癌処置
死抵抗性癌細胞を特徴とする癌を処置するための方法および組成物が記述される。一般に、こうした方法は、癌細胞の数種、および好ましくは大部分若しくは全部で細胞分裂異常を誘導する化合物の治療上有効な量の投与を必要とする。こうした処置の有効性の評価方法もまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概括的には、癌、とりわけ薬物誘発性アポトーシスに抵抗性の癌の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．はじめに。
本出願は、以下の米国仮出願、すなわち“Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ（癌処置）“と題されかつ２００４年１１月５日出願の第６０／６２５，１９３号；および“Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ（癌処置）”と題されかつ２００５年３月１０日出願の第６０／６６０，２６６号のそれぞれの利益およびそれらに対する優先権を主張する。これらの出願のそれぞれは、図、表および請求の範囲を包含するそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０００３】
以下の記述は本発明の理解において有用でありうる情報を包含する。それは、いかなるこうした情報も本特許請求される発明に対する従来技術であるか若しくはそれに関すること、または、明示的若しくは黙示的に参照されるいかなる刊行物も従来技術であることの承認ではない。
【０００４】
２．背景。
癌は現在米国で第二位の死因であり、そして米国の８百万を超える人が癌と診断されている。１９９５年には、癌は米国の全死亡の２３．３％を占めた。非特許文献１を参照されたい。
【０００５】
癌は分子レベルで完全に理解されてはいない。ある種のウイルス、ある種の化学物質若しくは放射のような発癌物質への細胞の曝露が、「抑制」遺伝子を不活性化若しくは「癌遺伝子」を活性化するＤＮＡ変化につながることが既知である。抑制遺伝子は増殖調節遺伝子であり、突然変異に際してもはや細胞増殖を制御し得ない。癌遺伝子は当初は正常遺伝子（癌原遺伝子と呼ばれる）であり、突然変異若しくは変えられた発現情況によりトランスフォーミング遺伝子となる。トランスフォーミング遺伝子の産物は不適切な細胞増殖を引き起こす。２０種以上の異なる正常な細胞遺伝子が、遺伝子変化により癌遺伝子になり得る。形質転換された細胞は、細胞形態学、細胞と細胞の相互作用、膜内容物、細胞骨格構造、タンパク質分泌、遺伝子発現および死亡率を包含する多くの方法で正常細胞と異なる（形質転換された細胞は無制限に増殖し得る）。
【０００６】
新生物すなわち腫瘍は細胞成長（ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ）の異常な調節されないかつ無秩序の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）であり、そして一般に癌と称される。新生物は、それが破壊的増殖、侵襲性および転移性の特性を有する場合に悪性すなわち癌性である。侵襲性は、典型的に組織の境界を規定する基底層を突き破りそれによりしばしば身体の循環系に進入する、浸潤すなわち周囲組織の破壊による新生物の局所拡延を指す。転移は、典型的には、リンパ若しくは血管による腫瘍細胞の播種を指す。転移はまた、漿膜腔またはクモ膜下若しくは他の空隙を通る直接拡張による腫瘍細胞の移動も指す。転移の過程により、身体の他領域への腫瘍細胞移動は最初の出現の部位から離れた領域に新生物を確立する。
【０００７】
癌は今や、主として３種の型の治療法すなわち外科手術；放射線；および化学療法の１種若しくは組合せで処置される。外科手術は病的組織の大量除去を伴う。外科手術はある部位、例えば乳房、結腸および皮膚に位置する腫瘍の除去においてときに有効である一方
、それは脊柱のような他領域に位置する腫瘍の処置でも、白血病のような播種性腫瘍状態の処置にも使用し得ない。放射線治療は、曝露された細胞に対する死若しくは損傷を引き起こすイオン化放射への生存組織の曝露を伴う。放射線治療からの副作用は急性かつ一時的でありうる一方、他者は不可逆的でありうる。化学療法は細胞複製若しくは細胞代謝の破壊を伴う。それは最もしばしば乳房、肺および精巣癌の処置で使用される。
【０００８】
腫瘍性疾患の処置で使用される全身性化学療法の副作用は、癌の処置を受ける患者により最も恐れられる。これらの副作用のうち、吐き気および嘔吐が最も一般的である。他の有害な副作用は、骨髄レスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）若しくは放射線治療を伴う高用量の化学療法を受領する患者における血球減少、感染症、悪液質、粘膜炎；脱毛症（脱毛）；掻痒症、蕁麻疹および血管浮腫のような皮膚合併症；神経学的合併症；肺および心の合併症；ならびに生殖器および内分泌の合併症を包含する。化学療法誘発性の副作用は患者の生活の質に重大な影響を与え、そして処置への患者コンプライアンスに劇的に影響しうる。であるから、改良された処置方法が必要とされる。
【０００９】
３．定義。
「アルキル化剤」は、ＤＮＡを化学的に修飾しかつその機能を破壊する化学療法化合物を指す。数種のアルキル化剤は、二本鎖ＤＮＡ分子の同一鎖若しくは相補鎖上のヌクレオチド間の架橋の形成を引き起こす一方、なお他者はＤＮＡ鎖間の塩基対不適正を引き起こす。例示的アルキル化剤は、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパおよびトリエチレンメラミンを包含する。
【００１０】
「代謝拮抗剤」は、ＤＮＡを合成するのに必要とされる、ＤＮＡ合成に必要とされるもの（例えばヌクレオシドおよびヌクレオチド）を包含する生体分子の合成を妨害する化学療法剤を指す。代謝拮抗剤の例は、カペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（およびその活性化型ａｒａ−ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、ダカバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサートおよび６−チオグアニンを包含する。
【００１１】
「抗分裂剤」は、典型的には微小管形成の破壊により有糸分裂を妨害する化学療法剤を指す。抗有糸分裂化合物の例は、ナベルビン、パクリタキセル、タキソテール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを包含する。
【００１２】
本発明の情況において、「化学療法剤」は悪性細胞および組織を破壊することを意図している化学物質を指す。化学療法剤は、癌若しくは他の悪性病変を予防若しくは処置するために患者に投与される場合に抗腫瘍効果を有する小分子、核酸（例えばアンチセンス分子、リボザイム、小分子干渉ＲＮＡ分子など）ならびにタンパク質（例えば抗体、抗体フラグメント、サイトカイン、酵素およびペプチドホルモン）を包含する。化学療法剤は、しばしば作用機序に基づき分類に分割される（例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤および抗分裂剤）。
【００１３】
「併用療法」という用語は、示される治療効果を達成するために最低２種の別個の療法の規定を伴う治療レジメンを指す。例えば、併用療法は２種若しくはそれ以上の化学的に別個の有効成分、例えば速効性の化学療法剤および骨髄保護剤の投与を伴いうる。あるいは、併用療法は、１種若しくはそれ以上の化学療法剤の投与、ならびに放射線治療および
／あるいは外科手術または患者の生活の質を向上させるか若しくは癌を処置するかのいずれかのための他の技術を伴いうる。２種若しくはそれ以上の化学的に別個の有効成分の投与の情況において、有効成分を同一組成物の一部として若しくは異なる組成物として投与しうることが理解される。別個の組成物として投与される場合、異なる有効成分を含んでなる組成物は、同一若しくは異なる時点で、同一若しくは異なる経路により、同一若しくは異なる投薬レジメンを使用して、全部特定の情況が必要とするとおりかつ主治医により決定されるとおり投与しうる。同様に、１種若しくはそれ以上の化学療法剤が例えば放射線および／若しくは外科手術と組合せられる場合、該薬物（１種若しくは複数）は外科手術若しくは放射線治療の前若しくは後に送達しうる。
【００１４】
「挿入剤」は、二本鎖ＤＮＡ分子の隣接塩基対間にそれ自身を挿入してＤＮＡ構造を破壊しかつＤＮＡ複製、遺伝子転写および／若しくはＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡへの結合を妨害する化学療法剤を指す。
【００１５】
「単剤療法」は、単一用量として投与されるにしろ若しくは長時間にわたり数個の用量で投与されるにしろ、１種の治療上有効な化合物の送達に基づく処置レジメンを指す。
【００１６】
医薬品の商品化の情況において、「販促」、「販促する」、「販促すること」などの用語は、特定の製薬学的化合物、組成物若しくは処置レジメンの処方、供給、購入および／若しくは使用を誘導することを直接若しくは間接的に意図している、該化合物、組成物若しくは処置レジメンの発見、研究、開発および／若しくは商品化に関与する製造元、供給元若しくは他の実体により若しくはその代わりに実施されるいかなるおよび全部の情報、説得および学術的活動を指す。こうした活動は、限定されるものでないが医学専門家（例えば医師および看護師）、薬剤師、医療管理者、保険会社若しくは政府の代表者ならびに患者（潜在的患者を包含する）を挙げることができる、供給および配布の連鎖にある何人にも向けられうる。言い換えれば、販促の主目的は、特定の製薬学的化合物、組成物若しくは処置レジメンの販売若しくは使用、および／またはそれにおける利益を刺激することであり、そして、従って、この目的にかなうことを意図しているいかなる活動も、該特定の製薬学的化合物、組成物若しくは処置レジメンの「販促」を構成する。
【００１７】
本発明の「特許可能な」組成物、方法、機械若しくは製品は、該分析が実施される時点で特許可能性に対する全部の法定の要件を主題が満たすことを意味している。例えば、新規性、非自明性などに関して、１個若しくはそれ以上の請求項が新規性、非自明性などを無効にするとみられる１個若しくはそれ以上の態様を包含することを後の調査が示す場合、「特許可能な」態様への明確な限定により制限される該請求項（１個若しくは複数）は、特許不可能な態様（１個若しくは複数）を特別に排除する。また、それに付随する請求項は、最も広範な合理的な範囲を提供しならびにそれらの妥当性を保存するの双方のように解釈されるべきである。さらに、特許性に対する法定の要件の１個若しくはそれ以上が改正される場合、または、特許性に対する特定の法定の要件が、本出願が出願されるか若しくは特許として発行される時点から、付随する請求の範囲の１個若しくはそれ以上の妥当性が疑問視される時点まで満足されているかどうかを評価するため標準が変わる場合、請求の範囲は、（１）それらの妥当性を保存しかつ（２）該環境下で最も広範な合理的な解釈を提供する方法で解釈されるべきである。
【００１８】
「製薬学的に許容できる塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性および特性を保持しかつ生物学的に若しくは別の方法で望ましくなくない塩を指す。多くの場合、本発明の化合物は、アミノおよび／若しくはカルボキシル基またはそれに類似の基の存在によって酸および／若しくは塩基塩を形成することが可能である。製薬学的に許容できる酸付加塩は無機および有機酸から製造しうる一方、製薬学的に許容できる塩基付加塩は無機および有機塩基から製造し得る。製薬学的に許容できる塩の総説については、非特許文
献２を参照されたい。「非毒性の製薬学的に許容できる塩」という表現は、非毒性の製薬学的に許容できる無機若しくは有機酸または無機若しくは有機塩基と形成される非毒性の塩を指す。例えば、塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などのような無機酸由来のもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、フマル酸、メタンスルホン酸およびトルエンスルホン酸などのような有機酸から製造される塩を包含する。塩はまたアンモニア、ヒドロキシエチルアミンおよびヒドラジンのような無機塩基からのものも包含する。適する有機塩基は、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルチルアミン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、ヒドロキシエチルアミン、モルホリン、ピペラジンおよびグアニジンを包含する。
【００１９】
「複数の」は１以上を意味している。
【００２０】
「リツキシマブ難治性」という用語は、リツキシマブでの、しかし医師若しくは処置する専門家により決定されるところの単剤として若しくは組合せでのいずれかで与えられるリツキシマブ治療に難治性の疾患（リツキシマブ処置完了６か月以内に応答なし若しくは進行と定義される）、および／またはさらなる処置を保証されないようにする前のリツキシマブ治療に対する予期しない反応によりさらなる処置に不適切な、前の処置を意味している。
【００２１】
「抗ＣＤ２０難治性」という用語は、ＣＤ２０抗原と相互作用する剤での、しかし医師若しくは処置する専門家により決定されるところの単剤として若しくは組合せでのいずれかで与えられる抗ＣＤ２０剤に難治性の疾患（抗ＣＤ２０剤処置完了６か月以内に応答なし若しくは進行と定義される）、および／若しくはさらなる処置を保証されないようにする前の抗ＣＤ２０治療に対する予期しない反応によりさらなる処置に不適切な、前の処置を意味している。
【００２２】
細胞周期の「Ｓ期」は染色体が複製される期を指す。
【００２３】
「種」という用語は多様な文脈で本明細書で使用される（例えば化学療法剤の特定の１種）。各情況において、該用語は、該特定の情況で言及される種類の化学的に不明瞭な分子の一集団を指す。
【００２４】
「被験体」若しくは「患者」という用語は、本発明の分子により遂げられ得る処置の必要な動物を指す。本発明により処置し得る動物は脊椎動物を包含し、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタならびに霊長類（ヒトおよびヒト以外の霊長類を包含する）動物のような哺乳類がとりわけ好ましい例である。
【００２５】
「治療上有効な量」は、こうした処置の必要な被験体に投与される場合に処置を遂げるのに十分な有効成分の量を指す。癌治療の情況において、「治療上有効な量」は、特定の癌と相互に関連づけられる１種若しくはそれ以上の遺伝子の発現の増大若しくは減少、腫瘍量の減少、癌細胞溶解、生物学的サンプル（例えば生検、および全血、血漿、血清、尿などのような体液のアリコート）中の１種若しくはそれ以上の癌細胞死マーカーの検出、誘導アポトーシス若しくは他の細胞死経路の誘導などを包含する、癌細胞の生存若しくは代謝と関連する１種若しくはそれ以上のパラメータの客観的に測定される変化を生じるものである。もちろん、治療上有効な量は、処置されている特定の被験体および状態、被験体の重量および齢、疾患状態の重症度、選ばれる特定の化合物、従われるべき投薬レジメン、投与のタイミング、投与様式などに依存して変動することができ、それらの全部は当
業者により容易に決定され得る。併用療法の情況において、特定の１有効成分の治療上有効な量を構成するものは、単剤療法（すなわち有効成分として１種のみの化学的実体を使用する治療レジメン）として投与される場合の該有効成分の治療上有効な量を構成するものと異なりうることが認識されるであろう。
【００２６】
「処置」若しくは「処置すること」という用語は、疾患若しくは障害に対し予防若しくは保護すること（すなわち臨床症状を発生させないこと）；疾患若しくは障害を阻害すること（すなわち臨床症状の発症を停止若しくは抑制すること）；および／または疾患若しくは障害を緩和すること（すなわち臨床症状の退縮を引き起こすこと）を包含する、疾患若しくは障害のいかなる処置も意味している。認識されるであろうとおり、究極の誘導事象（１種若しくは複数）は未知のことも若しくは潜在的なこともあるため、疾患若しくは障害を「予防すること」と「抑制すること」を識別することは常に可能なわけではない。従って、「予防」という用語は、「予防すること」および「抑制すること」双方を包含するある型の「処置」を構成することが理解されるであろう。「保護」という用語は従って「予防」を包含する。
【非特許文献１】Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｕｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ｈｅａｌｔｈ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ １９９６−１９９７ ａｎｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｃｈａｒｔｂｏｏｋ １１７（１９９７）
【非特許文献２】Ｂｅｒｇｅら（（１９９７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、ｖｏｌ．６６、１）
【発明の開示】
【００２７】
［発明の要約］
本発明の一目的は、単独または他の化合物および／若しくは処置とともに癌細胞で細胞分裂異常を誘発する化合物（例えばベンダムスチン）の投与による、死抵抗性癌細胞（ｄｅａｔｈ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ）を特徴とする癌の特許可能な処置方法を提供することである。好ましい態様において、これらの方法は、患者が死抵抗性癌細胞を特徴とする癌を有するかどうかを決定すること、およびその場合にその後該患者に治療上有効な量のベンダムスチンを投与することを伴う。本発明のなお別の目的は、癌治療の投与の間若しくは後の１若しくはそれ以上の期間に患者から採取した生物学的サンプル中の癌細胞死マーカーの検出に基づく癌処置の有効性の評価方法に関する。
【００２８】
従って、本発明の一局面は、その癌が、死抵抗性癌細胞、すなわちアポトーシス若しくは他のプログラムされた細胞死経路に抵抗する癌細胞、ならびに例えば単独の若しくは抗ＣＤ２０剤、例えばリツキシマブとともにの１種若しくはそれ以上のアルキル化剤の投与により誘発されうるところの多剤耐性（ＭＤＲ）を表す細胞を特徴とする癌患者の特許可能な処置方法に関する。これらの方法は、死抵抗性癌細胞で細胞分裂異常を誘導する治療上有効な量の化合物を患者に投与することを含んでなる。こうした細胞は薬物誘発性アポトーシスに抵抗性であるものを包含する。こうした細胞の例は、典型的にはｐ５３をコードする遺伝子中の若しくはその欠失を包含するその突然変異の結果としてｐ５３欠損を有するものを包含する。こうした癌の代表例は、非ホジキンリンパ腫（「ＮＨＬ」）および慢性リンパ球性白血病（「ＣＬＬ」）を包含する。細胞分裂異常を誘導するためのとりわけ好ましい一化合物はアルキル化剤ベンダムスチンである。従って、関連する一局面は、特定の癌の細胞の死抵抗性癌細胞としての特徴付け、次いで、単独で若しくは他の化学療法剤、佐剤、外科手術および／若しくは放射線とともにのこうした細胞で細胞分裂異常を誘導する化合物（例えばベンダムスチン）での処置を伴う処置方法に関する。加えて、こうした処置レジメンの有効性をモニターして、該特定の単剤療法若しくは併用療法処置が所望の効果を達成しているかどうかを評価し得る。
【００２９】
本発明の別の局面は、癌、とりわけ死抵抗性癌細胞を特徴とする癌のある種の関連する特許可能な処置方法に関する。これらの方法は、癌を含んでなる細胞の少なくとも一部分が細胞周期のＳ期にある時点での治療上有効な量の化合物の患者への投与を含んでなる。いくつかの態様において、患者の癌細胞の少なくとも一部分が、Ｓ期に細胞を駆動する化合物を患者に投与することの結果としてＳ期に駆動される。ベンダムスチンは癌細胞をＳ期に駆動するためのとりわけ好ましい化合物である。ベンダムスチンは癌細胞をＳ期に駆動することにおいて有用であるため、付加的な好ましい態様は、より活性である（すなわち、細胞が細胞周期のＳ期にある場合により大きな治療効果、例えば細胞傷害性を発揮する）１種若しくはそれ以上の他の化学療法剤種のその後の投与を伴う。こうした方法において、１種若しくはそれ以上の化学療法剤のその後の投与は、好ましくはベンダムスチン投与後最低約１０分、および好ましくは最低約３０ないし約６０分若しくはそれ以上に起こるとは言え、こうした他の剤（１種若しくは複数）の投与はベンダムスチンが投与された後約７２時間、好ましくは約４８時間若しくはそれ未満以内に起こることが好ましい。これらの好ましい態様のいくつかにおいて、他の化学療法剤（１種若しくは複数）は、ベンダムスチンの投与後約３０分ないし約３６時間以内、好ましくはベンダムスチンの投与後約３０分ないし２４時間以内、およびいくつかの場合にはベンダムスチンの投与後約３０分ないし６ないし約１２時間以内に与えられる。関連する方法は癌治療に伴う毒性を低下させることを伴う。こうした方法は、癌患者に治療上有効な量のベンダムスチンの複数の用量を投与することを含んでなる。第一の用量はおそらく望ましくない毒性をもたらすであろう。こうした場合に、第二のもの（若しくは他のその後の用量）の投与を、該望ましくない毒性が弱まり始めた後まで遅らせうる。いくつかの場合には、異なる時点で投与されるベンダムスチンの用量もまた変動しうる。
【００３０】
本発明のなお別の局面は、従って、それが単剤療法であろうと若しくは併用療法であろうと、処置の経過中若しくはその完了後のいずれかのアルキル化剤（例えばベンダムスチン）の投与に基づく癌処置の有効性の特許可能な評価方法に関する。１種のアルキル化剤（例えばベンダムスチン）の投与を伴う治療レジメンの投与後に該評価を実施する場合、好ましくは、アルキル化剤がその意図される若しくは所望の治療効果を発揮し得るように十分な期間を経過させる。こうした方法において、処置の有効性と相関する癌細胞死のマーカー（すなわち、死につつある若しくは死んだ癌細胞により産生若しくはそれらにより放出される分子（例えばタンパク質、炭水化物、脂質、核酸若しくは他の分子）、ならびに細胞生存能力の欠如、増殖することの不能、老化などのような表現型）を、患者から得た生物学的サンプル中で検出して、での処置が有効であったかどうかを決定する。細胞死の好ましいマーカーは、アデニル酸キナーゼ活性レベル、ＰＡＲＰ切断生成物のレベルおよび低下された細胞生存率を包含する。マーカーに依存して、こうした検出は定性的、半定量的若しくは定量的でありうる。検出されるマーカーの存在若しくはレベルは、該処置が有効であるかもしくはあったかどうかを示す。
【００３１】
本発明のなお別の局面において、本発明は、１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤（例えばリツキシマブ）に抵抗性すなわち難治性の癌を有する患者にベンダムスチンを投与することに基づく癌の処置に関する。好ましくは、これらの方法は死抵抗性癌細胞を特徴とする癌に対し配備される。本発明の関連する一局面は、難治性癌すなわち死抵抗性癌細胞を特徴とする癌、とりわけ１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤、例えばリツキシマブの組合せでの処置に難治性の癌を処置するためのベンダムスチン使用を販促することを伴う、こうした癌の処置における事業の実施方法に関する。なお別の局面は、患者の癌がベンダムスチン処置の影響を受けやすいかどうかに関する。認識されるであろうとおり、ベンダムスチン感受性のいかなる適する評価も使用し得る。これらの方法のいくつかの好ましい態様において、患者から採取した癌組織からの細胞サンプルの若干若しくは全部を、癌細胞に対し毒性である化合物の非存在下で該癌細胞を増殖させる増殖条件下でベンダムスチンに曝露する。感受性の評価をその後、該アッ
セイの結果に基づき行う。例えば、対照と比較しての低下された増殖は、該細胞およびこれゆえに該患者の癌がベンダムスチンに基づく治療に感受性であることを示すとみられる。対照的に、に対する影響なし（若しくは高められた増殖）は感受性の欠如を示すとみられる。
【００３２】
本発明のなお別の局面は、死抵抗性癌細胞を特徴とする癌の処置、すなわち難治性の癌、とりわけ１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤、例えばリツキシマブの組合せでの処置に難治性の癌の処置のための医薬品の製造におけるベンダムスチンの使用に関する。好ましくは、こうした医薬品は治療上有効な量のベンダムスチンを包含する。
【００３３】
［図面の簡単な説明］
本特許出願はカラーで作成された最低１個の図を含有する。カラー図面（１個若しくは複数）を伴う本特許出願の複写は要求および必要な料金の支払いに際して提供されることができる。
【００３４】
図１は、遺伝子発現プロファイルをそれぞれ示す２図ＡおよびＢを有する。該図は１２，０００種以上の既知遺伝子を含有するＡｆｆｙｍｅｔｉｘ遺伝子チップ（Ｕ１３３Ａ）を使用して非ホジキンリンパ腫細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−１で測定した遺伝子発現の変化を示す。ベンダムスチンはＩＣ５０（２５μＭ；レーン１）およびＩＣ９０（３５μＭ；レーン２）で試験した。クロラムブシル（５μＭ；レーン３）およびホスホルアミドマスタード（シクロホスファミド代謝物、５０μＭ；レーン４）はＩＣ９０で試験した。ｍＲＮＡの単離は曝露後８時間に実施した。Ａ．示されるクラスター図は対照（希釈剤、ＤＭＳＯ）に比較しての上位１００種の最も調節される遺伝子を表す。赤色は上方調節された遺伝子を表し；青色は下方制御された遺伝子を表す。Ｂ．該クラスター図は全３種の試験した薬物により同時に誘導される遺伝子を表す。
図２は、３個の棒グラフ２Ａ、２Ｂおよび２Ｃを有する。Ｑ−ＰＣＲ分析を、等毒性濃度のベンダムスチン、ホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシルに曝露したＳＵ−ＤＨＬ−１細胞で、下の方法の節に記述されるとおり実施した。入力ｃＤＮＡのレベルは１８ｓ ＲＮＡについてのアッセイを使用して正規化し、そして未処理サンプル中の転写物のレベルを１に設定した。図２Ａは、２種の代表的なｐ５３依存性遺伝子ｐ２１およびＮＯＸＡの相対的ＲＮＡレベルを示す。図２ＢはＭ期の細胞周期チェックポイントに関与する４種の遺伝子、すなわちｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）、ａｕｒｏｒａキナーゼＡおよびＢ、ならびにサイクリンＢ１のＲＮＡレベルを示す。図２ＣはＤＮＡ修復機構に関与する遺伝子ＥＸＯ１およびＦｅｎ１の相対的ＲＮＡレベルを示す。柱（ｃｏｌｕｍｎ）はＤＭＳＯ処理対照からの変化の倍数の平均±ＳＥを表す。結果は３回の独立した実験から得た。
図３は、ＮＨＬ細胞（ＳＵ−ＤＨＬ−１）でのシクロホスファミド（５０μＭ）およびクロラムブシル（４μＭ）に比較してのベンダムスチン（５０μＭ）のその高められたアポトーシス効果を示す数種のイムノブロットを示す。これらのイムノブロットを生成するため、細胞ライセートを、下の実験の節に記述されるとおり２０時間の曝露後に調製した。β−アクチンでのメンブレンのプロービングが負荷対照としてはたらき、そして調節されたタンパク質の下に示される。左上図は、リン酸化型特異的抗体を使用して検出された、Ｓｅｒ１５がリン酸化されたｐ５３の発現を表す。左中図は全ｐ５３およびｐ２１発現を示す。左下図はＢａｘの発現を表す。右図は、特異的カスパーゼ切断部位を認識する抗体を使用しての完全長ＰＡＲＰ（上）およびＰＡＰＰのカスパーゼ切断フラグメントの発現を示す。
図４は、選択されたＤＮＡ修復機構の機能分析を表す２グラフＡおよびＢよりなる。図４Ａは、ベンダムスチンが塩基除去修復（ＢＥＲ）を介するＤＮＡ損傷修復に至るがしかしシクロホスファミドは至らないことを示す。修復酵素Ａｐｅ−１（ベンダムスチンの細胞傷害活性においてＢＥＲ経路で決定的な役割を演じているプリン塩基のないエンドヌクレアーゼ）、およびシクロホスファミド代謝物ホスホルアミドマスタード（ＰＭ）の役割を、Ａｐｅ−１阻害剤メトキシアミン（ＭＸ）を使用して評価した。ベンダムスチンおよびＭＸで観察される曲線の左方移動は、ベンダムスチンにより生じられるＤＮＡ損傷がＢＥＲにより修復されることを示す。図４Ｂは、ＭＧＭＴ修復活性の阻害がベンダムスチンの細胞傷害性に影響を及ぼさないことを示す。ベンダムスチンの細胞傷害活性における修復酵素ＭＧＭＴ（Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）の役割を、ＭＧＭＴ阻害剤Ｏ６−ベンジルグアニン（Ｏ６−ＢＧ）を使用して評価した。Ｏ６−ベンジルグアニンの添加はベンダムスチンのＩＣ５０を有意に変化せず、従って、ベンダムスチンがＯ６−アルキルグアニンＤＮＡ付加物を誘導することはありそうにない。対照的に、Ｏ６−ベンジルグアニンは、カルムスチンおよびホスホルアミドマスタード（ＰＭ）のような他のナイトロジェンマスタードに対し細胞を大きく感作する。
図５は、ベンダムスチンが腫瘍細胞に効率的に進入し、かつ、最低３種のシグナル伝達経路、すなわち１）おそらくＮＯＸＡおよびＢａｘのような前アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーにより媒介される固有のアポトーシスの強い活性化をもたらす「正準」ｐ５３依存性ストレス経路の活性化；２）ＮＨＬ若しくはＣＬＬ患者で頻繁に使用される他のアルキル化剤により活性化されない塩基除去修復機構のようなＤＮＡ修復機構の活性化；ならびに３）キナーゼＰＬＫ−１ならびにＡｕｒｏｒａ ＡおよびＢのような数種の有糸分裂チェックポイントの阻害の開始をもたらす、長期のかつ広範囲のＤＮＡ損傷を誘導することを具体的に説明する。特定の論理に束縛されることを願わない一方、ＤＮＡ損傷の同時の誘導および有糸分裂チェックポイントの阻害が、おそらく、ベンダムスチンに曝露された腫瘍細胞が有糸分裂を受ける前にＤＮＡ損傷を効率的に修復することを予防する。細胞は従って損傷されたＤＮＡを伴い有糸分裂に進入するか、若しくは「慣習的」ｐ５３依存性アポトーシスに進行し得ない細胞が、細胞分裂異常による死を受けることができる。この代替のプログラムされた細胞死経路は、伝統的なアポトーシスの強い活性化と一緒になって、ベンダムスチンがｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬剤耐性癌細胞の死滅においてならびに化学難治性腫瘍を有する患者において非常に有効である理由であると考えられる。
図６は、下の実施例３に記述される「ウォッシュアウト」実験のいくつかの経過で実施したアデニル酸キナーゼアッセイの結果を示すヒストグラムである。これらの実験において、ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞を５０μＭベンダムスチン、２０μＭホスホルアミドマスタード若しくは２μＭクロラムブシルのいずれかで３０、６０若しくは９０分間のいずれか処理した。調時的薬物インキュベーション後に、細胞を１×ＰＢＳで洗浄して特定の化学療法剤を「洗い流し」、そしてその後新鮮培地を添加した。細胞をその後４８時間培養し、その時間の後にアデニル酸キナーゼアッセイを細胞上清で実施した。桃色の棒は０分の薬物（すなわち薬物なし）インキュベーションを表す。緑色の棒は３０分のインキュベーションを表し、橙色の棒は６０分のインキュベーションを表し、そして紫色の棒は１２０分のインキュベーションを表す。該結果は、３種の薬物および「薬物なし」対照に対する上清中のアデニル酸キナーゼ活性のレベルをプロットする。標準偏差を該グラフの各棒の上部に表す。
図７は、図６のように、下の実施例３に記述される「ウォッシュアウト」実験のいくつかの経過で実施したアデニル酸キナーゼアッセイの結果を示すヒストグラムである。図６および７に描かれる結果間の差違は、図６に表されるデータが、薬物のそれぞれが培養物から「洗い流された」後の４８時間の細胞培養に関する一方、図７のデータは特定の薬物を「洗い流した」後の７２時間の細胞培養に関することである。
【００３５】
当業者が認識するであろうとおり、以下の記述は本発明のある好ましい態様を詳細に記述し、そして従って代表的にすぎず、そして本発明の実際の範囲を描かない。本発明を詳細に記述する前に、本発明は記述される特定の分子、系、および方法論に制限されないことが理解される。これらは変動しうるためである。本明細書で使用される用語法は特定の態様のみを記述する目的上であり、そして付随する請求の範囲により定義される本発明の範囲を制限することを意図していないこともまた理解されるべきである。
【００３６】
［発明の詳細な記述］
