皮膚外用剤の評価方法
【課題】アルコールを含む皮膚外用剤を迅速かつ簡便な操作で定量的に評価することができる皮膚外用剤の評価方法を提供すること。
【解決手段】アルコールを含む皮膚外用剤の評価方法であって、前記皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも１種と接触させ、前記皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および／または前記皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする皮膚外用剤の評価方法。
【解決手段】アルコールを含む皮膚外用剤の評価方法であって、前記皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも１種と接触させ、前記皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および／または前記皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする皮膚外用剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚外用剤の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトの皮膚に用いられる皮膚外用剤の開発、その使用者の皮膚に適した皮膚外用剤の提供方法の開発などに有用な皮膚外用剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚に用いられる化粧料などの皮膚外用剤には、必要により、爽快感や清涼感を付与するための清涼化剤や皮膚の保湿のための保湿剤として、アルコールが配合されている。このような皮膚外用剤を用いた場合、使用者によっては皮膚に痛みや灼熱感などの不快な刺激を感じることがある。
【０００３】
皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の評価は、例えば、スティンギングテストなどによって行なわれている。このスティンギングテストは、皮膚外用剤を皮膚に接触させたときの感覚刺激の度合いに応じて被験者がスティンギングスコアをつけ、そのスティンギングスコアを集計することにより、皮膚に対する皮膚外用剤の刺激を定量的に評価する方法である。
【０００４】
しかしながら、スティンギングテストは、被験者による刺激の感じ方のバラつきなどによって、評価結果の誤差が生じやすいという欠点がある。また、スティンギングテストは、一度に評価することができる皮膚外用剤の数が少ないので、多種類の皮膚外用剤を評価する場合、長時間を要し、しかも煩雑な操作を要するという欠点がある。そのため、皮膚外用剤を迅速かつ簡便な操作で定量的に評価する方法の開発が求められている。
【０００５】
ところで、一過性受容体電位チャネル（以下、「ＴＲＰチャネル」という）は、痛みを惹起する因子を受容する受容体として機能することが知られている。例えば、ＴＲＰチャネルの１つであるＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化がパラベン類やアルカリ剤が配合された皮膚外用剤を用いたときに引き起こされる不快な刺激と関連していることが、本発明者らによって見出されている。また、前記パラベン類やアルカリ剤による刺激と前記ＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化との関連性を利用して、パラベン類やアルカリ剤による刺激を抑制する物質を評価することが提案されている（例えば、特許文献１および２参照）。
【０００６】
しかしながら、本発明者らは、現時点では、アルコールを含む皮膚外用剤による刺激とＴＲＰＡ１との関連性や前記関連性を利用して、前記皮膚外用剤を迅速かつ簡便な操作で定量的に評価する方法が具体的に記載されている文献を発見していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−７９５２８号公報
【特許文献２】特開２００９−８２０５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、アルコールを含む皮膚外用剤を迅速かつ簡便な操作で定量的に評価することができる皮膚外用剤の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、
（１） アルコールを含む皮膚外用剤の評価方法であって、前記皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも１種と接触させ、前記皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および／または前記皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする皮膚外用剤の評価方法、
（２） 生理学的事象が、前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である前記（１）に記載の評価方法、
（３） 前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さごとに前記皮膚外用剤を分類する前記（１）または（２）に記載の評価方法、ならびに
（４） 前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激を評価する前記（１）または（２）に記載の評価方法
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、アルコールを含む皮膚外用剤を迅速かつ簡便な操作で定量的に評価することができるという優れた効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、頸部におけるスティンギンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図２】実施例１において、頸部におけるスティンギンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図３】実施例２において、顔におけるスティンギンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図４】実施例２において、顔におけるスティンギンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図５】実施例３において、皮膚外用剤の種類とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図６】実施例３において、皮膚外用剤の種類とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［皮膚外用剤の評価方法］
本発明の皮膚外用剤の評価方法は、アルコールを含む皮膚外用剤の評価方法であって、前記皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも１種と接触させ、前記皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および／または前記皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする。
【００１３】
本発明者らは、アルコールを含む試料を、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させたとき、ＴＲＰチャネルのうち、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１の双方が活性化することを見出した。また、アルコールを含む試料によるＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれの活性とスティンギングテストの結果とには相関性があることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００１４】
本発明の皮膚外用剤の評価方法は、アルコールを含む皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも１種と接触させる点に１つの大きな特徴がある。本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および／または皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を迅速かつ簡便な操作で定量的に測定することができる。したがって、本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さを定量的に具体的な数値で評価することができ、しかも前記刺激の強さごとに前記皮膚外用剤を定量的に分類することができる。
【００１５】
さらに、本発明の皮膚外用剤の評価方法には、皮膚外用剤を評価する際に、皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および／または皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定する点にも１つの大きな特徴がある。本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、前記生理学的事象を測定するので、ヒト、実験動物などを用いる場合と比べて、迅速かつ簡便な操作で、ヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激を定量的に具体的な数値で評価することができる。しかも、前記生理学的事象は、同一条件下に同時に何回も並行して測定することができるので、本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、迅速かつ高い処理効率で多種類の皮膚外用剤を評価することができる。
【００１６】
皮膚外用剤としては、例えば、スキンローション、乳液、エッセンス、クリーム、パック化粧料、洗顔化粧料、クレンジング化粧料などの皮膚に用いられる化粧料などが挙げられる。
【００１７】
皮膚外用剤に含まれるアルコールとしては、例えば、一価アルコール、多価アルコールなどが挙げられる。これらのアルコールは、それぞれ単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【００１８】
前記一価アルコールとしては、皮膚外用剤に配合される一価アルコールであればよく、特に限定されないが、例えば、脂肪族一価アルコールなどが挙げられる。前記脂肪族一価アルコールとしては、例えば、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、ペンチルアルコール、ヘキシルアルコール、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、ノニルアルコール、デシルアルコールなどの炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコールなどが挙げられる。これらの一価アルコールは、それぞれ単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【００１９】
前記多価アルコールとしては、皮膚外用剤に配合される多価アルコールであればよく、特に限定されないが、例えば、脂肪族多価アルコールなどが挙げられる。前記脂肪族多価アルコールとしては、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ペンチレングリコール、ヘキシレングリコールなどの炭素数２〜６の脂肪族二価アルコールなどが挙げられる。これらの多価アルコールは、それぞれ単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【００２０】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、マスタード、シナモアルデヒド、アリルイソチオシアネート、カルバクロール、アリシンなどによる化学刺激、冷覚刺激（例えば、１７℃前後での刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。
【００２１】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＡ１発現細胞」ともいう）が好ましい。
【００２２】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞は、ＴＲＰＶ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＶ１の生理学的機能としては、例えば、カプサイシン、カンフル、プロトンなどによる化学刺激、熱覚刺激（例えば、４３℃前後の刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。
【００２３】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＶ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＶ１発現細胞」ともいう）が好ましい。
【００２４】
前記内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、内耳の細胞などが挙げられる。また、前記内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、脳の細胞、膀胱上皮の細胞などが挙げられる。
【００２５】
