本発明は、非造血系癌細胞に発現するＣＤ４３およびＣＥＡのエピトープには特異的に結合するが、白血球またはＪｕｒｋａｔ細胞に発現するＣＤ４３には特異的に結合せず、かつ、非造血系癌細胞の細胞表面のエピトープへの結合後、細胞毒コンジュゲーションおよび免疫エフェクター機能の非存在下で非造血系癌細胞のアポトーシスを誘導することができる新規な抗体であって、エピトープは、炭水化物構造を含み、エピトープに対する抗体の結合は、Ｌｅ^ａ構造、Ｌｅ^ａ−ラクトース構造、ＬＮＤＦＨ ＩＩ構造またはＬＮＴ構造を含む炭水化物により阻害される、抗体を提供する。さらに、本発明は、診断および治療目的での本明細書に記載の抗体の使用も提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００６年６月７日に出願された米国仮出願第６０／８１１，８５０号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、非造血系腫瘍または癌細胞に発現するＣＤ４３および癌胎児性抗原（ＣＥＡ：ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）のエピトープを含む炭水化物を認識する新規なモノクローナル抗体に関する。これらの抗体は、細胞毒コンジュゲーションおよび免疫エフェクター機能の非存在下でそうした非造血系腫瘍または癌細胞において細胞死（たとえば、アポトーシス）を誘導する特性を有する。これらのモノクローナル抗体は、診断薬および治療薬として有用である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＣＤ４３（シアロホリンまたはロイコシアリンとも呼ばれる）は、シアル酸に富む分子で、すべてのＴ細胞を含むほとんどのヒト白血球および血小板において高度に発現し、分子量は、１１５，０００〜１３５，０００である。Ｘ染色体関連劣性免疫不全障害であるウィスコット−アルドリッチ症候群の男性Ｔ細胞では、ＣＤ４３の発現が不完全である（Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら、（１９８７）Ｂｌｏｏｄ ７０（１）：１０４−９；Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌら、（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９：１７０５−２３）。
【０００４】
機能の研究から、抗ＣＤ４３モノクローナル抗体が末梢血Ｔリンパ球の増殖（Ｍｅｎｔｚｅｒら、（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１；１６５（５）：１３８３−９２；Ｐａｒｋら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５０：７０６−９）および単球の活性化（Ｎｏｎｇら、（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１：１７０（１）：２５９−６７）を刺激することが明らかにされた。モノクローナル抗ＣＤ４３抗体Ｌ１１は、リンパ節およびパイエル板ＨＥＶ（ｈｉｇｈ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｖｅｎｕｌｅ）へのＴ細胞の結合を遮断する。抗体Ｌ１１は、血液から系統的な二次リンパ組織へのＴ細胞の血管外遊走を阻害する（ＭｃＥｖｏｙら、（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１４９３−８）。ＣＤ４３分子を認識するモノクローナル抗体は、ＣＤ３４を高密度で発現する、細胞系統マーカー陰性の骨髄造血前駆細胞（ＨＰＣ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（Ｂａｚｉｌら、（１９９６）Ｂｌｏｏｄ，８７（４）：１２７２−８１．）およびヒトＴリンパ芽球様細胞（Ｂｒｏｗｎら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７６８６−９５）のアポトーシスを誘導する。最近の研究ではさらに、ＣＤ４３が、ヒトＴ細胞のＥ−セレクチンのリガンドとして機能することも示唆された（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００５】
興味深いことに、科学者らにより、ある種の非造血系腫瘍細胞、特に結腸直腸腺癌の細胞表面にもＣＤ４３分子が発現することが発見されている。非特許文献３：非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６を参照されたい。結腸癌細胞株（ＣＯＬＯ２０５）に発現するＣＤ４３のグリカンは、白血球のＣＤ４３のグリカンと異なることが明らかになっている（Ｂａｅｃｋｓｔｒｏｍら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１１５０３−９）。ＣＤ４３が過剰に発現すると、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３が活性化され（非特許文献７）、ｐ６５の転写活性の阻害などによりＮＦ−κＢ標的遺伝子のサブセットが抑制されると考えられてきたが（非特許文献８）、結腸腫瘍形成におけるＣＤ４３の原因的役割を示す直接的な証拠は未だに認められていない。非造血系腫瘍細胞の治療剤として従来の抗ＣＤ４３抗体を用いるのは、腫瘍にも免疫Ｔ細胞にも強く結合するため実用的ではない。非造血系腫瘍または癌細胞に発現するＣＤ４３に特異的に結合しても、白血球または造血系由来の他の細胞に発現するＣＤ４３には結合しない抗体を作製することが依然として求められている。こうした抗体は、ＣＤ４３を発現する非造血系癌を処置する治療薬として有用である可能性がある。
【０００６】
ＣＥＡは通常、種々の腺上皮組織（胃腸管、気道および尿生殖管など）に発現し、細胞の頂端膜側に局在していると思われる（非特許文献９）。こうした組織から生じる腫瘍では、頂端膜ドメインから細胞表面全体に延在するＣＥＡの発現レベルが上昇するとともに、このタンパク質が血液へ分泌される（非特許文献９）。結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、肝細胞癌、乳房癌および甲状腺癌など、多くのタイプの癌では、ＣＥＡの過剰な発現が観察された。したがって、ＣＥＡは、腫瘍マーカーとして用いられており、癌の予後および管理においては、癌患者の血液中のＣＥＡ量の増加を測定するため、免疫学的アッセイが長年にわたり臨床の場で用いられている（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。
【０００７】
より重要なのは、ＣＥＡが、標的治療の腫瘍関連抗原として有用性が期待されるようになったことである（非特許文献１３）。癌免疫療法にＣＥＡを標的として用いる主要な戦略が２つ開発されている。１つの方法は、抗ＣＥＡ抗体によるＣＥＡ発現腫瘍細胞への自殺遺伝子（一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ：ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子）（Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ．ら、（２０００）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０（６Ａ）：４０６７−７１）または同位元素（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ Ｒ Ｗ．ら、（２００１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９８，１０２５６−６０，Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｍ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，８６：１３９２−１４０３，Ｏｌａｆｓｅｎ Ｔ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１７，２１−２７，２００４）の特異的ターゲティングである。また、この方法は、抗体、あるいは、薬物、トキシン、放射性ヌクレオチド、免疫調節物質（ｉｍｍｕｍｏｄｕｌａｔｏｒ）またはサイトカインなどの治療薬とコンジュゲートされた抗体フラグメントを使用するまでに広がっている。もう１つの方法は、免疫細胞溶解活性を利用するもので、具体的には抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によりＣＥＡ発現腫瘍細胞を除去する（Ｉｍａｋｉｉｒｅ Ｔら、，（２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１０８，５６４−５７０）。これらの方法は、サイトカインを放出させるため、副作用が認められる場合が多い。
【０００８】
本明細書に開示する参考文献、刊行物および特許出願については、参照によってその全体を本明細書に援用する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５）１７５：８０４２−５０
【非特許文献２】Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅら、Ｂｌｏｏｄ（２００６）１０７：１４２１−６
【非特許文献３】Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６）５６：３５２６−９
【非特許文献４】Ｂａｅｃｋｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：１３６８８−９２
【非特許文献５】Ｂａｅｃｋｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２：１１５０３−９
【非特許文献６】Ｓｉｋｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９７）２３８：６１２−６
【非特許文献７】Ｋａｄａｊａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００４）２３：２５２３−３０
【非特許文献８】Ｌａｏｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．（２００６）２８：６９５−７０４
【非特許文献９】Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｓ． Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．（１９９９）９，６７−８１．
【非特許文献１０】Ｇｏｌｄ Ｐ，ら、Ｊ．Ｅｘｐｌ．Ｍｅｄ．（１９６５）１２２：４６７−８１
【非特許文献１１】Ｃｈｅｖｉｎｓｋｙ，Ａ．Ｈ． Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．（１９９１）７，１６２−１６６
【非特許文献１２】Ｓｈｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９８５）２，３５５−３９９
【非特許文献１３】Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ，ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００２）２２：４２５５−６４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
要旨
一態様では、本発明は、非造血系癌細胞に発現するＣＤ４３およびＣＥＡのエピトープには特異的に結合するが、白血球（たとえば、ヒト末梢性Ｔ細胞）またはＪｕｒｋａｔ細胞（リンパ芽球様の白血病細胞）に発現するＣＤ４３には特異的に結合しない新規な抗体を提供する。抗体が結合するエピトープは、炭水化物を含む。こうした抗体は、そうした非造血系癌細胞において、抗体への細胞毒コンジュゲーションおよび免疫エフェクター機能の非存在下で細胞死を誘導することができる。
【００１１】
本発明は、非造血系癌細胞に発現するＣＤ４３および／またはＣＥＡのエピトープには特異的に結合するが、白血球またはＪｕｒｋａｔ細胞に発現するＣＤ４３には特異的に結合せず、かつ、非造血系癌細胞の細胞表面に発現するエピトープへの結合後、細胞毒コンジュゲーションおよび免疫エフェクター機能の非存在下で、非造血系癌細胞のアポトーシスを誘導することができる抗体であって、エピトープは、炭水化物を含み、エピトープに対する抗体の結合は、Ｌｅ^ａ構造、Ｌｅ^ａ−ラクトース構造、ＬＮＤＦＨ ＩＩ構造またはＬＮＴ構造を含む炭水化物により阻害される、抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体が結合するエピトープは、フコース感受性である。
【００１２】
非造血系癌細胞は、結腸直腸癌および胃癌由来の細胞を含むが、これに限定されるものではない。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、非造血系癌細胞の細胞表面に発現するエピトープに結合すると、癌細胞の数を減少させ、および／または癌細胞の成長または増殖を阻害する。たとえば、抗体の存在下での細胞数の減少率または細胞成長の阻害率は、抗体の非存在下での細胞数または細胞成長と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６５％、約７５％またはそれ以上のいずれかである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、非造血系癌細胞に発現するＣＤ４３およびＣＥＡの細胞外ドメインの立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｐｉｔｏｐｅ）を認識し、立体構造エピトープは、トリペプチドが形成する構造、Ｎ’−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｃ’と等価な物理的特徴および化学的特徴を持つ構造を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、Ｎ末端にアミノ酸配列Ｎ’−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｃ’を含むポリペプチドに結合する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、非造血系癌細胞の細胞表面にあるエピトープへの結合において、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、非造血系癌細胞の細胞表面にあるエピトープへの結合において、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、非造血系癌細胞の細胞表面に発現するエピトープへの結合において、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列由来の３つのＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列由来の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列由来の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸配列由来の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５のアミノ酸配列由来の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域および配列番号６のアミノ酸配列由来の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むヒト化抗体である。
【００２３】
別の態様では、本発明は、重鎖および／または軽鎖または本明細書に記載の抗体のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。また、本発明は、本明細書に記載の抗体のいずれかに由来するポリペプチドであって、非造血系癌細胞に発現するＣＤ４３およびＣＥＡのエピトープには特異的に結合するが、白血球またはＪｕｒｋａｔ細胞に発現するＣＤ４３には特異的に結合せず、かつ、非造血系癌細胞の細胞表面に発現するＣＤ４３への結合後、細胞毒コンジュゲーションおよび免疫エフェクター機能に非存在下で、非造血系癌細胞のアポトーシスを誘導することができる、ポリペプチドを提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドのいずれかをコードしているポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含むベクター（発現ベクターなど）を提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドのいずれかを含む組成物を提供する。ある実施形態では、抗体またはポリペプチドを薬品に結合させる。いくつかの実施形態では、薬品は、治療薬（たとえば、放射性部分、細胞毒および化学療法剤）である。いくつかの実施形態では、薬品は、標識（たとえば、酵素、蛍光分子およびビオチン）である。
【００２６】
また、本発明は、本明細書に記載の抗体またはポリペプチド、あるいは、その抗体もしくはポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのいずれかおよび薬学的に許容されるキャリアを有効量で含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、抗体またはポリペプチドを治療薬に結合させる。いくつかの実施形態では、組成物を、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射および筋肉内注射による投与用および経口、粘膜、吸入、舌下などのような他の投与形態用に製剤化する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、組成物は、本発明の複数種の抗体を含んでもよいし、本発明の抗体１種類と一緒に１種または複数種の他の抗癌抗体または他の抗癌剤を含んでもよい。
【００２８】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドを作製する方法であって、抗体またはポリペプチドを作製できる条件下で宿主細胞またはその子孫を培養することを含み、宿主細胞は、抗体またはポリペプチドをコードしている発現ベクターを含む、方法を提供する いくつかの実施形態では、この方法は、抗体またはポリペプチドを精製することをさらに含む。
【００２９】
別の態様では、本発明は、好適な細胞において１種または複数種の抗体をコードしているポリヌクレオチドを発現させる（１つのベクターから、１つの軽鎖または重鎖として別々に発現させても、軽鎖および重鎖の両方として発現させもよい）ことで本明細書に記載の抗体のいずれかを作製し、通常、その後、目的の抗体またはポリペプチドを回収および／または単離する、方法を提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、細胞表面にエピトープを発現している非造血系癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、癌細胞を本明細書に記載の抗体またはポリペプチドと接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌細胞は、個体内にある。
【００３１】
別の態様では、本発明は、個体の非造血系癌を処置する方法であって、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドを含む組成物を有効量で個体に投与することを含み、抗体またはポリペプチドは個体の癌細胞に結合する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌は、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌または肺癌である。
【００３２】
別の態様では、本発明は、個体の非造血系癌を処置する方法であって、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドおよび別の抗癌剤を一定量で個体に投与することを含み、抗体またはポリペプチドは、個体の癌細胞に結合し、それにより抗体またはポリペプチドおよび抗癌剤の併用が個体の癌の効果的な処置となる、方法を提供する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、個体の非造血系癌を処置するキットであって、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドを含む、キットを提供する。こうしたキットは、癌を処置するために抗体またはポリペプチドを個体に投与する際の説明書をさらに含んでも構わない。
【００３４】
別の態様では、本発明は、非造血系癌の検出または診断、非造血系癌のある個体の処置を目的とした特定、あるいは非造血系癌の進行の監視を行う方法であって、サンプルを本明細書に記載の抗体またはポリペプチドと接触させることと、サンプルの細胞に対する抗体またはポリペプチドの結合の有無またはレベルを検出することとを含む、方法を提供する。サンプルにおいて抗体と細胞間で結合が見られれば、サンプルに癌細胞が含まれている可能性があり、および／または癌のある個体を本明細書に記載の抗体で処置してもよいことが示唆される。この方法は、結合のレベルを対照と比較するステップをさらに含んでも構わない。
【００３５】
別の態様では、本発明は、非造血系癌の検出または診断、非造血系癌のある個体の処置を目的とした特定、あるいは非造血系癌の進行の監視を行うキットであって、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドおよびサンプルにおける細胞に対する抗体またはポリペプチドの結合を検出する試薬を含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、５Ｆ１の標的タンパク質の同定結果を示す。ＣＯＬＯ２０５ライセート（レーン１および３）またはＣＯＬＯ３２０ライセート（レーン２および４）由来の、５Ｆ１のイムノアフィニティーカラムの溶出液中のタンパク質を、市販の抗ＣＤ４３抗体ＡＦ２０３８（レーン１および２）または抗体５Ｆ１（レーン３および４）でイムノブロットした。
【図２Ａ】図２Ａは、３種の癌細胞株：結腸直腸癌細胞（ＣＯＬＯ２０５およびＤＬＤ−１）および胃癌細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７）に対する抗体５Ｆ１の結合のフローサイトメトリー解析結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、正常な内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、正常な（胎児）肺細胞（ＭＲＣ−５）、正常な乳腺上皮細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）、正常な結腸直腸細胞（ＣＣＤ８４１−ＣｏＮ）、活性化Ｔリンパ球（活性化は７日間）または正常な末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対する抗体５Ｆ１の結合のフローサイトメトリー解析結果を示す。
【図３】図３は、抗体５Ｆ１または９Ｅ１０（抗ｍｙｃ抗体）あるいは対照培地の存在下で、６、２４および４８時間インキュベートした後のＣＯＬＯ２０５細胞の細胞質におけるヌクレオソームの平均エンリッチメントを示す。
【図４】図４は、抗体５Ｆ１、９Ｅ１０またはアジドとインビトロで７２時間インキュベートした後、ＷＳＴ−１アッセイで測定したＣＯＬＯ２０５の細胞成長の結果を示す。
【図５】図５は、ＷＳＴ−１アッセイで測定した細胞成長の結果を示す。結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞ＣＯＬＯ２０５および正常な結腸直腸細胞株ＣＣＤ８４１−ＣｏＮを、未処理あるいは９Ｅ１０、５Ｆ１（「ｍ１３３−５Ｆ１」という）または０．５％アジドとインキュベートした。
【図６】図６は、様々な濃度の５Ｆ１（０、２、４、８、１６、３２、６４ｕｇ／ｍｌ）、９Ｅ１０（６４ｕｇ／ｍｌ）または０．５％アジドとのインキュベーション後のＣＯＬＯ２０５細胞のＭＴＴ染色の結果を示す。
【図７】図７は、ＳＣＩＤマウスのヒトＣＯＬＯ２０５腫瘍に対する抗体５Ｆ１（「ｍ１３３−５Ｆ１」ともいう）のインビボでの（腫瘍の大きさに対する）作用を示す。抗体５Ｆ１（５００μｇ／注射）または対照抗体９Ｅ１０（５００μｇ／注射）あるいはＰＢＳ（未処理）を０、３、５、７、１０、１２、１４および１７日目に注射した。
【図８】図８は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＣＯＬＯ２０５腫瘍に対する化学薬品５ＦＵ／ＬＶを加えた抗体５Ｆ１のインビボでの作用（腫瘍の大きさに対する）を示す。ＣＯＬＯ２０５細胞の接種から１週間後、２５ｍｇ／ｋｇの５ＦＵ／ＬＶを１日おきに４回静脈内注射した。腫瘍移植から７日後３週にわたり、抗体５Ｆ１を０、６．２５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇで週２回腹腔内注射した。
【図９】図９Ａは、ＣＯＬＯ２０５細胞に対するキメラ抗体５Ｆ１の結合のフローサイトメトリー結果を示す。図９Ｂは、ＣＯＬＯ２０５細胞と対照培地（未処理）、アジ化ナトリウム（０．５％）、マウス抗体５Ｆ１（ｍ５Ｆ１、２〜３２μｇ／ｍｌ）またはキメラ抗体５Ｆ１（ｃ５Ｆ１、２〜３２μｇ／ｍｌ）とのインキュベーション後のアネキシンＶ陽性細胞およびＰＩ陽性細胞の比率を示す。
【図１０】図１０は、様々な抗体とのインキュベーション後のアポトーシス細胞死に対するＣＯＬＯ２０５およびＮＣＩ−Ｎ８７細胞の染色を示す。ＣＯＬＯ２０５およびＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、対照、９Ｅ１０（３０ｕｇ／ｍｌ）、ｍ５Ｆ１（１０ｕｇ／ｍｌ）またはｍ５Ｆ１（３０ｕｇ／ｍｌ）と一晩インキュベートした。次いで細胞をＹＯ−ＰＲＯ−１（Ａ）またはアネキシン−ＶとＰＩとの併用（Ｂ）で染色した。条件ごとの染色比率を棒グラフに示す。
【図１１】図１１は、ｍ５Ｆ１が、ＣＯＬＯ２０５細胞に発現する組換えヒトＣＥＡ（ｒｈＣＥＡ）に結合するが、ＣＯＳ−７細胞に発現するｒｈＣＥＡを認識しないことを示す。図１１Ａでは、ｆｌａｇタグ付きヒトＣＥＡを発現しているＣＯＬＯ２０５細胞可溶化物を抗Ｆｌａｇ抗体Ｍ２で免疫沈降し、免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてから、ＮＣ紙にトランスファーした。ＮＣ紙を、図示したように抗Ｆｌａｇ Ｍ２、ｍ５Ｆ１、５１−４１、１３８−１０またはＣＥＡ／Ａｂ−３とインキュベートした。図１１Ｂでは、ｆｌａｇタグ付きヒトＣＥＡを発現しているＣＯＳ−７細胞（＋）またはＣＥＡを発現していないＣＯＳ−７細胞（−）の細胞可溶化物を抗Ｆｌａｇ抗体Ｍ２で免疫沈降し、免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてから、ＮＣ紙にトランスファーした。ＮＣ紙を、図示したように抗Ｆｌａｇ Ｍ２、ｍ５Ｆ１またはＣＥＡ／Ａｂ−３とインキュベートした。
【図１２】図１２は、ｍ５Ｆ１が、ＣＯＬＯ２０５細胞に発現する組換えＣＤ４３（ｒｈＣＤ４３）に結合するが、ＣＯＳ−７細胞に発現するｒｈＣＤ４３を認識しないことを示す。図１２Ａでは、ＣＯＬＯ２０５細胞に発現し、プロテインＡセファロースビーズで精製した可溶性ＣＤ４３をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ＮＣ紙にトランスファーし、このＮＣ紙を、抗体ｍ５Ｆ１、５１−１４または１３８−１０でウエスタンブロットした。図１２Ｂでは、ｈＣＤ４３またはｈＣＤ４３／ｍｙｃ−ＨｉｓをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞、あるいはトランスフェクトしなかった細胞の細胞可溶化物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ＮＣ紙にトランスファーし、このＮＣ紙を、抗ＣＤ４３（ＭＥＭ５９）（左パネル）またはｍ５Ｆ１（右パネル）でウエスタンブロットした。
【図１３】図１３は、ｍ５Ｆ１抗体がフコース依存性糖エピトープを認識することを示す。ＣＯＬＯ２０５細胞に発現するｒｈＣＥＡを０、０．０１、０．０３、０．１ｍＵのα−１→（２，３，４）−フコシダーゼで処理した。処理後、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてから、クマーシーブルー染色するか（右パネル）、ｍ５Ｆ１抗体を用いてウエスタンブロットを行った。
【図１４】図１４は、Ｌｅｗｉｓ^ａ−ラクトース（Ｌｅ^ａ−ラクトース）、Ｌｅｗｉｓ^ｂ−ラクトース（Ｌｅ^ｂ−ラクトース）、Ｌｅｗｉｓ^ｘ−ラクトース（Ｌｅ^ｘ−ラクトース）、ラクトース、Ｌｅｗｉｓ^ｙ（Ｌｅ^ｙ）、シアリル−Ｌｅｗｉｓ^ｘ（シアリル−Ｌｅ^ｘ）、Ｌｅｗｉｓ^ａ（Ｌｅ^ａ）、ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）およびレクト−Ｎ−ジフコヘキサオース ＩＩ（ＬＮＤＦＨ ＩＩ）の構造を示す。
【図１５】図１５は、オリゴ糖を加えてＣＯＬＯ２０５細胞に対するｍ５Ｆ１、１３８−１０および５１−４１の結合を競合させた結合阻害アッセイの結果を示す。オリゴ糖（ＬＮＤＦＨ ＩＩ、ＬＮＴ、ｓＬｅ（ｘ）、Ｌｅ（ｙ）、ラクトース、Ｌｅ（ｘ）−ラクトース、Ｌｅ（ｂ）−ラクトース、Ｌｅ（ａ）−ラクトースまたはＬｅ（ａ）；それぞれ１ｍＭ）を、２×１０^５個のＣＯＬＯ２０５細胞を含む異なるウェルに加え、続いて抗体（１３８−１０、５１−４１またはｍ５Ｆ１）を加えて、対照には抗体を加えなかった。ＣＯＬＯ２０５細胞に対する抗体の結合をフローサイトメトリー解析で測定した。各抗体に対するオリゴ糖による結合阻害を、平均蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）値で判定した阻害率として図に示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義
「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域に存在する少なくとも１つの抗原認識部位を介して炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどのような標的に特異的に結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、この語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体ばかりでなく、そのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、これらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の修飾構造も包含する。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）など任意のクラスの抗体を含むが、抗体は、特定のクラスである必要はない。免疫グロブリンは、抗体の重鎖定常ドメインのアミノ酸配列によって異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭという５つの主要なクラスがあり、そのうちの一部は、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２などのサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けることができる。免疫グロブリンの個々のクラスに対応する重鎖の定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの各クラスのサブユニット構造および三次元構造は、周知である。
【００３８】
本発明の抗体は、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域により決定されるポリペプチドに対する親和性を持つ二重特異性分子、多重特異性分子、単鎖分子ならびにキメラ分子およびヒト化分子をさらに含むものである。さらに、本発明の抗体は、抗体の重鎖可変ドメインまたは抗体の軽鎖可変ドメインのどちらかである単一ドメイン抗体もさらに含む。Ｈｏｌｔら、，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：４８４−４９０，２００３を参照。また、抗体の６つの天然型相補性決定領域のうち３つを含む、抗体の重鎖可変ドメインまたは抗体の軽鎖可変ドメインのどちらかを含むドメイン抗体の作製方法についても、当該技術分野において公知である。たとえば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２，２００１を参照されたい。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体群の中の抗体をいう。言い換えれば、抗体集団を構成する個々の抗体は、わずかながら存在する場合がある自然に発生し得る突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は通常、特異性が高く、単一の抗原部位を標的とする。さらに、各モノクローナル抗体は、異なる決定基（エピトープ）を標的にする様々な抗体を含むことが一般的なポリクローナル抗体調製物と異なり、抗原の単一決定基を標的にする。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体の特性を示すもので、任意の特定の方法により抗体を作製する必要があるものと解釈してはならない。たとえば、本発明に従って使用できるモノクローナル抗体については、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に最初に記されたハイブリドーマ法で製造してもよいし、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換えＤＮＡ法で製造してもよい。さらに、たとえば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４に記載の技法を用いて作製されたファージライブラリーからモノクローナル抗体を単離しても構わない。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」とは、第１の種の可変領域または可変領域の一部と第２の種の定常領域を持つ抗体をいう。インタクトなキメラ抗体は、キメラ軽鎖の２つのコピーおよびキメラ重鎖の２つのコピーを含む。キメラ抗体の作製については、当該技術分野において公知である（Ｃａｂｉｌｌｙら、（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３２７３−３２７７；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。一般に、こうしたキメラ抗体では、軽鎖および重鎖の可変領域がともに、一方の哺乳動物種に由来する抗体の可変領域に類似しているのに対し、定常部分は、他方の動物種に由来する抗体の配列に相同的である。こうしたキメラ形態の明確な利点の１つは、たとえば、容易に入手できる非ヒト宿主生物のハイブリドーマまたはＢ細胞を、たとえば、ヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて用いて、可変領域を現在知られている供給源から簡便に得ることができることにある。この可変領域には、調製しやすく特異性が供給源による影響を受けないという利点があり、定常領域がヒトであれば、抗体を注射する際に非ヒト供給源由来の定常領域の場合よりもヒト被験者が免疫反応を起こしにくい。しかしながら、この定義は、この特定例に限定されるものではない。
【００４１】
