発光シグナルの増強
インビトロおよびインビボ細胞におけるルシフェラーゼ生物発光を測定するための方法および組成物が記述される。本組成物は、緩衝液の組成を変更することによって、少なくとも１つの、シグナルの安定性またはシグナルの程度の増強を提供する。１つ以上の以下のパラメータを変更した。ＥＤＴＡの存在下または非存在下、ＮａＣｌの濃度、コエレンテラジンの濃度、イオン性および非イオン性界面活性剤の評価、界面活性剤の量、どのようにして界面活性剤が加えられたか、およびシグナルが記録された期間。デュアルレポーターシステムもまた開示されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ルシフェラーゼは、光を放射する反応を触媒する酵素である。ルシフェラーゼは、甲虫（ホタル）（たとえば第５，６４１，６４１号を参照のこと）または海洋生物のようなこれらの供給源生物にしたがって命名される。生物発光海洋動物の例には、シーパンジーとしても知られているＲｅｎｉｌｌａが含まれ、このＲｅｎｉｌｌａは花虫類動物としても知られている腔腸動物のクラスに属する。Ｒｅｉｌｌａに加えて、他の代表的なクラス花虫類動物の生物発光属には、Ｃａｖａｒｎｕｌａｒｉａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ、ＡｃａｎｔｈｏｐｔｉｌｕｍおよびＰａｒａｚｏａｎｔｈｕｓが含まれる。これらの生物のすべてが生物発光性であり、適切な生物学的条件下で基質（ルシフェリン）上の酵素（ルシフェラーゼ）の活性の結果として光を放射する。先の研究によって、すべての上述花虫類動物が、同様のルシフェラーゼおよびルシフェリンを含むことが示された。たとえば、Ｃｏｒｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８１：２９１−２９８（１９７３）を参照のこと。これらの花虫類動物のそれぞれからのルシフェラーゼおよびルシフェリンは、互いに交差反応して、Ｒｅｎｉｌｌａ抽出物中で観察される特徴的な青色発光を産出する。これらのルシフェラーゼのそれぞれが、同様の生化学的特性を有し、生物発光のための生化学的要件が、ルシフェラーゼが由来する花虫類動物に関わらず、同一であることが報告された（米国特許第５，２９２，６５８号）。
【０００２】
異なるルシフェラーゼは、基質特異性および光放射の強度および生物発光シグナルの安定性に関して異なった特性を有し、一般的に照度計によって測定される。ルシフェラーゼは、転写レポーター遺伝子として、および生きている対象におけるレポーター遺伝子発現を画像化することにおいて、また分子生物学における多くの他の適用において、有用である。
【０００３】
基質としてコエレンテラジンルシフェリンを用いるルシフェラーゼは、ハイスループットスクリーニングのような特定の分子生物学的反応のために有用であり得る程度の生物発光の閃光を産出する。とりわけこのルシフェラーゼを使用することにより、生物発光シグナルの時間がより長くなるので有利である。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の実施形態において、コエレンテラジン基質、生理食塩水中での濃度より低い濃度の塩化ナトリウム、および界面活性剤を含むルシフェラーゼアッセイ緩衝液が提供され、このアッセイ緩衝液は、約３０秒から約１分より長い時間、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼによる生物発光を検出するのに適しており、たとえば、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発光が、このルシフェラーゼへのアッセイ緩衝液の添加時から少なくとも約３０秒の時間にわたって照度計にて検出され得る。また、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼによる生物発光は、アッセイ緩衝液の添加時から少なくとも１分間の時間にわたって、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発光に加算されて検出可能である。アッセイ緩衝液は、この使用のための取扱説明書とともに、キットに組み込み得る。
【０００５】
以上のアッセイ緩衝液の例において、塩化ナトリウムは、約０．０１から０．１５Ｍの範囲の濃度であり、好ましくはカルシウムまたはマグネシウムイオンを含まず、約３％以下の濃度のＥＤＴＡを場合により含む。アッセイ緩衝液は、約０．００１％から０．５％の範囲の濃度の非イオン性界面活性剤をさらに含んでもよい。緩衝液中で使用し得る界面活性剤の例には、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６５０（ＮＰ４０）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０およびデオキシコレート（ＤＯＣ）が含まれる。
【０００６】
本発明のさらなる実施形態において、ルシフェラーゼアッセイ緩衝液は、約５μＭ以下の濃度のコエレンテラジンを含む。
【０００７】
本発明のさらなる実施形態において、塩濃度が約０．０１から０．１５Ｍの範囲であり、コエレンテラジンが５μＭ未満の濃度であり、さらに、約０．００１％から０．５％の範囲の濃度の非イオン性界面活性剤を含むルシフェラーゼアッセイ緩衝液が提供される。アッセイ緩衝液は、この使用のための取扱説明書とともに、キットに組み込み得る。
【０００８】
本発明のさらなる実施形態において、コエレンテラジン濃度が約１μＭから５μＭであり、非イオン性界面活性剤が少なくとも約０．０５％の濃度であり、さらにＥＤＴＡを含むルシフェラーゼアッセイ緩衝液が提供され、そこで、アッセイ緩衝液は、少なくとも２分間の時間にわたって、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発光放射を安定化することが可能である。本緩衝液を用いる方法には、この緩衝液を選択すること、およびこれをルシフェラーゼに加えることが含まれる。
【０００９】
本発明のさらなる実施形態において、非イオン性界面活性剤が約０．０５％未満の濃度であるルシフェラーゼアッセイ緩衝液が提供され、このアッセイ緩衝液は、ＥＤＴＡの非存在下で、少なくとも３０秒間の時間、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発光の程度を増強することが可能である。本緩衝液を用いる方法には、この緩衝液を選択すること、およびこれをルシフェラーゼに加えることが含まれる。本方法の例において、４μＭのコエレンテラジン濃度が選択される。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態において、単一調製物中で第一および第二ルシフェラーゼを測定するための方法が提供され、そこで、本方法には、以下の段階、（ａ）ベンジルコエレンテラジンを含む第一アッセイ緩衝液、およびコエレンテラジンを含む第二緩衝液を調製する段階、（ｂ）前記ベンジルコエレンテラジンを細胞調製物に加えて第一ルシフェラーゼによる生物発光の量を測定する段階、（ｃ）前記コエレンテラジンを加えて第一および第二ルシフェラーゼによる生物発光の量を測定する段階、および（ｄ）段階（ｂ）と段階（ｃ）とにおける生物発光の差を計算して、第二ルシフェラーゼによる生物発光の量を決定する段階、が含まれる。第一ルシフェラーゼの例はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼであり、第二ルシフェラーゼの例は、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼである。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態において、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼをコードする遺伝子で形質転換された細胞を直接検出するための方法が提供され、そこで上で記述したアッセイ緩衝液を、培養培地中の細胞に加え、生物発光を裸眼または顕微鏡で検出する。さらに、細胞は、標的タンパク質をコードする遺伝子と融合したＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼを発現するプラスミドと、標的タンパク質を指向するｓｉＲＮＡをコードしている遺伝子とで同時形質移入（または共トランスフェクション）され得る。これは、遺伝子サイレンシングのために種々のｓｉＲＮＡをスクリーニングするために有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
インビトロおよびインビボ（細胞内）でのコエレンテラジン依存ルシフェラーゼ生物発光を測定するための方法および組成物が記述されている。組成物は、緩衝液の組成を変更することによって、少なくとも１つの、シグナルの安定性の増強またはシグナルの程度の増強をもたらす。１つ以上の以下のパラメータを変化させた。ＥＤＴＡ（またはＣＤＴＡ）、カルシウムおよびマグネシウムイオンの存在または非存在、ＮａＣｌの濃度、コエレンテラジンの濃度、イオン性および非イオン性界面活性剤の効果、界面活性剤の量、どのようにして界面活性剤が加えられたか、およびシグナルが記録された期間。デュアルレポーターシステムもまた開示されている。
【００１３】
コエレンテラジン依存ルシフェラーゼ（たとえば、ＷＯ９９／４９０１９）には、Ｇａｕｓｓｉａ、Ｒｅｎｉｌｌａ、ＰｌｅｕｒｏｍａｍｍａおよびＭｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼおよびこの変異体が含まれる。コエレンテラジンを利用するルシフェラーゼを有する属には、Ｃｈｉｒｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｅｕｃｌｅｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｏｎｙｃｈｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｗａｔａｓｅｎｉａ、ｃｕｔｔｌｅｆｉｓｈ、ＳｅｐｉｏｌｉｎａおよびＯｐｌｏｐｈｏｒｉｏｕｓ、Ａｃａｎｔｈｏｐｈｙｒａ、ＳｅｒｇｅｓｔｅｓおよびＧｎａｔｈｏｐｌａｕｓｉａのようなエビ、Ａｇｒｙｏｐｅｌｅｃｕｓ、Ｙａｒｅｌｌａ、Ｄｉａｐｈｕｓ、ＧｏｎａｄｏｓｔｏｍｉａｓおよびＮｅｏｓｃｏｐｅｌｕｓのような深海魚が含まれる。これらのルシフェラーゼは、このベースライン生物発光の点で異なる。たとえば、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、哺乳動物細胞内で発現した場合に、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼよりも千倍以上明るい。しかしながら、以下で示すように、例示された３つのコエレンテラジン依存ルシフェラーゼ（組換え体細菌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、哺乳動物細胞によって分泌されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、および細胞溶解物からのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）について、初期生物発光シグナルの程度を増強する、次いで時間とともに安定化するための条件は、特定の活性の差違にも関わらず同様である。このことは、一般的に、これらのパラメータがコエレンテラジン依存ルシフェラーゼに適用可能であることを示唆している。
【００１４】
ＰＢＳ、高モル濃度塩（たとえば０．５Ｍ ＮａＣｌ）および高モル濃度コエレンテラジン（たとえば２０μＭ）を含むアッセイ緩衝液中のルシフェラーゼ活性は、２分未満の間に光産出の９０％が失われ不安定である。非コエレンテラジン依存ルシフェラーゼ、たとえばジチオスレイトール（ＤＴＴ）および補酵素Ａの明反応の安定化剤が、ホタルルシフェラーゼとともに使用される。
【００１５】
本発明の実施形態において、ＥＤＴＡを緩衝液から除き、使用したコエレンテラジンの量を５μＭまで増加させた場合に、短期および長期両方でのコエレンテラジン依存ルシフェラーゼアッセイにおいて、１０倍も大きな生物発光を産出可能であるルシフェラーゼアッセイ緩衝液が提供される。この効果は、表３で例示している。試験した異なるルシフェラーゼによる生物発光シグナルの程度および安定性についての種々のアッセイ条件の効果を表７に要約している。アッセイ緩衝液の特定の実施形態において、少なくとも４５分までにわたる発光の維持が提供される。この効果の例は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに関して表４で、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに関して表５で示している。
【００１６】
実施例には、ＧａｕｓｓｉａおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの解析が含まれるが、他のルシフェラーゼは容易に試験可能であり、好ましい条件が本明細書で記述されたパラメータおよびアッセイを用いて決定される。
【００１７】
コエレンテラジン依存ルシフェラーゼを測定するために確立された実施の慣用は、少なくとも１つのＥＤＴＡ、カルシウム／マグネシウムイオン、高濃度の界面活性剤（１％以上）、高濃度の塩（０．５Ｍ以上）および比較的高いレベルのコエレンテラジン（１０μＭ以上）を含むアッセイ緩衝液を利用することである（Ｔａｎｎｏｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．１１（３）：４３５−４３（２００５））。
【００１８】
本発明の特定の実施形態は、ＥＤＴＡを必要とせず、また、カルシウムおよびマグネシウム塩が、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼによる生物発光のシグナル強度を延長すること、または程度を増加させることに対して有害であることを立証する。しかしながら、任意のまたはすべての以下の成分が、シグナルの程度および安定性の少なくとも１つを増加させるために有益であることが発見された。すなわち、低濃度のＮａＣｌ（０．５Ｍ未満）、界面活性剤（１％ｖ／ｖ未満）、および低濃度のコエレンテラジン（１０μＭ以下）は、短期間にわたる生物発光の程度の改善を示している。界面活性剤に加えてＥＤＴＡを加えることが、１分より長い時間にわたる発光シグナルの安定性を改善するための助けとなり、必要である（図１２から１５）。さらに、図１５は、特に、界面活性剤をルシフェラーゼに直接加えた試料（◆）に関して、図１３における４μＭコエレンテラジンと比較して、１．３μＭコエレンテラジンを使用した場合に、改善された安定性プロファイルが得られることを示している。
【００１９】
（Ｐｒｏｌｕｍｅ／ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，Ａｒｉｚｏｎａのような）供給業者によって推奨されるコエレンテラジンの濃度は、本実施形態に対して必要な濃度よりはるかに高かった。ベンジルコエレンテラジンが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに対する効果的な基質であるとわかったが、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに対する基質としては適切ではなかった（たとえば図８、９および表６を参照のこと）。実施例２は、これらの異なる基質特異性がどのようにしてデュアルレポーターシステムにおいて使用可能であるかを記述している。
【００２０】
細菌ルシフェラーゼに対する種々の条件の効果を、表２、６および７、および図４ｂおよび８に例示し、哺乳動物細胞からの分泌ルシフェラーゼに関しては、表１、３、５、６および７および図１、２、３、４Ａ、８、１０から１５、１６および１７にて、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに関しては、表３、４、６および７、および図６、７および９にて例示している。