前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸がいずれも発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞においては、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸は、皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象をそれぞれ測定する観点から、それぞれ別々の発現プロモーターの制御下にあることが好ましい。発現プロモーターは、宿主細胞内でＴＲＰＡ１を発現させるのに適したプロモーターであればよい。発現プロモーターは、用いられる宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、染色体外要素として前記核酸が存在している細胞であってもよく、前記核酸が染色体に組み込まれている細胞であってもよい。
【００２７】
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。また、前記外因性ＴＲＰＶ１発現細胞は、ＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。
【００２８】
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。また、前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよい。
【００２９】
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトに適用する皮膚外用剤を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であることが好ましい。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。
【００３０】
また、前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトに適用する皮膚外用剤を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸であることが好ましい。前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：３に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿０８０７０４．３としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＶ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。また、ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸とオルタナティブスプライシングを介して異なるスプライシングバリアントであってもよい。前記スプライシングバリアントとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８７２７．５、ＮＭ＿０８０７０５．３、ＮＭ＿０８０７０６．３などの塩基配列で示される核酸が挙げられる。
【００３１】
ＴＲＰＡ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）ストリンジェントな条件下で、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
【００３２】
また、ＴＲＰＶ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（ａ）配列番号：３に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｂ）配列番号：４において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｃ）ストリンジェントな条件下で、配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
【００３３】
なお、本明細書において、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸または配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸と前記核酸に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられる。
【００３４】
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：３に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：３に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。
【００３５】
前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸および／またはＴＲＰＶ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。これらのなかでは、ヒトにおけるＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１の生理学的機能を十分に再現する観点から、動物細胞であることが好ましい。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞などが挙げられる。ヒト細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。サル細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。マウス細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。前記宿主細胞のなかでは、取扱いが容易であることから、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。これらのなかでは、ＴＲＰチャネルがほとんど発現しておらず、外因性のＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１の活性化を容易にかつ選択的に測定することができることから、ＨＥＫ２９３細胞が好ましい。
【００３６】
前記組換えベクターは、ＴＲＰＡ１をコードする核酸および／またはＴＲＰＶ１をコードする核酸と慣用のベクターとを連結させることによって得られるベクターである。前記ベクターは、その調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。前記ベクターは、形質転換後に、組換えベクターを保持する細胞を容易に選択する観点から、選択マーカー遺伝子を有するベクターであることが好ましい。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。これらのベクターは、用いられる宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞および外因性ＴＲＰＶ１発現細胞を作製するための組換えベクターに用いられるベクターは、発現プロモーターを有していてもよい。
【００３７】
前記組換えベクターを用いた形質転換は、用いられる宿主細胞の種類に応じて、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などの形質転換方法によって行なうことができる。これらの形質転換方法は、例えば、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールド スプリング ハーバー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕などの記載に準じて行なうことができる。形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどによって行なうことができる。
【００３８】
得られた細胞が、ＴＲＰＡ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＡ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。また、得られた細胞が、ＴＲＰＶ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１００ｎＭ〜１０μＭカプサイシンと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＶ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、カプサイシンと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。
【００３９】
皮膚外用剤と、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞との接触は、例えば、各細胞の培養に適した培地中で、皮膚外用剤と、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞とをインキュベーションすること、皮膚外用剤と、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞との混合物をインキュベーションすることなどによって行なわれる。なお、ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いる場合、皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象をそれぞれ測定するタイミングに合わせて、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１をそれぞれ別々に発現させるようにする。
【００４０】
前記培地としては、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞が生育するのに適した成分〔例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質など）、血清（例えば、ウシ胎仔血清など）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど〕を含む培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に前記成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。基本培地としては、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地などが挙げられる。かかる培地は、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、用いられる細胞がＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞である場合、培地として、１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。
【００４１】
皮膚外用剤に接触させるＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞の量は、試験データの信頼性の観点から、皮膚外用剤１００μＬあたり、それぞれ１×１０1細胞以上が好ましく、１×１０2細胞以上がより好ましく、細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎないようにする観点から、３×１０２細胞以下が好ましく、２×１０２細胞以下がより好ましい。
【００４２】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させる皮膚外用剤の量は、皮膚外用剤の種類に応じて適宜設定することができる。
【００４３】
なお、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、それぞれ、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持するために、必要に応じて、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を、各細胞に適した条件下で、予めインキュベーションしておいてもよい。
【００４４】
前記インキュベーションは、用いられる細胞の種類に応じた方法によって行なうことができる。かかる方法としては、例えば、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法などが挙げられる。また、インキュベーション温度、インキュベーション時間、二酸化炭素濃度などの条件は、用いられる細胞に応じて適宜設定される。例えば、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞として、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞を用いる場合、かかる細胞は、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持する観点から、通常、５体積％二酸化炭素を含む雰囲気中で、３６〜３８℃、好ましくは３６．５〜３７．５℃でインキュベーションすればよい。
【００４５】
前記生理学的事象としては、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化、皮膚外用剤との接触前後の一定電位下での電流の変化、これらの組み合わせなどが挙げられる。本発明においては、簡便な操作で、かつ高感度で測定することができる観点から、前記生理学的事象は、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化であることが好ましい。
【００４６】
前記一定の電位での電流の測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。
【００４７】
