癌診断方法および癌診断キット
【課題】消化器癌の検査、診断あるいは治療に有用なＣＴ抗原を見出し、当該ＣＴ抗原を癌マーカーとする新規な癌診断方法および癌診断キットを提供する
【解決手段】精巣特異的タンパク質として知られているＧＫＡＰ１（Ｇ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）は、胃癌組織で発現し、胃癌患者の血清中に抗体が存在するＣＴ抗原であることを見出した。血清中の抗ＧＫＡＰ１抗体の存在、癌組織におけるＧＫＡＰ１の発現を正常レベルと比較することにより、胃癌の診断が可能となる。
【解決手段】精巣特異的タンパク質として知られているＧＫＡＰ１（Ｇ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）は、胃癌組織で発現し、胃癌患者の血清中に抗体が存在するＣＴ抗原であることを見出した。血清中の抗ＧＫＡＰ１抗体の存在、癌組織におけるＧＫＡＰ１の発現を正常レベルと比較することにより、胃癌の診断が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な癌診断方法および癌診断キットに関するものであり、より詳細には、Ｇ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １（以下「ＧＫＡＰ１」と記す）の発現または抗ＧＫＡＰ１抗体の存在を指標とする癌診断方法および癌診断キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
消化器癌、特に胃癌、大腸癌には、検査、診断あるいは治療に有用な癌抗原が少ない。それゆえ、消化器癌の検査、診断あるいは治療に有用な癌抗原を見出し、これをマーカーとして診断等に適用することは極めて重要である。
【０００３】
癌抗原のなかで、癌・精巣抗原（Ｃａｎｃｅｒ−Ｔｅｓｔｉｓ抗原、以下「ＣＴ抗原」と記す）は、各種の癌組織、および正常組織のうち精巣と一部卵巣・胎盤組織で発現が認められる抗原群である。現在多くのＣＴ抗原が同定、報告されており、その数は確定していないが、約３８個のＣＴ抗原が知られている。しかしながら、これらのＣＴ抗原のすべてが癌患者に対して免疫原性が強いわけではなく、癌の診断、検査のマーカー、あるいは癌治療に有望なＣＴ抗原は限られている。
【０００４】
現在報告されている代表的なＣＴ抗原として、ＭＡＧＥ（非特許文献１参照）、ＳＳＸ（非特許文献２参照）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（非特許文献３参照）を挙げることができる。
【０００５】
ＭＡＧＥとＮＹ−ＥＳＯ−１については欧米を中心に臨床応用され、一定の効果が得られた例もある（例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１の臨床応用については非特許文献４参照）。
【０００６】
しかしながら、過去に報告されているＣＴ抗原は胃癌や大腸癌などの消化器癌での発現はまれであり、しかも消化器癌患者の抗体産生の頻度もきわめて少ない。例えば、大腸癌患者のＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ、ＳＳＸに対する抗体産生能は何れも０％であることが報告されている（非特許文献５参照）。
【０００７】
また、ＣＴ抗原のうち、現在癌治療等への応用に最も有望とされているものはＮＹ−ＥＳＯ−１であるが、
本願発明者らが、様々な上皮系腫瘍の患者についてＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体産生能を調べたところ、膀胱癌で７％（９／１２４、非特許文献５参照）、前立腺癌で４．６％（１０／２１８、非特許文献６参照）、乳癌で１．６％（１／６２、非特許文献７参照）、食道癌で３．９％（２／５１、非特許文献８参照）、肝臓癌で２．２％（２／９２、非特許文献９参照）であり、何れ癌種もそれほど高くないという結果を報告している。
【非特許文献１】van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, van den Eynde B, Knuth A, Boon T.A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254: 1643-1647, 1991.
【非特許文献２】Gure AO, Tureci O, Sahin U, Tsang S, Scanlan MJ, Jager E, Knuth A, Pfreundschuh M, Old LJ, Chen YT. SSX: a multigene family with several members transcribed in normal testis and human cancer. Int. J. Cancer 72: 965-971, 1997.
【非特許文献３】Chen YT, Scanlan, MJ, Sahin U, Tureci O, Gure AO, Tsang S, Williamson B, Stockert E, Pfreundschuh M, Old LJ. A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1914-1918, 1997.
【非特許文献４】Jager E, Gnjatic S, Nagata Y, Stockert E, Jager D, Karbach J, Neumann A, Rieckenberg J, Chen YT, Ritter G, Hoffman E, Arand M, Old LJ, Knuth A. Induction of primary NY-ESO-1 immunity: CD8+ T lymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinated patients with NY-ESO-1+ cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 12198-12203.
【非特許文献５】Stockert E, Jager E, Chen YT, Scanlan MJ, Gout I, Karbach J, Arand M, Knuth A, Old LJ. A survey of the humoral immune response of cancer patients to a panel of human tumor antigens. J. Exp. Med. 187: 1349-1354, 1998.
【非特許文献６】Kurashige T, Noguchi Y, Saika T, Ono T, Nagata Y, Jungbluth AA, Ritter G, Chen YT, Stockert E, Tsushima T, Kumon H, Old LJ, Nakayama E. NY-ESO-1 expression and immunogenicity associated with transitional cell carcinoma: correlation with tumor grade. Cancer Res. 61: 4671-4674, 2001.
【非特許文献７】Nakada T, Noguchi Y, Sato S, Ono T, Saika T, Kurashige T, Gnjatic S, Ritter G, Chen YT, Stockert E, Nasu Y, Tsushima T, Kumon H, Old LJ, Nakayama E. NY-ESO-1 mRNA expression and immunogenicity in advanced prostate cancer. Cancer Immunity 3: 10, 2003.
【非特許文献８】Sugita Y, Wada S, Fujita S, Nakata T, Sato S, Noguchi Y, Jungbluth AA, Yamaguchi M, Chen YT, Stockert E, Gnjatic S, Williamson B, Scanlan MJ, Ono T, Sakita I, Yasui M, Miyoshi Y, Tamaki Y, Matsuura N, Noguchi S, Old LJ, Nakayama E, Monden M. NY-ESO-1 expression and immunogenicity in malignant and benign breast tumors.Cancer Res. 64: 2199-2204, 2004.
【非特許文献９】Fujita S, Wada H, Jungbluth AA. Sato S, Nakata T, Noguchi Y, Doki Y, Yasui M, Sugita Y, Yasuda T, Yano M, Ono T, Chen YT, Higashiyama M, Gnjatic S, Old LJ, Nakayama E, Monden M. NY-ESO-1 expression and immunogenicity in esophageal cancer.Clin. Cancer Res. 10: 6551-6558, 2004.