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から同定され、分離および／または回収された抗体である。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋」とは、純度（すなわち、夾雑物を含まない）が少なくとも５０％、一層好ましくは純度が少なくとも９０％、一層好ましくは純度が少なくとも９５％、一層好ましくは純度が少なくとも９８％、一層好ましくは純度が少なくとも９９％である材料をいう。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「ヒト化」抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最低限しか含まない特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２または抗体の他の抗原結合部分配列など）である非ヒト（たとえばマウス）抗体の形態をいう。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）（ＣＤＲ）由来の残基を、所望の特異性、親和性および能力を持つマウス、ラットまたはウサギなど、非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基に置き換える、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）残基を、対応する非ヒト残基で置き換える。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移植したＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られないが、抗体性能の一層の改良および最適化を行うために加える残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は実質的に、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの全部を含む。その可変ドメインでは、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部は、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である。さらに、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのそれを含むのが最も望ましい。抗体は、国際公開第９９／５８５７２号に記載されているように改変したＦｃ領域を含んでも構わない。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体から変化している１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）（元の抗体の１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼べる）を持っている。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」は、ヒトから作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を持っている抗体をいい、および／または、当該技術分野において公知か、本明細書に開示されたヒト抗体の作製技法のいずれかを用いて作製されている。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも１種のヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１種のヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。そうした例の１つとして、マウス軽鎖ポリペプチドおよびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体がある。当該技術分野において公知の種々の技法を用いてヒト抗体を作製することができる。一実施形態では、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４；Ｓｈｅｅｔｓら、，１９９８，ＰＮＡＳ，（ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１）。また、たとえば、内在性免疫グロブリン遺伝子を一部または完全に不活化したマウスのようなトランスジェニックアニマルにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入して、ヒト抗体を作製してもよい。このアプローチについては、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；および同第５，６６１，０１６号に記載されている。あるいは、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球（このＢリンパ球については個体から回収してもよいし、インビトロで感作してもよい）を不死化することで、ヒト抗体を調製することもできる。たとえば、Ｃｏｌｅら、，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
【００４５】
抗体の「可変領域」とは、抗体の軽鎖可変領域または抗体の重鎖可変領域のどちらかあるいは両方をいう。重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域とも呼ばれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が結合している４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接してつながっており、他方のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。２つのＣＤＲを決定するには、少なくとも（１）異種間の配列多様性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ））；および（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））といった技法がある。本明細書で使用する場合、ＣＤＲは、このアプローチのどちらか、または、２つのアプローチを併用して定義されるＣＤＲを指してもよい。
【００４６】
抗体の「定常領域」とは、抗体の軽鎖定常領域または抗体の重鎖定常領域のどちらかあるいは両方をいう。抗体の定常領域は通常、構造を安定化させるほか、抗体鎖の結合、分泌、経胎盤移行および補体結合など他の生物学的機能を与えるが、抗原に対する結合には関与していない。定常領域の遺伝子のアミノ酸配列および対応するエクソン配列は、それが由来する種によって異なるが、アロタイプが生じるアミノ酸配列の変異は、概ね種内の特定の定常領域に限られる。各鎖の可変領域は、結合ポリペプチド配列で定常領域に結合している。この結合配列は、軽鎖遺伝子の「Ｊ」配列と、重鎖遺伝子の「Ｄ」配列および「Ｊ」配列の組み合わせとによってコードされている。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ：Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（たとえばナチュラルキラー（ＮＫ：ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞に結合した抗体を認識し、その後、標的細胞を溶解させる細胞媒介性の反応をいう。目的の分子のＡＤＣＣ活性については、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを用いて判定することができる。そうしたアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）およびＮＫ細胞がある。その代わりに、またはそれに加えて、たとえば、Ｃｌｙｎｅｓら、，１９９８，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９５：６５２−６５６に開示されたような動物モデルを用いて、目的の分子のＡＤＣＣ活性をインビボで判定してもよい。
【００４８】
「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させることをいう。補体活性化の経路は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が同族抗原と複合体を形成した分子（たとえば抗体）に結合することで始まる。補体活性化を判定するには、たとえば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを行ってもよい。
【００４９】
本明細書では、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という語については同義で用い、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。ポリマーは、直鎖でも分枝でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸を挟んで結合していてもよい。さらに、この語は、天然に修飾されている、あるいは、たとえば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または標識成分とのコンジュゲーションのような他の任意の操作または修飾などの介入により修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。さらに、この定義には、たとえば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（たとえば、天然ではないアミノ酸など）および当該技術分野において公知の他の修飾体を含むポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドは抗体をベースにしているため、ポリペプチドが、単鎖または結合鎖として生じる可能性があることが理解されよう。
【００５０】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」または「核酸」については、同義に用い、任意の長さヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基および／またはこれらのアナログ、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーに取り込まれる場合がある任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびそのアナログを含んでも構わない。ヌクレオチド構造の修飾を行う場合は、ポリマーの構築の前でも後でもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分を含んでいてもよい。ポリヌクレオチドについては、標識成分とのコンジュゲーションなどより、重合後にさらに修飾することもできる。他のタイプの修飾として、たとえば、「キャップ」、アナログによる１種または複数種の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間の修飾（たとえば、非荷電結合（たとえば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カバマートなど）および荷電結合（たとえば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）による修飾、たとえば、タンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシンなど）などのペンダント部分を含ませる修飾、インターカレーター（たとえば、アクリジン、ソラレンなど）による修飾、キレート剤（たとえば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含ませる修飾、アルキル化剤を含ませる修飾、修飾結合（たとえば、αアノマー核酸など）による修飾）、およびポリヌクレオチド（単数または複数）の無修飾形態が挙げられる。さらに、たとえば、糖に普通に存在するヒドロキシル基のいずれかを、ホスホン酸基、リン酸基で置換しても、標準的な保護基で保護しても、活性化して新たなヌクレオチドへの追加結合を作製してもよいし、固体支持体にコンジュゲートしてもよい。５’および３’末端のＯＨについては、リン酸化しても、アミンまたは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換しても構わない。さらに、他のヒドロキシルを標準的な保護基に誘導体化することもできる。さらに、ポリヌクレオチドは、一般に当該技術分野において公知のリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態を含んでもよく、たとえば、２’−−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、αアノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、環状アナログおよびメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシドアナログがある。１つまたは複数のホスホジエステル結合を別の結合基で置換してもよい。そうした別の結合基として、ホスファートを、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、’’（Ｏ）ＮＲ_２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）（ＲまたはＲ’は各々独立にＨまたは任意にエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジルを含む置換もしくは非置換アルキル（１〜２０個のＣ）である）で置換する実施形態があるが、これに限定されるものではない。ポリヌクレオチドのすべての結合が同一である必要はない。前述の記載を、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む本明細書に言及するすべてのポリヌクレオチドに適用する。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「ベクター」とは、１種または複数種の目的の遺伝子（単数または複数）または配列（単数または複数）を送達し、好ましくは宿主細胞において発現させることができるコンストラクトをいう。ベクターの例として、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、陽イオン性縮合剤に結合されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターおよび生成細胞などのある種の真核細胞があるが、これに限定されるものではない。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「発現制御配列」とは、核酸の転写を指令する核酸配列をいう。発現制御配列は、構成的もしくは誘導性プロモーターなどのプロモーターまたはエンハンサーであってもよい。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動的に連結されている。
【００５３】
本明細書で使用する場合、薬物、化合物または医薬組成物の「有効投与量」または「有効量」は、有益または所望の結果をもたらすのに十分な量である。予防的な用途の場合、有益または所望の結果には、疾患、その合併症および疾患の発生過程で見られる病理学的中間表現型の生化学的、組織学的および／または行動的症状を含む、疾患のリスクの除去もしくは抑制、重症度の緩和または発症の遅延などの結果が含まれる。治療用途の場合、有益または所望の結果には、疾患に起因する１つまたは複数の症状の減少、疾患に罹患している人の生活の質の向上、疾患の処置に必要な他の薬の用量の減少、ターゲティングなどによる別の薬の作用の強化、疾患の進行の遅延および／または生存の延長などの臨床結果がある。癌または腫瘍の場合、薬物の有効量は、癌細胞の数の減少；腫瘍の大きさの縮小；周辺臓器への癌細胞浸潤の抑制（すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止）；腫瘍転移の抑制（すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の抑制；および／または障害に伴う１つまたは複数の症状のある程度の軽減に作用する場合がある。有効投与量を、単回で投与しても、複数回で投与してもよい。本発明において、薬物、化合物または医薬組成物の有効投与量は、直接あるいは間接に予防処置または治療処置を達成するのに十分な量である。臨床的な観点から理解されるように、薬物、化合物または医薬組成物の有効投与量を、別の薬物、化合物または医薬組成物との併用で達成する場合もあれば、そうでない場合もある。したがって、１種または複数種の治療薬を投与する観点から、「有効投与量」を考慮してもよく、１種または複数種の他の薬品と併用して、所望の結果を得る可能性がある、または、得ている場合、単一の薬品を有効量で投与すると考えてもよい。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「併用して」とは、１つの処置方式に加えて別の処置方式を投与することをいう。そのため、「併用して」とは、他方の処置方式を個体に投与する前、投与している最中または投与した後に、一方の処置方式を投与することをいう。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「処置」または「処置する」とは、好ましくは臨床的な結果を含め有益または所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の有益または所望の臨床的な結果として、癌性細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の抑制（または癌細胞の破壊）、疾患に起因する諸症状の減少、疾患に罹患している人の生活の質の向上、疾患の処置に必要な他の薬の用量の減少、疾患の進行の遅延および／または個体の生存の延長の１つまたは複数があるが、これに限定されるものではない。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「疾患の発生の遅延」とは、疾患（癌など）の発生を遅らせる、妨げる、遅くする、妨害する、安定させる、および／または先延ばしすることをいう。こうした遅延の時間の長さは、疾患の既往および／または処置する個体によって異なってもよい。当業者には明らかなように、十分なまたはかなりの遅延は、個体が疾患を発生しないという点で実質的に予防を包含する。たとえば、転移の発生のような後期癌を遅延させることができる。
【００５７】
「個体」または「被検体」とは、哺乳動物であり、一層好ましくはヒトである。さらに、哺乳動物には、家畜、競技用動物、ペット（ネコ、イヌ、ウマなど）、霊長類、マウスおよびラットも含まれるが、これに限定されるものではない。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「特異的に認識する」または「特異的に結合する」という語は、生体分子などの不均一な分子集団の存在下で標的の有無の判定に役立つ、標的と抗体間の誘引または結合などの測定可能で再現性のある相互作用をいう。たとえば、エピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、標的の他のエピトープまたは標的以外のエピトープに結合するよりも高い親和性、結合活性で、容易に、および／または長時間そのエピトープに結合する抗体である。この定義を読めば、たとえば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分またはエピトープ）は、第２の標的に特異的または優先的に結合することもあれば、そうでない場合があることも理解されるであろう。そのため、「特異的結合」または「優先的な結合」は、必ずしも排他的な結合を（含んでもよいが）必要としない。標的に特異的に結合する抗体の結合定数は、少なくとも約１０^３Ｍ^−１または１０^４Ｍ^−１、場合によっては約１０^５Ｍ^−１または１０^６Ｍ^−１、他の場合には約１０^６Ｍ^−１または１０^７Ｍ^−１、約１０^８Ｍ^−１〜１０^９Ｍ^−１または約１０^１０Ｍ^−１〜１０^１１Ｍ^−１またはそれ以上であってもよい。種々のイムノアッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質に対して特異的な免疫反応を示す抗体を選択することができる。たとえば、固相ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）イムノアッセイを用いて、タンパク質に対して特異的な免疫反応を示すモノクローナル抗体を日常的に選択することができる。たとえば、特定の免疫反応性を判定できるイムノアッセイのフォーマットおよび条件については、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照されたい。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「癌」、「腫瘍」、「癌性」および「悪性」という語は、一般に無秩序な細胞成長を特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すか、説明する。癌の例として、腺癌などの癌腫、リンパ腫、芽腫、メラノーマおよび肉腫があるが、これに限定されるものではない。そうした癌のより具体的な例として、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、胃腸癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、神経膠腫、卵巣癌、肝癌およびヘパトーマなどの肝臓癌、膀胱癌、乳房癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎細胞癌およびウィルムス腫瘍などの腎臓癌、基底細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌および様々なタイプの頭頸部癌がある。
【００６０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数の言及を含む。たとえば、「抗体」について言及する場合、１つの抗体からモル量のような多数の抗体をいい、当業者に公知のその等価物を含んでおり、以下同様である。
【００６１】
本明細書に記載の本発明の態様および変形例は、態様および変形例「からなる」および／または態様および変形例「から本質的になる」ものを含むことが理解されよう。
【００６２】
非造血系癌細胞に発現するＣＤ４３およびＣＥＡの炭水化物エピトープに特異的に結合する抗体およびポリペプチド
本発明は、非造血系癌細胞に発現するＣＤ４３および／またはＣＥＡのエピトープには特異的に結合するが、白血球（末梢性Ｔ細胞など）またはＪｕｒｋａｔ細胞に発現するＣＤ４３には特異的に結合しない抗体に由来する、単離された抗体およびポリペプチドを提供する。本発明の抗体およびポリペプチドは、以下の特徴のうち１つまたは複数をさらに有していてもよい：（ａ）エピトープを含む分子をα−１→（２，３，４）−フコシダーゼで処置した場合、エピトープに対する抗体またはポリペプチドの結合が減少する；（ｂ）エピトープに対する抗体またはポリペプチドの結合が、Ｌｅ^ａ構造、Ｌｅ^ａ−ラクトース構造、ＬＮＤＦＨ ＩＩ構造および／またはＬＮＴ構造を含む炭水化物により阻害される；（ｃ）癌細胞の細胞表面に発現するエピトープへの結合後、細胞毒コンジュゲーションおよび免疫エフェクター機能の存在下で（アポトーシスなどにより）非造血系癌細胞の死を誘導する；（ｄ）癌細胞の細胞表面に発現するエピトープへの結合後、非造血系癌細胞の細胞成長または増殖を阻害する；および（ｅ）結腸直腸癌および胃癌など、個体の細胞表面にエピトープを発現させる非造血系癌を処置または防止する。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「阻害」という語は、部分的阻害および完全な阻害を含む。たとえば、Ｌｅ^ａ構造、Ｌｅ^ａ−ラクトース構造、ＬＮＤＦＨ ＩＩ構造またはＬＮＴ構造を含む炭水化物で、ＣＤ４３およびＣＥＡのエピトープに対する抗体またはポリペプチドの結合を、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％阻害する。エピトープに対する抗体の結合については、直接的な競合または他のメカメカニズムにより阻害することもできる。
【００６４】
エピトープを発現する非造血系癌細胞の例として、結腸直腸癌細胞（ＣＯＬＯ２０５およびＤＬＤ−１など）および胃癌細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７など）があるが、これに限定されるものではない。
【００６５】
本発明の抗体およびポリペプチドは、非造血系癌細胞に存在するＣＤ４３の細胞外ドメインを認識できるが、白血球のＣＤ４３（たとえば、末梢性Ｔ細胞）の細胞外ドメインまたはＪｕｒｋａｔ細胞（リンパ芽球様の白血病細胞）に発現するＣＤ４３の細胞外ドメインには結合しない。いくつかの実施形態では、本発明の新規な抗体またはポリペプチドは、造血系由来の細胞に発現するＣＤ４３に特異的に結合しない。
【００６６】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、これらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要な特異性を持つ抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の変形構造を包含してもよい。抗体は、マウス由来でも、ラット由来でも、ラクダ由来でも、ヒト由来でも、他の任意のものの由来（ヒト化抗体など）でも構わない。
【００６７】
ＣＤ４３またはＣＥＡに対するポリペプチド（抗体を含む）の結合親和性は、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭまたは約５０ｐＭのいずれかを下回ってもよい。当該技術分野において周知のように、結合親和性をＫ_Ｄ、すなわち解離定数で表してもよく、結合親和性が高まると、Ｋ_Ｄは小さくなる。ＣＤ４３またはＣＥＡに対する抗体の結合親和性を判定する１つのやり方は、抗体の単機能Ｆａｂフラグメントの結合親和性を測定する。単機能Ｆａｂフラグメントを得るには、抗体（たとえば、ＩｇＧ）をパパインで切断しても、組換えによって発現させてもよい。表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）システム，ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ，ピスカウェイ（Ｐｉｓｃａｗａｙ），ニュージャージー州）およびＥＬＩＳＡで抗体のＦａｂフラグメントの親和性を判定してもよい。反応速度論的会合速度（ｋ_ｏｎ）および解離速度（ｋ_ｏｆｆ）（通常２５℃で測定）を得て、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）値をｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆとして算出する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体およびポリペプチドは、癌細胞の数を減少させ、および／またはエピトープを持つ腫瘍または癌細胞の細胞成長または増殖を阻害する。好ましくは、細胞数の減少率または細胞成長もしくは増殖の阻害率は、抗体またはポリペプチドを処置していない細胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６５％、約７５％またはそれ以上である。癌細胞には、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、胃癌があるが、これに限定されるものではない。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体およびポリペプチドは、非造血系癌細胞の細胞表面に発現するエピトープへの結合後、たとえば、アポトーシスにより細胞死を単独で誘導することができる。本明細書で使用する場合、「細胞死を誘導する」という語は、本発明の抗体またはポリペプチドが、細胞表面に発現する分子と直接的に相互作用することができ、細胞の細胞死を誘導するには、細胞毒コンジュゲーションまたは他の免疫エフェクター機能、すなわち、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または食作用などの他の因子の助けを借りずに、結合／相互作用だけで十分であることをいう。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「アポトーシス」という語は、遺伝子依存性の細胞内の細胞破壊プロセスをいう。アポトーシスは、壊死とは異なる。アポトーシスでは、細胞骨格の破壊、細胞質の収縮および凝縮、細胞膜表面におけるホスファチジルセリンの発現ならびにブレッビングが起こり、細胞膜に結合した小胞またはアポトーシス小体が形成される。このプロセスは、「プログラムされた細胞死」とも呼ばれる。アポトーシスの過程では、ｃｕｒｖｅｄ細胞表面、核クロマチンの凝縮、染色体ＤＮＡの断片化およびミトコンドリア機能の低下などの特徴的な現象が観察される。アネキシンＶ、ヨウ化プロピジウム、ＤＮＡ断片化アッセイおよびＹＯ−ＰＲＯ−１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））による細胞の染色など、既知の様々な技法を用いてアポトーシスを検出することができる。
【００７１】
細胞死（アポトーシスなど）を検出する方法には、形態、ＤＮＡ断片化、酵素活性およびポリペプチド分解などの検出があるが、これに限定されるものではない。参照によって本明細書に援用するＳｉｍａｎら、，米国特許第６，０４８，７０３号；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ（１９９５），Ｃｅｌｌ，８２：３４９−５２；Ｔｈｏｍｂｅｒｒｙ ａｎｄ Ｌａｚｅｂｎｉｋ（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：１３１２−６；Ｚｏｕら、，米国特許第６，２９１，６４３号；Ｓｃｏｖａｓｓｉ ａｎｄ Ｐｏｉｒｉｅｒ（１９９９），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９：１２５−３７；Ｗｙｌｌｉｅ ｅ ｔａｌ．（１９８０），Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ，６８：２５１−３０６；Ｂｅｌｈｏｃｉｎｅら、（２００４），Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，３（１）：２３−３２を参照されたい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体およびポリペプチドは、非造血系癌細胞に発現する立体構造エピトープを認識し、このエピトープは、トリペプチドが形成する構造、Ｎ’−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｃ’と等価な物理的特徴および化学的特徴を持つ構造を含む。本明細書で使用する場合、「エピトープは、ペプチドが形成する構造と等価な物理的特徴および化学的特徴を持つ構造を含む」とは、抗体結合に関して２つの構造の物理化学的特性が同等であるため、抗体が一方の構造に特異的に結合すれば、両方の構造に結合することをいう。いくつかの実施形態では、抗体およびポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端にアミノ酸配列、Ｎ’−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｃ’を含むポリペプチドに結合する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体およびポリペプチドは、癌細胞の細胞表面に発現するエピトープへの結合において抗体５Ｆ１、１３８−１０または５１−４１と競合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはポリペプチドは、抗体５Ｆ１、１３８−１０および５１−４１のうち少なくとも１つが結合するＣＤ４３またはＣＥＡのエピトープに結合する。
【００７４】
競合アッセイを用いて、同一または立体的にオーバーラップするエピトープを認識することで２つの抗体が同じエピトープに結合するかどうか、あるいは、ある抗体が別の抗体の抗原への結合を競合的に阻害するかどうかを判定することができる。こうしたアッセイは、当該技術分野において公知であり、実施例に詳細に記載してある。一般には、抗原または抗原を発現している細胞をマルチウェルプレートに固定化し、非標識の抗体が標識抗体の結合を遮断する能力を測定する。そうした競合アッセイの一般的な標識は、放射性標識または酵素標識である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗体５Ｆ１または５Ｆ１に由来する抗体である。５Ｆ１の重鎖可変配列および軽鎖可変配列をそれぞれ配列番号１および配列番号２に記載してある。本発明は、抗体５Ｆ１のフラグメントもしくは領域を含む抗体またはポリペプチドを提供する。一実施形態では、フラグメントは、抗体５Ｆ１の軽鎖である。別の実施形態では、フラグメントは、抗体５Ｆ１の重鎖である。なお別の実施形態では、フラグメントは、抗体５Ｆ１の軽鎖および／または重鎖由来の１つまたは複数の可変領域を含む。なお別の実施形態では、フラグメントは、抗体５Ｆ１の軽鎖および／または重鎖由来の１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７に示す重鎖可変領域および配列番号８に示す軽鎖可変領域を含むｈ５Ｆ１などの５Ｆ１のヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体５Ｆ１に由来する１つまたは複数のＣＤＲは、５Ｆ１の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つのＣＤＲと、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％が同一である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗体１３８−１０または１３８−１０に由来する抗体である。１３８−１０の重鎖可変配列および軽鎖可変配列をそれぞれ配列番号３および配列番号４に記載してある。本発明は、抗体１３８−１０のフラグメントもしくは領域を含む抗体またはポリペプチドを提供する。一実施形態では、フラグメントは、抗体１３８−１０の軽鎖である。別の実施形態では、フラグメントは、抗体１３８−１０の重鎖である。なお別の実施形態では、フラグメントは、抗体１３８−１０の軽鎖および／または重鎖由来の１つまたは複数の可変領域を含む。なお別の実施形態では、フラグメントは、抗体１３８−１０の軽鎖および／または重鎖由来の１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、１３８−１０のヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体１３８−１０に由来する１つまたは複数のＣＤＲは、１３８−１０の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つのＣＤＲと、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％が同質である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗体５１−４１または５１−４１に由来する抗体である。５１−４１の重鎖可変配列および軽鎖可変配列をそれぞれ配列番号５および配列番号６に記載してある。本発明は、抗体５１−４１のフラグメントもしくは領域を含む抗体またはポリペプチドを提供する。一実施形態では、フラグメントは、抗体５１−４１の軽鎖である。別の実施形態では、フラグメントは、抗体５１−４１の重鎖である。なお別の実施形態では、フラグメントは、抗体５１−４１の軽鎖および／または重鎖由来の１つまたは複数の可変領域を含む。なお別の実施形態では、フラグメントは、抗体５１−４１の軽鎖および／または重鎖由来の１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、５１−４１のヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体５１−４１に由来する１つまたは複数のＣＤＲは、５１−４１の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つのＣＤＲと、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％が同一である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組み合わせ（「混合型（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）ＣＤＲ」または「拡張型（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ＣＤＲ」ともいう）である。換言すれば、複数のＣＤＲを含む任意の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａおよび／または混合型のいずれであっても構わない。