細胞内カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を調べる方法などを用いて算出することができる。この場合、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、ＴＲＰＡ１またはＴＲＰＶ１のアゴニストと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度に対する皮膚外用剤と接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の変化を求めることによって調べることができる。
【００４８】
前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンと結合した当該蛍光カルシウム指示薬の量によってその蛍光特性が変化する試薬であればよく、特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ ２、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられる。
【００４９】
なお、蛍光カルシウム指示薬が２種類の励起波長を有する場合、より精度を高める観点から、各励起波長における蛍光強度から蛍光強度比を算出することが好ましい。例えば、蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭの励起波長は、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍである。この場合、前記ＴＲＰＡ１またはＴＲＰＶ１のアゴニストと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度に対する皮膚外用剤と接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、Δ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストを算出することにより調べることができる。前記Δ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストは、式（Ｉ）：
【００５０】
〔Δ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニスト〕
＝〔（皮膚外用剤存在下での蛍光強度340nm／皮膚外用剤存在下での蛍光強度380nm−対照存在下での蛍光強度340nm／対照存在下での蛍光強度380nm）〕
÷〔（アゴニスト存在下での蛍光強度340nm／アゴニスト存在下での蛍光強度380nm−対照存在下での蛍光強度340nm／対照存在下での蛍光強度380nm）〕 （Ｉ）
【００５１】
に基づいて算出することができる。なお、本明細書において、「蛍光強度340nm」は励起波長３４０ｎｍにおける蛍光強度を示し、「蛍光強度380nm」は励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度を示す。
【００５２】
皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象と、ヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激を定量的に評価する方法の１つであるスティンギングテストによる評価結果とには、後述の実施例により示されるように、相関性がある。したがって、皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象、例えば、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いなどと、ヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さとには相関性があるといえる。
【００５３】
したがって、本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さごとに前記皮膚外用剤を分類することができる。このように、皮膚外用剤を分類することにより、使用者の皮膚の敏感性に応じて前記使用者に適した皮膚外用剤を提供することができる。
【００５４】
また、本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激を評価することができる。このように、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用いることにより、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激を、定量的に具体的な数値で評価することができる。
【実施例】
【００５５】
つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００５６】
（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μＬとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μＬと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μＬとを混合し、混合物ＩＩを得た。
【００５７】
また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。
【００５８】
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
【００５９】
（製造例２）
製造例１において、ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＶ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ＿０８０７０４．３）に示される塩基配列の２７６位〜２７９５位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＶ１発現細胞を得た。
【００６０】
（実施例１）
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
【００６１】
得られたＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。
【００６２】
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、アルコールを含む皮膚外用剤のモデルとなる試料を入れ、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞と試料とを混合した。なお、前記試料として、前記溶媒Ａによって、エチルアルコールをエチルアルコール濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、プロピレングリコールをプロピレングリコール濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液または溶媒Ａによって、グリセリンをグリセリン濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液を用いた。
【００６３】
その後、チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を測定した。
【００６４】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比試料を算出した。前記Δ蛍光強度比試料は、式（ＩＩ）：
【００６５】
【数１】
【００６６】
に基づいて算出した。
【００６７】
また、前記試料の代わりにＴＲＰＡ１に対する既知のアゴニストであるアリルイソチオシアナート（２０μＭアリルイソチオシアナート水溶液）を用いたことを除き、前記試料を用いた場合と同様にしてΔ蛍光強度比アゴニストを算出した。前記Δ蛍光強度比アゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【００６８】
【数２】
【００６９】
に基づいて算出した。
【００７０】
算出されたΔ蛍光強度比試料とΔ蛍光強度比アゴニストとから、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。その結果を表１に示す。
【００７１】
【表１】
【００７２】
（２）ＴＲＰＶ１発現細胞による評価
前記（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに製造例２で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＶ１に対する既知のアゴニストであるカプサイシン（１μＭカプサイシン水溶液）を用いたことを除き、前記（１）と同様にして、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。その結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
【００７４】
（３）スティンガーの選択
頸部の耳下部を濡れタオルで軽く拭いて皮脂汚れなどを除去した２０歳代から３０歳代の女性１１名の被験者を、室温２１〜２３℃、相対湿度４５〜６０％の試験室内で約１０分間馴化させた。
【００７５】
つぎに、アルコールを含む皮膚外用剤のモデルとなる試料６００μＬを不織布〔三昭紙業（株）製、品番：ＫＰ９５６０、縦３ｃｍ×横３ｃｍ〕に含浸させ、試験用シート２枚を得た。なお、アルコールを含む皮膚外用剤のモデルとなる試料として、５０体積％エチルアルコール水溶液を用いた。
【００７６】
一方、前記試料の代わりに、１０体積％エチルアルコール水溶液６００μＬを用いたことを除いて、前記と同様にして、対照用シートを得た。
【００７７】
前記試験用シートおよび対照用シートそれぞれを、頸部の右側耳下部および左側耳下部に貼付し、貼付時から１分間、３分間、５分間、７分間および１０分間経過時それぞれにおける刺激の強さに対して、以下の刺激の評価方法にしたがって、それぞれ、順に、スティンギングスコアＳA1、ＳA3、ＳA5、ＳA7およびＳA10をつけた。
【００７８】
また、貼付時から１０分間経過時における刺激の強さ評価の終了後、頸部の右側耳下部および左側耳下部から試験用シートおよび対照用シートそれぞれを除去した。その後、試験用シートおよび対照用シートそれぞれの除去時から１週間以上の期間の経過後、前記試験用シートおよび対照用シートそれぞれを、頸部の右側耳下部および左側耳下部に貼付し、前記と同様にして、貼付時から１分間、３分間、５分間、７分間および１０分間経過時における刺激の強さに対して、それぞれ、順に、スティンギングスコアＳB1、ＳB3、ＳB5、ＳB7およびＳB10をつけた。
【００７９】
被験者ごとに、スティンギングスコアＳA1〜ＳA7より最大値ＳAmaxを集計するとともに、スティンギングスコアＳB1〜ＳB7より最大値ＳＢmaxを集計し、各被験者の最大値ＳAmaxと最大値ＳＢmaxとの平均値を求めた。
【００８０】
〔刺激の評価方法〕
刺激には、チクチクとした痛み、ヒリヒリとした痛みおよび灼熱感が含まれる。そこで、本刺激の評価方法においては、チクチクとした痛み、ヒリヒリとした痛みおよび灼熱感を刺激として評価に用いた。
【００８１】
以下の評価基準に基づいて、各被験者が、各時間の経過時に試験用シートおよび対照用シートのそれぞれについて刺激の強さに対して、スティンギングスコアをつけた。
【００８２】
［評価基準］
０点：刺激をまったく感じない。
１点：かすかな刺激を感じる。
３点：はっきりとした刺激を感じる。
５点：我慢できない刺激を感じる。
【００８３】
〔スティンガーの選択〕
被験者のなかから、試験用シートについて、前記平均値が２以上であり、かつ対照シートについて、前記平均値が１以下である被験者をスティンガーとして採用した。
【００８４】
（４）頸部におけるスティンギングテスト
前記（３）で選ばれたスティンガーを被験者とし、試料として、５０体積％エチルアルコール水溶液、５０体積％プロピレングリコール水溶液または５０体積％グリセリン水溶液を用い、前記（３）と同様にして刺激の強さを評価した。その結果を表３に示す。
【００８５】
【表３】
【００８６】
（５）ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれによる生理学的事象とスティンギングスコアの最大値の平均値との関係
前記（１）で算出されたＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト（表１を参照）と前記（４）のスティンギングテストによる頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値（表３を参照）とを、試料ごとにプロットし、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を調べた。実施例１において、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図１に示す。
【００８７】
また、前記（２）で算出されたＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト（表２を参照）と前記（４）のスティンギングテストによる頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値（表３を参照）とを、試料ごとにプロットし、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を調べた。実施例１において、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図２に示す。
【００８８】
図１に示された結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値の大きさは、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値の大きさに比例して大きくなっていることがわかる。また、図１において、前記プロットに基づいて作成された近似直線は、式：ｙ＝０．２６９７ｘ−０．２５４９で表され、かかる近似直線のＲ２乗値は、０．９９８である。Ｒ２乗値が１に近いほど、信頼性が高いと判断されることから、前記近似直線は、十分な信頼性を有することがわかる。したがって、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとには、相関性があることがわかる。