【００２１】
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性に対する、アッセイ緩衝液中のＮａＣｌ濃度の増加の効果を、ＮＰ４０界面活性剤およびＥＤＴＡの非存在下、およびＮＰ４０およびＥＤＴＡの存在下で、表１に示している。表１は、ＥＤＴＡの非存在下でのＮａＣｌの増加が生物発光を減少させたが、ＥＤＴＡおよびＮＰ４０の存在がこの効果を逆転させたことを示している。これは、Ｐｅｒｉｐｈｙｌｌａによる高塩濃度に対する要求に関して報告しているＳｈｉｍｏｍｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．２０１：３３９−３４７（２００１）の観察とは反対である。
【００２２】
低濃度（０．５％以下）でのＮＰ４０界面活性剤の、アッセイ試薬への添加が、結果として、文献中で報告されたアッセイ組成物、および市販されているものと比較して、ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに対する発光活性の有意な増加、ならびに発光シグナルの安定性の有意な改善をもたらした。
【００２３】
ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに関して、界面活性剤の範囲を試験した（図２、３、６および７）。０．００１％から０．５％の界面活性剤が、発光を増強することがわかった。たとえば、０．０２％の界面活性剤が、コエレンテラジンの添加後最初の４分以内に生物発光の程度の増強において効果的であることがわかった。安定化効果の改善が、たとえば０．２％まで界面活性剤の濃度を増加させた場合に、長時間にわたって観察された。
【００２４】
低濃度の界面活性剤、たとえばＮＰ４０が、バックグラウンド活性においてほとんど変化を示さずに、発光シグナルを安定化および増強させたことが示された（図２、３、６および７）。
【００２５】
コエレンテラジン／ＰＢＳを含むアッセイ緩衝液を加える前に、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ調製物に直接界面活性剤を加えることによって、アッセイ緩衝液に界面活性剤を加える場合と比較してシグナルの安定性が増加した。ルシフェラーゼとともに使用する前にアッセイ緩衝液に界面活性剤を加えることによって、初期シグナルの程度が増加した（図１２から１５）。
【００２６】
本発明の実施形態において、コエレンテラジンを、酸化脱水エタノール中で安定化し、１から５μＭの範囲の濃度でアッセイ緩衝液に加えた。この濃度範囲は、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性の改善のために効果的であった（図４Ａおよび４Ｂを参照のこと）。この量のコエレンテラジンは実質的に、Ｔａｎｎｏｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．１１（３）：４３５−４３（２００５）によって先に報告された２０μＭという最小値よりも少ない。
【００２７】
本発明の実施形態において、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼを測定するためにキットが提供される。このキットには、アッセイ緩衝液および取扱説明書が含まれる。キットはたとえば、細胞集団、細胞溶解物およびタンパク質溶液に対して使用し得る。
【００２８】
コエレンテラジン依存ルシフェラーゼによる生物発光シグナルの程度および／または安定性を変えるための条件の操作によって、結果として種々の応用例のために好適である産物がもたらされる。応用例には、トランスフェクトしたルシフェラーゼまたはルシフェラーゼタグ化抗体を用いる生物発光腫瘍のインビボ可視化のための腫瘍イメージング、遺伝子発現のリアルタイム解析、薬物ディスカバリーのため、または遺伝子サイレンシングＲＮＡに関するスクリーニングのためのハイスループットスクリーニング、細胞内伝達経路解析および免疫診断／酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。
【００２９】
本明細書で記述されたような、および少なくとも２分間にわたり、生物発光の延長を与える例において記述されたようなアッセイ試薬の使用が、このような応用例に対して望ましい。タンパク質−タンパク質相互作用を、スピリットルシフェラーゼを用いてモニタし得る。レポーターとしてコエレンテラジン依存ルシフェラーゼを含む生存アッセイを、細菌、真菌またはウイルスを殺すこと、および環境ストレスに対する応答をモニタすることにおいて、異なる薬物の効果を測定するために使用可能である。
【００３０】
ルシフェラーゼを使用して、標的ＤＮＡ配列とのオリゴヌクレオチド相互作用を同定および定量し得る。対象のオリゴヌクレオチドをルシフェラーゼでタグ化し、次いで、チップまたはマイクロタイターディッシュ上の固定化標的ＤＮＡに対して暴露する。対象のオリゴ配列と相互作用可能なＤＮＡ配列を含むウェルは、ルシフェラーゼを用いて可視化可能である。本発明の実施形態において、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを、任意の上述の応用例のために使用可能である。生物発光反応のためのアッセイ試薬または緩衝液の選択は、これが２から４分間まで維持される生物発光の初期バーストを最大化するために好ましいかどうか、またはルシフェラーゼ基質の添加後１０から１５分の時点で簡単に検出可能である安定化シグナルをもつために望ましいかどうかに依存する。したがって、１％ ＥＤＴＡの添加、０．２％ 界面活性剤のようなより高い濃度の界面活性剤、またはたとえば４から６μＭまでのより高い濃度のコエレンテラジンのような本明細書で記述した任意の条件の変更を、初期シグナルの安定性を増加させる、または大きさを増加させるために使用し得る。
【００３１】
本アッセイのさらなる使用は、リアルタイムでのｓｉＲＮＡを用いる遺伝子サイレンシングを決定するためのインビボ実験に関する。生物発光を繰り返し測定可能であり、細胞溶解を必要としないので、分泌されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、細胞内Ｒｅｎｉｌｌａおよびホタルルシフェラーゼに対して有利な点を有する。
【００３２】
以上および以下で引用したすべての参考文献、ならびに米国特許仮出願第６０／６５９，１５２号が、参考によって本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【００３３】
アッセイ試薬組成の最適化
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、カイアシ、Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓよりクローン化された（Ｂａｌｌｏｕ ｅｔ ａｌ，１１ｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ａｓｉｌｏｍａｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（２０００），Ｖｅｒｈａｅｇｅｎｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７４：４３７８−８５（２００２），Ｔａｎｎｏｕｓ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１１（３）：４３５−４３（００５），Ｓｉｏｕｘｓｉｅ Ｗｉｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３４２７−３４３２（２００５），Ｓｖｅｔｌａｎａ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３２１２−３２１７０（２００４））。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ，１８５ａａ，１９．９ｋＤａ）は、公知の最も小さなルシフェラーゼであり、天然に分泌される。このルシフェラーゼは、６００ｎｍまで広がる広い放射スペクトルを有し、４８０ｎｍのピークにて光を放射する（Ｔａｎｎｏｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１（３）：４３５−４３（２００５））。
【００３４】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、Ｐｒｏｌｕｍｅ／ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，Ａｒｉｚｏｎａより市販されている。組換え体細菌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、Ｐｒｏｌｕｍｅ／ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，Ａｒｉｚｏｎａより得た。
【００３５】
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、図１６で示したベクターを用いた細胞のトランスフェクション後に、哺乳動物細胞より分泌された。
【００３６】
実施例中で使用した試薬には、ＰＢＳ（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ），Ｃａ／Ｍｇ／Ｋを有するＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ），ＮＰ４０として明細書中で使用したＩｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），標準Ｒｅｎｉｌｌａアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、コエレンテラジンおよびベンジルコエレンテラジン（Ｐｒｏｌｕｍｅ／ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，Ａｒｉｚｏｎａ），哺乳動物中のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼのための発現ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ），哺乳動物および細菌発現Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを希釈するために使用したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が含まれる。生物発光の測定は、照度計（Ｔｕｒｎｅｒ ＴＤ２０２０照度計、Ｔｕｒｎｅｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にて実施した。
標準Ｇａｕｓｓｉａアッセイ試薬の処方
以下のストック溶液を、種々のアッセイ緩衝液の調製にて使用した。１０×ＰＢＳのストック溶液を、ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏより購入した。２％ ＥＤＴＡのストック溶液を、最終容量１００ｍｌまで水中に２ｇのＥＤＴＡを溶解することによって調製した。
【００３７】
２％界面活性剤を含むストック溶液、すなわちＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０またはＤＯＣの２％ ｖ／ｖストック溶液は、２ｍｌの界面活性剤溶液を９８ｍｌの水に加えることによって調製した。２％ ＳＤＳのストック溶液は、２ｇｍｓのＳＤＳを水中に溶解し、最終客積１００ｍｌにすることによって調製した。０．２％界面活性剤を含むストック溶液は、水による２％ストック溶液の１：１０希釈によって調製した。
【００３８】
ＰＢＳ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤を含むアッセイ緩衝液は、適切な量のストック溶液を水中に希釈し、ＰＢＳ、ＥＤＴＡまたは界面活性剤の所望の最終濃度を得ることにより調製した。
【００３９】
コエレンテラジンまたはベンジルコエレンテラジンを、以下のように酸化脱水エタノール中に希釈した。３ｍｇのコエレンテラジンを、１ｍｌ無水エタノールおよび２５μｌ ２Ｎ ＨＣＬと混合した。エタノールを、４：１（すなわち酸性エタノール中１ｍｌのコエレンテラジンに対して４ｍｌのエタノール）の比で加え、コエレンテラジンまたはベンジルコエレンテラジンの１００×濃縮ストック溶液を調製した。このコエレンテラジン溶液の一定量を、１から１０μＭの範囲の最終濃度を得るまでアッセイ緩衝液に加えた。５０μｌのアッセイ緩衝液を、２０μｌのルシフェラーゼを含む試料と混合し、生物発光を照度計を用いて測定した。
コエレンテラジン依存ルシフェラーゼによるシグナルの程度および／または維持の改善のための条件の同定
１．Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼによるシグナルの程度に対する、カルシウム／マグネシウム、およびまたはＥＤＴＡの効果の決定
ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，Ａｒｉｚｏｎａから得た粉末化細菌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼの一定量を、ＤＭＥＭ中に溶解し、照度計より読み取りが得られるまで、対照アッセイ緩衝液中で希釈した。図１で示した結果は、０．５×ＰＢＳ、０．５×ＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ、０．５×ＰＢＳ／１％ ＥＤＴＡおよび０．５×ＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ／１％ ＥＤＴＡからなる３種のアッセイ緩衝液を利用しており、各緩衝液はさらに、１．３μＭコエレンテラジンを含む。最良の結果が、コエレンテラジンに加えてＰＢＳのみで得られ、カルシウム、マグネシウムまたはＥＤＴＡのいずれか、またはそれらの両方の存在下での場合よりもシグナルが約５倍大きかった。
【００４０】
２．Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に対する、アッセイ試薬中の、０．０２％ ｖ／ｖの濃度を有する異なる界面活性剤の効果の決定
本実施例において、２０μｌの哺乳動物Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ試料（細胞上清）を、２％および０．２％濃度で、８μｌの指示された界面活性剤（アッセイ溶液中の界面活性剤の最終濃度が０．２％および０．０２％であった）、および５０μｌのＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイ試薬（０．５×ＰＢＳ、ＥＤＴＡなし、１．３μＭコエレンテラジン）と混合し、Ｔｕｒｎｅｒ ＴＤ２０２０ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ，Ｔｕｒｎｅｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａで読んだ。試料を１５分後に再び読み、異なる界面活性剤の存在下での、発光シグナルの安定性を評価した。異なる試薬を使用した結果を、図２、３および表６（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに関して）およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに関して図６で示している。ＧａｕｓｓｉａおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ両方に対して、最適な安定性が、ＮＰ４０およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて観察された。