本発明は、アルキル化剤ベンダムスチンが、慣習的化学療法レジメンに難治性のものを包含する多数の癌細胞型に対し非常に迅速な細胞傷害効果を発揮するという驚くべき発見に基づく。ベンダムスチンは、下に詳述されるとおり、他の抗癌剤に比較して別個の作用様式によりその毒性効果を発揮することもまた発見された。
【００３７】
ベンダムスチンすなわち４−｛５−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−メチル−２−ベンズイミダゾリル｝はナイトロジェンマスタードの分類の化学療法剤である。ベンダムスチンは主としてアルキル化活性を表す。すなわちそれはＤＮＡ損傷剤である。ヒトに（典型的にはボーラス静脈内注入により）投与される場合、ベンダムスチンは短い血清半減期（約２時間）を有する。従ってそれは患者の身体から迅速に消失される。驚くべきことに、細胞取り込み後にベンダムスチンはその永続的な細胞傷害効果を迅速に発揮することが発見された。事実、下の実施例３に報告されるとおり、該化合物の細胞傷害効果の大半は、癌細胞を該剤に約３０分と同じくらい短い間曝露することに際して発揮される。
【００３８】
ベンダムスチン処置の現在のプロトコルは、典型的に、それぞれ同等量のベンダムスチンを含有する３回の別個のボーラス静脈内注入の送達を必要とする。第二の注入は一般に第一の注入の１日後、次いで第三の注入は第一の注入の３週後に与える。本レジメンは、骨髄抑制を包含するベンダムスチン処置に関する毒性に起因して使用された。ベンダムスチンの短い血清半減期およびその速効性を考えれば、薬物関連の毒性は、第二およびその後の投与を遅らせることにより低減し得る。事実、広範囲のかつおそらく致死的な腫瘍溶解が非ホジキンリンパ腫のベンダムスチン処置に関してときに報告されているため、薬物の複数回投与のより大きな間隔を空けることが腫瘍溶解の発生を低下させるのに役立つ。不必要な毒性を低減させることに加え、特定の処置レジメンでのベンダムスチン投与のより大きな間隔を空けることは、治療濃度期間（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）、すなわち薬物がその意図される治療上の利益を発揮している期間を増大させるのにもまた役立つことができる。
【００３９】
本発明の実務で使用される組成物（１種若しくは複数）は、ヒトおよび他の哺乳動物を包含する被験体への投与、すなわちそれぞれ「製薬学的」および「獣医学」投与のための薬剤（すなわち医薬品若しくは治療的組成物）を製造するための製薬学的調合技術の慣習的方法に従って加工しうる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、フィラデルフィア州イーストン）の最新版を参照されたい。典型的には、ベンダムスチンのような化合物は、組成物として製薬学的に許容できる担体と組み合わせられる。組成物（１種若しくは複数）はまた、以下、すなわち保存剤；可溶化剤；安定剤；湿潤剤；乳化剤；甘味料；着色料；着臭剤；塩；緩衝剤；コーティング剤および抗酸化剤の１種若しくはそれ以上も包含しうる。
【００４０】
本発明の実務で使用される薬物は遊離酸若しくは塩基として製造することができ、それらをその後、好ましくは適する化合物と組み合わせて製薬学的に許容できる塩を生じる。「製薬学的に許容できる塩」という表現は、非毒性の製薬学的に許容できる無機若しくは有機酸または無機若しくは有機塩基と形成される非毒性の塩を指す。例えば、塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などのような無機酸由来のもの、ならびに、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、フマル酸、メタンスルホン酸およびトルエンスルホン酸などのような有機酸から調製される塩を包含する。塩はまたアンモニア、ヒドロキシエチルアミンおよびヒドラジンのような無機塩基からのものも包含する。適する有機塩基は、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、ヒドロキシエチルアミン、モルホリン、ピペラジンおよびグアニジンを包含する。
【００４１】
いかなる場合も、治療的組成物は、好ましくは、所定の量の所望の治療剤（例えばベンダムスチン）および担体（すなわち生理学的に許容できる賦形剤）を含有する投薬単位の形態で作成される。ヒト若しくは他の哺乳動物（または他の動物）のためのいずれかのこうした分子の治療上有効な量を構成するものは、とりわけ、疾患若しくは障害の型、被験体の齢、重量、性、医学的状態、状態の重症度、投与経路、および使用される特定の化合物を包含する多様な因子に依存することができる。従って、投薬レジメンは広範に変動しうるが、しかし標準的方法を使用して慣例に決定し得る。いかなる場合も、化学療法剤の「有効量」は所望の細胞傷害性を導き出す量である。所望の効果を達成するのに必要とされるこうした治療的分子の量は、特定の分子それ自身、処置されるべき疾患若しくは障害、該分子に応答する被験体の癌の能力、投与経路などを包含する多数の考慮に依存することができる。所望の効果を達成するのに必要とされる分子の正確な量は実務家の判断に依存することができ、そして各個々の被験体に特有である。しかしながら、適する投薬量は、１日あたり体重１キログラムあたり約数ナノグラム（ｎｇ）から約数ミリグラム（ｍｇ）までの有効成分の範囲にわたりうる。
【００４２】
治療的組成物の製造法は当該技術分野で十分に理解されている。典型的には、こうした組成物は、液体溶液若しくは懸濁液のいずれかとしての注入可能物（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）として製造されるが、しかしながら、注入前に液体中の溶液若しくは懸濁液に適する固体の形態もまた製造し得る。調製物はまた乳化もされ得る。有効な治療成分はしばしば、生理学的に許容できかつ有効成分と適合性である賦形剤と混合される。適する賦形剤は、例えば、注射用水、生理的食塩水、Ｄ−ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組合せである。加えて、所望の場合は、組成物は、少量の、有効成分の有効性を高める湿潤若しくは乳化剤、解熱剤、安定剤、増粘剤、懸濁化剤、麻酔薬、保存剤、抗酸化剤、静菌剤、鎮痛薬、ｐＨ緩衝剤などのような補助物質を含有し得る。こうした成分は付加的な治療上の利益を提供し得るか、若しくは該製薬学的組成物の投与の結果として引き起こされうるいかなる潜在的な副作用も予防するために作用し得る。
【００４３】
本発明の組成物は、慣習的担体、補助物質およびベヒクルを含有する投薬単位製剤で、経口で、非経口で、吸入スプレーにより、直腸で、節内に（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）、クモ膜下に若しくは局所で投与しうる。ヒト投与に意図される治療的組成物の情況においては製薬学的に許容できる担体を使用する。「製薬学的に許容できる担体」および「生理学的に許容できる担体」という用語は、被験体に投与される場合に生理学的に耐えられかつ胃の不調、眩暈などのような意図されないアレルギー若しくは類似の予期しない反応を典型的に生じない分子実体および組成物を指す。
【００４４】
経口投与のためには、組成物は、例えば、とりわけカプセル剤、錠剤、舐剤、トローチ剤、散剤、懸濁剤若しくは液体を包含するいずれの適する形態のものであってもよい。液体は、生理的食塩水、Ｄ−ブドウ糖若しくは水を包含する適する担体を含む組成物として注入により投与しうる。「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内若しくは腹腔内経路を介する注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（連続的若しくは間欠的注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）を包含する）および注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を包含する。直腸投与のための坐剤は、有効成分（１種若しくは複数）を、常温で固体しかし生理学的温度で液体であるカカオバターおよび／若しくはポリエチレングリコールのような適する非刺激性賦形剤と混合することにより製造し得る。
【００４５】
組成物は固体の形態（顆粒剤、散剤若しくは坐剤を包含する）でもまた製造しうる。組成物は、滅菌のような慣習的製薬学的操作にかけることができ、かつ／若しくは保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などのような慣習的補助物質を含有しうる。経口投与のための固体の投薬形態物はカプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤を包含しうる。こうした固体の投薬形態物において、有効成分をショ糖、乳糖若しくはデンプンのような最低１種の不活性賦形剤と混合しうる。こうした投薬形態物はまた、不活性希釈剤以外の付加的な物質、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤も含みうる。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、該投薬形態物はまた緩衝剤も含みうる。錠剤および丸剤は、付加的に、腸溶コーティングを伴い製造し得る。経口投与のための液体の投薬形態物は、水のような当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含有する、製薬学的に許容できる乳剤、溶液、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を包含しうる。こうした組成物はまた、湿潤剤甘味料、着香料（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ）および香料（ｐｅｒｆｕｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）のような補助物質も含みうる。
【００４６】
無菌の注入可能な水性若しくは油性懸濁剤のような注入可能な製剤は、適する分散若しくは湿潤剤および懸濁化剤を使用して既知の方法に従って処方しうる。注入可能な製剤はまた、非毒性の非経口で許容できる希釈剤若しくは溶媒中の無菌の注入可能な溶液若しくは懸濁液でもありうる。使用しうる適するベヒクルおよび溶媒は、とりわけ、注射用水、リンゲル液、等張の塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の不揮発性油を溶媒若しくは懸濁媒として使用し得る。この目的上、合成のモノ若しくはジグリセリドを包含するいかなる無刺激性の不揮発性油も使用しうる。加えて、オレイン酸のような脂肪酸は注入可能物の製剤中で使用を見出す。
【００４７】
局所投与のためには、適する局所用量の組成物を１日１ないし４、および好ましくは２若しくは３回投与しうる。用量はまた、用量を適用しない介在する日を伴っても投与しうる。局所送達のための適する組成物は、しばしば、製剤の０．００１％から１０ｗ／ｗ％までの有効成分、例えば１％から２重量％までを含んでなるとはいえ、それは製剤の約１０ｗ／ｗ％、しかし好ましくは５ｗ／ｗ％未満、およびより好ましくは０．１％から１％までを含みうる。局所投与に適する製剤は、皮膚を通る浸透に適する液体若しくは半液体製剤（例えばリニメント剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤若しくはパスタ剤）、および眼、耳若しくは鼻への投与に適する滴剤を包含する。
【００４８】
（例えば無菌（ｓｔｅｒｉｌｅ）すなわち無菌（ａｓｅｐｔｉｃ）条件を達成するような）本発明の組成物の例示的投与方法は当業者に明らかであろう。こうした目的上適するある種の方法が、ＧｏｏｄｍａｎとＧｉｌｍａｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第７版（１９８５）に示されている。患者への投与は間欠的；または漸次の、継続的、一定、若しくは制御された速度であり得る。
【００４９】
非ホジキンリンパ腫の処置のためのベンダムスチンの局所の治療上有効な用量は、２連
続日の単回用量として若しくは用量間に数日を伴い与えられる約６０〜１２０ｍｇ／ｍ２からであり得る。該周期を約３ないし４週毎に反復し得る。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の処置のためには、ベンダムスチンを第１および２日に約８０〜１００ｍｇ／ｍ２で与えることができる。該周期を約４週後に反復し得る。ホジキン病（ステージＩＩ〜ＩＶ）の処置のためには、ベンダムスチンは、約４週毎の該周期の反復を伴う、第１および１５日のダウノルビシン２５ｍｇ／ｍ２、第１および１５日のブレオマイシン１０ｍｇ／ｍ２、第１および１５日のビンクリスチン１．４ｍｇ／ｍ２ならびに第１〜５日のベンダムスチン５０ｍｇ／ｍ２を含む「ＤＢＶＢｅレジメン」で与えることができる。乳癌に対しては、第１および８日のベンダムスチン（１２０ｍｇ／ｍ２）を、約４週毎の該周期の反復を伴い、第１および８日のメトトレキセート４０ｍｇ／ｍ２、ならびに第１および８日の５−フルオロウラシル６００ｍｇ／ｍ２とともに与えることができる。乳癌治療の第二列として、ベンダムスチンは、約４週毎の該周期の反復を伴い、第１および２日に約１００〜１５０ｍｇ／ｍ２で与えることができる。
【００５０】
本発明の方法は単剤療法および併用療法の双方を伴う。併用療法の情況において、本発明は２種若しくはそれ以上の化学療法剤の投与を想定している。多様な化学療法剤が当該技術分野で既知である。これらの化合物のいくつかは、１種若しくはそれ以上の癌の適応症の処置における使用のため既に承認されている。他者は前臨床および臨床開発の多様な段階にある。本発明の併用療法の実務で有用な化学療法剤の例は、アルキル化剤ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパおよびトリエチレンメラミンを包含する。ベンダムスチンとともにの使用のための好ましい代謝拮抗剤は、カペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（およびその活性化型ａｒａ−ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、ダカバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサートならびに６−チオグアニンを包含する。ベンダムスチンとの併用療法で使用し得る好ましい抗分裂化合物は、ナベルビン、パクリタキセル、タキソテール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを包含する。
【００５１】
化学療法剤の他の分類は、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えばカンプトテシン、イリノテカン。トポテカンなど）；ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、イダルビシン、ミトキサントロンおよびテニポシドのようなトポイソメラーゼＩＩ阻害剤：血管新生阻害剤（例えばダルテパリン、スラミンなど）；アレムツズマブ、ベバシズマブ、ベキサロテン、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、オゾガミシン、イブリツモマブチウキセタン、メシル酸イマチニブ、ラルチトレキセド、レブリミド、リツキシマブ、トラスツズマブを包含する抗体；チロシンキナーゼ阻害剤；挿入剤；ならびにアナストロゾール、エストロゲン、抗エストロゲン（例えばフルベストラントおよびタモキシフェン）、エキセメスタン、フルタミド、ゴセレリン、リュープロリド、ニルタミド、レビマソール、レトロゾール、プレドニゾンおよびトレミフェンのようなホルモンを包含する。他の化学療法剤は、アンジオスタチン、アスパラギナーゼ、デニルエキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｕｅｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、エンドスタチン、イミキモド、インターフェロン、インターロイキン−１１およびペグアスパルガーゼのようなタンパク質を包含する。なお他の化学療法剤は、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミフォスチン、アムサクリン、三酸化ヒ素、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボキシアミドトリアゾール、セレコキシブ、ダクチノマイシン、エピルビシン、ゲルダンマイシン、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７ ＡＡＧ）、イリノテカン、２−メトキシエストラジオール、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、オキザリプラチン、スクアラミン、テモゾラミド、サリドマイド、トレチノイン トリアピンおよびバルルビシンのような分子を包含する。当業者が認識するであろうとおり、これらおよび現在既知の若しくは後に開発される他の化学療法剤は、癌を包含する多様な新形成を処置するためにベンダムスチンとともに使用しうる。
【００５２】
実施例
以下の実施例は、本発明のある局面を具体的に説明するため、および本発明の実施において当業者を補助するために提供される。これらの実施例はいかなる様式でも本発明の範囲を制限すると決してみなされるべきでない。
【実施例１】
【００５３】
ベンダムスチンの作用機序の分子解析
Ａ．緒言。
ベンダムスチン（ＴｒｅａｎｄａＴＭ、Ｓａｌｍｅｄｉｘ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州；ＲｉｂｏｍｕｓｔｉｎＴＭ（Ｒｉｂｏｓｅｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ、独国・ミュンヘン））は慣習的ＤＮＡ損傷剤に難治性のものを包含する、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ球性白血病、充実性腫瘍、乳房および小細胞肺癌ならびに多発性骨髄腫のような多様なヒト癌に対する立証された前臨床および臨床活性をもつ抗腫瘍剤である。ベンダムスチンすなわち４−｛５−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−メチル−２−ベンズイミダゾリル｝酪酸塩酸塩は、元は低毒性ならびにアルキル化および代謝拮抗双方の特性をもつ剤を製造する意図を伴い合成された。それは３個の下位構造要素、すなわち２−クロロエチルアミンアルキル化基；ベンズイミダゾール環；および酪酸側鎖を有する。２−クロロエチルアミンアルキル化基は、シクロホスファミド、クロラムブシルおよびメルファランのような他のナイトロジェンマスタードと共有される。ベンズイミダゾール中央環系はベンダムスチンの独特の特徴であるとは言え、酪酸側鎖はクロラムブシルに存在する。この多局面構造が、その独特の抗腫瘍活性プロファイルに寄与するとみられ、そしてそれを慣習的アルキル化剤と識別する。
【００５４】
ＤＮＡアルキル化剤は化学療法の装備一式中で極めて有用である。こうした薬物は、これらの化合物の数種のプログラムされた壊死を誘導する能力、および核を欠く細胞中でさえアポトーシスを誘導する他者（例えばプラチン類）の能力のような予期されない作用機序を有しうる。「ナイトロジェンマスタード」の場合、主要な差違が、多様な適応症でのそれらの識別された使用、すなわち、主としてＮＨＬの処置において使用されるシクロホスファミド；慢性リンパ球性白血病の処置において使用されるクロラムブシル；および多発性骨髄腫の処置において使用されるメルファラン、により反映されるように、それらの活性プロファイルに存在する。
【００５５】
他のアルキル化剤と共通のベンダムスチンの主な抗腫瘍作用は、ＤＮＡの対形成した鎖間の架橋の形成に由来するとは言え、他の作用機序もまた関わるとみられる。従って、ベンダムスチンの抗腫瘍作用は、単純に古典的なアルキル化活性より複雑である機構に由来しうる。ベンダムスチンにより引き起こされるＤＮＡ二本鎖切断はシクロホスファミド若しくはＢＮＣＵにより引き起こされるものより有意により耐性であり、ベンダムスチンは他のアルキル化剤に対しｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで抵抗性である細胞株に対する活性を示し、そして独特の前アポトーシス活性が、数種のｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍モデルで単剤としておよび他の抗癌剤と組合せのベンダムスチンにより示されたためである。ベンダムスチンの正確な作用機序に関する詳細な分子研究はわずかなままである。この理由から、従来技術の分子ツールを使用して、ベンダムスチンの作用機序を完全に分析した。本実施例は、ＮＨＬ細胞株中でベンダムスチンにより誘発される遺伝子発現プロファイル変化を解析するための薬ゲノム学的アッセイ由来の結果を提示する。これらの薬ゲノム学的分析は、アポトーシスシグナル伝達の開始、ＤＮＡ修復の機構および有糸分裂チェックポイントの調節を扱う機能アッセイにより検証された。最後に、ベンダムスチンは、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のヒト腫瘍の６０種の細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングでプロファイルされ、そして他のアルキル化剤（すなわちクロラムブシルおよびホスホルアミドマスタード（シクロホスファミドの代謝物））のライブラリーに対するその比較活性が研究された。結果はまた、ＮＨＬ細胞株中でベンダムスチンにより誘発された遺伝子発現プロファイル変化を解析するための薬ゲノム学アッセイを使用しても生成された。これらの薬ゲノム学分析は、Ｑ−ＰＣＲ、およびアポトーシスシグナル伝達の開始、ＤＮＡ修復の機構および有糸分裂チェックポイントの調節を扱う機能アッセイにより検証された。一緒に、これらの結果は、ベンダムスチンが他のＤＮＡアルキル化剤と異なる複数の作用機序を有することを示し、慣習的治療に難治性の腫瘍を有する患者におけるベンダムスチンの活性を説明する。
【００５６】
Ｂ．材料および方法。
ａ．細胞。
ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞はカリフォルニア大学サンディエゴ校から得た。細胞は１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で増殖させた。
【００５７】
ｂ．試薬。
塩酸ベンダムスチンはＦｕｊｉｓａｗａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ（独国ミュンヘン）から得た。シクロホスファミドの活性代謝物、ホスホルアミドマスタードシクロヘキシルアミン塩（ＰＭ、ＮＳＣ６９９４５）は、国立癌研究所（ＮＣＩ）の開発治療薬プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＤＴＰ）の合成集積所（ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）から得た。全部の他の試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈのような商業的供給源から得た。
【００５８】
ｃ．薬物処理。
本実施例で提示されるアッセイの大部分について、ベンダムスチン、ホスホルアミドマスタード（シクロホスファミドの活性代謝物）およびクロラムブシルに使用した濃度は、３日にわたるＭＴＴアッセイで測定されたそれらの細胞傷害活性に基づき選択した。薬物はＤＭＳＯ中で調製し、そしてその後培地で希釈した。
【００５９】
ｄ．ＲＮＡサンプルの調製および発現データの分析。
細胞を１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）中で収集し（５×１０６細胞）、そして全ＲＮＡを製造元の説明書に従い単離した。ビオチン標識ｃＤＮＡ（１５μｇ）を各ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタクララ）にハイブリダイズさせた。簡潔には、チップへのハイブリダイゼーションのための材料を調製するための手順は複数の段階を必要とした。全ＲＮＡを単離し、そして光学密度により定量した。ｃＤＮＡを、第一鎖ｃＤＮＡを生成させるためｄＮＴＰ、ＤＴＴおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩとともに、Ｔ７プロモーター（ｄＴ７−（Ｔ）２４）と結合したポリＡ尾部を認識する特異的プライマーを使用して生成した。このアプローチはポリＡ（＋）ｍＲＮＡを単離する必要性を軽減した。第二鎖は、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡ ｐｏｌ ＩおよびＲＮアーゼＨを用いてｄＮＴＰを付加すること、およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを追加の５分間添加する前に１６℃で２時間インキュベートすることにより合成した。ｃＤＮＡをカラム精製しかつ定量した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を、高密度オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーション前に実施した。この反応の出発原料は１μｇのｃＤＮＡであり、それに、１０ｍＭビオチニル化１１−ＣＴＰおよび１０ｍＭビオチニル化１６−ＵＴＰを添加することにより補償されるように２５％より少ないＣＴＰおよびＵＴＰを用いてＮＴＰを付加した。適切な緩衝液中３７℃で６時間のＴ７酵素の最終添加がビオチニル化ＩＶＴ ＲＮＡを生じ、それをその後カラム精製した（ＲＮｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ）。
【００６０】
化学的に断片化したＩＶＴ ＲＮＡ（１５μｇ）を、９５℃に加熱した適切な緩衝液中で対照オリゴヌクレオチド、標準（ハウスキーピング遺伝子を包含する）およびサケ精子ＤＮＡと５分間混合し、そしてチップに４２℃で１６時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズされない物質を２×ＳＳＰＥで洗い落とし、そしてフィコエリトリン標識アビジンをその後反応に添加した。過剰の蛍光色素を洗い落とし、そしてチップをその後、各合成部分（ｆｅａｔｕｒｅ）（合成部分は７．５平方ミクロンである）の蛍光の強度について走査した。
【００６１】
ｅ．生物情報学解析。
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐの走査画像を解析するためのＣＯＲＧＯＮ法の使用を伴った遺伝子発現データの解析のための戦略および方法を開発した。ＣＯＲＧＯＮは、その中心的統計学的方法が既知である無料で入手可能なソフトウェアである（Ｓａｓｉｋら（２００２）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ｖｏｌ．１８、ｎｏ．１２：１６３３−４０）。条件の最低１種でｐ＜０．０５（９５％信頼水準）で存在した遺伝子のみをさらなる解析に考慮した。ＣＯＲＧＯＮのＡｆｆｙｍｅｔｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ（ＡＭＳ）５．０ソフトウェアとの比較は、ＡＭＳ ５．０について２９％に比較してＣＯＲＧＯＮについて４．４％の擬陽性誤差率を示した。選択された遺伝子を平均若しくはピークの調節の程度に従って選別した。上位１００種の最も調節される遺伝子を、それらの発現パターンの類似性に基づきクラスター化のため選んだ。階層的クラスター化法を使用した。この最初の分類は、どれが検討中の過程により調節される主遺伝子および経路であったかの決定において極めて有用であった。共調節されると思われた遺伝子のクラスターをプロモーター解析にかけた。次の段階はＧＯ３解析、すなわち該過程に関するＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベース（ウェブサイト：ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）の統計学的に有意の条件（ｔｅｒｍ）を見出すための不偏かつ教師なしツールであった。ＧＯ３は、有意に調節された系の決定的な成分を同定する過程を容易にする。データベースに３種のオントロジー、すなわち分子機能；生物学的過程；および細胞成分が存在した。該解析は、ＵＣＳＤのＡＩＤＳ研究ゲノム学中核センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で実施した。
【００６２】
ｆ．定量的ＰＣＲ分析。
特異的転写物の発現レベルを定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して測定した。各処理したＳＵ−ＤＨＬ−１細胞ペレットからの全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を使用して単離した。ｃＤＮＡは、製造元のプロトコルに従い、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオリゴｄＴプライマーを使用して作成した。Ｑ−ＰＣＲ増幅および定量はｉＣｙｃｌｅｒ装置（Ｂｉｏ−ＲＡＤ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して実施した。サンプル増幅は、１２．５μＬの２×ＩＱ ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＴＭミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、１μＭの各プライマー、および８０ｎｇの全ＲＮＡに対応する容量のｃＤＮＡを含有する２５μＬの容量で実施した。循環条件は：９５℃５秒間；各プライマーの適切なアニーリング温度で３０秒；および７２℃３０秒間であった。アッセイの標的特異性を融解曲線分析により検証した。各遺伝子の発現を各サンプルについて１８ｓの発現レベルに関し正規化した。未処理対照に関する各遺伝子の発現をその後、ＬｉｖａｋとＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（（２００１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、ｖｏｌ．２５：４０２−４０８）の方法に従って計算した。プライマーは、Ｂｅａｃｏｎ ＤｅｓｉｇｎｅｒＴＭ（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ、カリフォルニア州パロアルト）を使用して設計したか、若しくは文献に基づき設計した。プライマー配列およびアニーリング温度は後に続くとおりである（各プライマーは５’から３’、次いでその配列番号で書かれている）。
【００６３】
【表１】
【００６４】
ｇ．ＣＯＭＰＡＲＥ解析。
ベンダムスチンを、６０種のヒト腫瘍細胞株よりなるＮＣＩのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍スクリーニングで試験した。試験は、１０倍希釈の最小５濃度を伴い、そして各スクリーニングを２回反復した。４８時間連続薬物曝露プロトコルを使用した。スルホローダミンＢタンパク質アッセイが細胞生存率若しくは増殖を推定した。ＣＯＭＰＡＲＥ法および関連データは、開発治療薬プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＤＴＰ）ウェブサイト（ウェブサイト：ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で無料で入手可能である。ＮＣＩはベンダムスチンに番号ＮＳＣ１３８７８３を割り当てた。
【００６５】
ｈ．ウエスタンブロット分析。
ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞を５０μＭベンダムスチン、２μＭクロラムブシル、若しくは２０μＭホスホルアミドマスタードとともに２０時間インキュベートした。細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、そして溶解直前に添加する氷冷溶解緩衝液（１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭフッ化ナトリウム、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ、ニュージャージー州ナットレー）およびホスファターゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含む１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコリンナトリウム）で１時間溶解した。非溶解性膜、ＤＮＡおよび他の沈殿物をペレットにし、そしてタンパク質上清を得た。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用して測定した。２０μｇのライセートを４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上でのゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転写し、そして以下の一次モノクローナル抗体、すなわち抗ｐ５３、抗リン酸化ｐ５３（Ｓｅｒ１５特異的）、抗ｐ２１および抗切断型ＰＡＲＰ（カスパーゼ特異的切断部位）（それらは全部Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（マサチューセッツ州ビバリー）から購入した）；抗Ｂａｘおよび抗ＰＡＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した）、ならびに負荷対照に使用した抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した）を使用するイムノブロッティングにより検出した。一次抗体を４℃で穏やかに振とうしながら一夜インキュベートした。メンブレンを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６８０ヤギ抗マウス二次抗体（４０００倍）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）とともに穏やかに振とうしながら室温で２時間インキュベートした。ブロットを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＬｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナで走査した。
【００６６】
ｉ．ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に基づくＡｐｅ−１およびＡＧＴアッセイ。
細胞を、６ｍＭメトキシアミン（Ｓｉｇｍａ）、若しくは５０μＭのＯ６−ベンジルグアニン（Ｓｉｇｍａ）（それぞれ、Ａｐｅ−１塩基除去修復酵素およびアルキルグアニルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）酵素の阻害剤）のいずれかとともに３０分間プレインキュ
ベートした。細胞をその後、多様な濃度の示される剤に７２時間曝露した。細胞傷害性をＭＴＴアッセイ（１３）により評価し、そして、未処理対照の値を５０％阻害した薬物濃度としてＩＣ５０を測定した。解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン３．００
ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して実施した。
【００６７】
ｊ．細胞周期分析。
ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞を、等毒性（ＩＣ５０）濃度のベンダムスチン（５０μＭ）、クロラムブシル（４μＭ）若しくはホスホルアミドマスタード（５０μＭ）とともに８時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、そして７０％エタノール２０℃中で最低１時間固定した。固定した細胞をＰＢＳで洗浄することにより再水和した。細胞を、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州ラホヤ）、１０μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＡ（ＤＮアーゼを含まない、Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）、および１０μｌ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｓｉｇｍａ）よりなるヨウ化プロピジウム染色溶液に再懸濁した。サンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を使用して分析した。細胞周期分布の解析は、ＤＮＡ ＭｏｄＦｉｔ ＬＴ（Ｖｅｒｉｔｙ Ｈｏｕｓｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州サニーベール）モデル化ソフトウェアを使用して実施した。
【００６８】
ｋ．Ｈ２ＡＸフォーカス形成
細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバースライドガラス（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｌ．、イリノイ州ネーパービル）上で増殖させた。細胞を最低１日間付着させた後、細胞をＤＭＳＯ若しくは５０μＭベンダムスチンいずれかを含む培地中で処理した。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、そしてその後ＰＢＳで２回洗浄した。それらを３７℃で追加の４時間インキュベートした。細胞をその後１×ＰＢＳで２回洗浄し、そして−２０℃の１００％メタノール中で１０分インキュベートして細胞を固定した。それらをその後１×ＰＢＳでそれぞれ５分間３回洗浄した。それらをブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中１０％ＦＢＳ、１％ＢＳＡ）中室温で１時間インキュベートした。スライドガラスを、一次ポリクローナル抗Ｈ２ＡＸ抗体（Ｒ
＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）とともに一夜揺らしながら４℃でインキュベートした。抗体はブロッキング緩衝液中１：１０，０００の比で希釈した。スライドガラスを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８ヤギ抗ウサギ二次抗体（４０００倍）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）とともに穏やかに振とうしながら室温で４５分間インキュベートした。スライドガラスを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてその後チャンバーを除去し、そしてＤＡＰＩを伴うＳｌｏｗＦａｄｅ Ｌｉｇｈｔ Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を細胞に添加しかつカバーガラスをスライドガラス上に封止した。分析は、ＤＩＣ光学系および蛍光を伴う電動式Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＰｌａｎ ２ｅ画像化顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲｍカメラおよびＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアバージョン４．２を使用して実施した。
【００６９】
ｌ．残基Ｓｅｒ１３９でのＨ２ＡＸのリン酸化のイムノブロット。
細胞株は１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中でコンフルエンスまで増殖させた。細胞をその後、１×ＰＢＳで２回洗浄し、そして、溶解直前に添加する氷冷溶解緩衝液（１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ、ニュージャージー州ナットレー）およびホスファターゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含む、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコリンナトリウム）で１時間溶解した。非溶解性膜、ＤＮＡおよび他の沈殿物をペレットにし、そしてタンパク質上清を得た。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用して測定した。２０マイクログラムのライセートを４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）に転写し、そしてポリクローナル抗Ｈ２ＡＸ抗体（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を使用するイムノブロッティングにより検出した。抗体は１：２０００の比でブロッキング緩衝液で希釈し、そしてメンブレンを穏やかに振とうしながら室温で２時間インキュベートした。メンブレンを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６８０ヤギ抗ウサギ二次抗体（５０００倍）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）とともに穏やかに振とうしながら室温で２時間インキュベートした。ブロットを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＬｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナで走査した。
【００７０】
Ｃ．結果。
ａ．遺伝子発現プロファイリングは、クロラムブシル若しくはシクロホスファミドと異なる、ベンダムスチンにより調節されるシグネチャ遺伝子を同定する。
【００７１】
ベンダムスチン、クロラムブシルおよびホスホルアミドマスタード（シクロホスファミドの活性代謝物）の等毒性濃度を、薬物への３日の曝露後に細胞生存率を測定することにより測定した。本研究に提示されるアッセイについて、ベンダムスチン、ホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシルに使用した濃度はこのデータに基づき選択した（下の表１）。これらの濃度はまた、各薬物の臨床上達成可能な濃度も反映する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析を使用して、薬物処理したＳＵ−ＤＨＬ−１（非ホジキンリンパ腫細胞株、対照細胞に比較される細胞）中の１２，０００を越える遺伝子の発現レベルを比較した。ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞を、ＩＣ５０濃度（２５μＭ）およびＩＣ９０濃度（３５μＭ）のベンダムスチンとともにインキュベートした。クロラムブシルおよびシクロホスファミドの代謝物ホスホルアミドマスタードはＩＣ９０、すなわちそれぞれ５μＭおよび５０μＭで試験した。遺伝子発現を、薬物で処理後８時間モニターして、この初期ストレス応答の近接事象を同定した。
【００７２】
ゲノム解析は、該遺伝子の大多数が、上位１００種の調節される遺伝子のクラスター図（図１Ａ）により示されるとおり、３種の試験した薬物間で同様に調節されることを示した。大部分の遺伝子は該薬物への曝露に際して上方制御された（赤色）。遺伝子の一サブセットは薬物処理後に転写的に抑制された（青色）。重要なことに、試験した他２種の薬物に比較して、ベンダムスチンによる示差的調節を表した一群の遺伝子が同定された。
【００７３】
誘導される遺伝子の多く（図１Ｂ）は、それらのプロモーター領域にｐ５３応答エレメントを有することが知られ、そしてｐ５３依存性とみなされる。これらの遺伝子の例は：ｐ２１（ｐ５３で誘導される細胞分裂キナーゼ阻害剤）；ｗｉｐ１（ｐ５３で誘導されるタンパク質ホスファターゼ１）；ＮＯＸＡ（ｐ５３で誘導される前アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー）；ＤＲ５／ＫＩＬＬＥＲ（ｐ５３に調節されるＤＮＡ損傷誘導可能な細胞死受容体）；およびＢＴＧ２である。興味深いことに、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの４メンバー（メンバー６、９、１０および１０ｂ）が、上位１００種の調節される遺伝子中で同定された。これらの遺伝子の数種は外因性アポトーシス経路（ＲＥＦ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦアポトーシス）の調節で決定的に重要な役割を演じていることが示されている。数種の他の遺伝子は、ベンダムスチンと他２種の化合物の間で反対の傾向を表す（データは示されない）。これらの遺伝子は双方の濃度でベンダムスチンにより上方制御されるが、しかしクロラムブシルおよびホスホルアミドマスタード双方により下方制御された。
【００７４】
ベンダムスチン、クロラムブシルおよびホスホルアミドマスタード間の薬ゲノム学的差違を評価するため、遺伝子プロファイリングからの結果をＧＯ３ソフトウェア（該過程に関連したＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）データベース（ウェブサイト：ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）中の統計学的に有意の条件を見出すための不偏かつ教師なしツール）で再解析した。ベンダムスチン処理した細胞で有意に上方若しくは下方制御されかつ対照処理された細胞中での発現のレベルの最低１．５倍上若しくは下の遺伝子を、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）共同事業体により提供される生物学的過程の注釈に結びつけた。ＧＯ注釈の階層構造に基づき、各初期娘期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｄａｕｇｈｔｅｒ ｔｅｒｍ）（Ｐ値）が選択された遺伝子の数に偶然結びつけられる確率を計算した。ＤＭＳＯ処理対照およびベンダムスチン処理細胞（ＩＣ９０用量で）を比較するＧＯ解析の結果を下の表２に報告する。下の表２で、第一列は一般的範疇を表し、第二および第三列は特定の生物学的過程の数および名称であり、そして最後の列は各過程のｐ値である。ｐ値はＧＯ３ソフトウェアを使用して計算した。４種の主要な機能群、すなわち（１）ＤＮＡ損傷、ストレス応答、アポトーシス；（２）ＤＮＡ代謝、ＤＮＡ修復、転写；（３）細胞増殖、細胞周期、有糸分裂チェックポイント；および（４）細胞調節が、ベンダムスチンにより統計学的に調節されることが見出された。これらの群のそれぞれは、ベンダムスチンにより有意に調節されることが見出された数種の生物学的過程を包含する。最低のｐ値を提供しかつ従って最も統計学的に有意であった生物学的過程は：ＤＮＡ損傷ストレスに対する応答（ＧＯ６９７４）；ＤＮＡ代謝（ＧＯ６２５９）；および細胞増殖（ＧＯ８２８３）であった。
【００７５】
クロラムブシルおよびホスホルアミドマスタードを用いて実施した類似の解析は、ベンダムスチンおよびクロラムブシルで得られたプロファイル間に重なりがほとんど存在しないことを示唆した。遺伝子調節における若干の類似性がベンダムスチンとホスホルアミドマスタードの間で観察されたとは言え、これらは「ＤＮＡ代謝、ＤＮＡ修復および転写」群に限定された。これらの結果は、遺伝子アレイの結果の定量的検証およびベンダムスチンのより決定的な差別化のための特定の遺伝子産物の選択のための基礎を提供した。
【００７６】
ｂ．リアルタイム定量的Ｑ−ＰＣＲ分析によるゲノム解析の検証。
アレイデータの確認および検証をリアルタイム定量的ＰＣＲ分析（Ｑ−ＰＣＲ）により実施した。ｐ５３シグナル伝達、アポトーシス、ＤＮＡ修復および細胞周期／有糸分裂チェックポイントに関与する数種の遺伝子は、全部、試験した他のアルキル化剤とベンダムスチンを比較する場合に示差的に調節された。
【００７７】
Ｑ−ＰＣＲ検証に選択した「正準」ｐ５３依存性遺伝子の２例は、ｐ２１（Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１）すなわちサイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ａ、および前アポトーシスＢＨ３−ｏｎｌｙ Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーＮＯＸＡであった。双方の遺伝子は、ベンダムスチンへの曝露８時間後にＳＵ−ＤＨＬ−１細胞中で誘導されることが見出された。双方の遺伝子はまた、等毒性濃度のホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシルにより、しかしはるかにより低い程度まで誘導された（図２Ａ）。
【００７８】
検証分析から出現した最も特筆すべき結果の１つは、ｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）、ＡｕｒｏｒａキナーゼＡおよびＢ、ならびにサイクリンＢ１を包含する数種の有糸分裂関連遺伝子の示差的調節であった。これらの遺伝子は有糸分裂チェックポイントの調節で重要を演じていると考えられる。ベンダムスチンでの処理は全部のこれらの遺伝子のｍＲＮＡ発現の６０ないし８０％下方制御に至った。対照的に、ホスホルアミドマスタード若しくはクロラムブシルは、おそらくＡｕｒｏａキナーゼを除き、これらの遺伝子の転写物に対する小さな影響のみ発揮した（図２Ｂ）。
【００７９】
差違はまた、ＤＮＡ修復遺伝子エキソヌクレアーゼ−１（ＥＸＯ１）のｍＲＮＡ発現の
分析でも出現した。ベンダムスチンは、ホスホルアミドマスタード（１．５倍）若しくはクロラムブシル（１．８倍）で観察されたものと比較して、Ｅｘｏ１発現のわずかにより強い（２．５倍）上方制御を誘導した（図２Ｃ）。Ｆｅｎ１（ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ１）もまたベンダムスチンにより上方制御され、そして、ホスホルアミドマスタードは、等毒性濃度で使用した場合にこの遺伝子を同一レベルまで上方制御した（図２Ｃ）。
【００８０】
ｃ．ＮＨＬ細胞中でのベンダムスチンによるアポトーシスシグナル伝達。
ＮＨＬ細胞中でのベンダムスチン誘導性のプログラムされた細胞死に関与する分子事象を分析するため、重要なアポトーシスタンパク質の発現をイムノブロット分析によりモニターした。該結果は、ベンダムスチンが古典的ｐ５３依存性アポトーシス経路を効率的かつ迅速に起動させ得ることを明確に示した。初期若しくは頂点の（ａｐｉｃａｌ）事象の１つは、セリン１５残基のリン酸化を特異的に認識する抗体を使用して検出されるとおり、ｐ５３リン酸化の誘導である。Ｓｅｒ１５リン酸化ｐ５３の８倍の上方制御が、ベンダムスチンに曝露したＳＵ−ＤＨＬ−１細胞で観察された一方、小さい上方制御のみがホスホルアミドマスタード処理した細胞で見られ、また、クロラムブシル処理した細胞で変化は観察されなかった（図３、左上図）。
【００８１】
リン酸化されたｐ５３の誘導と平行して、全ｐ５３の発現の強い増大が、ベンダムスチン処理した細胞で見られた。クロラムブシル処理した細胞は全ｐ５３の小さな増大を表した一方、ホスホルアミドマスタードへの曝露はｐ５３レベルの変化を誘導しなかった。ｐ２１タンパク質発現で観察された変化は、ｐ５３のタンパク質発現レベルの変化に比較した場合に、薬物のそれぞれについて小さかった。Ｂａｘ（重要なＢＨ３−ｏｎｌｙ前アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー）のタンパク質発現の増大は、ベンダムスチン処理したＳＵ−ＤＨＬ−１細胞でのみ観察された（図３、左下図）。
【００８２】
ホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシルとベンダムスチンの効果の比較において観察された最も顕著な差違は、ＰＡＲＰ（ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ−１）の発現を比較した場合に見出された。ＰＡＲＰはＤＮＡ修復機構で重要な決定的なＮＡＤを要求する酵素である。ＰＡＲＰはまた前アポトーシスタンパク質分解性カスパーゼ酵素の「初期」基質でもある。ベンダムスチンで処理したＳＵ−ＤＨＬ−１細胞はＰＡＲＰタンパク質発現の劇的な減少を示した（図３、右上図）。ＰＡＲＰ発現の該減少の理由は、「切断特異的」酵素により認識されるタンパク質分解性切断生成物の出現により示されるとおり、カスパーゼによるその切断であった（図３、右中図）。注目すべきことに、ＰＡＲＰの発現の変化は、等毒性濃度のホスホルアミドマスタード若しくはクロラムブシルにより処理したＮＨＬ細胞で検出されなかった。類似の結果は、ベンダムスチンの用量（５０μＭ）を維持しつつ２倍の等毒性用量のホスホルアミドマスタード（４０μＭ）およびクロラムブシル（４μＭ）を使用する場合に観察された（データは示されない）。従って、ＰＡＲＰ発現レベルの評価を多様な目的上使用し得る。例えば、ＰＡＲＰアッセイは特定の治療レジメンの有効性に関する指標を提供するはずであり得、ここで、低下されたＰＡＲＰ発現（好ましくは、ＰＡＲＰ切断生成物の存在などについてタンパク質レベルで、例えばＰＡＲＰ活性により測定される）は、投与された薬物が所望の効果を有していることを示す。加えて、ＰＡＲＰアッセイは、例えば、組織の細胞（例えば生検若しくは他の生物学的サンプル由来の細胞）が特定の治療（例えばベンダムスチン単剤療法、若しくは治療の１種がベンダムスチンを利用する併用療法）に応答することがありそうであるかどうかを決定するのに予後的に使用し得る。
【００８３】
ｄ．塩基除去修復の阻害はベンダムスチン活性を阻害するが、しかしＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ修復は阻害しない。
修復酵素Ａｐｅ−１、すなわちベンダムスチンおよびシクロホスファミドの代謝物ホスホルアミドマスタードの細胞傷害活性において塩基除去修復（ＢＥＲ）経路で決定的な役
割を演じている、プリン塩基のないエンドヌクレアーゼの役割を、Ａｐｅ−１阻害剤メトキシアミンを使用して評価した。ベンダムスチンのＩＣ５０は、メトキシアミン添加でおよそ４倍（およそ５０μＭからおよそ１２μＭまで）低下された（図４Ａ）。対照的に、ホスホルアミドマスタードのＩＣ５０は、メトキシアミンを添加した場合にわずかにのみ変化した。該結果は、ＢＥＲがベンダムスチン誘導性のＤＮＡ損傷の修復において重要な役割を演じうるが、しかしシクロホスファミドにより誘導される損傷の修復においてはしないかもしれないことを示唆する。
【００８４】
ベンダムスチンの抗腫瘍活性に対するＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）の既知の阻害剤、Ｏ６−ベンジルグアニンの効果もまたＳＵ−ＤＨＬ−１細胞で試験した。該結果は、ベンダムスチンの細胞傷害効力がＯ６−ベンジルグアニンを添加することにより高められなかったことを示した。反対の結果がシクロホスファミドで得られ、シクロホスファミドと異なり、ベンダムスチンはＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤＮＡ修復機構に認め得るほど頼らないことを示唆した（図４Ｂ）。
【００８５】
ｅ．ベンダムスチンＨＣｌは二本鎖切断の形成を迅速に誘導して独特の細胞周期変化をもたらす。
二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するベンダムスチンＨＣｌの能力を検討するため、２種の生化学的マーカー、すなわち免疫蛍光によるγ−Ｈ２ＡＸヒストンの核局在化；およびイムノブロット分析による残基Ｓｅｒ１３９でのＨ２ＡＸのリン酸化を分析した。結果は、ベンダムスチンＨＣｌが、多剤耐性およびｐ５３欠損株を包含する多様な腫瘍細胞中でＤＳＢを強力かつ迅速に誘導したことを確認した。５０μＭベンダムスチンＨＣｌとのインキュベーションは約３０分後に検出可能な核内フォーカスの形成に至る。時間経過分析は、γ−Ｈ２ＡＸのＳｅｒ１３９リン酸化が、ベンダムスチンＨＣＬへの２４時間の連続曝露後、ならびに該薬物への非常に短い曝露（３０分）、次いで薬物の除去（ウォッシュアウト）後に検出可能であったことを示した。ベンダムスチンＨＣｌは、シクロホスファミドのような他の２−クロロエチルアミノＤＮＡアルキル化剤でよりも早期に発生するＨ２ＡＸのリン酸化を誘導した。５０μＭベンダムスチンＨＣｌに８時間曝露したＳＵ−ＤＨＬ−１リンパ腫細胞の細胞周期分析は、付随するＧ２Ｍ停止を伴わずに４０％超の平均のＳ期分布の増大を示した。等毒性濃度のクロラムブシルおよびシクロホスアミドへの曝露は、Ｓ期分布をそれぞれおよそ２０％および１５％増大させた。これらの知見は、ベンダムスチンＨＣｌが、一過性の３０分曝露後でさえＤＮＡ二本鎖切断を誘導し得ることを具体的に説明する。
【００８６】
ｆ．ベンダムスチンは、ＮＣＩのＣＯＭＰＡＲＥ解析を使用して活性の独特なプロファイルを表す。
ベンダムスチンの細胞傷害性を、国立癌研究所の前臨床抗腫瘍薬発見スクリーニング（ＮＣＩスクリーニング）の６０種のヒト細胞株で評価した。ＮＣＩスクリーニングは、潜在的抗腫瘍薬の相対的効力を４５，０００種以上の化合物および天然産物の広範囲のデータベースからの既知の治療薬と比較するのに有用である。ＣＯＭＰＡＲＥ解析を、「種（ｓｅｅｄ）」としてベンダムスチンを用いて生成させたＧＩ５０の結果を使用して実施した。高いＰｅａｒｓｏｎ相関係数（ＰＣＣ）をもつ化合物は、しばしば類似の作用機序を有する。ベンダムスチンは、ＮＣＩスクリーニングでいかなる剤とも強い相関（＞０．８）を示さなかった（下の表３）。ベンダムスチンとの６種の上位の一致のうち、メチル化剤ＤＴＩＣ（ダカルバジン）のみがおよそ８０％の相関一致（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）（ｒ値）を示した。対照的に、０．８３超の相関係数をもつ全２５種の化合物が、メルファラン、クロラムブシル、若しくはシクロホスファミドの活性代謝物について同定された。加えて、本スクリーニングでのメルファラン、クロラムブシルおよびシクロホスファミドの感受性パターンの直接比較は、該３種の薬物間の高い相関係数を示した（０．７６２〜０．９３４、データは示されない）。これらのデータは、該剤の感受性プロファイルの統計学的一致、および共通の作用機序の高い見込みを示す。ベンダムスチンと、ナイトロジェンマスタードの分類の他メンバーの間の相関の欠如は説得力があり、そしてベンダムスチンが別個の抗腫瘍活性パターンを有することを示す。
【００８７】
Ｄ．考察。
多様な生物学的および分析ツールを使用して得られたこれらの実験の結果は、ベンダムスチンが、シクロホスファミドおよびクロラムブシルのような同一の「ナイトロジェンマスタード」活性部分を共有する他の臨床で使用される化合物と比較した場合に、別個の作用機序を有することを示す。
【００８８】
本研究で使用したツールの１種は薬ゲノム学アプローチであり、選択された薬物との標的細胞株のインキュベーションに際して、数千の完全に特徴付けられた遺伝子の発現レベルの同時の解析およびモニタリングを可能にし、他の抗癌薬の作用機序を解明するために成功裏に使用されている。その大きな利点は、それを他のＤＮＡアルキル化剤と識別する、ベンダムスチンの別個の作用機序の同定に至った不偏情報の生成であった。
【００８９】
本アプローチを用い、強い古典的ｐ５３依存性のストレス応答「シグネチャ」がベンダムスチンについて検出され、また、ホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシル処理した細胞で存在したが、しかし大きく低下された強度でであった。Ｑ−ＰＣＲ分析は遺伝子アレイ分析を確認し、ｐ２１（Ｗａｆ／Ｃｉｐ１）およびＮＯＸＡのようなｐ５３応答エレメントを含有する遺伝子の上方制御を検証した。サイクリン依存性キナーゼの阻害剤、とりわけ細胞周期のＧ１期の間に機能するものとして、ｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１はｐ５３誘発性のＧ１停止を少なくとも部分的に媒介すると考えられる。ｐ５３誘発性の細胞周期停止およびアポトーシスに至る機構は広範囲に検討かつ報告されている。Ｎｏｘａはタンパク質のＢｃｌ−２ファミリーのＢｃｌ−２相同性３（ＢＨ３）−ｏｎｌｙメンバーをコードする。ＮＯＸＡは、ｐ５３媒介性のトランス活性化の標的でありかつミトコンドリア機能異常によるｐ５３依存性アポトーシスの媒介物質として機能することが示された。Ｎｏｘａが欠損のマウス胚線維芽細胞は、ＤＮＡ損傷に応答しての癌遺伝子依存性アポトーシスに対する顕著な抵抗性を示した。
【００９０】
ｐ５３前アポトーシス経路の活性化をその後、リン酸化ｐ５３（Ｓｅｒ１５）の検出ならびにＢａｘの上方制御を伴い、イムノブロット分析により確認した。他のナイトロジェンマスタードはｐ５３媒介性ストレス応答を誘導することが以前に報告されているとは言え、ベンダムスチンは、等毒性用量のシクロホスファミド代謝物（ＰＭ）若しくはクロラムブシルに比較した場合に、より強くかつより迅速に誘導されるシグナルを提供する。ベンダムスチンはまた、多様なタンパク質のポリ（ＡＤＰリボシル化）を触媒する酵素ＰＡＲＰの迅速かつ広範囲の切断を誘導することも見出された。ベンダムスチンはＰＡＲＰ切断を誘導するとは言え、ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞でＰＡＲＰ切断を引き起こす該３種の薬物の能力間の差違は顕著であった。ＰＡＲＰ切断のこの迅速な誘導は、ＤＮＡ修復機構に対するＰＡＲＰの重要性を考えれば、ベンダムスチンの作用機序において決定的な役割を演じうる。事実、ＤＮＡ損傷に応答して、細胞は最初にＰＡＲＰを活性化し、ＤＮＡ修復酵素および転写因子へのＤＮＡの到達可能性の増大をもたらす。加えて、ＰＡＲＰはアポトーシス若しくは壊死いずれかによる細胞死の開始に関与している。
【００９１】
ベンダムスチンおよび他の試験したナイトロジェンマスタードの薬ゲノム学プロファイリングから出現した別の大きな差違は、ｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）、Ａｕｒｏｒａキナーゼ（ＡおよびＢ）ならびにサイクリンＢ１の発現レベルに対する影響であった。有糸分裂チェックポイントキナーゼＰＬＫ−１およびＡｕｒｏｒａは、ＣＤＫ／サイクリン複合体の活性化および不活性化、セントロソームの集成および成熟、ならびに分裂中期−分裂後期転移の間の分裂後期促進複合体（ＡＰＣ）の活性化、ならびに細胞質分裂のような細胞周期調節の多くの局面に関与している。興味深いことに、これらのチェックポイント調節物質を、ｓｉＲＮＡを使用して、若しくは標的を定めた小分子を使用して阻害する場合、ＤＮＡ損傷薬物の効果の増強が、細胞分裂異常の出現と一緒になって観察される。細胞分裂異常は、分裂中期の間に発生する細胞死の一形態であり、そして形態学的にアポトーシスと異なる。細胞分裂異常は、機能的ｐ５３の非存在下で、若しくは慣習的なカスパーゼ依存性アポトーシスが抑制されている細胞で発生し得る。この理由から、細胞分裂異常の開始は腫瘍細胞死の目立つ機構である。それはまた慣習的化学療法剤を使用する数回の化学療法により選択された腫瘍細胞中でも機能しうるからである。ベンダムスチンにより導き出される広範囲のかつ耐性のＤＮＡ損傷、およびベンダムスチンによるＭ期特異的チェックポイントの同時の阻害は、処理した細胞中で細胞分裂異常を誘発しうる。これは、シクロホスファミドおよびクロラムブシル含有レジメンに難治性の患者におけるベンダムスチンの臨床で報告された活性を説明しうる。
【００９２】
効率的なＤＮＡ修復機構は、ＤＮＡアルキル化薬の作用機序において決定的な役割を演じていることが示された。別個のＤＮＡ修復機構の活性化はまた、類似の化学的特徴を共有する薬物に対する別個の活性プロファイルも賦与しうる。本明細書に記述される薬ゲノム学分析は、ホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシルに比較して、ベンダムスチンにより示差的に調節されるＤＮＡ修復遺伝子を同定した。１つのこうした遺伝子、エキソヌクレアーゼ１（Ｅｘｏ１）は、ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬホモログと相互作用する５’−３’エキソヌクレアーゼであり、そしてＤＮＡミスマッチ修復の除去段階ならびに二本鎖切断のプロセシングおよび修復に関与している。Ｅｘｏ１は、体細胞突然変異およびクラススイッチ組換えに関与しており、そして従ってＢ細胞機能および抗体の生成において非常に重要である。
【００９３】