【００８９】
また、図２に示された結果から、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値の大きさは、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値の大きさに比例して大きくなっていることがわかる。また、図２ににおいて、前記プロットに基づいて作成された近似直線は、式：ｙ＝０．４７７５ｘ−０．４６０１で表され、かかる近似直線のＲ２乗値は、０．９９５５である。Ｒ２乗値が１に近いほど、信頼性が高いと判断されることから、前記近似直線は、十分な信頼性を有することがわかる。したがって、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストと、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とには、相関性があることがわかる。
【００９０】
さらに、表１および表２に示された結果から、試料に用いたアルコールの種類を、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストそれぞれの値の大きさの順に並べると、いずれもエチルアルコール、プロピレングリコールおよびグリセリンの順であることがわかる。一方、表３に示された結果から、試料に用いたアルコールの種類を、スティンギングスコア（最大値）の平均値の大きさの順に並べると、エチルアルコール、プロピレングリコールおよびグリセリンの順であることがわかる。したがって、これらの結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストに基づいて、皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さを定量的に具体的な数値で評価することができ、かつ皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さごとに皮膚外用剤を分類することができることが示唆される。
【００９１】
以上の結果より、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象とスティンギングテストの結果とには、相関性があることから、アルコールを含む皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させ、かかる皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、迅速かつ簡便な操作で頸部の皮膚に対するアルコールを含む皮膚外用剤の刺激を定量的に具体的な数値で評価することができることが示唆される。
【００９２】
また、以上の結果より、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストに基づいて、頸部の皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さごとに皮膚外用剤を分類することができることが示唆される。
【００９３】
さらに、以上の結果より、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞に代えて、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１の両方を発現するＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合にも、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれを用いた場合と同様に皮膚外用剤を評価することができることが示唆される。
【００９４】
（実施例２）
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
実施例１の（１）において、試料として、前記溶媒Ａによって、エチルアルコールをエチルアルコール濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、プロピレングリコールをプロピレングリコールが１Ｍとなるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、グリセリンをグリセリン濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液または前記溶媒Ａによって、ジプロピレングリコールをジプロピレングリコール濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液を用いたことを除き、前記実施例１の（１）と同様にして、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。その結果を表４に示す。
【００９５】
【表４】
【００９６】
（２）ＴＲＰＶ１発現細胞による評価
実施例１の（２）において、試料として、前記溶媒Ａによって、エチルアルコールをエチルアルコール濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、プロピレングリコールをプロピレングリコールが１Ｍとなるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、グリセリンをグリセリン濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液または前記溶媒Ａによって、ジプロピレングリコールをジプロピレングリコール濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液を用いたことを除き、前記実施例１の（２）と同様にして、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。その結果を表５に示す。
【００９７】
【表５】
【００９８】
（３）スティンガーの選択
目の下周辺を中心に顔を洗った健常な男性８６名の被験者を、室温２５℃、相対湿度４５〜６０％の試験室内で５分間馴化させた。
【００９９】
つぎに、０．２体積％オクチルアルコール水溶液７５０μＬを不織布〔三昭紙業（株）製、品番：ＫＰ９５６０、縦１ｃｍ×横３ｃｍ〕に含浸させ、試験用シートを得た。
【０１００】
一方、前記０．２体積％オクチルアルコール水溶液の代わりに、１０体積％エチルアルコール水溶液７５０μＬを用いたことを除き、前記と同様にして対照用シートを得た。
【０１０１】
前記試験用シートおよび対照用シートを、それぞれ両目の目の下に貼付した。貼付時から２．５分間、５分間または８分間経過時における刺激の強さを、以下の刺激の評価方法にしたがって、それぞれ、順に、スティンギングスコアＳA2.5、ＳA5およびＳA8をつけた。
【０１０２】
また、貼付時から１０分間経過時における刺激の強さ評価の終了後、両目の目の下から試験用シートおよび対照用シートそれぞれを除去した。その後、試験用シートおよび対照用シートそれぞれの除去時から１週間以上の期間の経過後、前記試験用シートおよび対照用シートそれぞれを、両目の目の下に貼付し、前記と同様にして、貼付時から２．５分間、５分間および８分間経過時における刺激の強さに対して、それぞれ、順に、スティンギングスコアＳB2.5、ＳB5およびＳB8をつけた。
【０１０３】
被験者ごとに、スティンギングスコアＳA2.5〜ＳA8より最大値ＳAmaxを集計するとともに、スティンギングスコアＳB2.5〜ＳB8より最大値ＳＢmaxを集計し、各被験者の最大値ＳAmaxと最大値ＳＢmaxとの平均値を求めた。
【０１０４】
〔刺激の評価方法〕
以下の評価基準に基づいて、各被験者が、各時間の経過時に試験用シートおよび対照用シートのそれぞれについて刺激の強さを評価した。
【０１０５】
［評価基準］
０点：刺激をまったく感じない。
１点：かすかな刺激を感じる。
２点：「かすかな刺激」と「はっきりとした刺激」との中間の強さの刺激を感じる。
３点：はっきりとした刺激を感じる。
４点：「はっきりとした刺激」と「我慢できない刺激」との中間の強さの刺激を感じる。
５点：我慢できない刺激を感じる。
【０１０６】
〔スティンガーの選択〕
被験者のなかから、試験用シートについて、前記平均値が３以上であり、かつ対照シートについて、前記平均値が１以下である被験者をスティンガーとして採用した。
【０１０７】
（４）顔におけるスティンギングテスト
前記（３）において、前記（３）で選ばれたスティンガーを被験者とし、試料として、５０体積％エチルアルコール水溶液、５０体積％プロピレングリコール水溶液、５０体積％グリセリン水溶液または５０体積％ジプロピレングリコール水溶液を用い、前記（３）と同様にして刺激の強さを評価した。その結果を表６に示す。
【０１０８】
【表６】
【０１０９】
（５）ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれによる生理学的事象とスティンギングスコア（最大値）の平均値との関係
前記（１）で算出されたＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト（表４参照）と前記（４）のスティンギングテストによる顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値（表６参照）とを、試料ごとにプロットし、顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を調べた。実施例２において、顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図３に示す。
【０１１０】
また、前記（２）で算出されたＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト（表５参照）と前記（４）のスティンギングテストによる顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値（表６参照）とを、試料ごとにプロットし、顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を調べた。実施例２において、顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図４に示す。
【０１１１】
図３に示された結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値の大きさは、顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値の大きさに比例して大きくなっていることがわかる。また、図３において、前記プロットに基づいて作成された近似直線は、式：ｙ＝０．２０８３ｘ−０．１４６４で表され、かかる近似直線のＲ２乗値は、０．８６９７である。Ｒ２乗値が１に近いほど、信頼性が高いと判断されることから、前記近似直線は、十分な信頼性を有することがわかる。したがって、顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとには、相関性があることがわかる。
【０１１２】
また、図４に示された結果から、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値の大きさは、顔におけるスティンギングスコアの最大値の平均値の大きさに比例して大きくなっていることがわかる。また、図４において、前記プロットに基づいて作成された近似直線は、式：ｙ＝０．３７１１ｘ−０．２７２４で表され、近似直線のＲ２乗値は、０．８７８７である。Ｒ２乗値が１に近いほど、信頼性が高いと判断されることから、前記近似直線は、十分な信頼性を有することがわかる。したがって、顔におけるスティンギングスコアの最大値の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとには、相関性があることがわかる。
【０１１３】
さらに、表４および表５に示された結果から、試料に用いたアルコールの種類を、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストそれぞれの値の大きさの順に並べると、いずれもジプロピレングリコール、エチルアルコール、プロピレングリコールおよびグリセリンの順であることがわかる。一方、表６に示された結果から、試料に用いたアルコールの種類を、スティンギングスコア（最大値）の平均値の大きさの順に並べると、ジプロピレングリコール、エチルアルコール、プロピレングリコールおよびグリセリンの順であることがわかる。したがって、これらの結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストに基づいて皮膚外用剤を分類することができ、かつ皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さを評価することができることが示唆される。
【０１１４】
以上の結果より、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象とスティンギングテストの結果とには相関性があることから、アルコールを含む皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させ、かかる皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、迅速かつ簡便な操作で顔の皮膚に対するアルコールを含む皮膚外用剤の刺激を定量的に具体的な数値で評価することができる。
【０１１５】
また、以上の結果より、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストに基づいて顔の皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さごとに皮膚外用剤を分類することができることが示唆される。
【０１１６】
