癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤
【課題】ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）を含有する癌治療に有効な新規な薬剤を提供することにある。
【解決手段】２−０−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−０−ジオレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成される担体とｐｏｌｙ（I)・ｐｏｌｙ（Ｃ）又はミスマッチドｐｏｌｙ（I)・ｐｏｌｙ（Ｃ）との複合体を含有する癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤である。
【解決手段】２−０−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−０−ジオレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成される担体とｐｏｌｙ（I)・ｐｏｌｙ（Ｃ）又はミスマッチドｐｏｌｙ（I)・ｐｏｌｙ（Ｃ）との複合体を含有する癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤に関するものである。ここで「癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤」とは、癌細胞内のヌクレアーゼを活性化して癌細胞にアポトーシスを誘導し癌細胞を死滅させることができる薬剤をいう。また、「Ｉ」とはイノシン酸を、「Ｃ」とはシチジル酸を、「Ａ」とはアデニル酸を、「Ｕ」とはウリジル酸を、それぞれ意味する。
【０００２】
ミスマッチドｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）やミスマッチドｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）とは、当業者に周知の事項であるが、二本鎖を構成する核酸塩基の中に一部相補的でない塩基を含むｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）を意味する。
【背景技術】
【０００３】
ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）は、ポリイノシン酸とポリシチジル酸とからなるポリリボヌクレオチドコポリマーの二本鎖ＲＮＡであり、強力なインターフェロン誘導能と免疫賦活作用を有する薬物として広く知られている。そして、かかるｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）が免疫賦活作用を有することから、免疫反応により間接的に癌細胞の増殖を抑制しうると考えられ、これまで癌治療剤としての可能性が模索されてきた。しかし、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の免疫反応による間接的な作用では癌細胞の増殖を有効に抑えられず、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）は癌治療剤として開発されるまでに至っていない。インターフェロン誘導能や免疫賦活作用に基づくその他の適応症についてもｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）は開発されるに至っていない。
【０００４】
ポリアデニル酸とポリウリジル酸とからなるポリリボヌクレオチドコポリマーであるｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）やミスマッチドｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）、ミスマッチドｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）についても、程度の差はあれｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）と同様な作用を有していると考えられる。
【０００５】
一方、細胞内へ薬物を移入するのに有効な担体としては、例えば、カチオニック・リポソームと一般に呼ばれている、リポフェクチン（登録商標）や下記の構造式［I］に係る２−０−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−０−ジオレオイルグリセロール等のグリセロール誘導体及びリン脂質を必須構成成分として形成される担体が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。
【０００６】
【化１】
上記カチオニック・リポソームは、脂質二分子膜からなる、水溶液中で正電荷を持った小胞体であると考えられる。かかるカチオニック・リポソームは水溶液中で正電荷を帯び、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の二本鎖ＲＮＡは水溶液中で負電荷を帯びることから、カチオニック・リポソームとｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等とは容易に複合体を形成することができる。
【０００７】
しかし、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の二本鎖ＲＮＡ自身やそれらとカチオニック・リポソームとの複合体が癌細胞内のヌクレアーゼを活性化して癌細胞にアポトーンスを誘導し癌細胞を死滅させるかどうかについては、全く知られていなかった。
【特許文献１】国際公開第９１／１７４２４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９４／１９３１４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、癌治療に有効な薬剤を提供することにある。また、本発明の目的は、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の二本鎖ＲＮＡを含有する新規な薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤が癌治療に有効であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
従って、本発明は、癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤に関する。癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤であるかどうかは、例えば後述する試験例２のようなＤＮＡやＲＮＡのフラグメント化を観察する実験等を行うことによって容易に決定することができる。例えば、本発明として、細胞内へ薬物を移入するのに有効な担体とｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）若しくはミスマッチドｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）又はｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）若しくはミスマッチドｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）（以下、これら二本鎖ＲＮＡを総称して「ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等」という）との複合体を含有する癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤やカチオニック・リポソームとｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等との複合体を含有する癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤を挙げることができる。
【００１１】
好ましい本発明の具体例としては、２−０−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−０−ジオレオイルグリセロール（以下「本グリセロール誘導体」という）及びリン脂質を必須構成成分として形成される担体（以下「本担体」という）とｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等との複合体（以下「本複合体」という）を含有する癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤（以下「本活性化剤」という）を挙げることができる。
【００１２】
以下、好ましい本発明の具体例である本活性化剤について詳述する。