【非特許文献１０】Nakamura, S, Nouso K, Noguchi Y, Higashi T, Ono T, Jungbluth AA, Chen YT, Old LJ, Nakayama E, Shiratori Y. Expression and immunogenicity of NY-ESO-1 in hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol. Hepatol. 21: 1281-1285, 2006.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、過去に報告されているＣＴ抗原は、上皮系腫瘍患者の血清中に抗体が存在する頻度が極めて低い。さらに、胃癌や大腸癌などの消化器癌患者については、文献的なデータが全くないのが現状である。
【０００９】
大腸癌については、本願発明者らが５８例の大腸癌患者血清を用いてＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体産生能を調べたが、抗体産生能は０％であった（未発表）。また、本発明者らの胃癌患者血清を用いた予備的解析においても、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体を証明できていない。
【００１０】
このように、上皮系腫瘍、特に胃癌や大腸癌などの消化器系癌の診断に有用な癌マーカーを見出すことは容易ではなく、それゆえ消化器系癌の診断に有用な癌マーカーの開発が非常に強く望まれている。
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、消化器癌の検査、診断あるいは治療に有用なＣＴ抗原を見出し、当該ＣＴ抗原を癌マーカーとする新規な癌診断方法および癌診断キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、正常精巣由来のｃＤＮＡライブラリーと胃癌患者血清とを用いたＳＥＲＥＸ（serological analysis of cancer antigens by recombinant cDNA expression cloning）法を実施し、陽性クローン中のＧＫＡＰ１がＣＴ抗原であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドのレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程、および上記ポリヌクレオチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含することを特徴としている。
【００１４】
また、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドのレベルを測定するポリペプチド測定工程、および上記ポリペプチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含することを特徴としている。
【００１５】
また、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定する抗体測定工程、および上記抗体のレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含することを特徴としている。
【００１６】
上記本発明に係る癌診断方法は、上皮系腫瘍または皮膚癌の診断に用いることが好ましく、胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種の診断に用いることがより好ましい。
【００１７】
本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドを備えることを特徴としている。
【００１８】
また、本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えることを特徴としている。
【００１９】
また、本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドを備えることを特徴としている。
【００２０】
上記本発明に係るキットは、上皮系腫瘍または皮膚癌の診断に用いることが好ましく、胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種の診断に用いることがより好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、胃癌、大腸癌などの消化器癌の診断に有効なＣＴ抗原をマーカーに用いた新規な癌診断方法および癌診断キットを提供することができる。当該ＣＴ抗原は、消化器癌に限定されず、乳癌、頭頸部癌、肺癌などの他の上皮系腫瘍や、悪性黒色腫などの皮膚癌の診断にも有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
１．癌診断方法
本発明者らは、正常精巣由来のｃＤＮＡライブラリーと胃癌患者血清とを用いてＳＥＲＥＸ法を実施し、陽性クローンの１つであるＧＫＡＰ１がＣＴ抗原であることを見出した。すなわち、胃癌患者の血清中に抗ＧＫＡＰ１抗体が存在することを見出した。さらに、ＧＫＡＰ１の発現解析を行い、ＧＫＡＰ１がヒト正常組織では精巣のみに強く発現していること、一方、癌組織および癌細胞株において発現が認められることを確認した。これらの知見に基づいて、癌マーカーとしてＧＫＡＰ１を用いる本発明が完成した。
【００２３】
ここで、ＳＥＲＥＸ（serological analysis of cancer antigens by recombinant cDNA expression cloning）法は、癌組織由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーの中から患者血清中の抗体が認識する抗原遺伝子を同定する方法であり（Sahin U, Tureci O, Schmitt H, Cochlovius B, Johannes T, Schmits R, Stenner F, Luo G, Schobert I, Pfreundschuh M. Human neoplasms elicit multiple specific immune responses in the autologous host. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Dec 5;92(25):11810-3.）、癌抗原のスクリーニング方法として優れていることが知られている。
【００２４】
また、ＧＫＡＰ（Ｇ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は２０００年にマウスで同定された（ＧＫＡＰ４２）。マウスのｃＧＭＰ依存性のシグナル伝達に関するｃＧＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ｃＧＫ）の解析中にクローニングされたものである（Yuasa,K., Omori,K. and Yanaka,N. Binding and phosphorylation of a novel male germ cell-specific cGMP-dependent protein kinase-anchoring protein by cGMP-dependent protein kinase Ialpha. J. Biol. Chem. 275 (7), 4897-4905 (2000)）。もう１編ＧＫＡＰ４２に関する論文があり、これもマウスでのシグナル伝達に関するものである（Smolenski A, Schultess J, Danielewski O, Garcia Arguinzonis MI, Thalheimer P, Kneitz S, Walter U, Lohmann SM. Quantitative analysis of the cardiac fibroblast transcriptome-implications for NO/cGMP signaling. Genomics. 2004 Apr;83(4):577-87.）。ヒトでのＧＫＡＰ１に関する論文はなく、その後、Ｙｕａｓａのグループにより２００１年４月３日にヒト遺伝子としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録された（ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ， ＡＢ０３３１３１: ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ２， ＡＢ０３３１３２）。さらに、２００１年７月１３日に中国よりＧＫＡＰ４２（ＦＫＳＧ２１）として登録された（ＡＦ３１９４７６）。しかし、これらはいずれも直接クローニングされたものではなく、遺伝子断片であった（それぞれ１６８３ｂｐ、１５３０ｂｐ、１５４２ｂｐ）。さらに、ヒトゲノム情報をもとにＧＫＡＰ１（Ｇ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）として２００４年６月２９日にＧｅｎＢａｎｋに登録された（ＢＣ０１４４７６）。ＧｅｎＢａｎｋを統括しているＮＣＢＩにより修正、確認され、２００５年９月２４日に全長１７９６ｂｐの遺伝子として再登録された（ＮＭ＿０２５２１１）。
【００２５】
以上のように、ヒトＧＫＡＰ１は公知であるが、癌での発現に関する報告は過去になく、ＧＫＡＰ１の癌での発現および癌患者血清中の抗ＧＫＡＰ１抗体の存在は、本発明者らが初めて見出したものである。
【００２６】
配列番号１には、ヒトＧＫＡＰ１ｃＤＮＡの塩基配列が示されており、配列番号２にはヒトＧＫＡＰ１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を示している。なお、ヒトＧＫＡＰ１ｃＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＧＫＡＰ１ｍＲＮＡの塩基配列（1796bp、GenBank ACCESSION NM_025211）のうち、３’末端の２０ｂｐのａ（アデニン）の連続配列（ポリＡテール）を除いた１７７６ｂｐの塩基配列と一致する。
【００２７】
本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて、当該試料における上記ＧＫＡＰ１の発現レベルを測定し、このレベルを正常レベルと比較することにより癌を診断する方法である。ＧＫＡＰ１の発現レベルは転写産物（ｍＲＮＡ）量、または翻訳産物（タンパク質）量を測定することにより決定することができる。
【００２８】
また、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて、当該試料における抗ＧＫＡＰ１抗体のレベルを測定し、このレベルを正常レベルと比較することにより癌を診断する方法である。抗ＧＫＡＰ１抗体のレベルは被検体由来の血清における抗ＧＫＡＰ１抗体の力価を測定することにより決定することができる。
【００２９】
本発明の癌診断方法の適用対象となる被検体は特に限定されるものではなく広く動物一般を含むが、ヒトであることが好ましい。被検体がヒトである場合、癌患者や癌を有する疑いのある患者のみでなく、健常人も被検体となり得る。
【００３０】
本発明の癌診断方法に用いられる被検体由来の試料としては、非検体から得られるものであれば特に限定されない。例えば、血液（血清、血漿、血球等）、尿、糞便、喀痰、腹水、腹腔洗浄液、生検組織、外科的に切除された検体などを挙げることができる。
【００３１】
正常レベルとは、正常健康個体（健常人）におけるＧＫＡＰ１の発現レベル、または抗ＧＫＡＰ１抗体のレベルを意味する。正常レベルは、比較する非検体由来の試料と同一の正常細胞、組織、体液を試料として用いて測定されたものであることが好ましい。また、正常レベルは正常健康個体集団の平均レベルを用いることがより好ましい。
【００３２】
癌を診断するとは、被検体が癌を有しているか否かの判定、進行度合いの判定、治療効果の判定を行うことが意図される。
【００３３】
また、診断の対象となる癌の種類は特に限定されるものではないが、上皮系腫瘍または皮膚癌であることが好ましい。上皮系腫瘍としては、例えば、胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣上皮癌、前立腺癌などを挙げることができる。また、皮膚癌としては、悪性黒色腫を挙げることができる。
【００３４】
（１）ＧＫＡＰ１のｍＲＮＡレベルを指標とする癌診断方法
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドのレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程、および上記ポリヌクレオチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含するものであればよい。なお、ポリヌクレオチドにはＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。
【００３５】
本実施形態では、ポリヌクレオチド測定工程において、ＧＫＡＰ１のｍＲＮＡレベルを測定すればよい。
【００３６】
ｍＲＮＡレベルを測定する方法としては、特定のｍＲＮＡレベルを測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、ＧＫＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡの塩基配列またはそれらの相補塩基配列の一部からなるポリヌクレオチドであって、ＧＫＡＰ１遺伝子のいずれかのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合（ハイブリダイズ）するポリヌクレオチドを含むプライマーやプローブを用いた方法が挙げられる。上記プライマーやプローブは、ＧＫＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成するものであれば、ｍＲＮＡを測定・検出するための様々な修飾がされたものであってよい。