さらに、以上の結果より、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞に代えて、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１の両方を発現するＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合にも、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれを用いた場合と同様に評価することができることが示唆される。
【０１１７】
これらの結果より、本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、アルコールを含む化粧料などの皮膚外用剤をＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞に接触させ、皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することによって迅速かつ簡便な操作で定量的に皮膚外用剤を評価することができることがわかる。さらに、前記生理学的事象は、同一条件下に同時に何回も並行して測定することができるため、本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、迅速かつ高い処理効率で多種類の皮膚外用剤を評価することができることがわかる。
【０１１８】
（実施例３）
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
実施例１の（１）において、試料として、前記溶媒Ａによって、表７の試料番号１の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が１０体積％となるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、表７の試料番号２の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が１０体積％となるように希釈した溶液または前記溶媒Ａによって、表７の試料番号３の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が１０体積％となるように希釈した溶液を用いたことを除き、前記実施例１の（１）と同様にして、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。なお、表７中、「％」は、体積％を示す。
【０１１９】
【表７】
【０１２０】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、前記式（Ｉ）に基づいて、Δ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。なお、式（Ｉ）中、対照は、溶媒Ａである。
【０１２１】
実施例３において、皮膚外用剤の種類とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図５に示す。
【０１２２】
（２）ＴＲＰＶ１発現細胞による評価
実施例１の（２）において、試料として、前記溶媒Ａによって、表７の試料番号１の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が１０体積％となるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、表７の試料番号２の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が１０体積％となるように希釈した溶液または前記溶媒Ａによって、表７の試料番号３の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が１０体積％となるように希釈した溶液を用いたことを除き、前記実施例１の（２）と同様にして、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。
【０１２３】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、前記式（Ｉ）に基づいて、Δ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【０１２４】
実施例３において、皮膚外用剤の種類とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図６に示す。
【０１２５】
（３）顔におけるスティンギングテスト
実施例３の（４）において、被験者として、３０名の健常男性からなるスティンガーを用い、試料として、表７に示される試料番号１〜３の皮膚外用剤を用いたことを除き、前記実施例３の（４）と同様にして刺激の強さを評価した。その結果を表８に示す。
【０１２６】
【表８】
【０１２７】
（５）ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれによる生理学的事象とスティンギングスコアの最大値の平均値との関係
ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニスト（図５参照）およびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニスト（図６参照）それぞれの値の大きさに基づき、顔の皮膚に対する各試料の刺激を評価した。
【０１２８】
図５および図６に示された結果から、試料の種類を、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストおよびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストそれぞれの値の大きさの順に並べると、いずれも試料１、試料２および試料３の順であることがわかる。これらの結果は、顔におけるスティンギングテストの結果と一致している。
【０１２９】
したがって、これらの結果から、顔の皮膚に対する刺激は、試料１が最も強く、試料３が最も弱いことが示唆される。
【０１３０】
以上の結果より、アルコールを含む皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させ、かかる皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、迅速かつ簡便な操作で顔の皮膚に対するアルコールを含む皮膚外用剤の刺激を定量的に具体的な数値で評価することができる。
【０１３１】
また、以上の結果より、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１それぞれにおけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストおよびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストに基づいてアルコールを含む皮膚外用剤を分類することができ、かつ皮膚に対するアルコールを含む皮膚外用剤の刺激の強さを評価することができることが示唆される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚外用剤の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトの皮膚に用いられる皮膚外用剤の開発、その使用者の皮膚に適した皮膚外用剤の提供方法の開発などに有用な皮膚外用剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚に用いられる化粧料などの皮膚外用剤には、必要により、爽快感や清涼感を付与するための清涼化剤や皮膚の保湿のための保湿剤として、アルコールが配合されている。このような皮膚外用剤を用いた場合、使用者によっては皮膚に痛みや灼熱感などの不快な刺激を感じることがある。
【０００３】
皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の評価は、例えば、スティンギングテストなどによって行なわれている。このスティンギングテストは、皮膚外用剤を皮膚に接触させたときの感覚刺激の度合いに応じて被験者がスティンギングスコアをつけ、そのスティンギングスコアを集計することにより、皮膚に対する皮膚外用剤の刺激を定量的に評価する方法である。
【０００４】
しかしながら、スティンギングテストは、被験者による刺激の感じ方のバラつきなどによって、評価結果の誤差が生じやすいという欠点がある。また、スティンギングテストは、一度に評価することができる皮膚外用剤の数が少ないので、多種類の皮膚外用剤を評価する場合、長時間を要し、しかも煩雑な操作を要するという欠点がある。そのため、皮膚外用剤を迅速かつ簡便な操作で定量的に評価する方法の開発が求められている。
【０００５】
ところで、一過性受容体電位チャネル（以下、「ＴＲＰチャネル」という）は、痛みを惹起する因子を受容する受容体として機能することが知られている。例えば、ＴＲＰチャネルの１つであるＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化がパラベン類やアルカリ剤が配合された皮膚外用剤を用いたときに引き起こされる不快な刺激と関連していることが、本発明者らによって見出されている。また、前記パラベン類やアルカリ剤による刺激と前記ＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化との関連性を利用して、パラベン類やアルカリ剤による刺激を抑制する物質を評価することが提案されている（例えば、特許文献１および２参照）。
【０００６】
しかしながら、本発明者らは、現時点では、アルコールを含む皮膚外用剤による刺激とＴＲＰＡ１との関連性や前記関連性を利用して、前記皮膚外用剤を迅速かつ簡便な操作で定量的に評価する方法が具体的に記載されている文献を発見していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−７９５２８号公報
【特許文献２】特開２００９−８２０５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、アルコールを含む皮膚外用剤を迅速かつ簡便な操作で定量的に評価することができる皮膚外用剤の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、
（１） アルコールを含む皮膚外用剤の評価方法であって、前記皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも１種と接触させ、前記皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および／または前記皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする皮膚外用剤の評価方法、
（２） 生理学的事象が、前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である前記（１）に記載の評価方法、
（３） 前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さごとに前記皮膚外用剤を分類する前記（１）または（２）に記載の評価方法、ならびに
（４） 前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激を評価する前記（１）または（２）に記載の評価方法
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、アルコールを含む皮膚外用剤を迅速かつ簡便な操作で定量的に評価することができるという優れた効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、頸部におけるスティンギンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図２】実施例１において、頸部におけるスティンギンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図３】実施例２において、顔におけるスティンギンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図４】実施例２において、顔におけるスティンギンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図５】実施例３において、皮膚外用剤の種類とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図６】実施例３において、皮膚外用剤の種類とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［皮膚外用剤の評価方法］
本発明の皮膚外用剤の評価方法は、アルコールを含む皮膚外用剤の評価方法であって、前記皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも１種と接触させ、前記皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および／または前記皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする。
【００１３】
本発明者らは、アルコールを含む試料を、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させたとき、ＴＲＰチャネルのうち、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１の双方が活性化することを見出した。また、アルコールを含む試料によるＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれの活性とスティンギングテストの結果とには相関性があることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００１４】