本担体は、カチオニック・リポソームの一種と一般に考えることができるが、細胞内へ薬物を移入する機能を有していれば必ずしもカチオニック・リポソームのような形態を有している必要はない。
【００１３】
本発明に係るｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の鎖長は、特に制限されないが、例えばｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の場合には、５０〜２，０００ｂｐ（ｂｐ：ベースペアー、塩基対数）のものが適当であり、１００〜５００ｂｐのものが好ましく、２００〜４００ｂｐのものがより好ましい。５０ｂｐ未満であると有効性に問題が生じるおそれがあり、２，０００ｂｐより長いと安全性に問題が生じるおそれがある。１００〜５００ｂｐの範囲のｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）は、本発明において有効性と安全性とのバランスがとれている鎖長領域であると考えられる。ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等は、通常様々な鎖長からなる一定の分布をもって存在するので、左記のｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の鎖長は、平均分布鎖長を意味する。
本発明に係るリン脂質は、医薬上許容されるリン脂質であれば特に制限されない。具体例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、レシチン等を挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質も挙げることができる。好ましいリン脂質としては、卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、卵黄ホスファチドを挙げることができる。２種以上のリン脂質を用いることもできる。なお、ホスファチジルコリン又はレシチンは、カチオニック・リポソームにおいて一般的に用いられるホスファチジルエタノールアミンと比べて、活性の低下なしに毒性を有意に低下させることができる。
【００１４】
本複合体中の、本担体とｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等との構成比率は、リン脂質の種類やｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の種類、癌の種類等によって異なるが、本担体１０重量部に対して、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等０．０５〜１０重量部が適当であり、０．１〜４重量部が好ましく、０．５〜２重量部がより好ましい。
【００１５】
本担体中の、本グリセロール誘導体とリン脂質との構成比率は、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の種類や使用量やリン脂質の種類等によって異なるが、本グリセロール誘導体１重量部に対して、リン脂質０．１〜１０重量部が適当であり、０．５〜５重量部が好ましく、１〜２重量部がより好ましい。
【００１６】
本活性化剤は、例えば、本複合体が水溶液中に分散している液剤（注射剤、点滴剤等）やその凍結乾燥製剤の形態をとることができる。液剤の場合、本複合体が、０．００１〜２５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内で存在しているものが適当であり、０．０１〜５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内で存在しているものが好ましく、０．１〜１％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内で存在しているものがより好ましい。
【００１７】
本活性化剤は、任意の医薬上許容される添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤を適当量含有していてもよい。具体的には、炭素数６〜２２の脂肪酸（例、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸）やその医薬上許容される塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩）、アルブミン、デキストラン等の乳化補助剤、コレステロール、ホスファチジン酸等の安定化剤、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース等の等張化剤、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン等のｐＨ調整剤などを挙げることができる。
【００１８】
本活性化剤は、例えば、リポソームの一般的な製法と同様にして製造することができる。例えば、まず所定量の本グリセロール誘導体及びリン脂質に、所定量の水（注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等）を加えこれらを攪拌混合し、この混合物を適当な分散機、例えば、ホモミキサー、ホモジナイザー、超音波分散器、超音波ホモジナイザー、高圧乳化分散機、マイクロフルイダイザー（商品名）、ナノマイザー（商品名）、アルティマイザー（商品名）、マントン−ガウリン型高圧ホモジナイザーを用いて分散処理する。そして、その上に所定量のｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等を加え、再度適当な分散機で分散処理して注射剤としての本活性化剤を製造することができる。他の任意の添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。また、初めから本グリセロール誘導体、リン脂質、及びｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の三者の混合物に水を加えて同時に分散処理して本活性化剤を製造することもでき、また、粗分散を経て製造することもできる。
【００１９】
次いで、上記分散処理して得られた本活性化剤を凍結乾燥処理すれば、本活性化剤の凍結乾燥製剤を調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行なうことができる。例えば、上記分散処理して得られた本活性化剤を滅菌後、所定量をバイアル瓶に分注する。約−４０〜−２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥する。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本活性化剤の凍結乾燥製剤を得ることができる。
【００２０】
本活性化剤の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。
【００２１】
本活性化剤は、癌細胞内のヌクレアーゼを活性化して癌細胞にアポトーシスを誘導し癌細胞を死滅させることができ、毒性も低いので、ヒトを含む哺乳動物の癌治療、例えば肝臓癌治療に有用である。特に本担体とｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）との複合体を含有する本活性化剤は、有効性が極めて高い反面、毒性が極めて低いので優れている。
【００２２】
本活性化剤は、癌治療のため静脈内投与、癌内局所投与、経粘膜投与等することができ、肝臓癌治療のため本活性化剤を用いる場合には、静脈内投与、肝動脈内投与、門脈内投与が適当である。
【００２３】
本活性化剤の癌治療のための投与量は、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等やリン脂質の種類、癌の種類、癌の進行状況、年齢、種差、投与経路、投与方法等によって異なるが、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の投与量として、１回当たり通常５０μｇ〜５０ｍｇ／ヒトが適当であり、１００μｇ〜２ｍｇ／ヒトが好ましい。ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の投与量としても、１回当たり通常５０μｇ〜５０ｍｇ／ヒトが適当であり、１００μｇ〜２ｍｇ／ヒトが好ましい。本活性化剤は、１日１〜３回を、連日、隔日、１週毎、２週毎等に１ショット投与や点滴投与等することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、実施例及び試験例を掲げて、本発明を更に詳しく説明する。各実施例及び各試験例において、本活性化剤の濃度は、すべて本活性化剤中の当該ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の濃度で表している。
実施例１