【００７９】
抗体および抗体に由来するポリペプチドを製造する方法については、当該技術分野において公知であり、本明細書に開示してある。確立した方法を用いて本発明のモノクローナル抗体を調製することができる。たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５），Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に記載されているようなハイブリドーマ技法を用いてモノクローナル抗体を調製してもよい。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主生物を免疫剤（たとえば、ＣＤ４３またはＣＥＡを発現している癌細胞、本明細書に記載の抗体を用いて精製できるＣＤ４３またはＣＥＡ（癌細胞に発現する細胞外ドメインおよびそのフラグメントを含む）またはポリペプチドのＮ末端にアミノ酸配列Ｎ’−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＩＩｅ−Ｃ’を含むポリペプチド）で免疫して、免疫剤に特異的に結合する抗体を作製する、あるいは作製する能力のあるリンパ球を誘導するのが一般的である。あるいは、リンパ球をインビトロで感作してもよい。次いで、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３１）。不死化細胞株は、ほとんどの場合、形質転換された哺乳動物細胞、具体的には齧歯動物、ウサギ、ウシおよびヒト由来の骨髄腫細胞である。普通は、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を用いる。好ましくは、融合していない不死化細胞の成長または生存を阻害する１種または複数種の物質を含む好適な培地で、ハイブリドーマ細胞を培養してもよい。たとえば、親細胞にヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ：ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）酵素が欠損している場合、ハイブリドーマの培地は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防ぐ物質ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むのが一般的である（「ＨＡＴ培地」）。
【００８０】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による高レベルで安定な抗体の発現を支持するもので、かつ、ＨＡＴ培地などの培地に感受性である。一層好ましい不死化細胞株は、たとえば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，サンディエゴ，カリフォルニア州およびアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），マナッサス，ヴァージニア州から入手可能なマウスの骨髄腫株である。ヒトモノクローナル抗体の作製に関しては、ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株についても記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８４），１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３）。
【００８１】
その後、ハイブリドーマ細胞を培養する培地について、モノクローナル抗体の有無をアッセイすればよい。抗体に対して、非造血系癌または腫瘍細胞に発現するＣＤ−４３またはＣＥＡのエピトープには特異的に結合するが、ＣＤ４３を発現する白血球、Ｊｕｒｋａｔ細胞および／またはＣＤ４３を発現する造血系由来の他の細胞には特異的に結合しないかどうかをスクリーニングすることができる。エピトープを含む癌細胞または細胞外ドメイン（そのフラグメントを含む）を用いてスクリーニングを行っても構わない。たとえば、実施例１０に記載のＣＯＬＯ２０５細胞に発現するＣＥＡ−Ｎ−Ａ２を用いてスクリーニングを行ってもよい。
【００８２】
Ｊｕｒｋａｔ細胞株は、リンパ芽球様の白血病細胞であり、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらにより１４歳の少年の末梢血から樹立された。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １９：６２１−６２６，１９７７を参照されたい。様々なＪｕｒｋａｔ細胞株が、たとえば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（たとえば、ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２、ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６７８）から市販されている。
【００８３】
好ましくは、ハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体の結合特異性を免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）もしくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイで判定する。そうした技法およびアッセイは、当該技術分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性については、たとえば、Ｍｕｎｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｌａｒｄ（１９８０），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０のスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）解析により判定することができる。
【００８４】
同定した抗体における細胞死（たとえば、アポトーシス）を誘導する能力および／または細胞の成長または増殖を阻害する能力について、当該技術分野において公知の方法および本明細書に記載の方法を用いてさらに検査してもよい。
【００８５】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、希釈を少なくした手順でサブクローニングし、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ、上掲）で成長させてもよい。そのための好適な培地として、たとえば、ダルベッコ変法イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地がある。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、哺乳動物の腹水のようにインビボで成長させてもよい。
【００８６】
ハイブリドーマ細胞を培養してモノクローナル抗体を作製できれば、ハイブリドーマ細胞が分泌する抗体をさらに単離または精製することができる。たとえば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順で培地または腹水から抗体を単離または精製しても構わない。
【００８７】
本発明の抗体を、参照によって本明細書に援用する米国特許第４，８１６，５６７号および同第６，３３１，４１５号に記載されているような組換えＤＮＡ法で作製してもよい。たとえば、本発明のモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡを、従来の手順（たとえば、マウスの抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブなど）を用いて容易に単離して配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そうしたＤＮＡの好ましい供給源になる。ＤＮＡを単離したら、発現ベクターに組み込み、次いでそのベクターを、本来ならば免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得ることができる。さらに、たとえば、マウスの相同配列をヒトの重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列に置換して（米国特許第４，８１６，５６７号）、あるいは、非免疫グロブリンのポリペプチドのコード配列の全部または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合的に連結してＤＮＡを修飾してもよい。本発明の抗体の定常ドメイン、あるいは、本発明の抗体における１つの抗原結合部位の可変ドメインを、そうした非免疫グロブリンのポリペプチドと置換してキメラ二価抗体を作製してもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体を２種の発現ベクターから発現させる。第１の発現ベクターは、抗体の重鎖の可変領域をコードしている第１の部分および抗体の重鎖の定常領域をコードしている第２の部分を含む抗体（たとえば、ヒト化抗体）の重鎖をコードしている。いくつかの実施形態では、第１の部分は、配列番号７に示すアミノ酸配列を持つ可変領域をコードしている。第２の発現ベクターは、抗体の軽鎖の可変領域をコードしている第１の部分および抗体の軽鎖の定常領域をコードしている第２の部分を含む抗体の軽鎖をコードしている。いくつかの実施形態では、第１の部分は、配列番号８に示すアミノ酸配列を持つ可変領域をコードしている。
【００８９】
あるいは、本発明の抗体（たとえば、ヒト化抗体）を単一の発現ベクターから発現させる。単一の発現ベクターは、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードしている。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、配列番号７に示すアミノ酸配列を持つ重鎖の可変領域および配列番号８に示すアミノ酸配列を持つ軽鎖の可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列を含む。
【００９０】
通常、発現ベクターは、宿主細胞と適合性のある種に由来する転写調節配列および翻訳調節配列を含む。さらに、ベクターは通常、形質転換細胞における表現型による選抜を可能にする特定の遺伝子（単数または複数）も保有する。
【００９１】
真核細胞の様々な組換え宿主ベクター発現系が知られており、それを本発明に用いてもよい。たとえば、真核微生物では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、すなわち一般のパン酵母が最も多く用いられるが、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなど他にも多くの菌株を用いることができる。ＡＴＣＣから入手可能なＳｐ２／０またはチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）など、多細胞生物に由来する細胞株を宿主として用いてもよい。真核細胞の形質転換に好適な典型的なベクタープラスミドには、たとえば、ｐＳＶ２ｎｅｏおよびｐＳＶ２ｇｐｔ（ＡＴＣＣ）、ｐＳＶＬおよびｐＳＶＫ３（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））ならびにｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（インターナショナルバイオテクノロジーインク（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．））がある。
【００９２】
本発明に有用な真核宿主細胞は、好ましくは、ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、形質細胞腫細胞またはリンパ腫細胞である。しかしながら、哺乳動物の宿主細胞が、タンパク質の発現のための転写および翻訳ＤＮＡ配列を認識し、リーダー配列を切断してタンパク質を分泌させてリーダーペプチドを処理し、たとえば、グリコシル化のようなタンパク質の翻訳後修飾を行える場合、他の真核宿主細胞を好適に用いることができる。
【００９３】
したがって、本発明は、本明細書に開示するＤＮＡコンストラクトを含む組換え発現ベクターで形質転換されていて、かつ、本発明の抗体またはポリペプチドを発現することができる真核宿主細胞を提供する。故に、いくつかの実施形態では、本発明の形質転換宿主細胞は、本明細書に記載の軽鎖ＤＮＡ配列および重鎖ＤＮＡ配列と、抗体またはポリペプチドの発現を誘導する軽鎖および重鎖をコードしているＤＮＡ配列に基づいて配置している転写調節配列および翻訳調節配列とを含む少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトを含む。
【００９４】
本発明に用いる宿主細胞については、当該技術分野において周知の標準的なトランスフェクション手順により種々のやり方で形質転換することができる。用いることができる標準的なトランスフェクション手順には、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法およびリン酸カルシウム沈殿法がある。こうした技法は概ね、Ｆ．Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏら、（１９８６），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，６：７０３−７０６；Ｇ．Ｃｈｕら、，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９８７），１５：１３１１−１３２５；Ｄ．Ｒｉｃｅら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７９），７９：７８６２−７８６５；ａｎｄ Ｖ．Ｏｉら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３），８０：８２５−８２９に記載されている。
【００９５】
発現ベクターが２種類の場合、２種の発現ベクターを宿主細胞に１つ１つ別々に導入してもよいし、一緒に導入してもよい（同時導入または同時トランスフェクト）。
【００９６】
また、本発明は、抗体またはポリペプチドの作製方法であって、抗体またはポリペプチドをコードしている発現ベクター（単数または複数）を含む宿主細胞を培養することと、当業者に周知のやり方で培養から抗体またはポリペプチドを回収することとを含む、方法も提供する。
【００９７】
また、所望の抗体をトランスジェニックアニマルで作製することもできる。適切な発現ベクターを卵に微量注入することと、その卵を偽妊娠の雌に移植することと、所望の抗体を発現する子孫を選択することとを含む標準的な方法により、好適なトランスジェニックアニマルを得ることができる。
【００９８】
また、本発明は、癌細胞に発現するＣＤ４３およびＣＥＡのエピトープを特異的に認識するキメラ抗体を提供する。たとえば、キメラ抗体の可変領域と定常領域は、別の種に由来する。いくつかの実施形態では、重鎖と軽鎖の可変領域は、ともに本明細書に記載のマウスの抗体に由来する。いくつかの実施形態では、可変領域は、配列番号１および配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可変領域は、配列番号３および配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可変領域は、配列番号５および配列番号６に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖と軽鎖の定常領域は、ともにヒト抗体である。
【００９９】
本発明のキメラ抗体については、当該技術分野で確立された技法によって調製することができる。たとえば、参照によって各々を本明細書に援用する米国特許第６，８０８，９０１号、米国特許第６，６５２，８５２号、米国特許第６，３２９，５０８号、米国特許第６，１２０，７６７号および米国特許第５，６７７，４２７号を参照されたい。一般に、抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードしているｃＤＮＡを得て、ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入して、真核宿主細胞に導入すると、本発明のキメラ抗体が発現することで、キメラ抗体を調製することができる。好ましくは、発現ベクターには、任意の可変重鎖または軽鎖配列を発現ベクターに挿入しやすいように機能的に完全な定常重鎖または軽鎖配列がある。
【０１００】
本発明は、非造血系癌細胞に発現するＣＤ４３およびＣＥＡのエピトープを特異的に認識するヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体は、ＣＤＲの残基を、所望の特異性、親和性および能力を持つマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲの残基で置換したヒト抗体が一般的である。場合によっては、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基で置換することもある。
【０１０１】
モノクローナル抗体をヒト化するには、一般に４つのステップがある。それは：（１）出発抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を決定するステップ、（２）ヒト化抗体を設計するステップ、すなわち、ヒト化プロセスにおいて用いる抗体フレームワーク領域を決定するステップ、（３）実際のヒト化の方法／技法のステップおよび（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号；同第５，８０７，７１５号；同第５，８６６，６９２号；同第６，３３１，４１５号；同第５，５３０，１０１号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；同第５，５８５，０８９号；同第６，１８０，３７０号；および同第６，５４８，６４０号を参照されたい。たとえば、抗体を臨床試験およびヒトの処置に用いる場合、定常領域を操作してヒト定常領域との類似性を高め、免疫反応を抑えることができる。たとえば、米国特許第５，９９７，８６７号および同第５，８６６，６９２号を参照されたい。
【０１０２】
抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持したまま抗体をヒト化することが重要である。それには、三次元モデルの親配列およびヒト化配列を用いて親配列および種々の概念的ヒト化産物を解析するプロセスでヒト化抗体を調製すればよい。三次元の免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体配座構造を図解表示するコンピュータプログラムを入手することができる。こうした表示を検討すれば、候補免疫グロブリン配列の機能に対して推定される残基の役割の解析、すなわち、抗原に対する候補免疫グロブリンの結合能力に影響を与える残基の解析を行うことができる。こうして、コンセンサス配列および移入配列からＦＲ残基を選択し組み合わせて、標的抗原（単数または複数）に対する親和性の増強など、抗体の所望の特徴を得る。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に直接関与し、最も大きな影響を与える。ヒト化抗体は、抗体の１つまたは複数の特徴を改良するためヒンジ領域が改変されていてもよい。
【０１０３】
別の方法として、抗体をスクリーニングしファージディスプレイ法による組換えで製造する。たとえば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７号；同第５，７３３，７４３号および同第６，２６５，１５０号；およびＷｉｎｔｅｒら、，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：４３３−４５５（１９９４）を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０））を用いて非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメインの遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで作製してもよい。この手法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなど糸状のバクテリオファージのメジャーあるいはマイナーコートタンパク質の遺伝子にインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面に機能的な抗体フラグメントとして提示させる。糸状の粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡのコピーを含んでいるため、抗体の機能的特性に基づき選択を行えば、その特性を示す遺伝子をコードしている抗体を選択することにもなる。したがって、このファージは、ある程度Ｂ細胞の特性と類似している。ファージディスプレイについては、種々のフォーマットで行うことができる。概説には、たとえば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３，５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。ファージディスプレイでは、Ｖ−遺伝子セグメントの複数の供給源を用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８ （１９９１）は、多様な抗オキサゾロン抗体を、感作したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模でランダムなコンビナトリアルライブラリーから単離した。感作されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを作成することができ、 Ｍａｒｋら、，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１），ｏｒ Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、，ＥＭＢＯＪ．１２：７２５−７３４（１９９３）が記載した技法に本質的に従って多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を単離してもよい。自然な免疫反応では、抗体遺伝子は高い頻度で突然変異を積み重ねる（体細胞突然変異）。変異（ｃｈａｎｇｅ）がある程度導入されると、親和性が高まり、高親和性の表面免疫グロブリンを提示しているＢ細胞は優先的に複製され、その後の抗原チャレンジの過程で分化される。この自然なプロセスを、「鎖シャフリング」と呼ばれる手法を用いて模倣することができる。Ｍａｒｋｓ，ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９−７８３（１９９２））を参照されたい。この方法では、重鎖Ｖ領域遺伝子および軽鎖Ｖ領域遺伝子を、非免疫ドナーから得られるＶドメイン遺伝子の自然に発生する変異体のレパートリー（レパートリー）と順次置換することで、ファージディスプレイで得られる「一次」ヒト抗体の親和性を改善することができる。この手法であれば、親和性がｐＭ〜ｎＭの範囲にある抗体および抗体フラグメントの作製が可能である。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「マザーオブオールライブラリー（ｍｏｔｈｅｒ−ｏｆ−ａｌｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」とも呼ばれる）を作製する戦略については、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６ （１９９３）に記載されている。また、遺伝子シャフリングを用いて齧歯動物抗体からヒト抗体を得てもよく、この場合、ヒト抗体は、最初の齧歯動物抗体と同等の親和性と特性を持つ。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法では、ファージディスプレイ手法で得られる齧歯動物抗体の重鎖Ｖドメイン遺伝子または軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、齧歯動物−ヒトキメラを作製する。抗原を選択することが、機能的な抗原結合部位を回復できるヒト可変領域の単離につながる。すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（インプリントする）。このプロセスを繰り返して残りの齧歯動物Ｖドメインを置換すれば、ヒト抗体が得られる（国際公開第９３／０６２１３号，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ａｐｒｉｌ １，１９９３を参照）。ＣＤＲグラフティングによる従来の齧歯動物抗体のヒト化と異なり、この手法では、齧歯動物由来のフレームワーク残基またはＣＤＲ残基のない完全なヒト抗体が得られる。上記の考察はヒト化抗体に関するが、考察対象の一般的な原理は、たとえば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマおよびウシ用に抗体をカスタマイズする際に適用できることは明らかである。
【０１０４】
ある実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体である。抗原に特異的に結合する非ヒト抗体を用いて、その抗原に結合する完全ヒト抗体を作製することができる。たとえば、当業者は、非ヒト抗体の重鎖を様々なヒト軽鎖を発現する発現ライブラリーと共発現させる鎖スワッピング手法を用いてもよい。次いで、得られたハイブリッド抗体（１つのヒト軽鎖と１つの非ヒト重鎖を含む）については、抗原結合をスクリーニングする。その後、抗原結合に関与する軽鎖をヒト抗体の重鎖ライブラリーと共発現させる。得られたヒト抗体を対象に、抗原結合について、もう一度スクリーニングを行う。このような技法については、米国特許第５，５６５，３３２号により詳細に記載されている。さらに、抗原を用いてヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したトラスジェニック動物に接種してもよい。たとえば、米国特許第５，６６１，０１６号を参照されたい。
【０１０５】
抗体は、少なくとも２種類の抗原に対して結合特異性を持つモノクローナル抗体の二重特異性抗体でもよく、本明細書に開示する抗体を用いて調製することができる。二重特異性抗体を製造する方法は、当該技術分野において公知である（たとえば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０を参照）。従来の組換え型二重特異性抗体の作製は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現をベースとし、その２つの重鎖は異なる特異性を持っていた（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５，５３７−５３９）。
【０１０６】
二重特異性抗体の製造の一アプローチによれば、所望の結合特異性を持つ抗体可変ドメイン（抗体抗原結合部位）を免疫グロブリンの定常ドメイン配列と融合する。この融合は、好ましくはヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域のうち少なくとも一部を含む免疫グロブリンの重鎖定常ドメインとの融合である。この定常ドメインは、各融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖との結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を含むことが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、異なる発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物に共導入する。こうして別々のベクターに共導入すれば、この構築に用いる３つのポリペプチド鎖の比率が異なるとき収量が最適になる場合、実施形態における３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調節する際の柔軟性が高まる。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖が同じ割合で発現した方が高い収量になる場合、またはその割合に特に重要性がない場合、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入してもよい。
【０１０７】
一アプローチでは、二重特異性抗体は、一方の腕に第１の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖があり、他方の腕にハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を与える）がある。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖を持つこうした非対称構造により、不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物を分離しやくなる。このアプローチは、国際公開第９４／０４６９０号，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｒｃｈ ３，１９９４に記載されている。
【０１０８】
共有結合で結合した２つの抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内である。そうした抗体は、免疫系細胞を不要な細胞に向かわせるのに使用される（米国特許第４，６７６，９８０号）ほか、ＨＴＶ感染の処置（国際公開第９１／００３６０号および国際公開第９２／２００３７３号；および欧州特許第０３０８９号）にも使用されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて製造することができる。好適な架橋剤および技法については、当該技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
【０１０９】
単鎖Ｆｖフラグメントも、Ｉｌｉａｄｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９７，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０９：４３７−４４１に記載されているように作製することができる。種々のリンカーを用いたこうした単鎖フラグメントの結合については、Ｋｏｒｔｔら、，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：４２３−４３３に記載されている。抗体の組換え作製および操作の様々な技法は、当該技術分野において周知である。
【０１１０】
本発明は、上記のモノクローナル抗体ばかりでなく、抗体の活性結合領域を含むその任意のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメントおよび同種のものなど）を包含するものである。そうしたフラグメントを、当該技術分野において確立された技法を用いて本明細書に記載のモノクローナル抗体から作製することができる（Ｒｏｕｓｓｅａｕｘら、（１９８６），ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１：６６３−６９ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。
【０１１１】
抗体フラグメントを調製する方法は、当該技術分野において周知である。たとえば、ペプシンで抗体を酵素的に切断しＦ（ａｂ’）_２と呼ばれる１００Ｋｄのフラグメントを得ることで抗体フラグメントを作製することができる。このフラグメントを、チオール還元剤および任意にジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の保護基を用いてさらに切断して、５０Ｋｄの一価Ｆａｂ’フラグメントを作製してもよい。あるいは、パパインを用いて酵素的に切断して、２つの一価Ｆａｂフラグメントおよび１つのＦｃフラグメントを直接作製しても構わない。こうした方法は、たとえば、米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号およびそこに含まれる参考文献に記載されており、特許については、参照によって本明細書に援用する。さらに、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、（１９６０），Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０；Ｐｏｒｔｅｒ（１９５９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９，Ｅｄｅｌｍａｎら、，ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ ＶＯＬ．１，ｐａｇｅ ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）を参照されたい。
【０１１２】
あるいは、抗体のＦａｂをコードしているＤＮＡを原核生物の発現ベクターまたは真核生物の発現ベクターに挿入し、そのベクターを、Ｆａｂを発現する原核生物または真核生物に導入してＦａｂを作製することができる。
【０１１３】
本発明は、特性に大きな影響を与えない機能的に等価な抗体ならびに活性および／または親和性に強弱がある変異体など、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドの修飾体を包含する。たとえば、抗体５Ｆ１またはヒト化抗体のアミノ酸配列を変異させて、癌細胞に発現するＣＤ４３またはＣＥＡに対して所望の結合親和性を持つ抗体を得てもよい。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において日常的に行われており、本明細書に詳細に記載する必要はない。修飾ポリペプチドの例として、アミノ酸残基の保存的置換を持つポリペプチド、機能活性に著しい有害な変化を与えないアミノ酸の１つまたは複数の欠失あるいは付加を含むポリペプチド、または化学的アナログを使用したポリペプチドが挙げられる。
【０１１４】
アミノ酸配列の挿入には、長さが１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまで幅があるアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合だけでなく、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。末端挿入の例として、Ｎ末端にメチオニル残基を持つ抗体あるいはエピトープタグとの融合抗体がある。抗体分子のこれ以外の挿入変異体には、抗体の血清半減期を延長させる酵素またはポリペプチドと、抗体のＮ末端またはＣ末端との融合がある。
【０１１５】
置換変異体は、抗体分子の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、代わりに別の残基が挿入されている。置換による突然変異誘発で大きな関心を集めている部位として、超可変領域があるが、ＦＲの変更も考えられる。保存的置換を次の表に「保存的置換」の項目で示す。こうした置換により生物活性に変化が生じた場合、次の表に「例示的置換」として示してある、あるいは、アミノ酸クラスを参照して下記に詳述するように、より実質的な変化を導入して、その産物をスクリーニングしてもよい。
【０１１６】
【化１】