【００４１】
３．哺乳動物分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性および組換え体細菌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに対する、アッセイ試薬中の異なる濃度のコエレンテラジンの効果の決定（図４Ａおよび４Ｂ）
精製した哺乳動物分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを、０．５×ＰＢＳ＋１％ ＥＤＴＡ、０．２％ ＮＰ４０、および１．３μＭ、４μＭ、６μＭ、１２μＭ、および２５μＭの（図４Ａ）の、または１．３μＭ、３．８μＭ、４μＭ、６μＭ、１２μＭ、および２５μＭのコエレンテラジンのアッセイ試薬中で試験した。
【００４２】
２つの異なる濃度のコエレンテラジン（１．３μＭおよび４μＭ）の効果を、１％ ＥＤＴＡの存在下、または非存在下、および０．２％または０．０２％ ＮＰ４０の使用をまたＧａｕｓｓｉａおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに関して試験した、アッセイ試薬中でさらに調査した（表３）。表４は、０、７、２０および８０分の時間間隔でのＥＤＴＡの非存在下で、異なる濃度のＮＰ４０およびコエレンテラジンの効果を示している。
【００４３】
４．ベンジルコエレンテラジンでのコエレンテラジンの置換
Ｇａｕｓｓｉａｎルシフェラーゼは、基質としてのベンジルコエレンテラジンの使用に対してほとんど応答しない（表３を参照のこと）。しかしながら、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、ベンジルコエレンテラジンにて有意に増強したシグナルを産出し、このシグナルは、基質としてコエレンテラジンを使用したものと比べて、比較的安定している（図９および表６）。
【００４４】
５．アッセイ試薬中の種々の濃度のＮａＣｌの効果
０．５×ＰＢＳおよび１．３μＭコエレンテラジンからなるアッセイ試薬中でのＮａＣｌの濃度の変化の効果は、約０．５Ｍ ＮａＣｌをより高い濃度では、生物発光を低下させた。この効果は、０．０２５％ ＮＰ４０および１％ ＥＤＴＡがまた存在する場合には有意ではなかった（表１）。
【００４５】
６．生物発光シグナルの程度および安定性に関するアッセイ試薬へのＥＤＴＡの添加の効果を、表２および図１２から１５にて示している。１％ ＥＤＴＡは、シグナルの初期の程度を低下させる効果を有するが、長期にわたると生物発光のより安定したプロファイルをもたらした。
【００４６】
０から１２０秒および０から約１０００秒にわたる、ＥＤＴＡの存在下、または非存在下でのコエレンテラジンの量（４μＭまたは１．３μＭ）で、ルシフェラーゼに直接加えたか、またはアッセイ試薬に加えたＮＰ４０の量の変化（０．０２％または０．２％）の効果を、哺乳動物分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに関して、図１０から１５および表７にて要約している。表７はまた、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼおよび細菌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに関して、以上にしたがった条件の変更の効果を要約している。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
【表４】
【００５１】
【表５】
【００５２】
【表６】
【００５３】
【表７】
【実施例２】
【００５４】
デュアルレポーターシステム
１．ＲｅｎｉｌｌａおよびＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼを使用したデュアルレポーターシステムが本明細書で記述されている。
【００５５】
本システムは、ＲｅｎｉｌｌａおよびＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの活性に対する表６および図８および９で示した基質ベンジルコエレンテラジンの異なる効果によっている。この効果は、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼが哺乳動物細胞から分泌される一方で、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは分泌されないので、さらに利用可能である（図１５を参照のこと）。図１７は、９６．２％のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼが上清培地中に分泌され、約３．８％のみが細胞に結合することを示している。したがって、多重遺伝子発現システムは、レポーターとしてＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ両方を用いて同時に測定可能である。したがって、これらのルシフェラーゼをコードするＤＮＡは、共トランスフェクションによって、哺乳動物細胞の集団に導入可能である。細胞内Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの量は、基質としてベンジルコエレンテラジンを用いて決定可能であり、一方で、分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性の量は、基質としてコエレンテラジンを用いて決定可能である。コエレンテラジンが、ＧａｕｓｓｉａおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ両方に対する基質であるので、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼの定量を、ベンジルコエレンテラジンを用いて得られた値からコエレンテラジンを用いた生物発光を差し引くことによって決定可能である。
【００５６】
アッセイ試薬（０．４×ＰＢＳ、０．０２５％ ＮＰ４０、１．３μＭ コエレンテラジン）を使用して、８日間にわたる、トランスフェクトヒト胎児腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞の細胞上清中のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性を評価した（図１２を参照のこと）。時間経過実験の最後に、細胞の集団をまた、分泌されないＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを発現するプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした場合には、細胞を溶解し、０．５×ＰＢＳ、０．２％ ＮＰ−４０、４ｕＭベンジルコエレンテラジンを用いてアッセイ可能である。
【００５７】
ホタルルシフェラーゼ／Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーターシステムに対する本明細書で記述したデュアルレポーターシステムの利点は、時間経過または薬物応答実験を、毎時点での細胞融解の必要なしに、（上清中のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性をアッセイすることによって）同一の群のトランスフェクト細胞の上で実施可能であることである。実験の最後に、細胞を溶解し、細胞溶解物をＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に関してアッセイ可能である。
【００５８】
２．ホタルおよびＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼに基づくデュアルルシフェラーゼアッセイ
９５％のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼが上清培養中に分泌され、約５％のみが細胞結合であった（図１５）。対象の遺伝子の活性を、レポーターとして、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを用いて研究可能である。トランスフェクション効率の正規化を、ホタルルシフェラーゼを発現する発現ベクターを用いた共トランスフェクションによって実施する。デュアルアッセイ試薬を、（基質としてホタルルシフェリンを用いる）細胞結合ホタルルシフェラーゼ活性と（基質としてコエレンテラジンを用いる）分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性の、同時解析のために処方する（表７を参照のこと）。
【００５９】
現在使用されるホタルルシフェラーゼ／Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーターシステムに対する今回提案されるデュアルルシフェラーゼアッセイシステムの利点は、時間経過または薬物応答実験を、毎時点での細胞融解の必要なしに、（上清中のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性をアッセイすることによって）同一の群のトランスフェクト細胞の上で実施可能であることである。実験の最後に、細胞を溶解し、細胞溶解物をホタルルシフェラーゼ活性に関してアッセイ可能である。
【００６０】
３．たとえば、ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼとＶａｒｇｕｌａルシフェラーゼを用いる生細胞調製物中のデュアルレポートシステム（ＷＯ９９／４９０１９）
２つの異なるプロモーターからの遺伝子発現の同時解析のための生細胞デュアルアッセイが、２つの異なるプラスミドベクターで細胞をトランスフェクトすることによって開発されてきており、異なるプロモーターの制御下で１つのベクターはＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼを発現しており、第二のベクターは、Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼを発現している。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを発現する構造物のプロモーター活性を、以上で記述したアッセイ緩衝液組成物を用いて研究し、細胞を溶解せずに異なる時間間隔にて細胞上清中のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性を測定可能である。
【００６１】
（Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼを発現している）第二プロモーターのプロモーター活性を、コエレンテラジンの代わりに、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼのアッセイに関して記述された組成と同一であるが、シプリジナルシフェリン（Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼのための基質）を含むアッセイ緩衝液で、細胞上清をアッセイすることによって研究可能である。
【実施例３】
【００６２】
ルシフェラーゼを発現する細胞の直接検出
ＨＥＫ−２９３細胞を、標準の組織培養技術を用いて図１８にしたがってＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼベクターでトランスフェクトした。細胞単層を形成した後、１０または５０μｌの、０．５×ＰＢＳ、０．０２５％ ＮＰ４０、０．０２％ ＮＰ４０および１．３μＭまたは４μＭコエレンテラジンを含むアッセイ溶液を、９６ウェルディッシュ中の、１００μｌ ＤＭＥＭおよび１０％ウシ胎児血清および細胞に加えた。トランスフェクト細胞を実施例１と一致した緩衝液条件にしたがって増殖させ、裸眼で同定可能である。本アッセイは、任意のコエレンテラジン依存ルシフェラーゼトランスフェクト組織培養細胞に対して機能することが予想される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】哺乳動物から分泌されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの活性に対する異なる緩衝液組成の効果を示しており、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のみの場合が、カルシウム、マグネシウムまたは／およびＥＤＴＡをＰＢＳに加えた場合よりも、有意に大きなシグナルを産出する。
【図２】哺乳動物細胞から分泌されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの活性に対する、０．５×ＰＢＳおよび１．３μＭコエレンテラジンを含むアッセイ緩衝液中の、０．０２％ ｖ／ｖ ＮＰ４０、０．０２％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２％ ｖ／ｖ ＤＯＣ、０．２％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０および０．０２％ ｗ／ｖ 硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）の効果を示している。各組における最初の４本の棒は、時間ゼロにおけるルシフェラーゼ活性を示しており、次の３本の棒は、１５分後の同一チューブ内でのルシフェラーゼ活性を示している。
【図３】哺乳動物分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性に対する、０．５×ＰＢＳおよび１．３μＭコエレンテラジンを含むアッセイ緩衝液中の、０．２％ ｖ／ｖのＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＤＯＣ、およびＴｗｅｅｎ８０の効果を示している。各組における最初の３本の棒は、時間ゼロにおけるＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性を示しており、次の３本の棒は、１５分後の同一チューブ内でのこのルシフェラーゼ活性を示している。
【図４Ａ】ゼロ時点での、哺乳動物分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性に対する、０．５×ＰＢＳ、１％ ＥＤＴＡおよび０．０２５％ ＮＰ４０を含むアッセイ緩衝液中の、種々の濃度（１．３μＭ、４μＭ、６μＭ、１２μＭおよび２５μＭ）のコエレンテラジンの効果を示している。この結果によって、４μＭより高い濃度のコエレンテラジンにて、ルシフェラーゼ活性の有意な増加はないことが示されている。
【図４Ｂ】組換え体細菌ルシフェラーゼの安定性に対する種々の濃度（１．３μＭ、３．８μＭ、４μＭ、６μＭ、１２μＭおよび２５μＭ）のコエレンテラジンの効果を示している。三つ組の試料に対する結果が、試験した各濃度のコエレンテラジンについて提供される。この結果によって、４μＭより高い濃度のコエレンテラジンにおいてはルシフェラーゼ活性の有意な増加はないことが示されている。
【図５】哺乳動物分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに対して、０から１００秒の間にわたる、標準のＰｒｏｍｅｇａ Ｒｅｎｉｌｌａアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）との、Ｇａｕｓｓｉａ安定化アッセイ試薬（０．４×ＰＢＳ、１％ ＥＤＴＡ、０．０２５％ ＮＰ４０）の比較を示している。
【図６】Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に対する、０．０２％ ｖ／ｖ界面活性剤（ＳＤＳはｗ／ｖである）の安定化効果を示している。２つの時点での三つ組の試料に対する結果が、試験した各界面活性剤について提供される。時点は、Ｔ＝０分およびＴ＝７分である。試験した界面活性剤は、水を対照として、ＮＰ４０、ＴｒｉｔｏｎＸ、ＤＯＣ、Ｔｗｅｅｎ８０およびＳＤＳであった。すべての試料において、第二時点でのシグナルの有意な欠損が存在した。
