンアーバイン、カリフォルニア州、米国）で分析する。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、予想される分子量を有する産物を精製する。８Ｂ６ Ｖ−ＶＬ領域をコードするｃＤＮＡ配列を確認するための得られた精製産物の核酸配列の決定は、ＧＥＮＯＭＥ ＥＸＰＲＥＳＳ社（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）が行った。８Ｂ６抗体の軽鎖可変領域と組み合わされたシグナルペプチドに相当する配列をこうして決定し、８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングするためのプローブを設計した。
【０１０７】
（ｄ）．８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡの増幅
【０１０８】
６０Ｃ３ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡ抽出物から、ＲＴ−ＰＣＲによって８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを増幅させた。反応混合液は以下の通りである：０．５μｇのオリゴｄ（Ｔ）１８（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、１μｇのＲＮＡ、および０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）、これらを滅菌水で１２μＬにする（ｑｓｐ１２μＬ）。この混合液を６５℃（乾燥制御された浴）で５分間、その後４℃（氷水）で２分間インキュベートしてＲＮＡを変性させる。次いでこの反応混合液に、４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ溶液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０ｍＭのＤＴＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１６０ＵのＲｎａｓｉｎｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、および８００Ｕの逆転写酵素（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を加える。得られた混合液を３７℃で１時間、その後反応を停止させるために７０℃で１５分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ遺伝子増幅によって、８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡのコピーを得る；５’− ＢａｍＨＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＬ：５’− ＡＡＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＣＣＴ ＧＴＴ −３’（センスプローブ、配列番号１４）および３’−ＸｈｏＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＬ：５’−ＣＣＧ ＴＴＴ ＴＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣＣ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号１５）。
【０１０９】
使用の合成プローブはＤＮＡ配列にサイレント変異を導入し、この変異は、アミノ酸配列は変化させない一方で、ベクターへのクローニングに必要なＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を導入する。
【０１１０】
反応媒体は以下の組成を有する：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＸｈｏＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＬおよびプローブ５’−ＢａｍＨＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＬ。
【０１１１】
この増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＰＥＬＴＩＥＲ ＴＨＥＲＭＡＬ ＣＹＣＬＥＲ）を用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。
【０１１２】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動分析で確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを精製する。
【０１１３】
（ｅ）．８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡの消化
【０１１４】
８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡ（１μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｈｏＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。消化したインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。
【０１１５】
（ｆ）．ライゲーション反応
【０１１６】
Ｔ４リガーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を使用してライゲーションすることで、消化および脱リン酸化されたベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）ｈｕ−Ｃκ中に、消化された８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡが挿入される。この反応をさらに１６℃の水浴中で１６時間、以下の反応媒体中で行う：ライゲーション緩衝液 ５×（４μＬ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、２００ｎｇの消化および脱リン酸化されたベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）ｈｕ−Ｃκ、Ｔ４リガーゼ（４００Ｕ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、（１ｋｂのインサートについて）１７０ｎｇの精製８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡ。インサート：ベクターのモル比は３：１である。ライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換に使用する。
【０１１７】
（ｇ）．ＰＣＲによる、ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）ｈｕ−Ｃκ中にインサート８Ｂ６ Ｌ−ＶＬの存在の確認
【０１１８】
単離した抵抗性のコロニーを、換気フード内で無菌条件下にて以下のＰＣＲ反応混合液を含むチューブに入れる：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＸｈｏＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＬおよびプローブ５’−ＢａｍＨＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＬ。増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。増幅されたＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのＰＣＲ産物が得られる。
【０１１９】
（ｈ）．目的のプラスミドｐｃＤＮＡ３（登録商標）ＫＭ８Ｂ６ Ｌの製造
【０１２０】
滅菌つまようじを使用し、コロニーを採取した後、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）を含む５ｍＬのＬＢ選択液体培地に加え、３７℃で１６時間インキュベートする。次いで、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）スピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。
【０１２１】
マウス６０Ｃ３モノクローナル抗体のＬ−ＶＨ可変領域をコードするｃＤＮＡの調製
【０１２２】
（ａ）．６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡの塩基配列の獲得
【０１２３】
６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ可変領域をコードするｃＤＮＡをＲＡＣＥ−ＰＣＲによってメッセンジャーＲＮＡから遺伝子増幅し、可変領域（ＶＬ）と組み合わされたシグナルペプチド（Ｌ）をコードする塩基配列を得た。この増幅は、ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社（サンノゼ、カリフォルニア州、米国）から入手したＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットをメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。逆転写に使用する全ＲＮＡ量は１μｇである。反応産物を、メーカーから入手可能なトリシンＥＤＴＡ緩衝液１００μＬ中に希釈した。体積２．５μＬの希釈産物を遺伝子増幅に使用した。使用した６０Ｃ３ＶＨのｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプローブは、κ型マウス抗体軽鎖のｍｕＣ−κ定常部をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズする３’−６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ：５’−ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＧＴ ＡＧＴ ＣＣＣ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号１６）である。増幅は、反応混合液をＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（ＰＥ）ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＷＥＬＬＥＳＬＥＹ社、マサチューセッツ州、米国）で以下の条件でインキュベートすることで行った：（９４℃５秒、７２℃３分）を５サイクル、その後（９４℃５秒、次いで７０℃１０秒、その後７２℃３分）を５サイクル、および（９４℃５秒、その後６９℃１０秒、７２℃３分）を２５サイクル。ＲＡＣＥ−ＰＣＲの反応産物を、泳動用緩衝液にトリスＥＤＴＡ（ｐＨ８；４０ｍＭのトリス塩基（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社））、２５ｍＭのＥＤＴＡ（ＩＮＥＲＣＨＩＭ社、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、フランス）、２０ｍＭの酢酸（ＣＡＲＬＯ ＥＲＢＡ ＲＥＡＧＥＮＴＩ ＳＰＡ社、Ｒｏｄａｎｏ、ＭＩ、イタリア）を用い、１％アガロースゲル電気泳動（Ｑ．ＢＩＯＧＥＮＥ社、モーガンアーバイン、カリフォルニア州、米国）で分析する。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、予想される分子量を有する産物を精製する。６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ領域をコードするｃＤＮＡ配列を確認するための得られた精製産物の核酸配列の決定は、ＧＥＮＯＭＥ ＥＸＰＲＥＳＳ社（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）が行った。６０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域と組み合わされたシグナルペプチドに相当する配列をこうして決定し、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨのｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングするためのプローブを設計した。
【０１２４】
（ｂ）．６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡの増幅
【０１２５】
６０Ｃ３ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡ抽出物から、ＲＴ−ＰＣＲによって、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを増幅させた。反応混合液は以下の通りである：０．５μｇのオリゴｄ（Ｔ）１８（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、１μｇのＲＮＡ、および０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）、これらを滅菌水で１２μＬにする（ｑｓｐ１２μＬ）。この混合液を６５℃（乾燥制御された浴）で５分間、その後４℃（氷水）で２分間インキュベートしてＲＮＡを変性させる。この反応混合液に、４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ溶液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０ｍＭのＤＴＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１６０ＵのＲｎａｓｉｎｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、および８００Ｕの逆転写酵素（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を加える。得られた混合液を３７℃で１時間、その後反応を停止させるために７０℃で１５分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ遺伝子増幅によって、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡのコピーを得る；５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ：５’−ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＡＡＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＴＡ ＡＣＣ ＡＴＧ Ｇ−３’（センスプローブ、配列番号１７）および３’−ＮｈｅＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ：５’−Ｔ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＣＡＧ ＡＧＴ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号１８）。
【０１２６】
使用の合成プローブはＤＮＡ配列にサイレント変異を導入し、この変異は、アミノ酸配列は変化させない一方でベクターへのクローニングに必要なＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を導入する。
【０１２７】
反応媒体は以下の組成を有する：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＮｈｅＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨおよびプローブ５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ。
【０１２８】
この増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＰＥＬＴＩＥＲ ＴＨＥＲＭＡＬ ＣＹＣＬＥＲ）を用いて以下の条件で行った：９４℃５分間；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。
【０１２９】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動分析で確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを精製する。
【０１３０】
７．６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨＣｄｎａを有する組換えプラスミドの構築
【０１３１】
（ａ）．クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨの構築
【０１３２】
６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ領域をコードする配列の、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）への挿入は、制限酵素ＥｃｏＲＶ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）でベクターを消化して平滑末端断面を作ることを含んでなる。得られた直鎖状プラスミドをｄＴＴＰ存在下でＴａｑポリメラーゼで処理し、ベクターの３’末端にさらにチミジンを付加してセルフライゲーションを防ぐ。６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを得るために使用するＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ産物の各３’末端に１つの末端アデニンを付加する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、このような産物は上記のベクターに直接クローニングすることができる。このライゲーション反応はＡ／Ｔ相補性のおかげで、平滑末端によるライゲーション反応と比べて収率が非常に高い。このライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換に使用する。
【０１３３】
（ｂ）．ＰＣＲによる、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）中に６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨインサートの存在の確認
【０１３４】
単離した抵抗性のコロニーを、換気フード内で無菌条件下にて以下のＰＣＲ反応混合液を含むチューブに入れる：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＮｈｅＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨおよびプローブ５’−ＢａｔｎＨＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ。増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。増幅されたＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのＰＣＲ産物が得られる。
【０１３５】
（ｃ）．目的のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨの製造
【０１３６】
この目的のために、滅菌つまようじを使用し、コロニーを採取した後、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）を含む５ｍＬのＬＢ選択液体培地に加え、３７℃で１６時間インキュベートする。次いで、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。
【０１３７】
（ｄ）．酵素消化による、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ中の６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨインサートの方向の確認
【０１３８】
６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨインサートがセンス方向で存在することを、酵素ＢａｍＨＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨを酵素消化することで確認する。実際、Ｔクローニング技術では、インサートが一方向であることは要求されないため、インサートはセンス方向またはアンチセンス方向に挿入され得る。６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨインサートは、センス方向のときだけ、２つのＢａｍＨＩ制限酵素認識部位によってフランキング部位が得られる。したがって、酵素ＢａｍＨＩでの消化後、電気泳動分析によって、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡをセンス方向で有するクローンを識別および選択することができる。
【０１３９】
８．ｈｕ−Ｃγ１ヒト抗体の定常領域をコードするｃＤＮＡの調製
【０１４０】
ａ．γ１イソタイプの重鎖を産生するＬＰ１ヒトミエローマ株からの全ＲＮＡの抽出
【０１４１】
ＲＮＡｂｌｅ試薬（ＣｏｕｒｔａｂｏｅｕｆのＥＵＲＯＢＩＯ社、フランス）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、指数増殖期の１０６ ＬＰ１ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出する。２６０ｎｍでの吸光度を測定して全ＲＮＡ濃度を決定する。
【０１４２】
ｂ．ｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡセグメントの遺伝子増幅
【０１４３】
ＬＰ１ハイブリドー
マの全ＲＮＡ抽出物から、ｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡを増幅させた。反応混合液は以下の通りである：０．５μｇのオリゴｄ（Ｔ）１８（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、１μｇのＲＮＡ、および０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）、これらを滅菌水で１２μＬにする（ｑｓｐ１２μＬ）。この混合液を６５℃（乾燥制御された浴）で５分間、その後４℃（氷水）で２分間インキュベートしてＲＮＡを変性させる。次いでこの反応混合液に、４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１０ｍＭのＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１６０ＵのＲｎａｓｉｎｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、および８００Ｕの逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を加える。得られた混合液を３７℃で１時間、その後反応を停止させるために７０℃で１５分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ遺伝子増幅によって、ｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡのコピーを得る；５’−Ｎｈｅｌ ｈｕ−Ｃγ１：５’−ＣＡ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＣＣ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＣＡ ＴＣＧ ＧＴＣ ＴＴＣ Ｃ−３’（センスプローブ、配列番号１９）および３’−ＸｂａＩ ｈｕ−Ｃγ１：５’−ＡＧＣ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＡＡ ＴＡＡ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＧ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号２０）。
【０１４４】
使用した合成プローブはＤＮＡ配列にサイレント変異を導入し、この変異は、アミノ酸配列は変化させない一方ベクターへのクローニングに必要なＮｈｅＩおよびＸｂａＩ制限酵素認識部位を導入する。
【０１４５】
反応媒体は以下の組成を有する：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＸｂａＩ ｈｕ−Ｃγ１およびプローブ５’−ＮｈｅＩ ｈｕ−Ｃγ１。
【０１４６】
この増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＰＥＬＴＩＥＲ ＴＨＥＲＭＡＬ ＣＹＣＬＥＲ）を用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで、９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。
【０１４７】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動分析で確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、ｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡを精製する。
【０１４８】
９．ｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡと結合した６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを有する組換えプラスミドの構築：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ＫＭ６０Ｃ３ Ｈ
【０１４９】
（ａ）．ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨおよびｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡの消化、並びに消化したベクターの脱リン酸化
【０１５０】
消化は以下の条件下で行う：１０×ＢＥＢ２緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨまたはｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡ（１μｇ）、制限酵素ＮｈｅＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｂａＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。消化したベクターおよびインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いでベクターをＣＩＰ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。
【０１５１】