本発明の皮膚外用剤の評価方法は、アルコールを含む皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも１種と接触させる点に１つの大きな特徴がある。本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および／または皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を迅速かつ簡便な操作で定量的に測定することができる。したがって、本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さを定量的に具体的な数値で評価することができ、しかも前記刺激の強さごとに前記皮膚外用剤を定量的に分類することができる。
【００１５】
さらに、本発明の皮膚外用剤の評価方法には、皮膚外用剤を評価する際に、皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および／または皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定する点にも１つの大きな特徴がある。本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、前記生理学的事象を測定するので、ヒト、実験動物などを用いる場合と比べて、迅速かつ簡便な操作で、ヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激を定量的に具体的な数値で評価することができる。しかも、前記生理学的事象は、同一条件下に同時に何回も並行して測定することができるので、本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、迅速かつ高い処理効率で多種類の皮膚外用剤を評価することができる。
【００１６】
皮膚外用剤としては、例えば、スキンローション、乳液、エッセンス、クリーム、パック化粧料、洗顔化粧料、クレンジング化粧料などの皮膚に用いられる化粧料などが挙げられる。
【００１７】
皮膚外用剤に含まれるアルコールとしては、例えば、一価アルコール、多価アルコールなどが挙げられる。これらのアルコールは、それぞれ単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【００１８】
前記一価アルコールとしては、皮膚外用剤に配合される一価アルコールであればよく、特に限定されないが、例えば、脂肪族一価アルコールなどが挙げられる。前記脂肪族一価アルコールとしては、例えば、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、ペンチルアルコール、ヘキシルアルコール、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、ノニルアルコール、デシルアルコールなどの炭素数２〜１０の直鎖または分岐鎖の脂肪族一価アルコールなどが挙げられる。これらの一価アルコールは、それぞれ単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【００１９】
前記多価アルコールとしては、皮膚外用剤に配合される多価アルコールであればよく、特に限定されないが、例えば、脂肪族多価アルコールなどが挙げられる。前記脂肪族多価アルコールとしては、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ペンチレングリコール、ヘキシレングリコールなどの炭素数２〜６の脂肪族二価アルコールなどが挙げられる。これらの多価アルコールは、それぞれ単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【００２０】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、マスタード、シナモアルデヒド、アリルイソチオシアネート、カルバクロール、アリシンなどによる化学刺激、冷覚刺激（例えば、１７℃前後での刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。
【００２１】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＡ１発現細胞」ともいう）が好ましい。
【００２２】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞は、ＴＲＰＶ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＶ１の生理学的機能としては、例えば、カプサイシン、カンフル、プロトンなどによる化学刺激、熱覚刺激（例えば、４３℃前後の刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。
【００２３】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＶ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＶ１発現細胞」ともいう）が好ましい。
【００２４】
前記内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、内耳の細胞などが挙げられる。また、前記内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、脳の細胞、膀胱上皮の細胞などが挙げられる。
【００２５】
前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸がいずれも発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞においては、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸は、皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象をそれぞれ測定する観点から、それぞれ別々の発現プロモーターの制御下にあることが好ましい。発現プロモーターは、宿主細胞内でＴＲＰＡ１を発現させるのに適したプロモーターであればよい。発現プロモーターは、用いられる宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、染色体外要素として前記核酸が存在している細胞であってもよく、前記核酸が染色体に組み込まれている細胞であってもよい。
【００２７】
前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。また、前記外因性ＴＲＰＶ１発現細胞は、ＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。前記ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸およびＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。
【００２８】
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。また、前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよい。
【００２９】
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトに適用する皮膚外用剤を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であることが好ましい。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。
【００３０】
また、前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトに適用する皮膚外用剤を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸であることが好ましい。前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：３に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿０８０７０４．３としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＶ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。また、ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸とオルタナティブスプライシングを介して異なるスプライシングバリアントであってもよい。前記スプライシングバリアントとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８７２７．５、ＮＭ＿０８０７０５．３、ＮＭ＿０８０７０６．３などの塩基配列で示される核酸が挙げられる。
【００３１】
ＴＲＰＡ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）ストリンジェントな条件下で、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
【００３２】
また、ＴＲＰＶ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（ａ）配列番号：３に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｂ）配列番号：４において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｃ）ストリンジェントな条件下で、配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
【００３３】
なお、本明細書において、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸または配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸と前記核酸に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられる。
【００３４】
前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：３に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：３に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。
【００３５】
前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸および／またはＴＲＰＶ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。これらのなかでは、ヒトにおけるＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１の生理学的機能を十分に再現する観点から、動物細胞であることが好ましい。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞などが挙げられる。ヒト細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。サル細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。マウス細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。前記宿主細胞のなかでは、取扱いが容易であることから、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。これらのなかでは、ＴＲＰチャネルがほとんど発現しておらず、外因性のＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１の活性化を容易にかつ選択的に測定することができることから、ＨＥＫ２９３細胞が好ましい。
【００３６】
前記組換えベクターは、ＴＲＰＡ１をコードする核酸および／またはＴＲＰＶ１をコードする核酸と慣用のベクターとを連結させることによって得られるベクターである。前記ベクターは、その調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＡ１および／またはＴＲＰＶ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。前記ベクターは、形質転換後に、組換えベクターを保持する細胞を容易に選択する観点から、選択マーカー遺伝子を有するベクターであることが好ましい。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。これらのベクターは、用いられる宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞および外因性ＴＲＰＶ１発現細胞を作製するための組換えベクターに用いられるベクターは、発現プロモーターを有していてもよい。
【００３７】
前記組換えベクターを用いた形質転換は、用いられる宿主細胞の種類に応じて、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などの形質転換方法によって行なうことができる。これらの形質転換方法は、例えば、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールド スプリング ハーバー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕などの記載に準じて行なうことができる。形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどによって行なうことができる。
【００３８】