【図７】Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に対する０．２％ ｖ／ｖ界面活性剤（ＳＤＳはｗ／ｖである）の安定化効果を示している。２つの時点での三つ組の試料に対する結果が、試験した各界面活性剤について提供される。時点は、Ｔ＝０分およびＴ＝１８分である。試験した界面活性剤は、水を対照として、ＮＰ４０、ＴｒｉｔｏｎＸ、ＤＯＣ、Ｔｗｅｅｎ８０およびＳＤＳであり、ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ８０が、０．２％の濃度で安定化効果を示している。
【図８】精製組換え体細菌ルシフェラーゼ（右）または分泌哺乳動物ルシフェラーゼ（左）による生物発光の程度を測定するために、０．５×ＰＢＳおよび１％ ＥＤＴＡ（ｗ／ｖ）ならびに０．０２５％ ＮＰ４０を含む緩衝液試薬中の、１．３μＭコエレンテラジンと比較した、基質として１．３μＭ ベンジルコエレンテラジンを用いた結果を示している。結果は、ベンジルコエレンテラジンが、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに対して貧弱な基質であることを示している。
【図９】Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼによる生物発光の量および安定性を測定するために、０．５×ＰＢＳ、０．０２５％ ＮＰ４０（ｖ／ｖ）および１％ ＥＤＴＡ（ｗ／ｖ）も含む緩衝液試薬中の、１．３μＭコエレンテラジンと比較した、基質として１．３μＭ ベンジルコエレンテラジンを用いた結果を示している。結果は、ベンジルコエレンテラジンが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに対して良好な基質であり、結果として、コエレンテラジンに対して観察されたものよりも有意に大きなシグナルとなったことを示している。
【図１０】１．３μＭコエレンテラジンを用いる分泌された哺乳動物Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性の活性に対するＮＰ４０の割合を変えることの効果を示している。１８０秒までは、界面活性剤の割合を減少させるほど発光シグナルの程度が増加した。しかしながら、生物発光シグナルの安定性プロファイルは、０．１％ ＮＰ４０の場合、２２０秒までは、界面活性剤の濃度が増加するほど改善される。
【図１１】０．５×ＰＢＳ、＋／− １％ ＥＤＴＡ ｗ／ｖ、０．０２％または０．２％ ｖ／ｖ ＮＰ４０および４μＭコエレンテラジンからなるアッセイ緩衝液中の哺乳動物細胞からの分泌ルシフェラーゼを用いることの１２０秒間にわたるＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発光に対する効果を示している。時間＝ゼロでの最も大きなシグナルの程度の増強が、０．５×ＰＢＳ、ＥＤＴＡなし、０．０２％ ＮＰ４０および４μＭコエレンテラジンを用いて観察された。最も安定なシグナルが、０．２％ ＮＰ４０、０．５×ＰＢＳ、ＥＤＴＡなしおよび４μＭコエレンテラジンの好ましい緩衝液中で観察された。
【図１２】０．５×ＰＢＳ、＋／−１％ＥＤＴＡおよび０．２％ ＮＰ４０からなるアッセイ緩衝液中の哺乳動物細胞からの分泌ルシフェラーゼを用いることの１２０秒間にわたるＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発光に対する効果を示している。２つの試料（■、△）においては、界面活性剤は、４μＭコエレンテラジンを加える前に、ルシフェラーゼに加えられ、１つの試料（◆）においては、界面活性剤は、４μＭコエレンテラジンに直接加えられた。時間＝ゼロでの、最も大きなシグナルの程度の増強が、０．５×ＰＢＳ、ＥＤＴＡなし、０．２％ ＮＰ４０および４μＭコエレンテラジンを用いて観察された。最も安定なプロファイルは、４μＭコエレンテラジン、０．５×ＰＢＳおよび１％ ＥＤＴＡの前に、０．２％ ＮＰ４０を加えることで達成された。
【図１３】約１０００秒にわたる生物発光に対する効果を示している。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼが哺乳動物細胞から分泌された。４μＭコエレンテラジンおよび０．５×ＰＢＳを全体にわたって使用した。試料の違いは、１％ＥＤＴＡおよび０．２％ ＮＰ４０のそれぞれを含むか、含まないかである。最も安定なプロファイルは、コエレンテラジン／ＰＢＳ緩衝液の前に、０．５×ＰＢＳ、１％ ＥＤＴＡおよび０．２％ ＮＰ４０をルシフェラーゼに加えた場合に発生した。
【図１４】０．５×ＰＢＳ、＋／−１％ ＥＤＴＡおよび０．２％ ＮＰ４０からなるアッセイ緩衝液中の、哺乳動物細胞からの分泌ルシフェラーゼを用いることの、１２０秒間にわたる、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発生に対する効果を示している。界面活性剤は、２つの試料（■、△）にて、１．３μＭコエレンテラジンを加える前に、ルシフェラーゼに加えた。または、界面活性剤を、１．３μＭコエレンテラジンに直接加えた（◆）。時間＝ゼロにて、最も大きなシグナルの程度の増強が、０．５×ＰＢＳ、ＥＤＴＡなし、０．２％ ＮＰ４０および１．３μＭコエレンテラジンを用いて観察された。最も安定なプロファイルは、１．３μＭコエレンテラジン、０．５×ＰＢＳおよび１％ ＥＤＴＡの前に加えた０．２％ ＮＰ４０で達成された。
【図１５】１０００秒にわたる生物発光における効果を示している。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼが、哺乳動物細胞より分泌された。１．３μＭコエレンテラジンおよび０．５×ＰＢＳを全体にわたって用いた。試料の違いは、１％ＥＤＴＡおよび０．２％ ＮＰ４０のそれぞれを含むか、または含まないかである。コエレンテラジン／ＰＢＳ緩衝液の前にルシフェラーゼに加えた０．５×ＰＢＳ、１％ＥＤＴＡ、１．３μＭコエレンテラジンおよび０．２％ ＮＰ４０を用いる発光の半減期は、１８分間より長く、これにより、ハイスループットスクリーニングのために特に有用となる。
【図１６】８日間にわたるトランスフェクト哺乳動物細胞（ＨＥＫ−２９３細胞）の培養培地中の分泌されたルシフェラーゼの増加を示している。ＨＥＫ−２９３細胞を、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼまたは分泌遺伝子を発現している発現ベクターでトランスフェクトした。示した時間間隔、Ｔ＝２４、４８、７２および９２時間にて、２０μｌの細胞上清分液を、それぞれ５０μｌのアッセイ緩衝液組成物（０．４×ＰＢＳ、１％ ＥＤＴＡ、０．０２５％ ＮＰ４０、１．３μＭコエレンテラジン）と混合することによってルシフェラーゼ活性を測定した。データは、四組の測定の平均を表している。
【図１７】Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを用いる哺乳動物培養液の上清におけるルシフェラーゼ活性を比較しているヒストグラムを示す。データは、三組の測定の平均によって示されており、トランスフェクション後１６時間での、細胞溶解物または上清中の総ルシフェラーゼ活性を示している。これにより総活性のわずか３．８％が細胞由来であることがわかる。
【図１８】Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼで哺乳動物細胞を形質移入（トランスフェクト）するために使用されるベクターを示している。
【技術分野】
【０００１】
ルシフェラーゼは、光を放射する反応を触媒する酵素である。ルシフェラーゼは、甲虫（ホタル）（たとえば第５，６４１，６４１号を参照のこと）または海洋生物のようなこれらの供給源生物にしたがって命名される。生物発光海洋動物の例には、シーパンジーとしても知られているＲｅｎｉｌｌａが含まれ、このＲｅｎｉｌｌａは花虫類動物としても知られている腔腸動物のクラスに属する。Ｒｅｉｌｌａに加えて、他の代表的なクラス花虫類動物の生物発光属には、Ｃａｖａｒｎｕｌａｒｉａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ、ＡｃａｎｔｈｏｐｔｉｌｕｍおよびＰａｒａｚｏａｎｔｈｕｓが含まれる。これらの生物のすべてが生物発光性であり、適切な生物学的条件下で基質（ルシフェリン）上の酵素（ルシフェラーゼ）の活性の結果として光を放射する。先の研究によって、すべての上述花虫類動物が、同様のルシフェラーゼおよびルシフェリンを含むことが示された。たとえば、Ｃｏｒｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８１：２９１−２９８（１９７３）を参照のこと。これらの花虫類動物のそれぞれからのルシフェラーゼおよびルシフェリンは、互いに交差反応して、Ｒｅｎｉｌｌａ抽出物中で観察される特徴的な青色発光を産出する。これらのルシフェラーゼのそれぞれが、同様の生化学的特性を有し、生物発光のための生化学的要件が、ルシフェラーゼが由来する花虫類動物に関わらず、同一であることが報告された（米国特許第５，２９２，６５８号）。
【０００２】
異なるルシフェラーゼは、基質特異性および光放射の強度および生物発光シグナルの安定性に関して異なった特性を有し、一般的に照度計によって測定される。ルシフェラーゼは、転写レポーター遺伝子として、および生きている対象におけるレポーター遺伝子発現を画像化することにおいて、また分子生物学における多くの他の適用において、有用である。
【０００３】
基質としてコエレンテラジンルシフェリンを用いるルシフェラーゼは、ハイスループットスクリーニングのような特定の分子生物学的反応のために有用であり得る程度の生物発光の閃光を産出する。とりわけこのルシフェラーゼを使用することにより、生物発光シグナルの時間がより長くなるので有利である。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の実施形態において、コエレンテラジン基質、生理食塩水中での濃度より低い濃度の塩化ナトリウム、および界面活性剤を含むルシフェラーゼアッセイ緩衝液が提供され、このアッセイ緩衝液は、約３０秒から約１分より長い時間、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼによる生物発光を検出するのに適しており、たとえば、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発光が、このルシフェラーゼへのアッセイ緩衝液の添加時から少なくとも約３０秒の時間にわたって照度計にて検出され得る。また、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼによる生物発光は、アッセイ緩衝液の添加時から少なくとも１分間の時間にわたって、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発光に加算されて検出可能である。アッセイ緩衝液は、この使用のための取扱説明書とともに、キットに組み込み得る。
【０００５】
以上のアッセイ緩衝液の例において、塩化ナトリウムは、約０．０１から０．１５Ｍの範囲の濃度であり、好ましくはカルシウムまたはマグネシウムイオンを含まず、約３％以下の濃度のＥＤＴＡを場合により含む。アッセイ緩衝液は、約０．００１％から０．５％の範囲の濃度の非イオン性界面活性剤をさらに含んでもよい。緩衝液中で使用し得る界面活性剤の例には、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６５０（ＮＰ４０）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０およびデオキシコレート（ＤＯＣ）が含まれる。
【０００６】
本発明のさらなる実施形態において、ルシフェラーゼアッセイ緩衝液は、約５μＭ以下の濃度のコエレンテラジンを含む。
【０００７】
本発明のさらなる実施形態において、塩濃度が約０．０１から０．１５Ｍの範囲であり、コエレンテラジンが５μＭ未満の濃度であり、さらに、約０．００１％から０．５％の範囲の濃度の非イオン性界面活性剤を含むルシフェラーゼアッセイ緩衝液が提供される。アッセイ緩衝液は、この使用のための取扱説明書とともに、キットに組み込み得る。
【０００８】
本発明のさらなる実施形態において、コエレンテラジン濃度が約１μＭから５μＭであり、非イオン性界面活性剤が少なくとも約０．０５％の濃度であり、さらにＥＤＴＡを含むルシフェラーゼアッセイ緩衝液が提供され、そこで、アッセイ緩衝液は、少なくとも２分間の時間にわたって、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発光放射を安定化することが可能である。本緩衝液を用いる方法には、この緩衝液を選択すること、およびこれをルシフェラーゼに加えることが含まれる。
【０００９】
本発明のさらなる実施形態において、非イオン性界面活性剤が約０．０５％未満の濃度であるルシフェラーゼアッセイ緩衝液が提供され、このアッセイ緩衝液は、ＥＤＴＡの非存在下で、少なくとも３０秒間の時間、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発光の程度を増強することが可能である。本緩衝液を用いる方法には、この緩衝液を選択すること、およびこれをルシフェラーゼに加えることが含まれる。本方法の例において、４μＭのコエレンテラジン濃度が選択される。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態において、単一調製物中で第一および第二ルシフェラーゼを測定するための方法が提供され、そこで、本方法には、以下の段階、（ａ）ベンジルコエレンテラジンを含む第一アッセイ緩衝液、およびコエレンテラジンを含む第二緩衝液を調製する段階、（ｂ）前記ベンジルコエレンテラジンを細胞調製物に加えて第一ルシフェラーゼによる生物発光の量を測定する段階、（ｃ）前記コエレンテラジンを加えて第一および第二ルシフェラーゼによる生物発光の量を測定する段階、および（ｄ）段階（ｂ）と段階（ｃ）とにおける生物発光の差を計算して、第二ルシフェラーゼによる生物発光の量を決定する段階、が含まれる。第一ルシフェラーゼの例はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼであり、第二ルシフェラーゼの例は、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼである。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態において、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼをコードする遺伝子で形質転換された細胞を直接検出するための方法が提供され、そこで上で記述したアッセイ緩衝液を、培養培地中の細胞に加え、生物発光を裸眼または顕微鏡で検出する。さらに、細胞は、標的タンパク質をコードする遺伝子と融合したＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼを発現するプラスミドと、標的タンパク質を指向するｓｉＲＮＡをコードしている遺伝子とで同時形質移入（または共トランスフェクション）され得る。これは、遺伝子サイレンシングのために種々のｓｉＲＮＡをスクリーニングするために有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