本グリセロール誘導体２ｇと精製卵黄レシチン２ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて５分間分散処理して本担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を更に実験用小型乳化分散機を用いて１時間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２５０ｍＬに５００ｍｇのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）〔平均鎖長は、ほぼ２００ｂｐ〕を含む１５０ｍＬの水溶液を攪拌しながら添加し、更に１時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理し本活性化剤を得た。その後、本活性化剤を１ｍＬづつバイアルに分注し常法に従って凍結乾燥製剤とした。
実施例２
本グリセロール誘導体５０ｇと卵黄ホスファチド３０ｇに１０Ｌの注射用水に溶解したスクロース４ｋｇを加えマントン−ガウリン型高圧ホモジナイザーを用いて１０分間分散処理し、注射用水で２５Ｌに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２０Ｌに１０ｇのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）〔平均鎖長は、ほぼ２００ｂｐ〕を含む１２Ｌの水溶液を攪拌しなから添加し、塩酸を用いてｐＨを５．５に調整し、さらに３０分マントン−ガウリン型高圧ホモジナイザーを用いて分散処理して本活性化剤を得た。その後、本活性化剤を２０ｍＬづつバイアルに分注し常法に従って凍結乾燥製剤とした。当該凍結乾燥製剤に市販の５％ブドウ糖輪液（５００ｍＬ）を加えて溶解した。
実施例３
本グリセロール誘導体２ｇと大豆レシチン２ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したブドウ糖２０ｇを加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて５分間分散処理して本担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を更に実験用小型高圧乳化分散磯を用いて１時間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２５０ｍＬに５０ｍｇのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）〔平均鎖長は、ほぼ２００ｂｐ〕を含む１５０ｍＬの水溶液を攪拌しなから添加し、さらに１時間実験用小型高圧乳化分散機を用いて分散処理して本活性化剤を得た。
実施例４
本グリセロール誘導体１．２ｇと精製卵黄レシチン２．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２５０ｍＬに２００ｍｇのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）〔平均鎖長は、ほぼ２００ｂｐ〕を含む１５０ｍＬの水溶液を攪拌しながら添加し、さらに２時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理して本活性化剤を得た。
実施例５
本グリセロール誘導体１．２ｇと精製卵黄レシチン２．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２５０ｍＬに、平均鎖長が３６０ベースのｐｏｌｙ（Ｉ）１００ｍｇと３１８ベースのｐｏｌｙ（Ｃ）１００ｍｇを含む１５０ｍＬの水溶液を攪拌しながら添加し、さらに２時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理して本活性化剤を得た。
実施例６
本グリセロール誘導体２ｇと精製卵黄レシチン２ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて５分間分散処理して本担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を更に実験用小型乳化分散機を用いて１時間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２５０ｍＬに、平均鎖長が１４１９ベースのｐｏｌｙ（Ｉ）２５０ｍｇと１４９１ベースのｐｏｌｙ（Ｃ）２５０ｍｇを含む１５０ｍＬの水溶液を攪拌しなから添加し、更に１時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理し本活性化剤を得た。その後、本活性化剤を１ｍＬづつバイアルに分注し常法に従って凍結乾燥製剤とした。
実施例７
本グリセロール誘導体１．２ｇと精製卵黄レシチン２．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２５０ｍＬに、平均鎖長が８４ベースのｐｏｌｙ（Ｉ）１００ｍｇと７６ベースのｐｏｌｙ（Ｃ）１００ｍｇを含む１５０ｍＬの水溶液を攪拌しながら添加し、さらに２時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理して本活性化剤を得た。
実施例８
実施例４と同様にして、平均鎖長がほぼ３５０ｂｐのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）を含む本活性化剤を得た。
実施例９
実施例４と同様にして、平均鎖長がほぼ１４５０ｂｐのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）を含む本活性化剤を得た。
実施例１０
実施例４と同様にして、平均鎖長がほぼ８０ｂｐのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）を含む本活性化剤を得た。
試験例１ 各種細胞株に対する増殖抑制効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
各々の細胞を９６穴のプレートに１０４細胞／穴の密度でまき、翌日実施例４に係る本活性化剤又はアドリアマイシンを添加して培養を続けた。３日後に生細胞数をＭＴＴ法で測定した。その結果を表１及び表２に示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
【表２】
表１及び表２から明らかなように、数多くの上皮系及び繊維芽細胞由来の癌細胞株に対し、０．０１〜５００ｎｇ／ｍＬの濃度で強い増殖抑制作用が見られた。核酸合成阻害により抗癌作用を示すアドリアマイシンと比較しても遜色のない強さであった。どの臓器の癌細胞に対しても効果があり、臓器特異性は見られなかった。一方、非癌細胞である肝臓由来株化細胞４株及び株化繊維芽細胞７株に対して本活性化剤は１０００ｎｇ／ｍＬの濃度でも増殖抑制作用を示さなかった。なお、このｉｎ ｖｉｔｒｏ癌細胞増殖抑制効果は、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）単独添加及び本担体単独では全く見られず、また単に細胞内へｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）が移入されただけでは想像のつかなかった現象である。
試験例２ アポトーシス現象の観察
（１）ＤＮＡ及びＲＮＡフラグメンテーション
1)ＤＮＡフラグメンテーション
Ａ４３１細胞及びＫＭ１２−ＨＸ細胞の各々にｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の濃度として１μｇ／ｍＬの実施例４に係る本活性化剤を添加し、Ａ４３１細胞については５時間後に、ＫＭ１２−ＨＸ細胞については７．５時間後に細胞を回収した。５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・１０ｍＭ ＥＤＴＡ・０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で細胞を溶解した後、１３０００×ｇで２０分間遠心してフラグメント化したＤＮＡ（上清）とクロマチン画分（沈殿）を分離した。上清に１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａを加え３７℃で１時間作用させた後、２００μｇ／ｍＬ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ及び１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）を５０℃で１．５時間反応させた。さらにフェノール／クロロホルムによりフラグメント化ＤＮＡを抽出し、１．８％アガロースゲルで電気泳動した。その結果、いずれの細胞においてもＤＮＡフラグメンテーションが観察された。
【００２７】