【００３７】
上記プライマーとして使用するポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列に基づいて設計されるものであれば限定されない。例えば、配列番号３および４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、本発明者らが実際にＲＴ−ＰＣＲを実施した際に用いたプライマーであり、ＧＫＡＰ１ｃＤＮＡを特異的に増幅させるものであることが実証されている。上記プローブとして使用するポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されるものであれば限定されない。例えば、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。当該ポリヌクレオチドは、本発明者らが実際にノザンブロット法を実施した際に用いたプローブであり、ＧＫＡＰ１ｍＲＮＡを特異的に検出できるものであることが実証されている。なお、目的のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を特異的に増幅させるプライマーとして利用可能なポリヌクレオチドは当該ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を特異的に検出するためのプローブとして使用可能であることは当業者にとって周知である。
【００３８】
上述のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合するポリヌクレオチドを含むプライマーやプローブを用いてｍＲＮＡを測定する公知の方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、コンペティティブＰＣＲ法、ｉｎ Ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法、ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法などを挙げることができる。
【００３９】
例えば、上記ＲＴ−ＰＣＲ法は、試料から調製したトータルＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲで増幅する方法である。さらに、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、ｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲ増幅する際に、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法である。リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）Ｇｒｅｅｎや、ＴａｑＭａｎ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）プローブ等が挙げられる。
【００４０】
例えば、上記ＤＮＡアレイ法は、支持体上にＧＫＡＰ１のｃＤＮＡまたはその部分配列が固定化し、試料から調製したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとインキュベートする。この際、上記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを蛍光標識等することにより、支持体上に固定化したＤＮＡと試料から調製したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出し、試料中のｍＲＮＡレベルを測定することができる。
【００４１】
上記比較工程においては、ポリヌクレオチド測定工程で測定した試料中のＧＫＡＰ１ｍＲＮＡレベルを正常レベルと比較すればよい。正常レベルは、上述のように、比較する非検体由来の試料と同一の正常細胞、組織、体液を試料として用いて、同一の方法で測定されたものであることが好ましい。正常レベルは正常健康個体由来の試料を同時に測定してもよく、背景データとして蓄積されているデータを用いてもよい。被検体由来の試料におけるｍＲＮＡレベルが正常レベルより高い場合に、被検体は癌を有していると判定することが可能である。正常レベルより高い場合とは、少なくとも２倍高いレベルであり、好ましくは３倍高いレベルである。
【００４２】
（２）ＧＫＡＰ１のタンパク質レベルを指標とする癌診断方法
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドのレベルを測定するポリペプチド測定工程、および上記ポリペプチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含するものであればよい。
【００４３】
本実施形態では、ポリペプチド測定工程において、ＧＫＡＰ１タンパク質のレベルを測定すればよい。
【００４４】
タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、特定のタンパク質レベルを測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、ＧＫＡＰ１タンパク質に特異的に結合する抗体を使用する方法を挙げることができる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等）でもよい。
【００４５】
抗体を用いてタンパク質レベルを測定する公知の方法としては、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ法（固相酵素免疫検定法）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、抗体アレイ法などを挙げることができる。これらの中でも、より感度がよく、簡便という点から、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００４６】
上記比較工程においては、ポリペプチド測定工程で測定した試料中のＧＫＡＰ１タンパク質レベルを正常レベルと比較すればよい。正常レベルは、上述のように、比較する非検体由来の試料と同一の正常細胞、組織、体液を試料として用いて、同一の方法で測定されたものであることが好ましい。正常レベルは正常健康個体由来の試料を同時に測定してもよく、背景データとして蓄積されているデータを用いてもよい。被検体由来の試料におけるＧＫＡＰ１タンパク質レベルが正常レベルより高い場合に、被検体は癌を有していると判定することが可能である。正常レベルより高い場合とは、少なくとも２倍高いレベルであり、好ましくは３倍高いレベルである。
【００４７】
（３）抗ＧＫＡＰ１抗体のレベルを指標とする癌診断方法
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定する抗体測定工程、および上記抗体のレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含するものであればよい。
【００４８】
本実施形態では、抗体測定工程において、抗ＧＫＡＰ１抗体の力価レベルを測定すればよい。なお、抗ＧＫＡＰ１抗体の力価レベルの測定に用いる試料は、通常血清である。
【００４９】
抗体の力価レベルを測定する方法としては、特定の抗体の力価レベルを測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、抗原であるＧＫＡＰ１タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法、タンパク質アレイを挙げることができる。抗ＧＫＡＰ１抗体の力価測定に用いるＧＫＡＰ１タンパク質は、生体試料から精製して取得することも可能であるが、組換えタンパク質として取得することが好ましい。組換えＧＫＡＰ１タンパク質は、ＧＫＡＰ１遺伝子を挿入した発現ベクターを宿主に導入して発現させ、精製することにより取得することができる。
【００５０】
上記比較工程においては、抗体測定工程で測定した試料中の抗ＧＫＡＰ１抗体レベルを正常レベルと比較すればよい。正常レベルは正常健康個体由来の試料（血清）を同時に測定してもよく、背景データとして蓄積されているデータを用いてもよい。被検体由来の試料における抗ＧＫＡＰ１抗体レベルが正常レベルより高い場合に、被検体は癌を有していると判定することが可能である。正常レベルより高い場合とは、少なくとも２倍高いレベルであり、好ましくは３倍高いレベルである。
【００５１】
２．キット
本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドを備えるものであればよい。配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、ＧＫＡＰ１のｍＲＮＡを測定するために使用するプライマー、プローブを挙げることができる。本キットはＧＫＡＰ１遺伝子の発現レベルの測定に好適に用いることができる。
【００５２】
一実施形態として、本キットはＧＫＡＰ１ｍＲＮＡ測定用のＲＴ−ＰＣＲキットまたはＧＫＡＰ１ｍＲＮＡ測定用のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲキットを構成することができる。また、ユーザーの選択によりＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの何れかを選択できるキットとすることもできる。
【００５３】
本キットは、ＧＫＡＰ１のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅するためのプライマーセットを備えていればよく、当該プライマーセット以外のキットの構成品は特に限定されないが、例えば、組織または細胞からＲＮＡを調製するための試薬、逆転写酵素、逆転写反応に用いる緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用試薬、リアルタイムＰＣＲ用試薬、ＰＣＲ用チューブ、ＰＣＲ用プレートなどを備えていることが好ましい。
【００５４】
また、本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えるものでもよい。本キットはＧＫＡＰ１タンパク質のレベル測定に好適に用いることができる。
【００５５】
さらに、本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドを備えるものでもよい。本キットは抗ＧＫＡＰ１抗体のレベル測定に好適に用いることができる。
【００５６】
一実施形態として、本キットはＥＬＩＳＡ用キットを構成することができる。キットには、ＧＫＡＰ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはＧＫＡＰ１タンパク質が予めＥＬＩＳＡ用プレートに固定化（固相化）された状態でキットに含まれていることが好ましい。さらに、ＧＫＡＰ１タンパク質に特異的に結合する抗体が固相化されたＥＬＩＳＡ用プレートとＧＫＡＰ１タンパク質が固相化されたＥＬＩＳＡ用プレートとの両方を備えるキットとすれば、ＧＫＡＰ１タンパク質のレベルと抗ＧＫＡＰ１抗体のレベルの両方を測定できるキットとすることができる。
【００５７】
上記ＥＬＩＳＡ用プレート以外のキットの構成品は特に限定されないが、例えば、標識された二次抗体、発色用試薬、洗浄用緩衝液などを備えていることが好ましい。
【００５８】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【００５９】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、核酸の抽出、切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、特に記載のない限り、各操作に使用する市販の試薬、機器装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd Ed（Sambrookら(2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press）」）に基本的に従った。
【００６１】
〔実施例１：ＳＥＲＥＸ法による胃癌患者血清中の抗体が認識する抗原の解析〕
ＳＥＲＥＸ法は、図１に概略を示したように、癌患者から摘出した癌組織から直接ｍＲＮＡを抽出し作製したｃＤＮＡ発現ライブラリーから、癌患者の血清を用いて癌抗原を検索する方法である。本実施例１では、胃癌の診断に有用な癌・精巣抗原を単離すべく、正常精巣由来のｃＤＮＡライブラリーと胃癌患者血清とを用いたＳＥＲＥＸ法を実施した。
【００６２】
（１）胃癌患者血清
原発巣および肝転移巣共に縮小傾向を示した胃腺癌患者から血清を得た。なお、当該患者血清は、予め正常精巣から得たタンパク質画分と強く反応することを確認したものを選択した。血清はＴＢＳ（Tris-Buffered Saline）で１０倍に希釈した後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０／Ｙ１０８９のアフィニティーカラム（BioDynamics Lab Inc., Tokyo）を用いて抗バクテリア抗体の吸収処理を行った。
【００６３】
（２）ｃＤＮＡ発現ライブラリーの作製