ベンダムスチン、シクロホスファミドおよびクロラムブシルの間の修復機構の差違をさらに検討するため、機能アッセイを実施した。２種の主要な機構、すなわち、ＤＮＡ修復タンパク質Ｏ６−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）；およびプリン塩基のない／ピリミジン塩基のないエンドヌクレアーゼＡｐｅ−１を検討した。偏在性酵素ＡＧＴは、ニトロソ尿素およびトリアゼンを包含する数種のアルキル化剤により引き起こされるＯ６−アルキルグアニンＤＮＡ付加物を除去する。臨床上の証拠は、高レベルのＡＧＴを発現する脳腫瘍は、テモゾロミドのような数種のＤＮＡアルキル化剤により抵抗性でありうる脳腫瘍を示唆する。ヌクレオシドＯ６−ベンジルグアニン（Ｏ６−ＢＧ）はＡＧＴタンパク質を効果的に不活性化するための手段を提供する。数種の細胞株において、ベンジルグアニンは、活性化された形態のシクロホスファミドの毒性を明瞭に高める。ここで示されるとおり、シクロホスファミドの細胞傷害効力は、Ｏ６−ベンジルグアニンを添加することにより高められたがしかしベンダムスチンはされず、ベンダムスチンがＡＧＴにより修復され得るＯ６−アルキルグアニンＤＮＡ付加物を誘導しないことを示す。
【００９４】
Ａｐｅ−１／Ｒｅｆ−１は、塩基除去修復（ＢＥＲ）経路で決定的な役割を演じているプリン塩基のない／ピリミジン塩基のないエンドヌクレアーゼである。ＢＥＲは、ＤＮＡアルキル化剤、およびテモゾロミドのようなＤＮＡメチル化剤を包含する多様なＤＮＡ損傷薬物により誘発される損傷により活性化される。Ａｐｅ−１の役割を、その酵素活性の特異的阻害剤、化合物メトキシアミン（ＭＸ）を使用して試験した。ベンダムスチンの細胞傷害活性はＭＸによるＡｐｅ−１の阻害により高められ、ＢＥＲに対する役割を示した。シクロホスファミド代謝物を使用して変化は観察されず、これらの薬物により活性化されるＤＮＡ修復機構間の大きな差違の根拠をなした。
【００９５】
ＮＣＩのヒト腫瘍の６０種の細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング（ＮＣＩ Ｈｕ
ｍａｎ Ｔｕｍｏｒ ６０ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｃｒｅｅｎ）は、潜在的抗腫瘍剤の相対的効力の他の既知治療薬との比較において有用である。化合物の対が、ＣＯＭＰＡＲＥ統計解析プログラムにより評価されるとおり、該一団を使用してのそれらのスクリーニング結果間に高い相関係数を有することが見出される場合は、該剤はしばしば類似の作用機序を有することが、多くの場合にまた示されている。ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシルおよびシクロホスファミドについて観察される高い相関は、全部既知のアルキル化剤とであり、共通の作用機序を見出すＣＯＭＰＡＲＥ解析の能力を確認する。ベンダムスチンとの６種の上位の一致のうち、メチル化剤ＤＴＩＣ（ダカルバジン）のみがおよそ８０％の相関一致（ｒ値）を示した。これらの結果は、ベンダムスチンが他の既知のアルキル化剤に関して異なる作用機序を表すことを示す。
【００９６】
本実施例に提示される結果に基づき、ベンダムスチンの推定される作用機序を図５に具体的に説明する。ベンダムスチンは腫瘍細胞に効率的に進入し得、そして、おそらくベンダムスチンのベンズイミダゾール環系により賦与されるアジリジニウム遷移状態環の高度の化学的安定性により、長期のおよび広範囲のＤＮＡアルキル化および断片化を誘導し得る。ベンダムスチン処置は、３種の主要なシグナル伝達経路、すなわち１）ＮＯＸＡおよびＢａｘのような前アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーにより媒介される固有のアポトーシスの強い活性化をもたらす「正準」ｐ５３依存性ストレス経路の活性化；２）ＮＨＬ若しくはＣＬＬ患者で頻繁に使用される他のナイトロジェンマスタードにより活性化されない塩基除去修復機構のようなＤＮＡ修復機構の活性化；ならびに３）キナーゼＰＬＫ−１ならびにＡｕｒｏｒａ ＡおよびＢのような数種の有糸分裂チェックポイントの阻害の開始をもたらす。ＤＮＡ損傷および有糸分裂チェックポイントの阻害の同時の誘導は、ベンダムスチンに曝露された腫瘍細胞が、有糸分裂を受ける前にＤＮＡ損傷を効率的に修復することを可能にしないとみられる。広範囲に損傷されたＤＮＡを伴い有糸分裂に進入するＤＮＡ、若しくは「慣習的」ｐ５３依存性アポトーシスに進行し得ない細胞は、細胞分裂異常による死を受けることができる。この代替のプログラムされた細胞死経路は、伝統的アポトーシスの強い活性化と一緒になって、ベンダムスチンがｉｎ ｖｉｔｒｏの薬剤耐性細胞で、ならびに化学難治性腫瘍を運搬する患者で有効である理由を示す。結果として、ベンダムスチン処置は、とりわけ、低悪性度の非ホジキンリンパ腫および他の血液学的癌を伴う患者の処置のための臨床家の装備一式への重要な追加を表すことができる。
【実施例２】
【００９７】
ＮＨＬ細胞中でのベンダムスチン活性は細胞分裂異常死経路を誘導する
上の実施例１に記述されるとおり、ベンダムスチンは別個の作用機序をもつアルキル化剤であり、そして伝統的なＤＮＡ損傷剤に難治性のＮＨＬおよびＣＬＬ患者で臨床試験を受けている。ベンダムスチンはＮＨＬ細胞中の遺伝子発現の独特の変化を誘導し、また、他の２−クロロエチルアミンアルキル化剤との交差耐性の欠如を表す。定量的ＰＣＲ分析は、Ｇ２／Ｍチェックポイント調節物質Ｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）およびＡｕｒｏｒａ Ａキナーゼ（ＡｕｒｋＡ）が、臨床上適切な濃度の薬物への曝露の８時間後にＮＨＬ細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−１中で下方制御されることを確認した。これらの同一の遺伝子の変化は、細胞を等毒性用量のクロラムブシル若しくはシクロホスファミドの活性代謝物に曝露した場合に観察されなかった。
【００９８】
古典的なカスパーゼ媒介性のアポトーシスを受けることが不可能な細胞で細胞毒性を誘導するベンダムスチンの能力を検討した。多剤耐性ＭＣＦ−７／ＡＤＲ細胞およびｐ５３欠損ＲＫＯ−Ｅ６結腸腺癌細胞を、５０μＭベンダムスチン単独、若しくは５０μＭベンダムスチンおよび２０μＭ汎カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋいずれかに２若しくは３日間曝露した。ｚＶＡＤ−ｆｍｋはアネキシンＶ陽性細胞中でベンダムスチン誘導性の増
大を阻害することが可能であったとは言え、単独若しくはｚＶＡＤ−ｆｍｋと組合せのいずれかのベンダムスチンで処理した細胞中のＤＮＡ染色ＤＡＰＩを使用する核形態の顕微鏡的分析は、微小核形成の増大された発生率を示した。多／微小核形成および異常なクロマチン凝縮は双方とも細胞分裂異常の顕著な特徴であり、そしてビンカアルカロイドおよびタキサン類のような微小管結合薬物に曝露された腫瘍細胞中で観察されている。細胞分裂異常の活性化は、古典的アポトーシス経路が阻害された腫瘍細胞中でのベンダムスチンの細胞傷害性およびその活性を増幅しうる。
【実施例３】
【００９９】
即効性のベンダムスチンはリンパ腫および白血病細胞での強力なアポトーシスおよび細胞死を活性化する
上述されたとおり、アルキル化剤ベンダムスチンはとりわけ薬剤耐性癌に対し化学療法活性を表し、そして他の関連する抗腫瘍剤に比較した場合に独特の作用機序を有する。他の抗腫瘍性ナイトロジェンマスタードと同様に、ベンダムスチンはヒトで比較的短い血清半減期を有し（およそ２時間）、そしてボーラス静脈内注入により臨床投与される。本実施例で報告される研究の目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで癌細胞に短期間曝露される場合に細胞死およびアポトーシスを誘導するベンダムスチンの能力を評価することであった。こうした実験モデルでのベンダムスチンの活性を、他の構造的に関連する剤と比較した。得られた結果は、ベンダムスチンが細胞への短い（３０分）曝露後に最大の抗腫瘍活性を発揮することを示す。これらの結果を得るため、ＮＨＬ細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−１を、３０分から４時間までの範囲にわたる短期間、５０μＭベンダムスチンに曝露し、洗浄し、そして薬物を含まない培地中で２０時間回復させた。ベンダムスチンに約３０分程度曝露した細胞は、薬物曝露後４８および７２時間に細胞内ＡＴＰおよび上清中へのアデニル酸キナーゼの遊離の測定を包含する多様な生物学的アッセイにより測定されるとおり、生存可能性の大きな喪失を表した（図６および７）。対照的に、この分類のアルキル化剤の他のメンバー（ここでは、クロラムブシル、メルファラン、およびシクロホスファミド代謝物ホスホルアミドマスタード；クロラムブシルおよびホスホルアミドマスタードのデータを示す）で処理した細胞は、これらの剤に３０、６０および１２０分間曝露した場合に生存可能性の最小限の喪失を経験した。これら他のナイトロジェンマスタードは、これらのアッセイでベンダムスチンに匹敵する細胞傷害効果を誘導するのにはるかにより長い曝露期間（最低４時間）を必要とした。これらの知見はＭＴＴに基づくアッセイを使用して確認され、ここでは、ベンダムスチンは、薬物への３０分、４時間若しくは７２時間の曝露後７２時間にＳＵ−ＤＨＬ−１およびＨＬ−６０細胞で類似のＩＣ５０を有した。比較すると、クロラムブシル、メルファランおよびホスホルアミドマスタードは、連続（７２時間）曝露に比較して、これらの同一の細胞株と３０分間インキュベートした場合に１０ないし２０倍より高いＩＣ５０値を表した。
【０１００】
細胞内ＡＴＰレベルは、以下のルシフェラーゼに基づくＡＴＰアッセイを使用してアッセイした。１０ｍＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｒ）試薬を適切な量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ基質（製造元の説明書に従う；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）と混合し、そして混合物を１０分間平衡化させた。１００μＬのこの溶液をその後１００μＬの細胞含有培地と合わせ、そして該混合物を１０分間インキュベートさせた。ＣＣＤに基づくプレートリーダーを使用して発光を検出した。
【０１０１】
処理した細胞の細胞膜が完全性を失い、ＡＤＫが培地（若しくは生物学的サンプルの情況では細胞外空隙、血液など）に放出されるため、アデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）アッセイを選択した。９６ウェルプレートでＡＤＫアッセイを実施するため、各試験ウェル中で、細胞をペレットにするために短時間遠心分離した培地のアリコートからの２０μＬの上清を、たった今調製しかつ１５分間平衡化させた１００μＬのＡＤＫ試薬（製造元の説明書に従った２０ｍＬのＣａｍｂｒｅｘ ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ試薬および適切な量のＣａｍｂｒｅｘ ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ基質；Ｃａｍｂｒｅｘ Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州）と混合した。反応混合物をその後２分間インキュベートしてキナーゼ反応を起こさせた。サンプルからの発光をその後即座にプレートリーダーで読み取った。
【０１０２】
細胞生存率は、特定の細胞培養物の２０μＬのアリコートを、使用直前に１０倍希釈に希釈した１８０μＬのＧｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州ヘイワード）と混合することによってもまたアッセイした。各混合物をその後５分間インキュベートした。ＶｉａＣｏｕｎｔ細胞計数アッセイをその後、１，０００全細胞あたりの生細胞の数が測定されることを可能にするＧｕａｖａ ＰＣフローサイトメーターを使用して実施した。生対死細胞を、それらの劣化しつつある細胞膜を通って死んだ若しくは死につつある細胞に拡散し得る色素７ＡＡＤを使用して識別した。
【０１０３】
実施例１に記述されるとおり、ＰＡＲＰ（ポリ［ＡＤＰリボース］ポリメラーゼ）切断の迅速な誘導は、ＮＨＬ細胞でのベンダムスチン誘導性の細胞死の顕著な特徴である。最大のＰＡＲＰ切断は、５０μＭのＳＤＸ−１０５に約３０分程度曝露しかつ薬物ウォッシュアウト後さらに８時間インキュベートしたＳＵ−ＤＨＬ−１細胞で観察された。ＮＡＲＰ切断は、４０μＭホスホルアミドマスタード、４μＭクロラムブシル若しくは２μＭメルファランで類似の様式で３０分間処理した細胞で観察されなかった。使用した各薬物の濃度は、７２時間の薬物曝露後にＭＴＴ［臭化３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム］に基づくアッセイにより測定されるとおり、５０μＭベンダムスチンと比較した場合に等毒性濃度を表す。
【０１０４】
ＭＴＴアッセイを実施して多様な薬物の用量を滴定して、処理した細胞の５０％を死滅させるのに必要とされる有効濃度を決定した。これらのアッセイは９６ウェルプレートで実施した。濃度は最大５００μＭまでの範囲にわたった。各アッセイにおいて、対照は未処理細胞および死滅細胞を包含した。「ウォッシュアウト」実験で細胞を試験するのに使用するプレートについて、プレートを５分間遠心分離して細胞をペレットにした。培地をその後除去し、細胞ペレットを１×ＰＢＳで１回すすぎ、そしてその後新鮮培地に再懸濁した。細胞を、特定の投薬量の薬物とともに、５．０％ＣＯ２を含有する雰囲気中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に１０μＬのＭＴＴ（１２ｍＭ）試薬（新鮮培地に溶解し、濾過滅菌し、２〜８℃に保存した５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を各ウェルに添加した。４時間インキュベーション後に、１００μＬの溶解緩衝液（２０％ＳＤＳ、０．０１５Ｍ ＨＣｌ）を各ウェルに添加した。混合物を、５．０％ＣＯ２を含有する雰囲気中３７℃に一夜置いて細胞を溶解させた。翌朝、細胞溶解の程度を、５９５ｎｍでのマルチウェル走査分光光度計の示度を使用して測定した。
【０１０５】
匹敵する結果が、ヒト癌細胞株ＨＬ−６０を１００μＭベンダムスチン若しくは１２μＭクロラムブシルで処理することにより得られた。薬物への曝露の期間は３０分、１時間若しくは２．５時間であり、ここで、薬物を含有する培地は示される時間後に除去しかつ薬物を含有しない新鮮培地で置換した。
【０１０６】
一緒にすれば、これらの結果は、それを他の関連するアルキル化剤と識別する、癌細胞との短時間のインキュベーション後でさえ不可逆的細胞死経路を活性化するベンダムスチンの独特の能力を具体的に説明する。こうした即効性の細胞傷害性はベンダムスチンの強力な臨床活性を確認し、そして慣習的化学療法に難治性であるものを包含する多様な癌を処置するためにそれが有用であろうことを示す。
【実施例４】
【０１０７】
臨床データ
本研究は、再発したか若しくは以前の化学療法レジメンに難治性であるＭＨＬを伴う患者でのベンダムスチンの有効性および毒性を評価した。リツキシマブに難治性の患者は処置６か月以内に疾患の進行を有した。
【０１０８】
方法：本フェーズＩＩ多施設試験は、米国およびカナダの１７施設からの再発した低悪性度若しくは形質転換リツキシマブ難治性Ｂ細胞ＮＨＬを伴う患者を登録した。低悪性度の組織学的表現型が患者の８４％で見られた一方、１６％は形質転換疾患を有した。患者の年齢の中央値は６３歳（範囲：３８〜８４歳）であり、そして８８％がステージＩＩＩ／ＩＶの疾患を有した。患者は、２１日毎に６サイクルまで、第１および２日に３０〜６０分にわたるベンダムスチン１２０ｍｇ／ｍ２ ＩＶを受領した。国際作業部会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）の基準を使用して応答を測定した。
【０１０９】
結果：ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ（ＩＴＴ）集団は、２という以前の化学療法の中央値を伴う、７５例の重度に前処置された患者よりなった。ＩＴＴ集団における全体奏功率（ＯＲＲ）は７４％であり；２５％は完全奏功を有し、４９％は部分奏功を有し、１２％は安定を有し、そして１４％は進行を有した。以前のアルキル化剤処置に難治性であった１５例の患者（最低１回の以前のアルキル化剤含有治療後に進行した患者）のうち、１０例（６７％）がベンダムスチンに対する奏功を経験した。応答の持続期間の中央値は全患者について６．６か月、低悪性度患者について９．３か月、および形質転換患者について２．４か月であった。
【０１１０】
結論：単剤ベンダムスチンは、以前のアルキル化剤処置にもまた難治性であった患者を包含する、重度に前処置されたリツキシマブ難治性の低悪性度および形質転換ＮＨＬ患者において、不都合な予後の特徴にもかかわらず、許容できる毒性を伴い、耐えられる奏功を生じた。
【０１１１】
本発明は上の実施例に関して記述されたとは言え、改変および変形が本発明の技術思想および範囲内に包含されることが理解されるであろう。従って、本発明は付随する請求の範囲によってのみ制限される。
【０１１２】
本明細書に開示かつ特許請求される組成物および方法の全部は、本開示に照らして過度の実験を伴わずに作成および実施し得る。本発明の組成物および方法は好ましい態様に関して記述された一方、変形を、付随する請求の範囲により定義されるところの本発明の技術思想および範囲から離れることなく、本明細書に記述される組成物および方法に、ならびに該方法の段階若しくは段階の連続において適用しうることが当業者に明らかであろう。
【０１１３】
本明細で挙げられる全部の特許、特許出願および刊行物は、本発明の関する技術分野の当業者の水準を暗示する。優先権若しくは別の利益が特許請求されるものを包含する全部の特許、特許出願および刊行物は、各個々の刊行物が引用することに組み込まれることをとりわけかつ個々に示した場合と同一の程度まで、そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
本明細書に具体的に記述される本発明は、適しては本明細書にとりわけ開示されないいかなる要素（１種若しくは複数）の非存在下でも実施しうる。従って、例えば、本明細書の各例において、「含んでなる」、「より本質的になる」および「よりなる」という用語のいずれも、他の２用語のいずれかで置換されうる。使用された用語および表現は、記述の条件としてかつ制限の条件としてでなく使用され、そして、こうした用語および表現の使用において、示されかつ記述される特徴若しくはそれらの部分のいかなる同等物も排除
するという意図は存在しないが、しかし、特許請求される本発明の範囲内で多様な改変が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい態様および任意の特徴により具体的に開示されたとは言え、開示される本明細書の概念の改変および変形が当業者により行われうること、ならびにこうした改変および変形は付随する請求の範囲により定義されるところの本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】遺伝子発現プロファイルをそれぞれ示す２図ＡおよびＢを有する。該図は１２，０００種以上の既知遺伝子を含有するＡｆｆｙｍｅｔｉｘ遺伝子チップ（Ｕ１３３Ａ）を使用して非ホジキンリンパ腫細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−１で測定した遺伝子発現の変化を示す。ベンダムスチンはＩＣ５０（２５μＭ；レーン１）およびＩＣ９０（３５μＭ；レーン２）で試験した。クロラムブシル（５μＭ；レーン３）およびホスホルアミドマスタード（シクロホスファミド代謝物、５０μＭ；レーン４）はＩＣ９０で試験した。ｍＲＮＡの単離は曝露後８時間に実施した。Ａ．示されるクラスター図は対照（希釈剤、ＤＭＳＯ）に比較しての上位１００種の最も調節される遺伝子を表す。赤色は上方調節された遺伝子を表し；青色は下方制御された遺伝子を表す。Ｂ．該クラスター図は全３種の試験した薬物により同時に誘導される遺伝子を表す。
【図２】３個の棒グラフ２Ａ、２Ｂおよび２Ｃを有する。Ｑ−ＰＣＲ分析を、等毒性濃度のベンダムスチン、ホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシルに曝露したＳＵ−ＤＨＬ−１細胞で、下の方法の節に記述されるとおり実施した。入力ｃＤＮＡのレベルは１８ｓ ＲＮＡについてのアッセイを使用して正規化し、そして未処理サンプル中の転写物のレベルを１に設定した。図２Ａは、２種の代表的なｐ５３依存性遺伝子ｐ２１およびＮＯＸＡの相対的ＲＮＡレベルを示す。図２ＢはＭ期の細胞周期チェックポイントに関与する４種の遺伝子、すなわちｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）、ａｕｒｏｒａキナーゼＡおよびＢ、ならびにサイクリンＢ１のＲＮＡレベルを示す。図２ＣはＤＮＡ修復機構に関与する遺伝子ＥＸＯ１およびＦｅｎ１の相対的ＲＮＡレベルを示す。柱（ｃｏｌｕｍｎ）はＤＭＳＯ処理対照からの変化の倍数の平均±ＳＥを表す。結果は３回の独立した実験から得た。
【図３】ＮＨＬ細胞（ＳＵ−ＤＨＬ−１）でのシクロホスファミド（５０μＭ）およびクロラムブシル（４μＭ）に比較してのベンダムスチン（５０μＭ）のその高められたアポトーシス効果を示す数種のイムノブロットを示す。これらのイムノブロットを生成するため、細胞ライセートを、下の実験の節に記述されるとおり２０時間の曝露後に調製した。β−アクチンでのメンブレンのプロービングが負荷対照としてはたらき、そして調節されたタンパク質の下に示される。左上図は、リン酸化型特異的抗体を使用して検出された、Ｓｅｒ１５がリン酸化されたｐ５３の発現を表す。左中図は全ｐ５３およびｐ２１発現を示す。左下図はＢａｘの発現を表す。右図は、特異的カスパーゼ切断部位を認識する抗体を使用しての完全長ＰＡＲＰ（上）およびＰＡＰＰのカスパーゼ切断フラグメントの発現を示す。
【図４】選択されたＤＮＡ修復機構の機能分析を表す２グラフＡおよびＢよりなる。図４Ａは、ベンダムスチンが塩基除去修復（ＢＥＲ）を介するＤＮＡ損傷修復に至るがしかしシクロホスファミドは至らないことを示す。修復酵素Ａｐｅ−１（ベンダムスチンの細胞傷害活性においてＢＥＲ経路で決定的な役割を演じているプリン塩基のないエンドヌクレアーゼ）、およびシクロホスファミド代謝物ホスホルアミドマスタード（ＰＭ）の役割を、Ａｐｅ−１阻害剤メトキシアミン（ＭＸ）を使用して評価した。ベンダムスチンおよびＭＸで観察される曲線の左方移動は、ベンダムスチンにより生じられるＤＮＡ損傷がＢＥＲにより修復されることを示す。図４Ｂは、ＭＧＭＴ修復活性の阻害がベンダムスチンの細胞傷害性に影響を及ぼさないことを示す。ベンダムスチンの細胞傷害活性における修復酵素ＭＧＭＴ（Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）の役割を、ＭＧＭＴ阻害剤Ｏ６−ベンジルグアニン（Ｏ６−ＢＧ）を使用して評価した。Ｏ６−ベンジルグアニンの添加はベンダムスチンのＩＣ５０を有意に変化せず、従って、ベンダムスチンがＯ６−アルキルグアニンＤＮＡ付加物を誘導することはありそうにない。対照的に、Ｏ６−ベンジルグアニンは、カルムスチンおよびホスホルアミドマスタード（ＰＭ）のような他のナイトロジェンマスタードに対し細胞を大きく感作する。
【図５】ベンダムスチンが腫瘍細胞に効率的に進入し、かつ、最低３種のシグナル伝達経路、すなわち１）おそらくＮＯＸＡおよびＢａｘのような前アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーにより媒介される固有のアポトーシスの強い活性化をもたらす「正準」ｐ５３依存性ストレス経路の活性化；２）ＮＨＬ若しくはＣＬＬ患者で頻繁に使用される他のアルキル化剤により活性化されない塩基除去修復機構のようなＤＮＡ修復機構の活性化；ならびに３）キナーゼＰＬＫ−１ならびにＡｕｒｏｒａ ＡおよびＢのような数種の有糸分裂チェックポイントの阻害の開始をもたらす、長期のかつ広範囲のＤＮＡ損傷を誘導することを具体的に説明する。特定の論理に束縛されることを願わない一方、ＤＮＡ損傷の同時の誘導および有糸分裂チェックポイントの阻害が、おそらく、ベンダムスチンに曝露された腫瘍細胞が有糸分裂を受ける前にＤＮＡ損傷を効率的に修復することを予防する。細胞は従って損傷されたＤＮＡを伴い有糸分裂に進入するか、若しくは「慣習的」ｐ５３依存性アポトーシスに進行し得ない細胞が、細胞分裂異常による死を受けることができる。この代替のプログラムされた細胞死経路は、伝統的なアポトーシスの強い活性化と一緒になって、ベンダムスチンがｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬剤耐性癌細胞の死滅においてならびに化学難治性腫瘍を有する患者において非常に有効である理由であると考えられる。
【図６】下の実施例３に記述される「ウォッシュアウト」実験のいくつかの経過で実施したアデニル酸キナーゼアッセイの結果を示すヒストグラムである。これらの実験において、ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞を５０μＭベンダムスチン、２０μＭホスホルアミドマスタード若しくは２μＭクロラムブシルのいずれかで３０、６０若しくは９０分間のいずれか処理した。調時的薬物インキュベーション後に、細胞を１×ＰＢＳで洗浄して特定の化学療法剤を「洗い流し」、そしてその後新鮮培地を添加した。細胞をその後４８時間培養し、その時間の後にアデニル酸キナーゼアッセイを細胞上清で実施した。桃色の棒は０分の薬物（すなわち薬物なし）インキュベーションを表す。緑色の棒は３０分のインキュベーションを表し、橙色の棒は６０分のインキュベーションを表し、そして紫色の棒は１２０分のインキュベーションを表す。該結果は、３種の薬物および「薬物なし」対照に対する上清中のアデニル酸キナーゼ活性のレベルをプロットする。標準偏差を該グラフの各棒の上部に表す。
【図７】図６のように、下の実施例３に記述される「ウォッシュアウト」実験のいくつかの経過で実施したアデニル酸キナーゼアッセイの結果を示すヒストグラムである。図６および７に描かれる結果間の差違は、図６に表されるデータが、薬物のそれぞれが培養物から「洗い流された」後の４８時間の細胞培養に関する一方、図７のデータは特定の薬物を「洗い流した」後の７２時間の細胞培養に関することである。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概括的には、癌、とりわけ薬物誘発性アポトーシスに抵抗性の癌の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．はじめに。
本出願は、以下の米国仮出願、すなわち“Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ（癌処置）“と題されかつ２００４年１１月５日出願の第６０／６２５，１９３号；および“Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ（癌処置）”と題されかつ２００５年３月１０日出願の第６０／６６０，２６６号のそれぞれの利益およびそれらに対する優先権を主張する。これらの出願のそれぞれは、図、表および請求の範囲を包含するそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０００３】
以下の記述は本発明の理解において有用でありうる情報を包含する。それは、いかなるこうした情報も本特許請求される発明に対する従来技術であるか若しくはそれに関すること、または、明示的若しくは黙示的に参照されるいかなる刊行物も従来技術であることの承認ではない。
【０００４】
２．背景。
癌は現在米国で第二位の死因であり、そして米国の８百万を超える人が癌と診断されている。１９９５年には、癌は米国の全死亡の２３．３％を占めた。非特許文献１を参照されたい。
【０００５】
癌は分子レベルで完全に理解されてはいない。ある種のウイルス、ある種の化学物質若しくは放射のような発癌物質への細胞の曝露が、「抑制」遺伝子を不活性化若しくは「癌遺伝子」を活性化するＤＮＡ変化につながることが既知である。抑制遺伝子は増殖調節遺伝子であり、突然変異に際してもはや細胞増殖を制御し得ない。癌遺伝子は当初は正常遺伝子（癌原遺伝子と呼ばれる）であり、突然変異若しくは変えられた発現情況によりトランスフォーミング遺伝子となる。トランスフォーミング遺伝子の産物は不適切な細胞増殖を引き起こす。２０種以上の異なる正常な細胞遺伝子が、遺伝子変化により癌遺伝子になり得る。形質転換された細胞は、細胞形態学、細胞と細胞の相互作用、膜内容物、細胞骨格構造、タンパク質分泌、遺伝子発現および死亡率を包含する多くの方法で正常細胞と異なる（形質転換された細胞は無制限に増殖し得る）。
【０００６】
新生物すなわち腫瘍は細胞成長（ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ）の異常な調節されないかつ無秩序の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）であり、そして一般に癌と称される。新生物は、それが破壊的増殖、侵襲性および転移性の特性を有する場合に悪性すなわち癌性である。侵襲性は、典型的に組織の境界を規定する基底層を突き破りそれによりしばしば身体の循環系に進入する、浸潤すなわち周囲組織の破壊による新生物の局所拡延を指す。転移は、典型的には、リンパ若しくは血管による腫瘍細胞の播種を指す。転移はまた、漿膜腔またはクモ膜下若しくは他の空隙を通る直接拡張による腫瘍細胞の移動も指す。転移の過程により、身体の他領域への腫瘍細胞移動は最初の出現の部位から離れた領域に新生物を確立する。
【０００７】
癌は今や、主として３種の型の治療法すなわち外科手術；放射線；および化学療法の１種若しくは組合せで処置される。外科手術は病的組織の大量除去を伴う。外科手術はある部位、例えば乳房、結腸および皮膚に位置する腫瘍の除去においてときに有効である一方
、それは脊柱のような他領域に位置する腫瘍の処置でも、白血病のような播種性腫瘍状態の処置にも使用し得ない。放射線治療は、曝露された細胞に対する死若しくは損傷を引き起こすイオン化放射への生存組織の曝露を伴う。放射線治療からの副作用は急性かつ一時的でありうる一方、他者は不可逆的でありうる。化学療法は細胞複製若しくは細胞代謝の破壊を伴う。それは最もしばしば乳房、肺および精巣癌の処置で使用される。
【０００８】
腫瘍性疾患の処置で使用される全身性化学療法の副作用は、癌の処置を受ける患者により最も恐れられる。これらの副作用のうち、吐き気および嘔吐が最も一般的である。他の有害な副作用は、骨髄レスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）若しくは放射線治療を伴う高用量の化学療法を受領する患者における血球減少、感染症、悪液質、粘膜炎；脱毛症（脱毛）；掻痒症、蕁麻疹および血管浮腫のような皮膚合併症；神経学的合併症；肺および心の合併症；ならびに生殖器および内分泌の合併症を包含する。化学療法誘発性の副作用は患者の生活の質に重大な影響を与え、そして処置への患者コンプライアンスに劇的に影響しうる。であるから、改良された処置方法が必要とされる。
【０００９】
３．定義。
「アルキル化剤」は、ＤＮＡを化学的に修飾しかつその機能を破壊する化学療法化合物を指す。数種のアルキル化剤は、二本鎖ＤＮＡ分子の同一鎖若しくは相補鎖上のヌクレオチド間の架橋の形成を引き起こす一方、なお他者はＤＮＡ鎖間の塩基対不適正を引き起こす。例示的アルキル化剤は、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパおよびトリエチレンメラミンを包含する。
【００１０】
「代謝拮抗剤」は、ＤＮＡを合成するのに必要とされる、ＤＮＡ合成に必要とされるもの（例えばヌクレオシドおよびヌクレオチド）を包含する生体分子の合成を妨害する化学療法剤を指す。代謝拮抗剤の例は、カペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（およびその活性化型ａｒａ−ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、ダカバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサートおよび６−チオグアニンを包含する。
【００１１】
「抗分裂剤」は、典型的には微小管形成の破壊により有糸分裂を妨害する化学療法剤を指す。抗有糸分裂化合物の例は、ナベルビン、パクリタキセル、タキソテール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを包含する。