反応媒体の組成は以下の通りである：１０×ＮＥＢ３緩衝剤（５μＬ）、ベクター（１μｇ）、ＣＩＰ（１μＬ）。
【０１５２】
（ｂ）．ライゲーション反応
【０１５３】
Ｔ４リガーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を使用してライゲーションすることで、消化および脱リン酸化されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ中に、消化されたｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡが挿入される。このライゲーション反応をさらに１６℃の水浴中で１６時間、以下の反応媒体中で行う：ライゲーション緩衝液 ５×（４μＬ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、２００ｎｇの消化および脱リン酸化されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ、Ｔ４リガーゼ（４００Ｕ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、（１ｋｂのインサートについて）１７０ｎｇの精製ｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡ。インサート：ベクターのモル比は３：１である。このライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換に使用する。
【０１５４】
（ｃ）．ＰＣＲによる、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ中のｈｕ−Ｃγ１インサートの存在および方向の確認
【０１５５】
ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ制限酵素認識部位を選んだことにより、ｈｕ−Ｃγ１インサートはセンス方向またはアンチセンス方向であり得る。これはこれらの制限酵素認識部位の配列が、インサートが一方向であることを要求しないためである。インサートがセンス方向であることをＰＣＲで確認する。単離したコロニーをそれぞれ、換気フード内で無菌条件下にて以下のＰＣＲ反応混合液を含むチューブにそれぞれ入れる：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのセンスプローブおよびアンチセンスプローブ。この増幅はＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。使用したプローブは、５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ：５’−ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＡＡＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＴＡ ＡＣＣ ＡＴＧ Ｇ−３’（センスプローブ、配列番号２１）および３’−ＸｂａＩ ｈｕ−Ｃγ１：５’−ＡＧＣ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＡＡ ＴＡＡ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＧ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号２１）である。
【０１５６】
インサートの方向が適切でなければ、増幅されるべき配列と同じ鎖上にプローブがあるため、増幅は起こらない。増幅されたＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのＰＣＲ産物が得られる。
【０１５７】
（ｄ）．目的のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ＫＭ６０Ｃ３ Ｈの製造
【０１５８】
滅菌つまようじを使用し、コロニーを採取した後、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）を含む５ｍＬのＬＢ選択液体培地に加え、３７℃で１６時間インキュベートする。次いで、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。
【０１５９】
１０．人工修飾抗体重鎖ＫＭ ８Ｂ６の発現ベクターの構築：ｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏ ８Ｂ６−Ｈ
【０１６０】
（ａ）．ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ｈｕ−Ｃγ１の獲得
【０１６１】
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化することで、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ＫＭ６０Ｃ３ ＨからベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ｈｕ−Ｃγ１を製造した。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクター（１μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｂａＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。次いで、このベクターを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いで、ベクターをＣＩＰ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ３ １０×緩衝剤（５μＬ）、ベクター（１μｇ）、ＣＩＰ（１μＬ）。
【０１６２】
（ｂ）．８Ｂ６モノクローナル抗体を産生する８Ｂ６ハイブリドーマからの全ＲＮＡの抽出
【０１６３】
ＲＮＡｂｌｅ試薬（ＣｏｕｒｔａｂｏｅｕｆのＥＵＲＯＢＩＯ社、フランス）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、指数増殖期の１０６ ８Ｂ６ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出する。２６０ｎｍでの吸光度を測定して全ＲＮＡ濃度を決定する。
【０１６４】
（ｃ）．８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡの塩基配列の獲得
【０１６５】
８Ｂ６ Ｌ−ＶＨ可変領域をコードするｃＤＮＡをＲＡＣＥ−ＰＣＲによってメッセンジャーＲＮＡから遺伝子増幅し、可変領域（ＶＨ）と組み合わされたシグナルペプチド（Ｌ）をコードする塩基配列を得た。この増幅は、ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社（サンノゼ、カリフォルニア州、米国）から入手したＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットをメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。逆転写に使用した全ＲＮＡ量は１μｇであった。反応産物を、メーカーから入手可能なトリシンＥＤＴＡ緩衝液１００μＬ中に希釈した。体積２．５μＬの希釈産物を遺伝子増幅に使用した。使用した８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプローブは、γ３型マウス抗体の重鎖ｍｕＣ−γ３定常部をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズする３’−ｍｕＣγ３：５’−ｔＧＡ ＴＣＡ ＡＣＴ ＣＡＧ ＴＣＴ ＴＧＣ ＴＧＧ ＣＴＧ ＧＧＴ ＧＧＧ−３’（配列番号２３）。増幅は、反応混合液をＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（ＰＥ）ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（米国マサチューセッツ州のＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＷＥＬＬＥＳＬＥＹ社、マサチューセッツ州、米国）で以下の条件でインキュベートすることで行った：（９４℃５秒、７２℃３分）を５サイクル；その後（９４℃５秒、次いで７０℃１０秒、７２℃３分）を５サイクル；その後（９４℃５秒、次いで６９℃１０秒、その後７２℃３分）を２５サイクル。このＲＡＣＥ−ＰＣＲの反応産物を、泳動用緩衝液にトリスＥＤＴＡ（ｐＨ８；４０ｍＭトリス塩基（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ））、２５ｍＭのＥＤＴＡ（ＩＮＥＲＣＨＩＭ社、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、フランス）、２０ｍＭの酢酸（ＣＡＲＬＯ ＥＲＢＡ ＲＥＡＧＥＮＴＩ ＳＰＡ社、Ｒｏｄａｎｏ、ＭＩ、イタリア）を用い、１％アガロースゲル電気泳動（Ｑ．ＢＩＯＧＥＮＥ社、モーガンアーバイン、カリフォルニア州、米国）で分析する。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、予想される分子量を有する産物を精製する。８Ｂ６ Ｌ−ＶＨ領域をコードするｃＤＮＡ配列を確認するための得られた精製産物の核酸配列の決定は、ＧＥＮＯＭＥ ＥＸＰＲＥＳＳ社（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）が行った。８Ｂ６抗体の重鎖可変領域と組み合わされたシグナルペプチドに相当する配列をこうして決定し、８Ｂ６ Ｌ−ＶＨのｃＤＮＡを発現ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ｈｕ−Ｃγ１にクローニングするためのプローブを設計した。
【０１６６】
（ｄ）．８Ｂ６ Ｌ−ＶＨセグメントの遺伝子増幅
【０１６７】
８Ｂ６ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡ抽出物から、ＲＴ−ＰＣＲによって８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを増幅させた。反応混合液は以下の通りである：１μＬのオリゴｄ（Ｔ）１８（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、１μｇのＲＮＡ、および０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）、これらを滅菌水で１２μＬにする（ｑｓｐ１２μＬ）。この混合液を６５℃（乾燥制御された浴）で５分間、その後４℃（氷水）で２分間インキュベートしてＲＮＡを変性させる。次いでこの反応混合液に、４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ溶液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０ｍＭのＤＴＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１６０ＵのＲｎａｓｉｎｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、および８００Ｕの逆転写酵素（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を加える。得られた混合液を３７℃で１時間、その後反応を停止させるために７０℃で１５分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ遺伝子増幅によって、８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡのコピーを得る；５’−ＢａｍＨＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＨ：５’−ＣＣＧ ＴＣＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＴＧＧ−３’（センスプローブ、配列番号２４）および３’−ＮｈｅＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＨ：５’−ＣＧＧ ＧＧＴ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＴＧＴ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号２５）。
【０１６８】
使用の合成プローブはＤＮＡ配列にサイレント変異を導入し、この変異は、アミノ酸配列は変化させない一方ベクターへのクローニングに必要なＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限酵素認識部位を導入する。
【０１６９】
反応媒体は以下の組成を有する：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００Ｍ．Ｍのプローブ３’−ＮｈｅＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＨおよびプローブ５’−ＢａｍＨＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＨ。
【０１７０】
この増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＰＥＬＴＩＥＲ ＴＨＥＲＭＡＬ ＣＹＣＬＥＲ）を用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。
【０１７１】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動分析で確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを精製する。
【０１７２】
（ｅ）．８Ｂ６ Ｌ−ＶＨＣｄｎａの消化
【０１７３】
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを消化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡ（１μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＮｈｅＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。消化したインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。
【０１７４】
（ｆ）．ライゲーション反応
【０１７５】
ライゲーションによって、消化および脱リン酸化されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ｈｕ−Ｃγ１中に、消化された８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡが挿入される。この反応をさらに１６℃の水浴中で１６時間、以下の反応媒体中で行う：ライゲーション緩衝液 ５×（４μＬ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、２００ｎｇの消化および脱リン酸化されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ｈｕ−Ｃγ１、Ｔ４リガーゼ（４００Ｕ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、（１ｋｂのインサートについて）１７０ｎｇの精製８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡ。インサート：ベクターのモル比は３：１である。このライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換に使用する。
【０１７６】
（ｇ）．人工修飾抗体重鎖をコードするｃＤＮＡの獲得
【０１７７】
人工修飾抗体重鎖をコードするｃＤＮＡを製造するために、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ＫＭ８Ｂ６ Ｈを制限酵素ＢａｍＩおよびＸｂａＩで消化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクター（１μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｂａＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。遊離したインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。
【０１７８】
（ｈ）．ベクターｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏの消化および消化したベクターの脱リン酸化
【０１７９】
消化は以下の条件で行う：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクター（１μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｂａＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。消化したベクターおよびインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いでベクターをＣＩＰ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ３緩衝剤 １０×（５μＬ）、ベクター（１μｇ）、ＣＩＰ（１μＬ）。
【０１８０】
（ｉ）．ライゲーション反応
【０１８１】
ライゲーション反応によって、消化および脱リン酸化されたベクターｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏ中に、人工修飾抗体重鎖をコードするｃＤＮＡが挿入される。反応をさらに１６℃の水浴中で１６時間、以下の反応媒体中で行う：ライゲーション緩衝液 ５×（４μＬ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、２００ｎｇの消化および脱リン酸化されたベクターｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏ、Ｔ４リガーゼ（４００Ｕ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、（１ｋｂのインサートについて）１７０ｎｇの人工修飾抗体重鎖をコードする精製ｃＤＮＡ。インサート：ベクターのモル比は３：１である。このライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換に使用する。
【０１８２】
（ｊ）．ＰＣＲによる、ベクターｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏ中に人工修飾抗体重鎖をコードするｃＤＮＡの存在の確認
【０１８３】
単離した抵抗性のコロニーを、換気フード内で無菌条件下にて以下のＰＣＲ反応混合液を含むチューブに入れる：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’およびプローブ５’。この増幅はＭＪ−リサーチ社のＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。使用するプローブは、５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ：５’−ＣＣＧ ＴＣＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＴＧＧ−３’（センスプローブ、配列番号２６）および３’−Ｎｈｅｌ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＨ：５’−ＣＧＧ ＧＧＴ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＴＧＴ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号２７）である。
【０１８４】
増幅されたＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのＰＣＲ産物が得られる。
【０１８５】
（ｋ）．目的のプラスミドｐｃＤＮＡ３ ＫＭ８Ｂ６ Ｌの製造
【０１８６】
滅菌つまようじを使用し、コロニーを採取した後、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）を含む５ｍＬのＬＢ選択液体培地に加え、３７℃で１６時間インキュベートする。次いで、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）スピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。
【０１８７】
１１．人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体の発現のための、ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
【０１８８】
人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体を発現および分泌させるのための宿主細胞としてＣＨＯ細胞を使用した。この細胞を、ＰｏｌｙＦｅｃｔ（登録商標）キット（ＱＩＡＧＥＮ ＧＭＢＨ社、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、それぞれ人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体の軽鎖（図４）および重鎖（図９）をコードするプラスミドｐＤＮＡ３（登録商標）ＫＭ８Ｂ６−ＬおよびｐＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（著作権）ＫＭ８Ｂ６−Ｈでコトランスフェクションした。形質転換した細胞は、ジェネテシン（登録商標）およびハイグロマイシンＢ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）に対する抵抗性で選択した。抵抗性クローンは、限定希釈法による従来のクローニング技術によって得た。次いでこれらを、ＥＬＩＳＡ免疫酵素アッセイを用いて、ＫＭ８Ｂ６抗体の発現および分泌に基づいて選択した。ＫＭ８Ｂ６抗体を３．８ｎｇ／ｍＬで分泌する、安定なトランスフェクタントクローンを選択した。
【０１８９】
１２．８Ｂ６抗体およびＫＭ８Ｂ６抗体の精製
【０１９０】
ガングリオシドに特異的なマウスモノクローナル抗体を、対応するハイブリドーマ（Ｃｅｒａｔｏ ｅｔ ａｌ、１９９７）の培養液上清から産生した。これらをマウスＩｇＧ３の不可逆的な同種親和性凝集現象（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ、１９９０）を制限する本発明者らが開発した手法に基づいて、プロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＢ社、ウプサラ、スウェーデン）で精製した。カラムを、最初に０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．６）の緩衝剤で平衡化する。１０％の平衡化緩衝剤を含む培養液上清サンプル２Ｌを、流速１ｍＬ／分でカラムに流す。次いで、カラムを１０体積の平衡化緩衝剤で洗浄する。プロテインＡに固定された材料を、酸性緩衝剤（０．１Ｍクエン酸塩、０．３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３）で溶出して画分ごとに回収し、これを回収用チューブに緩衝剤（１Ｍのトリス塩酸、ｐＨ７．６）を予め入れておくことで回収後すぐに中和する。回収画分の吸光度変化を測定することで、この精製の進行をモニターする。次いで、有用な画分をＰＢＳ溶液（０．３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に透析し、０．２２μｍのフィルターで濾過して滅菌する。２８０ｎｍでの吸光度を測定してタンパク質の量を決定し、次いでマウスＩｇＧ３の同種親和性凝集現象を防ぐために、ｍＡｂ濃度を１ｍＬ当たりのＡｃＮが０．９ｍｇ以下の濃度になるように調整する。精製したＡｃＭをそのまま４℃で使用まで保存する。
【０１９１】
プラスミドｐｃＤＮＡ３ ＫＭ８Ｂ６−ＬおよびｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏ ＫＭ８Ｂ６−Ｈで安定にコトランスフェクションされたクローンに由来するＣＨＯ細胞培養液上清から、人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【０１９２】
精製した抗体を、還元変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分析する。１０％のグリセロール（ＶＷＲ社、Ｆｏｎｔｅｎａｙ ｓｏｕｓ Ｂｏｉｓ、フランス）および５％のβ−メルカプトエタノール（ＰＲＯＭＥＧＡ社）を含む０．５Ｍのトリス塩酸（ｐＨ６．８）緩衝液にサンプルを取る。これを５分間煮沸し、次いでＬａｅｍｍｌｉの方法に基づくＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析する。１．５ｍｍ厚のポリアクリルアミドゲル（ＶＷＲ社）（ゲルの上部と下部のポリアクリルアミド濃度はそれぞれ４．５％および１２％）のウェルに３μｇのタンパク質を置く。室温、２００Ｖで４５分間電気泳動した後、ゲルを固定し、クーマシーブルーＲ２５０（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）で染色する。分子量マーカーＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（登録商標）Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）の移動度から分子量を計算する。
【０１９３】
還元変性条件下の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析は、ＬおよびＨキメラ鎖の分子量がそれぞれ２５ｋＤａおよび５０ｋＤａであることを示している。非還元変性条件下の６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析は、ＬおよびＨ鎖が適切に組立てられて抗体分子を産生していること、並びに人工修飾抗体の分子量が約１５０ｋＤａであることを示している。
【０１９４】
１３．ＫＭ８Ｂ６抗体特異性の研究
【０１９５】
（ａ）．生細胞の間接免疫螢光法による
【０１９６】
Ｏ−アセチル化ＧＤ２を発現するＩＭＲ３２細胞およびＯ−アセチル化ＧＤ２を発現しないＮｅｕｒｏ２Ａ細胞について、抗体特異性を調べた。１０６個の細胞を、８Ｂ６またはＫＭ８Ｂ６抗体と共に４℃で３０分間インキュベートする。次いで１％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝剤（ｐＨ７．４）で細胞を２回洗浄し、１％ＰＢＳ−ＢＳＡに１／１００希釈したフルオレセインイソチオシアネート（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ ＥＵＲＯＰＥ ＬＴＤ社、Ｃａｍｂｒｉｄｅｓｈｉｒｅ、英国）で標識したヤギＦ（ａｂ）２抗マウス免疫グロブリン抗体または抗ヒト免疫グロブリン抗体の存在下で再度３０分間インキュベートする。再度ＰＢＳで３回洗浄した後、死細胞および細胞残骸を除去した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｔｏｎ−Ｄｏｃｋｉｎｓｏｎ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州