正常精巣Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA）よりＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を用いてｍＲＮＡを精製した。５μｇのｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、γＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｃｔｏｒ（Stratagene）に組み換えてファージにパッケージングし、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製した。
【００６４】
（３）正常精巣ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニング
１５０ｍｍプレートあたり約４，０００個のファージを蒔き、６〜８時間培養した。ＩＰＴＧで誘導した蛋白質を直径１３５ｍｍニトロセルロースメンブラン（Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）に転写した後、抗バクテリア抗体を吸収した胃癌患者血清（ＴＢＳで２００倍に希釈）とさらに１５時間反応させ、パーオキシデース標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pa., USA）で検出した。この時、抗体産生細胞に由来するＩｇＧクローンを除去するために、メンブランをあらかじめ二次抗体のみで処理した。陽性クローンを単離し、それぞれ直径８２ｍｍあるいは４７ｍｍのメンブランを用いて２次、３次スクリーニングを行い、単クローンとした。
【００６５】
（４）インサートｃＤＮＡの塩基配列の決定
陽性クローンをｉｎ ｖｉｖｏエキシジョンによりｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドにした後、インサートｃＤＮＡの塩基配列を解析し（ABI PRISM R310 Genetic Analyzer; PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）、遺伝子データベース（http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）によるホモロジー検索を行った。
【００６６】
（５）結果
約２０万クローンをスクリーニングした結果、表１に示した４５個の陽性クローンを単離した。
【００６７】
【表１】
【００６８】
ホモロジー検索の結果、２１種類の遺伝子を同定した（ＯＹ−ＳＴ−１〜２１）。これらのうち、データベースによる正常組織発現の検索により、２種類の遺伝子は精巣特異的であった。精巣特異的に発現する遺伝子として、ＯＹ−ＳＴ−２：G kinase anchoring protein 1（GKAP1）が２クローン、ＯＹ−ＳＴ−５：synaptonemal complex protein 1, SYCP1（SCP-1）が１クローン単離された。他の１９種類の遺伝子については正常組織に広範囲に発現しているか、あるいは発現のデータは得られなかった。ＳＣＰ−１（ＯＹ−ＳＴ−５）はＳＥＲＥＸ法が開発された初期に発見された代表的ながん・精巣抗原（ＣＴ抗原）の一つであるが、その免疫原性は弱いことが知られている（Tureci, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998）。
【００６９】
ＯＹ−ＳＴ−２のインサートｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１）は全長１７７６ｂｐであった。この塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されているＧＫＡＰ１ ｍＲＮＡ（1796bp、accession No. NM_025211）の第１位〜第１７７６位と一致し、変異は認められなかった。ＧＫＡＰ１については、癌での発現について報告されていないことから、以後、ＧＫＡＰ１について発現解析を行った。
【００７０】
〔実施例２：ＧＫＡＰ１の発現解析〕
（１）ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析
ＧＫＡＰ１特異的プライマーとして、
G-SN（sense: 5’-CATTGTCAAACCCAGTACAG-3’、配列番号３）
G-ASN（antisense: 5’-CTTTCAGAACCACTTCCTGG-3’、配列番号４)
を使用した。プライマーはＤＮＡ合成機で合成した。
【００７１】
ヒト正常組織由来ｃＤＮＡ（MTC panel, BD Biosciences Clontech）は購入した。
【００７２】
癌組織は、４人の胃癌患者から手術あるいは生検によって得られた組織の提供を受け、それぞれ癌部と非癌部を得た。なお、実施例１および２に用いた癌患者または健常人由来の試料は、すべて、あらかじめ担当医により口頭および文書で直接提供者に説明し、インフォームドコンセントを得たものについてのみ提供を受けた。癌患者または健常人由来の試料は匿名化を行い、個人情報は厳重に保護したうえで研究に用いた。本研究の内容およびインフォームドコンセントのための説明文書および同意文書については、岡山大学大学院医歯薬学研究科「ヒトゲノム・遺伝子解析研究」倫理委員会の承認を受けている。
【００７３】
癌細胞株として、５種類の大腸癌細胞株、７種類の肺癌細胞株、５種類の悪性黒色腫細胞株、２種類の卵巣癌細胞株を用いた。これらのうち、肺癌細胞株ＫＭ、並びに卵巣癌細胞株Ｏ−３２およびＯ−３７は、本発明者らが独自に樹立した細胞株である。悪性黒色腫細胞株については米国スローン・ケタリング癌研究所で樹立されたものであり、当該研究所から本発明者らが入手したものである。これら以外の細胞株は、癌研究に一般に用いられているものであり、通常、公知の細胞保存機関等から入手可能である。
【００７４】
癌組織および癌細胞株については、それぞれｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し（RNeasy; Qiagen, Hilden, Germany）、ＭＭＬＶ逆転写酵素とｏｌｉｇｏ（ＤＴ）１５プライマーによりｃＤＮＡを合成した（Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK）。ＲＴ−ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６０℃、１分、伸長７２℃、１分３０秒を３２サイクル行った。正常組織についてはさらに３サイクル延長し、３５サイクルでもＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動で解析した。合成したｃＤＮＡについて同時にＧ３ＰＤＨ遺伝子の増幅を確認した。
【００７５】
（２）ノザンブロット法による発現解析
ヒト正常組織におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現をノザンブロットにより解析した。精巣ｃＤＮＡを上記ＧＫＡＰ１特異的プライマー（G-SNおよびG-ASN）を用いてＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離・精製した後、ランダムプライム標識法により32Ｐで標識し、これをＧＫＡＰ１特異的プローブとして用いた。なお、当該ＧＫＡＰ１特異的プローブの塩基配列を配列番号５に示した。32Ｐ標識ＧＫＡＰ１特異的プローブを用いて６５℃、１７時間ハイブリダイズし（BD MTN Multiple Tissue Northern Blots; BD Biosciences Clontech）、バイオ・イメージアナライザＢＡＳ−２０００ＩＩ（Fuji Film）で解析した。
【００７６】
（３）発現解析の結果
図２に、ＲＴ−ＰＣＲによるヒト正常組織のＧＫＡＰ１遺伝子発現解析結果を示した。
図２に示したように、調べた１６種類の正常組織のうち精巣にのみ発現がみられ、他の１５種類の正常組織には発現がみられなかった。
【００７７】
図３に、ノザンブロット法によるヒト正常組織のＧＫＡＰ１遺伝子発現解析結果を示した。図３に示したように、精巣に約１．８ｋｂの強いハイブリダイズシグナルがみられた。
【００７８】
図４に、４人の胃癌患者の胃癌手術摘出組織より得た、癌部および非癌部におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示した。図４に示したように、患者４の癌部に弱いＧＫＡＰ１遺伝子の発現が認められた。
【００７９】
図５に、乳癌組織および頭頸部癌組織におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示した。図５に示したように、乳癌組織では４例中１例にＧＫＡＰ１遺伝子の発現が認められた。頭頸部癌組織では２８例中９例にＧＫＡＰ１遺伝子の発現が認められた。図５にはその代表例として１１例の結果を示している。
【００８０】
図６に、癌細胞株におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示した。図６に示したように、肺癌細胞株で７例中２例に強い発現が認められ、他の５例の肺癌細胞株にも弱い発現が認められた。悪性黒色腫では５例中３例に弱い発現が認められた。一方、大腸癌細胞株、卵巣癌細胞株には発現は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は癌の診断に用いるものであり、臨床検査薬産業、試薬産業、医療機器産業等において利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ＳＥＲＥＸ法の概略を示す図である。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲによるヒト正常組織のＧＫＡＰ１遺伝子発現解析結果を示す画像である。
【図３】ノザンブロット法によるヒト正常組織のＧＫＡＰ１遺伝子発現解析結果を示す画像である。
【図４】胃癌手術摘出組織より得た癌部および非癌部におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す画像である。
【図５】乳癌組織および頭頸部癌組織におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す画像である。
【図６】癌細胞株におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す画像である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な癌診断方法および癌診断キットに関するものであり、より詳細には、Ｇ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １（以下「ＧＫＡＰ１」と記す）の発現または抗ＧＫＡＰ１抗体の存在を指標とする癌診断方法および癌診断キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
消化器癌、特に胃癌、大腸癌には、検査、診断あるいは治療に有用な癌抗原が少ない。それゆえ、消化器癌の検査、診断あるいは治療に有用な癌抗原を見出し、これをマーカーとして診断等に適用することは極めて重要である。
【０００３】
癌抗原のなかで、癌・精巣抗原（Ｃａｎｃｅｒ−Ｔｅｓｔｉｓ抗原、以下「ＣＴ抗原」と記す）は、各種の癌組織、および正常組織のうち精巣と一部卵巣・胎盤組織で発現が認められる抗原群である。現在多くのＣＴ抗原が同定、報告されており、その数は確定していないが、約３８個のＣＴ抗原が知られている。しかしながら、これらのＣＴ抗原のすべてが癌患者に対して免疫原性が強いわけではなく、癌の診断、検査のマーカー、あるいは癌治療に有望なＣＴ抗原は限られている。
【０００４】
現在報告されている代表的なＣＴ抗原として、ＭＡＧＥ（非特許文献１参照）、ＳＳＸ（非特許文献２参照）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（非特許文献３参照）を挙げることができる。
【０００５】
ＭＡＧＥとＮＹ−ＥＳＯ−１については欧米を中心に臨床応用され、一定の効果が得られた例もある（例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１の臨床応用については非特許文献４参照）。
【０００６】
しかしながら、過去に報告されているＣＴ抗原は胃癌や大腸癌などの消化器癌での発現はまれであり、しかも消化器癌患者の抗体産生の頻度もきわめて少ない。例えば、大腸癌患者のＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ、ＳＳＸに対する抗体産生能は何れも０％であることが報告されている（非特許文献５参照）。
【０００７】
また、ＣＴ抗原のうち、現在癌治療等への応用に最も有望とされているものはＮＹ−ＥＳＯ−１であるが、
本願発明者らが、様々な上皮系腫瘍の患者についてＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体産生能を調べたところ、膀胱癌で７％（９／１２４、非特許文献５参照）、前立腺癌で４．６％（１０／２１８、非特許文献６参照）、乳癌で１．６％（１／６２、非特許文献７参照）、食道癌で３．９％（２／５１、非特許文献８参照）、肝臓癌で２．２％（２／９２、非特許文献９参照）であり、何れ癌種もそれほど高くないという結果を報告している。
【非特許文献１】van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, van den Eynde B, Knuth A, Boon T.A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254: 1643-1647, 1991.