インビトロおよびインビボ（細胞内）でのコエレンテラジン依存ルシフェラーゼ生物発光を測定するための方法および組成物が記述されている。組成物は、緩衝液の組成を変更することによって、少なくとも１つの、シグナルの安定性の増強またはシグナルの程度の増強をもたらす。１つ以上の以下のパラメータを変化させた。ＥＤＴＡ（またはＣＤＴＡ）、カルシウムおよびマグネシウムイオンの存在または非存在、ＮａＣｌの濃度、コエレンテラジンの濃度、イオン性および非イオン性界面活性剤の効果、界面活性剤の量、どのようにして界面活性剤が加えられたか、およびシグナルが記録された期間。デュアルレポーターシステムもまた開示されている。
【００１３】
コエレンテラジン依存ルシフェラーゼ（たとえば、ＷＯ９９／４９０１９）には、Ｇａｕｓｓｉａ、Ｒｅｎｉｌｌａ、ＰｌｅｕｒｏｍａｍｍａおよびＭｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼおよびこの変異体が含まれる。コエレンテラジンを利用するルシフェラーゼを有する属には、Ｃｈｉｒｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｅｕｃｌｅｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｏｎｙｃｈｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｗａｔａｓｅｎｉａ、ｃｕｔｔｌｅｆｉｓｈ、ＳｅｐｉｏｌｉｎａおよびＯｐｌｏｐｈｏｒｉｏｕｓ、Ａｃａｎｔｈｏｐｈｙｒａ、ＳｅｒｇｅｓｔｅｓおよびＧｎａｔｈｏｐｌａｕｓｉａのようなエビ、Ａｇｒｙｏｐｅｌｅｃｕｓ、Ｙａｒｅｌｌａ、Ｄｉａｐｈｕｓ、ＧｏｎａｄｏｓｔｏｍｉａｓおよびＮｅｏｓｃｏｐｅｌｕｓのような深海魚が含まれる。これらのルシフェラーゼは、このベースライン生物発光の点で異なる。たとえば、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、哺乳動物細胞内で発現した場合に、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼよりも千倍以上明るい。しかしながら、以下で示すように、例示された３つのコエレンテラジン依存ルシフェラーゼ（組換え体細菌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、哺乳動物細胞によって分泌されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、および細胞溶解物からのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）について、初期生物発光シグナルの程度を増強する、次いで時間とともに安定化するための条件は、特定の活性の差違にも関わらず同様である。このことは、一般的に、これらのパラメータがコエレンテラジン依存ルシフェラーゼに適用可能であることを示唆している。
【００１４】
ＰＢＳ、高モル濃度塩（たとえば０．５Ｍ ＮａＣｌ）および高モル濃度コエレンテラジン（たとえば２０μＭ）を含むアッセイ緩衝液中のルシフェラーゼ活性は、２分未満の間に光産出の９０％が失われ不安定である。非コエレンテラジン依存ルシフェラーゼ、たとえばジチオスレイトール（ＤＴＴ）および補酵素Ａの明反応の安定化剤が、ホタルルシフェラーゼとともに使用される。
【００１５】
本発明の実施形態において、ＥＤＴＡを緩衝液から除き、使用したコエレンテラジンの量を５μＭまで増加させた場合に、短期および長期両方でのコエレンテラジン依存ルシフェラーゼアッセイにおいて、１０倍も大きな生物発光を産出可能であるルシフェラーゼアッセイ緩衝液が提供される。この効果は、表３で例示している。試験した異なるルシフェラーゼによる生物発光シグナルの程度および安定性についての種々のアッセイ条件の効果を表７に要約している。アッセイ緩衝液の特定の実施形態において、少なくとも４５分までにわたる発光の維持が提供される。この効果の例は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに関して表４で、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに関して表５で示している。
【００１６】
実施例には、ＧａｕｓｓｉａおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの解析が含まれるが、他のルシフェラーゼは容易に試験可能であり、好ましい条件が本明細書で記述されたパラメータおよびアッセイを用いて決定される。
【００１７】
コエレンテラジン依存ルシフェラーゼを測定するために確立された実施の慣用は、少なくとも１つのＥＤＴＡ、カルシウム／マグネシウムイオン、高濃度の界面活性剤（１％以上）、高濃度の塩（０．５Ｍ以上）および比較的高いレベルのコエレンテラジン（１０μＭ以上）を含むアッセイ緩衝液を利用することである（Ｔａｎｎｏｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．１１（３）：４３５−４３（２００５））。
【００１８】
本発明の特定の実施形態は、ＥＤＴＡを必要とせず、また、カルシウムおよびマグネシウム塩が、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼによる生物発光のシグナル強度を延長すること、または程度を増加させることに対して有害であることを立証する。しかしながら、任意のまたはすべての以下の成分が、シグナルの程度および安定性の少なくとも１つを増加させるために有益であることが発見された。すなわち、低濃度のＮａＣｌ（０．５Ｍ未満）、界面活性剤（１％ｖ／ｖ未満）、および低濃度のコエレンテラジン（１０μＭ以下）は、短期間にわたる生物発光の程度の改善を示している。界面活性剤に加えてＥＤＴＡを加えることが、１分より長い時間にわたる発光シグナルの安定性を改善するための助けとなり、必要である（図１２から１５）。さらに、図１５は、特に、界面活性剤をルシフェラーゼに直接加えた試料（◆）に関して、図１３における４μＭコエレンテラジンと比較して、１．３μＭコエレンテラジンを使用した場合に、改善された安定性プロファイルが得られることを示している。
【００１９】
（Ｐｒｏｌｕｍｅ／ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，Ａｒｉｚｏｎａのような）供給業者によって推奨されるコエレンテラジンの濃度は、本実施形態に対して必要な濃度よりはるかに高かった。ベンジルコエレンテラジンが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに対する効果的な基質であるとわかったが、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに対する基質としては適切ではなかった（たとえば図８、９および表６を参照のこと）。実施例２は、これらの異なる基質特異性がどのようにしてデュアルレポーターシステムにおいて使用可能であるかを記述している。
【００２０】
細菌ルシフェラーゼに対する種々の条件の効果を、表２、６および７、および図４ｂおよび８に例示し、哺乳動物細胞からの分泌ルシフェラーゼに関しては、表１、３、５、６および７および図１、２、３、４Ａ、８、１０から１５、１６および１７にて、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに関しては、表３、４、６および７、および図６、７および９にて例示している。
【００２１】
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性に対する、アッセイ緩衝液中のＮａＣｌ濃度の増加の効果を、ＮＰ４０界面活性剤およびＥＤＴＡの非存在下、およびＮＰ４０およびＥＤＴＡの存在下で、表１に示している。表１は、ＥＤＴＡの非存在下でのＮａＣｌの増加が生物発光を減少させたが、ＥＤＴＡおよびＮＰ４０の存在がこの効果を逆転させたことを示している。これは、Ｐｅｒｉｐｈｙｌｌａによる高塩濃度に対する要求に関して報告しているＳｈｉｍｏｍｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．２０１：３３９−３４７（２００１）の観察とは反対である。
【００２２】
低濃度（０．５％以下）でのＮＰ４０界面活性剤の、アッセイ試薬への添加が、結果として、文献中で報告されたアッセイ組成物、および市販されているものと比較して、ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに対する発光活性の有意な増加、ならびに発光シグナルの安定性の有意な改善をもたらした。
【００２３】
ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに関して、界面活性剤の範囲を試験した（図２、３、６および７）。０．００１％から０．５％の界面活性剤が、発光を増強することがわかった。たとえば、０．０２％の界面活性剤が、コエレンテラジンの添加後最初の４分以内に生物発光の程度の増強において効果的であることがわかった。安定化効果の改善が、たとえば０．２％まで界面活性剤の濃度を増加させた場合に、長時間にわたって観察された。
【００２４】
低濃度の界面活性剤、たとえばＮＰ４０が、バックグラウンド活性においてほとんど変化を示さずに、発光シグナルを安定化および増強させたことが示された（図２、３、６および７）。
【００２５】
コエレンテラジン／ＰＢＳを含むアッセイ緩衝液を加える前に、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ調製物に直接界面活性剤を加えることによって、アッセイ緩衝液に界面活性剤を加える場合と比較してシグナルの安定性が増加した。ルシフェラーゼとともに使用する前にアッセイ緩衝液に界面活性剤を加えることによって、初期シグナルの程度が増加した（図１２から１５）。
【００２６】
本発明の実施形態において、コエレンテラジンを、酸化脱水エタノール中で安定化し、１から５μＭの範囲の濃度でアッセイ緩衝液に加えた。この濃度範囲は、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性の改善のために効果的であった（図４Ａおよび４Ｂを参照のこと）。この量のコエレンテラジンは実質的に、Ｔａｎｎｏｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．１１（３）：４３５−４３（２００５）によって先に報告された２０μＭという最小値よりも少ない。
【００２７】
本発明の実施形態において、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼを測定するためにキットが提供される。このキットには、アッセイ緩衝液および取扱説明書が含まれる。キットはたとえば、細胞集団、細胞溶解物およびタンパク質溶液に対して使用し得る。
【００２８】
コエレンテラジン依存ルシフェラーゼによる生物発光シグナルの程度および／または安定性を変えるための条件の操作によって、結果として種々の応用例のために好適である産物がもたらされる。応用例には、トランスフェクトしたルシフェラーゼまたはルシフェラーゼタグ化抗体を用いる生物発光腫瘍のインビボ可視化のための腫瘍イメージング、遺伝子発現のリアルタイム解析、薬物ディスカバリーのため、または遺伝子サイレンシングＲＮＡに関するスクリーニングのためのハイスループットスクリーニング、細胞内伝達経路解析および免疫診断／酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。
【００２９】
本明細書で記述されたような、および少なくとも２分間にわたり、生物発光の延長を与える例において記述されたようなアッセイ試薬の使用が、このような応用例に対して望ましい。タンパク質−タンパク質相互作用を、スピリットルシフェラーゼを用いてモニタし得る。レポーターとしてコエレンテラジン依存ルシフェラーゼを含む生存アッセイを、細菌、真菌またはウイルスを殺すこと、および環境ストレスに対する応答をモニタすることにおいて、異なる薬物の効果を測定するために使用可能である。
【００３０】
ルシフェラーゼを使用して、標的ＤＮＡ配列とのオリゴヌクレオチド相互作用を同定および定量し得る。対象のオリゴヌクレオチドをルシフェラーゼでタグ化し、次いで、チップまたはマイクロタイターディッシュ上の固定化標的ＤＮＡに対して暴露する。対象のオリゴ配列と相互作用可能なＤＮＡ配列を含むウェルは、ルシフェラーゼを用いて可視化可能である。本発明の実施形態において、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを、任意の上述の応用例のために使用可能である。生物発光反応のためのアッセイ試薬または緩衝液の選択は、これが２から４分間まで維持される生物発光の初期バーストを最大化するために好ましいかどうか、またはルシフェラーゼ基質の添加後１０から１５分の時点で簡単に検出可能である安定化シグナルをもつために望ましいかどうかに依存する。したがって、１％ ＥＤＴＡの添加、０．２％ 界面活性剤のようなより高い濃度の界面活性剤、またはたとえば４から６μＭまでのより高い濃度のコエレンテラジンのような本明細書で記述した任意の条件の変更を、初期シグナルの安定性を増加させる、または大きさを増加させるために使用し得る。
【００３１】
本アッセイのさらなる使用は、リアルタイムでのｓｉＲＮＡを用いる遺伝子サイレンシングを決定するためのインビボ実験に関する。生物発光を繰り返し測定可能であり、細胞溶解を必要としないので、分泌されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、細胞内Ｒｅｎｉｌｌａおよびホタルルシフェラーゼに対して有利な点を有する。
【００３２】
以上および以下で引用したすべての参考文献、ならびに米国特許仮出願第６０／６５９，１５２号が、参考によって本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【００３３】
アッセイ試薬組成の最適化
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、カイアシ、Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓよりクローン化された（Ｂａｌｌｏｕ ｅｔ ａｌ，１１ｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ａｓｉｌｏｍａｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（２０００），Ｖｅｒｈａｅｇｅｎｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７４：４３７８−８５（２００２），Ｔａｎｎｏｕｓ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１１（３）：４３５−４３（００５），Ｓｉｏｕｘｓｉｅ Ｗｉｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３４２７−３４３２（２００５），Ｓｖｅｔｌａｎａ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３２１２−３２１７０（２００４））。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ，１８５ａａ，１９．９ｋＤａ）は、公知の最も小さなルシフェラーゼであり、天然に分泌される。このルシフェラーゼは、６００ｎｍまで広がる広い放射スペクトルを有し、４８０ｎｍのピークにて光を放射する（Ｔａｎｎｏｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１（３）：４３５−４３（２００５））。
【００３４】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、Ｐｒｏｌｕｍｅ／ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，Ａｒｉｚｏｎａより市販されている。組換え体細菌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、Ｐｒｏｌｕｍｅ／ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，Ａｒｉｚｏｎａより得た。