【００１２】
本発明の情況において、「化学療法剤」は悪性細胞および組織を破壊することを意図している化学物質を指す。化学療法剤は、癌若しくは他の悪性病変を予防若しくは処置するために患者に投与される場合に抗腫瘍効果を有する小分子、核酸（例えばアンチセンス分子、リボザイム、小分子干渉ＲＮＡ分子など）ならびにタンパク質（例えば抗体、抗体フラグメント、サイトカイン、酵素およびペプチドホルモン）を包含する。化学療法剤は、しばしば作用機序に基づき分類に分割される（例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤および抗分裂剤）。
【００１３】
「併用療法」という用語は、示される治療効果を達成するために最低２種の別個の療法の規定を伴う治療レジメンを指す。例えば、併用療法は２種若しくはそれ以上の化学的に別個の有効成分、例えば速効性の化学療法剤および骨髄保護剤の投与を伴いうる。あるいは、併用療法は、１種若しくはそれ以上の化学療法剤の投与、ならびに放射線治療および
／あるいは外科手術または患者の生活の質を向上させるか若しくは癌を処置するかのいずれかのための他の技術を伴いうる。２種若しくはそれ以上の化学的に別個の有効成分の投与の情況において、有効成分を同一組成物の一部として若しくは異なる組成物として投与しうることが理解される。別個の組成物として投与される場合、異なる有効成分を含んでなる組成物は、同一若しくは異なる時点で、同一若しくは異なる経路により、同一若しくは異なる投薬レジメンを使用して、全部特定の情況が必要とするとおりかつ主治医により決定されるとおり投与しうる。同様に、１種若しくはそれ以上の化学療法剤が例えば放射線および／若しくは外科手術と組合せられる場合、該薬物（１種若しくは複数）は外科手術若しくは放射線治療の前若しくは後に送達しうる。
【００１４】
「挿入剤」は、二本鎖ＤＮＡ分子の隣接塩基対間にそれ自身を挿入してＤＮＡ構造を破壊しかつＤＮＡ複製、遺伝子転写および／若しくはＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡへの結合を妨害する化学療法剤を指す。
【００１５】
「単剤療法」は、単一用量として投与されるにしろ若しくは長時間にわたり数個の用量で投与されるにしろ、１種の治療上有効な化合物の送達に基づく処置レジメンを指す。
【００１６】
医薬品の商品化の情況において、「販促」、「販促する」、「販促すること」などの用語は、特定の製薬学的化合物、組成物若しくは処置レジメンの処方、供給、購入および／若しくは使用を誘導することを直接若しくは間接的に意図している、該化合物、組成物若しくは処置レジメンの発見、研究、開発および／若しくは商品化に関与する製造元、供給元若しくは他の実体により若しくはその代わりに実施されるいかなるおよび全部の情報、説得および学術的活動を指す。こうした活動は、限定されるものでないが医学専門家（例えば医師および看護師）、薬剤師、医療管理者、保険会社若しくは政府の代表者ならびに患者（潜在的患者を包含する）を挙げることができる、供給および配布の連鎖にある何人にも向けられうる。言い換えれば、販促の主目的は、特定の製薬学的化合物、組成物若しくは処置レジメンの販売若しくは使用、および／またはそれにおける利益を刺激することであり、そして、従って、この目的にかなうことを意図しているいかなる活動も、該特定の製薬学的化合物、組成物若しくは処置レジメンの「販促」を構成する。
【００１７】
本発明の「特許可能な」組成物、方法、機械若しくは製品は、該分析が実施される時点で特許可能性に対する全部の法定の要件を主題が満たすことを意味している。例えば、新規性、非自明性などに関して、１個若しくはそれ以上の請求項が新規性、非自明性などを無効にするとみられる１個若しくはそれ以上の態様を包含することを後の調査が示す場合、「特許可能な」態様への明確な限定により制限される該請求項（１個若しくは複数）は、特許不可能な態様（１個若しくは複数）を特別に排除する。また、それに付随する請求項は、最も広範な合理的な範囲を提供しならびにそれらの妥当性を保存するの双方のように解釈されるべきである。さらに、特許性に対する法定の要件の１個若しくはそれ以上が改正される場合、または、特許性に対する特定の法定の要件が、本出願が出願されるか若しくは特許として発行される時点から、付随する請求の範囲の１個若しくはそれ以上の妥当性が疑問視される時点まで満足されているかどうかを評価するため標準が変わる場合、請求の範囲は、（１）それらの妥当性を保存しかつ（２）該環境下で最も広範な合理的な解釈を提供する方法で解釈されるべきである。
【００１８】
「製薬学的に許容できる塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性および特性を保持しかつ生物学的に若しくは別の方法で望ましくなくない塩を指す。多くの場合、本発明の化合物は、アミノおよび／若しくはカルボキシル基またはそれに類似の基の存在によって酸および／若しくは塩基塩を形成することが可能である。製薬学的に許容できる酸付加塩は無機および有機酸から製造しうる一方、製薬学的に許容できる塩基付加塩は無機および有機塩基から製造し得る。製薬学的に許容できる塩の総説については、非特許文
献２を参照されたい。「非毒性の製薬学的に許容できる塩」という表現は、非毒性の製薬学的に許容できる無機若しくは有機酸または無機若しくは有機塩基と形成される非毒性の塩を指す。例えば、塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などのような無機酸由来のもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、フマル酸、メタンスルホン酸およびトルエンスルホン酸などのような有機酸から製造される塩を包含する。塩はまたアンモニア、ヒドロキシエチルアミンおよびヒドラジンのような無機塩基からのものも包含する。適する有機塩基は、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルチルアミン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、ヒドロキシエチルアミン、モルホリン、ピペラジンおよびグアニジンを包含する。
【００１９】
「複数の」は１以上を意味している。
【００２０】
「リツキシマブ難治性」という用語は、リツキシマブでの、しかし医師若しくは処置する専門家により決定されるところの単剤として若しくは組合せでのいずれかで与えられるリツキシマブ治療に難治性の疾患（リツキシマブ処置完了６か月以内に応答なし若しくは進行と定義される）、および／またはさらなる処置を保証されないようにする前のリツキシマブ治療に対する予期しない反応によりさらなる処置に不適切な、前の処置を意味している。
【００２１】
「抗ＣＤ２０難治性」という用語は、ＣＤ２０抗原と相互作用する剤での、しかし医師若しくは処置する専門家により決定されるところの単剤として若しくは組合せでのいずれかで与えられる抗ＣＤ２０剤に難治性の疾患（抗ＣＤ２０剤処置完了６か月以内に応答なし若しくは進行と定義される）、および／若しくはさらなる処置を保証されないようにする前の抗ＣＤ２０治療に対する予期しない反応によりさらなる処置に不適切な、前の処置を意味している。
【００２２】
細胞周期の「Ｓ期」は染色体が複製される期を指す。
【００２３】
「種」という用語は多様な文脈で本明細書で使用される（例えば化学療法剤の特定の１種）。各情況において、該用語は、該特定の情況で言及される種類の化学的に不明瞭な分子の一集団を指す。
【００２４】
「被験体」若しくは「患者」という用語は、本発明の分子により遂げられ得る処置の必要な動物を指す。本発明により処置し得る動物は脊椎動物を包含し、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタならびに霊長類（ヒトおよびヒト以外の霊長類を包含する）動物のような哺乳類がとりわけ好ましい例である。
【００２５】
「治療上有効な量」は、こうした処置の必要な被験体に投与される場合に処置を遂げるのに十分な有効成分の量を指す。癌治療の情況において、「治療上有効な量」は、特定の癌と相互に関連づけられる１種若しくはそれ以上の遺伝子の発現の増大若しくは減少、腫瘍量の減少、癌細胞溶解、生物学的サンプル（例えば生検、および全血、血漿、血清、尿などのような体液のアリコート）中の１種若しくはそれ以上の癌細胞死マーカーの検出、誘導アポトーシス若しくは他の細胞死経路の誘導などを包含する、癌細胞の生存若しくは代謝と関連する１種若しくはそれ以上のパラメータの客観的に測定される変化を生じるものである。もちろん、治療上有効な量は、処置されている特定の被験体および状態、被験体の重量および齢、疾患状態の重症度、選ばれる特定の化合物、従われるべき投薬レジメン、投与のタイミング、投与様式などに依存して変動することができ、それらの全部は当
業者により容易に決定され得る。併用療法の情況において、特定の１有効成分の治療上有効な量を構成するものは、単剤療法（すなわち有効成分として１種のみの化学的実体を使用する治療レジメン）として投与される場合の該有効成分の治療上有効な量を構成するものと異なりうることが認識されるであろう。
【００２６】
「処置」若しくは「処置すること」という用語は、疾患若しくは障害に対し予防若しくは保護すること（すなわち臨床症状を発生させないこと）；疾患若しくは障害を阻害すること（すなわち臨床症状の発症を停止若しくは抑制すること）；および／または疾患若しくは障害を緩和すること（すなわち臨床症状の退縮を引き起こすこと）を包含する、疾患若しくは障害のいかなる処置も意味している。認識されるであろうとおり、究極の誘導事象（１種若しくは複数）は未知のことも若しくは潜在的なこともあるため、疾患若しくは障害を「予防すること」と「抑制すること」を識別することは常に可能なわけではない。従って、「予防」という用語は、「予防すること」および「抑制すること」双方を包含するある型の「処置」を構成することが理解されるであろう。「保護」という用語は従って「予防」を包含する。
【非特許文献１】Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｕｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ｈｅａｌｔｈ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ １９９６−１９９７ ａｎｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｃｈａｒｔｂｏｏｋ １１７（１９９７）
【非特許文献２】Ｂｅｒｇｅら（（１９９７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、ｖｏｌ．６６、１）
【発明の開示】
【００２７】
［発明の要約］
本発明の一目的は、単独または他の化合物および／若しくは処置とともに癌細胞で細胞分裂異常を誘発する化合物（例えばベンダムスチン）の投与による、死抵抗性癌細胞（ｄｅａｔｈ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ）を特徴とする癌の特許可能な処置方法を提供することである。好ましい態様において、これらの方法は、患者が死抵抗性癌細胞を特徴とする癌を有するかどうかを決定すること、およびその場合にその後該患者に治療上有効な量のベンダムスチンを投与することを伴う。本発明のなお別の目的は、癌治療の投与の間若しくは後の１若しくはそれ以上の期間に患者から採取した生物学的サンプル中の癌細胞死マーカーの検出に基づく癌処置の有効性の評価方法に関する。
【００２８】
従って、本発明の一局面は、その癌が、死抵抗性癌細胞、すなわちアポトーシス若しくは他のプログラムされた細胞死経路に抵抗する癌細胞、ならびに例えば単独の若しくは抗ＣＤ２０剤、例えばリツキシマブとともにの１種若しくはそれ以上のアルキル化剤の投与により誘発されうるところの多剤耐性（ＭＤＲ）を表す細胞を特徴とする癌患者の特許可能な処置方法に関する。これらの方法は、死抵抗性癌細胞で細胞分裂異常を誘導する治療上有効な量の化合物を患者に投与することを含んでなる。こうした細胞は薬物誘発性アポトーシスに抵抗性であるものを包含する。こうした細胞の例は、典型的にはｐ５３をコードする遺伝子中の若しくはその欠失を包含するその突然変異の結果としてｐ５３欠損を有するものを包含する。こうした癌の代表例は、非ホジキンリンパ腫（「ＮＨＬ」）および慢性リンパ球性白血病（「ＣＬＬ」）を包含する。細胞分裂異常を誘導するためのとりわけ好ましい一化合物はアルキル化剤ベンダムスチンである。従って、関連する一局面は、特定の癌の細胞の死抵抗性癌細胞としての特徴付け、次いで、単独で若しくは他の化学療法剤、佐剤、外科手術および／若しくは放射線とともにのこうした細胞で細胞分裂異常を誘導する化合物（例えばベンダムスチン）での処置を伴う処置方法に関する。加えて、こうした処置レジメンの有効性をモニターして、該特定の単剤療法若しくは併用療法処置が所望の効果を達成しているかどうかを評価し得る。
【００２９】
本発明の別の局面は、癌、とりわけ死抵抗性癌細胞を特徴とする癌のある種の関連する特許可能な処置方法に関する。これらの方法は、癌を含んでなる細胞の少なくとも一部分が細胞周期のＳ期にある時点での治療上有効な量の化合物の患者への投与を含んでなる。いくつかの態様において、患者の癌細胞の少なくとも一部分が、Ｓ期に細胞を駆動する化合物を患者に投与することの結果としてＳ期に駆動される。ベンダムスチンは癌細胞をＳ期に駆動するためのとりわけ好ましい化合物である。ベンダムスチンは癌細胞をＳ期に駆動することにおいて有用であるため、付加的な好ましい態様は、より活性である（すなわち、細胞が細胞周期のＳ期にある場合により大きな治療効果、例えば細胞傷害性を発揮する）１種若しくはそれ以上の他の化学療法剤種のその後の投与を伴う。こうした方法において、１種若しくはそれ以上の化学療法剤のその後の投与は、好ましくはベンダムスチン投与後最低約１０分、および好ましくは最低約３０ないし約６０分若しくはそれ以上に起こるとは言え、こうした他の剤（１種若しくは複数）の投与はベンダムスチンが投与された後約７２時間、好ましくは約４８時間若しくはそれ未満以内に起こることが好ましい。これらの好ましい態様のいくつかにおいて、他の化学療法剤（１種若しくは複数）は、ベンダムスチンの投与後約３０分ないし約３６時間以内、好ましくはベンダムスチンの投与後約３０分ないし２４時間以内、およびいくつかの場合にはベンダムスチンの投与後約３０分ないし６ないし約１２時間以内に与えられる。関連する方法は癌治療に伴う毒性を低下させることを伴う。こうした方法は、癌患者に治療上有効な量のベンダムスチンの複数の用量を投与することを含んでなる。第一の用量はおそらく望ましくない毒性をもたらすであろう。こうした場合に、第二のもの（若しくは他のその後の用量）の投与を、該望ましくない毒性が弱まり始めた後まで遅らせうる。いくつかの場合には、異なる時点で投与されるベンダムスチンの用量もまた変動しうる。
【００３０】
本発明のなお別の局面は、従って、それが単剤療法であろうと若しくは併用療法であろうと、処置の経過中若しくはその完了後のいずれかのアルキル化剤（例えばベンダムスチン）の投与に基づく癌処置の有効性の特許可能な評価方法に関する。１種のアルキル化剤（例えばベンダムスチン）の投与を伴う治療レジメンの投与後に該評価を実施する場合、好ましくは、アルキル化剤がその意図される若しくは所望の治療効果を発揮し得るように十分な期間を経過させる。こうした方法において、処置の有効性と相関する癌細胞死のマーカー（すなわち、死につつある若しくは死んだ癌細胞により産生若しくはそれらにより放出される分子（例えばタンパク質、炭水化物、脂質、核酸若しくは他の分子）、ならびに細胞生存能力の欠如、増殖することの不能、老化などのような表現型）を、患者から得た生物学的サンプル中で検出して、での処置が有効であったかどうかを決定する。細胞死の好ましいマーカーは、アデニル酸キナーゼ活性レベル、ＰＡＲＰ切断生成物のレベルおよび低下された細胞生存率を包含する。マーカーに依存して、こうした検出は定性的、半定量的若しくは定量的でありうる。検出されるマーカーの存在若しくはレベルは、該処置が有効であるかもしくはあったかどうかを示す。
【００３１】
本発明のなお別の局面において、本発明は、１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤（例えばリツキシマブ）に抵抗性すなわち難治性の癌を有する患者にベンダムスチンを投与することに基づく癌の処置に関する。好ましくは、これらの方法は死抵抗性癌細胞を特徴とする癌に対し配備される。本発明の関連する一局面は、難治性癌すなわち死抵抗性癌細胞を特徴とする癌、とりわけ１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤、例えばリツキシマブの組合せでの処置に難治性の癌を処置するためのベンダムスチン使用を販促することを伴う、こうした癌の処置における事業の実施方法に関する。なお別の局面は、患者の癌がベンダムスチン処置の影響を受けやすいかどうかに関する。認識されるであろうとおり、ベンダムスチン感受性のいかなる適する評価も使用し得る。これらの方法のいくつかの好ましい態様において、患者から採取した癌組織からの細胞サンプルの若干若しくは全部を、癌細胞に対し毒性である化合物の非存在下で該癌細胞を増殖させる増殖条件下でベンダムスチンに曝露する。感受性の評価をその後、該アッ
セイの結果に基づき行う。例えば、対照と比較しての低下された増殖は、該細胞およびこれゆえに該患者の癌がベンダムスチンに基づく治療に感受性であることを示すとみられる。対照的に、に対する影響なし（若しくは高められた増殖）は感受性の欠如を示すとみられる。
【００３２】
本発明のなお別の局面は、死抵抗性癌細胞を特徴とする癌の処置、すなわち難治性の癌、とりわけ１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤、例えばリツキシマブの組合せでの処置に難治性の癌の処置のための医薬品の製造におけるベンダムスチンの使用に関する。好ましくは、こうした医薬品は治療上有効な量のベンダムスチンを包含する。
【００３３】
［図面の簡単な説明］
本特許出願はカラーで作成された最低１個の図を含有する。カラー図面（１個若しくは複数）を伴う本特許出願の複写は要求および必要な料金の支払いに際して提供されることができる。
【００３４】
図１は、遺伝子発現プロファイルをそれぞれ示す２図ＡおよびＢを有する。該図は１２，０００種以上の既知遺伝子を含有するＡｆｆｙｍｅｔｉｘ遺伝子チップ（Ｕ１３３Ａ）を使用して非ホジキンリンパ腫細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−１で測定した遺伝子発現の変化を示す。ベンダムスチンはＩＣ５０（２５μＭ；レーン１）およびＩＣ９０（３５μＭ；レーン２）で試験した。クロラムブシル（５μＭ；レーン３）およびホスホルアミドマスタード（シクロホスファミド代謝物、５０μＭ；レーン４）はＩＣ９０で試験した。ｍＲＮＡの単離は曝露後８時間に実施した。Ａ．示されるクラスター図は対照（希釈剤、ＤＭＳＯ）に比較しての上位１００種の最も調節される遺伝子を表す。赤色は上方調節された遺伝子を表し；青色は下方制御された遺伝子を表す。Ｂ．該クラスター図は全３種の試験した薬物により同時に誘導される遺伝子を表す。
図２は、３個の棒グラフ２Ａ、２Ｂおよび２Ｃを有する。Ｑ−ＰＣＲ分析を、等毒性濃度のベンダムスチン、ホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシルに曝露したＳＵ−ＤＨＬ−１細胞で、下の方法の節に記述されるとおり実施した。入力ｃＤＮＡのレベルは１８ｓ ＲＮＡについてのアッセイを使用して正規化し、そして未処理サンプル中の転写物のレベルを１に設定した。図２Ａは、２種の代表的なｐ５３依存性遺伝子ｐ２１およびＮＯＸＡの相対的ＲＮＡレベルを示す。図２ＢはＭ期の細胞周期チェックポイントに関与する４種の遺伝子、すなわちｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）、ａｕｒｏｒａキナーゼＡおよびＢ、ならびにサイクリンＢ１のＲＮＡレベルを示す。図２ＣはＤＮＡ修復機構に関与する遺伝子ＥＸＯ１およびＦｅｎ１の相対的ＲＮＡレベルを示す。柱（ｃｏｌｕｍｎ）はＤＭＳＯ処理対照からの変化の倍数の平均±ＳＥを表す。結果は３回の独立した実験から得た。
図３は、ＮＨＬ細胞（ＳＵ−ＤＨＬ−１）でのシクロホスファミド（５０μＭ）およびクロラムブシル（４μＭ）に比較してのベンダムスチン（５０μＭ）のその高められたアポトーシス効果を示す数種のイムノブロットを示す。これらのイムノブロットを生成するため、細胞ライセートを、下の実験の節に記述されるとおり２０時間の曝露後に調製した。β−アクチンでのメンブレンのプロービングが負荷対照としてはたらき、そして調節されたタンパク質の下に示される。左上図は、リン酸化型特異的抗体を使用して検出された、Ｓｅｒ１５がリン酸化されたｐ５３の発現を表す。左中図は全ｐ５３およびｐ２１発現を示す。左下図はＢａｘの発現を表す。右図は、特異的カスパーゼ切断部位を認識する抗体を使用しての完全長ＰＡＲＰ（上）およびＰＡＰＰのカスパーゼ切断フラグメントの発現を示す。
図４は、選択されたＤＮＡ修復機構の機能分析を表す２グラフＡおよびＢよりなる。図４Ａは、ベンダムスチンが塩基除去修復（ＢＥＲ）を介するＤＮＡ損傷修復に至るがしかしシクロホスファミドは至らないことを示す。修復酵素Ａｐｅ−１（ベンダムスチンの細胞傷害活性においてＢＥＲ経路で決定的な役割を演じているプリン塩基のないエンドヌクレアーゼ）、およびシクロホスファミド代謝物ホスホルアミドマスタード（ＰＭ）の役割を、Ａｐｅ−１阻害剤メトキシアミン（ＭＸ）を使用して評価した。ベンダムスチンおよびＭＸで観察される曲線の左方移動は、ベンダムスチンにより生じられるＤＮＡ損傷がＢＥＲにより修復されることを示す。図４Ｂは、ＭＧＭＴ修復活性の阻害がベンダムスチンの細胞傷害性に影響を及ぼさないことを示す。ベンダムスチンの細胞傷害活性における修復酵素ＭＧＭＴ（Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）の役割を、ＭＧＭＴ阻害剤Ｏ６−ベンジルグアニン（Ｏ６−ＢＧ）を使用して評価した。Ｏ６−ベンジルグアニンの添加はベンダムスチンのＩＣ５０を有意に変化せず、従って、ベンダムスチンがＯ６−アルキルグアニンＤＮＡ付加物を誘導することはありそうにない。対照的に、Ｏ６−ベンジルグアニンは、カルムスチンおよびホスホルアミドマスタード（ＰＭ）のような他のナイトロジェンマスタードに対し細胞を大きく感作する。
図５は、ベンダムスチンが腫瘍細胞に効率的に進入し、かつ、最低３種のシグナル伝達経路、すなわち１）おそらくＮＯＸＡおよびＢａｘのような前アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーにより媒介される固有のアポトーシスの強い活性化をもたらす「正準」ｐ５３依存性ストレス経路の活性化；２）ＮＨＬ若しくはＣＬＬ患者で頻繁に使用される他のアルキル化剤により活性化されない塩基除去修復機構のようなＤＮＡ修復機構の活性化；ならびに３）キナーゼＰＬＫ−１ならびにＡｕｒｏｒａ ＡおよびＢのような数種の有糸分裂チェックポイントの阻害の開始をもたらす、長期のかつ広範囲のＤＮＡ損傷を誘導することを具体的に説明する。特定の論理に束縛されることを願わない一方、ＤＮＡ損傷の同時の誘導および有糸分裂チェックポイントの阻害が、おそらく、ベンダムスチンに曝露された腫瘍細胞が有糸分裂を受ける前にＤＮＡ損傷を効率的に修復することを予防する。細胞は従って損傷されたＤＮＡを伴い有糸分裂に進入するか、若しくは「慣習的」ｐ５３依存性アポトーシスに進行し得ない細胞が、細胞分裂異常による死を受けることができる。この代替のプログラムされた細胞死経路は、伝統的なアポトーシスの強い活性化と一緒になって、ベンダムスチンがｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬剤耐性癌細胞の死滅においてならびに化学難治性腫瘍を有する患者において非常に有効である理由であると考えられる。
図６は、下の実施例３に記述される「ウォッシュアウト」実験のいくつかの経過で実施したアデニル酸キナーゼアッセイの結果を示すヒストグラムである。これらの実験において、ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞を５０μＭベンダムスチン、２０μＭホスホルアミドマスタード若しくは２μＭクロラムブシルのいずれかで３０、６０若しくは９０分間のいずれか処理した。調時的薬物インキュベーション後に、細胞を１×ＰＢＳで洗浄して特定の化学療法剤を「洗い流し」、そしてその後新鮮培地を添加した。細胞をその後４８時間培養し、その時間の後にアデニル酸キナーゼアッセイを細胞上清で実施した。桃色の棒は０分の薬物（すなわち薬物なし）インキュベーションを表す。緑色の棒は３０分のインキュベーションを表し、橙色の棒は６０分のインキュベーションを表し、そして紫色の棒は１２０分のインキュベーションを表す。該結果は、３種の薬物および「薬物なし」対照に対する上清中のアデニル酸キナーゼ活性のレベルをプロットする。標準偏差を該グラフの各棒の上部に表す。
図７は、図６のように、下の実施例３に記述される「ウォッシュアウト」実験のいくつかの経過で実施したアデニル酸キナーゼアッセイの結果を示すヒストグラムである。図６および７に描かれる結果間の差違は、図６に表されるデータが、薬物のそれぞれが培養物から「洗い流された」後の４８時間の細胞培養に関する一方、図７のデータは特定の薬物を「洗い流した」後の７２時間の細胞培養に関することである。
【００３５】
当業者が認識するであろうとおり、以下の記述は本発明のある好ましい態様を詳細に記述し、そして従って代表的にすぎず、そして本発明の実際の範囲を描かない。本発明を詳細に記述する前に、本発明は記述される特定の分子、系、および方法論に制限されないことが理解される。これらは変動しうるためである。本明細書で使用される用語法は特定の態様のみを記述する目的上であり、そして付随する請求の範囲により定義される本発明の範囲を制限することを意図していないこともまた理解されるべきである。
【００３６】
［発明の詳細な記述］
本発明は、アルキル化剤ベンダムスチンが、慣習的化学療法レジメンに難治性のものを包含する多数の癌細胞型に対し非常に迅速な細胞傷害効果を発揮するという驚くべき発見に基づく。ベンダムスチンは、下に詳述されるとおり、他の抗癌剤に比較して別個の作用様式によりその毒性効果を発揮することもまた発見された。
【００３７】
ベンダムスチンすなわち４−｛５−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−メチル−２−ベンズイミダゾリル｝はナイトロジェンマスタードの分類の化学療法剤である。ベンダムスチンは主としてアルキル化活性を表す。すなわちそれはＤＮＡ損傷剤である。ヒトに（典型的にはボーラス静脈内注入により）投与される場合、ベンダムスチンは短い血清半減期（約２時間）を有する。従ってそれは患者の身体から迅速に消失される。驚くべきことに、細胞取り込み後にベンダムスチンはその永続的な細胞傷害効果を迅速に発揮することが発見された。事実、下の実施例３に報告されるとおり、該化合物の細胞傷害効果の大半は、癌細胞を該剤に約３０分と同じくらい短い間曝露することに際して発揮される。
【００３８】
ベンダムスチン処置の現在のプロトコルは、典型的に、それぞれ同等量のベンダムスチンを含有する３回の別個のボーラス静脈内注入の送達を必要とする。第二の注入は一般に第一の注入の１日後、次いで第三の注入は第一の注入の３週後に与える。本レジメンは、骨髄抑制を包含するベンダムスチン処置に関する毒性に起因して使用された。ベンダムスチンの短い血清半減期およびその速効性を考えれば、薬物関連の毒性は、第二およびその後の投与を遅らせることにより低減し得る。事実、広範囲のかつおそらく致死的な腫瘍溶解が非ホジキンリンパ腫のベンダムスチン処置に関してときに報告されているため、薬物の複数回投与のより大きな間隔を空けることが腫瘍溶解の発生を低下させるのに役立つ。不必要な毒性を低減させることに加え、特定の処置レジメンでのベンダムスチン投与のより大きな間隔を空けることは、治療濃度期間（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）、すなわち薬物がその意図される治療上の利益を発揮している期間を増大させるのにもまた役立つことができる。
【００３９】
本発明の実務で使用される組成物（１種若しくは複数）は、ヒトおよび他の哺乳動物を包含する被験体への投与、すなわちそれぞれ「製薬学的」および「獣医学」投与のための薬剤（すなわち医薬品若しくは治療的組成物）を製造するための製薬学的調合技術の慣習的方法に従って加工しうる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、フィラデルフィア州イーストン）の最新版を参照されたい。典型的には、ベンダムスチンのような化合物は、組成物として製薬学的に許容できる担体と組み合わせられる。組成物（１種若しくは複数）はまた、以下、すなわち保存剤；可溶化剤；安定剤；湿潤剤；乳化剤；甘味料；着色料；着臭剤；塩；緩衝剤；コーティング剤および抗酸化剤の１種若しくはそれ以上も包含しうる。
【００４０】
本発明の実務で使用される薬物は遊離酸若しくは塩基として製造することができ、それらをその後、好ましくは適する化合物と組み合わせて製薬学的に許容できる塩を生じる。「製薬学的に許容できる塩」という表現は、非毒性の製薬学的に許容できる無機若しくは有機酸または無機若しくは有機塩基と形成される非毒性の塩を指す。例えば、塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などのような無機酸由来のもの、ならびに、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、フマル酸、メタンスルホン酸およびトルエンスルホン酸などのような有機酸から調製される塩を包含する。塩はまたアンモニア、ヒドロキシエチルアミンおよびヒドラジンのような無機塩基からのものも包含する。適する有機塩基は、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、ヒドロキシエチルアミン、モルホリン、ピペラジンおよびグアニジンを包含する。
【００４１】
いかなる場合も、治療的組成物は、好ましくは、所定の量の所望の治療剤（例えばベンダムスチン）および担体（すなわち生理学的に許容できる賦形剤）を含有する投薬単位の形態で作成される。ヒト若しくは他の哺乳動物（または他の動物）のためのいずれかのこうした分子の治療上有効な量を構成するものは、とりわけ、疾患若しくは障害の型、被験体の齢、重量、性、医学的状態、状態の重症度、投与経路、および使用される特定の化合物を包含する多様な因子に依存することができる。従って、投薬レジメンは広範に変動しうるが、しかし標準的方法を使用して慣例に決定し得る。いかなる場合も、化学療法剤の「有効量」は所望の細胞傷害性を導き出す量である。所望の効果を達成するのに必要とされるこうした治療的分子の量は、特定の分子それ自身、処置されるべき疾患若しくは障害、該分子に応答する被験体の癌の能力、投与経路などを包含する多数の考慮に依存することができる。所望の効果を達成するのに必要とされる分子の正確な量は実務家の判断に依存することができ、そして各個々の被験体に特有である。しかしながら、適する投薬量は、１日あたり体重１キログラムあたり約数ナノグラム（ｎｇ）から約数ミリグラム（ｍｇ）までの有効成分の範囲にわたりうる。
【００４２】
治療的組成物の製造法は当該技術分野で十分に理解されている。典型的には、こうした組成物は、液体溶液若しくは懸濁液のいずれかとしての注入可能物（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）として製造されるが、しかしながら、注入前に液体中の溶液若しくは懸濁液に適する固体の形態もまた製造し得る。調製物はまた乳化もされ得る。有効な治療成分はしばしば、生理学的に許容できかつ有効成分と適合性である賦形剤と混合される。適する賦形剤は、例えば、注射用水、生理的食塩水、Ｄ−ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組合せである。加えて、所望の場合は、組成物は、少量の、有効成分の有効性を高める湿潤若しくは乳化剤、解熱剤、安定剤、増粘剤、懸濁化剤、麻酔薬、保存剤、抗酸化剤、静菌剤、鎮痛薬、ｐＨ緩衝剤などのような補助物質を含有し得る。こうした成分は付加的な治療上の利益を提供し得るか、若しくは該製薬学的組成物の投与の結果として引き起こされうるいかなる潜在的な副作用も予防するために作用し得る。
【００４３】