また、Ａ４３１細胞についてその時間経過を調べた。Ａ４３１細胞を６穴プレートに２．８×１０５細胞／穴の密度でまき、翌日２μＣｉ〔３Ｈ〕Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを加え細胞のＤＮＡをラベルした。その後実施例４に係る本活性化剤（１μｇ／ｍＬ）を添加し、各時間で細胞を集めた。５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・１０ｍＭ ＥＤＴＡ・０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で細胞を溶解した後、１３０００×ｇで２０分間遠心してフラグメント化したＤＮＡ（上清）とクロマチン画分（沈殿）を分離した。上清及び沈殿の放射活性量からフラグメント化ＤＮＡの全ＤＮＡに対する割合を算出した。その結果を図１に示す。
【００２８】
添加後３時間で全ＤＮＡの約３０％、５時間で５５％以上のフラグメント化が起こっており、この分解が本活性化剤が細胞に入ってから直ぐに起こる現象であることがわかった。
2)ＲＮＡフラグメンテーション
【００２９】
Ａ４３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ＫＢ細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、及びＭＣＦ−７細胞の各々にｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の濃度として１μｇ／ｍＬの実施例４に係る本活性化剤を添加し、４時間後に細胞を回収した。各細胞からリボソーム画分を分画し、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ−Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法により総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡをホルムアルデヒド変性ゲル（１．８％アガロースゲル）で電気泳動後、エチジウムブロマイド染色した。その結果、いずれの細胞においても２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡのフラグメンテーションが観察された。
（２）ヌクレアーゼ阻害剤の影響
ＨｅＬａＳ３細胞を９６穴プレートに１０４細胞／穴の密度でまき、翌日ヌクレアーゼ阻害剤ＡＴＡ（ａｕｒｉｎｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）１０μＭと実施例４に係る本活性化剤とを同時に添加した。さらに３日間培養を続け、生細胞数をＭＴＴ法で測定した。その結果を図２に示す。
【００３０】
図２から明らかなように、ＡＴＡを加え細胞内ヌクレアーゼの働きを止めておくと本活性化剤の癌細胞増殖抑制作用は見られなかった。そして、添加したＡＴＡを８時間後に培地から取り除き、その後本活性化剤を添加しても本活性化剤の作用はないことから、このＡＴＡの効果は、本活性化剤の細胞内への取り込みを抑えるものではなく、ヌクレアーゼ阻害剤として働いた結果のものと考えられる。
（３）以上の試験結果から、本活性化剤は細胞内のヌクレアーゼを活性化することがわかり、それにより癌細胞内にアポトーシスをもたらすことがわかった。
試験例３ マウス転移性肝臓癌モデルでの効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）
ヌードマウスＢａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ（５週齢、雄）の脾臓にＫＭ１２−ＨＸ（ヒト大腸癌細胞であり、ヌードマウスの脾臓に移植すると効率的に肝臓に転移して肝臓癌病変を形成する株）を１０６細胞／マウスで注射し、１０分後に脾臓を摘出した。３日後から実施例４に係る本活性化剤をほぼ等間隔で週２回、５週間静脈内投与した。最終投与２日後に肝臓を摘出し、肝臓に形成された癌結節数及び面積を測定した。その結果を表３に示す。
【表３】
３０μｇ／ｋｇ投与群では、コントロール群（１０％マルトース投与）に比較して７２％、１００μｇ／ｋｇ投与群では９１％の肝臓癌細胞の増殖抑制効果が見られた。また、１００μｇ／ｋｇ投与に関しては週１回投与でも７７％の肝臓癌細胞の増殖抑制効果が見られた。
【００３１】
また、各々の肝臓組織の標本を作製し、病理学的解析を行ったところ、コントロール群の肝臓に形成された癌は上皮性低分化型腺癌であった。腫瘍血管は普通程度に発達していた。特に免疫担当細胞の浸潤は見られなかった。また、この癌組織では所々に石灰化を伴っていた。本活性化剤投与群では明らかな癌細胞は見当たらず、薬物投与による癌治癒後に残存した石灰化のみが見られた。
【００３２】
このように本活性化剤は、肝癌モデル動物において１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ・週２回の連続静脈投与で有意な効果があった。
試験例４ 毒性試験
（１）ラット単回投与による肝毒性の発現（急性毒性試験）
６週齢ＳＤ雄性ラット８匹について実施例４に係る本活性化剤の単回静脈内投与を行い、２０時間後の血清アミノアシルトランスフェラーゼ活性を測定した。その結果、５ｍｇ／ｋｇまで死亡例は見られず、５ｍｇ／ｋｇで軽度の血清アミノアシルトランスフェラーゼの上昇が見られた程度であった。１ｍｇ／ｋｇでは血清アミノアシルトランスフェラーゼの上昇はほとんどなかった。
（２）ラット２週間限定亜急性毒性試験
実施例４に係る本活性化剤について、ＳＤ雄性ラット６匹（６週齢）に１４日間連日静脈内投与したところ、１ｍｇ／ｋｇ以下では特に問題となる毒性は見られなかった。
（３）抗原性試験
実施例４に係る本活性化剤について、雄性モルモット（ｈａｒｔｌｅｙ，５週齢）を用い抗原性試験を実施したところ、５０μｇ／モルモットで抗原性は認められなかった。
（４）簡易変異原性試験
実施例４に係る本活性化剤について、簡易復帰突然変異試験および簡易染色体異常試験を実施したところ、１０μｇ／ｍＬで変異原性は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＤＮＡフラグメンテーションの割合を示す。縦軸はＤＮＡフラグメンテーションの割合（％）を、横軸は時間（時間）をそれぞれ表す。
【図２】ＡＴＡ添加によるヌクレアーゼ阻害剤の影響を示す。縦軸は阻害率（％）を、横軸は実施例４に係る本活性化剤の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表す。−○−は、ＡＴＡを添加しない系での結果を、−●−は、ＡＴＡを添加した系での結果を、それぞれ表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤に関するものである。ここで「癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤」とは、癌細胞内のヌクレアーゼを活性化して癌細胞にアポトーシスを誘導し癌細胞を死滅させることができる薬剤をいう。また、「Ｉ」とはイノシン酸を、「Ｃ」とはシチジル酸を、「Ａ」とはアデニル酸を、「Ｕ」とはウリジル酸を、それぞれ意味する。
【０００２】
ミスマッチドｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）やミスマッチドｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）とは、当業者に周知の事項であるが、二本鎖を構成する核酸塩基の中に一部相補的でない塩基を含むｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）を意味する。
【背景技術】
【０００３】
ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）は、ポリイノシン酸とポリシチジル酸とからなるポリリボヌクレオチドコポリマーの二本鎖ＲＮＡであり、強力なインターフェロン誘導能と免疫賦活作用を有する薬物として広く知られている。そして、かかるｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）が免疫賦活作用を有することから、免疫反応により間接的に癌細胞の増殖を抑制しうると考えられ、これまで癌治療剤としての可能性が模索されてきた。しかし、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の免疫反応による間接的な作用では癌細胞の増殖を有効に抑えられず、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）は癌治療剤として開発されるまでに至っていない。インターフェロン誘導能や免疫賦活作用に基づくその他の適応症についてもｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）は開発されるに至っていない。
【０００４】