を用いてＳＳＣ／ＦＬ１−Ｈウィンドウ内で、１００００個の細胞を分析する。二次抗体のみで非特異的に標識されたコントロールを用いてベースを調節した後に１Ｌｏｇを超える蛍光を有する細胞を陽性と呼ぶ。
【０１９７】
得られた結果は、ＫＭ８Ｂ６抗体は、８Ｂ６抗体のように、ＩＭＲ３２細胞のみを認識することを示している。
【０１９８】
（ｂ）．９６ウェルマクロタイタープレート内の乾燥細胞のＥＬＩＳＡ免疫酵素アッセイによる
【０１９９】
Ｏ−アセチル化ＧＤ２を発現するＩＭＲ３２細胞およびＯ−アセチル化ＧＤ２を発現しないＮｅｕｒｏ２Ａ細胞に対する抗体特異性を調べた。腫瘍細胞のインビトロ培養物を、トリプシン処理で培養基質から剥離する。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をＭａｘｉｓｏｒｐ平底マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ Ａ／Ｓ社、ロスキレ、デンマーク）の各ウェルに、１０５個の細胞を含む体積５０μＬのＰＢＳ中を分注する。次いで、プレートを３７℃のオーブンに一晩置いてＰＢＳを蒸発させる。プレートは、直接使用することもできるし、使用まで室温で数ヶ月保存することもできる。分析のために、非特異的部位を飽和させる目的で、プレートを最初に室温で１時間、１％ＢＳＡを含む２００μＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）と一緒に撹拌しながらインキュベートする。次いでプレートを、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液に希釈した抗体溶液１００μＬと一緒に撹拌しながら室温で２時間インキュベートする。２００μＬのＰＢＳ緩衝液でそれぞれ３回洗浄した後、全マウス免疫グロブリンまたは全ヒト免疫グロブリンのいずれかに特異的なビオチン化抗体に由来するＦ（ａｂ’）２溶液（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ ＥＵＲＯＰＥ ＬＴＤ社、Ｃａｍｂｒｉｄｅｓｈｉｒｅ、英国）を０．１％ＰＢＳ−ＢＳＡに１／２５００に希釈した溶液１００μＬを、各ウェルに入れる。室温で撹拌しながら１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、ビオチン化ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ ＥＵＲＯＰＥ ＬＴＤ社、Ｃａｍｂｒｉｄｅｓｈｉｒｅ、英国）の０．１％ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液を１時間反応させ、その後洗浄して除去する。固定された複合体の発達は、１００μＬのＡＢＴＳ基質（ＲＯＣＨＥ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ ＧＭＢＨ社、マンハイム、ドイツ）を添加することで行った。分光光度計（ＭｕｌｔｉｓａｎＥＸ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて異なる時間間隔でプレートのを４０５ｎｍで読み取ることで、吸光度を決定する。
【０２００】
得られた結果は、ＫＭ８Ｂ６抗体は、８Ｂ６抗体のように、ＩＭＲ３２細胞でのみ、用量依存的に固定されることを示している。
【０２０１】
（ｃ）．シリカ薄層上
【０２０２】
ＩＭＲ３２細胞の全ガングリオシド抽出物について分析を行った。Ａｒｉｇａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）に記載されている技術に従って、組織ガングリオシドを抽出する。抽出するサンプルを１０体積のクロロホルム／メタノール（Ｃ：Ｍ）混合物（１：１、ｖ／ｖ）中で粉砕し、室温で一晩機械的に撹拌する。濾過後、残渣を２．５体積の（Ｃ：Ｍ）（１：１、ｖ／ｖ）に取り、さらに６時間撹拌する。次いで、混合物を濾過し、ロータリーエバポレータ上でこれら２つの濾液を減圧下で蒸発させる。次いで、乾燥残渣を酢酸塩の形態のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）を２ｍＬ含むカラムに入れる。１５ｍＬの媒体Ａで中性脂質を除去する。次いで、０．４Ｍの酢酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）を含む１５ｍＬのメタノールでガングリオシドを溶出する。ＭｃＬｕｅｒの方法（１９９０）に従ってＣ１８疎水性ゲルのＳｅｐ−Ｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏ．社、ミルフォード、マサチューセッツ州）を用いて脱塩するために、得られた画分にｐＨ７．４のＰＢＳを３０ｍＬ添加する。Ｃ１８ゲルを、最初に２カラム体積のメタノールで、その後１：２（ｖ／ｖ）メタノール／ＰＢＳ混合物で前処理（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）する。次いで、脱塩する抽出物を流速１ｍＬ／分でカラムに流す。ガングリオシドの炭化水素鎖は、疎水性結合を通してゲルと相互作用するが、塩およびその他の非疎水性分子は２カラム体積の蒸留水で除去される。次いで、１体積のメタノール、続けて１体積の２：１（ｖ／ｖ）クロロホルム／メタノール混合物で、スフィンゴ糖脂質を溶出する。このカラムから溶出されるガングリオシドは、好適な更なる１体積の２：１（ｖ／ｖ）Ｃ／Ｍ混合物に濃縮され、−２０℃で保存される。
【０２０３】
次いで、薄層クロマトグラフィーでガングリオシドを分離する。この方法は、全ガングリオシドのプロフィール決定を可能にする。ＨＰＴＬＣプレートは、アルミホイル上にコーティングされたシリカゲル６０（ＭＥＲＣＫ社）で構成される。スポットしたガングリオシドを、展開溶媒で満たした容器内で、室温で２０分間展開する。この媒体（移動相）は、Ｃ／Ｍ／ＣａＣｌ２混合物の０．２２％水溶液（５０：４５：１０、ｖ／ｖ／ｖ）から構成される。ガングリオシドは、シアル化されているほど極性が強くなり、移動性が最も低くなる。ガングリオシドプレートの検出は、レゾルシノール／ＨＣｌ試薬を用いて化学的に行う（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、１９６３）。この試薬は、ガングリオシドに特徴的なシアル酸とだけ反応する。レゾルシノールで発達した後、全抽出物からガングリオシドの展開に対応する複数の染色バンドが観察される。分離されたガングリオシドの同定は、特異的モノクローナル抗体によって行うか、調べるガングリオシド抽出物と同時に展開するマーカーとして使用される標準ガングリオシドとの比較によって行う。
【０２０４】
シリカ薄層上でガングリオシドを展開した後、プレートをヘキサン中０．０１％のポリ−（イソブチル）−メタクリレート溶液に１分間浸漬し、その後風乾する。これによって、後の段階でゲルが基板からはがれるのを防ぐために、プレートを可塑化することができる。その後、ガングリオシドへの抗体結合の発達を除いて、乾燥細胞を用いたＥＬＩＳＡアッセイ法をモニターする。この発達は、産物１ｍｇをメタノール１ｍＬに溶解し、２０ｍＬのＰＢＳにとり、そこに３０体積の酸素水３０μＬを加えて使用直前に調製した４−クロロ−１−ナフトール溶液（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ ＣＨＥＭＩＥ ＧＭＢＨ社、ＳＴＥＮＨＥＩＭ、ドイツ）を用いて行われる。
【０２０５】
結果は、ＫＭ８Ｂ６抗体は、８Ｂ６抗体のように、ガングリオシド抽出物をアルカリ処置しない場合に、Ｏ−アセチル化ＧＤ２のみを認識することを示している。
【０２０６】
１４．神経系および腫瘍組織におけるＧＤ２ガングリオシドおよびそのＯ−アセチル化型の分布の研究
【０２０７】
腫瘍サンプル（膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、肺癌）を外科切除により得た。ヒト末梢神経のサンプルは、筋皮神経の末端感覚分岐部、腓骨神経の側枝から採取した。これらは、診断に問題を生じさせる前角状態（正常知覚神経）または末梢神経障害を診断するためのサンプルである。体積０．５ｃｍ３以下の組織サンプルを採取し、液体窒素の温度に冷却したイソペンタン中で凍結させる。６０秒後にサンプルを取り出し、予め−７０℃に冷却した凍結管に移す。凍結組織の１０μＭ切片をクリオスタットでカットする。切片をＳｕｏｅｒｆｒｏｓｔ Ｇｏｌｄ＋スライドガラス（ＶＷＲ社）に回収する。切片を３分間風乾し、次いでアセトンで１０分間固定し、再度風乾する。次いで、免疫組織化学的方法で分析するまで、切片を−２０℃で保存する。組織サンプルの免疫染色は、以下の一次マウスｍＡｂを用いて行った：
【０２０８】
ＧＤ２に特異的な一次抗体：
【０２０９】
ＧＤ２に特異的なｍＡｂ １０Ｂ８（ＩｇＧ３、κ）
【０２１０】
ＧＤ２−Ｏ−Ａｃに特異的な８Ｂ６ ｍＡｂ（ＩｇＧ３、κ）
【０２１１】
ネガティブコントロール用の試薬として使用する一次抗体：ＤＮＰに特異的なＭＣＡ２０６３ｍＡｂ（ＩｇＧ３、κ）（Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｆｒａｎｃｅ社、Ｃｅｒｇｙ Ｓａｉｎｔ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ、フランス）
【０２１２】
被験組織サンプルにおけるこれらの抗体の結合の発達は、マウス一次抗体と使用するためのＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋ ＳｙｓｔｅｍのＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ ＨＲＰキット（ＤＡＫＯ社、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）をメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。次いで、水性マウント媒体Ａｑｕａｄｅｘ（ＶＷＲ社）と共に、スライドとカバーガラスの間にサンプルをマウントする。次いで、倍率１００倍および４００倍の光学顕微鏡を用いた光学顕微鏡分析によって標識を確認する。各サンプルにつきランダムに選択した３つの顕微鏡フィールドのデジタル顕微鏡写真を分析する。
【０２１３】
様々な患者の全ての腫瘍サンプルで、膜および細胞質は１０Ｂ８抗体および８Ｂ６抗体での標識に陽性であったが、健康細胞はこれらの抗体のいずれでも標識されなかった。ＭＣＡ２０６３抗ＤＮＰ抗体では標識は検出されなかった。
【０２１４】
全ての被験神経サンプルで、有髄線維節間部は１０Ｂ８抗体で標識されたが、軸索および線維芽細胞は標識されていなかった。この標識は、８Ｂ６抗体では全くまたはほとんど検出できなかった。ＭＣＡ２０６３抗体では標識は観察されなかった。
【０２１５】
１５．Ｏ−アセチル化８Ｂ６およびＫＭ８Ｂ６抗ＧＤ２抗体の細胞毒性の研究
【０２１６】
（ａ）．標的細胞懸濁液の調製
【０２１７】
ＲＰＭＩ培地で培養した１×１０６個のＩＭＲ３２ヒト神経芽細胞腫細胞を、１．８５ＭＢｑのＮａ２５ＩＣｒＣ４存在下で３７℃にて１時間インキュベートする。次いで、ＲＰＭＩで細胞を３回洗浄し、遠心後、ＲＰＭＩに再懸濁し、放射性物質の自発的な脱塩を測定するために４℃で３０分間インキュベートする。
【０２１８】
最後の遠心後、細胞を５ｍＬのＲＰＭＩに取り、濃度を２×１０５細胞／ｍＬに調節する。
【０２１９】
（ｂ）．エフェクター細胞の調製
【０２２０】
自発的ドナーから、ヘパリンの入った血液試験管内にヒト血液を採取した。遠心による（１，８００×ｇ、３０分間）Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配で、全血液から末梢血液白血球を分離した。得られた細胞を洗浄するためにＲＰＭＩ中で１５００×ｇで３回遠心して、ＲＰＭＩに再懸濁し、細胞濃度を５×１０６細胞／ｍＬとした。
【０２２１】
（ｃ）．ＡＤＣＣ活性の測定
【０２２２】
Ｆａｌｃｏｎ社から入手したＵ底９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、ａ）で得られた標的細胞懸濁液５０μＬを添加する。次いで、ｂ）で得られたエフェクター細胞懸濁液１００μＬを添加する（すなわち、１ウェル当たり５００００細胞）。標的細胞とエフェクター細胞数の比率は１：５０である。次いで、８Ｂ６抗体、および人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体、およびリツキサン（登録商標）、κＩｇＧｌ、ネガティブコントロールとして使用する抗ＣＤ２０ヒト−マウス抗体を、濃度１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬで各ウェルに添加する。この混合物を３７℃で４時間インキュベートする。遠心後、プレートを遠心し、γカウンターを用いて上清中の５１Ｃｒの量を測定する。同じ手順で、抗体を含まない媒体とエフェクター細胞懸濁液の代わりの５Ｎ水酸化ナトリウム溶液とを加え、遊離した５１Ｃｒの総量を測定する。次いで、以下の式を用いてＡＤＣＣを計算する：
【０２２３】
〔数１〕
％ＡＤＣＣ活性＝（上清中の５１Ｃｒ−自発的に遊離した５１Ｃｒ）／（全５１Ｃｒ−自発的に遊離した５１Ｃｒ）
【０２２４】
１６．マウスリンパ腫の同質遺伝子モデルにおける８Ｂ６抗体の腫瘍活性
【０２２５】
ＧＤ２抗原を発現するマウスＥＬ−４Ｔリンパ腫をマウスＣ５７ＢＬ／６系統に皮下移植した同質遺伝子的なモデル（Ｚｈａｎｇ Ｈ、 Ｚｈａｎｇ Ｓ、 Ｃｈｅｕｎｇ ＮＫ、 Ｒａｇｕｐａｔｈｉ Ｇ、 Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ ＰＯ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＧＤ２ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｃａｎ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｓｙｎｇｅｎｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９８、 ５８： ２８４４−９）における８Ｂ６抗体の抗腫瘍活性を測定した。これらのＥＬ４細胞はＯ−アセチル化ＧＤ２抗原も発現する。Ａ１グレードの承認を受けた動物小屋で飼育した２４頭のマウスに、１２週齢の時点で、ＰＢＳに懸濁した２０×１０４個のＥＬ−４細胞を皮下注射で投与した。マウス１２頭のバッチを２つ構成した。バッチＡのマウスには、７０μｇのｍＡｂ ８Ｂ６を２００μＬのＰＢＳ緩衝液でｉ．ｖ．投与し、これはＥＬ４細胞の注射後１日目から２１日目まで３日間隔で行った。バッチＢのマウスには、同じ手順で２００μＬのＰＢＳ溶液だけを投与した。次いで、腫瘍の体積を２日間隔で測定した。腫瘍体積は以下の式を用いて評価した：体積（ｍｍ３）＝長さ（ｍｍ）×幅２（ｍｍ）×０．５（Ｚｅｎｇ Ｇ、Ｌｉ ＤＤ、Ｇａｏ Ｌ、Ｂｉｒｋｌｅ Ｓ、Ｂｉｅｂｅｒｉｃｈ Ｅ、Ｔｏｋｕｄａ Ａ、Ｙｕ ＲＫ；Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｙ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ＧＤ３−ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９ ３８： ８７６２−９）。体積＞３０００ｍｍ３を示したマウスを屠殺する。
【０２２６】
得られた結果を図１６に示す。ＰＢＳｉ．ｖ．と投与したバッチＢは非処置コントロールバッチに相当する（図１６、プレートＢ）腫瘍は接種１０日後から検出され始め、それに続き指数増殖を示し始める。接種２０日後、２匹を除き全てのマウスの腫瘍が１０００ｍｍ３を超える。腫瘍が３０００ｍｍ３を超えたので、動物実験の規制に従って、３０日目の前に全てのマウスを屠殺した。８Ｂ６抗体で処置したバッチＡのマウス（図１６、プレートＡ）では、腫瘍の発達の遅延が見られる。さらに、この抗体を投与されたマウスでは腫瘍の増殖が遅延する。接種２０日後、処置した全てのマウスで腫瘍は１０００ｍｍ３を超えていない。３０日後、非処置マウスが全て死亡したのに対し、８Ｂ６ ｍＡｂで処置したマウスは５８％が生存している。４０日後、処置したマウスの２５％がまだ生存しており、５０日後では、マウスの８％がまだ生存しており、明白な腫瘍を示さず、治癒したとみなされる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞を有する癌の診断および治療のための新規な方法を提供する。これら方法は、Ｏ−アセチル化ＧＤ２を認識し、健康細胞および末梢神経系の神経線維は認識しない、組換えモノクローナル抗体またはその断片の使用を本質的に含む。この新規な方法は、既に癌の治療に使用されている抗体および誘導体に比べて、癌細胞への特異的がより高く、治療の毒性を低減しうる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞の表面には多くの抗原決定基がある。これらの抗原決定基の一部は腫瘍に特異的な抗原である。この腫瘍抗原は、主にまたはもっぱら癌細胞表面で発現する。
【０００３】
これらのヒト腫瘍抗原は、マウス等の異なる種の免疫系によって、抗体として知られる分子の産生を誘導する。この抗体には、抗体自身が由来する抗原分子を特異的に認識するという特徴がある。
【０００４】
モノクローナル抗体とそのヒト腫瘍抗原との間のこの特異的認識は、癌の免疫ターゲッティングに特に利点がある。実際、これによって、腫瘍を診断するための検出剤または治療するための毒性薬剤を患部組織または患部臓器に集中させることができる。これらの検出剤または毒性薬剤としては、その投与の前または後に抗体に人工的に連結された、必要に応じて放射性の、化学化合物、または生体化合物が含まれ得る。これらの薬剤はまた、抗体によって腫瘍細胞へと集まる、患者に天然に存在する生体化合物（補体成分、ケモカイン、サイトカイン、細胞毒性細胞（例えばＴまたはＮＫリンパ球））であってもよい。
【０００５】
ガングリオシドは細胞膜の構成成分であり、その一部は腫瘍抗原として特徴付けられている。ＧＤ２ガングリオシドは、特に黒色腫、膠芽腫、小細胞肺性癌、神経芽細胞腫等の神経外胚葉起源のヒトの癌で多く発現していることが示され得る。上記の腫瘍病理のリストは網羅的ではない。網膜芽細胞腫および骨肉腫もＧＤ２ガングリオシドを発現する。一部の卵巣癌もＧＤ２ガングリオシドを発現する。ＧＤ２ガングリオシドは、セラミドが、グルコース・ガラクトース・Ｎ−アセチル−ガラクトサミンの配列を有するオリゴ糖と組み合わさって形成される糖脂質酸（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ａｃｉｄ）である。ガラクトース分子には２分子のシアル酸が結合している。末端シアル酸にＯ−アセチル部分を加えてＯ−アセチル化ＧＤ２が生成されるように修飾することができる。ＧＤ２に特異的でありかつそのＯ−アセチル化型も認識する抗体を用いることで、特定の種類のがん、特に神経外胚葉起源の腫瘍が、ＧＤ２およびそのＯ−アセチル化型であるＯ−アセチル化ＧＤ２を様々な比率で発現していることを示すことができるであろう。
【０００６】
マウスで産生された、数種のモノクローナル抗ＧＤ２抗体が報告されている。抗ＧＤ２モノクローナル抗体である１４．Ｇ２ａおよび３Ｆ８（それぞれクラスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３マウス免疫グロブリンに属する）の治療における使用が臨床研究で試験されてきた。
【０００７】
これらの研究から、マウスモノクローナル抗体に固有な複数の悪性副作用が指摘されてきた。
【０００８】
そのような副作用の１つは、マウス抗体に対して人間が起こす免疫応答によって生じるアレルギー反応またはアナフィラキシー反応である。
【０００９】
マウスで産生されたモノクローナル抗体のこのような免疫原性の問題を解決するために、遺伝子工学技術を用いてキメラ抗体を製造することが可能である。「キメラ」抗体とは、マウス抗体をコードする遺伝情報の幾分重要な部分をヒト抗体の対応する部分を用いて遺伝的に改変された抗体を意味する。一般的に、マウス抗体の重鎖および軽鎖（ＶＨおよびＶＬ）の可変領域が保存され、抗体分子の残りの部分がヒト抗体に由来する。このキメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に固有の腫瘍抗原特異的な認識を維持する一方で、ヒト抗体に固有の生理学的性質およびエフェクター特性を有する。それゆえ、臨床研究から、キメラ抗体ｃｈ．ｌ４Ｇ２ａおよびｃｈ．１４．１８は、それらが由来するマウスモノクローナル抗体と比較して低い免疫原性および長い血清半減期を有することが示されている。さらに、マウス抗ＧＤ２モノクローナル抗体は、キメラ化されたときにより強くヒトエフェクター細胞をリクルートする能力を示し、一方マウス抗体がこれらのヒトエフェクター細胞をリクルートする能力は限定的であることが示されている。
【００１０】
さらにマウス抗体をヒト抗体に同定するには、抗体の特異性を決定する抗原付着部位を含むいわゆるＣＤＲ領域または「相補性決定領域」中のアミノ酸のみをマウス抗体から保存することで行うことができる。「ヒト化」抗体とは、最初のマウス抗体のＣＤＲのアミノ酸のみ（所望により、さらにこのＣＤＲ領域近くの数アミノ酸）が保存され、分子の残りの部分がヒト抗体に由来する、遺伝的に改変された抗体を意味する。
【００１１】
先行技術の不利
治療または診断のためのインビボでのモノクローナル抗体の使用のためには、後者が特定の特異性、親和性、および非毒性という要件を満たす必要がある。しかし、モノクローナルおよびキメラ抗ＧＤ２抗体について行われた臨床研究から、キメラ化またはヒト化で解決されない大きな悪性副作用である抗ＧＤ２抗体による神経毒性が立証された。実際、抗ＧＤ２抗体を投与された神経外胚葉起源の癌患者は、抗体を投与されている間痛みに苦しみ、これらの患者の一部は末梢神経系の神経障害を発症した。この作用は、末梢系の神経線維細胞の表面にＧＤ２ガングリオシドが存在することで説明される。
【００１２】
したがって、抗ＧＤ２抗体の使用に固有のこの神経毒性が、この抗体を用いた免疫療法の臨床開発を制限してきたことは明確である。しかし、依然として非常に多くのＧＤ２抗原標的が、神経外胚葉起源の癌の免疫ターゲッティングにとって非常に重要な要素である。
【００１３】
この神経毒性の問題を解決する助けとなるであろう１つのアプローチは、ＧＤ２ガングリオシドとは異なる神経外胚葉起源の癌に関係する腫瘍抗原を認識し、かつ末梢系神経線維を認識しない抗体の使用であると考えられる。
【００１４】
数年前、本発明者らは、抗ＧＤ２抗体を製造するために、一連のマウスの免疫化を行った。それによって複数の抗ＧＤ２抗体を単離し、その特徴解析の結果、特に、Ｏ−アセチル部分が存在するようにわずかに修飾されたＧＤ２ガングリオシド分子を特異的に認識する、８Ｂ６と称するマウスＩｇＧ３クラスの抗体を同定した。この研究および特に８Ｂ６抗体については、引用することにより本明細書の一部とされる文献（Variable Region Gene Segments of Nine Monoclonal Antibodies Specific to Disialoganglisosides (GD2, GD3) and their O-Acetylated Derivative;Cerato et al., Hybridoma Volume 16, Number 4, 1997, 307-316
）に記載されている。
【００１５】
この抗体の構造が調べられたが、その先の展開は行われなかった。実際、当時、公知の抗ＧＤ２抗体に比べてこの新規の抗体に特別な興味が払われることはなかった。非アセチル化型のＧＤ２とは対照的に、Ｏ−アセチル化ＧＤ２の人間内での組織分布については、アセチル化型ＧＤ２に特異的なモノクローナル抗体の使用に基づく方法等の感度のよい検出方法がないために、未だに明確に実証されていない。したがって、この新規の抗体を臨床使用すれば、抗ＧＤ２モノクローナル抗体を使用した場合と同じ神経毒性の問題を生じるであろうと予想されていた。さらに、８Ｂ６抗体は細胞毒性活性が実証されておらず、ＩｇＧ３抗体は凝集しやすいために扱いが容易ではない。
【００１６】
発明の目的
ＧＤ２ガングリオシドを認識せず、Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドに特異的なモノクローナル抗体は、末梢神経線維を認識せず、そのため神経毒性を生じないという利点を有し得る。したがって、このような抗体は抗ＧＤ２モノクローナル抗体と比較して、ＧＤ２ガングリオシドをＯ−アセチル化型で発現する神経外胚葉起源のヒトの癌等の特定の種類の癌の免疫ターゲッティングに大きな利点を有し得る。
【００１７】
このような抗体は当業者に公知の種々の技術で得ることができる。これらの技術では、最初に動物、特にマウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ラマ等のラクダ科の免疫化が含まれている。免疫原性材料、すなわち、それに対して抗体が産生される抗原を含む製剤は、精製された糖脂質自体または未精製物もしくは一部精製混合物に含まれる糖脂質であってもよく、あるいは、糖脂質またはその部分（特にグリコシル化された親水性部分）の１つであってもよく、必要に応じて、免疫応答を刺激するための「キャリア」としてのタンパク質または脂質に共有結合されていてもよい。別の免疫化プロセスでは、免疫原性材料は、抗原を発現する細胞から調製することができ、そのような細胞は、腫瘍サンプルから得られる腫瘍細胞または初代細胞の株の細胞培養により得られる。有用な株としては、特に、マウスまたはヒトのＥＬ−４胸腺腫、例えば、ヒトＩＭＲ３２神経芽細胞腫、ヒトＵ８７ＭＧ膠芽腫、ＨＣＩ−Ｈ８２小細胞肺性癌、およびヒトＭ２１黒色腫等の動物細胞株が包含される。次いでこれらの細胞を全体（生細胞または固定細胞）として投与するか、分画して例えば細胞膜または細胞質成分を含む一部精製画分のみを注射することができる。
【００１８】
これらの免疫原性材料は、種々の経路、特に皮下、腹腔内、または筋肉内で、単独またはアジュバント（特にミョウバンまたはフロイントアジュバント）存在下で動物に投与することができる。免疫化は、数日から数ヶ月の頻度で繰り返すことができる。
【００１９】
一般的な３つの方法で、産業用途で使用できる抗体を提供することができる。第１の方法には、免疫化した動物から血液試料を採取し、当業者に公知のプロセスで、この血液試料からある程度（ｍｏｒｅ ｏｒ ｌｅｓｓ）精製された抗体（血清または血漿、全免疫グロブリン）を含む画分を抽出することが含まれてなる。この抗体をクロマトグラフィー技術または免疫吸着によってさらに精製してもよい。第２の方法では、抗体を合成することができる脾臓またはリンパ節細胞等の細胞を採取し、特に、当業者に公知のプロセスに従うウイルス形質転換または体細胞ハイブリダイゼーションにより、それらを不死化することが含まれてなる。不死化細胞の中から、クローニングによって、目的の抗体を産生する細胞のスクリーニングが可能になり、細胞培養することで、これらの抗体を培養液上清から単離し、それらを大量精製することが可能になる。最後に第３の方法には、抗体を合成することができる細胞、特に動物（免疫化されているか否かに関わらず）またはヒトから採取した脾臓、リンパ節、または末梢リンパ球細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡライブラリーを編集し、そこから当業者に公知の方法に基づくスクリーニング、特にファージディスプレイ発現系としても知られるバクテリオファージ表面でのライブラリー発現によって、目的の抗体の配列を選択することが含まれている。ＶＨ領域とＶＬ領域を連結する「単鎖」断片（「単鎖Ｆｖ」、ｓｃＦｖ）の形態またはＶＨ−ＣＨ１ペプチドセグメント（後者は定常領域の第１ドメインに相当）に関連する軽鎖からなるＦ（ａｂ）断片の形態で繊維状ファージの表面で発現される（「ファージディスプレイ」）、ヒトのＶＨ領域とＶＬ領域を組み合わせたライブラリーの構築。
【００２０】