【非特許文献２】Gure AO, Tureci O, Sahin U, Tsang S, Scanlan MJ, Jager E, Knuth A, Pfreundschuh M, Old LJ, Chen YT. SSX: a multigene family with several members transcribed in normal testis and human cancer. Int. J. Cancer 72: 965-971, 1997.
【非特許文献３】Chen YT, Scanlan, MJ, Sahin U, Tureci O, Gure AO, Tsang S, Williamson B, Stockert E, Pfreundschuh M, Old LJ. A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1914-1918, 1997.
【非特許文献４】Jager E, Gnjatic S, Nagata Y, Stockert E, Jager D, Karbach J, Neumann A, Rieckenberg J, Chen YT, Ritter G, Hoffman E, Arand M, Old LJ, Knuth A. Induction of primary NY-ESO-1 immunity: CD8+ T lymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinated patients with NY-ESO-1+ cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 12198-12203.
【非特許文献５】Stockert E, Jager E, Chen YT, Scanlan MJ, Gout I, Karbach J, Arand M, Knuth A, Old LJ. A survey of the humoral immune response of cancer patients to a panel of human tumor antigens. J. Exp. Med. 187: 1349-1354, 1998.
【非特許文献６】Kurashige T, Noguchi Y, Saika T, Ono T, Nagata Y, Jungbluth AA, Ritter G, Chen YT, Stockert E, Tsushima T, Kumon H, Old LJ, Nakayama E. NY-ESO-1 expression and immunogenicity associated with transitional cell carcinoma: correlation with tumor grade. Cancer Res. 61: 4671-4674, 2001.
【非特許文献７】Nakada T, Noguchi Y, Sato S, Ono T, Saika T, Kurashige T, Gnjatic S, Ritter G, Chen YT, Stockert E, Nasu Y, Tsushima T, Kumon H, Old LJ, Nakayama E. NY-ESO-1 mRNA expression and immunogenicity in advanced prostate cancer. Cancer Immunity 3: 10, 2003.
【非特許文献８】Sugita Y, Wada S, Fujita S, Nakata T, Sato S, Noguchi Y, Jungbluth AA, Yamaguchi M, Chen YT, Stockert E, Gnjatic S, Williamson B, Scanlan MJ, Ono T, Sakita I, Yasui M, Miyoshi Y, Tamaki Y, Matsuura N, Noguchi S, Old LJ, Nakayama E, Monden M. NY-ESO-1 expression and immunogenicity in malignant and benign breast tumors.Cancer Res. 64: 2199-2204, 2004.
【非特許文献９】Fujita S, Wada H, Jungbluth AA. Sato S, Nakata T, Noguchi Y, Doki Y, Yasui M, Sugita Y, Yasuda T, Yano M, Ono T, Chen YT, Higashiyama M, Gnjatic S, Old LJ, Nakayama E, Monden M. NY-ESO-1 expression and immunogenicity in esophageal cancer.Clin. Cancer Res. 10: 6551-6558, 2004.
【非特許文献１０】Nakamura, S, Nouso K, Noguchi Y, Higashi T, Ono T, Jungbluth AA, Chen YT, Old LJ, Nakayama E, Shiratori Y. Expression and immunogenicity of NY-ESO-1 in hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol. Hepatol. 21: 1281-1285, 2006.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、過去に報告されているＣＴ抗原は、上皮系腫瘍患者の血清中に抗体が存在する頻度が極めて低い。さらに、胃癌や大腸癌などの消化器癌患者については、文献的なデータが全くないのが現状である。
【０００９】
大腸癌については、本願発明者らが５８例の大腸癌患者血清を用いてＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体産生能を調べたが、抗体産生能は０％であった（未発表）。また、本発明者らの胃癌患者血清を用いた予備的解析においても、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体を証明できていない。
【００１０】
このように、上皮系腫瘍、特に胃癌や大腸癌などの消化器系癌の診断に有用な癌マーカーを見出すことは容易ではなく、それゆえ消化器系癌の診断に有用な癌マーカーの開発が非常に強く望まれている。
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、消化器癌の検査、診断あるいは治療に有用なＣＴ抗原を見出し、当該ＣＴ抗原を癌マーカーとする新規な癌診断方法および癌診断キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、正常精巣由来のｃＤＮＡライブラリーと胃癌患者血清とを用いたＳＥＲＥＸ（serological analysis of cancer antigens by recombinant cDNA expression cloning）法を実施し、陽性クローン中のＧＫＡＰ１がＣＴ抗原であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドのレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程、および上記ポリヌクレオチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含することを特徴としている。
【００１４】
また、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドのレベルを測定するポリペプチド測定工程、および上記ポリペプチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含することを特徴としている。
【００１５】
また、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定する抗体測定工程、および上記抗体のレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含することを特徴としている。
【００１６】
上記本発明に係る癌診断方法は、上皮系腫瘍または皮膚癌の診断に用いることが好ましく、胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種の診断に用いることがより好ましい。
【００１７】
本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドを備えることを特徴としている。
【００１８】
また、本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えることを特徴としている。
【００１９】
また、本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドを備えることを特徴としている。
【００２０】
上記本発明に係るキットは、上皮系腫瘍または皮膚癌の診断に用いることが好ましく、胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種の診断に用いることがより好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、胃癌、大腸癌などの消化器癌の診断に有効なＣＴ抗原をマーカーに用いた新規な癌診断方法および癌診断キットを提供することができる。当該ＣＴ抗原は、消化器癌に限定されず、乳癌、頭頸部癌、肺癌などの他の上皮系腫瘍や、悪性黒色腫などの皮膚癌の診断にも有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
１．癌診断方法
本発明者らは、正常精巣由来のｃＤＮＡライブラリーと胃癌患者血清とを用いてＳＥＲＥＸ法を実施し、陽性クローンの１つであるＧＫＡＰ１がＣＴ抗原であることを見出した。すなわち、胃癌患者の血清中に抗ＧＫＡＰ１抗体が存在することを見出した。さらに、ＧＫＡＰ１の発現解析を行い、ＧＫＡＰ１がヒト正常組織では精巣のみに強く発現していること、一方、癌組織および癌細胞株において発現が認められることを確認した。これらの知見に基づいて、癌マーカーとしてＧＫＡＰ１を用いる本発明が完成した。
【００２３】
ここで、ＳＥＲＥＸ（serological analysis of cancer antigens by recombinant cDNA expression cloning）法は、癌組織由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーの中から患者血清中の抗体が認識する抗原遺伝子を同定する方法であり（Sahin U, Tureci O, Schmitt H, Cochlovius B, Johannes T, Schmits R, Stenner F, Luo G, Schobert I, Pfreundschuh M. Human neoplasms elicit multiple specific immune responses in the autologous host. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Dec 5;92(25):11810-3.）、癌抗原のスクリーニング方法として優れていることが知られている。
【００２４】