得られた細胞が、ＴＲＰＡ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＡ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。また、得られた細胞が、ＴＲＰＶ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１００ｎＭ〜１０μＭカプサイシンと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＶ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、カプサイシンと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。
【００３９】
皮膚外用剤と、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞との接触は、例えば、各細胞の培養に適した培地中で、皮膚外用剤と、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞とをインキュベーションすること、皮膚外用剤と、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞との混合物をインキュベーションすることなどによって行なわれる。なお、ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いる場合、皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象をそれぞれ測定するタイミングに合わせて、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１をそれぞれ別々に発現させるようにする。
【００４０】
前記培地としては、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞が生育するのに適した成分〔例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質など）、血清（例えば、ウシ胎仔血清など）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど〕を含む培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に前記成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。基本培地としては、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地などが挙げられる。かかる培地は、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、用いられる細胞がＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞である場合、培地として、１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。
【００４１】
皮膚外用剤に接触させるＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞の量は、試験データの信頼性の観点から、皮膚外用剤１００μＬあたり、それぞれ１×１０1細胞以上が好ましく、１×１０2細胞以上がより好ましく、細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎないようにする観点から、３×１０２細胞以下が好ましく、２×１０２細胞以下がより好ましい。
【００４２】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞にそれぞれ接触させる皮膚外用剤の量は、皮膚外用剤の種類に応じて適宜設定することができる。
【００４３】
なお、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞は、それぞれ、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持するために、必要に応じて、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を、各細胞に適した条件下で、予めインキュベーションしておいてもよい。
【００４４】
前記インキュベーションは、用いられる細胞の種類に応じた方法によって行なうことができる。かかる方法としては、例えば、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法などが挙げられる。また、インキュベーション温度、インキュベーション時間、二酸化炭素濃度などの条件は、用いられる細胞に応じて適宜設定される。例えば、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞として、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞を用いる場合、かかる細胞は、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持する観点から、通常、５体積％二酸化炭素を含む雰囲気中で、３６〜３８℃、好ましくは３６．５〜３７．５℃でインキュベーションすればよい。
【００４５】
前記生理学的事象としては、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化、皮膚外用剤との接触前後の一定電位下での電流の変化、これらの組み合わせなどが挙げられる。本発明においては、簡便な操作で、かつ高感度で測定することができる観点から、前記生理学的事象は、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化であることが好ましい。
【００４６】
前記一定の電位での電流の測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。
【００４７】
細胞内カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を調べる方法などを用いて算出することができる。この場合、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、ＴＲＰＡ１またはＴＲＰＶ１のアゴニストと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度に対する皮膚外用剤と接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の変化を求めることによって調べることができる。
【００４８】
前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンと結合した当該蛍光カルシウム指示薬の量によってその蛍光特性が変化する試薬であればよく、特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ ２、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられる。
【００４９】
なお、蛍光カルシウム指示薬が２種類の励起波長を有する場合、より精度を高める観点から、各励起波長における蛍光強度から蛍光強度比を算出することが好ましい。例えば、蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭの励起波長は、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍである。この場合、前記ＴＲＰＡ１またはＴＲＰＶ１のアゴニストと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度に対する皮膚外用剤と接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、Δ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストを算出することにより調べることができる。前記Δ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストは、式（Ｉ）：
【００５０】
〔Δ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニスト〕
＝〔（皮膚外用剤存在下での蛍光強度340nm／皮膚外用剤存在下での蛍光強度380nm−対照存在下での蛍光強度340nm／対照存在下での蛍光強度380nm）〕
÷〔（アゴニスト存在下での蛍光強度340nm／アゴニスト存在下での蛍光強度380nm−対照存在下での蛍光強度340nm／対照存在下での蛍光強度380nm）〕 （Ｉ）
【００５１】
に基づいて算出することができる。なお、本明細書において、「蛍光強度340nm」は励起波長３４０ｎｍにおける蛍光強度を示し、「蛍光強度380nm」は励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度を示す。
【００５２】
皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象と、ヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激を定量的に評価する方法の１つであるスティンギングテストによる評価結果とには、後述の実施例により示されるように、相関性がある。したがって、皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象、例えば、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いなどと、ヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さとには相関性があるといえる。
【００５３】
したがって、本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さごとに前記皮膚外用剤を分類することができる。このように、皮膚外用剤を分類することにより、使用者の皮膚の敏感性に応じて前記使用者に適した皮膚外用剤を提供することができる。
【００５４】
また、本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激を評価することができる。このように、皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用いることにより、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激を、定量的に具体的な数値で評価することができる。
【実施例】
【００５５】
つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００５６】
（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μＬとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μＬと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μＬとを混合し、混合物ＩＩを得た。
【００５７】
また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。
【００５８】
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
【００５９】
（製造例２）
製造例１において、ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＶ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ＿０８０７０４．３）に示される塩基配列の２７６位〜２７９５位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＶ１発現細胞を得た。
【００６０】
（実施例１）
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
【００６１】
得られたＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。
【００６２】
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、アルコールを含む皮膚外用剤のモデルとなる試料を入れ、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞と試料とを混合した。なお、前記試料として、前記溶媒Ａによって、エチルアルコールをエチルアルコール濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、プロピレングリコールをプロピレングリコール濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液または溶媒Ａによって、グリセリンをグリセリン濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液を用いた。
【００６３】
その後、チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を測定した。
【００６４】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比試料を算出した。前記Δ蛍光強度比試料は、式（ＩＩ）：
【００６５】
【数１】
【００６６】
に基づいて算出した。
【００６７】
また、前記試料の代わりにＴＲＰＡ１に対する既知のアゴニストであるアリルイソチオシアナート（２０μＭアリルイソチオシアナート水溶液）を用いたことを除き、前記試料を用いた場合と同様にしてΔ蛍光強度比アゴニストを算出した。前記Δ蛍光強度比アゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【００６８】
【数２】
【００６９】
に基づいて算出した。
【００７０】
算出されたΔ蛍光強度比試料とΔ蛍光強度比アゴニストとから、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。その結果を表１に示す。