本発明の抗体は、前述の方法のいずれかで得られた抗体から、Ｏ−アセチル化ＧＤ２抗原を認識し、非Ｏ−アセチル化ＧＤ２抗原は認識しないという点で選択することができ、この特徴を必要な特異性という。この選択は、抗体単離プロセスの間に、例えば必要な特異性を有する抗体産生細胞のみを増殖させることで行うことができる。あるいは、この特異性を有する抗体を選択するために、既に単離されている抗体を探索することもできるであろう。この目的のために、種々の方法を、特に間接免疫螢光法を、Ｏ−アセチル化ＧＤ２を発現することが知られている細胞（特にＩＭＲ３２）を認識する抗体を、ＧＤ２は発現するがＯ−アセチル化ＧＤ２は発現しない細胞（特にＮｅｕｒｏ２Ａ）も認識するであろう抗体から識別するために細胞に対して使用することができる。Ｏ−アセチル化ＧＤ２を発現する細胞のみに結合し、ＧＤ２のみを発現する細胞には結合しない抗体を選択するために、乾燥細胞にＥＬＩＳＡ免疫酵素アッセイを使用することもできるであろう。Ｏ−アセチル化ＧＤ２およびＧＤ２の両方を発現する細胞（特にＩＭＲ３２）の糖脂質成分を分離するシリカ薄層クロマトグラフィーを用いて、Ｏ−アセチル化ＧＤ２に相当するバンドのみを標識する抗体だけを得ることによっても、必要な特異性を有する抗体を選択することができるであろう。この結果は、脂質抽出物中のＯ−アセチル化ＧＤ２をアルカリ処理で分解し、標識が効果的に消失されることを調べることで確認することができるであろう。本発明の抗体の特異性を確認するためのこれらの技術の実例は、以下の本発明の詳細な説明に記載されている。同じ目的のために当業者はその他の方法を開発することもできる。
【００２１】
本発明の抗体は、種々の用途に好適なものにするために、当業者に公知の種々の技術で修飾することができる。したがって、単鎖ｓｃＦｖ抗体、および抗原結合能を維持している種々の融合タンパク質を製造するために、従来技術で公知の種々の方法を用いることができる。特に、例えば抗原認識能を失うことなくマウス定常領域をヒトの定常領域と交換するために、抗体のいわゆる定常領域を全体的に修飾することが知られている。キメラ抗体の構築には、マウスモノクローナル抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡの単離すること並びにそれをヒト免疫グロブリンの定常領域ＨおよびＬをコードするＤＮＡに結合させることが含まれてなる。このような遺伝的構築は、ヒトにおいて定常部分の免疫原性が全くないか非常に低いヒトハイブリッド抗体（一般的にヒトＩｇＧｌの定常部とヒトＣκ領域）を提供する。さらに、抗原認識に必要な領域、いわゆる超可変領域、相補性決定領域またはＣＤＲのみを保存し、実施のためにその他全部を置換することは公知であり、これは「ヒト化」として知られている。得られたこれらのタンパク質の混合物を、記述を簡単にするために「人工修飾抗体（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語で呼ぶ。
【００２２】
これらのタンパク質のいくつかは本発明の抗体にとって特に興味深い。例えば、ＧＤ２ガングリオシドを認識せずＯ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドの認識が保存された人工修飾Ｏ−アセチル化抗ＧＤ２抗体は、マウスＯ−アセチル化抗ＧＤ２モノクローナル抗体と比べて、より優れた物理的特徴およびエフェクター特徴を有するかもしれないという点で、大きな利点を有し得る。
【００２３】
Ｏ−アセチル化ＧＤ２に特異的な人工修飾抗体は、毒性物質または治療物質を健康な組織または細胞内に送達することのある上記抗体の拡散を可能な限り防止するために、対応する抗原に対して十分な親和性を有するべきである。本発明の範囲内では、ＧＤ２ガングリオシドに対する親和性は１０−７ｍｏｌ／リットルを超えるべきである。これらの抗体の親和性は当業者に公知の技術により高めることができる。したがって、バクテリオファージ表面で抗体断片の発現は、所与のｓｃＦｖから高親和性変異体を探索するのに役立つツールを構成する。したがって、免疫応答発生中に観察される親和性成熟を模倣することも可能である。したがって、ランダム変異または標的変異とその後の免疫吸着／溶出サイクルの繰り返しによる選択のための技術の使用が成功しており、最初の断片の約１０倍の親和性を有する抗体断片が得られてきた。
【００２４】
本発明の特別な目的は、この例に限定されるべきではないが、必要な特異性を示すことが知られている８Ｂ６抗体から製造された人工修飾抗体、および配列番号３〜８に示す相補性決定領域の配列を使用した組換えタンパク質に関する。
【００２５】
本発明の目的はまた、特定の癌の診断または治療に有用な性質を抗体に提供するための、必要な特異性を有する抗体の修飾を提供することである。これらの応用においては、抗体またはその誘導体をいくつかの癌状態を患っている患者に注射することが必要である。この場合、ヒト抗体の配列により密接に関連する配列を有する誘導体が好ましい。なぜならそれらは、処置された患者が注射された分子に対して抗体を産生するのを抑え、許容度を高くし、反復投与を可能にするからである。さらにそのような誘導体は、注射した抗体に特異的な特定の決定基に対する抗体応答（治療的価値があると言われているいわゆる抗イディオタイプ抗体）にとっても有利に働く可能性がある。
【００２６】
治療用途には、標的抗原（本件の場合はＯ−アセチル化ＧＤ２）を発現する腫瘍細胞に対して細胞毒性活性を提供する修飾が好ましい。
【００２７】
一部のクラスの免疫グロブリンのみが、補体を活性化する性質または細胞媒介性の細胞毒性を誘導する性質を有することが知られている。例として、８Ｂ６抗体はＯ−アセチル化ＧＤ２を認識するが、この細胞毒性を十分効果的に誘導することはできない。したがって、本発明の別の目的は、Ｏ−アセチル化ＧＤ２を認識し、細胞毒性活性を有する抗体を提供することである。これは特に、この細胞毒性を誘発することができる抗体の定常領域（クラス１ヒト免疫グロブリンの定常領域等）で抗体定常領域を置換することで行うことができる。その後、細胞毒性能をさらに高めることができ、これは特に、特別にグリコシル化（低フコシル化を含む）された抗体を、例えば特別に選択されたまたは形質転換された細胞を用いて製造することで行われるだろう。文献に記載の具体的な変異を、同じ目的のために本抗体配列に導入することもできる。
【００２８】
本発明に基づく治療抗体を製造する別の方法は、必要な特異性を有する抗体誘導体に細胞毒性薬剤を組み合わせることである。前記細胞毒性薬剤は、毒性化学物質；タキサン類、ニチニチソウアルカロイド類、それらの誘導体等の細胞毒性抗腫瘍薬等の、アンチセンスＲＮＡ；アントラサイクリン系薬剤、アルキル化剤；リシンもしくはシュードモナス毒素等の植物または細菌の毒素等の、生物学的毒性薬剤；または、１３１−ヨウ素、９０−イットリウム、１７７−ルテチウム、１８６−レニウム、６７−銅等のベータ粒子を放出する放射性同位元素；または１１１−インジウム等のオージェ電子を放出する放射性同位元素；またはさらに、２１３−ビスマス、２１２−ビスマス、２１１−アスタチン等のアルファ粒子を放出する放射性同位元素であってもよい。これらの例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。抗体はまた、当業者に公知の分子工学的方法で、サイトカインと組み合わせた融合タンパク質の形態で製造することもできる。使用されるサイトカインは基本的に、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、およびＩＬ−１８等のインターロイキンファミリーの一員；ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）またはＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）等の造血成長因子；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およびケモカインである。得られた抗体−サイトカイン融合タンパク質は、それが由来する抗体の特異性とサイトカインの生物学的性質を有する。
【００２９】
本発明の抗体はまた、当業者に公知の任意の技術の後で、細胞または生体液試料中のＯ−アセチル化ＧＤ２抗原の存在を検出するためにインビトロで診断を行うにしても、あるいは公知の医療イメージング技術（すなわちシンチグラフィーまたは陽電子放射断層撮影法）の１つで検出可能になるように修飾された抗体誘導体の投与によってインビボで行うにしても、診断に有利に適用することができる。その場合、抗体誘導体は、シンチグラフィー・イメージングまたは単一光子断層撮影法については、１３１−ヨウ素、１２３−ヨウ素、１１１−インジウム、または９９ｍ−テクネチウム等のガンマ光子を放出する放射性同位元素と組み合わされるか、あるいは陽電子放射断層撮影法については、１８−フッ素、１２４−ヨウ素、８６−イットリウム、６４−銅、４４−スカンジウム等の陽電子放出同位元素と組み合わされる。これらの例も本発明の範囲を限定するものではない。
【００３０】
本発明の抗体は、毒性または放射性の化合物と組み合わせることができる。毒性物は、エステル結合、アミド結合、ジスルフィド結合、またはチオエーテル結合等の種々の化学結合で化学的に、または共有結合で抗体に結合される。放射性原子は、求電子置換（ヨウ素同位体元素の場合）または求核置換（１８−フッ素の場合）で直接結合されるか、またはヨウ素同位元素の場合であればＢｏｌｔｏｎ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ試薬のような放射標識された反応性シントンを介して結合されるか、またはヨウ素同位元素もしくは２１１−アスタチンの場合であればスタニル化された活性エステルを介して結合されるか、あるいは放射性金属の場合であればキレート剤を用いて結合される。後者の場合、キレート剤の中から、どれが生体液中で金属と共に高い安定性を有する錯体を提供するか選ぶことは、当業者の知識範囲に含まれる。従って、ＤＴＰＡを１１１−インジウムと有利に使用することができるが、９０−イットリウムでの標識にはＤＯＴＡが好ましいであろう。
【００３１】
本発明の抗体は、毒性薬剤または検出可能な薬剤が抗体に直接結合されているのではなく、むしろ患者に抗体誘導体を投与した後の第２ステージで投与される低分子量分子（抗体誘導体はこの小分子をインビボで認識することができる）に結合している、当業者に公知の方法で使用することができる。この場合、抗体誘導体は特に二重特異性抗体もしくは免疫コンジュゲートであるか、または抗体誘導体とアビジンの融合タンパク質である。このアプローチは、インビボでの腫瘍の診断および治療に本発明の抗体と有利に使用することができる。
【００３２】
したがって、本発明の抗体および「誘導体」、「抗体誘導体」または「誘導体材料」は、そのような腫瘍の診断または治療に有利に使用することができる。これらには、黒色腫、小細胞肺癌、神経膠腫、神経芽細胞腫等の神経外胚葉起源の腫瘍が包含される。本発明の生成物は、これらの腫瘍の検出および治療に、特に腫瘍が散在しているかまたは既存の処置に反応しない場合に、有利に適用することができる。
【発明の概要】
【００３３】
本発明は、黒色腫、膠芽腫、小細胞肺性癌、神経芽細胞腫等をはじめとする神経外胚葉起源のヒトの癌の免疫ターゲッティングのための抗体の使用を開示する。
【００３４】
上述の本発明の種々の態様の全てにおいて、特に驚くべきことに、Ｏ−アセチル化ＧＤ２に特異的なモノクローナル抗体が、ＧＤ２ガングリオシドおよびそのＯ−アセチル化型を発現する腫瘍細胞を認識する一方で、ＧＤ２を発現する神経線維には付着しないことが明らかとなった。したがって、このような抗体は、末梢神経線維を認識しない、神経外胚葉起源の腫瘍細胞に限定された特異性を有する。この特異性の向上は、治療への適用における毒性の低減につながり、これは特に、ＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体で観察される正常末梢神経組織への付着がないことによるものである。したがって本発明は、このような抗体の、ＧＤ２を認識する抗体と比べて特異性が向上され、毒性が低下した、癌の診断および治療のための使用を包含する。
【００３５】
本発明の抗体は、その認識する腫瘍細胞に対する細胞毒性活性を有し、これは、内因性のものであるか（これが本発明の抗体をキメラ化またはヒト化する理由の１つである）、または抗体が毒性薬剤、特に放射性薬剤のベクターとして働くためである。
【００３６】
したがって、本発明は、Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する任意のモノクローナルキメラ抗体またはモノクローナルヒト化抗体、またはこの抗体の断片を包含し、前記抗体または前記断片は、末梢神経表面で発現するＧＤ２分子は認識せず、腫瘍細胞が発現するＯ−アセチル化ＧＤ２分子を認識する。
【００３７】
本発明はまた、特に元の抗体の性質を修飾するため、特にその免疫原性を低減させるため、またはその毒性活性を増大させるため、または注入後のクリアランスを早めるもしくは遅らせるため、当業者に公知の分子遺伝学的技術を用いて数個のアミノ酸が別のアミノ酸で置換された抗体を提供する。
【００３８】
有利には、本発明の人工修飾モノクローナル抗体またはその断片は、Ｏ−アセチル化ＧＤ２に対して１０−７ｍｏｌ／リットルを超える親和性を有し、ＧＤ２自体には１０分の１未満の親和性を有するκ−ＩｇＧであり、前記抗体または前記断片が単一特異性または二重特異性であることを特徴とする。
【００３９】
特に本発明は、限定されるものではないが、Ｈ鎖可変領域の相補性決定領域が配列番号３、配列番号４および配列番号５で表されるアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖可変領域の相補性決定領域が配列番号６、配列番号７および配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する、任意の人工修飾モノクローナル抗体またはその断片を提供する。
【００４０】
特に本発明は、限定されるものではないが、非ヒト抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡをヒト免疫グロブリンの定常領域をコードするｃＤＮＡに連結することで得られる重鎖を有し、同じ非ヒト抗体の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡをヒト免疫グロブリンの軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡに連結することで得られる軽鎖を有する人工修飾モノクローナル抗体またはその断片において、前記非ヒト抗体がマウス８Ｂ６モノクローナル抗体であり、前記人工修飾抗体がＯ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドに対して産生されたものであり末梢神経繊維を認識しないことを特徴とする、任意の人工修飾モノクローナル抗体またはその断片を提供する。
【００４１】
特に本発明は、限定されるものではないが、配列番号１で表されるアミノ酸推定配列の重鎖可変領域を有し、配列番号２で表されるアミノ酸推定配列の軽鎖可変領域を有する、任意の人工修飾モノクローナル抗体またはその断片を提供する。
【００４２】
請求項５に記載の人工修飾モノクローナル抗体またはその断片は、ＣＨＯ細胞株を用いて得られるＫＭ８Ｂ６抗体またはその断片であることが好ましい。
【００４３】
本発明はまた、本発明の人工修飾抗体またはその断片に由来する医薬分子であって、抗体またはその断片が、分子Ｘ（ここでＸは毒性分子、薬、プロドラッグ、または特異性に無関係な二次抗体である）に結合している任意の医薬分子を提供する。
【００４４】
一つの態様によれば、上記毒性分子は、毒性の化学分子、生物学的分子、または放射性分子であって、上記分子は、Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する腫瘍細胞を死滅させることを意図したものである。
【００４５】
本発明の医薬分子の標的になる前記腫瘍細胞は、神経芽細胞腫、黒色腫、膠芽腫、または小細胞肺癌の細胞であることが好ましい。
【００４６】
本発明の医薬分子は、糖の付加によってＦｃ領域が変異しており、したがって、免疫細胞および補体系分子の活性化を調節するものであることが好ましい。
【００４７】
本発明はまた、腫瘍細胞表面でＯ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドの発現を示す癌の診断のための任意の分子を提供し、前記分子は本発明の人工修飾抗体またはその断片に由来し、前記抗体または前記断片は、この抗体または前記断片を蛍光または放射活性で検出するための薬剤に結合している。
【００４８】
したがって、本発明は、Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞を有する癌を治療処置するための薬の製造、またはそのような癌を診断するための製品の製造のための、本発明の人工修飾抗体もしくはその断片および／または本発明の分子の任意の使用に関する。
【００４９】
さらに、本発明は、医薬分子の製造における８Ｂ６モノクローナル抗体（論文’Variable Region Gene Segments of Nine Monoclonal Antibodies Specific to Disialoganglisosides (GD2, GD3) and their O-Actylated Derivatives‘, Cerato et al., Hybridoma Volume 16, n°4, 1997, 307-316’に記載されている）の任意の使用を提供し、前記抗体は毒性の化学物質、生物学的薬剤、または放射性薬剤に結合しており、ここで前記分子はＯ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する腫瘍細胞を死滅させることを意図したものである。
【００５０】
特に本発明は、限定されるものではないが、前記細胞が神経芽細胞腫、黒色腫、膠芽腫、または小細胞肺癌の細胞であるような使用を提供する。
【００５１】
特に本発明は、限定されるものではないが、前記治療分子が糖の付加によってＦｃ領域が変異しており、従って免疫細胞および補体系分子の活性化を調節する使用を提供する。
【００５２】
本発明はまた、腫瘍細胞の表面にＯ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する癌を診断するための分子の製造のための、８Ｂ６モノクローナル抗体の任意の使用を提供し、前記分子は前記抗体に由来し、ここで前記抗体は蛍光または放射活性によって抗体を検出するための薬剤に結合している。
【００５３】
本発明はまた、本発明の人工修飾抗体をコードするＤＮＡの任意の配列、およびプロモーターに機能的に連結されたそのようなＤＮＡ配列を含む任意の発現ベクターを提供する。
【００５４】
本発明はまた、そのような発現ベクターを含む任意の細胞、特に動物細胞、および本発明の人工修飾抗体を産生する任意の非ヒト形質転換体を提供する。
【００５５】
最後に、本発明は、Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドに対する人工修飾抗体を製造するための任意の方法を提供し、前記プロセスは、好適な条件下における細胞または非ヒト形質転換体中でのＤＮＡ配列の発現、および抗体の回収を含んでなる。
【００５６】
細胞または形質転換体は、抗体が蓄積する条件下で培養することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】プラスミドｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬの構築を示す図である。
【図２】プラスミドｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌの構築を示す図である。
【図３】プラスミドｐｃＤＮＡ３（登録商標）ＫＭ８Ｂ６Ｌの構築を示す図である。
【図４】人工修飾抗体ＫＭ８Ｂ６の軽鎖の塩基配列およびアミノ酸推定配列を示す図である。
【図５】プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨの構築を示す図である。
【図６】プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ ＳＫ（＋）ＫＭ６０Ｃ３−Ｈの構築を示す図である。
【図７】プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ ＳＫ（＋）ＫＭ８Ｂ６−Ｈの構築を示す図である。
【図８】プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（著作権）（＋）ＫＭ８Ｂ６−Ｈの構築を示す図である。
【図９】人工修飾抗体の重鎖ＫＭ８Ｂ６の塩基配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１０】精製した抗Ｏ−アセチル化ＧＤ２人工修飾抗体ＫＭ８Ｂ６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。分析は、還元条件下（左側）および非還元条件下（右側）で行った。左から順に、分子量マーカー、ＫＭ８Ｂ６、ＩｇＧ３ ８Ｂ６（還元条件）、高分子量マーカー、ＫＭ８Ｂ６、およびＩｇＧ３ ８Ｂ６（非還元条件）。
【図１１】免疫蛍光で測定した、ＩＭＲ３２およびＮｅｕｒｏＡ細胞（それぞれＯ−アセチル化ＧＤ２抗原ありまたはなし）上の８Ｂ６抗体およびＫＭ８Ｂ６抗体の反応性を示すグラフである。縦軸は検出された細胞数、横軸は蛍光強度を示す。青色のプロットは、基準となる反応性に相当し、赤色のプロットは生成物の反応性に相当する。
【図１２】ＥＬＩＳＡアッセイで試験した、ＩＭＲ３２細胞およびＮｅｕｒｏＡ細胞上の８Ｂ６抗体およびＫＭ８Ｂ６抗体の反応性を示すグラフである。
【図１３】シリカ薄層クロマトグラフィーで分離したラット脳ガングリオシドについてＫＭ８Ｂ６抗体を用いて得られた免疫染色のプロフィールを示す図である。バンドＡ：種々のラット脳ガングリオシドの遊走のレゾルシノール染色。
【図１４】神経芽細胞腫細胞およびヒト神経繊維の免疫組織化学的アッセイの結果を示す図である。
【図１５】毒性試験（ＡＤＣＣ）の結果を示す図である。人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体およびそれが由来するマウス８Ｂ６ ｍＡｂのパーセントＡＤＣＣ活性を示す。＊リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））：ネガティブコントロールとして使用した抗ＣＤ２０抗体。
【図１６】マウスにおける、Ｏ−アセチル化ＧＤ２抗原を発現するマウスＥＬ４胸腺腫に対する８Ｂ６ ｍＡｂの抗腫瘍効果のインビボ試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体の製造
【００５９】
１．マウスモノクローナル抗体６０Ｃ３の可変Ｌ−ＶＬ領域をコードするｃＤＮＡの調製
【００６０】
（ａ）モノクローナル６０Ｃ３抗体を産生する６０Ｃ３ハイブリドーマからの全ＲＮＡの抽出
【００６１】
ＲＮＡｂｌｅ試薬（ＥＵＲＯＢＩＯ社、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、指数増殖期の１０６ ６０Ｃ３ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出する。２６０ｎｍでの吸光度を測定して全ＲＮＡ濃度を決定する。
【００６２】
（ｂ）．６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡの塩基配列の獲得
【００６３】
６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ可変領域をコードするｃＤＮＡをＲＡＣＥ−ＰＣＲによってメッセンジャーＲＮＡから遺伝子増幅し、可変領域（ＶＬ）と組み合わされたシグナルペプチド（Ｌ）をコードする塩基配列を得た。この増幅は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（サンノゼ、カリフォルニア州、米国）から入手したＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットをメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。逆転写に使用する全ＲＮＡ量は１μｇである。反応産物を、メーカーから入手可能なトリシンＥＤＴＡ緩衝液１００μＬ中に希釈した。体積２．５μＬの希釈産物を遺伝子増幅に使用した。使用した６０Ｃ３ ＶＬのｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプローブは、５’−６０Ｃ３ ＶＬ：５’−ＴＴＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＡＧＣ −３’（配列番号９）である。増幅は、反応混合液をＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（ＰＥ）ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＷＥＬＬＥＳＬＥＹ社、マサチューセッツ州、米国）で以下の条件でインキュベートすることで行った：（９４℃５秒、７２℃３分）を５サイクル；その後（９４℃５秒、次いで７０℃１０秒、その後７２℃３分）を５サイクル、および（９４℃５秒、次いで６９℃１０秒、および７２℃３分）を２５サイクル。ＲＡＣＥ−ＰＣＲの反応産物を、泳動用緩衝液にトリスＥＤＴＡ（ｐＨ８；４０ｍＭのトリス塩基（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ製））、２５ｍＭのＥＤＴＡ（ＩＮＥＲＣＨＩＭ社、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、フランス）、２０ｍＭの酢酸（イタリア、ＲｏｄａｎｏのＣＡＲＬＯ ＥＲＢＡ ＲＥＡＧＥＮＴＩ ＳＰＡ社、Ｒｏｄａｎｏ、ＭＩ、イタリア）を用い、１％アガロースゲル電気泳動（Ｑ．ＢＩＯＧＥＮＥ社、モーガンアーバイン、カリフォルニア州、米国）で分析する。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、予想される分子量を有する産物を精製する。６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ領域をコードするｃＤＮＡ配列を確認するための得られた精製産物の核酸配列の決定は、ＧＥＮＯＭＥ ＥＸＰＲＥＳＳ社（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）が行った。６０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域と組み合わされたシグナルペプチドに相当する配列をこうして決定し、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬのｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングするためのプローブを設計した。
【００６４】
（ｃ）．６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡの増幅
【００６５】