【００３５】
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、図１６で示したベクターを用いた細胞のトランスフェクション後に、哺乳動物細胞より分泌された。
【００３６】
実施例中で使用した試薬には、ＰＢＳ（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ），Ｃａ／Ｍｇ／Ｋを有するＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ），ＮＰ４０として明細書中で使用したＩｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），標準Ｒｅｎｉｌｌａアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、コエレンテラジンおよびベンジルコエレンテラジン（Ｐｒｏｌｕｍｅ／ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，Ａｒｉｚｏｎａ），哺乳動物中のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼのための発現ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ），哺乳動物および細菌発現Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを希釈するために使用したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が含まれる。生物発光の測定は、照度計（Ｔｕｒｎｅｒ ＴＤ２０２０照度計、Ｔｕｒｎｅｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にて実施した。
標準Ｇａｕｓｓｉａアッセイ試薬の処方
以下のストック溶液を、種々のアッセイ緩衝液の調製にて使用した。１０×ＰＢＳのストック溶液を、ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏより購入した。２％ ＥＤＴＡのストック溶液を、最終容量１００ｍｌまで水中に２ｇのＥＤＴＡを溶解することによって調製した。
【００３７】
２％界面活性剤を含むストック溶液、すなわちＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０またはＤＯＣの２％ ｖ／ｖストック溶液は、２ｍｌの界面活性剤溶液を９８ｍｌの水に加えることによって調製した。２％ ＳＤＳのストック溶液は、２ｇｍｓのＳＤＳを水中に溶解し、最終客積１００ｍｌにすることによって調製した。０．２％界面活性剤を含むストック溶液は、水による２％ストック溶液の１：１０希釈によって調製した。
【００３８】
ＰＢＳ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤を含むアッセイ緩衝液は、適切な量のストック溶液を水中に希釈し、ＰＢＳ、ＥＤＴＡまたは界面活性剤の所望の最終濃度を得ることにより調製した。
【００３９】
コエレンテラジンまたはベンジルコエレンテラジンを、以下のように酸化脱水エタノール中に希釈した。３ｍｇのコエレンテラジンを、１ｍｌ無水エタノールおよび２５μｌ ２Ｎ ＨＣＬと混合した。エタノールを、４：１（すなわち酸性エタノール中１ｍｌのコエレンテラジンに対して４ｍｌのエタノール）の比で加え、コエレンテラジンまたはベンジルコエレンテラジンの１００×濃縮ストック溶液を調製した。このコエレンテラジン溶液の一定量を、１から１０μＭの範囲の最終濃度を得るまでアッセイ緩衝液に加えた。５０μｌのアッセイ緩衝液を、２０μｌのルシフェラーゼを含む試料と混合し、生物発光を照度計を用いて測定した。
コエレンテラジン依存ルシフェラーゼによるシグナルの程度および／または維持の改善のための条件の同定
１．Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼによるシグナルの程度に対する、カルシウム／マグネシウム、およびまたはＥＤＴＡの効果の決定
ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｉｎｅｔｏｐ，Ａｒｉｚｏｎａから得た粉末化細菌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼの一定量を、ＤＭＥＭ中に溶解し、照度計より読み取りが得られるまで、対照アッセイ緩衝液中で希釈した。図１で示した結果は、０．５×ＰＢＳ、０．５×ＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ、０．５×ＰＢＳ／１％ ＥＤＴＡおよび０．５×ＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ／１％ ＥＤＴＡからなる３種のアッセイ緩衝液を利用しており、各緩衝液はさらに、１．３μＭコエレンテラジンを含む。最良の結果が、コエレンテラジンに加えてＰＢＳのみで得られ、カルシウム、マグネシウムまたはＥＤＴＡのいずれか、またはそれらの両方の存在下での場合よりもシグナルが約５倍大きかった。
【００４０】
２．Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に対する、アッセイ試薬中の、０．０２％ ｖ／ｖの濃度を有する異なる界面活性剤の効果の決定
本実施例において、２０μｌの哺乳動物Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ試料（細胞上清）を、２％および０．２％濃度で、８μｌの指示された界面活性剤（アッセイ溶液中の界面活性剤の最終濃度が０．２％および０．０２％であった）、および５０μｌのＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイ試薬（０．５×ＰＢＳ、ＥＤＴＡなし、１．３μＭコエレンテラジン）と混合し、Ｔｕｒｎｅｒ ＴＤ２０２０ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ，Ｔｕｒｎｅｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａで読んだ。試料を１５分後に再び読み、異なる界面活性剤の存在下での、発光シグナルの安定性を評価した。異なる試薬を使用した結果を、図２、３および表６（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに関して）およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに関して図６で示している。ＧａｕｓｓｉａおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ両方に対して、最適な安定性が、ＮＰ４０およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて観察された。
【００４１】
３．哺乳動物分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性および組換え体細菌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに対する、アッセイ試薬中の異なる濃度のコエレンテラジンの効果の決定（図４Ａおよび４Ｂ）
精製した哺乳動物分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを、０．５×ＰＢＳ＋１％ ＥＤＴＡ、０．２％ ＮＰ４０、および１．３μＭ、４μＭ、６μＭ、１２μＭ、および２５μＭの（図４Ａ）の、または１．３μＭ、３．８μＭ、４μＭ、６μＭ、１２μＭ、および２５μＭのコエレンテラジンのアッセイ試薬中で試験した。
【００４２】
２つの異なる濃度のコエレンテラジン（１．３μＭおよび４μＭ）の効果を、１％ ＥＤＴＡの存在下、または非存在下、および０．２％または０．０２％ ＮＰ４０の使用をまたＧａｕｓｓｉａおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに関して試験した、アッセイ試薬中でさらに調査した（表３）。表４は、０、７、２０および８０分の時間間隔でのＥＤＴＡの非存在下で、異なる濃度のＮＰ４０およびコエレンテラジンの効果を示している。
【００４３】
４．ベンジルコエレンテラジンでのコエレンテラジンの置換
Ｇａｕｓｓｉａｎルシフェラーゼは、基質としてのベンジルコエレンテラジンの使用に対してほとんど応答しない（表３を参照のこと）。しかしながら、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、ベンジルコエレンテラジンにて有意に増強したシグナルを産出し、このシグナルは、基質としてコエレンテラジンを使用したものと比べて、比較的安定している（図９および表６）。
【００４４】
５．アッセイ試薬中の種々の濃度のＮａＣｌの効果
０．５×ＰＢＳおよび１．３μＭコエレンテラジンからなるアッセイ試薬中でのＮａＣｌの濃度の変化の効果は、約０．５Ｍ ＮａＣｌをより高い濃度では、生物発光を低下させた。この効果は、０．０２５％ ＮＰ４０および１％ ＥＤＴＡがまた存在する場合には有意ではなかった（表１）。
【００４５】
６．生物発光シグナルの程度および安定性に関するアッセイ試薬へのＥＤＴＡの添加の効果を、表２および図１２から１５にて示している。１％ ＥＤＴＡは、シグナルの初期の程度を低下させる効果を有するが、長期にわたると生物発光のより安定したプロファイルをもたらした。
【００４６】
０から１２０秒および０から約１０００秒にわたる、ＥＤＴＡの存在下、または非存在下でのコエレンテラジンの量（４μＭまたは１．３μＭ）で、ルシフェラーゼに直接加えたか、またはアッセイ試薬に加えたＮＰ４０の量の変化（０．０２％または０．２％）の効果を、哺乳動物分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに関して、図１０から１５および表７にて要約している。表７はまた、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼおよび細菌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに関して、以上にしたがった条件の変更の効果を要約している。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
【表４】
【００５１】
【表５】
【００５２】
【表６】
【００５３】
【表７】
【実施例２】
【００５４】
デュアルレポーターシステム
１．ＲｅｎｉｌｌａおよびＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼを使用したデュアルレポーターシステムが本明細書で記述されている。
【００５５】
本システムは、ＲｅｎｉｌｌａおよびＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの活性に対する表６および図８および９で示した基質ベンジルコエレンテラジンの異なる効果によっている。この効果は、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼが哺乳動物細胞から分泌される一方で、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは分泌されないので、さらに利用可能である（図１５を参照のこと）。図１７は、９６．２％のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼが上清培地中に分泌され、約３．８％のみが細胞に結合することを示している。したがって、多重遺伝子発現システムは、レポーターとしてＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ両方を用いて同時に測定可能である。したがって、これらのルシフェラーゼをコードするＤＮＡは、共トランスフェクションによって、哺乳動物細胞の集団に導入可能である。細胞内Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの量は、基質としてベンジルコエレンテラジンを用いて決定可能であり、一方で、分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性の量は、基質としてコエレンテラジンを用いて決定可能である。コエレンテラジンが、ＧａｕｓｓｉａおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ両方に対する基質であるので、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼの定量を、ベンジルコエレンテラジンを用いて得られた値からコエレンテラジンを用いた生物発光を差し引くことによって決定可能である。
【００５６】
アッセイ試薬（０．４×ＰＢＳ、０．０２５％ ＮＰ４０、１．３μＭ コエレンテラジン）を使用して、８日間にわたる、トランスフェクトヒト胎児腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞の細胞上清中のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性を評価した（図１２を参照のこと）。時間経過実験の最後に、細胞の集団をまた、分泌されないＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを発現するプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした場合には、細胞を溶解し、０．５×ＰＢＳ、０．２％ ＮＰ−４０、４ｕＭベンジルコエレンテラジンを用いてアッセイ可能である。
【００５７】
ホタルルシフェラーゼ／Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーターシステムに対する本明細書で記述したデュアルレポーターシステムの利点は、時間経過または薬物応答実験を、毎時点での細胞融解の必要なしに、（上清中のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性をアッセイすることによって）同一の群のトランスフェクト細胞の上で実施可能であることである。実験の最後に、細胞を溶解し、細胞溶解物をＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に関してアッセイ可能である。
【００５８】
２．ホタルおよびＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼに基づくデュアルルシフェラーゼアッセイ
９５％のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼが上清培養中に分泌され、約５％のみが細胞結合であった（図１５）。対象の遺伝子の活性を、レポーターとして、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを用いて研究可能である。トランスフェクション効率の正規化を、ホタルルシフェラーゼを発現する発現ベクターを用いた共トランスフェクションによって実施する。デュアルアッセイ試薬を、（基質としてホタルルシフェリンを用いる）細胞結合ホタルルシフェラーゼ活性と（基質としてコエレンテラジンを用いる）分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性の、同時解析のために処方する（表７を参照のこと）。
【００５９】