ポリアデニル酸とポリウリジル酸とからなるポリリボヌクレオチドコポリマーであるｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）やミスマッチドｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）、ミスマッチドｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）についても、程度の差はあれｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）と同様な作用を有していると考えられる。
【０００５】
一方、細胞内へ薬物を移入するのに有効な担体としては、例えば、カチオニック・リポソームと一般に呼ばれている、リポフェクチン（登録商標）や下記の構造式［I］に係る２−０−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−０−ジオレオイルグリセロール等のグリセロール誘導体及びリン脂質を必須構成成分として形成される担体が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。
【０００６】
【化１】
上記カチオニック・リポソームは、脂質二分子膜からなる、水溶液中で正電荷を持った小胞体であると考えられる。かかるカチオニック・リポソームは水溶液中で正電荷を帯び、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の二本鎖ＲＮＡは水溶液中で負電荷を帯びることから、カチオニック・リポソームとｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等とは容易に複合体を形成することができる。
【０００７】
しかし、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の二本鎖ＲＮＡ自身やそれらとカチオニック・リポソームとの複合体が癌細胞内のヌクレアーゼを活性化して癌細胞にアポトーンスを誘導し癌細胞を死滅させるかどうかについては、全く知られていなかった。
【特許文献１】国際公開第９１／１７４２４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９４／１９３１４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、癌治療に有効な薬剤を提供することにある。また、本発明の目的は、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の二本鎖ＲＮＡを含有する新規な薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤が癌治療に有効であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
従って、本発明は、癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤に関する。癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤であるかどうかは、例えば後述する試験例２のようなＤＮＡやＲＮＡのフラグメント化を観察する実験等を行うことによって容易に決定することができる。例えば、本発明として、細胞内へ薬物を移入するのに有効な担体とｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）若しくはミスマッチドｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）又はｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）若しくはミスマッチドｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）（以下、これら二本鎖ＲＮＡを総称して「ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等」という）との複合体を含有する癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤やカチオニック・リポソームとｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等との複合体を含有する癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤を挙げることができる。
【００１１】
好ましい本発明の具体例としては、２−０−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−０−ジオレオイルグリセロール（以下「本グリセロール誘導体」という）及びリン脂質を必須構成成分として形成される担体（以下「本担体」という）とｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等との複合体（以下「本複合体」という）を含有する癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤（以下「本活性化剤」という）を挙げることができる。
【００１２】
以下、好ましい本発明の具体例である本活性化剤について詳述する。
本担体は、カチオニック・リポソームの一種と一般に考えることができるが、細胞内へ薬物を移入する機能を有していれば必ずしもカチオニック・リポソームのような形態を有している必要はない。
【００１３】
本発明に係るｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の鎖長は、特に制限されないが、例えばｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の場合には、５０〜２，０００ｂｐ（ｂｐ：ベースペアー、塩基対数）のものが適当であり、１００〜５００ｂｐのものが好ましく、２００〜４００ｂｐのものがより好ましい。５０ｂｐ未満であると有効性に問題が生じるおそれがあり、２，０００ｂｐより長いと安全性に問題が生じるおそれがある。１００〜５００ｂｐの範囲のｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）は、本発明において有効性と安全性とのバランスがとれている鎖長領域であると考えられる。ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等は、通常様々な鎖長からなる一定の分布をもって存在するので、左記のｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の鎖長は、平均分布鎖長を意味する。
本発明に係るリン脂質は、医薬上許容されるリン脂質であれば特に制限されない。具体例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、レシチン等を挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質も挙げることができる。好ましいリン脂質としては、卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、卵黄ホスファチドを挙げることができる。２種以上のリン脂質を用いることもできる。なお、ホスファチジルコリン又はレシチンは、カチオニック・リポソームにおいて一般的に用いられるホスファチジルエタノールアミンと比べて、活性の低下なしに毒性を有意に低下させることができる。
【００１４】
本複合体中の、本担体とｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等との構成比率は、リン脂質の種類やｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の種類、癌の種類等によって異なるが、本担体１０重量部に対して、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等０．０５〜１０重量部が適当であり、０．１〜４重量部が好ましく、０．５〜２重量部がより好ましい。
【００１５】
本担体中の、本グリセロール誘導体とリン脂質との構成比率は、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の種類や使用量やリン脂質の種類等によって異なるが、本グリセロール誘導体１重量部に対して、リン脂質０．１〜１０重量部が適当であり、０．５〜５重量部が好ましく、１〜２重量部がより好ましい。
【００１６】
本活性化剤は、例えば、本複合体が水溶液中に分散している液剤（注射剤、点滴剤等）やその凍結乾燥製剤の形態をとることができる。液剤の場合、本複合体が、０．００１〜２５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内で存在しているものが適当であり、０．０１〜５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内で存在しているものが好ましく、０．１〜１％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内で存在しているものがより好ましい。