抗体の生物学的特性の実質的な修飾を達成するには、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、たとえば、シートまたはらせん構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性または（ｃ）側鎖の大きさの維持に対する作用が大きく異なる置換を選択する必要がある。以下に天然の残基を、共通の側鎖特性に基づき群に分けてある：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）非荷電極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（負に荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性（正に荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【０１１７】
非保存的置換に関しては、こうしたクラスのうちのあるクラスのメンバーを別のクラスと置換することで作製する。
【０１１８】
抗体の適切な立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基については、一般的にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を阻害することもできる。反対に、特に抗体が、Ｆｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合、システイン結合（単数または複数）を抗体に付加して、安定性を高めることもできる。
【０１１９】
アミノ酸修飾は、１個または複数個のアミノ酸の変換または修飾から可変領域などの領域の完全な再設計まで多岐にわたる場合がある。可変領域を変換すれば、結合親和性および／または特異性が変化することがある。いくつかの実施形態では、ＣＤＲドメイン内に１〜５個以下の保存的アミノ酸置換を作製する。他の実施形態では、ＣＤＲドメイン内に１〜３個以下の保存的アミノ酸置換を作製する。なお他の実施形態では、ＣＤＲドメインは、ＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲ Ｌ３である。
【０１２０】
また、修飾体は、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチドならびに、たとえば、様々な糖によるグリコシル化、アセチル化およびリン酸化など他の翻訳後修飾を受けたポリペプチドも含む。抗体は、定常領域の保存位置でグリコシル化する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｕｎｄ，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１−１２８；Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，ＴｉｂＴＥＣＨ １５：２６−３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、，１９９６，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８；Ｗｉｔｔｗｅ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５−４１８０）および立体構造に影響する可能性がある糖タンパク質の部分と糖タンパク質の提示された三次元表面との間の分子内相互作用（Ｈｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｕｎｄ，ｓｕｐｒａ；Ｗｙｓｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９−４１６）に影響を与える。また、オリゴ糖は、特異的認識構造に基づき一定の糖タンパク質をある種の分子に向かわせる役割を果たす場合がある。さらに、抗体のグリコシル化は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に作用することも報告されている。特に、テトラサイクリンによる調節でβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）（バイセクティングＧｌｃＮＡｃの形成を触媒する糖転移酵素）を発現させたＣＨＯ細胞では、ＡＤＣＣ活性の増強が報告された（Ｕｍａｎａら、，１９９９，Ｍａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０）。
【０１２１】
抗体のグリコシル化は一般に、Ｎ結合型またはＯ結合型のどちらかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基側鎖への炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−トレオニンおよびアスパラギン−Ｘ−システイン（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこうしたトリペプチド配列のいずれかが存在すれば、有望なグリコシル化部位になる。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを用いてもよい。
【０１２２】
抗体へのグリコシル化部位の付加を達成するには、アミノ酸配列が上記のトリペプチド配列の１つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を変化させると都合がよい（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。この変更を、元の抗体の配列にセリン残基またはトレオニン残基の１つまたは複数を付加することで、あるいは、セリン残基またはトレオニン残基の１つまたは複数で置換することで行うこともできる（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。
【０１２３】
さらに、根底にあるヌクレオチド配列を変化させずに抗体のグリコシル化パターンを変化させることもできる。グリコシル化の大部分は、抗体の発現に用いる宿主細胞によって決まる。たとえば、有望な治療剤としての抗体などの組換え糖タンパク質の発現に用いる細胞型が天然細胞であることは稀であるため、抗体のグリコシル化パターンの変形を想定することができる（たとえば、Ｈｓｅら、，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２−９０７０を参照）。
【０１２４】
抗体の組換え作製の過程で、宿主細胞の選択の他にグリコシル化に影響する要因として、成長モード、培地組成、培養密度、酸素反応、ｐＨ、精製スキームおよび同種のものなどがある。個々の宿主生物で得られるグリコシル化パターンを変えるため、オリゴ糖生成に関与する一定の酵素の導入または過剰発現など、様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号；同第５，５１０，２６１号および第５，２７８，２９９号）。グリコシル化またはある種のグリコシル化については、たとえば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を用いて糖タンパク質を酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞を遺伝子改変して、ある種の多糖類の処理を不完全なものにすることもできる。これらおよび類似の技法は、当該技術分野において周知である。
【０１２５】
他の修飾方法には、以下に限定されるものではないが、酵素的手段、酸化置換およびキレート化など当該技術分野において公知のカップリング技法の使用がある。たとえば、修飾を利用してイムノアッセイ用標識を結合してもよい。修飾ポリペプチドについては、当該技術分野において確立された手順を用いて製造して、当該技術分野において公知の標準アッセイによりスクリーニングすることができ、その一部を下記および実施例に記載してある。
【０１２６】
本発明の抗体またはポリペプチドを治療薬および標識などの薬品とコンジュゲート（たとえば、結合）してもよい。治療薬の例として、放射性部分、細胞毒または化学療法分子が挙げられる。
【０１２７】
本発明の抗体（またはポリペプチド）は、蛍光分子、放射性分子、酵素または当該技術分野において公知の他の任意の標識などの標識に結合してもよい。本明細書で使用する場合、「標識」という語は、検出できる任意の分子をいう。ある実施形態では、放射能標識アミノ酸を組み込むことで抗体を標識することができる。ある実施形態では、印を付けたアビジン（たとえば、光学的方法または比色法で検出可能な蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）で検出できるビオチン部分を抗体に結合してもよい。ある実施形態では、標識を別の試薬に組み込むか結合させて、試薬を目的の抗体に結合させても構わない。たとえば、標識を抗体に組み込むか結合させて、その抗体を目的の抗体を特異的に結合させることができる。ある実施形態では、標識またはマーカーは、治療的に作用してもよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は、当該技術分野において公知であり、それを用いても構わない。標識のある種の一般的なクラスとして、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識および放射性標識が挙げられる。ポリペプチドの標識の例として、放射性同位元素またはラジオヌクレオイド（たとえば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（たとえば、フルオレセインイソトシアナート（ＦＩＴＣ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｏｃｙａｎａｔｅ）、ローダミン、ランタニド蛍光体、フィコエリトリン（ＰＥ：ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ））、酵素標識（たとえば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース酸化酵素、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒロゲナーゼ、リンゴ酸デヒロゲナーゼ、ペニシリナーゼ、ルシフェラーゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（たとえば、ロイシン ジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）があるが、これに限定されるものではない。ある実施形態では、標識を様々な長さのスペーサーアームで結合して立体障害の起こる可能性を低下させる。
【０１２８】
また、本発明は、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドおよび薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む医薬組成物も提供する。薬学的に許容される賦形剤は、当該技術分野において公知であり、薬理学的に有効な物質を投与しやすくする、どちらかといえば不活性な物質である。たとえば、賦形剤は、形状またはコンシステンシーを与えてもよいし、希釈薬として働いてもよい。好適な賦形剤には、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、重量オスモル濃度を変化させる塩、被包剤、緩衝剤および皮膚浸透促進剤があるが、これに限定されるものではない。非経口的および経口的薬物送達用の賦形剤および製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に記載されている。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、薬剤としての使用および／または薬剤製造のための使用に関わりなく、本明細書に記載の方法のいずれかに用いる（本明細書に記載の）組成物を提供する。
【０１３０】
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
また、本発明は、本明細書に記載のモノクローナル抗体およびポリペプチドのいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の重鎖可変領域をコードしている核酸配列および／または配列番号２に記載の軽鎖可変領域をコードしている核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１由来の１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域をコードしている核酸配列および／または配列番号２由来の１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域をコードしている核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９に記載の核酸配列および／または配列番号１０に記載の核酸配列を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３に記載の重鎖可変領域をコードしている核酸配列および／または配列番号４に記載の軽鎖可変領域をコードしている核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３由来の１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域をコードしている核酸配列および／または配列番号４由来の１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域をコードしている核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１１に記載の核酸配列および／または配列番号１２に記載の核酸配列を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５に記載の重鎖可変領域をコードしている核酸配列および／または配列番号６に記載の軽鎖可変領域をコードしている核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５由来の１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域をコードしている核酸配列および／または配列番号６由来の１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域をコードしている核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３に記載の核酸配列および／または配列番号１４に記載の核酸配列を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７に記載の重鎖可変領域をコードしている核酸配列および／または配列番号８に記載の軽鎖可変領域をコードしている核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１５に記載の核酸配列および／または配列番号１６に記載の核酸配列を含む。
【０１３５】
当業者であれば、遺伝コードの縮重が原因で、本明細書に記載するようなポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が多く存在することが分かる。こうしたポリヌクレオチドの一部は、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列との相同性が極めて低い。したがって、本発明は、コドン使用量の相違によって変化する各ポリヌクレオチドを明確に意図している。さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換など、１つまたは複数の突然変異が原因で変化する内因性の遺伝子である。その結果生じるＲＮＡおよびタンパク質は、異なる構造または機能を持つ場合もあるが、持っていなくてもよい。対立遺伝子は、標準技法（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を用いて同定することができる。
【０１３６】
本発明のポリヌクレオチドについては、化学合成、組換え方法またはＰＣＲを用いて得ることができる。ポリヌクレオチドの化学的合成方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。当業者であれば、本明細書に記載の配列および市販のＤＮＡ合成機を用いて所望のＤＮＡ配列を製造することができる。
【０１３７】
組換え法を用いたポリヌクレオチドの作製の場合、本明細書で詳細に考察しているように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを好適なベクターに挿入し、さらに、そのベクターを複製および増幅に好適な宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入するのは、当該技術分野において公知の任意の手段で構わない。細胞に関しては、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−配合またはエレクトロポレーションにより外来性ポリヌクレオチドを導入して形質転換する。外来性ポリヌクレオチドを導入したら、組み込まれていないベクター（プラスミドなど）として細胞内で維持しても、宿主細胞ゲノムに組み込んでもよい。こうして増幅させたポリヌクレオチドを、当該技術分野においてよく知られている方法で宿主細胞から単離することができる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）を参照されたい。
【０１３８】
あるいは、ＰＣＲを用いると、ＤＮＡ配列の複製が可能になる。ＰＣＲ技法は、当該技術分野において周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄｓ．，Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）に記載されている。
【０１３９】
また、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド（抗体を含む）のいずれかをコードしている核酸配列も含むベクターを提供する（たとえば、クローニングベクター、発現ベクター）。好適なクローニングベクターに関しては、標準技法に従って構築してもよいし、当該技術分野において入手可能な多数のクローニングベクターから選択してもよい。選択するクローニングベクターは、使用しようとする宿主細胞によって異なってもよいが、有用なクローニングベクターは通常、自己複製能を持ち、特定の制限エンドヌクレアーゼに対して１つの標的があればよく、および／またはベクターを含むクローンの選択に使用できるマーカー用の遺伝子を運搬することができる。好適な例として、プラスミドおよび細菌ウイルス（たとえば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（たとえば、ｐＢＳ ＳＫ＋））およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡおよびシャトルベクター（ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８など）が挙げられる。これらおよび他の多くのクローニングベクターは、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）、ストラテジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）およびインビトロジェンなどの商業ベンダーから入手できる。
【０１４０】
発現ベクター通常は、本発明によるポリヌクレオチドを含む複製可能なポリヌクレオチドコンストラクトである。発現ベクターは、宿主細胞でエピソームとして、あるいは染色体ＤＮＡの重要な部分として複製可能の場合がある。好適な発現ベクターには、プラスミド、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなど）、コスミドおよび国際公開第８７／０４４６２号に開示された発現ベクター（単数または複数）があるが、これに限定されるものではない。ベクター成分としては通常、シグナル配列；複製起点；１つまたは複数のマーカー遺伝子；好適な転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）の１つまたは複数があるが、これに限定されるものではない。発現（すなわち、翻訳）では、ほとんどの場合、リボソーム結合部位、翻訳開始部位および終止コドンなど、１つまたは複数の翻訳制御エレメントも必要とされる。
【０１４１】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターについては、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質などを用いたトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（たとえば、ベクターがワクシニアウイルスなどの病原体の場合）のような多数の適切な手段のいずれかで宿主細胞に導入してもよい。多くの場合、宿主細胞の特色に応じて導入するベクターまたはポリヌクレオチドを選択することになる。
【０１４２】
また、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子を単離するには、異種ＤＮＡを過剰発現できる任意の宿主細胞を用いることができる。哺乳動物の宿主細胞の非限定的な例として、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞があるが、これに限定されるものではない。さらに、国際公開第８７／０４４６２号を参照されたい。好適な非哺乳動物の宿主細胞には、原核生物（大腸菌または枯草菌など）および酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ；またはＫ．ｌａｃｔｉｓなど）がある。
【０１４３】
診断用途
本発明は、エピトープの発現（正常なサンプルと比較した場合の発現の増加または減少、および／または通常はエピトープの発現が見られない組織（単数または複数）および／または細胞（単数または複数）で発現が認められるなどの異常な発現）に関連している疾患、障害または症候の検出、診断および監視を対象とした、本発明の抗体、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法を提供する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、この方法は、結腸直腸、膵臓癌、胃癌および肺癌などの癌の疑いがある被検体から得たサンプルにおけるエピトープの発現を検出することを含む。好ましくは、この検出方法は、サンプルと本発明の抗体、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとを接触させること、および結合レベルが対照サンプルまたは比較サンプルのレベルと異なるかどうかを判定することを含む。また、この方法は、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドが患者の治療法として適切かどうかを判定するのにも有用である。
【０１４５】
本明細書で使用する場合、「サンプル」または「生物学的サンプル」という語は、生物全体またはその組織、細胞もしくは構成要素（たとえば、以下に限定されるものではないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液および精液などの体液）のサブセットをいう。「サンプル」または「生物学的サンプル」はさらに、生物全体またはその組織、細胞もしくは構成要素のサブセットから調製されるホモジネート、ライセートまたは抽出物、あるいは、以下に限定されるものではないが、たとえば、血漿、血清、髄液、リンパ液（ｌｙｍｐｈ ｆｌｕｉｄ）、皮膚管、気道、腸管および尿生殖器官の外部切片、涙液、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、臓器など、その画分または部分をいう。ほとんどの場合、サンプルを動物から採取しているが、「サンプル」または「生物学的サンプル」という語は、インビボで、すなわち、動物から取り出すことなく解析される細胞または組織もいう。一般に、「サンプル」または「生物学的サンプル」は、動物由来の細胞を含むが、さらに、癌関連ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルの測定に用いることができる血液、唾液または尿の非細胞性の画分など、非細胞性の生物材料もいう。さらに、「サンプル」または「生物学的サンプル」は、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含み、かつ、生体を繁殖させる栄養ブロスまたはゲルなどの培地もいう。
【０１４６】
一実施形態では、細胞または細胞／組織ライセートを抗体と接触させ、抗体と細胞間の結合を判定する。同じ組織型の対照細胞と比較して被検細胞に結合活性が示された場合、被検細胞が癌性であることが示唆されることがある。いくつかの実施形態では、被検細胞は、ヒト組織由来である。
【０１４７】
特異的な抗体−抗原結合の検出には、当該技術分野において公知の様々な方法を用いることができる。本発明に従って行うことができる例示的なイムノアッセイとして、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ：ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、比濁阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ：ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。指標部分または標識基については、対象となる抗体に結合させればよいが、用いる方法の様々な使用の要件を満たすように選択する。使用要件は、アッセイ機器が利用できるかどうか、さらに機器に適合するイムノアッセイの手順により左右されることが多い。適切な標識として、放射性核種（たとえば、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^３Ｈまたは^３２Ｐ）、酵素（たとえば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼまたはβ−グラクトシダーゼ）、蛍光部分もしくはタンパク質（たとえば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）またはＢＦＰ（ｂｕｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ））または発光部分（たとえば、カンタムドットコーポレーション（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），パロアルト，カリフォルニア州が提供するＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）があるが、これに限定されるものではない。上記の様々なイムノアッセイを行う際に用いることができる一般的な技法は、当業者に公知である。
【０１４８】
診断のために、抗体を含むポリペプチドを、以下に限定されるものではないが、放射性同位元素、蛍光標識および当該技術分野において知られている種々の酵素−基質標識などの検出可能な部分で標識してもよい。標識を抗体にコンジュゲートする方法は、当該技術分野において公知である。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体を含むポリペプチドを標識しなくてもよく、その有無を、本発明の抗体に結合する標識抗体を用いて検出してもよい。
【０１５０】
本発明の抗体については、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイなど、任意の既知のアッセイ方法において用いることができる。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照されたい。
【０１５１】
抗体およびポリペプチドを、インビボイメージングなどのインビボ診断アッセイに用いてもよい。通常、抗体またはポリペプチドを放射性核種（^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ、^１４Ｃ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉまたは^３Ｈなど）で標識して、免疫シンチオグラフィーを用いて目的の細胞または組織の位置を特定できるようにする。
【０１５２】
さらに、当該技術分野において周知の技法を用いて、病理研究用の染色試薬としてこの抗体を使用しても構わない。
【０１５３】
治療用途
本発明の抗体の非常に驚くべき特色は、非造血系癌の細胞死を効果的に誘導する作用に関する。したがって、本発明は、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、乳房癌、肝細胞癌および甲状腺癌などの癌を処置する際の、本発明の抗体およびポリペプチドの治療用途を提供する。癌細胞に発現するエピトープを本明細書に記載の抗体が認識するのであれば、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳房癌、脳腫瘍、悪性メラノーマ、腎細胞癌、膀胱癌、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、テコーマトーシス、アンドロブラストーマ、子宮内膜肥厚、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経線維腫、乏突起膠腫、髄芽腫、神経節芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、過誤芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状腺肉腫およびウィルムス腫瘍など、任意の癌を処置することができる。この方法は、処置する個体において本明細書に記載の抗体またはポリペプチドと腫瘍または癌細胞との間の結合を検出するステップをさらに含んでも構わない。
【０１５４】
通常、抗体またはポリペプチドを含む組成物を、処置が必要な被検体に有効量で投与することで、癌細胞の成長を阻害し、および／または癌細胞の死を誘導する。好ましくは、この組成物を薬学的に許容されるキャリアとともに製剤化する。
【０１５５】
一実施形態では、組成物を、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射および筋肉内注射による投与および経口、粘膜、吸入、舌下などによる他の形の投与用に製剤化する。
【０１５６】
別の実施形態では、本発明は、検出可能な標識または治療薬もしくは細胞傷害性薬剤などの他の分子にコンジュゲートした本発明の抗体またはポリペプチドを含む組成物の投与を意図している。この薬品は、放射性同位元素、トキシン、トキソイド、炎症剤、酵素、アンチセンス分子、ペプチド、サイトカインまたは化学療法剤を含んでもよい。抗体をそうした分子とコンジュゲートする方法は通常、当業者に公知である。たとえば、国際公開第９２／０８４９５号；国際公開第９１／１４４３８号；国際公開第８９／１２６２４号；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照されたい。これらの開示については、その全体を参照によって本明細書に援用する。
【０１５７】
一実施形態では、この組成物は、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートした抗体またはポリペプチドを含む。細胞傷害性薬剤は、細胞に有害な任意の薬品を含んでもよい。抗体またはフラグメントにコンジュゲートすることができる細胞傷害性薬剤の好ましいクラスとして、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにこれらのアナログまたはホモログが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１５８】
処置に必要な投与量は、投与経路の選択、製剤の性質、被検体の疾病の性質、被検体の大きさ、体重、表面積、年齢および性別、投与する他の薬物および主治医の判断によって異なる。好適な投与量は、０．０１〜１０００．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１５９】
一般に、以下の用量のいずれかを用いることができる：少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重またはそれ未満の用量を投与する。数日間以上にわたる反復投与の場合、症候に応じて、疾患症状の所望の抑制が認められるまで処置を持続する。例示的な投与レジメンは、抗体を約６ｍｇ／ｋｇで週１回投与することを含む。ただし、開業医が達成したい薬物動態学的消失のパターンにより、他の投与レジメン（ｄｏｓａｇｅ ｒｅｇｉｍｅｎ）が有用な場合もある。一般に、半減期などの経験的判断が投与量の決定に寄与する。こうした治療の進行については、従来の技法およびアッセイにより容易に監視できる。
【０１６０】
一部の被検体では、複数回の投与が必要とされる場合がある。投与頻度を決定してから、治療の過程で投与頻度を調整してもよい。たとえば、処置する癌のタイプおよびステージ、薬品を投与するのが予防目的か治療目的か、今までの治療、患者の病歴および薬品に対する反応ならびに主治医の裁量に基づき、投与頻度の決定または調整を行うことができる。一般に、臨床医は、所望の結果が得られる適切な投与量に達するまで治療用抗体（ヒト化５Ｆ１など）を投与する。場合によっては、抗体の持続放出性製剤が適切なこともある。持続的な放出を実現するための様々な製剤および装置については、当該技術分野において公知である。
【０１６１】
一実施形態では、抗体またはポリペプチドの投与量を、１回または複数回の投与（単数または複数）を行っている被検体ごとに経験に基づき決定しても構わない。抗体またはポリペプチドの投与量を段階的に増やして被検体に投与する。抗体またはポリペプチドの有効性を判定するには、ＣＤ４３またはＣＥＡなどの疾患症状のマーカーを監視すればよい。また、インビボでの有効性を、腫瘍量または腫瘍容積、疾患進行までの経過時間（ＴＤＰ：ｔｉｍｅ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）および／または奏効率（ＲＲ：ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒａｔｅ）の判定により判定することもできる。
【０１６２】
本発明の方法による抗体またはポリペプチドの投与は、たとえば、被投与者の生理的状態、投与が治療目的か予防目的か、さらに当業者の知る他の要因に応じて連続的でも、間歇的でも構わない。抗体またはポリペプチドの投与は、本質的に事前に選択した期間にわたり連続的であってもよいし、間隔をおいた一連の投与であってもよい。
【０１６３】
他の製剤は、以下に限定されるものではないが、リポソームのようなキャリアなど、当該技術分野において公知の好適な送達形態である。たとえば、Ｍａｈａｔｏら、（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３−８５９を参照されたい。リポソーム調製物には、サイトフェクチン、多重膜ベシクルおよび単層リポソームがあるが、これに限定されるものではない。
【０１６４】
別の実施形態では、組成物は、１種または複数種の抗癌剤、本明細書に記載の１種または複数種の抗体、あるいは別の抗原に結合する抗体またはポリペプチドを含んでもよい。こうした組成物は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の抗体を含んでも構わない。抗体および他の抗癌剤に関しては、同じ製剤（たとえば、当該技術分野でよく呼ばれる混合物）中にあっても、別の製剤中にあってもよいが、同時または連続的に投与すれば、広範な個体群の処置に特に有用である。
【０１６５】
また、本発明の抗体またはポリペプチド（抗体５Ｆ１またはヒト化形態など）のいずれかをコードしているポリヌクレオチドを用いて、本発明の抗体またはポリペプチドのいずれかを送達し、所望の細胞に発現させることもできる。発現ベクターを用いて抗体またはポリペプチドの発現を誘導できることは明らかである。発現ベクターについては、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、髄腔内投与、脳室内投与、経口投与、経腸的投与、非経口的投与、鼻腔内投与、経皮的投与、舌下投与または吸入など、当該技術分野において公知の任意の手段で投与することができる。たとえば、発現ベクターの投与には、注射、経口投与、パーティクルガンまたはカテーテル投与および局所投与などの局所または全身投与がある。当業者であれば、インビボで外来性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。たとえば、米国特許第６，４３６，９０８号；同第６，４１３，９４２号；および同第６，３７６，４７１号を参照されたい。
【０１６６】
本発明の抗体またはポリペプチドのいずれかをコードしているポリヌクレオチドを含む治療用組成物の標的送達を用いることもできる。受容体を介したＤＮＡ送達の技法は、たとえば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら、，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ （Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，ｅｄ．）（１９９４）；Ｗｕら、，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕら、，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら、（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：３６５５；Ｗｕら、（１９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３３８に記載されている。局所投与の遺伝子治療プロトコルでは、ＤＮＡ約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲でポリヌクレオチドを含む治療用組成物を投与する。また、遺伝子治療プロトコルにおいては、ＤＮＡを約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇおよび約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲で用いてもよい。
【０１６７】
遺伝子送達ビヒクルを用いて本発明の治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを送達してもよい。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス由来でも、非ウイルス由来でも構わない（Ｊｏｌｌｙ（１９９４），Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４），Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９８５），Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１８５；ａｎｄ Ｋａｐｌｉｔｔ（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１４８を全般的に参照）。そうしたコード配列の発現を、哺乳動物の内因性または異種プロモーターを用いて誘導してもよい。コード配列の発現は、構成的でも、あるいは、調節的でも構わない。
【０１６８】
所望のポリヌクレオチドを所望の細胞に送達し、発現させるウイルスベースのベクターは、当該技術分野において周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルとして、組換えレトロウイルス（たとえば、国際公開第９０／０７９３６号；国際公開第９４／０３６２２号；国際公開第９３／２５６９８号；国際公開第９３／２５２３４号；国際公開第９３／１１２３０号；国際公開第９３／１０２１８号；国際公開第９１／０２８０５号；米国特許第５，２１９，７４０号；同特許第４，７７７，１２７号；独国特許第２，２００，６５１号；および欧州特許第０３４５２４２号を参照）、たとえば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））などのアルファウイルスベースのベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクター（たとえば、国際公開第９４／１２６４９号、国際公開第９３／０３７６９号；国際公開第９３／１９１９１号；国際公開第９４／２８９３８号；国際公開第９５／１１９８４号および国際公開第９５／００６５５号を参照）が挙げられるが、これに限定されるものではない。Ｃｕｒｉｅｌ（１９９２），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７に記載されているような死滅アデノウイルスに結合したＤＮＡの投与を用いてもよい。
【０１６９】
さらに、以下に限定されるものではないが、死滅アデノウイルスに単独で結合した、あるいは結合していないポリカチオン性凝縮ＤＮＡ（たとえば、Ｃｕｒｉｅｌ（１９９２），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７を参照）；リガンド結合ＤＮＡ（たとえば、Ｗｕ（１９８９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５を参照）；真核細胞の送達ビヒクル細胞（たとえば、米国特許第５，８１４，４８２号；国際公開第９５／０７９９４号；国際公開第９６／１７０７２号；国際公開第９５／３０７６３号；および国際公開第９７／４２３３８号を参照）および核電荷の中和または細胞膜との融合など、非ウイルス性の送達ビヒクルおよび方法を用いても構わない。
【０１７０】
さらに、裸のＤＮＡを用いてもよい。例示的な裸のＤＮＡの導入方法については、国際公開第９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして働くリポソームについては、米国特許第５，４２２，１２０号；国際公開第９５／１３７９６号；国際公開第９４／２３６９７号；国際公開第９１／１４４４５号；および欧州特許第０５２４９６８号に記載されている。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ９１：１５８１に記載されている。
【０１７１】
本発明の抗体を含む組成物については、化学療法剤（５−ＦＵ、５−ＦＵ／ＭＴＸ、５−ＦＵ／ロイコボリン、レバミソール、イリノテカン、オキサリプラチン、カペシタビンまたはウラシル／テガフールなど）、免疫アジュバント、成長阻害剤、細胞傷害性薬剤およびサイトカインなど１種または複数種の他の治療薬と連続的に、または、同時に投与してもよい。抗体および治療薬の量は、使用する薬物のタイプ、処置対象の病状ならびに投与スケジュールおよび投与経路によって異なるが、通常、各治療薬を個々に使用する場合よりも少量になる。
【０１７２】
本明細書に記載の抗体を含む組成物の投与後、当業者に周知の様々な方法によりインビトロでもインビボでも組成物の有効性を評価することができる。候補組成物の抗癌活性を検査する場合、様々な動物モデルがよく知られている。こうしたモデルには、無胸腺ヌードマウスまたはｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに異種移植したヒト腫瘍、あるいはｐ５３ノックアウトマウスなどのマウスの遺伝性腫瘍モデルがある。こうした動物モデルのインビボでの性質から、ヒト患者の反応が具体的に予測される。こうしたモデルを、たとえば、皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植および腎被膜下移植など標準技法を用いて細胞を同系マウスに導入して作製してもよい。
【０１７３】
キット
また、本発明は、本方法で使用するキットも提供する。本発明のキットは、本明細書に記載の精製抗体またはポリペプチドと、本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従った使用説明書とを含む１つまたは複数の容器を含む。いくつかの実施形態では、こうした説明書は、本明細書に記載の方法のいずれかに従って結腸直腸癌などの非造血系癌を処置する抗体の投与に関する説明を含む。キットは、個体に疾患があるかどうかおよびその疾患のステージ、あるいは個体の癌細胞にエピトープが発現しているかどうかの確認を踏まえた、処置に好適な個体の選択に関する説明をさらに含んでも構わない。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、サンプル中の癌細胞を検出するキットは、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドと、サンプル中の細胞に対する抗体またはポリペプチドの結合を検出する試薬とを含む。
【０１７５】
癌を処置する抗体またはポリペプチドの使用に関する説明書には通常、対象となる処置についての投与量、投与スケジュールおよび投与経路に関する情報が含まれている。容器は、１回用量でも、バルクパッケージ（たとえば、反復投与用のパッケージ）でも、サブユニット用量でも構わない。本発明のキットに付属の説明書は一般に、ラベルまたは添付文書（たとえば、キットに含まれる紙シート）に記載された説明書であるが、機械読み取り可能な説明書（たとえば、磁気または光学保存ディスク上にある説明書）でも問題ない。
【０１７６】
ラベルまたは添付文書には、その組成物を用いて本明細書に記載の癌を処置する旨表示されている。本明細書に記載の方法のいずれかの実施に関する説明書を提供してもよい。
【０１７７】
本発明のキットは、適切にパッケージされている。適切なパッケージには、バイアル、ビン、ジャー、フレキシブルパッケージ（たとえば、シールマイラーまたはビニール袋）および同種のものが含まれるが、これに限定されるものではない。さらに、吸入器、鼻腔内投与装置（たとえば、アトマイザー）またはミニポンプなどの注入装置のような特定の装置と組み合わせて用いるパッケージも意図している。キットには、滅菌アクセスポートがあってもよい（たとえば、容器は、皮下注射針で穿刺可能な栓が付いた静脈内注射液バッグまたはバイアルであってもよい）。さらに、容器にも、滅菌アクセスポートがあってもよい（たとえば、容器は、皮下注射針で穿刺可能な栓が付いた静脈内注射液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの有効な薬物は、本明細書に記載の抗体である。容器は、薬学的に有効な第２の薬物をさらに含んでも構わない。
【０１７８】
キットは任意に、緩衝剤および説明情報など他の要素も提供する。通常、キットは、容器と、容器の表面上あるいは容器に付属したラベルまたは添付文書（単数または複数）とを含む。
【実施例】
【０１７９】
以下の実施例は、本発明の説明を目的としており、本発明を限定するために提供するものではない。
【０１８０】
（実施例１）
癌細胞に発現するＣＤ４３に特異的に結合するモノクローナル抗体の作製および特徴付け
モノクローナル抗体の作製
フードインダストリーリサーチアンドデベロップメントインスティテュート（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＣＣＲＣ ６００５４），新竹（Ｈｓｉｎ−ｃｈｕ），台湾からヒト結腸直腸腺癌の細胞株ＣＯＬＯ２０５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）を購入し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）ＢＲＬ）で１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコＢＲＬ）とともに５％ＣＯ_２の湿潤雰囲気において３７℃にて生育させた。８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、５００μｌのＰＢＳ（（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ））に加えた２×１０^７個のＣＯＬＯ２０５細胞またはＣＦＡ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）に加えた１０マイクログラムの部分精製タンパク質で２週ごとに３回免疫し、最後に２００μｌのＰＢＳに加えた２×１０^６個のＣＯＬＯ２０５細胞または１０マイクログラムの部分精製タンパク質で追加免役した。最後の追加免疫から５日後、その脾臓細胞をＸ６３骨髄腫細胞と融合した。ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ（ハイクローン）およびＨＡＴ（Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（登録商標）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｈ０２６２、最終濃度はヒポキサンチン１００μＭ、アミノプテリン０．４μＭ、チミジン１６μＭ）を補充したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）で選択した。モノクローナル抗体５Ｆ１、５１−４１および１３８−１０を分泌している３種のハイブリドーマ細胞株ｍ５Ｆ１、ｍ５１−４１、ｍ１３８−１０を作製した。
【０１８１】
モノクローナル抗体５Ｆ１の標的抗原の同定および特徴付け
結腸直腸癌組織またはＣＯＬＯ２０５細胞由来の膜タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤（コンプリート錠；ロシュモレキュラーバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を含む抽出緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ノニデットＰ−４０）で単離した。最初に、膜タンパク質のライセートを、プロテインＧセファロース（アマシャムファルマシアバイオテクインク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．），ニュージャージー州、米国）に固定化した非免疫マウスのＩｇＧを含む１ｍｌのカラムで前除去して、その溶出部分を、プロテインＧ−セファロースに結合した５Ｆ１の１ｍｌのカラムに直接導入した。カラムを洗浄し、５Ｆ１の標的タンパク質を溶出させた。単離されたタンパク質の純度を銀染色で可視化して、さらに８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離後、ウエスタンブロッティングで同定した。さらに、単離されたタンパク質を用いてマウスを免疫し、１３８−１０または５１−４１など他の５Ｆ１様抗体を作製した。
【０１８２】
免疫沈降実験では、この膜タンパク質を５Ｆ１または抗ＣＤ４３抗体（ＡＦ２０３８，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．）とインキュベートし、続いてプロテインＧセファロース（アマシャムファルマシアバイオテクインク，ニュージャージー州，米国）とインキュベートした。その沈殿物を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ウエスタン（またはイムノ）ブロット解析に供した。
【０１８３】
タンパク質を等量のサンプル緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭのＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、２％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、０．１％ブロモフェノールブルー、１０％グリセロール）と混合し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してから、ニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ Ｓｕｐｅｒ，アマシャム）にトランスファーした。次いで、ニトロセルロース膜をＰＢＳに加えた５％スキムミルクでブロックして、５Ｆ１または抗ＣＤ４３ｍＡｂ（ＡＦ２０３８）とインキュベートした。その後、ブロットを、西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリン（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ウエストグローブ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ），ペンシルベニア州）で処理し、化学発光試薬（ＥＣＬ，アマシャム，英国）で展開した。
【０１８４】
５Ｆ１がＣＤ４３を認識するかどうかを検査するため、市販されている抗ＣＤ４３ｍＡｂ（ＡＦ２０３８、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．）を用いて、ウエスタンブロット解析でＣＯＬＯ２０５ライセート由来の５Ｆ１親和性精製タンパク質の種類を確認した。５Ｆ１結合陰性細胞株ＣＯＬＯ３２０由来のライセートを対照として用いた。今回の結果（図１）によれば、抗ＣＤ４３（ＡＦ２０３８）抗体と５Ｆ１抗体がともに５Ｆ１のイムノアフィニティーカラムで捕獲したタンパク質と反応しており、５Ｆ１がＣＤ４３を認識することが強く示唆された。
【０１８５】
モノクローナル抗体５Ｆ１は、非造血系癌細胞のＣＤ４３に発現する細胞表面を特異的に認識する。
【０１８６】
２×１０^５個のＣＯＬＯ２０５細胞を、ｖ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、５Ｆ１抗体と０．３３〜１μｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度で４℃にて１時間インキュベートした。細胞を２００μｌのＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）緩衝液（１×ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ）で２回洗浄し、１μｇ／ｍｌ（ＦＡＣＳ緩衝液中）のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（サザンバイオテク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．））１００μｌで染色してから、４℃で３０間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、フローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ，ＢＤライフサイエンシズ（ＢＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））で解析した。
【０１８７】
フローサイトメトリーによる抗体結合の結果を以下の表１に示す。５Ｆ１（アイソタイプ：ＩｇＧ３）または１３８−１０（アイソタイプ ＩｇＭ）または５１−４１（アイソタイプ ＩｇＭ）などのモノクローナル抗体は、ＣＯＬＯ２０５結腸直腸癌細胞およびＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞の細胞質膜表面に発現するＣＤ４３を認識するが、末梢性ＴとＪｕｒｋａｔ（リンパ芽球様の白血病細胞株；ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）のいずれも認識しない。以下の表１を参照されたい。さらに、フローサイトメトリーのデータ（図２Ａおよび図２Ｂ）によれば、５Ｆ１は、結腸直腸癌細胞（ＤＬＤ−１）および胃癌細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７）など、他のタイプの癌細胞に結合するが、正常な内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、正常な肺細胞（ＭＲＣ−５）、正常な乳腺上皮細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）、正常な結腸直腸細胞（ＣＣＤ８４１−ＣｏＮ）、活性化Ｔリンパ球（数日間活性化した）または正常な末梢血単核球（ＰＢＭＣ）には結合しない。
【０１８８】
表１は、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、ヒト末梢性Ｔ細胞およびＪｕｒｋａｔ（リンパ芽球様の白血病細胞株）に対する５Ｆ１、１３８−１０または５１−４１などの抗ＣＤ４３抗体の抗原結合特性を示す。
【０１８９】
【表１】