６０Ｃ３ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡ抽出物から、ＲＴ−ＰＣＲによって６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを増幅させた。反応混合液は以下の通りである：０．５μｇのオリゴｄ（Ｔ）１８（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、１μｇのＲＮＡ、および０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）、これらを滅菌水で１２μＬにする（ｑｓｐ１２μＬ）。この混合液を６５℃（乾燥制御された浴）で５分間、その後４℃（氷水）で２分間インキュベートしてＲＮＡを変性させる。この反応混合液に、４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ溶液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０ｍＭのＤＴＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１６０ＵのＲｎａｓｉｎｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、および８００Ｕの逆転写酵素（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を加える。得られた混合液を３７℃で１時間、その後反応を停止させるために７０℃で１５分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ遺伝子増幅によって、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡのコピーを得る；５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ：５’−ＡＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＡＴ−３’（センスプローブ、配列番号１０）および３’−ＸｈｏＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ：５’−ＴＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＡＧＣ ＡＣＣ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号１１）。
【００６６】
使用した合成プローブはＤＮＡ配列にサイレント変異を導入し、この変異は、アミノ酸配列は変化させない一方で、ベクターへのクローニングに必要なＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を導入する。
【００６７】
反応媒体は以下の組成を有する：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧａ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−Ｘｈｏｌ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬおよびプローブ５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３。
【００６８】
この増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＰＥＬＴＩＥＲ ＴＨＥＲＭＡＬ ＣＹＣＬＥＲ）を用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。
【００６９】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動分析で確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを精製する。
【００７０】
２．６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを有する組換えプラスミドの構築：ｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ
【００７１】
（ａ）．ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）および６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡの消化、並びに消化したベクターの脱リン酸化
【００７２】
制限酵素で消化し、目的のｃＤＮＡを挿入するために必要な付着末端を有する直鎖状ベクターを得る。この消化は、以下の条件で行われる：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）または６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡ（１（μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｈｏＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。消化したベクターおよびインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いでベクターをＣＩＰ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。反応混合液の組成は以下の通りである：１０×ＮＥＢ３緩衝剤（５μＬ）、ベクター（１μｇ）、ＣＩＰ（１μＬ）。この反応は、ベクターのセルフライゲーションの割合を減少させることでライゲーション収率を高める。実際、遊離端部の５’端および３’端のリン酸部分を消化して抑制すると、ベクターの自発的な閉鎖が妨げられる。
【００７３】
（ｂ）．ライゲーション反応
【００７４】
Ｔ４リガーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を使用してライゲーションすることで、消化および脱リン酸化されたベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）中に、消化された６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡが挿入される。この反応はさらに１６℃の水浴中で１６時間、以下の反応媒体中で行われる：ライゲーション緩衝液 ５×（４μＬ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、２００ｎｇの消化および脱リン酸化されたベクター、Ｔ４リガーゼ（４００Ｕ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、（１ｋｂのインサートについて）１７０ｎｇの精製ｃＤＮＡ。インサート：ベクターのモル比は３：１である。
【００７５】
（ｃ）．コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換
【００７６】
ライゲーション反応産物２０μＬをコンピテント細菌懸濁液１００μＬに加える。得られた混合液を４℃で３０分間インキュベートする。次いでこの細菌に４２℃で２分間ヒートショックを与え、続いて４℃に２分間置く。次いで、体積１ｍＬのＬＢ培地を加え、この細菌を撹拌（２５０ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間インキュベートする。４０００×ｇ、４℃で５分間遠心して細菌を回収する。細菌ペレットを１０μＬのＬＢ培地にとり、その後１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）を含む２ＸＴＹ寒天培地の入ったペトリ皿に蒔く。３７℃で一晩インキュベートした後、抵抗性のコロニーが発達する。
【００７７】
（ｄ）．ＰＣＲによる、ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）中にインサート６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬの存在の確認
【００７８】
単離したコロニーを、換気フード内で無菌条件下にて以下のＰＣＲ反応混合液を含むチューブにそれぞれ入れる：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＸｈｏＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬおよびプローブ５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３。
【００７９】
この増幅はＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。増幅されたＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンだけで、予想されるサイズのＰＣＲ産物が得られる。
【００８０】
（ｅ）．目的のプラスミドｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬの製造
【００８１】
滅菌つまようじを使用し、コロニーを採取した後、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）を含む５ｍＬのＬＢ選択液体培地に加え、３７℃で１６時間インキュベートする。次いで、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。
【００８２】
３．ヒトＰ３Ｎｏｎ２モノクローナル抗体の定常領域ｈｕ−ＣκをコードするｃＤＮＡの調製
【００８３】
（ａ）．Ｐ３Ｎｏｎ２モノクローナル抗体を産生するＰ３Ｎｏｎ２ハイブリドーマからの全ＲＮＡの抽出
【００８４】
ＲＮＡｂｌｅ試薬（フランス、ＣｏｕｒｔａｂｏｅｕｆのＥＵＲＯＢＩＯ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、指数増殖期の１０６ Ｐ３Ｎｏｎ２ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出する。２６０ｎｍでの吸光度を測定することで、全ＲＮＡ濃度を決定する。
【００８５】
（ｂ）．ｈｕ−ＣκｃＤＮＡの増幅
【００８６】
ｈｕ−ＣκのｃＤＮＡの増幅は、Ｐ３Ｎｏｎ２ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡ抽出物をＲＴ−ＰＣＲすることで行った。反応混合液は以下の通りである：０．５μｇのオリゴｄ（Ｔ）１８（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、１μｇのＲＮＡ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）、これらを滅菌水で１２μＬにした（ｑｓｐ１２μＬ）。この混合液を６５℃（乾燥制御された浴）で５分間、次いで４℃（氷水）で２分間インキュベートし、ＲＮＡを変性させる。次いでこの反応混合液に、４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ溶液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０ｍＭのＤＴＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１６０ＵのＲｎａｓｉｎｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、および８００Ｕの逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を加える。得られた混合液を３７℃で１時間、次いで反応を停止させるために７０℃で１５分間インキュベートする。６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡのコピーを、以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ遺伝子増幅で得る；５’−ＸｈｏＩ ｈｕ−Ｃκ：５’−ＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＡ Ｃ−３’（センスプローブ、配列番号１２）および３’−ＸｂａＩ ｈｕ−Ｃκ：５’−ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＴＴ ＧＡ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号１３）。
【００８７】
使用の合成プローブはＤＮＡ配列にサイレント変異を導入し、この変異は、アミノ酸配列は変化させない一方で、ベクターにクローニングするために必要なＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を導入する。
【００８８】
反応媒体は以下の組成を有する：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＸｂａＩ ｈｕ−Ｃκおよびプローブ５’−ＸｈｏＩ ｈｕ−Ｃκ。
【００８９】
この増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＰＥＬＴＩＥＲ ＴＨＥＲＭＡＬ ＣＹＣＬＥＲ）を用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。
【００９０】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動分析で確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、ｈｕ−ＣκｃＤＮＡを精製する。
【００９１】
４．人工修飾抗体ＫＭ６０Ｃ３の軽鎖の発現ベクターの構築：ｐｃＤＮＡ３（登録商標）ＫＭ６０Ｃ３−Ｌ
【００９２】
（ａ）．ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬおよびｈｕ−ＣκｃＤＮＡの消化、および消化したベクターの脱リン酸化
【００９３】
消化は以下の条件下で行う：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬまたはｈｕ−ＣκｃＤＮＡ（１μｇ）、制限酵素ＸｈｏＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｂａＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続けた。消化したベクターおよびインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いで、ベクターをＣＩＰ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ３１０×緩衝剤（５μＬ）、ベクター（１μｇ）、ＣＩＰ（１μＬ）。
【００９４】
（ｂ）．ライゲーション反応
【００９５】
Ｔ４リガーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を使用してライゲーションすることで、消化および脱リン酸化されたベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ中に、消化されたｃＤＮＡであるｈｕ−ＣκｃＤＮＡが挿入される。この反応はさらに１６℃の水浴中で１６時間、以下の反応媒体中で行われる：ライゲーション緩衝液 ５×（４μＬ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、２００ｎｇの消化および脱リン酸化されたベクター、Ｔ４リガーゼ（４００Ｕ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、（１ｋｂのインサートについて）１７０ｎｇの精製ｃＤＮＡ。インサート：ベクターのモル比は３：１である。ライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換に使用する。
【００９６】
（ｃ）．ＰＣＲによる、ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＬ中にインサートｈｕ−Ｃκの存在の確認
【００９７】
単離した抵抗性のコロニーを、換気フード内で無菌条件下にて以下のＰＣＲ反応混合液を含むチューブに入れる：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＸｂａＩ ｈｕ−Ｃκおよびプローブ５’−ＸｈｏＩ ｈｕ−Ｃκ。増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。増幅されたＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのＰＣＲ産物が得られる。
【００９８】
（ｄ）．目的のプラスミドｐｃＤＮＡ３（登録商標）ＫＭ６０Ｃ３−Ｌの製造
【００９９】
滅菌つまようじを使用し、コロニーを採取した後、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）を含む５ｍＬのＬＢ選択液体培地に加え、３７℃で１６時間インキュベートする。次いで、ＱｌＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。
【０１００】
５．人工修飾抗体ＫＭ ８Ｂ６の軽鎖の発現ベクターの構築：ｐｃＤＮＡ３（登録商標）８Ｂ６−Ｌ
【０１０１】
（ａ）．ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）ｈｕ−Ｃκの獲得
【０１０２】
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化することで、ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）ＫＭ６０Ｃ３−ＬからベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）ｈｕ−Ｃκを調製した。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ２１０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクター（１μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｈｏＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。消化したベクターを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いでベクターをＣＩＰ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ３緩衝剤１０×（５μＬ）、ベクター（１μｇ）、ＣＩＰ（１μＬ）。
【０１０３】
（ｂ）．８Ｂ６モノクローナル抗体を産生する８Ｂ６ハイブリドーマからの全ＲＮＡの抽出
【０１０４】
ＲＮＡｂｌｅ試薬（フランス、ＣｏｕｒｔａｂｏｅｕｆのＥＵＲＯＢＩＯ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、指数増殖期の１０６ ８Ｂ６ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出する。２６０ｎｍでの吸光度を測定して全ＲＮＡ濃度を決定する。
【０１０５】
（ｃ）．８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡの塩基配列の獲得
【０１０６】
可変領域８Ｂ６ Ｌ−ＶＬをコードするｃＤＮＡをＲＡＣＥ−ＰＣＲによってメッセンジャーＲＮＡから遺伝子増幅し、可変領域（ＶＬ）と組み合わされたシグナルペプチド（Ｌ）をコードする塩基配列を得た。この増幅は、ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社（サンノゼ、カリフォルニア州、米国）から入手したＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットをメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。逆転写に使用する全ＲＮＡ量は１μｇである。反応産物を、メーカーから入手可能なトリシンＥＤＴＡ緩衝液１００μＬ中に希釈した。体積２．５μＬの希釈産物を遺伝子増幅に使用した。使用した８Ｂ６ ＶＬ ｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプローブは以下の通りである：κ型マウス抗体軽鎖の定常部ｍｕＣκをコードするｃＤＮＡとハイブリダイズする３’−ｍｕＣκ：５’−ｇｔｔ ｃａｔ ａｃｔ ｃｇｔ ｃｃｔ ｔｇｇ ｔｃａ ａｃｇ ｔｇａ ｇｇｇ−３’。増幅は、反応混合液をＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（ＰＥ）ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＷＥＬＬＥＳＬＥＹ社、マサチューセッツ州、米国）で以下の条件でインキュベートすることで行った：（９４℃５秒、７２℃３分）を５サイクル、次いで（９４℃５秒、次いで７０℃１０秒、その後７２℃３分）を５サイクル、（９４℃５秒、６９℃１０秒、７２℃３分）を２５サイクル。ＲＡＣＥ−ＰＣＲ反応産物を、泳動用緩衝液にトリスＥＤＴＡ（ｐＨ８；４０ｍＭのトリス塩基（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社））、２５ｍＭのＥＤＴＡ（ＩＮＥＲＣＨＩＭ社、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、フランス）、２０ｍＭの酢酸（ＣＡＲＬＯ ＥＲＢＡ ＲＥＡＧＥＮＴＩ ＳＰＡ社、Ｒｏｄａｎｏ、ＭＩ、イタリア）を用い、１％アガロースゲル電気泳動（Ｑ．ＢＩＯＧＥＮＥ社、モーガンアーバイン、カリフォルニア州、米国）で分析する。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、予想される分子量を有する産物を精製する。８Ｂ６ Ｖ−ＶＬ領域をコードするｃＤＮＡ配列を確認するための得られた精製産物の核酸配列の決定は、ＧＥＮＯＭＥ ＥＸＰＲＥＳＳ社（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）が行った。８Ｂ６抗体の軽鎖可変領域と組み合わされたシグナルペプチドに相当する配列をこうして決定し、８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングするためのプローブを設計した。
【０１０７】
（ｄ）．８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡの増幅
【０１０８】
６０Ｃ３ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡ抽出物から、ＲＴ−ＰＣＲによって８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを増幅させた。反応混合液は以下の通りである：０．５μｇのオリゴｄ（Ｔ）１８（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、１μｇのＲＮＡ、および０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）、これらを滅菌水で１２μＬにする（ｑｓｐ１２μＬ）。この混合液を６５℃（乾燥制御された浴）で５分間、その後４℃（氷水）で２分間インキュベートしてＲＮＡを変性させる。次いでこの反応混合液に、４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ溶液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０ｍＭのＤＴＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１６０ＵのＲｎａｓｉｎｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、および８００Ｕの逆転写酵素（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を加える。得られた混合液を３７℃で１時間、その後反応を停止させるために７０℃で１５分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ遺伝子増幅によって、８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡのコピーを得る；５’− ＢａｍＨＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＬ：５’− ＡＡＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＣＣＴ ＧＴＴ −３’（センスプローブ、配列番号１４）および３’−ＸｈｏＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＬ：５’−ＣＣＧ ＴＴＴ ＴＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣＣ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号１５）。
【０１０９】
使用の合成プローブはＤＮＡ配列にサイレント変異を導入し、この変異は、アミノ酸配列は変化させない一方で、ベクターへのクローニングに必要なＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を導入する。
【０１１０】
反応媒体は以下の組成を有する：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＸｈｏＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＬおよびプローブ５’−ＢａｍＨＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＬ。
【０１１１】
この増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＰＥＬＴＩＥＲ ＴＨＥＲＭＡＬ ＣＹＣＬＥＲ）を用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。
【０１１２】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動分析で確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを精製する。
【０１１３】
（ｅ）．８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡの消化
【０１１４】
８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡ（１μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｈｏＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。消化したインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。
【０１１５】
（ｆ）．ライゲーション反応
【０１１６】
Ｔ４リガーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を使用してライゲーションすることで、消化および脱リン酸化されたベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）ｈｕ−Ｃκ中に、消化された８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡが挿入される。この反応をさらに１６℃の水浴中で１６時間、以下の反応媒体中で行う：ライゲーション緩衝液 ５×（４μＬ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、２００ｎｇの消化および脱リン酸化されたベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）ｈｕ−Ｃκ、Ｔ４リガーゼ（４００Ｕ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、（１ｋｂのインサートについて）１７０ｎｇの精製８Ｂ６ Ｌ−ＶＬｃＤＮＡ。インサート：ベクターのモル比は３：１である。ライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換に使用する。