【００１７】
本活性化剤は、任意の医薬上許容される添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤を適当量含有していてもよい。具体的には、炭素数６〜２２の脂肪酸（例、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸）やその医薬上許容される塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩）、アルブミン、デキストラン等の乳化補助剤、コレステロール、ホスファチジン酸等の安定化剤、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース等の等張化剤、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン等のｐＨ調整剤などを挙げることができる。
【００１８】
本活性化剤は、例えば、リポソームの一般的な製法と同様にして製造することができる。例えば、まず所定量の本グリセロール誘導体及びリン脂質に、所定量の水（注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等）を加えこれらを攪拌混合し、この混合物を適当な分散機、例えば、ホモミキサー、ホモジナイザー、超音波分散器、超音波ホモジナイザー、高圧乳化分散機、マイクロフルイダイザー（商品名）、ナノマイザー（商品名）、アルティマイザー（商品名）、マントン−ガウリン型高圧ホモジナイザーを用いて分散処理する。そして、その上に所定量のｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等を加え、再度適当な分散機で分散処理して注射剤としての本活性化剤を製造することができる。他の任意の添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。また、初めから本グリセロール誘導体、リン脂質、及びｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の三者の混合物に水を加えて同時に分散処理して本活性化剤を製造することもでき、また、粗分散を経て製造することもできる。
【００１９】
次いで、上記分散処理して得られた本活性化剤を凍結乾燥処理すれば、本活性化剤の凍結乾燥製剤を調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行なうことができる。例えば、上記分散処理して得られた本活性化剤を滅菌後、所定量をバイアル瓶に分注する。約−４０〜−２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥する。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本活性化剤の凍結乾燥製剤を得ることができる。
【００２０】
本活性化剤の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。
【００２１】
本活性化剤は、癌細胞内のヌクレアーゼを活性化して癌細胞にアポトーシスを誘導し癌細胞を死滅させることができ、毒性も低いので、ヒトを含む哺乳動物の癌治療、例えば肝臓癌治療に有用である。特に本担体とｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）との複合体を含有する本活性化剤は、有効性が極めて高い反面、毒性が極めて低いので優れている。
【００２２】
本活性化剤は、癌治療のため静脈内投与、癌内局所投与、経粘膜投与等することができ、肝臓癌治療のため本活性化剤を用いる場合には、静脈内投与、肝動脈内投与、門脈内投与が適当である。
【００２３】
本活性化剤の癌治療のための投与量は、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等やリン脂質の種類、癌の種類、癌の進行状況、年齢、種差、投与経路、投与方法等によって異なるが、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）等の投与量として、１回当たり通常５０μｇ〜５０ｍｇ／ヒトが適当であり、１００μｇ〜２ｍｇ／ヒトが好ましい。ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の投与量としても、１回当たり通常５０μｇ〜５０ｍｇ／ヒトが適当であり、１００μｇ〜２ｍｇ／ヒトが好ましい。本活性化剤は、１日１〜３回を、連日、隔日、１週毎、２週毎等に１ショット投与や点滴投与等することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、実施例及び試験例を掲げて、本発明を更に詳しく説明する。各実施例及び各試験例において、本活性化剤の濃度は、すべて本活性化剤中の当該ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の濃度で表している。
実施例１
本グリセロール誘導体２ｇと精製卵黄レシチン２ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて５分間分散処理して本担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を更に実験用小型乳化分散機を用いて１時間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２５０ｍＬに５００ｍｇのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）〔平均鎖長は、ほぼ２００ｂｐ〕を含む１５０ｍＬの水溶液を攪拌しながら添加し、更に１時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理し本活性化剤を得た。その後、本活性化剤を１ｍＬづつバイアルに分注し常法に従って凍結乾燥製剤とした。
実施例２
本グリセロール誘導体５０ｇと卵黄ホスファチド３０ｇに１０Ｌの注射用水に溶解したスクロース４ｋｇを加えマントン−ガウリン型高圧ホモジナイザーを用いて１０分間分散処理し、注射用水で２５Ｌに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２０Ｌに１０ｇのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）〔平均鎖長は、ほぼ２００ｂｐ〕を含む１２Ｌの水溶液を攪拌しなから添加し、塩酸を用いてｐＨを５．５に調整し、さらに３０分マントン−ガウリン型高圧ホモジナイザーを用いて分散処理して本活性化剤を得た。その後、本活性化剤を２０ｍＬづつバイアルに分注し常法に従って凍結乾燥製剤とした。当該凍結乾燥製剤に市販の５％ブドウ糖輪液（５００ｍＬ）を加えて溶解した。
実施例３
本グリセロール誘導体２ｇと大豆レシチン２ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したブドウ糖２０ｇを加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて５分間分散処理して本担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を更に実験用小型高圧乳化分散磯を用いて１時間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２５０ｍＬに５０ｍｇのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）〔平均鎖長は、ほぼ２００ｂｐ〕を含む１５０ｍＬの水溶液を攪拌しなから添加し、さらに１時間実験用小型高圧乳化分散機を用いて分散処理して本活性化剤を得た。
実施例４
本グリセロール誘導体１．２ｇと精製卵黄レシチン２．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２５０ｍＬに２００ｍｇのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）〔平均鎖長は、ほぼ２００ｂｐ〕を含む１５０ｍＬの水溶液を攪拌しながら添加し、さらに２時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理して本活性化剤を得た。
実施例５
本グリセロール誘導体１．２ｇと精製卵黄レシチン２．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２５０ｍＬに、平均鎖長が３６０ベースのｐｏｌｙ（Ｉ）１００ｍｇと３１８ベースのｐｏｌｙ（Ｃ）１００ｍｇを含む１５０ｍＬの水溶液を攪拌しながら添加し、さらに２時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理して本活性化剤を得た。