本発明の組成物は、慣習的担体、補助物質およびベヒクルを含有する投薬単位製剤で、経口で、非経口で、吸入スプレーにより、直腸で、節内に（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）、クモ膜下に若しくは局所で投与しうる。ヒト投与に意図される治療的組成物の情況においては製薬学的に許容できる担体を使用する。「製薬学的に許容できる担体」および「生理学的に許容できる担体」という用語は、被験体に投与される場合に生理学的に耐えられかつ胃の不調、眩暈などのような意図されないアレルギー若しくは類似の予期しない反応を典型的に生じない分子実体および組成物を指す。
【００４４】
経口投与のためには、組成物は、例えば、とりわけカプセル剤、錠剤、舐剤、トローチ剤、散剤、懸濁剤若しくは液体を包含するいずれの適する形態のものであってもよい。液体は、生理的食塩水、Ｄ−ブドウ糖若しくは水を包含する適する担体を含む組成物として注入により投与しうる。「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内若しくは腹腔内経路を介する注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（連続的若しくは間欠的注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）を包含する）および注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を包含する。直腸投与のための坐剤は、有効成分（１種若しくは複数）を、常温で固体しかし生理学的温度で液体であるカカオバターおよび／若しくはポリエチレングリコールのような適する非刺激性賦形剤と混合することにより製造し得る。
【００４５】
組成物は固体の形態（顆粒剤、散剤若しくは坐剤を包含する）でもまた製造しうる。組成物は、滅菌のような慣習的製薬学的操作にかけることができ、かつ／若しくは保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などのような慣習的補助物質を含有しうる。経口投与のための固体の投薬形態物はカプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤を包含しうる。こうした固体の投薬形態物において、有効成分をショ糖、乳糖若しくはデンプンのような最低１種の不活性賦形剤と混合しうる。こうした投薬形態物はまた、不活性希釈剤以外の付加的な物質、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤も含みうる。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、該投薬形態物はまた緩衝剤も含みうる。錠剤および丸剤は、付加的に、腸溶コーティングを伴い製造し得る。経口投与のための液体の投薬形態物は、水のような当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含有する、製薬学的に許容できる乳剤、溶液、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を包含しうる。こうした組成物はまた、湿潤剤甘味料、着香料（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ）および香料（ｐｅｒｆｕｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）のような補助物質も含みうる。
【００４６】
無菌の注入可能な水性若しくは油性懸濁剤のような注入可能な製剤は、適する分散若しくは湿潤剤および懸濁化剤を使用して既知の方法に従って処方しうる。注入可能な製剤はまた、非毒性の非経口で許容できる希釈剤若しくは溶媒中の無菌の注入可能な溶液若しくは懸濁液でもありうる。使用しうる適するベヒクルおよび溶媒は、とりわけ、注射用水、リンゲル液、等張の塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の不揮発性油を溶媒若しくは懸濁媒として使用し得る。この目的上、合成のモノ若しくはジグリセリドを包含するいかなる無刺激性の不揮発性油も使用しうる。加えて、オレイン酸のような脂肪酸は注入可能物の製剤中で使用を見出す。
【００４７】
局所投与のためには、適する局所用量の組成物を１日１ないし４、および好ましくは２若しくは３回投与しうる。用量はまた、用量を適用しない介在する日を伴っても投与しうる。局所送達のための適する組成物は、しばしば、製剤の０．００１％から１０ｗ／ｗ％までの有効成分、例えば１％から２重量％までを含んでなるとはいえ、それは製剤の約１０ｗ／ｗ％、しかし好ましくは５ｗ／ｗ％未満、およびより好ましくは０．１％から１％までを含みうる。局所投与に適する製剤は、皮膚を通る浸透に適する液体若しくは半液体製剤（例えばリニメント剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤若しくはパスタ剤）、および眼、耳若しくは鼻への投与に適する滴剤を包含する。
【００４８】
（例えば無菌（ｓｔｅｒｉｌｅ）すなわち無菌（ａｓｅｐｔｉｃ）条件を達成するような）本発明の組成物の例示的投与方法は当業者に明らかであろう。こうした目的上適するある種の方法が、ＧｏｏｄｍａｎとＧｉｌｍａｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第７版（１９８５）に示されている。患者への投与は間欠的；または漸次の、継続的、一定、若しくは制御された速度であり得る。
【００４９】
非ホジキンリンパ腫の処置のためのベンダムスチンの局所の治療上有効な用量は、２連
続日の単回用量として若しくは用量間に数日を伴い与えられる約６０〜１２０ｍｇ／ｍ２からであり得る。該周期を約３ないし４週毎に反復し得る。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の処置のためには、ベンダムスチンを第１および２日に約８０〜１００ｍｇ／ｍ２で与えることができる。該周期を約４週後に反復し得る。ホジキン病（ステージＩＩ〜ＩＶ）の処置のためには、ベンダムスチンは、約４週毎の該周期の反復を伴う、第１および１５日のダウノルビシン２５ｍｇ／ｍ２、第１および１５日のブレオマイシン１０ｍｇ／ｍ２、第１および１５日のビンクリスチン１．４ｍｇ／ｍ２ならびに第１〜５日のベンダムスチン５０ｍｇ／ｍ２を含む「ＤＢＶＢｅレジメン」で与えることができる。乳癌に対しては、第１および８日のベンダムスチン（１２０ｍｇ／ｍ２）を、約４週毎の該周期の反復を伴い、第１および８日のメトトレキセート４０ｍｇ／ｍ２、ならびに第１および８日の５−フルオロウラシル６００ｍｇ／ｍ２とともに与えることができる。乳癌治療の第二列として、ベンダムスチンは、約４週毎の該周期の反復を伴い、第１および２日に約１００〜１５０ｍｇ／ｍ２で与えることができる。
【００５０】
本発明の方法は単剤療法および併用療法の双方を伴う。併用療法の情況において、本発明は２種若しくはそれ以上の化学療法剤の投与を想定している。多様な化学療法剤が当該技術分野で既知である。これらの化合物のいくつかは、１種若しくはそれ以上の癌の適応症の処置における使用のため既に承認されている。他者は前臨床および臨床開発の多様な段階にある。本発明の併用療法の実務で有用な化学療法剤の例は、アルキル化剤ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパおよびトリエチレンメラミンを包含する。ベンダムスチンとともにの使用のための好ましい代謝拮抗剤は、カペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（およびその活性化型ａｒａ−ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、ダカバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサートならびに６−チオグアニンを包含する。ベンダムスチンとの併用療法で使用し得る好ましい抗分裂化合物は、ナベルビン、パクリタキセル、タキソテール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを包含する。
【００５１】
化学療法剤の他の分類は、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えばカンプトテシン、イリノテカン。トポテカンなど）；ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、イダルビシン、ミトキサントロンおよびテニポシドのようなトポイソメラーゼＩＩ阻害剤：血管新生阻害剤（例えばダルテパリン、スラミンなど）；アレムツズマブ、ベバシズマブ、ベキサロテン、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、オゾガミシン、イブリツモマブチウキセタン、メシル酸イマチニブ、ラルチトレキセド、レブリミド、リツキシマブ、トラスツズマブを包含する抗体；チロシンキナーゼ阻害剤；挿入剤；ならびにアナストロゾール、エストロゲン、抗エストロゲン（例えばフルベストラントおよびタモキシフェン）、エキセメスタン、フルタミド、ゴセレリン、リュープロリド、ニルタミド、レビマソール、レトロゾール、プレドニゾンおよびトレミフェンのようなホルモンを包含する。他の化学療法剤は、アンジオスタチン、アスパラギナーゼ、デニルエキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｕｅｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、エンドスタチン、イミキモド、インターフェロン、インターロイキン−１１およびペグアスパルガーゼのようなタンパク質を包含する。なお他の化学療法剤は、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミフォスチン、アムサクリン、三酸化ヒ素、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボキシアミドトリアゾール、セレコキシブ、ダクチノマイシン、エピルビシン、ゲルダンマイシン、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７ ＡＡＧ）、イリノテカン、２−メトキシエストラジオール、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、オキザリプラチン、スクアラミン、テモゾラミド、サリドマイド、トレチノイン トリアピンおよびバルルビシンのような分子を包含する。当業者が認識するであろうとおり、これらおよび現在既知の若しくは後に開発される他の化学療法剤は、癌を包含する多様な新形成を処置するためにベンダムスチンとともに使用しうる。
【００５２】
実施例
以下の実施例は、本発明のある局面を具体的に説明するため、および本発明の実施において当業者を補助するために提供される。これらの実施例はいかなる様式でも本発明の範囲を制限すると決してみなされるべきでない。
【実施例１】
【００５３】
ベンダムスチンの作用機序の分子解析
Ａ．緒言。
ベンダムスチン（ＴｒｅａｎｄａＴＭ、Ｓａｌｍｅｄｉｘ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州；ＲｉｂｏｍｕｓｔｉｎＴＭ（Ｒｉｂｏｓｅｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ、独国・ミュンヘン））は慣習的ＤＮＡ損傷剤に難治性のものを包含する、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ球性白血病、充実性腫瘍、乳房および小細胞肺癌ならびに多発性骨髄腫のような多様なヒト癌に対する立証された前臨床および臨床活性をもつ抗腫瘍剤である。ベンダムスチンすなわち４−｛５−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−メチル−２−ベンズイミダゾリル｝酪酸塩酸塩は、元は低毒性ならびにアルキル化および代謝拮抗双方の特性をもつ剤を製造する意図を伴い合成された。それは３個の下位構造要素、すなわち２−クロロエチルアミンアルキル化基；ベンズイミダゾール環；および酪酸側鎖を有する。２−クロロエチルアミンアルキル化基は、シクロホスファミド、クロラムブシルおよびメルファランのような他のナイトロジェンマスタードと共有される。ベンズイミダゾール中央環系はベンダムスチンの独特の特徴であるとは言え、酪酸側鎖はクロラムブシルに存在する。この多局面構造が、その独特の抗腫瘍活性プロファイルに寄与するとみられ、そしてそれを慣習的アルキル化剤と識別する。
【００５４】
ＤＮＡアルキル化剤は化学療法の装備一式中で極めて有用である。こうした薬物は、これらの化合物の数種のプログラムされた壊死を誘導する能力、および核を欠く細胞中でさえアポトーシスを誘導する他者（例えばプラチン類）の能力のような予期されない作用機序を有しうる。「ナイトロジェンマスタード」の場合、主要な差違が、多様な適応症でのそれらの識別された使用、すなわち、主としてＮＨＬの処置において使用されるシクロホスファミド；慢性リンパ球性白血病の処置において使用されるクロラムブシル；および多発性骨髄腫の処置において使用されるメルファラン、により反映されるように、それらの活性プロファイルに存在する。
【００５５】
他のアルキル化剤と共通のベンダムスチンの主な抗腫瘍作用は、ＤＮＡの対形成した鎖間の架橋の形成に由来するとは言え、他の作用機序もまた関わるとみられる。従って、ベンダムスチンの抗腫瘍作用は、単純に古典的なアルキル化活性より複雑である機構に由来しうる。ベンダムスチンにより引き起こされるＤＮＡ二本鎖切断はシクロホスファミド若しくはＢＮＣＵにより引き起こされるものより有意により耐性であり、ベンダムスチンは他のアルキル化剤に対しｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで抵抗性である細胞株に対する活性を示し、そして独特の前アポトーシス活性が、数種のｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍モデルで単剤としておよび他の抗癌剤と組合せのベンダムスチンにより示されたためである。ベンダムスチンの正確な作用機序に関する詳細な分子研究はわずかなままである。この理由から、従来技術の分子ツールを使用して、ベンダムスチンの作用機序を完全に分析した。本実施例は、ＮＨＬ細胞株中でベンダムスチンにより誘発される遺伝子発現プロファイル変化を解析するための薬ゲノム学的アッセイ由来の結果を提示する。これらの薬ゲノム学的分析は、アポトーシスシグナル伝達の開始、ＤＮＡ修復の機構および有糸分裂チェックポイントの調節を扱う機能アッセイにより検証された。最後に、ベンダムスチンは、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のヒト腫瘍の６０種の細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングでプロファイルされ、そして他のアルキル化剤（すなわちクロラムブシルおよびホスホルアミドマスタード（シクロホスファミドの代謝物））のライブラリーに対するその比較活性が研究された。結果はまた、ＮＨＬ細胞株中でベンダムスチンにより誘発された遺伝子発現プロファイル変化を解析するための薬ゲノム学アッセイを使用しても生成された。これらの薬ゲノム学分析は、Ｑ−ＰＣＲ、およびアポトーシスシグナル伝達の開始、ＤＮＡ修復の機構および有糸分裂チェックポイントの調節を扱う機能アッセイにより検証された。一緒に、これらの結果は、ベンダムスチンが他のＤＮＡアルキル化剤と異なる複数の作用機序を有することを示し、慣習的治療に難治性の腫瘍を有する患者におけるベンダムスチンの活性を説明する。
【００５６】
Ｂ．材料および方法。
ａ．細胞。
ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞はカリフォルニア大学サンディエゴ校から得た。細胞は１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で増殖させた。
【００５７】
ｂ．試薬。
塩酸ベンダムスチンはＦｕｊｉｓａｗａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ（独国ミュンヘン）から得た。シクロホスファミドの活性代謝物、ホスホルアミドマスタードシクロヘキシルアミン塩（ＰＭ、ＮＳＣ６９９４５）は、国立癌研究所（ＮＣＩ）の開発治療薬プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＤＴＰ）の合成集積所（ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）から得た。全部の他の試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈのような商業的供給源から得た。
【００５８】
ｃ．薬物処理。
本実施例で提示されるアッセイの大部分について、ベンダムスチン、ホスホルアミドマスタード（シクロホスファミドの活性代謝物）およびクロラムブシルに使用した濃度は、３日にわたるＭＴＴアッセイで測定されたそれらの細胞傷害活性に基づき選択した。薬物はＤＭＳＯ中で調製し、そしてその後培地で希釈した。
【００５９】
ｄ．ＲＮＡサンプルの調製および発現データの分析。
細胞を１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）中で収集し（５×１０６細胞）、そして全ＲＮＡを製造元の説明書に従い単離した。ビオチン標識ｃＤＮＡ（１５μｇ）を各ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタクララ）にハイブリダイズさせた。簡潔には、チップへのハイブリダイゼーションのための材料を調製するための手順は複数の段階を必要とした。全ＲＮＡを単離し、そして光学密度により定量した。ｃＤＮＡを、第一鎖ｃＤＮＡを生成させるためｄＮＴＰ、ＤＴＴおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩとともに、Ｔ７プロモーター（ｄＴ７−（Ｔ）２４）と結合したポリＡ尾部を認識する特異的プライマーを使用して生成した。このアプローチはポリＡ（＋）ｍＲＮＡを単離する必要性を軽減した。第二鎖は、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡ ｐｏｌ ＩおよびＲＮアーゼＨを用いてｄＮＴＰを付加すること、およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを追加の５分間添加する前に１６℃で２時間インキュベートすることにより合成した。ｃＤＮＡをカラム精製しかつ定量した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を、高密度オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーション前に実施した。この反応の出発原料は１μｇのｃＤＮＡであり、それに、１０ｍＭビオチニル化１１−ＣＴＰおよび１０ｍＭビオチニル化１６−ＵＴＰを添加することにより補償されるように２５％より少ないＣＴＰおよびＵＴＰを用いてＮＴＰを付加した。適切な緩衝液中３７℃で６時間のＴ７酵素の最終添加がビオチニル化ＩＶＴ ＲＮＡを生じ、それをその後カラム精製した（ＲＮｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ）。
【００６０】
化学的に断片化したＩＶＴ ＲＮＡ（１５μｇ）を、９５℃に加熱した適切な緩衝液中で対照オリゴヌクレオチド、標準（ハウスキーピング遺伝子を包含する）およびサケ精子ＤＮＡと５分間混合し、そしてチップに４２℃で１６時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズされない物質を２×ＳＳＰＥで洗い落とし、そしてフィコエリトリン標識アビジンをその後反応に添加した。過剰の蛍光色素を洗い落とし、そしてチップをその後、各合成部分（ｆｅａｔｕｒｅ）（合成部分は７．５平方ミクロンである）の蛍光の強度について走査した。
【００６１】
ｅ．生物情報学解析。
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐの走査画像を解析するためのＣＯＲＧＯＮ法の使用を伴った遺伝子発現データの解析のための戦略および方法を開発した。ＣＯＲＧＯＮは、その中心的統計学的方法が既知である無料で入手可能なソフトウェアである（Ｓａｓｉｋら（２００２）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ｖｏｌ．１８、ｎｏ．１２：１６３３−４０）。条件の最低１種でｐ＜０．０５（９５％信頼水準）で存在した遺伝子のみをさらなる解析に考慮した。ＣＯＲＧＯＮのＡｆｆｙｍｅｔｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ（ＡＭＳ）５．０ソフトウェアとの比較は、ＡＭＳ ５．０について２９％に比較してＣＯＲＧＯＮについて４．４％の擬陽性誤差率を示した。選択された遺伝子を平均若しくはピークの調節の程度に従って選別した。上位１００種の最も調節される遺伝子を、それらの発現パターンの類似性に基づきクラスター化のため選んだ。階層的クラスター化法を使用した。この最初の分類は、どれが検討中の過程により調節される主遺伝子および経路であったかの決定において極めて有用であった。共調節されると思われた遺伝子のクラスターをプロモーター解析にかけた。次の段階はＧＯ３解析、すなわち該過程に関するＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベース（ウェブサイト：ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）の統計学的に有意の条件（ｔｅｒｍ）を見出すための不偏かつ教師なしツールであった。ＧＯ３は、有意に調節された系の決定的な成分を同定する過程を容易にする。データベースに３種のオントロジー、すなわち分子機能；生物学的過程；および細胞成分が存在した。該解析は、ＵＣＳＤのＡＩＤＳ研究ゲノム学中核センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で実施した。
【００６２】
ｆ．定量的ＰＣＲ分析。
特異的転写物の発現レベルを定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して測定した。各処理したＳＵ−ＤＨＬ−１細胞ペレットからの全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を使用して単離した。ｃＤＮＡは、製造元のプロトコルに従い、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオリゴｄＴプライマーを使用して作成した。Ｑ−ＰＣＲ増幅および定量はｉＣｙｃｌｅｒ装置（Ｂｉｏ−ＲＡＤ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して実施した。サンプル増幅は、１２．５μＬの２×ＩＱ ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＴＭミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、１μＭの各プライマー、および８０ｎｇの全ＲＮＡに対応する容量のｃＤＮＡを含有する２５μＬの容量で実施した。循環条件は：９５℃５秒間；各プライマーの適切なアニーリング温度で３０秒；および７２℃３０秒間であった。アッセイの標的特異性を融解曲線分析により検証した。各遺伝子の発現を各サンプルについて１８ｓの発現レベルに関し正規化した。未処理対照に関する各遺伝子の発現をその後、ＬｉｖａｋとＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（（２００１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、ｖｏｌ．２５：４０２−４０８）の方法に従って計算した。プライマーは、Ｂｅａｃｏｎ ＤｅｓｉｇｎｅｒＴＭ（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ、カリフォルニア州パロアルト）を使用して設計したか、若しくは文献に基づき設計した。プライマー配列およびアニーリング温度は後に続くとおりである（各プライマーは５’から３’、次いでその配列番号で書かれている）。
【００６３】
【表１】
【００６４】
ｇ．ＣＯＭＰＡＲＥ解析。
ベンダムスチンを、６０種のヒト腫瘍細胞株よりなるＮＣＩのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍スクリーニングで試験した。試験は、１０倍希釈の最小５濃度を伴い、そして各スクリーニングを２回反復した。４８時間連続薬物曝露プロトコルを使用した。スルホローダミンＢタンパク質アッセイが細胞生存率若しくは増殖を推定した。ＣＯＭＰＡＲＥ法および関連データは、開発治療薬プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＤＴＰ）ウェブサイト（ウェブサイト：ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で無料で入手可能である。ＮＣＩはベンダムスチンに番号ＮＳＣ１３８７８３を割り当てた。
【００６５】
ｈ．ウエスタンブロット分析。
ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞を５０μＭベンダムスチン、２μＭクロラムブシル、若しくは２０μＭホスホルアミドマスタードとともに２０時間インキュベートした。細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、そして溶解直前に添加する氷冷溶解緩衝液（１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭフッ化ナトリウム、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ、ニュージャージー州ナットレー）およびホスファターゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含む１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコリンナトリウム）で１時間溶解した。非溶解性膜、ＤＮＡおよび他の沈殿物をペレットにし、そしてタンパク質上清を得た。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用して測定した。２０μｇのライセートを４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上でのゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転写し、そして以下の一次モノクローナル抗体、すなわち抗ｐ５３、抗リン酸化ｐ５３（Ｓｅｒ１５特異的）、抗ｐ２１および抗切断型ＰＡＲＰ（カスパーゼ特異的切断部位）（それらは全部Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（マサチューセッツ州ビバリー）から購入した）；抗Ｂａｘおよび抗ＰＡＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した）、ならびに負荷対照に使用した抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した）を使用するイムノブロッティングにより検出した。一次抗体を４℃で穏やかに振とうしながら一夜インキュベートした。メンブレンを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６８０ヤギ抗マウス二次抗体（４０００倍）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）とともに穏やかに振とうしながら室温で２時間インキュベートした。ブロットを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＬｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナで走査した。
【００６６】
ｉ．ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に基づくＡｐｅ−１およびＡＧＴアッセイ。
細胞を、６ｍＭメトキシアミン（Ｓｉｇｍａ）、若しくは５０μＭのＯ６−ベンジルグアニン（Ｓｉｇｍａ）（それぞれ、Ａｐｅ−１塩基除去修復酵素およびアルキルグアニルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）酵素の阻害剤）のいずれかとともに３０分間プレインキュ
ベートした。細胞をその後、多様な濃度の示される剤に７２時間曝露した。細胞傷害性をＭＴＴアッセイ（１３）により評価し、そして、未処理対照の値を５０％阻害した薬物濃度としてＩＣ５０を測定した。解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン３．００
ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して実施した。
【００６７】
ｊ．細胞周期分析。
ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞を、等毒性（ＩＣ５０）濃度のベンダムスチン（５０μＭ）、クロラムブシル（４μＭ）若しくはホスホルアミドマスタード（５０μＭ）とともに８時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、そして７０％エタノール２０℃中で最低１時間固定した。固定した細胞をＰＢＳで洗浄することにより再水和した。細胞を、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州ラホヤ）、１０μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＡ（ＤＮアーゼを含まない、Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）、および１０μｌ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｓｉｇｍａ）よりなるヨウ化プロピジウム染色溶液に再懸濁した。サンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を使用して分析した。細胞周期分布の解析は、ＤＮＡ ＭｏｄＦｉｔ ＬＴ（Ｖｅｒｉｔｙ Ｈｏｕｓｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州サニーベール）モデル化ソフトウェアを使用して実施した。
【００６８】
ｋ．Ｈ２ＡＸフォーカス形成
細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバースライドガラス（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｌ．、イリノイ州ネーパービル）上で増殖させた。細胞を最低１日間付着させた後、細胞をＤＭＳＯ若しくは５０μＭベンダムスチンいずれかを含む培地中で処理した。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、そしてその後ＰＢＳで２回洗浄した。それらを３７℃で追加の４時間インキュベートした。細胞をその後１×ＰＢＳで２回洗浄し、そして−２０℃の１００％メタノール中で１０分インキュベートして細胞を固定した。それらをその後１×ＰＢＳでそれぞれ５分間３回洗浄した。それらをブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中１０％ＦＢＳ、１％ＢＳＡ）中室温で１時間インキュベートした。スライドガラスを、一次ポリクローナル抗Ｈ２ＡＸ抗体（Ｒ
＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）とともに一夜揺らしながら４℃でインキュベートした。抗体はブロッキング緩衝液中１：１０，０００の比で希釈した。スライドガラスを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８ヤギ抗ウサギ二次抗体（４０００倍）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）とともに穏やかに振とうしながら室温で４５分間インキュベートした。スライドガラスを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてその後チャンバーを除去し、そしてＤＡＰＩを伴うＳｌｏｗＦａｄｅ Ｌｉｇｈｔ Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を細胞に添加しかつカバーガラスをスライドガラス上に封止した。分析は、ＤＩＣ光学系および蛍光を伴う電動式Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＰｌａｎ ２ｅ画像化顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲｍカメラおよびＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアバージョン４．２を使用して実施した。
【００６９】
ｌ．残基Ｓｅｒ１３９でのＨ２ＡＸのリン酸化のイムノブロット。
細胞株は１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中でコンフルエンスまで増殖させた。細胞をその後、１×ＰＢＳで２回洗浄し、そして、溶解直前に添加する氷冷溶解緩衝液（１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ、ニュージャージー州ナットレー）およびホスファターゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含む、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコリンナトリウム）で１時間溶解した。非溶解性膜、ＤＮＡおよび他の沈殿物をペレットにし、そしてタンパク質上清を得た。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用して測定した。２０マイクログラムのライセートを４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）に転写し、そしてポリクローナル抗Ｈ２ＡＸ抗体（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を使用するイムノブロッティングにより検出した。抗体は１：２０００の比でブロッキング緩衝液で希釈し、そしてメンブレンを穏やかに振とうしながら室温で２時間インキュベートした。メンブレンを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６８０ヤギ抗ウサギ二次抗体（５０００倍）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）とともに穏やかに振とうしながら室温で２時間インキュベートした。ブロットを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＬｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナで走査した。
【００７０】
Ｃ．結果。
ａ．遺伝子発現プロファイリングは、クロラムブシル若しくはシクロホスファミドと異なる、ベンダムスチンにより調節されるシグネチャ遺伝子を同定する。
【００７１】
ベンダムスチン、クロラムブシルおよびホスホルアミドマスタード（シクロホスファミドの活性代謝物）の等毒性濃度を、薬物への３日の曝露後に細胞生存率を測定することにより測定した。本研究に提示されるアッセイについて、ベンダムスチン、ホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシルに使用した濃度はこのデータに基づき選択した（下の表１）。これらの濃度はまた、各薬物の臨床上達成可能な濃度も反映する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析を使用して、薬物処理したＳＵ−ＤＨＬ−１（非ホジキンリンパ腫細胞株、対照細胞に比較される細胞）中の１２，０００を越える遺伝子の発現レベルを比較した。ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞を、ＩＣ５０濃度（２５μＭ）およびＩＣ９０濃度（３５μＭ）のベンダムスチンとともにインキュベートした。クロラムブシルおよびシクロホスファミドの代謝物ホスホルアミドマスタードはＩＣ９０、すなわちそれぞれ５μＭおよび５０μＭで試験した。遺伝子発現を、薬物で処理後８時間モニターして、この初期ストレス応答の近接事象を同定した。
【００７２】
ゲノム解析は、該遺伝子の大多数が、上位１００種の調節される遺伝子のクラスター図（図１Ａ）により示されるとおり、３種の試験した薬物間で同様に調節されることを示した。大部分の遺伝子は該薬物への曝露に際して上方制御された（赤色）。遺伝子の一サブセットは薬物処理後に転写的に抑制された（青色）。重要なことに、試験した他２種の薬物に比較して、ベンダムスチンによる示差的調節を表した一群の遺伝子が同定された。
【００７３】
誘導される遺伝子の多く（図１Ｂ）は、それらのプロモーター領域にｐ５３応答エレメントを有することが知られ、そしてｐ５３依存性とみなされる。これらの遺伝子の例は：ｐ２１（ｐ５３で誘導される細胞分裂キナーゼ阻害剤）；ｗｉｐ１（ｐ５３で誘導されるタンパク質ホスファターゼ１）；ＮＯＸＡ（ｐ５３で誘導される前アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー）；ＤＲ５／ＫＩＬＬＥＲ（ｐ５３に調節されるＤＮＡ損傷誘導可能な細胞死受容体）；およびＢＴＧ２である。興味深いことに、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの４メンバー（メンバー６、９、１０および１０ｂ）が、上位１００種の調節される遺伝子中で同定された。これらの遺伝子の数種は外因性アポトーシス経路（ＲＥＦ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦアポトーシス）の調節で決定的に重要な役割を演じていることが示されている。数種の他の遺伝子は、ベンダムスチンと他２種の化合物の間で反対の傾向を表す（データは示されない）。これらの遺伝子は双方の濃度でベンダムスチンにより上方制御されるが、しかしクロラムブシルおよびホスホルアミドマスタード双方により下方制御された。
【００７４】
ベンダムスチン、クロラムブシルおよびホスホルアミドマスタード間の薬ゲノム学的差違を評価するため、遺伝子プロファイリングからの結果をＧＯ３ソフトウェア（該過程に関連したＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）データベース（ウェブサイト：ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）中の統計学的に有意の条件を見出すための不偏かつ教師なしツール）で再解析した。ベンダムスチン処理した細胞で有意に上方若しくは下方制御されかつ対照処理された細胞中での発現のレベルの最低１．５倍上若しくは下の遺伝子を、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）共同事業体により提供される生物学的過程の注釈に結びつけた。ＧＯ注釈の階層構造に基づき、各初期娘期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｄａｕｇｈｔｅｒ ｔｅｒｍ）（Ｐ値）が選択された遺伝子の数に偶然結びつけられる確率を計算した。ＤＭＳＯ処理対照およびベンダムスチン処理細胞（ＩＣ９０用量で）を比較するＧＯ解析の結果を下の表２に報告する。下の表２で、第一列は一般的範疇を表し、第二および第三列は特定の生物学的過程の数および名称であり、そして最後の列は各過程のｐ値である。ｐ値はＧＯ３ソフトウェアを使用して計算した。４種の主要な機能群、すなわち（１）ＤＮＡ損傷、ストレス応答、アポトーシス；（２）ＤＮＡ代謝、ＤＮＡ修復、転写；（３）細胞増殖、細胞周期、有糸分裂チェックポイント；および（４）細胞調節が、ベンダムスチンにより統計学的に調節されることが見出された。これらの群のそれぞれは、ベンダムスチンにより有意に調節されることが見出された数種の生物学的過程を包含する。最低のｐ値を提供しかつ従って最も統計学的に有意であった生物学的過程は：ＤＮＡ損傷ストレスに対する応答（ＧＯ６９７４）；ＤＮＡ代謝（ＧＯ６２５９）；および細胞増殖（ＧＯ８２８３）であった。
【００７５】
クロラムブシルおよびホスホルアミドマスタードを用いて実施した類似の解析は、ベンダムスチンおよびクロラムブシルで得られたプロファイル間に重なりがほとんど存在しないことを示唆した。遺伝子調節における若干の類似性がベンダムスチンとホスホルアミドマスタードの間で観察されたとは言え、これらは「ＤＮＡ代謝、ＤＮＡ修復および転写」群に限定された。これらの結果は、遺伝子アレイの結果の定量的検証およびベンダムスチンのより決定的な差別化のための特定の遺伝子産物の選択のための基礎を提供した。
【００７６】
ｂ．リアルタイム定量的Ｑ−ＰＣＲ分析によるゲノム解析の検証。
アレイデータの確認および検証をリアルタイム定量的ＰＣＲ分析（Ｑ−ＰＣＲ）により実施した。ｐ５３シグナル伝達、アポトーシス、ＤＮＡ修復および細胞周期／有糸分裂チェックポイントに関与する数種の遺伝子は、全部、試験した他のアルキル化剤とベンダムスチンを比較する場合に示差的に調節された。
【００７７】
Ｑ−ＰＣＲ検証に選択した「正準」ｐ５３依存性遺伝子の２例は、ｐ２１（Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１）すなわちサイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ａ、および前アポトーシスＢＨ３−ｏｎｌｙ Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーＮＯＸＡであった。双方の遺伝子は、ベンダムスチンへの曝露８時間後にＳＵ−ＤＨＬ−１細胞中で誘導されることが見出された。双方の遺伝子はまた、等毒性濃度のホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシルにより、しかしはるかにより低い程度まで誘導された（図２Ａ）。
【００７８】
検証分析から出現した最も特筆すべき結果の１つは、ｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）、ＡｕｒｏｒａキナーゼＡおよびＢ、ならびにサイクリンＢ１を包含する数種の有糸分裂関連遺伝子の示差的調節であった。これらの遺伝子は有糸分裂チェックポイントの調節で重要を演じていると考えられる。ベンダムスチンでの処理は全部のこれらの遺伝子のｍＲＮＡ発現の６０ないし８０％下方制御に至った。対照的に、ホスホルアミドマスタード若しくはクロラムブシルは、おそらくＡｕｒｏａキナーゼを除き、これらの遺伝子の転写物に対する小さな影響のみ発揮した（図２Ｂ）。
【００７９】
差違はまた、ＤＮＡ修復遺伝子エキソヌクレアーゼ−１（ＥＸＯ１）のｍＲＮＡ発現の
分析でも出現した。ベンダムスチンは、ホスホルアミドマスタード（１．５倍）若しくはクロラムブシル（１．８倍）で観察されたものと比較して、Ｅｘｏ１発現のわずかにより強い（２．５倍）上方制御を誘導した（図２Ｃ）。Ｆｅｎ１（ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ１）もまたベンダムスチンにより上方制御され、そして、ホスホルアミドマスタードは、等毒性濃度で使用した場合にこの遺伝子を同一レベルまで上方制御した（図２Ｃ）。
【００８０】
ｃ．ＮＨＬ細胞中でのベンダムスチンによるアポトーシスシグナル伝達。
ＮＨＬ細胞中でのベンダムスチン誘導性のプログラムされた細胞死に関与する分子事象を分析するため、重要なアポトーシスタンパク質の発現をイムノブロット分析によりモニターした。該結果は、ベンダムスチンが古典的ｐ５３依存性アポトーシス経路を効率的かつ迅速に起動させ得ることを明確に示した。初期若しくは頂点の（ａｐｉｃａｌ）事象の１つは、セリン１５残基のリン酸化を特異的に認識する抗体を使用して検出されるとおり、ｐ５３リン酸化の誘導である。Ｓｅｒ１５リン酸化ｐ５３の８倍の上方制御が、ベンダムスチンに曝露したＳＵ−ＤＨＬ−１細胞で観察された一方、小さい上方制御のみがホスホルアミドマスタード処理した細胞で見られ、また、クロラムブシル処理した細胞で変化は観察されなかった（図３、左上図）。
【００８１】
リン酸化されたｐ５３の誘導と平行して、全ｐ５３の発現の強い増大が、ベンダムスチン処理した細胞で見られた。クロラムブシル処理した細胞は全ｐ５３の小さな増大を表した一方、ホスホルアミドマスタードへの曝露はｐ５３レベルの変化を誘導しなかった。ｐ２１タンパク質発現で観察された変化は、ｐ５３のタンパク質発現レベルの変化に比較した場合に、薬物のそれぞれについて小さかった。Ｂａｘ（重要なＢＨ３−ｏｎｌｙ前アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー）のタンパク質発現の増大は、ベンダムスチン処理したＳＵ−ＤＨＬ−１細胞でのみ観察された（図３、左下図）。
【００８２】
ホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシルとベンダムスチンの効果の比較において観察された最も顕著な差違は、ＰＡＲＰ（ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ−１）の発現を比較した場合に見出された。ＰＡＲＰはＤＮＡ修復機構で重要な決定的なＮＡＤを要求する酵素である。ＰＡＲＰはまた前アポトーシスタンパク質分解性カスパーゼ酵素の「初期」基質でもある。ベンダムスチンで処理したＳＵ−ＤＨＬ−１細胞はＰＡＲＰタンパク質発現の劇的な減少を示した（図３、右上図）。ＰＡＲＰ発現の該減少の理由は、「切断特異的」酵素により認識されるタンパク質分解性切断生成物の出現により示されるとおり、カスパーゼによるその切断であった（図３、右中図）。注目すべきことに、ＰＡＲＰの発現の変化は、等毒性濃度のホスホルアミドマスタード若しくはクロラムブシルにより処理したＮＨＬ細胞で検出されなかった。類似の結果は、ベンダムスチンの用量（５０μＭ）を維持しつつ２倍の等毒性用量のホスホルアミドマスタード（４０μＭ）およびクロラムブシル（４μＭ）を使用する場合に観察された（データは示されない）。従って、ＰＡＲＰ発現レベルの評価を多様な目的上使用し得る。例えば、ＰＡＲＰアッセイは特定の治療レジメンの有効性に関する指標を提供するはずであり得、ここで、低下されたＰＡＲＰ発現（好ましくは、ＰＡＲＰ切断生成物の存在などについてタンパク質レベルで、例えばＰＡＲＰ活性により測定される）は、投与された薬物が所望の効果を有していることを示す。加えて、ＰＡＲＰアッセイは、例えば、組織の細胞（例えば生検若しくは他の生物学的サンプル由来の細胞）が特定の治療（例えばベンダムスチン単剤療法、若しくは治療の１種がベンダムスチンを利用する併用療法）に応答することがありそうであるかどうかを決定するのに予後的に使用し得る。
【００８３】
ｄ．塩基除去修復の阻害はベンダムスチン活性を阻害するが、しかしＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ修復は阻害しない。
修復酵素Ａｐｅ−１、すなわちベンダムスチンおよびシクロホスファミドの代謝物ホスホルアミドマスタードの細胞傷害活性において塩基除去修復（ＢＥＲ）経路で決定的な役
割を演じている、プリン塩基のないエンドヌクレアーゼの役割を、Ａｐｅ−１阻害剤メトキシアミンを使用して評価した。ベンダムスチンのＩＣ５０は、メトキシアミン添加でおよそ４倍（およそ５０μＭからおよそ１２μＭまで）低下された（図４Ａ）。対照的に、ホスホルアミドマスタードのＩＣ５０は、メトキシアミンを添加した場合にわずかにのみ変化した。該結果は、ＢＥＲがベンダムスチン誘導性のＤＮＡ損傷の修復において重要な役割を演じうるが、しかしシクロホスファミドにより誘導される損傷の修復においてはしないかもしれないことを示唆する。
【００８４】
ベンダムスチンの抗腫瘍活性に対するＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）の既知の阻害剤、Ｏ６−ベンジルグアニンの効果もまたＳＵ−ＤＨＬ−１細胞で試験した。該結果は、ベンダムスチンの細胞傷害効力がＯ６−ベンジルグアニンを添加することにより高められなかったことを示した。反対の結果がシクロホスファミドで得られ、シクロホスファミドと異なり、ベンダムスチンはＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤＮＡ修復機構に認め得るほど頼らないことを示唆した（図４Ｂ）。
【００８５】
ｅ．ベンダムスチンＨＣｌは二本鎖切断の形成を迅速に誘導して独特の細胞周期変化をもたらす。
二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するベンダムスチンＨＣｌの能力を検討するため、２種の生化学的マーカー、すなわち免疫蛍光によるγ−Ｈ２ＡＸヒストンの核局在化；およびイムノブロット分析による残基Ｓｅｒ１３９でのＨ２ＡＸのリン酸化を分析した。結果は、ベンダムスチンＨＣｌが、多剤耐性およびｐ５３欠損株を包含する多様な腫瘍細胞中でＤＳＢを強力かつ迅速に誘導したことを確認した。５０μＭベンダムスチンＨＣｌとのインキュベーションは約３０分後に検出可能な核内フォーカスの形成に至る。時間経過分析は、γ−Ｈ２ＡＸのＳｅｒ１３９リン酸化が、ベンダムスチンＨＣＬへの２４時間の連続曝露後、ならびに該薬物への非常に短い曝露（３０分）、次いで薬物の除去（ウォッシュアウト）後に検出可能であったことを示した。ベンダムスチンＨＣｌは、シクロホスファミドのような他の２−クロロエチルアミノＤＮＡアルキル化剤でよりも早期に発生するＨ２ＡＸのリン酸化を誘導した。５０μＭベンダムスチンＨＣｌに８時間曝露したＳＵ−ＤＨＬ−１リンパ腫細胞の細胞周期分析は、付随するＧ２Ｍ停止を伴わずに４０％超の平均のＳ期分布の増大を示した。等毒性濃度のクロラムブシルおよびシクロホスアミドへの曝露は、Ｓ期分布をそれぞれおよそ２０％および１５％増大させた。これらの知見は、ベンダムスチンＨＣｌが、一過性の３０分曝露後でさえＤＮＡ二本鎖切断を誘導し得ることを具体的に説明する。
【００８６】
ｆ．ベンダムスチンは、ＮＣＩのＣＯＭＰＡＲＥ解析を使用して活性の独特なプロファイルを表す。
ベンダムスチンの細胞傷害性を、国立癌研究所の前臨床抗腫瘍薬発見スクリーニング（ＮＣＩスクリーニング）の６０種のヒト細胞株で評価した。ＮＣＩスクリーニングは、潜在的抗腫瘍薬の相対的効力を４５，０００種以上の化合物および天然産物の広範囲のデータベースからの既知の治療薬と比較するのに有用である。ＣＯＭＰＡＲＥ解析を、「種（ｓｅｅｄ）」としてベンダムスチンを用いて生成させたＧＩ５０の結果を使用して実施した。高いＰｅａｒｓｏｎ相関係数（ＰＣＣ）をもつ化合物は、しばしば類似の作用機序を有する。ベンダムスチンは、ＮＣＩスクリーニングでいかなる剤とも強い相関（＞０．８）を示さなかった（下の表３）。ベンダムスチンとの６種の上位の一致のうち、メチル化剤ＤＴＩＣ（ダカルバジン）のみがおよそ８０％の相関一致（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）（ｒ値）を示した。対照的に、０．８３超の相関係数をもつ全２５種の化合物が、メルファラン、クロラムブシル、若しくはシクロホスファミドの活性代謝物について同定された。加えて、本スクリーニングでのメルファラン、クロラムブシルおよびシクロホスファミドの感受性パターンの直接比較は、該３種の薬物間の高い相関係数を示した（０．７６２〜０．９３４、データは示されない）。これらのデータは、該剤の感受性プロファイルの統計学的一致、および共通の作用機序の高い見込みを示す。ベンダムスチンと、ナイトロジェンマスタードの分類の他メンバーの間の相関の欠如は説得力があり、そしてベンダムスチンが別個の抗腫瘍活性パターンを有することを示す。
【００８７】
Ｄ．考察。
多様な生物学的および分析ツールを使用して得られたこれらの実験の結果は、ベンダムスチンが、シクロホスファミドおよびクロラムブシルのような同一の「ナイトロジェンマスタード」活性部分を共有する他の臨床で使用される化合物と比較した場合に、別個の作用機序を有することを示す。
【００８８】
本研究で使用したツールの１種は薬ゲノム学アプローチであり、選択された薬物との標的細胞株のインキュベーションに際して、数千の完全に特徴付けられた遺伝子の発現レベルの同時の解析およびモニタリングを可能にし、他の抗癌薬の作用機序を解明するために成功裏に使用されている。その大きな利点は、それを他のＤＮＡアルキル化剤と識別する、ベンダムスチンの別個の作用機序の同定に至った不偏情報の生成であった。
【００８９】
本アプローチを用い、強い古典的ｐ５３依存性のストレス応答「シグネチャ」がベンダムスチンについて検出され、また、ホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシル処理した細胞で存在したが、しかし大きく低下された強度でであった。Ｑ−ＰＣＲ分析は遺伝子アレイ分析を確認し、ｐ２１（Ｗａｆ／Ｃｉｐ１）およびＮＯＸＡのようなｐ５３応答エレメントを含有する遺伝子の上方制御を検証した。サイクリン依存性キナーゼの阻害剤、とりわけ細胞周期のＧ１期の間に機能するものとして、ｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１はｐ５３誘発性のＧ１停止を少なくとも部分的に媒介すると考えられる。ｐ５３誘発性の細胞周期停止およびアポトーシスに至る機構は広範囲に検討かつ報告されている。Ｎｏｘａはタンパク質のＢｃｌ−２ファミリーのＢｃｌ−２相同性３（ＢＨ３）−ｏｎｌｙメンバーをコードする。ＮＯＸＡは、ｐ５３媒介性のトランス活性化の標的でありかつミトコンドリア機能異常によるｐ５３依存性アポトーシスの媒介物質として機能することが示された。Ｎｏｘａが欠損のマウス胚線維芽細胞は、ＤＮＡ損傷に応答しての癌遺伝子依存性アポトーシスに対する顕著な抵抗性を示した。
【００９０】
ｐ５３前アポトーシス経路の活性化をその後、リン酸化ｐ５３（Ｓｅｒ１５）の検出ならびにＢａｘの上方制御を伴い、イムノブロット分析により確認した。他のナイトロジェンマスタードはｐ５３媒介性ストレス応答を誘導することが以前に報告されているとは言え、ベンダムスチンは、等毒性用量のシクロホスファミド代謝物（ＰＭ）若しくはクロラムブシルに比較した場合に、より強くかつより迅速に誘導されるシグナルを提供する。ベンダムスチンはまた、多様なタンパク質のポリ（ＡＤＰリボシル化）を触媒する酵素ＰＡＲＰの迅速かつ広範囲の切断を誘導することも見出された。ベンダムスチンはＰＡＲＰ切断を誘導するとは言え、ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞でＰＡＲＰ切断を引き起こす該３種の薬物の能力間の差違は顕著であった。ＰＡＲＰ切断のこの迅速な誘導は、ＤＮＡ修復機構に対するＰＡＲＰの重要性を考えれば、ベンダムスチンの作用機序において決定的な役割を演じうる。事実、ＤＮＡ損傷に応答して、細胞は最初にＰＡＲＰを活性化し、ＤＮＡ修復酵素および転写因子へのＤＮＡの到達可能性の増大をもたらす。加えて、ＰＡＲＰはアポトーシス若しくは壊死いずれかによる細胞死の開始に関与している。
【００９１】
ベンダムスチンおよび他の試験したナイトロジェンマスタードの薬ゲノム学プロファイリングから出現した別の大きな差違は、ｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）、Ａｕｒｏｒａキナーゼ（ＡおよびＢ）ならびにサイクリンＢ１の発現レベルに対する影響であった。有糸分裂チェックポイントキナーゼＰＬＫ−１およびＡｕｒｏｒａは、ＣＤＫ／サイクリン複合体の活性化および不活性化、セントロソームの集成および成熟、ならびに分裂中期−分裂後期転移の間の分裂後期促進複合体（ＡＰＣ）の活性化、ならびに細胞質分裂のような細胞周期調節の多くの局面に関与している。興味深いことに、これらのチェックポイント調節物質を、ｓｉＲＮＡを使用して、若しくは標的を定めた小分子を使用して阻害する場合、ＤＮＡ損傷薬物の効果の増強が、細胞分裂異常の出現と一緒になって観察される。細胞分裂異常は、分裂中期の間に発生する細胞死の一形態であり、そして形態学的にアポトーシスと異なる。細胞分裂異常は、機能的ｐ５３の非存在下で、若しくは慣習的なカスパーゼ依存性アポトーシスが抑制されている細胞で発生し得る。この理由から、細胞分裂異常の開始は腫瘍細胞死の目立つ機構である。それはまた慣習的化学療法剤を使用する数回の化学療法により選択された腫瘍細胞中でも機能しうるからである。ベンダムスチンにより導き出される広範囲のかつ耐性のＤＮＡ損傷、およびベンダムスチンによるＭ期特異的チェックポイントの同時の阻害は、処理した細胞中で細胞分裂異常を誘発しうる。これは、シクロホスファミドおよびクロラムブシル含有レジメンに難治性の患者におけるベンダムスチンの臨床で報告された活性を説明しうる。
【００９２】
効率的なＤＮＡ修復機構は、ＤＮＡアルキル化薬の作用機序において決定的な役割を演じていることが示された。別個のＤＮＡ修復機構の活性化はまた、類似の化学的特徴を共有する薬物に対する別個の活性プロファイルも賦与しうる。本明細書に記述される薬ゲノム学分析は、ホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシルに比較して、ベンダムスチンにより示差的に調節されるＤＮＡ修復遺伝子を同定した。１つのこうした遺伝子、エキソヌクレアーゼ１（Ｅｘｏ１）は、ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬホモログと相互作用する５’−３’エキソヌクレアーゼであり、そしてＤＮＡミスマッチ修復の除去段階ならびに二本鎖切断のプロセシングおよび修復に関与している。Ｅｘｏ１は、体細胞突然変異およびクラススイッチ組換えに関与しており、そして従ってＢ細胞機能および抗体の生成において非常に重要である。
【００９３】
ベンダムスチン、シクロホスファミドおよびクロラムブシルの間の修復機構の差違をさらに検討するため、機能アッセイを実施した。２種の主要な機構、すなわち、ＤＮＡ修復タンパク質Ｏ６−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）；およびプリン塩基のない／ピリミジン塩基のないエンドヌクレアーゼＡｐｅ−１を検討した。偏在性酵素ＡＧＴは、ニトロソ尿素およびトリアゼンを包含する数種のアルキル化剤により引き起こされるＯ６−アルキルグアニンＤＮＡ付加物を除去する。臨床上の証拠は、高レベルのＡＧＴを発現する脳腫瘍は、テモゾロミドのような数種のＤＮＡアルキル化剤により抵抗性でありうる脳腫瘍を示唆する。ヌクレオシドＯ６−ベンジルグアニン（Ｏ６−ＢＧ）はＡＧＴタンパク質を効果的に不活性化するための手段を提供する。数種の細胞株において、ベンジルグアニンは、活性化された形態のシクロホスファミドの毒性を明瞭に高める。ここで示されるとおり、シクロホスファミドの細胞傷害効力は、Ｏ６−ベンジルグアニンを添加することにより高められたがしかしベンダムスチンはされず、ベンダムスチンがＡＧＴにより修復され得るＯ６−アルキルグアニンＤＮＡ付加物を誘導しないことを示す。
【００９４】
Ａｐｅ−１／Ｒｅｆ−１は、塩基除去修復（ＢＥＲ）経路で決定的な役割を演じているプリン塩基のない／ピリミジン塩基のないエンドヌクレアーゼである。ＢＥＲは、ＤＮＡアルキル化剤、およびテモゾロミドのようなＤＮＡメチル化剤を包含する多様なＤＮＡ損傷薬物により誘発される損傷により活性化される。Ａｐｅ−１の役割を、その酵素活性の特異的阻害剤、化合物メトキシアミン（ＭＸ）を使用して試験した。ベンダムスチンの細胞傷害活性はＭＸによるＡｐｅ−１の阻害により高められ、ＢＥＲに対する役割を示した。シクロホスファミド代謝物を使用して変化は観察されず、これらの薬物により活性化されるＤＮＡ修復機構間の大きな差違の根拠をなした。
【００９５】
ＮＣＩのヒト腫瘍の６０種の細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング（ＮＣＩ Ｈｕ
ｍａｎ Ｔｕｍｏｒ ６０ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｃｒｅｅｎ）は、潜在的抗腫瘍剤の相対的効力の他の既知治療薬との比較において有用である。化合物の対が、ＣＯＭＰＡＲＥ統計解析プログラムにより評価されるとおり、該一団を使用してのそれらのスクリーニング結果間に高い相関係数を有することが見出される場合は、該剤はしばしば類似の作用機序を有することが、多くの場合にまた示されている。ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシルおよびシクロホスファミドについて観察される高い相関は、全部既知のアルキル化剤とであり、共通の作用機序を見出すＣＯＭＰＡＲＥ解析の能力を確認する。ベンダムスチンとの６種の上位の一致のうち、メチル化剤ＤＴＩＣ（ダカルバジン）のみがおよそ８０％の相関一致（ｒ値）を示した。これらの結果は、ベンダムスチンが他の既知のアルキル化剤に関して異なる作用機序を表すことを示す。
【００９６】
本実施例に提示される結果に基づき、ベンダムスチンの推定される作用機序を図５に具体的に説明する。ベンダムスチンは腫瘍細胞に効率的に進入し得、そして、おそらくベンダムスチンのベンズイミダゾール環系により賦与されるアジリジニウム遷移状態環の高度の化学的安定性により、長期のおよび広範囲のＤＮＡアルキル化および断片化を誘導し得る。ベンダムスチン処置は、３種の主要なシグナル伝達経路、すなわち１）ＮＯＸＡおよびＢａｘのような前アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーにより媒介される固有のアポトーシスの強い活性化をもたらす「正準」ｐ５３依存性ストレス経路の活性化；２）ＮＨＬ若しくはＣＬＬ患者で頻繁に使用される他のナイトロジェンマスタードにより活性化されない塩基除去修復機構のようなＤＮＡ修復機構の活性化；ならびに３）キナーゼＰＬＫ−１ならびにＡｕｒｏｒａ ＡおよびＢのような数種の有糸分裂チェックポイントの阻害の開始をもたらす。ＤＮＡ損傷および有糸分裂チェックポイントの阻害の同時の誘導は、ベンダムスチンに曝露された腫瘍細胞が、有糸分裂を受ける前にＤＮＡ損傷を効率的に修復することを可能にしないとみられる。広範囲に損傷されたＤＮＡを伴い有糸分裂に進入するＤＮＡ、若しくは「慣習的」ｐ５３依存性アポトーシスに進行し得ない細胞は、細胞分裂異常による死を受けることができる。この代替のプログラムされた細胞死経路は、伝統的アポトーシスの強い活性化と一緒になって、ベンダムスチンがｉｎ ｖｉｔｒｏの薬剤耐性細胞で、ならびに化学難治性腫瘍を運搬する患者で有効である理由を示す。結果として、ベンダムスチン処置は、とりわけ、低悪性度の非ホジキンリンパ腫および他の血液学的癌を伴う患者の処置のための臨床家の装備一式への重要な追加を表すことができる。
【実施例２】
【００９７】
ＮＨＬ細胞中でのベンダムスチン活性は細胞分裂異常死経路を誘導する
上の実施例１に記述されるとおり、ベンダムスチンは別個の作用機序をもつアルキル化剤であり、そして伝統的なＤＮＡ損傷剤に難治性のＮＨＬおよびＣＬＬ患者で臨床試験を受けている。ベンダムスチンはＮＨＬ細胞中の遺伝子発現の独特の変化を誘導し、また、他の２−クロロエチルアミンアルキル化剤との交差耐性の欠如を表す。定量的ＰＣＲ分析は、Ｇ２／Ｍチェックポイント調節物質Ｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）およびＡｕｒｏｒａ Ａキナーゼ（ＡｕｒｋＡ）が、臨床上適切な濃度の薬物への曝露の８時間後にＮＨＬ細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−１中で下方制御されることを確認した。これらの同一の遺伝子の変化は、細胞を等毒性用量のクロラムブシル若しくはシクロホスファミドの活性代謝物に曝露した場合に観察されなかった。
【００９８】
古典的なカスパーゼ媒介性のアポトーシスを受けることが不可能な細胞で細胞毒性を誘導するベンダムスチンの能力を検討した。多剤耐性ＭＣＦ−７／ＡＤＲ細胞およびｐ５３欠損ＲＫＯ−Ｅ６結腸腺癌細胞を、５０μＭベンダムスチン単独、若しくは５０μＭベンダムスチンおよび２０μＭ汎カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋいずれかに２若しくは３日間曝露した。ｚＶＡＤ−ｆｍｋはアネキシンＶ陽性細胞中でベンダムスチン誘導性の増