【０１１７】
（ｇ）．ＰＣＲによる、ベクターｐｃＤＮＡ３（登録商標）ｈｕ−Ｃκ中にインサート８Ｂ６ Ｌ−ＶＬの存在の確認
【０１１８】
単離した抵抗性のコロニーを、換気フード内で無菌条件下にて以下のＰＣＲ反応混合液を含むチューブに入れる：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＸｈｏＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＬおよびプローブ５’−ＢａｍＨＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＬ。増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。増幅されたＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのＰＣＲ産物が得られる。
【０１１９】
（ｈ）．目的のプラスミドｐｃＤＮＡ３（登録商標）ＫＭ８Ｂ６ Ｌの製造
【０１２０】
滅菌つまようじを使用し、コロニーを採取した後、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯ社）を含む５ｍＬのＬＢ選択液体培地に加え、３７℃で１６時間インキュベートする。次いで、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）スピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。
【０１２１】
マウス６０Ｃ３モノクローナル抗体のＬ−ＶＨ可変領域をコードするｃＤＮＡの調製
【０１２２】
（ａ）．６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡの塩基配列の獲得
【０１２３】
６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ可変領域をコードするｃＤＮＡをＲＡＣＥ−ＰＣＲによってメッセンジャーＲＮＡから遺伝子増幅し、可変領域（ＶＬ）と組み合わされたシグナルペプチド（Ｌ）をコードする塩基配列を得た。この増幅は、ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社（サンノゼ、カリフォルニア州、米国）から入手したＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットをメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。逆転写に使用する全ＲＮＡ量は１μｇである。反応産物を、メーカーから入手可能なトリシンＥＤＴＡ緩衝液１００μＬ中に希釈した。体積２．５μＬの希釈産物を遺伝子増幅に使用した。使用した６０Ｃ３ＶＨのｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプローブは、κ型マウス抗体軽鎖のｍｕＣ−κ定常部をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズする３’−６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ：５’−ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＧＴ ＡＧＴ ＣＣＣ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号１６）である。増幅は、反応混合液をＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（ＰＥ）ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＷＥＬＬＥＳＬＥＹ社、マサチューセッツ州、米国）で以下の条件でインキュベートすることで行った：（９４℃５秒、７２℃３分）を５サイクル、その後（９４℃５秒、次いで７０℃１０秒、その後７２℃３分）を５サイクル、および（９４℃５秒、その後６９℃１０秒、７２℃３分）を２５サイクル。ＲＡＣＥ−ＰＣＲの反応産物を、泳動用緩衝液にトリスＥＤＴＡ（ｐＨ８；４０ｍＭのトリス塩基（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社））、２５ｍＭのＥＤＴＡ（ＩＮＥＲＣＨＩＭ社、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、フランス）、２０ｍＭの酢酸（ＣＡＲＬＯ ＥＲＢＡ ＲＥＡＧＥＮＴＩ ＳＰＡ社、Ｒｏｄａｎｏ、ＭＩ、イタリア）を用い、１％アガロースゲル電気泳動（Ｑ．ＢＩＯＧＥＮＥ社、モーガンアーバイン、カリフォルニア州、米国）で分析する。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、予想される分子量を有する産物を精製する。６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ領域をコードするｃＤＮＡ配列を確認するための得られた精製産物の核酸配列の決定は、ＧＥＮＯＭＥ ＥＸＰＲＥＳＳ社（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）が行った。６０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域と組み合わされたシグナルペプチドに相当する配列をこうして決定し、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨのｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングするためのプローブを設計した。
【０１２４】
（ｂ）．６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡの増幅
【０１２５】
６０Ｃ３ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡ抽出物から、ＲＴ−ＰＣＲによって、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを増幅させた。反応混合液は以下の通りである：０．５μｇのオリゴｄ（Ｔ）１８（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、１μｇのＲＮＡ、および０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）、これらを滅菌水で１２μＬにする（ｑｓｐ１２μＬ）。この混合液を６５℃（乾燥制御された浴）で５分間、その後４℃（氷水）で２分間インキュベートしてＲＮＡを変性させる。この反応混合液に、４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ溶液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０ｍＭのＤＴＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１６０ＵのＲｎａｓｉｎｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、および８００Ｕの逆転写酵素（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を加える。得られた混合液を３７℃で１時間、その後反応を停止させるために７０℃で１５分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ遺伝子増幅によって、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡのコピーを得る；５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ：５’−ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＡＡＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＴＡ ＡＣＣ ＡＴＧ Ｇ−３’（センスプローブ、配列番号１７）および３’−ＮｈｅＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ：５’−Ｔ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＣＡＧ ＡＧＴ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号１８）。
【０１２６】
使用の合成プローブはＤＮＡ配列にサイレント変異を導入し、この変異は、アミノ酸配列は変化させない一方でベクターへのクローニングに必要なＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を導入する。
【０１２７】
反応媒体は以下の組成を有する：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＮｈｅＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨおよびプローブ５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ。
【０１２８】
この増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＰＥＬＴＩＥＲ ＴＨＥＲＭＡＬ ＣＹＣＬＥＲ）を用いて以下の条件で行った：９４℃５分間；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。
【０１２９】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動分析で確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを精製する。
【０１３０】
７．６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨＣｄｎａを有する組換えプラスミドの構築
【０１３１】
（ａ）．クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨの構築
【０１３２】
６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ領域をコードする配列の、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）への挿入は、制限酵素ＥｃｏＲＶ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）でベクターを消化して平滑末端断面を作ることを含んでなる。得られた直鎖状プラスミドをｄＴＴＰ存在下でＴａｑポリメラーゼで処理し、ベクターの３’末端にさらにチミジンを付加してセルフライゲーションを防ぐ。６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを得るために使用するＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ産物の各３’末端に１つの末端アデニンを付加する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、このような産物は上記のベクターに直接クローニングすることができる。このライゲーション反応はＡ／Ｔ相補性のおかげで、平滑末端によるライゲーション反応と比べて収率が非常に高い。このライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換に使用する。
【０１３３】
（ｂ）．ＰＣＲによる、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）中に６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨインサートの存在の確認
【０１３４】
単離した抵抗性のコロニーを、換気フード内で無菌条件下にて以下のＰＣＲ反応混合液を含むチューブに入れる：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＮｈｅＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨおよびプローブ５’−ＢａｔｎＨＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ。増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。増幅されたＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのＰＣＲ産物が得られる。
【０１３５】
（ｃ）．目的のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨの製造
【０１３６】
この目的のために、滅菌つまようじを使用し、コロニーを採取した後、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）を含む５ｍＬのＬＢ選択液体培地に加え、３７℃で１６時間インキュベートする。次いで、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。
【０１３７】
（ｄ）．酵素消化による、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ中の６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨインサートの方向の確認
【０１３８】
６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨインサートがセンス方向で存在することを、酵素ＢａｍＨＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨを酵素消化することで確認する。実際、Ｔクローニング技術では、インサートが一方向であることは要求されないため、インサートはセンス方向またはアンチセンス方向に挿入され得る。６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨインサートは、センス方向のときだけ、２つのＢａｍＨＩ制限酵素認識部位によってフランキング部位が得られる。したがって、酵素ＢａｍＨＩでの消化後、電気泳動分析によって、６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡをセンス方向で有するクローンを識別および選択することができる。
【０１３９】
８．ｈｕ−Ｃγ１ヒト抗体の定常領域をコードするｃＤＮＡの調製
【０１４０】
ａ．γ１イソタイプの重鎖を産生するＬＰ１ヒトミエローマ株からの全ＲＮＡの抽出
【０１４１】
ＲＮＡｂｌｅ試薬（ＣｏｕｒｔａｂｏｅｕｆのＥＵＲＯＢＩＯ社、フランス）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、指数増殖期の１０６ ＬＰ１ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出する。２６０ｎｍでの吸光度を測定して全ＲＮＡ濃度を決定する。
【０１４２】
ｂ．ｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡセグメントの遺伝子増幅
【０１４３】
ＬＰ１ハイブリドー
マの全ＲＮＡ抽出物から、ｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡを増幅させた。反応混合液は以下の通りである：０．５μｇのオリゴｄ（Ｔ）１８（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、１μｇのＲＮＡ、および０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）、これらを滅菌水で１２μＬにする（ｑｓｐ１２μＬ）。この混合液を６５℃（乾燥制御された浴）で５分間、その後４℃（氷水）で２分間インキュベートしてＲＮＡを変性させる。次いでこの反応混合液に、４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１０ｍＭのＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１６０ＵのＲｎａｓｉｎｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、および８００Ｕの逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を加える。得られた混合液を３７℃で１時間、その後反応を停止させるために７０℃で１５分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ遺伝子増幅によって、ｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡのコピーを得る；５’−Ｎｈｅｌ ｈｕ−Ｃγ１：５’−ＣＡ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＣＣ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＣＡ ＴＣＧ ＧＴＣ ＴＴＣ Ｃ−３’（センスプローブ、配列番号１９）および３’−ＸｂａＩ ｈｕ−Ｃγ１：５’−ＡＧＣ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＡＡ ＴＡＡ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＧ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号２０）。
【０１４４】
使用した合成プローブはＤＮＡ配列にサイレント変異を導入し、この変異は、アミノ酸配列は変化させない一方ベクターへのクローニングに必要なＮｈｅＩおよびＸｂａＩ制限酵素認識部位を導入する。
【０１４５】
反応媒体は以下の組成を有する：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’−ＸｂａＩ ｈｕ−Ｃγ１およびプローブ５’−ＮｈｅＩ ｈｕ−Ｃγ１。
【０１４６】
この増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＰＥＬＴＩＥＲ ＴＨＥＲＭＡＬ ＣＹＣＬＥＲ）を用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで、９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。
【０１４７】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動分析で確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、ｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡを精製する。
【０１４８】
９．ｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡと結合した６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを有する組換えプラスミドの構築：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ＫＭ６０Ｃ３ Ｈ
【０１４９】
（ａ）．ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨおよびｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡの消化、並びに消化したベクターの脱リン酸化
【０１５０】
消化は以下の条件下で行う：１０×ＢＥＢ２緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨまたはｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡ（１μｇ）、制限酵素ＮｈｅＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｂａＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。消化したベクターおよびインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いでベクターをＣＩＰ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。
【０１５１】
反応媒体の組成は以下の通りである：１０×ＮＥＢ３緩衝剤（５μＬ）、ベクター（１μｇ）、ＣＩＰ（１μＬ）。
【０１５２】
（ｂ）．ライゲーション反応
【０１５３】
Ｔ４リガーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を使用してライゲーションすることで、消化および脱リン酸化されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ中に、消化されたｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡが挿入される。このライゲーション反応をさらに１６℃の水浴中で１６時間、以下の反応媒体中で行う：ライゲーション緩衝液 ５×（４μＬ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、２００ｎｇの消化および脱リン酸化されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ、Ｔ４リガーゼ（４００Ｕ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、（１ｋｂのインサートについて）１７０ｎｇの精製ｈｕ−Ｃγ１ｃＤＮＡ。インサート：ベクターのモル比は３：１である。このライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換に使用する。
【０１５４】
（ｃ）．ＰＣＲによる、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ中のｈｕ−Ｃγ１インサートの存在および方向の確認
【０１５５】
ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ制限酵素認識部位を選んだことにより、ｈｕ−Ｃγ１インサートはセンス方向またはアンチセンス方向であり得る。これはこれらの制限酵素認識部位の配列が、インサートが一方向であることを要求しないためである。インサートがセンス方向であることをＰＣＲで確認する。単離したコロニーをそれぞれ、換気フード内で無菌条件下にて以下のＰＣＲ反応混合液を含むチューブにそれぞれ入れる：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのセンスプローブおよびアンチセンスプローブ。この増幅はＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。使用したプローブは、５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ：５’−ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＡＡＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＴＡ ＡＣＣ ＡＴＧ Ｇ−３’（センスプローブ、配列番号２１）および３’−ＸｂａＩ ｈｕ−Ｃγ１：５’−ＡＧＣ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＡＡ ＴＡＡ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＧ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号２１）である。
【０１５６】
インサートの方向が適切でなければ、増幅されるべき配列と同じ鎖上にプローブがあるため、増幅は起こらない。増幅されたＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのＰＣＲ産物が得られる。
【０１５７】
（ｄ）．目的のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ＫＭ６０Ｃ３ Ｈの製造
【０１５８】
滅菌つまようじを使用し、コロニーを採取した後、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）を含む５ｍＬのＬＢ選択液体培地に加え、３７℃で１６時間インキュベートする。次いで、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。
【０１５９】
１０．人工修飾抗体重鎖ＫＭ ８Ｂ６の発現ベクターの構築：ｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏ ８Ｂ６−Ｈ
【０１６０】
（ａ）．ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ｈｕ−Ｃγ１の獲得
【０１６１】
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化することで、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ＫＭ６０Ｃ３ ＨからベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ｈｕ−Ｃγ１を製造した。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクター（１μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｂａＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。次いで、このベクターを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いで、ベクターをＣＩＰ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ３ １０×緩衝剤（５μＬ）、ベクター（１μｇ）、ＣＩＰ（１μＬ）。
【０１６２】
（ｂ）．８Ｂ６モノクローナル抗体を産生する８Ｂ６ハイブリドーマからの全ＲＮＡの抽出
【０１６３】
ＲＮＡｂｌｅ試薬（ＣｏｕｒｔａｂｏｅｕｆのＥＵＲＯＢＩＯ社、フランス）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、指数増殖期の１０６ ８Ｂ６ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出する。２６０ｎｍでの吸光度を測定して全ＲＮＡ濃度を決定する。
【０１６４】
（ｃ）．８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡの塩基配列の獲得
【０１６５】