また、ＧＫＡＰ（Ｇ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は２０００年にマウスで同定された（ＧＫＡＰ４２）。マウスのｃＧＭＰ依存性のシグナル伝達に関するｃＧＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ｃＧＫ）の解析中にクローニングされたものである（Yuasa,K., Omori,K. and Yanaka,N. Binding and phosphorylation of a novel male germ cell-specific cGMP-dependent protein kinase-anchoring protein by cGMP-dependent protein kinase Ialpha. J. Biol. Chem. 275 (7), 4897-4905 (2000)）。もう１編ＧＫＡＰ４２に関する論文があり、これもマウスでのシグナル伝達に関するものである（Smolenski A, Schultess J, Danielewski O, Garcia Arguinzonis MI, Thalheimer P, Kneitz S, Walter U, Lohmann SM. Quantitative analysis of the cardiac fibroblast transcriptome-implications for NO/cGMP signaling. Genomics. 2004 Apr;83(4):577-87.）。ヒトでのＧＫＡＰ１に関する論文はなく、その後、Ｙｕａｓａのグループにより２００１年４月３日にヒト遺伝子としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録された（ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ， ＡＢ０３３１３１: ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ２， ＡＢ０３３１３２）。さらに、２００１年７月１３日に中国よりＧＫＡＰ４２（ＦＫＳＧ２１）として登録された（ＡＦ３１９４７６）。しかし、これらはいずれも直接クローニングされたものではなく、遺伝子断片であった（それぞれ１６８３ｂｐ、１５３０ｂｐ、１５４２ｂｐ）。さらに、ヒトゲノム情報をもとにＧＫＡＰ１（Ｇ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）として２００４年６月２９日にＧｅｎＢａｎｋに登録された（ＢＣ０１４４７６）。ＧｅｎＢａｎｋを統括しているＮＣＢＩにより修正、確認され、２００５年９月２４日に全長１７９６ｂｐの遺伝子として再登録された（ＮＭ＿０２５２１１）。
【００２５】
以上のように、ヒトＧＫＡＰ１は公知であるが、癌での発現に関する報告は過去になく、ＧＫＡＰ１の癌での発現および癌患者血清中の抗ＧＫＡＰ１抗体の存在は、本発明者らが初めて見出したものである。
【００２６】
配列番号１には、ヒトＧＫＡＰ１ｃＤＮＡの塩基配列が示されており、配列番号２にはヒトＧＫＡＰ１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を示している。なお、ヒトＧＫＡＰ１ｃＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＧＫＡＰ１ｍＲＮＡの塩基配列（1796bp、GenBank ACCESSION NM_025211）のうち、３’末端の２０ｂｐのａ（アデニン）の連続配列（ポリＡテール）を除いた１７７６ｂｐの塩基配列と一致する。
【００２７】
本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて、当該試料における上記ＧＫＡＰ１の発現レベルを測定し、このレベルを正常レベルと比較することにより癌を診断する方法である。ＧＫＡＰ１の発現レベルは転写産物（ｍＲＮＡ）量、または翻訳産物（タンパク質）量を測定することにより決定することができる。
【００２８】
また、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて、当該試料における抗ＧＫＡＰ１抗体のレベルを測定し、このレベルを正常レベルと比較することにより癌を診断する方法である。抗ＧＫＡＰ１抗体のレベルは被検体由来の血清における抗ＧＫＡＰ１抗体の力価を測定することにより決定することができる。
【００２９】
本発明の癌診断方法の適用対象となる被検体は特に限定されるものではなく広く動物一般を含むが、ヒトであることが好ましい。被検体がヒトである場合、癌患者や癌を有する疑いのある患者のみでなく、健常人も被検体となり得る。
【００３０】
本発明の癌診断方法に用いられる被検体由来の試料としては、非検体から得られるものであれば特に限定されない。例えば、血液（血清、血漿、血球等）、尿、糞便、喀痰、腹水、腹腔洗浄液、生検組織、外科的に切除された検体などを挙げることができる。
【００３１】
正常レベルとは、正常健康個体（健常人）におけるＧＫＡＰ１の発現レベル、または抗ＧＫＡＰ１抗体のレベルを意味する。正常レベルは、比較する非検体由来の試料と同一の正常細胞、組織、体液を試料として用いて測定されたものであることが好ましい。また、正常レベルは正常健康個体集団の平均レベルを用いることがより好ましい。
【００３２】
癌を診断するとは、被検体が癌を有しているか否かの判定、進行度合いの判定、治療効果の判定を行うことが意図される。
【００３３】
また、診断の対象となる癌の種類は特に限定されるものではないが、上皮系腫瘍または皮膚癌であることが好ましい。上皮系腫瘍としては、例えば、胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣上皮癌、前立腺癌などを挙げることができる。また、皮膚癌としては、悪性黒色腫を挙げることができる。
【００３４】
（１）ＧＫＡＰ１のｍＲＮＡレベルを指標とする癌診断方法
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドのレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程、および上記ポリヌクレオチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含するものであればよい。なお、ポリヌクレオチドにはＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。
【００３５】
本実施形態では、ポリヌクレオチド測定工程において、ＧＫＡＰ１のｍＲＮＡレベルを測定すればよい。
【００３６】
ｍＲＮＡレベルを測定する方法としては、特定のｍＲＮＡレベルを測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、ＧＫＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡの塩基配列またはそれらの相補塩基配列の一部からなるポリヌクレオチドであって、ＧＫＡＰ１遺伝子のいずれかのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合（ハイブリダイズ）するポリヌクレオチドを含むプライマーやプローブを用いた方法が挙げられる。上記プライマーやプローブは、ＧＫＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成するものであれば、ｍＲＮＡを測定・検出するための様々な修飾がされたものであってよい。
【００３７】
上記プライマーとして使用するポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列に基づいて設計されるものであれば限定されない。例えば、配列番号３および４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、本発明者らが実際にＲＴ−ＰＣＲを実施した際に用いたプライマーであり、ＧＫＡＰ１ｃＤＮＡを特異的に増幅させるものであることが実証されている。上記プローブとして使用するポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計されるものであれば限定されない。例えば、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。当該ポリヌクレオチドは、本発明者らが実際にノザンブロット法を実施した際に用いたプローブであり、ＧＫＡＰ１ｍＲＮＡを特異的に検出できるものであることが実証されている。なお、目的のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を特異的に増幅させるプライマーとして利用可能なポリヌクレオチドは当該ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を特異的に検出するためのプローブとして使用可能であることは当業者にとって周知である。
【００３８】
上述のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合するポリヌクレオチドを含むプライマーやプローブを用いてｍＲＮＡを測定する公知の方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、コンペティティブＰＣＲ法、ｉｎ Ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法、ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法などを挙げることができる。
【００３９】
例えば、上記ＲＴ−ＰＣＲ法は、試料から調製したトータルＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲで増幅する方法である。さらに、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、ｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲ増幅する際に、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法である。リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）Ｇｒｅｅｎや、ＴａｑＭａｎ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）プローブ等が挙げられる。
【００４０】
例えば、上記ＤＮＡアレイ法は、支持体上にＧＫＡＰ１のｃＤＮＡまたはその部分配列が固定化し、試料から調製したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとインキュベートする。この際、上記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを蛍光標識等することにより、支持体上に固定化したＤＮＡと試料から調製したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出し、試料中のｍＲＮＡレベルを測定することができる。
【００４１】
上記比較工程においては、ポリヌクレオチド測定工程で測定した試料中のＧＫＡＰ１ｍＲＮＡレベルを正常レベルと比較すればよい。正常レベルは、上述のように、比較する非検体由来の試料と同一の正常細胞、組織、体液を試料として用いて、同一の方法で測定されたものであることが好ましい。正常レベルは正常健康個体由来の試料を同時に測定してもよく、背景データとして蓄積されているデータを用いてもよい。被検体由来の試料におけるｍＲＮＡレベルが正常レベルより高い場合に、被検体は癌を有していると判定することが可能である。正常レベルより高い場合とは、少なくとも２倍高いレベルであり、好ましくは３倍高いレベルである。
【００４２】
（２）ＧＫＡＰ１のタンパク質レベルを指標とする癌診断方法
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドのレベルを測定するポリペプチド測定工程、および上記ポリペプチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含するものであればよい。
【００４３】
本実施形態では、ポリペプチド測定工程において、ＧＫＡＰ１タンパク質のレベルを測定すればよい。
【００４４】
タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、特定のタンパク質レベルを測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、ＧＫＡＰ１タンパク質に特異的に結合する抗体を使用する方法を挙げることができる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等）でもよい。
【００４５】
抗体を用いてタンパク質レベルを測定する公知の方法としては、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ法（固相酵素免疫検定法）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、抗体アレイ法などを挙げることができる。これらの中でも、より感度がよく、簡便という点から、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００４６】