ＣＯＬＯ２０５細胞およびヒト結腸直腸癌組織における５Ｆ１の標的タンパク質の発現を検出するため、通例の免疫組織化学的方法を用いた。簡単に説明すると、細胞または組織を固定し、１μｇ／ｍｌの５Ｆ１で免疫染色して、ビオチン標識抗マウスＩｇＧとインキュベートし、次いでアビジンビオチンペルオキシダーゼ複合体（ベクターラボラトリーズインク（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．），バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ），カリフォルニア州，米国）とインキュベートし、色素原３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩で染色した。免疫組織化学試験から、結腸直腸癌患者由来の組織の５２．５パーセント（３１／５９）が５Ｆ１により陽性に染色された。
【０１９０】
（実施例２）
癌細胞に発現するＣＤ４３に特異的に結合する抗体のアポトーシス活性
ＥＬＩＳＡアッセイによる、ＣＯＬＯ２０５細胞において５Ｆ１が誘導するアポトーシスの検出
５Ｆ１が誘導する細胞死のタイプを評価するため、培養プレートで結腸直腸癌細胞を生育させ、５Ｆ１とともに、あるいはそれなしでインキュベートした。ヌクレオソーム間の（アポトーシス）ＤＮＡ断片化のレベルを、細胞死検出ＥＬＩＳＡ^ＰＬＵＳキット（ロシェ、カタログ番号１７７４４２５）を用いて、細胞質内のモノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームに結合したヒストン−ＤＮＡ複合体を抗体により捕獲および検出して判定した。製造者の指示に従って、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。簡単に説明すると、１×１０^４個のＣＯＬＯ２０５細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに蒔き、１０μｇ／ｍｌの濃度で５Ｆ１または９Ｅ１０（抗ｍｙｃ抗体）、あるいは、培地対照とインキュベートした。３７℃でインキュベートしてから６、２４または４８時間後、細胞を洗浄し、２００μｌの溶解緩衝液で３０分間インキュベートした。核をペレットした（２００×ｇ、１０分）後、断片化ＤＮＡを含む２０μｌの上清（細胞質画分）を、ビオチン標識抗ヒストンモノクローナル抗体とインキュベートしておいたストレプトアビジンコート済みマイクロタイタープレートに移した。抗ヒストン抗体に結合したヌクレオソームの断片化ＤＮＡの量を、ＡＢＴＳ（２，２−アジノ−ジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホナート−６−ジアンモニウム塩］）を基質として用いてペルオキシダーゼコンジュゲート抗ＤＮＡモノクローナル抗体で評価した。最後に、ペルオキシダーゼ基質と１０〜２０分間インキュベートした際に、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ），ＳＰＥＣＴＲＡ ｍａｘ Ｍ２）で４０５ｎｍの吸光度を判定した。溶解緩衝液および基質のみを含むウェルの値をバックグラウンドとして差し引いた。細胞質に放出されたモノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームを特異的なエンリッチメントとして、以下の式を用いた値からデータを解析した：
エンリッチメント係数（Ｅ．Ｆ．）＝サンプル（死につつある／死んだ細胞）のｍＵ／培地対照（ｍＡｂ処理をしてない細胞）のｍＵ
ｍＵ＝吸光度［１０^−３］
図３に示したデータから、インキュベーションから２４時間後にＣＯＬＯ２０５細胞の細胞質で５Ｆ１がヌクレオソームのエンリッチメントを誘導したことが示唆される。５Ｆ１で処理した細胞質において検出された断片化ＤＮＡは、培地対照と比較して４倍を超えて増加した。対照抗体９Ｅ１０（抗ｍｙｃ抗体）で処理した細胞でも、培地のみで処理した細胞でも、そうしたエンリッチメントは観察されなかったことから、癌細胞にアポトーシスを引き起こす原因となったのは５Ｆ１のみと考えられる。
【０１９１】
アネキシンＶおよびＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）染色を用いた、ＣＯＬＯ２０５細胞において５Ｆ１、１３８−１０および５１−４１が誘導するアポトーシスの検出
アネキシンＶは、アポトーシスプロセスの初期に細胞質膜の外側の方に向きを変えるリン脂質を染色する。したがって、ＦＡＣＳ分析で測定したように、アネキシンＶの染色から、アポトーシスの生じた細胞が示唆される。１．２×１０^５個のＣＯＬＯ２０５細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、次いでこの細胞に、培地または新鮮培地（未処理対照）で希釈した５Ｆ１を様々な濃度（２〜１６μｇ／ｍｌ）で加えた。５Ｆ１が腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導するのに架橋剤（ＣＬ：ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）を必要とするかどうかを検査するため、２０μｇ／ｍｌのウサギ抗マウスＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチ，カタログ番号３１５−００５−０４５）を比較のため一連のサンプルに加えた。３７℃で６時間インキュベートした後、この細胞を、１００μｌのアネキシンＶ結合緩衝液に加えた０．２５μｌのＦＩＴＣコンジュゲートアネキシンＶ（ストロングバイオテクコーポレーション（Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））で室温にて１５分間染色した。次いでこの細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、ＤＮＡ染色色素）染色しフローサイトメトリーで解析した。
【０１９２】
フローサイトメトリーのデータから、架橋剤の非存在下で４μｇ／ｍｌ以上の濃度で６時間５Ｆ１を処理すると、非常に多くの結腸直腸癌細胞でアポトーシスが生じることが示唆されることから、５Ｆ１は単独でＣＯＬＯ２０５細胞のアポトーシスを効果的に誘導すると考えられる。
【０１９３】
他の抗Ｃ４３抗体、１３８−１０および５１−４１によるＣＯＬＯ２０５細胞のアポトーシス誘導作用も検査した。以下の表２は、結腸直腸癌細胞においてアポトーシスを誘導する５Ｆ１、１３８−１０または５１−４１を示す。ＣＯＬＯ２０５細胞を、３２マイクログラム／ｍｌの各抗体と６時間インキュベートし、アネキシン−Ｖ、次いでＰＩで染色して、その後ＦＡＣＳ分析を行った。
【０１９４】
表２．ＣＯＬＯ２０５細胞における５Ｆ１、１３８−１０および５１−４１によるアポトーシスの誘導。
【０１９５】
【表２】