実施例６
本グリセロール誘導体２ｇと精製卵黄レシチン２ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて５分間分散処理して本担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を更に実験用小型乳化分散機を用いて１時間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２５０ｍＬに、平均鎖長が１４１９ベースのｐｏｌｙ（Ｉ）２５０ｍｇと１４９１ベースのｐｏｌｙ（Ｃ）２５０ｍｇを含む１５０ｍＬの水溶液を攪拌しなから添加し、更に１時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理し本活性化剤を得た。その後、本活性化剤を１ｍＬづつバイアルに分注し常法に従って凍結乾燥製剤とした。
実施例７
本グリセロール誘導体１．２ｇと精製卵黄レシチン２．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容して本担体分散液を回収した。本担体分散液２５０ｍＬに、平均鎖長が８４ベースのｐｏｌｙ（Ｉ）１００ｍｇと７６ベースのｐｏｌｙ（Ｃ）１００ｍｇを含む１５０ｍＬの水溶液を攪拌しながら添加し、さらに２時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理して本活性化剤を得た。
実施例８
実施例４と同様にして、平均鎖長がほぼ３５０ｂｐのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）を含む本活性化剤を得た。
実施例９
実施例４と同様にして、平均鎖長がほぼ１４５０ｂｐのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）を含む本活性化剤を得た。
実施例１０
実施例４と同様にして、平均鎖長がほぼ８０ｂｐのｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）を含む本活性化剤を得た。
試験例１ 各種細胞株に対する増殖抑制効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
各々の細胞を９６穴のプレートに１０４細胞／穴の密度でまき、翌日実施例４に係る本活性化剤又はアドリアマイシンを添加して培養を続けた。３日後に生細胞数をＭＴＴ法で測定した。その結果を表１及び表２に示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
【表２】
表１及び表２から明らかなように、数多くの上皮系及び繊維芽細胞由来の癌細胞株に対し、０．０１〜５００ｎｇ／ｍＬの濃度で強い増殖抑制作用が見られた。核酸合成阻害により抗癌作用を示すアドリアマイシンと比較しても遜色のない強さであった。どの臓器の癌細胞に対しても効果があり、臓器特異性は見られなかった。一方、非癌細胞である肝臓由来株化細胞４株及び株化繊維芽細胞７株に対して本活性化剤は１０００ｎｇ／ｍＬの濃度でも増殖抑制作用を示さなかった。なお、このｉｎ ｖｉｔｒｏ癌細胞増殖抑制効果は、ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）単独添加及び本担体単独では全く見られず、また単に細胞内へｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）が移入されただけでは想像のつかなかった現象である。
試験例２ アポトーシス現象の観察
（１）ＤＮＡ及びＲＮＡフラグメンテーション
1)ＤＮＡフラグメンテーション
Ａ４３１細胞及びＫＭ１２−ＨＸ細胞の各々にｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の濃度として１μｇ／ｍＬの実施例４に係る本活性化剤を添加し、Ａ４３１細胞については５時間後に、ＫＭ１２−ＨＸ細胞については７．５時間後に細胞を回収した。５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・１０ｍＭ ＥＤＴＡ・０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で細胞を溶解した後、１３０００×ｇで２０分間遠心してフラグメント化したＤＮＡ（上清）とクロマチン画分（沈殿）を分離した。上清に１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａを加え３７℃で１時間作用させた後、２００μｇ／ｍＬ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ及び１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）を５０℃で１．５時間反応させた。さらにフェノール／クロロホルムによりフラグメント化ＤＮＡを抽出し、１．８％アガロースゲルで電気泳動した。その結果、いずれの細胞においてもＤＮＡフラグメンテーションが観察された。
【００２７】
また、Ａ４３１細胞についてその時間経過を調べた。Ａ４３１細胞を６穴プレートに２．８×１０５細胞／穴の密度でまき、翌日２μＣｉ〔３Ｈ〕Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを加え細胞のＤＮＡをラベルした。その後実施例４に係る本活性化剤（１μｇ／ｍＬ）を添加し、各時間で細胞を集めた。５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・１０ｍＭ ＥＤＴＡ・０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で細胞を溶解した後、１３０００×ｇで２０分間遠心してフラグメント化したＤＮＡ（上清）とクロマチン画分（沈殿）を分離した。上清及び沈殿の放射活性量からフラグメント化ＤＮＡの全ＤＮＡに対する割合を算出した。その結果を図１に示す。
【００２８】
添加後３時間で全ＤＮＡの約３０％、５時間で５５％以上のフラグメント化が起こっており、この分解が本活性化剤が細胞に入ってから直ぐに起こる現象であることがわかった。
2)ＲＮＡフラグメンテーション
【００２９】
Ａ４３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ＫＢ細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、及びＭＣＦ−７細胞の各々にｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の濃度として１μｇ／ｍＬの実施例４に係る本活性化剤を添加し、４時間後に細胞を回収した。各細胞からリボソーム画分を分画し、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ−Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法により総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡをホルムアルデヒド変性ゲル（１．８％アガロースゲル）で電気泳動後、エチジウムブロマイド染色した。その結果、いずれの細胞においても２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡのフラグメンテーションが観察された。
（２）ヌクレアーゼ阻害剤の影響
ＨｅＬａＳ３細胞を９６穴プレートに１０４細胞／穴の密度でまき、翌日ヌクレアーゼ阻害剤ＡＴＡ（ａｕｒｉｎｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）１０μＭと実施例４に係る本活性化剤とを同時に添加した。さらに３日間培養を続け、生細胞数をＭＴＴ法で測定した。その結果を図２に示す。
【００３０】
図２から明らかなように、ＡＴＡを加え細胞内ヌクレアーゼの働きを止めておくと本活性化剤の癌細胞増殖抑制作用は見られなかった。そして、添加したＡＴＡを８時間後に培地から取り除き、その後本活性化剤を添加しても本活性化剤の作用はないことから、このＡＴＡの効果は、本活性化剤の細胞内への取り込みを抑えるものではなく、ヌクレアーゼ阻害剤として働いた結果のものと考えられる。
（３）以上の試験結果から、本活性化剤は細胞内のヌクレアーゼを活性化することがわかり、それにより癌細胞内にアポトーシスをもたらすことがわかった。
試験例３ マウス転移性肝臓癌モデルでの効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）
ヌードマウスＢａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ（５週齢、雄）の脾臓にＫＭ１２−ＨＸ（ヒト大腸癌細胞であり、ヌードマウスの脾臓に移植すると効率的に肝臓に転移して肝臓癌病変を形成する株）を１０６細胞／マウスで注射し、１０分後に脾臓を摘出した。３日後から実施例４に係る本活性化剤をほぼ等間隔で週２回、５週間静脈内投与した。最終投与２日後に肝臓を摘出し、肝臓に形成された癌結節数及び面積を測定した。その結果を表３に示す。