上記比較工程においては、ポリペプチド測定工程で測定した試料中のＧＫＡＰ１タンパク質レベルを正常レベルと比較すればよい。正常レベルは、上述のように、比較する非検体由来の試料と同一の正常細胞、組織、体液を試料として用いて、同一の方法で測定されたものであることが好ましい。正常レベルは正常健康個体由来の試料を同時に測定してもよく、背景データとして蓄積されているデータを用いてもよい。被検体由来の試料におけるＧＫＡＰ１タンパク質レベルが正常レベルより高い場合に、被検体は癌を有していると判定することが可能である。正常レベルより高い場合とは、少なくとも２倍高いレベルであり、好ましくは３倍高いレベルである。
【００４７】
（３）抗ＧＫＡＰ１抗体のレベルを指標とする癌診断方法
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定する抗体測定工程、および上記抗体のレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含するものであればよい。
【００４８】
本実施形態では、抗体測定工程において、抗ＧＫＡＰ１抗体の力価レベルを測定すればよい。なお、抗ＧＫＡＰ１抗体の力価レベルの測定に用いる試料は、通常血清である。
【００４９】
抗体の力価レベルを測定する方法としては、特定の抗体の力価レベルを測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、抗原であるＧＫＡＰ１タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法、タンパク質アレイを挙げることができる。抗ＧＫＡＰ１抗体の力価測定に用いるＧＫＡＰ１タンパク質は、生体試料から精製して取得することも可能であるが、組換えタンパク質として取得することが好ましい。組換えＧＫＡＰ１タンパク質は、ＧＫＡＰ１遺伝子を挿入した発現ベクターを宿主に導入して発現させ、精製することにより取得することができる。
【００５０】
上記比較工程においては、抗体測定工程で測定した試料中の抗ＧＫＡＰ１抗体レベルを正常レベルと比較すればよい。正常レベルは正常健康個体由来の試料（血清）を同時に測定してもよく、背景データとして蓄積されているデータを用いてもよい。被検体由来の試料における抗ＧＫＡＰ１抗体レベルが正常レベルより高い場合に、被検体は癌を有していると判定することが可能である。正常レベルより高い場合とは、少なくとも２倍高いレベルであり、好ましくは３倍高いレベルである。
【００５１】
２．キット
本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドを備えるものであればよい。配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、ＧＫＡＰ１のｍＲＮＡを測定するために使用するプライマー、プローブを挙げることができる。本キットはＧＫＡＰ１遺伝子の発現レベルの測定に好適に用いることができる。
【００５２】
一実施形態として、本キットはＧＫＡＰ１ｍＲＮＡ測定用のＲＴ−ＰＣＲキットまたはＧＫＡＰ１ｍＲＮＡ測定用のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲキットを構成することができる。また、ユーザーの選択によりＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの何れかを選択できるキットとすることもできる。
【００５３】
本キットは、ＧＫＡＰ１のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅するためのプライマーセットを備えていればよく、当該プライマーセット以外のキットの構成品は特に限定されないが、例えば、組織または細胞からＲＮＡを調製するための試薬、逆転写酵素、逆転写反応に用いる緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用試薬、リアルタイムＰＣＲ用試薬、ＰＣＲ用チューブ、ＰＣＲ用プレートなどを備えていることが好ましい。
【００５４】
また、本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えるものでもよい。本キットはＧＫＡＰ１タンパク質のレベル測定に好適に用いることができる。
【００５５】
さらに、本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドを備えるものでもよい。本キットは抗ＧＫＡＰ１抗体のレベル測定に好適に用いることができる。
【００５６】
一実施形態として、本キットはＥＬＩＳＡ用キットを構成することができる。キットには、ＧＫＡＰ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはＧＫＡＰ１タンパク質が予めＥＬＩＳＡ用プレートに固定化（固相化）された状態でキットに含まれていることが好ましい。さらに、ＧＫＡＰ１タンパク質に特異的に結合する抗体が固相化されたＥＬＩＳＡ用プレートとＧＫＡＰ１タンパク質が固相化されたＥＬＩＳＡ用プレートとの両方を備えるキットとすれば、ＧＫＡＰ１タンパク質のレベルと抗ＧＫＡＰ１抗体のレベルの両方を測定できるキットとすることができる。
【００５７】
上記ＥＬＩＳＡ用プレート以外のキットの構成品は特に限定されないが、例えば、標識された二次抗体、発色用試薬、洗浄用緩衝液などを備えていることが好ましい。
【００５８】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【００５９】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、核酸の抽出、切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、特に記載のない限り、各操作に使用する市販の試薬、機器装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd Ed（Sambrookら(2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press）」）に基本的に従った。
【００６１】
〔実施例１：ＳＥＲＥＸ法による胃癌患者血清中の抗体が認識する抗原の解析〕
ＳＥＲＥＸ法は、図１に概略を示したように、癌患者から摘出した癌組織から直接ｍＲＮＡを抽出し作製したｃＤＮＡ発現ライブラリーから、癌患者の血清を用いて癌抗原を検索する方法である。本実施例１では、胃癌の診断に有用な癌・精巣抗原を単離すべく、正常精巣由来のｃＤＮＡライブラリーと胃癌患者血清とを用いたＳＥＲＥＸ法を実施した。
【００６２】
（１）胃癌患者血清
原発巣および肝転移巣共に縮小傾向を示した胃腺癌患者から血清を得た。なお、当該患者血清は、予め正常精巣から得たタンパク質画分と強く反応することを確認したものを選択した。血清はＴＢＳ（Tris-Buffered Saline）で１０倍に希釈した後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０／Ｙ１０８９のアフィニティーカラム（BioDynamics Lab Inc., Tokyo）を用いて抗バクテリア抗体の吸収処理を行った。
【００６３】
（２）ｃＤＮＡ発現ライブラリーの作製
正常精巣Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA）よりＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を用いてｍＲＮＡを精製した。５μｇのｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、γＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｃｔｏｒ（Stratagene）に組み換えてファージにパッケージングし、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製した。
【００６４】
（３）正常精巣ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニング
１５０ｍｍプレートあたり約４，０００個のファージを蒔き、６〜８時間培養した。ＩＰＴＧで誘導した蛋白質を直径１３５ｍｍニトロセルロースメンブラン（Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）に転写した後、抗バクテリア抗体を吸収した胃癌患者血清（ＴＢＳで２００倍に希釈）とさらに１５時間反応させ、パーオキシデース標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pa., USA）で検出した。この時、抗体産生細胞に由来するＩｇＧクローンを除去するために、メンブランをあらかじめ二次抗体のみで処理した。陽性クローンを単離し、それぞれ直径８２ｍｍあるいは４７ｍｍのメンブランを用いて２次、３次スクリーニングを行い、単クローンとした。
【００６５】
（４）インサートｃＤＮＡの塩基配列の決定
陽性クローンをｉｎ ｖｉｖｏエキシジョンによりｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドにした後、インサートｃＤＮＡの塩基配列を解析し（ABI PRISM R310 Genetic Analyzer; PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）、遺伝子データベース（http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）によるホモロジー検索を行った。
【００６６】
（５）結果
約２０万クローンをスクリーニングした結果、表１に示した４５個の陽性クローンを単離した。
【００６７】
【表１】
【００６８】
ホモロジー検索の結果、２１種類の遺伝子を同定した（ＯＹ−ＳＴ−１〜２１）。これらのうち、データベースによる正常組織発現の検索により、２種類の遺伝子は精巣特異的であった。精巣特異的に発現する遺伝子として、ＯＹ−ＳＴ−２：G kinase anchoring protein 1（GKAP1）が２クローン、ＯＹ−ＳＴ−５：synaptonemal complex protein 1, SYCP1（SCP-1）が１クローン単離された。他の１９種類の遺伝子については正常組織に広範囲に発現しているか、あるいは発現のデータは得られなかった。ＳＣＰ−１（ＯＹ−ＳＴ−５）はＳＥＲＥＸ法が開発された初期に発見された代表的ながん・精巣抗原（ＣＴ抗原）の一つであるが、その免疫原性は弱いことが知られている（Tureci, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998）。
【００６９】
ＯＹ−ＳＴ−２のインサートｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１）は全長１７７６ｂｐであった。この塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されているＧＫＡＰ１ ｍＲＮＡ（1796bp、accession No. NM_025211）の第１位〜第１７７６位と一致し、変異は認められなかった。ＧＫＡＰ１については、癌での発現について報告されていないことから、以後、ＧＫＡＰ１について発現解析を行った。
【００７０】
〔実施例２：ＧＫＡＰ１の発現解析〕
（１）ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析
ＧＫＡＰ１特異的プライマーとして、
G-SN（sense: 5’-CATTGTCAAACCCAGTACAG-3’、配列番号３）
G-ASN（antisense: 5’-CTTTCAGAACCACTTCCTGG-3’、配列番号４)
を使用した。プライマーはＤＮＡ合成機で合成した。
【００７１】
ヒト正常組織由来ｃＤＮＡ（MTC panel, BD Biosciences Clontech）は購入した。
【００７２】
癌組織は、４人の胃癌患者から手術あるいは生検によって得られた組織の提供を受け、それぞれ癌部と非癌部を得た。なお、実施例１および２に用いた癌患者または健常人由来の試料は、すべて、あらかじめ担当医により口頭および文書で直接提供者に説明し、インフォームドコンセントを得たものについてのみ提供を受けた。癌患者または健常人由来の試料は匿名化を行い、個人情報は厳重に保護したうえで研究に用いた。本研究の内容およびインフォームドコンセントのための説明文書および同意文書については、岡山大学大学院医歯薬学研究科「ヒトゲノム・遺伝子解析研究」倫理委員会の承認を受けている。