上記の結果から、癌に発現するＣＤ４３に特異的な抗体で処理すると、癌細胞のアポトーシスを誘導できることが示唆される。
【０１９６】
ＹＯ−ＰＲＯ−１染色またはアネキシンＶおよびＰＩ染色を用いた、ＮＣＩ−８７細胞においてｍ５Ｆ１が誘導するアポトーシスの検出
４×１０^５個のＮＣＩ−Ｎ８７（ヒト胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株）細胞または５×１０^５個のＣＯＬＯ２０５細胞を、１２ウェル培養プレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ）のカタログ番号１５０６２８）に播種した。一晩培養した後、培地を交換し、図１０に示した濃度の抗体またはアジドを加えて６時間インキュベートした。次にこの細胞を、トリプシン処理し、集めてＹＯ−ＰＲＯ−１（インビトロジェンのカタログ番号Ｙ３６０３）で染色するか、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ ＆ ＰＩ（ストロングバイオテク，アポトーシス検出キット，カタログ番号ＡＶＫ２５０）で二重染色した。
【０１９７】
図１０Ａおよび１０Ｂに示すように、ＹＯ−ＰＲＯ−１染色（Ａ）およびアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣおよびＰＩを用いた二重染色（Ｂ）による測定から、抗体ｍ５Ｆ１は、ＮＣＩ−８７およびＣＯＬＯ２０５細胞においてアポトーシスを誘導した。こうしたデータは、ｍ５Ｆ１も胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞においてアポトーシスを誘導できることを示す。
【０１９８】
（実施例３）
５Ｆ１による癌細胞の成長阻害
５Ｆ１は単独で癌細胞の成長を阻害する
結腸直腸癌細胞（ＣＯＬＯ２０５）および正常な内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種し、５Ｆ１または対照抗体９Ｅ１０とインキュベートした。陰性対照として未処理の細胞もインキュベートした。本明細書に記載するように増殖活性を検出するため、ＭＴＴおよびＷＳＴ−１アッセイを用いて細胞生存を評価した。
【０１９９】
ＷＳＴ−１アッセイは、細胞ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼによりテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１がホルマザンへと切断されることに基づいている。生成されるホルマザンについては、分光光度計で４５０ｎｍの吸光度を測定して定量することができる。生細胞が増殖すれば、酵素の全活性が増強されるが、酵素活性の低下は、細胞の成長阻害を示す。そこで、ＷＳＴ−１アッセイを用いて、５Ｆ１処理後の腫瘍細胞の生存率を評価した。簡単に説明すると、１００μｌの培地に加えた４×１０^３個のＣＯＬＯ２０５細胞を、処理ごとに５回ずつ９６ウェル培養プレートに播種した。次に１０μｇ／ｍｌの５Ｆ１、対照抗体９Ｅ１０（抗ｍｙｃ抗体）または新鮮培地（未処理の対照）を加えた。このアッセイには、細胞毒性対照としてさらに０．５％アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）の処理も加えた。３７℃での３日のインキュベーション期間後、２０μｌのＷＳＴ−１試薬（ロシェ、カタログ番号１６６４８０７）を各ウェルに加え、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。処理した細胞の生存率を反映する４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＣＯＬＯ２０５細胞に関するＷＳＴ−１アッセイの結果を図４に示す。データから、ＣＯＬＯ２０５細胞の成長が著しく阻害された（図４）一方、ＨＵＶＥＣ（データなし）の成長には５Ｆ１処理の影響がないことが示唆された。抗体５Ｆ１で処理した癌細胞の生存率の割合は、アイソタイプコントロール抗体９Ｅ１０で処理した結腸直腸癌細胞と比較して５０％未満に低下した。０．５％アジ化ナトリウムで処理した陽性対照群の生存率は、１９％であった。
【０２００】
別の実験では、細胞（２×１０^３）を、９６ウェル培養プレートの各ウェルに播種し、１０マイクログラム／ｍｌのモノクローナル抗体５Ｆ１または対照の抗体９Ｅ１０（ｃ−ｍｙｃに対する抗体）とインキュベートした。未処理細胞を陰性対照として用い、０．５％アジ化ナトリウムで処理した細胞を陽性対照として用いた。３７℃での２日または３日のインキュベーション期間後、１０ｕｌのＷＳＴ−１試薬を各ウェルに加え、この細胞をさらに３０分間インキュベートした。その後、上記のようにＷＳＴ−１細胞生存アッセイを行った。図５に示すその結果から、抗体５Ｆ１はＣＯＬＯ２０５などの結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞の成長を実質的に阻害したのに対し、正常な結腸直腸細胞株（ＣＣＤ８４１−ＣｏＮなどには影響を与えなかった。
【０２０１】
ＭＴＴは、細胞の生存状況および増殖の測定に役立つテトラゾリウムをベースにしたもう１つの方法である。黄色のテトラゾリウムであるＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を、ＮＡＤＨ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）およびＮＡＤＰＨ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などの還元等価物を生成する代謝的に活性な細胞と、一部はデヒドロゲナーゼ酵素の作用とで還元する。得られた細胞内の紫色のホルマザンについては可溶化し、分光光度的手段で定量することができる。細胞（５×１０３）を９６ウェル培養プレートの各ウェルに播種し、モノクローナル抗体５Ｆ１（濃度範囲は０〜６４μｇ／ｍｌ）またはｃ−ｍｙｃに対する対照抗体９Ｅ１０（６４μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。未処理細胞を陰性対照として用い、０．５％アジ化ナトリウムで処理した細胞を陽性対照として用いた。３７℃での７２時間のインキュベーション期間後、１０μｌのＭＴＴ試薬を各ウェルに加え、この細胞を、紫色の沈殿が目視可能になるまでさらに２〜４時間インキュベートした。１００ｕｌの界面活性剤試薬（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を加える。５７０ｎｍのサンプルの吸光度を記録する。ＭＴＴアッセイのデータから、５Ｆ１が用量依存的（０〜６４μｇ／ｍｌ）にＣＯＬＯ２０５の細胞増殖を阻害し、ＥＤ５０（５０％阻害の有効用量）が８μｇ／ｍｌ（図６）であることが明らかになった。図６にも示してあるように、６４μｇ／ｍｌの５Ｆ１の使用時に細胞成長の顕著な阻害が確認されたのに対し、同じ濃度の対照抗体９Ｅ１０ではそうした作用は見られなかった。
【０２０２】
インビボでの５Ｆ１の抗腫瘍作用の評価
マウスの腫瘍異種移植モデルを用いてインビボでの５Ｆ１の抗腫瘍作用を解析した。５×１０^６個のＣＯＬＯ２０５細胞を０日目にＳＣＩＤマウスの後側腹部に皮下移植した。細胞接種から１週間後、ある実験では、マウスを、腹腔内注射により５００マイクログラムの５Ｆ１またはＰＢＳで処理した。別の実験では、樹立腫瘍を持つマウスの４群（各群にマウス６匹）を、２５ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシルおよびロイコボリン（５ＦＵ／ＬＶ）で１日おきに４回静脈内処理し、さらに様々な用量で５Ｆ１を週２回腹腔内注射するか、あるいはそれをしなかった。
【０２０３】
ある実験では、０日目にマウス１匹当たり１×１０^７個の結腸直腸癌細胞ＣＯＬＯ２０５を皮下注射して、ＳＣＩＤマウスに腫瘍を移植し、次いで０、３、５、７、１０、１２、１４および１７日目にモノクローナル抗体５Ｆ１（１用量当たり５００μｇ）または対照モノクローナル抗体９Ｅ１０（ｃ−ｍｙｃに対して産生される抗体）またはＰＢＳを腹腔内注射して処理した。この実験では、各群でマウス１５匹を使用した。腫瘍の大きさを、腫瘍産物の２つの幅と長さ（ＷｘＷｘＬ）を基準に５日目から２４日目まで測定し、ｍｍ^３で表した。図７に示すように、モノクローナル抗体５Ｆ１は、対照抗体９Ｅ１０およびＰＢＳ（未処理）と比較して腫瘍の成長を効果的に抑制した。
【０２０４】
５Ｆ１と５ＦＵ／ＬＶのような化学療法薬との併用作用を調べるため、腫瘍移植から７日後３週にわたり、マウスに２５ｍｇ／ｋｇの５ＦＵ／ＬＶを１日おきに４回静脈内注射し、５Ｆ１抗体を様々な量で週２回腹腔内注射するか、あるいはしなかった。カリパスによる週２回の腫瘍容積（ｍｍ^３）の測定に基づき腫瘍成長を判定し、腫瘍の大きさを、式：π／６×長径×（短径）^２（Ｋｉｅｖｉｔ Ｅ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０：６６４９−５５）を用いて算出した。図８に示すように、５Ｆ１抗体処理と５ＦＵ／ＬＶ処理を併用すると、化学療法薬の単独処理の場合と比較してヒト結腸直腸腫瘍の成長が著しく阻害された（図８）。
【０２０５】
（実施例４）
３つの新規な抗ＣＤ４３抗体５Ｆ１、１３８−１０および５１−４１は、癌細胞に発現する類似のエピトープを認識する。
【０２０６】
３つの新規な抗ＣＤ４３抗体（５Ｆ１、１３８−１０および５１−４１）の結合特性を解明するため、ＦＡＣＳ分析を用いた。ＣＯＬＯ２０５細胞（１００，０００個）を、ビオチン標識していない様々な量の抗体５Ｆ１、１３８−１０および５１−４１の存在下で、１マイクログラム／ｍｌのビオチン標識５Ｆ１で４℃にて１時間染色した。洗浄後、この細胞を、同じ条件で３０分間ストレプトアビジン−ＦＩＴＣによりさらに染色した。この細胞を洗浄し、ＦＡＣＳで解析した。以下の表３に示すデータは、ある代表的な実験の平均蛍光強度である。５１−４１抗体および１３８−１０抗体はともに、ＣＯＬＯ２０５細胞に対するビオチン標識５Ｆ１の結合で競合できることから、３つの抗体はすべて、ＣＯＬＯ２０５細胞の表面に発現する類似の結合部位に結合すると考えられる。
【０２０７】
表３．５Ｆ１、１３８−１０および５１−４１は、ＣＯＬＯ２０５細胞に発現する類似のエピトープを認識する。
【０２０８】
【表３】