現在使用されるホタルルシフェラーゼ／Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーターシステムに対する今回提案されるデュアルルシフェラーゼアッセイシステムの利点は、時間経過または薬物応答実験を、毎時点での細胞融解の必要なしに、（上清中のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性をアッセイすることによって）同一の群のトランスフェクト細胞の上で実施可能であることである。実験の最後に、細胞を溶解し、細胞溶解物をホタルルシフェラーゼ活性に関してアッセイ可能である。
【００６０】
３．たとえば、ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼとＶａｒｇｕｌａルシフェラーゼを用いる生細胞調製物中のデュアルレポートシステム（ＷＯ９９／４９０１９）
２つの異なるプロモーターからの遺伝子発現の同時解析のための生細胞デュアルアッセイが、２つの異なるプラスミドベクターで細胞をトランスフェクトすることによって開発されてきており、異なるプロモーターの制御下で１つのベクターはＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼを発現しており、第二のベクターは、Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼを発現している。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを発現する構造物のプロモーター活性を、以上で記述したアッセイ緩衝液組成物を用いて研究し、細胞を溶解せずに異なる時間間隔にて細胞上清中のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性を測定可能である。
【００６１】
（Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼを発現している）第二プロモーターのプロモーター活性を、コエレンテラジンの代わりに、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼのアッセイに関して記述された組成と同一であるが、シプリジナルシフェリン（Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼのための基質）を含むアッセイ緩衝液で、細胞上清をアッセイすることによって研究可能である。
【実施例３】
【００６２】
ルシフェラーゼを発現する細胞の直接検出
ＨＥＫ−２９３細胞を、標準の組織培養技術を用いて図１８にしたがってＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼベクターでトランスフェクトした。細胞単層を形成した後、１０または５０μｌの、０．５×ＰＢＳ、０．０２５％ ＮＰ４０、０．０２％ ＮＰ４０および１．３μＭまたは４μＭコエレンテラジンを含むアッセイ溶液を、９６ウェルディッシュ中の、１００μｌ ＤＭＥＭおよび１０％ウシ胎児血清および細胞に加えた。トランスフェクト細胞を実施例１と一致した緩衝液条件にしたがって増殖させ、裸眼で同定可能である。本アッセイは、任意のコエレンテラジン依存ルシフェラーゼトランスフェクト組織培養細胞に対して機能することが予想される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】哺乳動物から分泌されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの活性に対する異なる緩衝液組成の効果を示しており、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のみの場合が、カルシウム、マグネシウムまたは／およびＥＤＴＡをＰＢＳに加えた場合よりも、有意に大きなシグナルを産出する。
【図２】哺乳動物細胞から分泌されたＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの活性に対する、０．５×ＰＢＳおよび１．３μＭコエレンテラジンを含むアッセイ緩衝液中の、０．０２％ ｖ／ｖ ＮＰ４０、０．０２％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２％ ｖ／ｖ ＤＯＣ、０．２％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０および０．０２％ ｗ／ｖ 硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）の効果を示している。各組における最初の４本の棒は、時間ゼロにおけるルシフェラーゼ活性を示しており、次の３本の棒は、１５分後の同一チューブ内でのルシフェラーゼ活性を示している。
【図３】哺乳動物分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性に対する、０．５×ＰＢＳおよび１．３μＭコエレンテラジンを含むアッセイ緩衝液中の、０．２％ ｖ／ｖのＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＤＯＣ、およびＴｗｅｅｎ８０の効果を示している。各組における最初の３本の棒は、時間ゼロにおけるＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性を示しており、次の３本の棒は、１５分後の同一チューブ内でのこのルシフェラーゼ活性を示している。
【図４Ａ】ゼロ時点での、哺乳動物分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性に対する、０．５×ＰＢＳ、１％ ＥＤＴＡおよび０．０２５％ ＮＰ４０を含むアッセイ緩衝液中の、種々の濃度（１．３μＭ、４μＭ、６μＭ、１２μＭおよび２５μＭ）のコエレンテラジンの効果を示している。この結果によって、４μＭより高い濃度のコエレンテラジンにて、ルシフェラーゼ活性の有意な増加はないことが示されている。
【図４Ｂ】組換え体細菌ルシフェラーゼの安定性に対する種々の濃度（１．３μＭ、３．８μＭ、４μＭ、６μＭ、１２μＭおよび２５μＭ）のコエレンテラジンの効果を示している。三つ組の試料に対する結果が、試験した各濃度のコエレンテラジンについて提供される。この結果によって、４μＭより高い濃度のコエレンテラジンにおいてはルシフェラーゼ活性の有意な増加はないことが示されている。
【図５】哺乳動物分泌Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに対して、０から１００秒の間にわたる、標準のＰｒｏｍｅｇａ Ｒｅｎｉｌｌａアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）との、Ｇａｕｓｓｉａ安定化アッセイ試薬（０．４×ＰＢＳ、１％ ＥＤＴＡ、０．０２５％ ＮＰ４０）の比較を示している。
【図６】Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に対する、０．０２％ ｖ／ｖ界面活性剤（ＳＤＳはｗ／ｖである）の安定化効果を示している。２つの時点での三つ組の試料に対する結果が、試験した各界面活性剤について提供される。時点は、Ｔ＝０分およびＴ＝７分である。試験した界面活性剤は、水を対照として、ＮＰ４０、ＴｒｉｔｏｎＸ、ＤＯＣ、Ｔｗｅｅｎ８０およびＳＤＳであった。すべての試料において、第二時点でのシグナルの有意な欠損が存在した。
【図７】Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に対する０．２％ ｖ／ｖ界面活性剤（ＳＤＳはｗ／ｖである）の安定化効果を示している。２つの時点での三つ組の試料に対する結果が、試験した各界面活性剤について提供される。時点は、Ｔ＝０分およびＴ＝１８分である。試験した界面活性剤は、水を対照として、ＮＰ４０、ＴｒｉｔｏｎＸ、ＤＯＣ、Ｔｗｅｅｎ８０およびＳＤＳであり、ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ８０が、０．２％の濃度で安定化効果を示している。
【図８】精製組換え体細菌ルシフェラーゼ（右）または分泌哺乳動物ルシフェラーゼ（左）による生物発光の程度を測定するために、０．５×ＰＢＳおよび１％ ＥＤＴＡ（ｗ／ｖ）ならびに０．０２５％ ＮＰ４０を含む緩衝液試薬中の、１．３μＭコエレンテラジンと比較した、基質として１．３μＭ ベンジルコエレンテラジンを用いた結果を示している。結果は、ベンジルコエレンテラジンが、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに対して貧弱な基質であることを示している。
【図９】Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼによる生物発光の量および安定性を測定するために、０．５×ＰＢＳ、０．０２５％ ＮＰ４０（ｖ／ｖ）および１％ ＥＤＴＡ（ｗ／ｖ）も含む緩衝液試薬中の、１．３μＭコエレンテラジンと比較した、基質として１．３μＭ ベンジルコエレンテラジンを用いた結果を示している。結果は、ベンジルコエレンテラジンが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに対して良好な基質であり、結果として、コエレンテラジンに対して観察されたものよりも有意に大きなシグナルとなったことを示している。
【図１０】１．３μＭコエレンテラジンを用いる分泌された哺乳動物Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性の活性に対するＮＰ４０の割合を変えることの効果を示している。１８０秒までは、界面活性剤の割合を減少させるほど発光シグナルの程度が増加した。しかしながら、生物発光シグナルの安定性プロファイルは、０．１％ ＮＰ４０の場合、２２０秒までは、界面活性剤の濃度が増加するほど改善される。
【図１１】０．５×ＰＢＳ、＋／− １％ ＥＤＴＡ ｗ／ｖ、０．０２％または０．２％ ｖ／ｖ ＮＰ４０および４μＭコエレンテラジンからなるアッセイ緩衝液中の哺乳動物細胞からの分泌ルシフェラーゼを用いることの１２０秒間にわたるＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発光に対する効果を示している。時間＝ゼロでの最も大きなシグナルの程度の増強が、０．５×ＰＢＳ、ＥＤＴＡなし、０．０２％ ＮＰ４０および４μＭコエレンテラジンを用いて観察された。最も安定なシグナルが、０．２％ ＮＰ４０、０．５×ＰＢＳ、ＥＤＴＡなしおよび４μＭコエレンテラジンの好ましい緩衝液中で観察された。
【図１２】０．５×ＰＢＳ、＋／−１％ＥＤＴＡおよび０．２％ ＮＰ４０からなるアッセイ緩衝液中の哺乳動物細胞からの分泌ルシフェラーゼを用いることの１２０秒間にわたるＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発光に対する効果を示している。２つの試料（■、△）においては、界面活性剤は、４μＭコエレンテラジンを加える前に、ルシフェラーゼに加えられ、１つの試料（◆）においては、界面活性剤は、４μＭコエレンテラジンに直接加えられた。時間＝ゼロでの、最も大きなシグナルの程度の増強が、０．５×ＰＢＳ、ＥＤＴＡなし、０．２％ ＮＰ４０および４μＭコエレンテラジンを用いて観察された。最も安定なプロファイルは、４μＭコエレンテラジン、０．５×ＰＢＳおよび１％ ＥＤＴＡの前に、０．２％ ＮＰ４０を加えることで達成された。
【図１３】約１０００秒にわたる生物発光に対する効果を示している。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼが哺乳動物細胞から分泌された。４μＭコエレンテラジンおよび０．５×ＰＢＳを全体にわたって使用した。試料の違いは、１％ＥＤＴＡおよび０．２％ ＮＰ４０のそれぞれを含むか、含まないかである。最も安定なプロファイルは、コエレンテラジン／ＰＢＳ緩衝液の前に、０．５×ＰＢＳ、１％ ＥＤＴＡおよび０．２％ ＮＰ４０をルシフェラーゼに加えた場合に発生した。
【図１４】０．５×ＰＢＳ、＋／−１％ ＥＤＴＡおよび０．２％ ＮＰ４０からなるアッセイ緩衝液中の、哺乳動物細胞からの分泌ルシフェラーゼを用いることの、１２０秒間にわたる、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼによる生物発生に対する効果を示している。界面活性剤は、２つの試料（■、△）にて、１．３μＭコエレンテラジンを加える前に、ルシフェラーゼに加えた。または、界面活性剤を、１．３μＭコエレンテラジンに直接加えた（◆）。時間＝ゼロにて、最も大きなシグナルの程度の増強が、０．５×ＰＢＳ、ＥＤＴＡなし、０．２％ ＮＰ４０および１．３μＭコエレンテラジンを用いて観察された。最も安定なプロファイルは、１．３μＭコエレンテラジン、０．５×ＰＢＳおよび１％ ＥＤＴＡの前に加えた０．２％ ＮＰ４０で達成された。
【図１５】１０００秒にわたる生物発光における効果を示している。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼが、哺乳動物細胞より分泌された。１．３μＭコエレンテラジンおよび０．５×ＰＢＳを全体にわたって用いた。試料の違いは、１％ＥＤＴＡおよび０．２％ ＮＰ４０のそれぞれを含むか、または含まないかである。コエレンテラジン／ＰＢＳ緩衝液の前にルシフェラーゼに加えた０．５×ＰＢＳ、１％ＥＤＴＡ、１．３μＭコエレンテラジンおよび０．２％ ＮＰ４０を用いる発光の半減期は、１８分間より長く、これにより、ハイスループットスクリーニングのために特に有用となる。
【図１６】８日間にわたるトランスフェクト哺乳動物細胞（ＨＥＫ−２９３細胞）の培養培地中の分泌されたルシフェラーゼの増加を示している。ＨＥＫ−２９３細胞を、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼまたは分泌遺伝子を発現している発現ベクターでトランスフェクトした。示した時間間隔、Ｔ＝２４、４８、７２および９２時間にて、２０μｌの細胞上清分液を、それぞれ５０μｌのアッセイ緩衝液組成物（０．４×ＰＢＳ、１％ ＥＤＴＡ、０．０２５％ ＮＰ４０、１．３μＭコエレンテラジン）と混合することによってルシフェラーゼ活性を測定した。データは、四組の測定の平均を表している。
【図１７】Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを用いる哺乳動物培養液の上清におけるルシフェラーゼ活性を比較しているヒストグラムを示す。データは、三組の測定の平均によって示されており、トランスフェクション後１６時間での、細胞溶解物または上清中の総ルシフェラーゼ活性を示している。これにより総活性のわずか３．８％が細胞由来であることがわかる。
【図１８】Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼで哺乳動物細胞を形質移入（トランスフェクト）するために使用されるベクターを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コエレンテラジン、生理食塩水中での濃度より低い濃度の塩化ナトリウム、および界面活性剤を含むルシフェラーゼアッセイ緩衝液であって、照度計によって、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ)に関して少なくとも３０秒より長く、およびレニラルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）に関して１分より長い間、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼによる生物発光を測定するために好適である試薬としてのルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項２】
プルリマンマルシフェラーゼ（Ｐｌｕｒｉｍａｍｍａルシフェラーゼ）およびメトリディアルシフェラーゼ（Ｍｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ）による生物発光を少なくとも３０秒間測定するために好適である、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項３】