【００７３】
癌細胞株として、５種類の大腸癌細胞株、７種類の肺癌細胞株、５種類の悪性黒色腫細胞株、２種類の卵巣癌細胞株を用いた。これらのうち、肺癌細胞株ＫＭ、並びに卵巣癌細胞株Ｏ−３２およびＯ−３７は、本発明者らが独自に樹立した細胞株である。悪性黒色腫細胞株については米国スローン・ケタリング癌研究所で樹立されたものであり、当該研究所から本発明者らが入手したものである。これら以外の細胞株は、癌研究に一般に用いられているものであり、通常、公知の細胞保存機関等から入手可能である。
【００７４】
癌組織および癌細胞株については、それぞれｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し（RNeasy; Qiagen, Hilden, Germany）、ＭＭＬＶ逆転写酵素とｏｌｉｇｏ（ＤＴ）１５プライマーによりｃＤＮＡを合成した（Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK）。ＲＴ−ＰＣＲは変性９４℃、１分、アニーリング６０℃、１分、伸長７２℃、１分３０秒を３２サイクル行った。正常組織についてはさらに３サイクル延長し、３５サイクルでもＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動で解析した。合成したｃＤＮＡについて同時にＧ３ＰＤＨ遺伝子の増幅を確認した。
【００７５】
（２）ノザンブロット法による発現解析
ヒト正常組織におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現をノザンブロットにより解析した。精巣ｃＤＮＡを上記ＧＫＡＰ１特異的プライマー（G-SNおよびG-ASN）を用いてＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離・精製した後、ランダムプライム標識法により32Ｐで標識し、これをＧＫＡＰ１特異的プローブとして用いた。なお、当該ＧＫＡＰ１特異的プローブの塩基配列を配列番号５に示した。32Ｐ標識ＧＫＡＰ１特異的プローブを用いて６５℃、１７時間ハイブリダイズし（BD MTN Multiple Tissue Northern Blots; BD Biosciences Clontech）、バイオ・イメージアナライザＢＡＳ−２０００ＩＩ（Fuji Film）で解析した。
【００７６】
（３）発現解析の結果
図２に、ＲＴ−ＰＣＲによるヒト正常組織のＧＫＡＰ１遺伝子発現解析結果を示した。
図２に示したように、調べた１６種類の正常組織のうち精巣にのみ発現がみられ、他の１５種類の正常組織には発現がみられなかった。
【００７７】
図３に、ノザンブロット法によるヒト正常組織のＧＫＡＰ１遺伝子発現解析結果を示した。図３に示したように、精巣に約１．８ｋｂの強いハイブリダイズシグナルがみられた。
【００７８】
図４に、４人の胃癌患者の胃癌手術摘出組織より得た、癌部および非癌部におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示した。図４に示したように、患者４の癌部に弱いＧＫＡＰ１遺伝子の発現が認められた。
【００７９】
図５に、乳癌組織および頭頸部癌組織におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示した。図５に示したように、乳癌組織では４例中１例にＧＫＡＰ１遺伝子の発現が認められた。頭頸部癌組織では２８例中９例にＧＫＡＰ１遺伝子の発現が認められた。図５にはその代表例として１１例の結果を示している。
【００８０】
図６に、癌細胞株におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示した。図６に示したように、肺癌細胞株で７例中２例に強い発現が認められ、他の５例の肺癌細胞株にも弱い発現が認められた。悪性黒色腫では５例中３例に弱い発現が認められた。一方、大腸癌細胞株、卵巣癌細胞株には発現は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は癌の診断に用いるものであり、臨床検査薬産業、試薬産業、医療機器産業等において利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ＳＥＲＥＸ法の概略を示す図である。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲによるヒト正常組織のＧＫＡＰ１遺伝子発現解析結果を示す画像である。
【図３】ノザンブロット法によるヒト正常組織のＧＫＡＰ１遺伝子発現解析結果を示す画像である。
【図４】胃癌手術摘出組織より得た癌部および非癌部におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す画像である。
【図５】乳癌組織および頭頸部癌組織におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す画像である。
【図６】癌細胞株におけるＧＫＡＰ１遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す画像である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、
被検体由来の試料において、配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドのレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程、および
上記ポリヌクレオチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程
を包含することを特徴とする癌診断方法。
【請求項２】
被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、
被検体由来の試料において、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドのレベルを測定するポリペプチド測定工程、および
上記ポリペプチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程
を包含することを特徴とする癌診断方法。
【請求項３】
被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、
被検体由来の試料において、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定する抗体測定工程、および
上記抗体のレベルを正常レベルと比較する比較工程
を包含することを特徴とする癌診断方法。
【請求項４】
上記癌が上皮系腫瘍または皮膚癌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌診断方法。
【請求項５】
上記癌が胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌診断方法。
【請求項６】
被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、
配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドを備えることを特徴とするキット。
【請求項７】
被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、
配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えることを特徴とするキット。
【請求項８】
被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、
配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドを備えることを特徴とするキット。
【請求項９】
上記癌が上皮系腫瘍または皮膚癌であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の癌診断方法。
【請求項１０】
上記癌が胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の癌診断方法。
【請求項１】
被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、
被検体由来の試料において、配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドのレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程、および
上記ポリヌクレオチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程
を包含することを特徴とする癌診断方法。
【請求項２】
被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、
被検体由来の試料において、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドのレベルを測定するポリペプチド測定工程、および
上記ポリペプチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程
を包含することを特徴とする癌診断方法。
【請求項３】
被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、
被検体由来の試料において、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定する抗体測定工程、および
上記抗体のレベルを正常レベルと比較する比較工程
を包含することを特徴とする癌診断方法。
【請求項４】
上記癌が上皮系腫瘍または皮膚癌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌診断方法。
【請求項５】
上記癌が胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌診断方法。
【請求項６】
被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、
配列番号１に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドを備えることを特徴とするキット。
【請求項７】
被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、
配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えることを特徴とするキット。
【請求項８】
被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、
配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドを備えることを特徴とするキット。
【請求項９】
上記癌が上皮系腫瘍または皮膚癌であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の癌診断方法。
【請求項１０】
上記癌が胃癌、大腸癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の癌診断方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−６１５３６（Ｐ２００８−６１５３６Ａ）
【公開日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２４０７８７（Ｐ２００６−２４０７８７）
【出願日】平成１８年９月５日（２００６．９．５）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月５日（２００６．９．５）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
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