８Ｂ６ Ｌ−ＶＨ可変領域をコードするｃＤＮＡをＲＡＣＥ−ＰＣＲによってメッセンジャーＲＮＡから遺伝子増幅し、可変領域（ＶＨ）と組み合わされたシグナルペプチド（Ｌ）をコードする塩基配列を得た。この増幅は、ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社（サンノゼ、カリフォルニア州、米国）から入手したＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットをメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。逆転写に使用した全ＲＮＡ量は１μｇであった。反応産物を、メーカーから入手可能なトリシンＥＤＴＡ緩衝液１００μＬ中に希釈した。体積２．５μＬの希釈産物を遺伝子増幅に使用した。使用した８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプローブは、γ３型マウス抗体の重鎖ｍｕＣ−γ３定常部をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズする３’−ｍｕＣγ３：５’−ｔＧＡ ＴＣＡ ＡＣＴ ＣＡＧ ＴＣＴ ＴＧＣ ＴＧＧ ＣＴＧ ＧＧＴ ＧＧＧ−３’（配列番号２３）。増幅は、反応混合液をＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（ＰＥ）ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（米国マサチューセッツ州のＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＷＥＬＬＥＳＬＥＹ社、マサチューセッツ州、米国）で以下の条件でインキュベートすることで行った：（９４℃５秒、７２℃３分）を５サイクル；その後（９４℃５秒、次いで７０℃１０秒、７２℃３分）を５サイクル；その後（９４℃５秒、次いで６９℃１０秒、その後７２℃３分）を２５サイクル。このＲＡＣＥ−ＰＣＲの反応産物を、泳動用緩衝液にトリスＥＤＴＡ（ｐＨ８；４０ｍＭトリス塩基（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ））、２５ｍＭのＥＤＴＡ（ＩＮＥＲＣＨＩＭ社、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、フランス）、２０ｍＭの酢酸（ＣＡＲＬＯ ＥＲＢＡ ＲＥＡＧＥＮＴＩ ＳＰＡ社、Ｒｏｄａｎｏ、ＭＩ、イタリア）を用い、１％アガロースゲル電気泳動（Ｑ．ＢＩＯＧＥＮＥ社、モーガンアーバイン、カリフォルニア州、米国）で分析する。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、予想される分子量を有する産物を精製する。８Ｂ６ Ｌ−ＶＨ領域をコードするｃＤＮＡ配列を確認するための得られた精製産物の核酸配列の決定は、ＧＥＮＯＭＥ ＥＸＰＲＥＳＳ社（Ｍｅｙｌａｎ、フランス）が行った。８Ｂ６抗体の重鎖可変領域と組み合わされたシグナルペプチドに相当する配列をこうして決定し、８Ｂ６ Ｌ−ＶＨのｃＤＮＡを発現ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ｈｕ−Ｃγ１にクローニングするためのプローブを設計した。
【０１６６】
（ｄ）．８Ｂ６ Ｌ−ＶＨセグメントの遺伝子増幅
【０１６７】
８Ｂ６ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡ抽出物から、ＲＴ−ＰＣＲによって８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを増幅させた。反応混合液は以下の通りである：１μＬのオリゴｄ（Ｔ）１８（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）、１μｇのＲＮＡ、および０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）、これらを滅菌水で１２μＬにする（ｑｓｐ１２μＬ）。この混合液を６５℃（乾燥制御された浴）で５分間、その後４℃（氷水）で２分間インキュベートしてＲＮＡを変性させる。次いでこの反応混合液に、４μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ溶液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０ｍＭのＤＴＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１６０ＵのＲｎａｓｉｎｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、および８００Ｕの逆転写酵素（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を加える。得られた混合液を３７℃で１時間、その後反応を停止させるために７０℃で１５分間インキュベートする。以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ遺伝子増幅によって、８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡのコピーを得る；５’−ＢａｍＨＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＨ：５’−ＣＣＧ ＴＣＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＴＧＧ−３’（センスプローブ、配列番号２４）および３’−ＮｈｅＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＨ：５’−ＣＧＧ ＧＧＴ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＴＧＴ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号２５）。
【０１６８】
使用の合成プローブはＤＮＡ配列にサイレント変異を導入し、この変異は、アミノ酸配列は変化させない一方ベクターへのクローニングに必要なＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限酵素認識部位を導入する。
【０１６９】
反応媒体は以下の組成を有する：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１μＬのｃＤＮＡ（マトリックス）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００Ｍ．Ｍのプローブ３’−ＮｈｅＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＨおよびプローブ５’−ＢａｍＨＩ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＨ。
【０１７０】
この増幅は、ＭＪ−リサーチ社製のＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＰＥＬＴＩＥＲ ＴＨＥＲＭＡＬ ＣＹＣＬＥＲ）を用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。
【０１７１】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動分析で確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを精製する。
【０１７２】
（ｅ）．８Ｂ６ Ｌ−ＶＨＣｄｎａの消化
【０１７３】
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡを消化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡ（１μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＮｈｅＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。消化したインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。
【０１７４】
（ｆ）．ライゲーション反応
【０１７５】
ライゲーションによって、消化および脱リン酸化されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ｈｕ−Ｃγ１中に、消化された８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡが挿入される。この反応をさらに１６℃の水浴中で１６時間、以下の反応媒体中で行う：ライゲーション緩衝液 ５×（４μＬ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、２００ｎｇの消化および脱リン酸化されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ｈｕ−Ｃγ１、Ｔ４リガーゼ（４００Ｕ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、（１ｋｂのインサートについて）１７０ｎｇの精製８Ｂ６ Ｌ−ＶＨｃＤＮＡ。インサート：ベクターのモル比は３：１である。このライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換に使用する。
【０１７６】
（ｇ）．人工修飾抗体重鎖をコードするｃＤＮＡの獲得
【０１７７】
人工修飾抗体重鎖をコードするｃＤＮＡを製造するために、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ＫＭ８Ｂ６ Ｈを制限酵素ＢａｍＩおよびＸｂａＩで消化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクター（１μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｂａＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。遊離したインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。
【０１７８】
（ｈ）．ベクターｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏの消化および消化したベクターの脱リン酸化
【０１７９】
消化は以下の条件で行う：ＮＥＢ２ １０×緩衝剤（５μＬ）、ＢＳＡ １００×（０．５μＬ）、ベクター（１μｇ）、制限酵素ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）、制限酵素ＸｂａＩ（１０Ｕ）。制限酵素、反応緩衝液、およびＢＳＡ溶液の供給元はＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社であった。反応を３７℃の水浴中で３時間続ける。消化したベクターおよびインサートを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて精製する。次いでベクターをＣＩＰ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）を用いて３７℃で１時間脱リン酸化する。反応媒体の組成は以下の通りである：ＮＥＢ３緩衝剤 １０×（５μＬ）、ベクター（１μｇ）、ＣＩＰ（１μＬ）。
【０１８０】
（ｉ）．ライゲーション反応
【０１８１】
ライゲーション反応によって、消化および脱リン酸化されたベクターｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏ中に、人工修飾抗体重鎖をコードするｃＤＮＡが挿入される。反応をさらに１６℃の水浴中で１６時間、以下の反応媒体中で行う：ライゲーション緩衝液 ５×（４μＬ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、２００ｎｇの消化および脱リン酸化されたベクターｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏ、Ｔ４リガーゼ（４００Ｕ）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ Ｉｎｃ．社）、（１ｋｂのインサートについて）１７０ｎｇの人工修飾抗体重鎖をコードする精製ｃＤＮＡ。インサート：ベクターのモル比は３：１である。このライゲーション反応産物を、コンピテント細菌大腸菌ＸＬ１ ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換に使用する。
【０１８２】
（ｊ）．ＰＣＲによる、ベクターｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏ中に人工修飾抗体重鎖をコードするｃＤＮＡの存在の確認
【０１８３】
単離した抵抗性のコロニーを、換気フード内で無菌条件下にて以下のＰＣＲ反応混合液を含むチューブに入れる：５００μＭのｄＮＴＰ（ＰＲＯＭＥＧＡ社）、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１０μＬのＰＣＲ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）、５００μＭのプローブ３’およびプローブ５’。この増幅はＭＪ−リサーチ社のＰＴＣ２００サーマルサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃５分；次いで９４℃３０秒、５５℃４５秒、および７２℃１分を３５サイクル。使用するプローブは、５’−ＢａｍＨＩ ６０Ｃ３ Ｌ−ＶＨ：５’−ＣＣＧ ＴＣＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＴＧＧ−３’（センスプローブ、配列番号２６）および３’−Ｎｈｅｌ ８Ｂ６ Ｌ−ＶＨ：５’−ＣＧＧ ＧＧＴ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＴＧＴ−３’（アンチセンスプローブ、配列番号２７）である。
【０１８４】
増幅されたＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲル電気泳動分析で確認する。適切に形質転換されたクローンでのみ、予想されるサイズのＰＣＲ産物が得られる。
【０１８５】
（ｋ）．目的のプラスミドｐｃＤＮＡ３ ＫＭ８Ｂ６ Ｌの製造
【０１８６】
滅菌つまようじを使用し、コロニーを採取した後、これを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）および１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）を含む５ｍＬのＬＢ選択液体培地に加え、３７℃で１６時間インキュベートする。次いで、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）スピンミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、この細菌希釈液からプラスミドＤＮＡのミニプレップを行う。
【０１８７】
１１．人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体の発現のための、ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
【０１８８】
人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体を発現および分泌させるのための宿主細胞としてＣＨＯ細胞を使用した。この細胞を、ＰｏｌｙＦｅｃｔ（登録商標）キット（ＱＩＡＧＥＮ ＧＭＢＨ社、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、それぞれ人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体の軽鎖（図４）および重鎖（図９）をコードするプラスミドｐＤＮＡ３（登録商標）ＫＭ８Ｂ６−ＬおよびｐＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（著作権）ＫＭ８Ｂ６−Ｈでコトランスフェクションした。形質転換した細胞は、ジェネテシン（登録商標）およびハイグロマイシンＢ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）に対する抵抗性で選択した。抵抗性クローンは、限定希釈法による従来のクローニング技術によって得た。次いでこれらを、ＥＬＩＳＡ免疫酵素アッセイを用いて、ＫＭ８Ｂ６抗体の発現および分泌に基づいて選択した。ＫＭ８Ｂ６抗体を３．８ｎｇ／ｍＬで分泌する、安定なトランスフェクタントクローンを選択した。
【０１８９】
１２．８Ｂ６抗体およびＫＭ８Ｂ６抗体の精製
【０１９０】
ガングリオシドに特異的なマウスモノクローナル抗体を、対応するハイブリドーマ（Ｃｅｒａｔｏ ｅｔ ａｌ、１９９７）の培養液上清から産生した。これらをマウスＩｇＧ３の不可逆的な同種親和性凝集現象（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ、１９９０）を制限する本発明者らが開発した手法に基づいて、プロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＢ社、ウプサラ、スウェーデン）で精製した。カラムを、最初に０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．６）の緩衝剤で平衡化する。１０％の平衡化緩衝剤を含む培養液上清サンプル２Ｌを、流速１ｍＬ／分でカラムに流す。次いで、カラムを１０体積の平衡化緩衝剤で洗浄する。プロテインＡに固定された材料を、酸性緩衝剤（０．１Ｍクエン酸塩、０．３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３）で溶出して画分ごとに回収し、これを回収用チューブに緩衝剤（１Ｍのトリス塩酸、ｐＨ７．６）を予め入れておくことで回収後すぐに中和する。回収画分の吸光度変化を測定することで、この精製の進行をモニターする。次いで、有用な画分をＰＢＳ溶液（０．３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に透析し、０．２２μｍのフィルターで濾過して滅菌する。２８０ｎｍでの吸光度を測定してタンパク質の量を決定し、次いでマウスＩｇＧ３の同種親和性凝集現象を防ぐために、ｍＡｂ濃度を１ｍＬ当たりのＡｃＮが０．９ｍｇ以下の濃度になるように調整する。精製したＡｃＭをそのまま４℃で使用まで保存する。
【０１９１】
プラスミドｐｃＤＮＡ３ ＫＭ８Ｂ６−ＬおよびｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏ ＫＭ８Ｂ６−Ｈで安定にコトランスフェクションされたクローンに由来するＣＨＯ細胞培養液上清から、人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【０１９２】
精製した抗体を、還元変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分析する。１０％のグリセロール（ＶＷＲ社、Ｆｏｎｔｅｎａｙ ｓｏｕｓ Ｂｏｉｓ、フランス）および５％のβ−メルカプトエタノール（ＰＲＯＭＥＧＡ社）を含む０．５Ｍのトリス塩酸（ｐＨ６．８）緩衝液にサンプルを取る。これを５分間煮沸し、次いでＬａｅｍｍｌｉの方法に基づくＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析する。１．５ｍｍ厚のポリアクリルアミドゲル（ＶＷＲ社）（ゲルの上部と下部のポリアクリルアミド濃度はそれぞれ４．５％および１２％）のウェルに３μｇのタンパク質を置く。室温、２００Ｖで４５分間電気泳動した後、ゲルを固定し、クーマシーブルーＲ２５０（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）で染色する。分子量マーカーＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（登録商標）Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）の移動度から分子量を計算する。
【０１９３】
還元変性条件下の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析は、ＬおよびＨキメラ鎖の分子量がそれぞれ２５ｋＤａおよび５０ｋＤａであることを示している。非還元変性条件下の６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析は、ＬおよびＨ鎖が適切に組立てられて抗体分子を産生していること、並びに人工修飾抗体の分子量が約１５０ｋＤａであることを示している。
【０１９４】
１３．ＫＭ８Ｂ６抗体特異性の研究
【０１９５】
（ａ）．生細胞の間接免疫螢光法による
【０１９６】
Ｏ−アセチル化ＧＤ２を発現するＩＭＲ３２細胞およびＯ−アセチル化ＧＤ２を発現しないＮｅｕｒｏ２Ａ細胞について、抗体特異性を調べた。１０６個の細胞を、８Ｂ６またはＫＭ８Ｂ６抗体と共に４℃で３０分間インキュベートする。次いで１％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝剤（ｐＨ７．４）で細胞を２回洗浄し、１％ＰＢＳ−ＢＳＡに１／１００希釈したフルオレセインイソチオシアネート（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ ＥＵＲＯＰＥ ＬＴＤ社、Ｃａｍｂｒｉｄｅｓｈｉｒｅ、英国）で標識したヤギＦ（ａｂ）２抗マウス免疫グロブリン抗体または抗ヒト免疫グロブリン抗体の存在下で再度３０分間インキュベートする。再度ＰＢＳで３回洗浄した後、死細胞および細胞残骸を除去した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｔｏｎ−Ｄｏｃｋｉｎｓｏｎ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州
を用いてＳＳＣ／ＦＬ１−Ｈウィンドウ内で、１００００個の細胞を分析する。二次抗体のみで非特異的に標識されたコントロールを用いてベースを調節した後に１Ｌｏｇを超える蛍光を有する細胞を陽性と呼ぶ。
【０１９７】
得られた結果は、ＫＭ８Ｂ６抗体は、８Ｂ６抗体のように、ＩＭＲ３２細胞のみを認識することを示している。
【０１９８】
（ｂ）．９６ウェルマクロタイタープレート内の乾燥細胞のＥＬＩＳＡ免疫酵素アッセイによる
【０１９９】
Ｏ−アセチル化ＧＤ２を発現するＩＭＲ３２細胞およびＯ−アセチル化ＧＤ２を発現しないＮｅｕｒｏ２Ａ細胞に対する抗体特異性を調べた。腫瘍細胞のインビトロ培養物を、トリプシン処理で培養基質から剥離する。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をＭａｘｉｓｏｒｐ平底マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ Ａ／Ｓ社、ロスキレ、デンマーク）の各ウェルに、１０５個の細胞を含む体積５０μＬのＰＢＳ中を分注する。次いで、プレートを３７℃のオーブンに一晩置いてＰＢＳを蒸発させる。プレートは、直接使用することもできるし、使用まで室温で数ヶ月保存することもできる。分析のために、非特異的部位を飽和させる目的で、プレートを最初に室温で１時間、１％ＢＳＡを含む２００μＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）と一緒に撹拌しながらインキュベートする。次いでプレートを、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液に希釈した抗体溶液１００μＬと一緒に撹拌しながら室温で２時間インキュベートする。２００μＬのＰＢＳ緩衝液でそれぞれ３回洗浄した後、全マウス免疫グロブリンまたは全ヒト免疫グロブリンのいずれかに特異的なビオチン化抗体に由来するＦ（ａｂ’）２溶液（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ ＥＵＲＯＰＥ ＬＴＤ社、Ｃａｍｂｒｉｄｅｓｈｉｒｅ、英国）を０．１％ＰＢＳ−ＢＳＡに１／２５００に希釈した溶液１００μＬを、各ウェルに入れる。室温で撹拌しながら１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、ビオチン化ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ ＥＵＲＯＰＥ ＬＴＤ社、Ｃａｍｂｒｉｄｅｓｈｉｒｅ、英国）の０．１％ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液を１時間反応させ、その後洗浄して除去する。固定された複合体の発達は、１００μＬのＡＢＴＳ基質（ＲＯＣＨＥ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ ＧＭＢＨ社、マンハイム、ドイツ）を添加することで行った。分光光度計（ＭｕｌｔｉｓａｎＥＸ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて異なる時間間隔でプレートのを４０５ｎｍで読み取ることで、吸光度を決定する。
【０２００】
得られた結果は、ＫＭ８Ｂ６抗体は、８Ｂ６抗体のように、ＩＭＲ３２細胞でのみ、用量依存的に固定されることを示している。
【０２０１】
（ｃ）．シリカ薄層上
【０２０２】
ＩＭＲ３２細胞の全ガングリオシド抽出物について分析を行った。Ａｒｉｇａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）に記載されている技術に従って、組織ガングリオシドを抽出する。抽出するサンプルを１０体積のクロロホルム／メタノール（Ｃ：Ｍ）混合物（１：１、ｖ／ｖ）中で粉砕し、室温で一晩機械的に撹拌する。濾過後、残渣を２．５体積の（Ｃ：Ｍ）（１：１、ｖ／ｖ）に取り、さらに６時間撹拌する。次いで、混合物を濾過し、ロータリーエバポレータ上でこれら２つの濾液を減圧下で蒸発させる。次いで、乾燥残渣を酢酸塩の形態のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）を２ｍＬ含むカラムに入れる。１５ｍＬの媒体Ａで中性脂質を除去する。次いで、０．４Ｍの酢酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｃｏ社）を含む１５ｍＬのメタノールでガングリオシドを溶出する。ＭｃＬｕｅｒの方法（１９９０）に従ってＣ１８疎水性ゲルのＳｅｐ−Ｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏ．社、ミルフォード、マサチューセッツ州）を用いて脱塩するために、得られた画分にｐＨ７．４のＰＢＳを３０ｍＬ添加する。Ｃ１８ゲルを、最初に２カラム体積のメタノールで、その後１：２（ｖ／ｖ）メタノール／ＰＢＳ混合物で前処理（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）する。次いで、脱塩する抽出物を流速１ｍＬ／分でカラムに流す。ガングリオシドの炭化水素鎖は、疎水性結合を通してゲルと相互作用するが、塩およびその他の非疎水性分子は２カラム体積の蒸留水で除去される。次いで、１体積のメタノール、続けて１体積の２：１（ｖ／ｖ）クロロホルム／メタノール混合物で、スフィンゴ糖脂質を溶出する。このカラムから溶出されるガングリオシドは、好適な更なる１体積の２：１（ｖ／ｖ）Ｃ／Ｍ混合物に濃縮され、−２０℃で保存される。
【０２０３】
次いで、薄層クロマトグラフィーでガングリオシドを分離する。この方法は、全ガングリオシドのプロフィール決定を可能にする。ＨＰＴＬＣプレートは、アルミホイル上にコーティングされたシリカゲル６０（ＭＥＲＣＫ社）で構成される。スポットしたガングリオシドを、展開溶媒で満たした容器内で、室温で２０分間展開する。この媒体（移動相）は、Ｃ／Ｍ／ＣａＣｌ２混合物の０．２２％水溶液（５０：４５：１０、ｖ／ｖ／ｖ）から構成される。ガングリオシドは、シアル化されているほど極性が強くなり、移動性が最も低くなる。ガングリオシドプレートの検出は、レゾルシノール／ＨＣｌ試薬を用いて化学的に行う（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、１９６３）。この試薬は、ガングリオシドに特徴的なシアル酸とだけ反応する。レゾルシノールで発達した後、全抽出物からガングリオシドの展開に対応する複数の染色バンドが観察される。分離されたガングリオシドの同定は、特異的モノクローナル抗体によって行うか、調べるガングリオシド抽出物と同時に展開するマーカーとして使用される標準ガングリオシドとの比較によって行う。