塩化ナトリウムが０．０１から０．１５Ｍの範囲の濃度である、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項４】
実質的にカルシウムまたはマグネシウムイオンを含まない、請求項３に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項５】
場合により３％以下の濃度のＥＤＴＡを含む、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項６】
０．０１％から０．５％の範囲の濃度の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項７】
界面活性剤が、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０（ＮＰ４０）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０およびデオキシコレート（ＤＯＣ）からなる群より選択される、請求項６に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項８】
コエレンテラジンが、５μＭ以下の濃度で緩衝液中に存在する、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項９】
ルシフェラーゼが、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、プレウロマンマ（Ｐｌｅｕｒｏｍａｍｍａ）およびメトリディア（Ｍｅｔｒｉｄｉａ）ルシフェラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項１０】
ルシフェラーゼがガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）である、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項１１】
塩濃度が約０．１０から０．１５Ｍの範囲であり、コエレンテラジンが約５μＭ未満の濃度であり、約０．０１％から０．５％の範囲の濃度の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１または４に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項１２】
コエレンテラジン濃度が１μＭから５μＭであり、非イオン性界面活性剤が少なくとも０．０５％の濃度であり、ＥＤＴＡをさらに含み、２分より長い間、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）による生物発光放射を安定化することが可能である、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項１３】
非イオン性界面活性剤が０．１％未満の濃度であり、ＥＤＴＡの非存在下で、少なくとも３０秒間ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）による生物発光の量を増強することが可能である、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項１４】
請求項１または１１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液、および取扱説明書を含むキット。
【請求項１５】
請求項１に記載のアッセイ緩衝液を選択すること、およびアッセイ緩衝液をルシフェラーゼに加えること、を含む、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼによる生物発光を測定するための方法。
【請求項１６】
界面活性剤の濃度が０．００１％から０．５％であり、アッセイ緩衝液が３％以下の濃度のＥＤＴＡを場合により含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記コエレンテラジンが約５μＭ未満の濃度である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載のアッセイ緩衝液を選択すること、および前記アッセイ緩衝液をルシフェラーゼに加えることを含む、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼ反応による生物発生を増強する方法。
【請求項１９】
請求項１２のアッセイ緩衝液をコエレンテラジン依存ルシフェラーゼの調製物に加えることを含む、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼ反応による生物発光シグナルを安定化する方法。
【請求項２０】
コエレンテラジンの濃度が約５μＭ未満である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）ベンジルコエレンテラジンを含む第一アッセイ緩衝液、およびコエレンテラジンを含む第二緩衝液を調製すること、
（ｂ）前記ベンジルコエレンテラジンを細胞調製物に加えて、第一ルシフェラーゼによる生物発光の量を測定すること、
（ｃ）前記コエレンテラジンを加えて、第一および第二ルシフェラーゼによる生物発光の量を測定すること、および
（ｄ）段階（ｂ）と段階（ｃ）とにおける生物発光の差を計算して、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）生物発光の量を決定すること、
を含む、単一の調製物中で第一および第二ルシフェラーゼを検出する方法。
【請求項２２】
第一ルシフェラーゼが、レニラルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）であり、第二ルシフェラーゼがガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のアッセイ緩衝液を培養培地中の細胞に加えること、およびマイクロプレート照度計または顕微鏡によって生物発光を検出することを含む、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）をコードする遺伝子で形質転換された細胞を直接検出する方法。
【請求項２４】
ガウシアルシフェラーゼ遺伝子（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ遺伝子）が、標的タンパク質を発現する遺伝子と融合され、前記融合遺伝子が、遺伝子サイレンシングのためにｓｉＲＮＡを発現する遺伝子とともに同時形質転換される、請求項２３に記載の方法。
【請求項１】
コエレンテラジン、生理食塩水中での濃度より低い濃度の塩化ナトリウム、および界面活性剤を含むルシフェラーゼアッセイ緩衝液であって、照度計によって、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ)に関して少なくとも３０秒より長く、およびレニラルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）に関して１分より長い間、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼによる生物発光を測定するために好適である試薬としてのルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項２】
プルリマンマルシフェラーゼ（Ｐｌｕｒｉｍａｍｍａルシフェラーゼ）およびメトリディアルシフェラーゼ（Ｍｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ）による生物発光を少なくとも３０秒間測定するために好適である、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項３】
塩化ナトリウムが０．０１から０．１５Ｍの範囲の濃度である、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項４】
実質的にカルシウムまたはマグネシウムイオンを含まない、請求項３に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項５】
場合により３％以下の濃度のＥＤＴＡを含む、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項６】
０．０１％から０．５％の範囲の濃度の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項７】
界面活性剤が、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０（ＮＰ４０）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０およびデオキシコレート（ＤＯＣ）からなる群より選択される、請求項６に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項８】
コエレンテラジンが、５μＭ以下の濃度で緩衝液中に存在する、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項９】
ルシフェラーゼが、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、プレウロマンマ（Ｐｌｅｕｒｏｍａｍｍａ）およびメトリディア（Ｍｅｔｒｉｄｉａ）ルシフェラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項１０】
ルシフェラーゼがガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）である、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項１１】
塩濃度が約０．１０から０．１５Ｍの範囲であり、コエレンテラジンが約５μＭ未満の濃度であり、約０．０１％から０．５％の範囲の濃度の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１または４に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項１２】
コエレンテラジン濃度が１μＭから５μＭであり、非イオン性界面活性剤が少なくとも０．０５％の濃度であり、ＥＤＴＡをさらに含み、２分より長い間、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）による生物発光放射を安定化することが可能である、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項１３】
非イオン性界面活性剤が０．１％未満の濃度であり、ＥＤＴＡの非存在下で、少なくとも３０秒間ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）による生物発光の量を増強することが可能である、請求項１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液。
【請求項１４】
請求項１または１１に記載のルシフェラーゼアッセイ緩衝液、および取扱説明書を含むキット。
【請求項１５】
請求項１に記載のアッセイ緩衝液を選択すること、およびアッセイ緩衝液をルシフェラーゼに加えること、を含む、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼによる生物発光を測定するための方法。
【請求項１６】
界面活性剤の濃度が０．００１％から０．５％であり、アッセイ緩衝液が３％以下の濃度のＥＤＴＡを場合により含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記コエレンテラジンが約５μＭ未満の濃度である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載のアッセイ緩衝液を選択すること、および前記アッセイ緩衝液をルシフェラーゼに加えることを含む、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼ反応による生物発生を増強する方法。
【請求項１９】
請求項１２のアッセイ緩衝液をコエレンテラジン依存ルシフェラーゼの調製物に加えることを含む、コエレンテラジン依存ルシフェラーゼ反応による生物発光シグナルを安定化する方法。
【請求項２０】
コエレンテラジンの濃度が約５μＭ未満である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）ベンジルコエレンテラジンを含む第一アッセイ緩衝液、およびコエレンテラジンを含む第二緩衝液を調製すること、
（ｂ）前記ベンジルコエレンテラジンを細胞調製物に加えて、第一ルシフェラーゼによる生物発光の量を測定すること、
（ｃ）前記コエレンテラジンを加えて、第一および第二ルシフェラーゼによる生物発光の量を測定すること、および
（ｄ）段階（ｂ）と段階（ｃ）とにおける生物発光の差を計算して、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）生物発光の量を決定すること、
を含む、単一の調製物中で第一および第二ルシフェラーゼを検出する方法。
【請求項２２】
第一ルシフェラーゼが、レニラルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）であり、第二ルシフェラーゼがガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のアッセイ緩衝液を培養培地中の細胞に加えること、およびマイクロプレート照度計または顕微鏡によって生物発光を検出することを含む、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）をコードする遺伝子で形質転換された細胞を直接検出する方法。
【請求項２４】
ガウシアルシフェラーゼ遺伝子（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ遺伝子）が、標的タンパク質を発現する遺伝子と融合され、前記融合遺伝子が、遺伝子サイレンシングのためにｓｉＲＮＡを発現する遺伝子とともに同時形質転換される、請求項２３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００８−５３２５１７（Ｐ２００８−５３２５１７Ａ）
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５００８５０（Ｐ２００８−５００８５０）
【出願日】平成１８年３月７日（２００６．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００８１４１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９６７３５
【国際公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願人】（５０７３００６１８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月７日（２００６．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００８１４１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９６７３５
【国際公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願人】（５０７３００６１８）
【Ｆターム（参考）】
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