（実施例５）
抗体５Ｆ１のエピトープの特定
モノクローナル抗体５Ｆ１が認識するエピトープ構造をさらに明らかにするため、このモノクローナル抗体を用いて様々なポリペプチド配列に対する特異的反応を検査した。９６ウェルマイクロタイタープレートを、０．１ＭのＮａＨＣＯ_３（ｐＨ８．６）コーティング緩衝液に加えた濃度１０μｇ／ｍｌの抗体５Ｆ１（１ウェル当たり５０μｌ）で４℃にて一晩コートした。洗浄後、このプレートを、０．１ＭのＮａＨＣＯ_３（ｐＨ８．６）、５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、０．０２％ＮａＮ_３（１５０μｌ／ウェル）を含むブロッキング緩衝液で４℃にて少なくとも１時間インキュベートしてブロックした。次いでプレートを、様々なポリペプチドのフラグメントを含む融合タンパク質と種々の濃度で室温にて１時間インキュベートした。ＴＢＳ（ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を含む０．５％トウィーンで洗浄後、結合した融合タンパク質−ポリペプチドを、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）緩衝液で溶出し、１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）で中和した。次いで、溶出した融合タンパク質−ポリペプチドのアミノ酸配列を特定した。抗体５Ｆ１が結合するポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までにトリペプチド配列Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（ＷＰＩ）を含む。このトリペプチドアミノ酸配列は、ＣＤ４３のアミノ酸配列には存在しない。Ｐａｌｌａｎｔら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１３２８−３２，１９８９；Ｓｈｅｌｌｅｙら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２８１９−２３，１９８９を参照されたい。
【０２０９】
抗体５Ｆ１が結合するトリペプチドのエピトープをさらに確認するため、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。９６ウェルマイクロタイタープレートを、１ウェル当たり５０μｌとして１μｇ／ｍｌの濃度の抗体（５Ｆ１または対照抗体９Ｅ１０）で４℃にて一晩コートした。プレートを、ＰＢＳに加えた０．２５％ＢＳＡ（１５０μｌ／ウェル）で３７℃にて１時間インキュベートしてブロックした。次いでプレートを、キャリアタンパク質と融合したポリペプチドの様々なフラグメントを含む融合タンパク質と室温で２時間インキュベートした。０．０５％トウィーン２０を含むＰＢＳで４回洗浄した後、プレートを、キャリアタンパク質に特異的な２μｇ／ｍｌの抗体と室温で１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。次いでＨＲＰとコンジュゲートした３０００倍希釈のヤギ抗キャリアタンパク質特異的抗体５０μｌを各ウェルに加え、このプレートを３７℃で１時間インキュベートした。ＨＲＰ酵素の基質を加えて酵素反応を行い、これら２つの抗体（５Ｆ１および９Ｅ１０）に対するこれらに対する指定のポリペプチドの反応性を判定した。以下の表４は、５Ｆ１または９Ｅ１０をプレートに固定化した際のＥＬＩＳＡアッセイのデータを示す。「＋」は、指定のポリペプチドがこのモノクローナル抗体に結合することを示し、「−」は、指定のポリペプチドがこのモノクローナル抗体に結合しないことを示す。モノクローナル抗体５Ｆ１は、トリペプチドのＷＰＩエピトープ構造を認識した。トリペプチドのＷＰＩ配列は、ＣＤ４３には存在しないため、こうしたデータから、５Ｆ１は、トリペプチドＷＰＩが形成する構造に類似または等価な物理的および／または化学的特徴を持つ構造を含む立体構造エピトープを認識することが示唆される。
【０２１０】
表４．５Ｆ１が認識するエピトープ構造
【０２１１】
【表４】