【０２０４】
シリカ薄層上でガングリオシドを展開した後、プレートをヘキサン中０．０１％のポリ−（イソブチル）−メタクリレート溶液に１分間浸漬し、その後風乾する。これによって、後の段階でゲルが基板からはがれるのを防ぐために、プレートを可塑化することができる。その後、ガングリオシドへの抗体結合の発達を除いて、乾燥細胞を用いたＥＬＩＳＡアッセイ法をモニターする。この発達は、産物１ｍｇをメタノール１ｍＬに溶解し、２０ｍＬのＰＢＳにとり、そこに３０体積の酸素水３０μＬを加えて使用直前に調製した４−クロロ−１−ナフトール溶液（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ ＣＨＥＭＩＥ ＧＭＢＨ社、ＳＴＥＮＨＥＩＭ、ドイツ）を用いて行われる。
【０２０５】
結果は、ＫＭ８Ｂ６抗体は、８Ｂ６抗体のように、ガングリオシド抽出物をアルカリ処置しない場合に、Ｏ−アセチル化ＧＤ２のみを認識することを示している。
【０２０６】
１４．神経系および腫瘍組織におけるＧＤ２ガングリオシドおよびそのＯ−アセチル化型の分布の研究
【０２０７】
腫瘍サンプル（膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、肺癌）を外科切除により得た。ヒト末梢神経のサンプルは、筋皮神経の末端感覚分岐部、腓骨神経の側枝から採取した。これらは、診断に問題を生じさせる前角状態（正常知覚神経）または末梢神経障害を診断するためのサンプルである。体積０．５ｃｍ３以下の組織サンプルを採取し、液体窒素の温度に冷却したイソペンタン中で凍結させる。６０秒後にサンプルを取り出し、予め−７０℃に冷却した凍結管に移す。凍結組織の１０μＭ切片をクリオスタットでカットする。切片をＳｕｏｅｒｆｒｏｓｔ Ｇｏｌｄ＋スライドガラス（ＶＷＲ社）に回収する。切片を３分間風乾し、次いでアセトンで１０分間固定し、再度風乾する。次いで、免疫組織化学的方法で分析するまで、切片を−２０℃で保存する。組織サンプルの免疫染色は、以下の一次マウスｍＡｂを用いて行った：
【０２０８】
ＧＤ２に特異的な一次抗体：
【０２０９】
ＧＤ２に特異的なｍＡｂ １０Ｂ８（ＩｇＧ３、κ）
【０２１０】
ＧＤ２−Ｏ−Ａｃに特異的な８Ｂ６ ｍＡｂ（ＩｇＧ３、κ）
【０２１１】
ネガティブコントロール用の試薬として使用する一次抗体：ＤＮＰに特異的なＭＣＡ２０６３ｍＡｂ（ＩｇＧ３、κ）（Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｆｒａｎｃｅ社、Ｃｅｒｇｙ Ｓａｉｎｔ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ、フランス）
【０２１２】
被験組織サンプルにおけるこれらの抗体の結合の発達は、マウス一次抗体と使用するためのＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋ ＳｙｓｔｅｍのＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ ＨＲＰキット（ＤＡＫＯ社、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）をメーカーの取扱説明書に従って用いて行った。次いで、水性マウント媒体Ａｑｕａｄｅｘ（ＶＷＲ社）と共に、スライドとカバーガラスの間にサンプルをマウントする。次いで、倍率１００倍および４００倍の光学顕微鏡を用いた光学顕微鏡分析によって標識を確認する。各サンプルにつきランダムに選択した３つの顕微鏡フィールドのデジタル顕微鏡写真を分析する。
【０２１３】
様々な患者の全ての腫瘍サンプルで、膜および細胞質は１０Ｂ８抗体および８Ｂ６抗体での標識に陽性であったが、健康細胞はこれらの抗体のいずれでも標識されなかった。ＭＣＡ２０６３抗ＤＮＰ抗体では標識は検出されなかった。
【０２１４】
全ての被験神経サンプルで、有髄線維節間部は１０Ｂ８抗体で標識されたが、軸索および線維芽細胞は標識されていなかった。この標識は、８Ｂ６抗体では全くまたはほとんど検出できなかった。ＭＣＡ２０６３抗体では標識は観察されなかった。
【０２１５】
１５．Ｏ−アセチル化８Ｂ６およびＫＭ８Ｂ６抗ＧＤ２抗体の細胞毒性の研究
【０２１６】
（ａ）．標的細胞懸濁液の調製
【０２１７】
ＲＰＭＩ培地で培養した１×１０６個のＩＭＲ３２ヒト神経芽細胞腫細胞を、１．８５ＭＢｑのＮａ２５ＩＣｒＣ４存在下で３７℃にて１時間インキュベートする。次いで、ＲＰＭＩで細胞を３回洗浄し、遠心後、ＲＰＭＩに再懸濁し、放射性物質の自発的な脱塩を測定するために４℃で３０分間インキュベートする。
【０２１８】
最後の遠心後、細胞を５ｍＬのＲＰＭＩに取り、濃度を２×１０５細胞／ｍＬに調節する。
【０２１９】
（ｂ）．エフェクター細胞の調製
【０２２０】
自発的ドナーから、ヘパリンの入った血液試験管内にヒト血液を採取した。遠心による（１，８００×ｇ、３０分間）Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配で、全血液から末梢血液白血球を分離した。得られた細胞を洗浄するためにＲＰＭＩ中で１５００×ｇで３回遠心して、ＲＰＭＩに再懸濁し、細胞濃度を５×１０６細胞／ｍＬとした。
【０２２１】
（ｃ）．ＡＤＣＣ活性の測定
【０２２２】
Ｆａｌｃｏｎ社から入手したＵ底９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、ａ）で得られた標的細胞懸濁液５０μＬを添加する。次いで、ｂ）で得られたエフェクター細胞懸濁液１００μＬを添加する（すなわち、１ウェル当たり５００００細胞）。標的細胞とエフェクター細胞数の比率は１：５０である。次いで、８Ｂ６抗体、および人工修飾ＫＭ８Ｂ６抗体、およびリツキサン（登録商標）、κＩｇＧｌ、ネガティブコントロールとして使用する抗ＣＤ２０ヒト−マウス抗体を、濃度１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬで各ウェルに添加する。この混合物を３７℃で４時間インキュベートする。遠心後、プレートを遠心し、γカウンターを用いて上清中の５１Ｃｒの量を測定する。同じ手順で、抗体を含まない媒体とエフェクター細胞懸濁液の代わりの５Ｎ水酸化ナトリウム溶液とを加え、遊離した５１Ｃｒの総量を測定する。次いで、以下の式を用いてＡＤＣＣを計算する：
【０２２３】
〔数１〕
％ＡＤＣＣ活性＝（上清中の５１Ｃｒ−自発的に遊離した５１Ｃｒ）／（全５１Ｃｒ−自発的に遊離した５１Ｃｒ）
【０２２４】
１６．マウスリンパ腫の同質遺伝子モデルにおける８Ｂ６抗体の腫瘍活性
【０２２５】
ＧＤ２抗原を発現するマウスＥＬ−４Ｔリンパ腫をマウスＣ５７ＢＬ／６系統に皮下移植した同質遺伝子的なモデル（Ｚｈａｎｇ Ｈ、 Ｚｈａｎｇ Ｓ、 Ｃｈｅｕｎｇ ＮＫ、 Ｒａｇｕｐａｔｈｉ Ｇ、 Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ ＰＯ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＧＤ２ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｃａｎ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｓｙｎｇｅｎｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９８、 ５８： ２８４４−９）における８Ｂ６抗体の抗腫瘍活性を測定した。これらのＥＬ４細胞はＯ−アセチル化ＧＤ２抗原も発現する。Ａ１グレードの承認を受けた動物小屋で飼育した２４頭のマウスに、１２週齢の時点で、ＰＢＳに懸濁した２０×１０４個のＥＬ−４細胞を皮下注射で投与した。マウス１２頭のバッチを２つ構成した。バッチＡのマウスには、７０μｇのｍＡｂ ８Ｂ６を２００μＬのＰＢＳ緩衝液でｉ．ｖ．投与し、これはＥＬ４細胞の注射後１日目から２１日目まで３日間隔で行った。バッチＢのマウスには、同じ手順で２００μＬのＰＢＳ溶液だけを投与した。次いで、腫瘍の体積を２日間隔で測定した。腫瘍体積は以下の式を用いて評価した：体積（ｍｍ３）＝長さ（ｍｍ）×幅２（ｍｍ）×０．５（Ｚｅｎｇ Ｇ、Ｌｉ ＤＤ、Ｇａｏ Ｌ、Ｂｉｒｋｌｅ Ｓ、Ｂｉｅｂｅｒｉｃｈ Ｅ、Ｔｏｋｕｄａ Ａ、Ｙｕ ＲＫ；Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｙ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ＧＤ３−ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９ ３８： ８７６２−９）。体積＞３０００ｍｍ３を示したマウスを屠殺する。
【０２２６】
得られた結果を図１６に示す。ＰＢＳｉ．ｖ．と投与したバッチＢは非処置コントロールバッチに相当する（図１６、プレートＢ）腫瘍は接種１０日後から検出され始め、それに続き指数増殖を示し始める。接種２０日後、２匹を除き全てのマウスの腫瘍が１０００ｍｍ３を超える。腫瘍が３０００ｍｍ３を超えたので、動物実験の規制に従って、３０日目の前に全てのマウスを屠殺した。８Ｂ６抗体で処置したバッチＡのマウス（図１６、プレートＡ）では、腫瘍の発達の遅延が見られる。さらに、この抗体を投与されたマウスでは腫瘍の増殖が遅延する。接種２０日後、処置した全てのマウスで腫瘍は１０００ｍｍ３を超えていない。３０日後、非処置マウスが全て死亡したのに対し、８Ｂ６ ｍＡｂで処置したマウスは５８％が生存している。４０日後、処置したマウスの２５％がまだ生存しており、５０日後では、マウスの８％がまだ生存しており、明白な腫瘍を示さず、治癒したとみなされる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤ２ガングリオシドを認識せず、Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体の、癌の治療のための使用であって、ＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体を治療的投与に使用するときに認められる毒性がなく、前記抗体が、腫瘍細胞が発現するＯ−アセチル化ＧＤ２分子を認識し、末梢神経およびその他の正常神経組織の表面で発現するＧＤ２分子は認識しないものである、使用。
【請求項２】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、Ｏ−アセチル化ＧＤ２に対して１０７リットル／ｍｏｌを超える親和性を有し、ＧＤ２自体に対してその１０分の１より低い親和性を有するκ−ＩｇＧである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、モノクローナル抗体または前記抗体の断片である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、元の抗体の特性を修飾するため、特にその免疫原性を低減するため、またはその毒性活性を増大させるため、または注入後のそのクリアランスを早めるまたは遅らせるため、当業者に公知の遺伝学的技術を用いて数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した前記元の抗体に相当する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、配列番号３、配列番号４および配列番号５で表されるアミノ酸配列を含んでなるＨ鎖可変領域の相補性決定領域を有し、配列番号６、配列番号７および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含んでなるＬ鎖可変領域の相補性決定領域を有する８Ｂ６抗体である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、キメラ抗体またはその断片である、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、ヒト抗体またはその断片である、請求項３に記載の使用。
【請求項８】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、配列番号３、配列番号４および配列番号５で表されるアミノ酸配列を含んでなるＨ鎖可変領域の相補性決定領域を有し、配列番号６、配列番号７および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含んでなるＬ鎖可変領域の相補性決定領域を有するキメラまたはヒト化抗体である、請求項６、７または８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記癌が、神経芽細胞腫、黒色腫、膠芽腫、または小細胞肺癌である、請求項１〜８に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗体またはその断片が、分子Ｘに結合しており、該分子Ｘが、毒性分子、薬剤、プロドラッグ、または特異性に関連しない二次抗体であることを特徴とする、請求項１〜９に記載の使用。
【請求項１１】
前記毒性分子が、毒性の化学分子、生物学的分子、または放射性分子であり、前記分子が、Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する腫瘍細胞を死滅させることを意図したものである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記抗体が、糖の付加でＦｃ領域が変異しており、これによって免疫細胞および補体系分子の活性化を調節する、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識するモノクローナル抗体であって、元の抗体の特性を修飾するため、特にその免疫原性を低減するため、またはその毒性活性を増大させるため、または注入後のそのクリアランスを早めるまたは遅らせるため、当業者に公知の遺伝学的技術を用い、数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した前記元の抗体に相当する、モノクローナル抗体。
【請求項１４】
キメラまたはヒト化された、ＧＤ２ガングリオシドを認識せずＯ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドを認識するモノクローナル抗体またはその断片であって、Ｈ鎖可変領域の相補性決定領域が、配列番号３、配列番号４、および配列番号５で表されるアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖可変領域の相補性決定領域が、配列番号６、配列番号７および配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１５】
キメラまたはヒト化された、配列番号１で表される推定アミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有し、配列番号２で表される推定アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項１４に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１６】
ＣＨＯ細胞株を用いて得られる、請求項１３、１４、または１５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１７】
前記抗体またはその断片が、分子Ｘに結合しており、前記分子Ｘが、毒性分子、薬剤、プロドラッグ、または特異性に関係しない二次抗体である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の抗体に由来する医薬分子。
【請求項１８】
前記毒性分子が、毒性の化学分子、生物学的分子、または放射性分子であり、前記分子が、Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する腫瘍細胞を死滅させることを意図したものである、請求項１７に記載の医薬分子。
【請求項１９】
前記治療分子が、糖の付加でＦｃ領域が変異しており、これによって免疫細胞および補体系分子の活性化を調節する、請求項１７〜１８に記載の医薬分子。
【請求項２０】
腫瘍細胞の表面にＯ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する癌を診断するための分子であって、前記分子が請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の抗体またはその断片に由来し、前記抗体または前記断片が、蛍光または放射活性により前記抗体を検出するための薬剤に結合している、分子。
【請求項２１】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の抗体をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２２】
プロモーターに機能的に連結された、請求項２１のＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２の発現ベクターを含んでなる細胞。
【請求項２４】
前記細胞が動物細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の抗体を産生する、非ヒト形質転換体。
【請求項２６】
Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドに対する抗体の製造方法であって、
好適な条件下で、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の細胞または非ヒト形質転換体中で請求項２１に記載のＤＮＡ配列を発現させ、前記抗体を回収することを含んでなる、方法。
【請求項２７】
請求項２３〜２５のいずれかに記載の細胞または非ヒト形質転換体が、抗体の蓄積する条件下で培養される、請求項２６に記載の方法。
【請求項１】
ＧＤ２ガングリオシドを認識せず、Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体の、癌の治療のための使用であって、ＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体を治療的投与に使用するときに認められる毒性がなく、前記抗体が、腫瘍細胞が発現するＯ−アセチル化ＧＤ２分子を認識し、末梢神経およびその他の正常神経組織の表面で発現するＧＤ２分子は認識しないものである、使用。
【請求項２】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、Ｏ−アセチル化ＧＤ２に対して１０７リットル／ｍｏｌを超える親和性を有し、ＧＤ２自体に対してその１０分の１より低い親和性を有するκ−ＩｇＧである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、モノクローナル抗体または前記抗体の断片である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、元の抗体の特性を修飾するため、特にその免疫原性を低減するため、またはその毒性活性を増大させるため、または注入後のそのクリアランスを早めるまたは遅らせるため、当業者に公知の遺伝学的技術を用いて数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した前記元の抗体に相当する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、配列番号３、配列番号４および配列番号５で表されるアミノ酸配列を含んでなるＨ鎖可変領域の相補性決定領域を有し、配列番号６、配列番号７および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含んでなるＬ鎖可変領域の相補性決定領域を有する８Ｂ６抗体である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、キメラ抗体またはその断片である、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、ヒト抗体またはその断片である、請求項３に記載の使用。
【請求項８】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識する前記抗体が、配列番号３、配列番号４および配列番号５で表されるアミノ酸配列を含んでなるＨ鎖可変領域の相補性決定領域を有し、配列番号６、配列番号７および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含んでなるＬ鎖可変領域の相補性決定領域を有するキメラまたはヒト化抗体である、請求項６、７または８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記癌が、神経芽細胞腫、黒色腫、膠芽腫、または小細胞肺癌である、請求項１〜８に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗体またはその断片が、分子Ｘに結合しており、該分子Ｘが、毒性分子、薬剤、プロドラッグ、または特異性に関連しない二次抗体であることを特徴とする、請求項１〜９に記載の使用。
【請求項１１】
前記毒性分子が、毒性の化学分子、生物学的分子、または放射性分子であり、前記分子が、Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する腫瘍細胞を死滅させることを意図したものである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記抗体が、糖の付加でＦｃ領域が変異しており、これによって免疫細胞および補体系分子の活性化を調節する、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
Ｏ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドのみを認識するモノクローナル抗体であって、元の抗体の特性を修飾するため、特にその免疫原性を低減するため、またはその毒性活性を増大させるため、または注入後のそのクリアランスを早めるまたは遅らせるため、当業者に公知の遺伝学的技術を用い、数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した前記元の抗体に相当する、モノクローナル抗体。
【請求項１４】
キメラまたはヒト化された、ＧＤ２ガングリオシドを認識せずＯ−アセチル化型のＧＤ２ガングリオシドを認識するモノクローナル抗体またはその断片であって、Ｈ鎖可変領域の相補性決定領域が、配列番号３、配列番号４、および配列番号５で表されるアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖可変領域の相補性決定領域が、配列番号６、配列番号７および配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１５】
キメラまたはヒト化された、配列番号１で表される推定アミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有し、配列番号２で表される推定アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、請求項１４に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１６】
ＣＨＯ細胞株を用いて得られる、請求項１３、１４、または１５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１７】
前記抗体またはその断片が、分子Ｘに結合しており、前記分子Ｘが、毒性分子、薬剤、プロドラッグ、または特異性に関係しない二次抗体である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の抗体に由来する医薬分子。
【請求項１８】
前記毒性分子が、毒性の化学分子、生物学的分子、または放射性分子であり、前記分子が、Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する腫瘍細胞を死滅させることを意図したものである、請求項１７に記載の医薬分子。
【請求項１９】
前記治療分子が、糖の付加でＦｃ領域が変異しており、これによって免疫細胞および補体系分子の活性化を調節する、請求項１７〜１８に記載の医薬分子。
【請求項２０】
腫瘍細胞の表面にＯ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する癌を診断するための分子であって、前記分子が請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の抗体またはその断片に由来し、前記抗体または前記断片が、蛍光または放射活性により前記抗体を検出するための薬剤に結合している、分子。
【請求項２１】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の抗体をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２２】
プロモーターに機能的に連結された、請求項２１のＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２の発現ベクターを含んでなる細胞。
【請求項２４】
前記細胞が動物細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の抗体を産生する、非ヒト形質転換体。
【請求項２６】
Ｏ−アセチル化ＧＤ２ガングリオシドに対する抗体の製造方法であって、
好適な条件下で、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の細胞または非ヒト形質転換体中で請求項２１に記載のＤＮＡ配列を発現させ、前記抗体を回収することを含んでなる、方法。
【請求項２７】
請求項２３〜２５のいずれかに記載の細胞または非ヒト形質転換体が、抗体の蓄積する条件下で培養される、請求項２６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
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【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１０−５０５９０９（Ｐ２０１０−５０５９０９Ａ）
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３１８３３（Ｐ２００９−５３１８３３）
【出願日】平成１９年１０月１０日（２００７．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０７５０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４３７７７
【国際公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【出願人】（５０５０２８２２２）ユニベルシテ ドゥ ナント (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１０日（２００７．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０７５０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４３７７７
【国際公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【出願人】（５０５０２８２２２）ユニベルシテ ドゥ ナント (3)
【Ｆターム（参考）】
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