大を阻害することが可能であったとは言え、単独若しくはｚＶＡＤ−ｆｍｋと組合せのいずれかのベンダムスチンで処理した細胞中のＤＮＡ染色ＤＡＰＩを使用する核形態の顕微鏡的分析は、微小核形成の増大された発生率を示した。多／微小核形成および異常なクロマチン凝縮は双方とも細胞分裂異常の顕著な特徴であり、そしてビンカアルカロイドおよびタキサン類のような微小管結合薬物に曝露された腫瘍細胞中で観察されている。細胞分裂異常の活性化は、古典的アポトーシス経路が阻害された腫瘍細胞中でのベンダムスチンの細胞傷害性およびその活性を増幅しうる。
【実施例３】
【００９９】
即効性のベンダムスチンはリンパ腫および白血病細胞での強力なアポトーシスおよび細胞死を活性化する
上述されたとおり、アルキル化剤ベンダムスチンはとりわけ薬剤耐性癌に対し化学療法活性を表し、そして他の関連する抗腫瘍剤に比較した場合に独特の作用機序を有する。他の抗腫瘍性ナイトロジェンマスタードと同様に、ベンダムスチンはヒトで比較的短い血清半減期を有し（およそ２時間）、そしてボーラス静脈内注入により臨床投与される。本実施例で報告される研究の目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで癌細胞に短期間曝露される場合に細胞死およびアポトーシスを誘導するベンダムスチンの能力を評価することであった。こうした実験モデルでのベンダムスチンの活性を、他の構造的に関連する剤と比較した。得られた結果は、ベンダムスチンが細胞への短い（３０分）曝露後に最大の抗腫瘍活性を発揮することを示す。これらの結果を得るため、ＮＨＬ細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−１を、３０分から４時間までの範囲にわたる短期間、５０μＭベンダムスチンに曝露し、洗浄し、そして薬物を含まない培地中で２０時間回復させた。ベンダムスチンに約３０分程度曝露した細胞は、薬物曝露後４８および７２時間に細胞内ＡＴＰおよび上清中へのアデニル酸キナーゼの遊離の測定を包含する多様な生物学的アッセイにより測定されるとおり、生存可能性の大きな喪失を表した（図６および７）。対照的に、この分類のアルキル化剤の他のメンバー（ここでは、クロラムブシル、メルファラン、およびシクロホスファミド代謝物ホスホルアミドマスタード；クロラムブシルおよびホスホルアミドマスタードのデータを示す）で処理した細胞は、これらの剤に３０、６０および１２０分間曝露した場合に生存可能性の最小限の喪失を経験した。これら他のナイトロジェンマスタードは、これらのアッセイでベンダムスチンに匹敵する細胞傷害効果を誘導するのにはるかにより長い曝露期間（最低４時間）を必要とした。これらの知見はＭＴＴに基づくアッセイを使用して確認され、ここでは、ベンダムスチンは、薬物への３０分、４時間若しくは７２時間の曝露後７２時間にＳＵ−ＤＨＬ−１およびＨＬ−６０細胞で類似のＩＣ５０を有した。比較すると、クロラムブシル、メルファランおよびホスホルアミドマスタードは、連続（７２時間）曝露に比較して、これらの同一の細胞株と３０分間インキュベートした場合に１０ないし２０倍より高いＩＣ５０値を表した。
【０１００】
細胞内ＡＴＰレベルは、以下のルシフェラーゼに基づくＡＴＰアッセイを使用してアッセイした。１０ｍＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｒ）試薬を適切な量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ基質（製造元の説明書に従う；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）と混合し、そして混合物を１０分間平衡化させた。１００μＬのこの溶液をその後１００μＬの細胞含有培地と合わせ、そして該混合物を１０分間インキュベートさせた。ＣＣＤに基づくプレートリーダーを使用して発光を検出した。
【０１０１】
処理した細胞の細胞膜が完全性を失い、ＡＤＫが培地（若しくは生物学的サンプルの情況では細胞外空隙、血液など）に放出されるため、アデニル酸キナーゼ（ＡＤＫ）アッセイを選択した。９６ウェルプレートでＡＤＫアッセイを実施するため、各試験ウェル中で、細胞をペレットにするために短時間遠心分離した培地のアリコートからの２０μＬの上清を、たった今調製しかつ１５分間平衡化させた１００μＬのＡＤＫ試薬（製造元の説明書に従った２０ｍＬのＣａｍｂｒｅｘ ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ試薬および適切な量のＣａｍｂｒｅｘ ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ基質；Ｃａｍｂｒｅｘ Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州）と混合した。反応混合物をその後２分間インキュベートしてキナーゼ反応を起こさせた。サンプルからの発光をその後即座にプレートリーダーで読み取った。
【０１０２】
細胞生存率は、特定の細胞培養物の２０μＬのアリコートを、使用直前に１０倍希釈に希釈した１８０μＬのＧｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州ヘイワード）と混合することによってもまたアッセイした。各混合物をその後５分間インキュベートした。ＶｉａＣｏｕｎｔ細胞計数アッセイをその後、１，０００全細胞あたりの生細胞の数が測定されることを可能にするＧｕａｖａ ＰＣフローサイトメーターを使用して実施した。生対死細胞を、それらの劣化しつつある細胞膜を通って死んだ若しくは死につつある細胞に拡散し得る色素７ＡＡＤを使用して識別した。
【０１０３】
実施例１に記述されるとおり、ＰＡＲＰ（ポリ［ＡＤＰリボース］ポリメラーゼ）切断の迅速な誘導は、ＮＨＬ細胞でのベンダムスチン誘導性の細胞死の顕著な特徴である。最大のＰＡＲＰ切断は、５０μＭのＳＤＸ−１０５に約３０分程度曝露しかつ薬物ウォッシュアウト後さらに８時間インキュベートしたＳＵ−ＤＨＬ−１細胞で観察された。ＮＡＲＰ切断は、４０μＭホスホルアミドマスタード、４μＭクロラムブシル若しくは２μＭメルファランで類似の様式で３０分間処理した細胞で観察されなかった。使用した各薬物の濃度は、７２時間の薬物曝露後にＭＴＴ［臭化３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム］に基づくアッセイにより測定されるとおり、５０μＭベンダムスチンと比較した場合に等毒性濃度を表す。
【０１０４】
ＭＴＴアッセイを実施して多様な薬物の用量を滴定して、処理した細胞の５０％を死滅させるのに必要とされる有効濃度を決定した。これらのアッセイは９６ウェルプレートで実施した。濃度は最大５００μＭまでの範囲にわたった。各アッセイにおいて、対照は未処理細胞および死滅細胞を包含した。「ウォッシュアウト」実験で細胞を試験するのに使用するプレートについて、プレートを５分間遠心分離して細胞をペレットにした。培地をその後除去し、細胞ペレットを１×ＰＢＳで１回すすぎ、そしてその後新鮮培地に再懸濁した。細胞を、特定の投薬量の薬物とともに、５．０％ＣＯ２を含有する雰囲気中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に１０μＬのＭＴＴ（１２ｍＭ）試薬（新鮮培地に溶解し、濾過滅菌し、２〜８℃に保存した５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を各ウェルに添加した。４時間インキュベーション後に、１００μＬの溶解緩衝液（２０％ＳＤＳ、０．０１５Ｍ ＨＣｌ）を各ウェルに添加した。混合物を、５．０％ＣＯ２を含有する雰囲気中３７℃に一夜置いて細胞を溶解させた。翌朝、細胞溶解の程度を、５９５ｎｍでのマルチウェル走査分光光度計の示度を使用して測定した。
【０１０５】
匹敵する結果が、ヒト癌細胞株ＨＬ−６０を１００μＭベンダムスチン若しくは１２μＭクロラムブシルで処理することにより得られた。薬物への曝露の期間は３０分、１時間若しくは２．５時間であり、ここで、薬物を含有する培地は示される時間後に除去しかつ薬物を含有しない新鮮培地で置換した。
【０１０６】
一緒にすれば、これらの結果は、それを他の関連するアルキル化剤と識別する、癌細胞との短時間のインキュベーション後でさえ不可逆的細胞死経路を活性化するベンダムスチンの独特の能力を具体的に説明する。こうした即効性の細胞傷害性はベンダムスチンの強力な臨床活性を確認し、そして慣習的化学療法に難治性であるものを包含する多様な癌を処置するためにそれが有用であろうことを示す。
【実施例４】
【０１０７】
臨床データ
本研究は、再発したか若しくは以前の化学療法レジメンに難治性であるＭＨＬを伴う患者でのベンダムスチンの有効性および毒性を評価した。リツキシマブに難治性の患者は処置６か月以内に疾患の進行を有した。
【０１０８】
方法：本フェーズＩＩ多施設試験は、米国およびカナダの１７施設からの再発した低悪性度若しくは形質転換リツキシマブ難治性Ｂ細胞ＮＨＬを伴う患者を登録した。低悪性度の組織学的表現型が患者の８４％で見られた一方、１６％は形質転換疾患を有した。患者の年齢の中央値は６３歳（範囲：３８〜８４歳）であり、そして８８％がステージＩＩＩ／ＩＶの疾患を有した。患者は、２１日毎に６サイクルまで、第１および２日に３０〜６０分にわたるベンダムスチン１２０ｍｇ／ｍ２ ＩＶを受領した。国際作業部会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）の基準を使用して応答を測定した。
【０１０９】
結果：ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ（ＩＴＴ）集団は、２という以前の化学療法の中央値を伴う、７５例の重度に前処置された患者よりなった。ＩＴＴ集団における全体奏功率（ＯＲＲ）は７４％であり；２５％は完全奏功を有し、４９％は部分奏功を有し、１２％は安定を有し、そして１４％は進行を有した。以前のアルキル化剤処置に難治性であった１５例の患者（最低１回の以前のアルキル化剤含有治療後に進行した患者）のうち、１０例（６７％）がベンダムスチンに対する奏功を経験した。応答の持続期間の中央値は全患者について６．６か月、低悪性度患者について９．３か月、および形質転換患者について２．４か月であった。
【０１１０】
結論：単剤ベンダムスチンは、以前のアルキル化剤処置にもまた難治性であった患者を包含する、重度に前処置されたリツキシマブ難治性の低悪性度および形質転換ＮＨＬ患者において、不都合な予後の特徴にもかかわらず、許容できる毒性を伴い、耐えられる奏功を生じた。
【０１１１】
本発明は上の実施例に関して記述されたとは言え、改変および変形が本発明の技術思想および範囲内に包含されることが理解されるであろう。従って、本発明は付随する請求の範囲によってのみ制限される。
【０１１２】
本明細書に開示かつ特許請求される組成物および方法の全部は、本開示に照らして過度の実験を伴わずに作成および実施し得る。本発明の組成物および方法は好ましい態様に関して記述された一方、変形を、付随する請求の範囲により定義されるところの本発明の技術思想および範囲から離れることなく、本明細書に記述される組成物および方法に、ならびに該方法の段階若しくは段階の連続において適用しうることが当業者に明らかであろう。
【０１１３】
本明細で挙げられる全部の特許、特許出願および刊行物は、本発明の関する技術分野の当業者の水準を暗示する。優先権若しくは別の利益が特許請求されるものを包含する全部の特許、特許出願および刊行物は、各個々の刊行物が引用することに組み込まれることをとりわけかつ個々に示した場合と同一の程度まで、そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
本明細書に具体的に記述される本発明は、適しては本明細書にとりわけ開示されないいかなる要素（１種若しくは複数）の非存在下でも実施しうる。従って、例えば、本明細書の各例において、「含んでなる」、「より本質的になる」および「よりなる」という用語のいずれも、他の２用語のいずれかで置換されうる。使用された用語および表現は、記述の条件としてかつ制限の条件としてでなく使用され、そして、こうした用語および表現の使用において、示されかつ記述される特徴若しくはそれらの部分のいかなる同等物も排除
するという意図は存在しないが、しかし、特許請求される本発明の範囲内で多様な改変が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい態様および任意の特徴により具体的に開示されたとは言え、開示される本明細書の概念の改変および変形が当業者により行われうること、ならびにこうした改変および変形は付随する請求の範囲により定義されるところの本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】遺伝子発現プロファイルをそれぞれ示す２図ＡおよびＢを有する。該図は１２，０００種以上の既知遺伝子を含有するＡｆｆｙｍｅｔｉｘ遺伝子チップ（Ｕ１３３Ａ）を使用して非ホジキンリンパ腫細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−１で測定した遺伝子発現の変化を示す。ベンダムスチンはＩＣ５０（２５μＭ；レーン１）およびＩＣ９０（３５μＭ；レーン２）で試験した。クロラムブシル（５μＭ；レーン３）およびホスホルアミドマスタード（シクロホスファミド代謝物、５０μＭ；レーン４）はＩＣ９０で試験した。ｍＲＮＡの単離は曝露後８時間に実施した。Ａ．示されるクラスター図は対照（希釈剤、ＤＭＳＯ）に比較しての上位１００種の最も調節される遺伝子を表す。赤色は上方調節された遺伝子を表し；青色は下方制御された遺伝子を表す。Ｂ．該クラスター図は全３種の試験した薬物により同時に誘導される遺伝子を表す。
【図２】３個の棒グラフ２Ａ、２Ｂおよび２Ｃを有する。Ｑ−ＰＣＲ分析を、等毒性濃度のベンダムスチン、ホスホルアミドマスタードおよびクロラムブシルに曝露したＳＵ−ＤＨＬ−１細胞で、下の方法の節に記述されるとおり実施した。入力ｃＤＮＡのレベルは１８ｓ ＲＮＡについてのアッセイを使用して正規化し、そして未処理サンプル中の転写物のレベルを１に設定した。図２Ａは、２種の代表的なｐ５３依存性遺伝子ｐ２１およびＮＯＸＡの相対的ＲＮＡレベルを示す。図２ＢはＭ期の細胞周期チェックポイントに関与する４種の遺伝子、すなわちｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）、ａｕｒｏｒａキナーゼＡおよびＢ、ならびにサイクリンＢ１のＲＮＡレベルを示す。図２ＣはＤＮＡ修復機構に関与する遺伝子ＥＸＯ１およびＦｅｎ１の相対的ＲＮＡレベルを示す。柱（ｃｏｌｕｍｎ）はＤＭＳＯ処理対照からの変化の倍数の平均±ＳＥを表す。結果は３回の独立した実験から得た。
【図３】ＮＨＬ細胞（ＳＵ−ＤＨＬ−１）でのシクロホスファミド（５０μＭ）およびクロラムブシル（４μＭ）に比較してのベンダムスチン（５０μＭ）のその高められたアポトーシス効果を示す数種のイムノブロットを示す。これらのイムノブロットを生成するため、細胞ライセートを、下の実験の節に記述されるとおり２０時間の曝露後に調製した。β−アクチンでのメンブレンのプロービングが負荷対照としてはたらき、そして調節されたタンパク質の下に示される。左上図は、リン酸化型特異的抗体を使用して検出された、Ｓｅｒ１５がリン酸化されたｐ５３の発現を表す。左中図は全ｐ５３およびｐ２１発現を示す。左下図はＢａｘの発現を表す。右図は、特異的カスパーゼ切断部位を認識する抗体を使用しての完全長ＰＡＲＰ（上）およびＰＡＰＰのカスパーゼ切断フラグメントの発現を示す。
【図４】選択されたＤＮＡ修復機構の機能分析を表す２グラフＡおよびＢよりなる。図４Ａは、ベンダムスチンが塩基除去修復（ＢＥＲ）を介するＤＮＡ損傷修復に至るがしかしシクロホスファミドは至らないことを示す。修復酵素Ａｐｅ−１（ベンダムスチンの細胞傷害活性においてＢＥＲ経路で決定的な役割を演じているプリン塩基のないエンドヌクレアーゼ）、およびシクロホスファミド代謝物ホスホルアミドマスタード（ＰＭ）の役割を、Ａｐｅ−１阻害剤メトキシアミン（ＭＸ）を使用して評価した。ベンダムスチンおよびＭＸで観察される曲線の左方移動は、ベンダムスチンにより生じられるＤＮＡ損傷がＢＥＲにより修復されることを示す。図４Ｂは、ＭＧＭＴ修復活性の阻害がベンダムスチンの細胞傷害性に影響を及ぼさないことを示す。ベンダムスチンの細胞傷害活性における修復酵素ＭＧＭＴ（Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）の役割を、ＭＧＭＴ阻害剤Ｏ６−ベンジルグアニン（Ｏ６−ＢＧ）を使用して評価した。Ｏ６−ベンジルグアニンの添加はベンダムスチンのＩＣ５０を有意に変化せず、従って、ベンダムスチンがＯ６−アルキルグアニンＤＮＡ付加物を誘導することはありそうにない。対照的に、Ｏ６−ベンジルグアニンは、カルムスチンおよびホスホルアミドマスタード（ＰＭ）のような他のナイトロジェンマスタードに対し細胞を大きく感作する。
【図５】ベンダムスチンが腫瘍細胞に効率的に進入し、かつ、最低３種のシグナル伝達経路、すなわち１）おそらくＮＯＸＡおよびＢａｘのような前アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーにより媒介される固有のアポトーシスの強い活性化をもたらす「正準」ｐ５３依存性ストレス経路の活性化；２）ＮＨＬ若しくはＣＬＬ患者で頻繁に使用される他のアルキル化剤により活性化されない塩基除去修復機構のようなＤＮＡ修復機構の活性化；ならびに３）キナーゼＰＬＫ−１ならびにＡｕｒｏｒａ ＡおよびＢのような数種の有糸分裂チェックポイントの阻害の開始をもたらす、長期のかつ広範囲のＤＮＡ損傷を誘導することを具体的に説明する。特定の論理に束縛されることを願わない一方、ＤＮＡ損傷の同時の誘導および有糸分裂チェックポイントの阻害が、おそらく、ベンダムスチンに曝露された腫瘍細胞が有糸分裂を受ける前にＤＮＡ損傷を効率的に修復することを予防する。細胞は従って損傷されたＤＮＡを伴い有糸分裂に進入するか、若しくは「慣習的」ｐ５３依存性アポトーシスに進行し得ない細胞が、細胞分裂異常による死を受けることができる。この代替のプログラムされた細胞死経路は、伝統的なアポトーシスの強い活性化と一緒になって、ベンダムスチンがｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬剤耐性癌細胞の死滅においてならびに化学難治性腫瘍を有する患者において非常に有効である理由であると考えられる。
【図６】下の実施例３に記述される「ウォッシュアウト」実験のいくつかの経過で実施したアデニル酸キナーゼアッセイの結果を示すヒストグラムである。これらの実験において、ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞を５０μＭベンダムスチン、２０μＭホスホルアミドマスタード若しくは２μＭクロラムブシルのいずれかで３０、６０若しくは９０分間のいずれか処理した。調時的薬物インキュベーション後に、細胞を１×ＰＢＳで洗浄して特定の化学療法剤を「洗い流し」、そしてその後新鮮培地を添加した。細胞をその後４８時間培養し、その時間の後にアデニル酸キナーゼアッセイを細胞上清で実施した。桃色の棒は０分の薬物（すなわち薬物なし）インキュベーションを表す。緑色の棒は３０分のインキュベーションを表し、橙色の棒は６０分のインキュベーションを表し、そして紫色の棒は１２０分のインキュベーションを表す。該結果は、３種の薬物および「薬物なし」対照に対する上清中のアデニル酸キナーゼ活性のレベルをプロットする。標準偏差を該グラフの各棒の上部に表す。
【図７】図６のように、下の実施例３に記述される「ウォッシュアウト」実験のいくつかの経過で実施したアデニル酸キナーゼアッセイの結果を示すヒストグラムである。図６および７に描かれる結果間の差違は、図６に表されるデータが、薬物のそれぞれが培養物から「洗い流された」後の４８時間の細胞培養に関する一方、図７のデータは特定の薬物を「洗い流した」後の７２時間の細胞培養に関することである。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者が死抵抗性癌細胞を特徴とする癌を有することを決定すること、次いで治療上有効な量のベンダムスチンを該患者に投与することを含んでなる、癌の処置方法。
【請求項２】
癌がアポトーシスに抵抗性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
死抵抗性癌細胞がｐ５３欠損を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌が非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ベンダムスチンを投与すること、最低約３０分しかし約４８時間を超えない間待機すること、および細胞が細胞周期のＳ期にある場合により活性である別の化学療法剤（１種若しくは複数）を投与することを含んでなる、癌患者の処置方法。
【請求項６】
化学療法剤が、ベンダムスチンの投与の約３０分ないし約３６時間後に与えられる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化学療法剤が、ベンダムスチンの投与の約３０分ないし２４時間後に与えられる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
化学療法剤が、ベンダムスチンの投与の約３０分ないし１２時間後に与えられる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
化学療法剤が、ベンダムスチンの投与の約３０分ないし６時間後に与えられる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
患者が死抵抗性癌細胞を特徴とする癌を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
癌患者から採取した生物学的サンプル中の癌細胞死のマーカーのレベルが処置の有効性と相関するかどうかを決定することを含んでなり、該決定が該癌を処置することを意図している治療レジメンの投与の間若しくは後になされ、該治療レジメンがアルキル化剤の投与を含んでなる、癌処置の有効性の評価方法。
【請求項１２】
アルキル化剤がベンダムスチンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ａ．治療上有効な量のベンダムスチンで癌を処置すること；
ｂ．ベンダムスチンに所望の治療効果を発揮させるのに十分な時間待機すること；およびｃ．癌細胞死のマーカーのレベルを測定して、ベンダムスチンでの処置が有効であったかどうか決定すること
を含んでなる、癌処置の有効性の評価方法。
【請求項１４】
第一の用量の治療上有効な量のベンダムスチンを患者に投与すること（第一のベンダムスチン用量が望ましくない毒性をもたらす）、および、該望ましくない毒性が弱まり始めた後まで該患者への第二の用量の治療上有効な量のベンダムスチンの投与を遅らせることを含んでなる、癌患者にベンダムスチンの複数の用量を投与することを含んでなる癌治療に伴う毒性の低減方法。
【請求項１５】
ａ．患者の癌組織からの細胞サンプルの少なくとも一部分を、癌細胞に対し毒性である
化合物の非存在下で該癌細胞を増殖させる増殖条件下でベンダムスチンに曝露すること；および
ｂ．該癌がベンダムスチン曝露に感受性であるかどうか評価すること
を含んでなる、患者の癌がベンダムスチンに感受性であるかどうかの評価方法。
【請求項１６】
癌がベンダムスチン曝露に感受性であるかどうかの評価が、癌細胞死のマーカーのレベルを測定することを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
癌細胞死のマーカーが、アデニル酸キナーゼ活性のレベル、細胞の生存率およびＰＡＲＰ切断生成物のレベルよりなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者が１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤に抵抗性と特徴づけられる癌を有することを決定することを含んでなり、前記患者に治療上有効な量のベンダムスチンを投与することを含んでなる、癌の処置方法。
【請求項１９】
癌が非ホジキンリンパ腫である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗ＣＤ２０剤がリツキシマブである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
死抵抗性癌細胞を特徴とする癌を処置するための使用のためベンダムスチンを販促することを含んでなる、死抵抗性癌細胞を特徴とする癌の処置に関連する事業を行う方法。
【請求項２２】
癌が、１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤の組合せを含んでなる処置に対し難治性の癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
難治性癌を処置するためのベンダムスチン使用を販促することを含んでなる、難治性癌の処置に関連する事業を行う方法。
【請求項２４】
難治性癌が、１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤の組合せでの処置に難治性の癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
死抵抗性癌細胞を特徴とする癌の処置のための医薬品の製造におけるベンダムスチンの使用。
【請求項２６】
難治性癌の処置のための医薬品の製造におけるベンダムスチンの使用。
【請求項２７】
難治性癌が、１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤の組合せでの処置に難治性の癌である、請求項２６に記載の使用。
【請求項１】
患者が死抵抗性癌細胞を特徴とする癌を有することを決定すること、次いで治療上有効な量のベンダムスチンを該患者に投与することを含んでなる、癌の処置方法。
【請求項２】
癌がアポトーシスに抵抗性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
死抵抗性癌細胞がｐ５３欠損を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌が非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ベンダムスチンを投与すること、最低約３０分しかし約４８時間を超えない間待機すること、および細胞が細胞周期のＳ期にある場合により活性である別の化学療法剤（１種若しくは複数）を投与することを含んでなる、癌患者の処置方法。
【請求項６】
化学療法剤が、ベンダムスチンの投与の約３０分ないし約３６時間後に与えられる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化学療法剤が、ベンダムスチンの投与の約３０分ないし２４時間後に与えられる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
化学療法剤が、ベンダムスチンの投与の約３０分ないし１２時間後に与えられる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
化学療法剤が、ベンダムスチンの投与の約３０分ないし６時間後に与えられる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
患者が死抵抗性癌細胞を特徴とする癌を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
癌患者から採取した生物学的サンプル中の癌細胞死のマーカーのレベルが処置の有効性と相関するかどうかを決定することを含んでなり、該決定が該癌を処置することを意図している治療レジメンの投与の間若しくは後になされ、該治療レジメンがアルキル化剤の投与を含んでなる、癌処置の有効性の評価方法。
【請求項１２】
アルキル化剤がベンダムスチンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ａ．治療上有効な量のベンダムスチンで癌を処置すること；
ｂ．ベンダムスチンに所望の治療効果を発揮させるのに十分な時間待機すること；およびｃ．癌細胞死のマーカーのレベルを測定して、ベンダムスチンでの処置が有効であったかどうか決定すること
を含んでなる、癌処置の有効性の評価方法。
【請求項１４】
第一の用量の治療上有効な量のベンダムスチンを患者に投与すること（第一のベンダムスチン用量が望ましくない毒性をもたらす）、および、該望ましくない毒性が弱まり始めた後まで該患者への第二の用量の治療上有効な量のベンダムスチンの投与を遅らせることを含んでなる、癌患者にベンダムスチンの複数の用量を投与することを含んでなる癌治療に伴う毒性の低減方法。
【請求項１５】
ａ．患者の癌組織からの細胞サンプルの少なくとも一部分を、癌細胞に対し毒性である
化合物の非存在下で該癌細胞を増殖させる増殖条件下でベンダムスチンに曝露すること；および
ｂ．該癌がベンダムスチン曝露に感受性であるかどうか評価すること
を含んでなる、患者の癌がベンダムスチンに感受性であるかどうかの評価方法。
【請求項１６】
癌がベンダムスチン曝露に感受性であるかどうかの評価が、癌細胞死のマーカーのレベルを測定することを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
癌細胞死のマーカーが、アデニル酸キナーゼ活性のレベル、細胞の生存率およびＰＡＲＰ切断生成物のレベルよりなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者が１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤に抵抗性と特徴づけられる癌を有することを決定することを含んでなり、前記患者に治療上有効な量のベンダムスチンを投与することを含んでなる、癌の処置方法。
【請求項１９】
癌が非ホジキンリンパ腫である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗ＣＤ２０剤がリツキシマブである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
死抵抗性癌細胞を特徴とする癌を処置するための使用のためベンダムスチンを販促することを含んでなる、死抵抗性癌細胞を特徴とする癌の処置に関連する事業を行う方法。
【請求項２２】
癌が、１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤の組合せを含んでなる処置に対し難治性の癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
難治性癌を処置するためのベンダムスチン使用を販促することを含んでなる、難治性癌の処置に関連する事業を行う方法。
【請求項２４】
難治性癌が、１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤の組合せでの処置に難治性の癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
死抵抗性癌細胞を特徴とする癌の処置のための医薬品の製造におけるベンダムスチンの使用。
【請求項２６】
難治性癌の処置のための医薬品の製造におけるベンダムスチンの使用。
【請求項２７】
難治性癌が、１種若しくはそれ以上のアルキル化剤および抗ＣＤ２０剤の組合せでの処置に難治性の癌である、請求項２６に記載の使用。
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００８−５１９０４７（Ｐ２００８−５１９０４７Ａ）
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４００８６（Ｐ２００７−５４００８６）
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４００６８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６５３９２
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０５１５８０２４）セフアロン・インコーポレーテツド (21)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４００６８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６５３９２
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０５１５８０２４）セフアロン・インコーポレーテツド (21)
【Ｆターム（参考）】
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