（実施例６）
５Ｆ１、１３８−１０および５１−４１の軽鎖および重鎖の可変領域のクローニングおよび抗体のヒト化
５Ｆ１の軽鎖および重鎖の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、その合成ｃＤＮＡを、配列決定できるようにｐＣＲＩＩ（インビトロジェン）にサブクローニングした。複数の独立クローンからヌクレオチド配列を得て解析した。各抗体の軽鎖Ｖ領域または重鎖Ｖ領域に相当するように、独立クローンから同一のｃＤＮＡ配列を選択した。以下の表５は、５Ｆ１、１３８−１０、５１−４１およびヒト化５Ｆ１（ｈ５Ｆ１Ｖｃ）の軽鎖Ｖ領域および重鎖Ｖ領域の翻訳アミノ酸配列およびそのＶ領域をコードしているヌクレオチド配列を示す。
【０２１２】
表５．抗体の可変領域のアミノ酸配列および抗体の可変領域をコードしている核酸配列（ＣＤＲを下線で示す）
５Ｆ１の重鎖アミノ酸配列（配列番号１）およびヌクレオチド配列（配列番号９）
【０２１３】
【化２】

５Ｆ１の軽鎖アミノ酸配列（配列番号２）およびヌクレオチド配列（配列番号１０）
【０２１４】
【化３】

１３８−１０の重鎖アミノ酸配列（配列番号３）およびヌクレオチド配列（配列番号１１）
【０２１５】
【化４】

１３８−１０の軽鎖アミノ酸配列（配列番号４）およびヌクレオチド配列（配列番号１２）
【０２１６】
【化５】

５１−４１の重鎖アミノ酸配列（配列番号５）およびヌクレオチド配列（配列番号１３）
【０２１７】
【化６】

５１−４１の軽鎖アミノ酸配列（配列番号６）およびヌクレオチド配列（配列番号１４）
【０２１８】
【化７】

ｈ５Ｆ１Ｖｃの重鎖アミノ酸配列（配列番号７）およびヌクレオチド配列（配列番号１５）
【０２１９】
【化８】

ｈ５Ｆ１Ｖｃの軽鎖アミノ酸配列（配列番号８）およびヌクレオチド配列（配列番号１６）
【０２２０】
【化９】

（実施例７）
キメラ５Ｆ１抗体の作製および特徴付け
キメラ抗体５Ｆ１（ｃ５Ｆ１）の構築および作製
キメラ抗体を発現するベクターを構築するため、５Ｆ１の軽鎖Ｖ領域をプラスミドｐＶＫにサブクローニングした。ｐＶＫは、ＣＭＶプロモーターおよびヒト軽鎖定常領域を含む。ヒト軽鎖定常領域に関する配列および生物学的情報は、Ｈｉｅｔｅｒ， Ｐ．Ａ．，ら、（１９８０），Ｃｌｏｎｅｄ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｋａｐｐａ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ａｎｄ Ｊ ｒｅｇｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｅｇｍｅｎｔｓ．Ｃｅｌｌ，２２（１ Ｐｔ １）：ｐ．１９７−２０７で確認することができる。
【０２２１】
５Ｆ１の重鎖Ｖ領域をプラスミドｐＶｇ１にサブクローニングした。ｐＶｇ１プラスミドはＣＭＶプロモーターを持ち、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域を含んでいる。ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域に関する配列および生物学的情報は、Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．，ＢＪ．Ｂｅｒｓｏｎ，ａｎｄ Ｌ．Ｅ．Ｈｏｏｄ（１９８１），Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｃ ｇａｍｍａ １ ｇｅｎｅ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１で確認することができる。
【０２２２】
次に、この軽鎖および重鎖を発現するプラスミドをＣｏｓ−７細胞に共導入した。ｃ５Ｆ１を含む上清を採取してｃ５Ｆ１のアポトーシス誘導機能を解析した。
【０２２３】
ｃ５Ｆ１の機能試験
その後、ｃ５Ｆ１を含む上清については、表面染色によりＣＯＬＯ２０５細胞に対するｃ５Ｆ１の結合を検査し、ｃ５Ｆ１の機能を上記のようなアネキシンＶアポトーシスアッセイで検査した。結合アッセイでは、０．５８マイクログラム／ｍｌのｃ５Ｆ１を用いた。アポトーシスアッセイでは、２〜３２マイクログラム／ｍｌのｍ５Ｆ１、ｃ５Ｆ１および９Ｅ１０（対照の抗ｍｙｃ抗体）を用い、インキュベーション時間は１６時間であった。ｃ５Ｆ１を含む上清は、マウスの５Ｆ１と同じようにＣＯＬＯ２０５細胞に結合し、ＣＯＬＯ２０５細胞におけるアポトーシスを誘導することから、クローン化ｃＤＮＡフラグメントは実際に、５Ｆ１のＶ領域をコードしていることが明らかにされる（図９Ａおよび図９Ｂ）。
【０２２４】
（実施例８）
ｍ５Ｆ１による結腸直腸癌組織の免疫組織化学的研究
ｍ５Ｆ１による組織染色
ｍ５Ｆ１標的の発現を、結腸直腸癌患者（ｎ＝５９）由来の原発腫瘍組織のパラフィン包埋サンプルを用いて免疫組織化学的検査により調査した。パラフィン包埋ヒト結腸および直腸癌組織の組織アレイをスーパーバイオチップスラボラトリーズ（ＳｕｐｅｒＢｉｏＣｈｉｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手した（ヒト組織アレイ，カタログ番号ＣＤ１）。製造者の指示に従って免疫組織化学的検査の標準的な染色手順を用いた（ベクタステインエリートＡＢＣキット（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ），ベクターラボラトリーズ）。すべての切片を５８℃で１時間加熱し、キシレンで５回脱パラフィン処理を行い、濃度を段階的に下げながらエタノールで再水和した。正常な血清（ベクタステイン，ＰＫ６１０２）で１時間ブロックした後、この切片を１μｇ／ｍｌの濃度でｍ５Ｆ１と室温で１時間インキュベートし、その後、ビオチン標識二次抗マウス抗体（ベクタステイン，ＰＫ６１０２）とインキュベートした。次に、切片をストレプトアビジン−ビオチン複合体（ベクタステイン，ＰＫ６１０２）とインキュベートした。このスライドをジアミノベンジジン溶液で展開した。最後に、このスライドをヘマトキシリンで対比染色し、脱水処理を行い、透徹して５０％グリセロールＰＢＳでマウントした。
【０２２５】
グレード分類による判定
２名の観察者により組織切片の抗原発現を評価し、５Ｆ１による染色を以下の経験的な半定量システムを用いてグレード分けした：
−は、陰性；＋−は、弱い染色；＋は、中程度の染色；＋＋は、強い染色。
【０２２６】
結果
ｍ５Ｆ１による染色では、すべての切片において、膜関連の染色が顕著であった。全体で、５９個の腫瘍標本のうち３１個（５２．５％）が５Ｆ１標的に対して陽性染色を呈し、５９個のうち２７個（４５．８％）が強い発現レベルを示した。１９サンプル（３２．２％）がｍ５Ｆ１標的の発現に対して陰性染色を呈した。検査対象の結腸直腸癌サンプル全体の染色結果の概要を表６に示す。こうしたデータから、抗体ｍ５Ｆ１を結腸直腸癌の診断に使用できることが示唆される。
【０２２７】
表６．ヒト結腸直腸癌における５Ｆ１標的の発現頻度
【０２２８】
【表６】

（実施例９）
ｍ５Ｆ１は、ＣＯＬＯ２０５に発現する組換えヒトＣＥＡ（ｒｈＣＥＡ）およびＣＤ４３（ｒｈＣＤ４３）に結合するが、ＣＯＳ−７細胞に発現するｒｈＣＥＡまたはｒｈＣＤ４３を認識しない
タンパク質サンプルの調製
ＣＯＬＯ２０５およびＣＯＳ細胞におけるＦｌａｇタグ付き組換えＣＥＡの免疫沈降：全長ＣＥＡタンパク質（３５〜７０２ａａ）をコードしているｃＤＮＡをプラスミドｐＦｌａｇ−ＣＭＶ−１にクローニングした。組換え（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）プラスミドＤＮＡを、エレクトロポレーションによりＣＯＬＯ２０５に導入するか（安定発現株の構築のため）、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン，カタログ番号１１６６８−０１９）によりＣＯＳ細胞に導入した（一過性発現実験のため）。細胞を発現する抗原を回収して、プロテアーゼ阻害剤（ロシェ，カタログ番号１１８３６１４５００１）を含む溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ４０）に溶解させた。細胞可溶化物の上清を抗Ｆｌａｇ（Ｍ２，ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），カタログ番号２００４７２）結合プロテインＧセファロースビーズ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），カタログ番号１７−０６１８−０２）と４℃で２時間インキュベートした。次いで、このプロテインＧセファロースビーズを溶解緩衝液で３回洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットには、プロテインＧセファロースビーズを含むＩＰ（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）産物をサンプルとして使用した。
【０２２９】
ＣＯＬＯ２０５細胞に発現するＣｒ１タグ付きＣＤ４３の可溶性組換えタンパク質の精製： ＣＤ４３タンパク質の細胞外ドメインをコードしているｃＤＮＡを、Ｎ末端にＦｌａｇタグとＣ末端にＣｒ１タグを含む修飾ｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングした。この組換え（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）プラスミドＤＮＡを、安定発現株の樹立のためエレクトロポレーションによりＣＯＬＯ２０５細胞に導入した。ＣＯＬＯ２０５に発現する可溶性組換えｈＣＤ４３^{２０−２５３}は、Ｎ末端に３×ＦｌａｇタグおよびＣ末端Ｃｒ１タグを含む。この可溶性タンパク質をプロテインＡセファロースビーズ（ＧＥヘルスケア，カタログ番号１７−１２７９−０２）で精製した。グリシン緩衝液で溶出しＰＢＳに対して透析した後、このタンパク質サンプルを今後の使用に備えて−２０℃で保存した。
【０２３０】
ＣＤ４３の全細胞可溶化物は、ＣＯＳ細胞に一過性に発現した：全長ヒトＣＤ４３（ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃ−Ｈｉｓ）を含むコンストラクトをリポフェクタミン２０００（インビトロジェン，カタログ番号１１６６８−０１９）によりＣＯＳ細胞に導入した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、０．２５％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０）で溶解し、２１，９００ｇ、４℃で１０分間遠心（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｇ）して上清を回収 した。バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）による定量後、ウエスタンブロット解析のため、タンパク質ライセートを十分な量でＳＤＳ−ＰＡＧＥに流した。
【０２３１】
ウエスタンブロット解析
サンプル緩衝液の添加後、このタンパク質サンプルを９５℃で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルに流してから、ＮＣ（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）紙（ＧＥヘルスケア，Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ，カタログ番号ＲＰＮ３０３Ｄ）にトランスファーした。この膜をＴＢＳに加えた５％脱脂乳でブロックした後、一次抗体を加えた。一次抗体の結合を、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（ＮＥＮライフサイエンス（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ），ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ，カタログ番号ＮＥＦ８２２またはサザンバイオテク，ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇ，カタログ番号１０１０−０５）で検出し、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア，カタログ番号ＲＰＮ２１０６）で展開した。
【０２３２】
結果
図１１Ａに示す実験では、ｒｈＣＥＡを発現しているＣＯＬＯ２０５細胞の細胞可溶化物を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降し（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐａｔｅｄ）、この免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ＮＣ紙にトランスファーした。ＮＣ紙を、抗Ｆｌａｇ、ｍ５Ｆ１、５０−１４、５１−４１、１３８−１０、１８６−１４、２８０−６または抗ＣＥＡ抗体（ＣＥＡ／Ａｂ−３；クローン名ＣＯＬ−１でネオマーカー（ＮｅｏＭａｒｋｅｒ）カタログＭＳ−６１３−Ｐ１ＡＢＸ）などの様々な抗体でブロットした。図１１Ａのデータから、ｍ５Ｆ１、５１−４１および１３８−１０は、ＣＯＬＯ２０５細胞に発現するｒｈＣＥＡを認識することが示された。
【０２３３】
図１１Ｂに示す実験では、ＣＯＳ−７細胞に発現するｒｈＣＥＡの細胞可溶化物を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降し（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐａｔｅｄ）、免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ＮＣ紙にトランスファーした。ＮＣ紙を、抗Ｆｌａｇ、ｍ５Ｆ１または抗ＣＥＡ（ＣＥＡ／Ａｂ−３）などの様々な抗体でブロットした。図１１Ｂのデータから、ｍ５Ｆ１は、ＣＯＳ−７細胞に発現するｒｈＣＥＡに結合しないことが示された。
【０２３４】
図１２Ａに示す実験では、ＣＯＬＯ２０５に発現した可溶性タンパク質をプロテインＡセファロースビーズで精製し、ＳＤＳゲルにかけて、ＮＣ紙にトランスファーした。ＮＣ紙を、ｍ５Ｆ１、５１−４１または１３８−１０などの様々な抗体でブロットした。図１２Ａのデータから、ｍ５Ｆ１、５１−４１および１３８−１０は、ＣＯＬＯ２０５細胞に発現するｒｈＣＤ４３を認識することが示された。
【０２３５】
図１２Ｂに示す実験では、ＣＯＬＯ２０５に発現した可溶性タンパク質をプロテインＡセファロースで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ＮＣ紙にトランスファーした。ＮＣ紙を、抗ＣＤ４３（ＭＥＭ５９）（左パネル）またはｍ５Ｆ１（右パネル）でブロットした。図１２Ｂのデータから、ｍ５Ｆ１は、ＣＯＳ−７細胞に発現するｒｈＣＤ４３を認識しないことが示された。こうしたデータからは、ｍ５Ｆ１が認識するエピトープは、一定の細胞型に特異的な翻訳後修飾を含むことが示唆される。
【０２３６】
（実施例１０）
ｍ５Ｆ１、５１−４１、１３８−１０が認識するエピトープは、Ｌｅｗｉｓ^ａ（Ｌｅ^ａ）構造を含み、フコース依存的である
グリコシダーゼ処理
組換えヒトＣＥＡ（ｒｈＣＥＡ）を、ＣＯＬＯ２０５細胞に発現したヒトＣＥＡタンパク質から作製した。ＣＥＡのアミノ酸３５−１４５（Ｎドメイン）およびアミノ酸３２４−４１５（Ａ２ドメイン）を持つ融合体であるｒｈＣＥＡ（ＣＥＡ−Ｎ−Ａ２）をコードしているｃＤＮＡを、Ｆｌａｇタグを含む修飾ｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングした。ＣＥＡのアミノ酸残基の位置は、プレタンパク質のアミノ酸の位置がベースになる。組換え（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）プラスミドＤＮＡを、安定発現株の構築のためエレクトロポレーションによりＣＯＬＯ２０５細胞に導入した。組換えＣＥＡタンパク質を、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて安定発現株を発現する組換えＣＥＡの細胞培養上清から精製した。
【０２３７】
各反応ごとに、約１．８μｇの組換えタンパク質（ｒｈＣＥＡ）を、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来のα−１→（２，３，４）−フコシダーゼ溶液（シグマ，カタログ番号Ｆ１９２４）と様々な量（０、０．０１、０．０３または０．１ｍＵ）で３７℃にて２０時間インキュベートした。処理後、このタンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、クマーシーブルー染色（図１３左パネル）またはｍ５Ｆ１によるウエスタンブロット検出（図１３右パネル）を行った。
【０２３８】
図１３に示すように、ｒｈＣＥＡに対するｍ５Ｆ１の結合は、この抗原をα−１→（２，３，４）−フコシダーゼで処理すると減少することから、ｍ５Ｆ１は、フコース感受性糖エピトープを認識すると考えられる。
【０２３９】
オリゴ糖競合アッセイ
ｍ５Ｆ１が認識する糖エピトープをさらに検査するため、様々なオリゴ糖との競合アッセイを行った。オリゴ糖（シグマのカタログ番号０３４９９のＬｅｗｉｓ^ａ、シグマのカタログ番号Ｌ７０３３のＬｅｗｉｓ^ｂ−ラクトース、シグマのカタログ番号Ｌ７７７７のＬｅｗｉｓ^ｘ−ラクトース、シグマのカタログ番号Ｌ７７８４のＬｅｗｉｓ^ｙ、シグマのカタログ番号Ｓ１７８２のシアリル−Ｌｅｗｉｓ^ｘ、シグマのカタログ番号Ｌ６７７０のラクト−Ｎ−テトラオース、シグマのカタログ番号Ｌ６６４５のラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩＩ、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）のカタログ番号４３４６２６のＬｅｗｉｓ^ａおよびシグマのカタログ番号Ｌ３７５０のβ−ラクトース）を購入し、ＰＢＳに溶解した。こうしたオリゴ糖の構造を図１４に示す。オリゴ糖（最終濃度１ｍＭ）を、２×１０^５個のＣＯＬＯ２０５細胞を含む異なるウェルに加え、続いて標記の抗体（ｍ５Ｆ１、５１−４１または１３８−１０；それぞれ０．２５ｕｇ／ｍｌ）を添加した。４℃での１時間のインキュベーション後、その上清を捨て、二次抗体（サザンバイオテク，ＲＰＥ−ヤギ抗マウスＩｇＧ，カタログ番号１０３２−０９またはサザンバイオテク，ＲＰＥ−ヤギ抗マウスＩｇＭ，カタログ番号１０２２−０９）を加えた。さらに、フローサイトメトリー解析で細胞結合シグナルを検出した。
【０２４０】
図１５に示すように、ＬＮＤＦＨ ＩＩ、Ｌｅ（ａ）−ラクトースおよびＬｅ（ａ）はすべて、様々なレベルで、ＣＯＬＯ２０５細胞に対する抗体ｍ５Ｆ１、５１−４１および１３８−１０の結合を阻害した。ＬＮＴも、ＣＯＬＯ２０５細胞に対する抗体５１−４１および１３８−１０の結合を阻害したが、ｍ５Ｆ１の結合を大きく阻害することはなかった。このことから、こうした抗体が認識するエピトープは、Ｌｅ^ａ構造またはそれに類する構造を含み、フコース感受性である可能性があることが示唆される。さらに、ｍ５Ｆ１抗体のフコース依存性は、抗体５１−４１および１３８−１０よりも高い。
【０２４１】
前述の発明について理解しやすいように説明および実施例によりある程度詳細に記載してきたが、その説明および実施例を、本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【０２４２】
参考文献
【０２４３】
【化１０】

【０２４４】
【化１１】

【０２４５】
【化１２】

【０２４６】
【化１３】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
非造血系癌細胞に発現するＣＤ４３またはＣＥＡのエピトープには特異的に結合するが、白血球またはＪｕｒｋａｔ細胞に発現するＣＤ４３には特異的に結合せず、かつ、細胞毒コンジュゲーションおよび免疫エフェクター機能の非存在下で、該非造血系癌細胞の細胞表面のエピトープに結合後、該非造血系癌細胞のアポトーシスを誘導することができるモノクローナル抗体であって、エピトープは、炭水化物を含み、該エピトープに対する該抗体の結合は、Ｌｅ^ａ構造、Ｌｅ^ａ−ラクトース構造、ＬＮＤＦＨ ＩＩ構造またはＬＮＴ構造を含む炭水化物により阻害される、モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記エピトープは、フコースを含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記エピトープに対する前記抗体の結合は、Ｌｅ^ａ構造を含む炭水化物により阻害される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記エピトープに対する前記抗体の結合は、Ｌｅ^ａ−ラクトース構造を含む炭水化物により阻害される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記エピトープに対する前記抗体の結合は、ＬＮＤＦＨ ＩＩ構造を含む炭水化物により阻害される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記エピトープに対する前記抗体の結合は、ＬＮＴ構造を含む炭水化物により阻害される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記抗体は、前記非造血系癌細胞に発現する前記ＣＤ４３またはＣＥＡの細胞外ドメインの立体構造エピトープを認識し、該立体構造エピトープは、トリペプチドＮ’−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｃ’により形成される構造と等価な物理的特徴および化学的特徴を持つ構造を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記抗体は、ポリペプチドのＮ末端にＮ’−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｃ’のアミノ酸配列を含む該ポリペプチドに結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記抗体は、前記非造血系癌細胞の細胞表面に存在する前記エピトープへの結合に際して、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
前記抗体は、前記非造血系癌細胞の細胞表面に存在する前記エピトープへの結合に際して、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
前記抗体は、前記非造血系癌細胞の細胞表面に存在する前記エピトープへの結合に際して、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
前記抗体は、ヒト化抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
前記抗体は、キメラ抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
前記抗体は、ヒト抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
前記抗体は、配列番号１のアミノ酸配列由来の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列由来の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
前記抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１７】
前記抗体は、配列番号３のアミノ酸配列由来の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸配列由来の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
前記抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
前記抗体は、配列番号５のアミノ酸配列由来の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域および配列番号６のアミノ酸配列由来の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
前記抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２１】
前記抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２２】
前記非造血系癌細胞は、結腸直腸癌細胞または胃癌細胞である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞。
【請求項２４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体および薬学的に許容されるキャリアを含む、組成物。
【請求項２５】
請求項１に記載のモノクローナル抗体をコードしている核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項１に記載のモノクローナル抗体をコードしている核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２８】
癌を有する個体の非造血系癌を処置するための方法であって、請求項１に記載の１種または複数種のモノクローナル抗体を含む組成物の有効量を該個体に投与することを含み、該１種または複数種の抗体は、該個体において該癌細胞に結合する、方法。
【請求項２９】
前記非造血系癌は、結腸直腸癌または胃癌である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記モノクローナル抗体は、細胞毒にコンジュゲートされている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
個体の非造血系癌を処置するための方法であって、一定量の請求項１に記載の１種または複数種のモノクローナル抗体および一定量の別の抗癌剤を該個体に投与することを含み、該１種または複数種の抗体は、該個体において該癌細胞に結合し、それにより該モノクローナル抗体および該抗癌剤の併用が、該個体において癌の有効な処置を提供する、方法。
【請求項３２】
前記非造血系癌は、結腸直腸癌または胃癌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗癌剤は、化学療法剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物と、非造血系癌を処置するために、該医薬組成物の有効量を個体に投与するための説明書とを含む、キット。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【公表番号】特表２００９−５３９３８０（Ｐ２００９−５３９３８０Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１４４１２（Ｐ２００９−５１４４１２）
【出願日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１３５８７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４６１７２
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０８３５９６１９）
【Ｆターム（参考）】