【表３】
３０μｇ／ｋｇ投与群では、コントロール群（１０％マルトース投与）に比較して７２％、１００μｇ／ｋｇ投与群では９１％の肝臓癌細胞の増殖抑制効果が見られた。また、１００μｇ／ｋｇ投与に関しては週１回投与でも７７％の肝臓癌細胞の増殖抑制効果が見られた。
【００３１】
また、各々の肝臓組織の標本を作製し、病理学的解析を行ったところ、コントロール群の肝臓に形成された癌は上皮性低分化型腺癌であった。腫瘍血管は普通程度に発達していた。特に免疫担当細胞の浸潤は見られなかった。また、この癌組織では所々に石灰化を伴っていた。本活性化剤投与群では明らかな癌細胞は見当たらず、薬物投与による癌治癒後に残存した石灰化のみが見られた。
【００３２】
このように本活性化剤は、肝癌モデル動物において１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ・週２回の連続静脈投与で有意な効果があった。
試験例４ 毒性試験
（１）ラット単回投与による肝毒性の発現（急性毒性試験）
６週齢ＳＤ雄性ラット８匹について実施例４に係る本活性化剤の単回静脈内投与を行い、２０時間後の血清アミノアシルトランスフェラーゼ活性を測定した。その結果、５ｍｇ／ｋｇまで死亡例は見られず、５ｍｇ／ｋｇで軽度の血清アミノアシルトランスフェラーゼの上昇が見られた程度であった。１ｍｇ／ｋｇでは血清アミノアシルトランスフェラーゼの上昇はほとんどなかった。
（２）ラット２週間限定亜急性毒性試験
実施例４に係る本活性化剤について、ＳＤ雄性ラット６匹（６週齢）に１４日間連日静脈内投与したところ、１ｍｇ／ｋｇ以下では特に問題となる毒性は見られなかった。
（３）抗原性試験
実施例４に係る本活性化剤について、雄性モルモット（ｈａｒｔｌｅｙ，５週齢）を用い抗原性試験を実施したところ、５０μｇ／モルモットで抗原性は認められなかった。
（４）簡易変異原性試験
実施例４に係る本活性化剤について、簡易復帰突然変異試験および簡易染色体異常試験を実施したところ、１０μｇ／ｍＬで変異原性は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＤＮＡフラグメンテーションの割合を示す。縦軸はＤＮＡフラグメンテーションの割合（％）を、横軸は時間（時間）をそれぞれ表す。
【図２】ＡＴＡ添加によるヌクレアーゼ阻害剤の影響を示す。縦軸は阻害率（％）を、横軸は実施例４に係る本活性化剤の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表す。−○−は、ＡＴＡを添加しない系での結果を、−●−は、ＡＴＡを添加した系での結果を、それぞれ表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−O−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−O−ジオレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成される担体とｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）又はｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）との複合体を含有する癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤。
【請求項２】
リン脂質がレシチンである請求項１記載の癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤。
【請求項３】
ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）又はｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）の平均鎖長が１００〜５００ｂｐの範囲内である請求項１又は２記載の癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤。
【請求項４】
癌が肝臓癌である請求項１〜３のいずれかに記載の癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤を含有することを特徴とする癌治療剤。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−O−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−O−ジオレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成される担体とｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）またはｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）との複合体。
【請求項２】
リン脂質がレシチンである請求項１記載の複合体。
【請求項３】
Ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の平均鎖長が１００〜５００ｂｐの範囲内である請求項1又は２記載の複合体。
【請求項４】
請求項１〜３記載の複合体を含有する組成物。
【請求項１】
２−O−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−O−ジオレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成される担体とｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）又はｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）との複合体を含有する癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤。
【請求項２】
リン脂質がレシチンである請求項１記載の癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤。
【請求項３】
ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）又はｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）の平均鎖長が１００〜５００ｂｐの範囲内である請求項１又は２記載の癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤。
【請求項４】
癌が肝臓癌である請求項１〜３のいずれかに記載の癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤を含有することを特徴とする癌治療剤。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−O−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−O−ジオレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成される担体とｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）またはｐｏｌｙ（Ａ）・ｐｏｌｙ（Ｕ）との複合体。
【請求項２】
リン脂質がレシチンである請求項１記載の複合体。
【請求項３】
Ｐｏｌｙ（Ｉ）・ｐｏｌｙ（Ｃ）の平均鎖長が１００〜５００ｂｐの範囲内である請求項1又は２記載の複合体。
【請求項４】
請求項１〜３記載の複合体を含有する組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−２０６６０７（Ｐ２００６−２０６６０７Ａ）
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１１９６７２（Ｐ２００６−１１９６７２）
【出願日】平成１８年４月２４日（２００６．４．２４）
【分割の表示】特願２０００−５１６６８０（Ｐ２０００−５１６６８０）の分割
【原出願日】平成１０年１０月１５日（１９９８．１０．１５）
【出願人】（０００００４１５６）日本新薬株式会社 (46)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２４日（２００６．４．２４）
【分割の表示】特願２０００−５１６６８０（Ｐ２０００−５１６６８０）の分割
【原出願日】平成１０年１０月１５日（１９９８．１０．１５）
【出願人】（０００００４１５６）日本新薬株式会社 (46)
【Ｆターム（参考）】
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