【００７１】
【表１】
【００７２】
（２）ＴＲＰＶ１発現細胞による評価
前記（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞の代わりに製造例２で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を用い、アゴニストとして、ＴＲＰＶ１に対する既知のアゴニストであるカプサイシン（１μＭカプサイシン水溶液）を用いたことを除き、前記（１）と同様にして、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。その結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
【００７４】
（３）スティンガーの選択
頸部の耳下部を濡れタオルで軽く拭いて皮脂汚れなどを除去した２０歳代から３０歳代の女性１１名の被験者を、室温２１〜２３℃、相対湿度４５〜６０％の試験室内で約１０分間馴化させた。
【００７５】
つぎに、アルコールを含む皮膚外用剤のモデルとなる試料６００μＬを不織布〔三昭紙業（株）製、品番：ＫＰ９５６０、縦３ｃｍ×横３ｃｍ〕に含浸させ、試験用シート２枚を得た。なお、アルコールを含む皮膚外用剤のモデルとなる試料として、５０体積％エチルアルコール水溶液を用いた。
【００７６】
一方、前記試料の代わりに、１０体積％エチルアルコール水溶液６００μＬを用いたことを除いて、前記と同様にして、対照用シートを得た。
【００７７】
前記試験用シートおよび対照用シートそれぞれを、頸部の右側耳下部および左側耳下部に貼付し、貼付時から１分間、３分間、５分間、７分間および１０分間経過時それぞれにおける刺激の強さに対して、以下の刺激の評価方法にしたがって、それぞれ、順に、スティンギングスコアＳA1、ＳA3、ＳA5、ＳA7およびＳA10をつけた。
【００７８】
また、貼付時から１０分間経過時における刺激の強さ評価の終了後、頸部の右側耳下部および左側耳下部から試験用シートおよび対照用シートそれぞれを除去した。その後、試験用シートおよび対照用シートそれぞれの除去時から１週間以上の期間の経過後、前記試験用シートおよび対照用シートそれぞれを、頸部の右側耳下部および左側耳下部に貼付し、前記と同様にして、貼付時から１分間、３分間、５分間、７分間および１０分間経過時における刺激の強さに対して、それぞれ、順に、スティンギングスコアＳB1、ＳB3、ＳB5、ＳB7およびＳB10をつけた。
【００７９】
被験者ごとに、スティンギングスコアＳA1〜ＳA7より最大値ＳAmaxを集計するとともに、スティンギングスコアＳB1〜ＳB7より最大値ＳＢmaxを集計し、各被験者の最大値ＳAmaxと最大値ＳＢmaxとの平均値を求めた。
【００８０】
〔刺激の評価方法〕
刺激には、チクチクとした痛み、ヒリヒリとした痛みおよび灼熱感が含まれる。そこで、本刺激の評価方法においては、チクチクとした痛み、ヒリヒリとした痛みおよび灼熱感を刺激として評価に用いた。
【００８１】
以下の評価基準に基づいて、各被験者が、各時間の経過時に試験用シートおよび対照用シートのそれぞれについて刺激の強さに対して、スティンギングスコアをつけた。
【００８２】
［評価基準］
０点：刺激をまったく感じない。
１点：かすかな刺激を感じる。
３点：はっきりとした刺激を感じる。
５点：我慢できない刺激を感じる。
【００８３】
〔スティンガーの選択〕
被験者のなかから、試験用シートについて、前記平均値が２以上であり、かつ対照シートについて、前記平均値が１以下である被験者をスティンガーとして採用した。
【００８４】
（４）頸部におけるスティンギングテスト
前記（３）で選ばれたスティンガーを被験者とし、試料として、５０体積％エチルアルコール水溶液、５０体積％プロピレングリコール水溶液または５０体積％グリセリン水溶液を用い、前記（３）と同様にして刺激の強さを評価した。その結果を表３に示す。
【００８５】
【表３】
【００８６】
（５）ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれによる生理学的事象とスティンギングスコアの最大値の平均値との関係
前記（１）で算出されたＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト（表１を参照）と前記（４）のスティンギングテストによる頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値（表３を参照）とを、試料ごとにプロットし、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を調べた。実施例１において、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図１に示す。
【００８７】
また、前記（２）で算出されたＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト（表２を参照）と前記（４）のスティンギングテストによる頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値（表３を参照）とを、試料ごとにプロットし、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を調べた。実施例１において、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図２に示す。
【００８８】
図１に示された結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値の大きさは、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値の大きさに比例して大きくなっていることがわかる。また、図１において、前記プロットに基づいて作成された近似直線は、式：ｙ＝０．２６９７ｘ−０．２５４９で表され、かかる近似直線のＲ２乗値は、０．９９８である。Ｒ２乗値が１に近いほど、信頼性が高いと判断されることから、前記近似直線は、十分な信頼性を有することがわかる。したがって、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとには、相関性があることがわかる。
【００８９】
また、図２に示された結果から、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値の大きさは、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値の大きさに比例して大きくなっていることがわかる。また、図２ににおいて、前記プロットに基づいて作成された近似直線は、式：ｙ＝０．４７７５ｘ−０．４６０１で表され、かかる近似直線のＲ２乗値は、０．９９５５である。Ｒ２乗値が１に近いほど、信頼性が高いと判断されることから、前記近似直線は、十分な信頼性を有することがわかる。したがって、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストと、頸部におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とには、相関性があることがわかる。
【００９０】
さらに、表１および表２に示された結果から、試料に用いたアルコールの種類を、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストそれぞれの値の大きさの順に並べると、いずれもエチルアルコール、プロピレングリコールおよびグリセリンの順であることがわかる。一方、表３に示された結果から、試料に用いたアルコールの種類を、スティンギングスコア（最大値）の平均値の大きさの順に並べると、エチルアルコール、プロピレングリコールおよびグリセリンの順であることがわかる。したがって、これらの結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストに基づいて、皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さを定量的に具体的な数値で評価することができ、かつ皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さごとに皮膚外用剤を分類することができることが示唆される。
【００９１】
以上の結果より、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象とスティンギングテストの結果とには、相関性があることから、アルコールを含む皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させ、かかる皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、迅速かつ簡便な操作で頸部の皮膚に対するアルコールを含む皮膚外用剤の刺激を定量的に具体的な数値で評価することができることが示唆される。
【００９２】
また、以上の結果より、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストに基づいて、頸部の皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さごとに皮膚外用剤を分類することができることが示唆される。
【００９３】
さらに、以上の結果より、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞に代えて、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１の両方を発現するＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合にも、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれを用いた場合と同様に皮膚外用剤を評価することができることが示唆される。
【００９４】
（実施例２）
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
実施例１の（１）において、試料として、前記溶媒Ａによって、エチルアルコールをエチルアルコール濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、プロピレングリコールをプロピレングリコールが１Ｍとなるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、グリセリンをグリセリン濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液または前記溶媒Ａによって、ジプロピレングリコールをジプロピレングリコール濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液を用いたことを除き、前記実施例１の（１）と同様にして、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。その結果を表４に示す。
【００９５】
【表４】
【００９６】
（２）ＴＲＰＶ１発現細胞による評価
実施例１の（２）において、試料として、前記溶媒Ａによって、エチルアルコールをエチルアルコール濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、プロピレングリコールをプロピレングリコールが１Ｍとなるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、グリセリンをグリセリン濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液または前記溶媒Ａによって、ジプロピレングリコールをジプロピレングリコール濃度が１Ｍとなるように希釈した溶液を用いたことを除き、前記実施例１の（２）と同様にして、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。その結果を表５に示す。
【００９７】
【表５】
【００９８】
（３）スティンガーの選択
目の下周辺を中心に顔を洗った健常な男性８６名の被験者を、室温２５℃、相対湿度４５〜６０％の試験室内で５分間馴化させた。
【００９９】
つぎに、０．２体積％オクチルアルコール水溶液７５０μＬを不織布〔三昭紙業（株）製、品番：ＫＰ９５６０、縦１ｃｍ×横３ｃｍ〕に含浸させ、試験用シートを得た。
【０１００】
一方、前記０．２体積％オクチルアルコール水溶液の代わりに、１０体積％エチルアルコール水溶液７５０μＬを用いたことを除き、前記と同様にして対照用シートを得た。
【０１０１】
前記試験用シートおよび対照用シートを、それぞれ両目の目の下に貼付した。貼付時から２．５分間、５分間または８分間経過時における刺激の強さを、以下の刺激の評価方法にしたがって、それぞれ、順に、スティンギングスコアＳA2.5、ＳA5およびＳA8をつけた。
【０１０２】
また、貼付時から１０分間経過時における刺激の強さ評価の終了後、両目の目の下から試験用シートおよび対照用シートそれぞれを除去した。その後、試験用シートおよび対照用シートそれぞれの除去時から１週間以上の期間の経過後、前記試験用シートおよび対照用シートそれぞれを、両目の目の下に貼付し、前記と同様にして、貼付時から２．５分間、５分間および８分間経過時における刺激の強さに対して、それぞれ、順に、スティンギングスコアＳB2.5、ＳB5およびＳB8をつけた。
【０１０３】
被験者ごとに、スティンギングスコアＳA2.5〜ＳA8より最大値ＳAmaxを集計するとともに、スティンギングスコアＳB2.5〜ＳB8より最大値ＳＢmaxを集計し、各被験者の最大値ＳAmaxと最大値ＳＢmaxとの平均値を求めた。
【０１０４】
〔刺激の評価方法〕
以下の評価基準に基づいて、各被験者が、各時間の経過時に試験用シートおよび対照用シートのそれぞれについて刺激の強さを評価した。
【０１０５】
［評価基準］
０点：刺激をまったく感じない。
１点：かすかな刺激を感じる。
２点：「かすかな刺激」と「はっきりとした刺激」との中間の強さの刺激を感じる。
３点：はっきりとした刺激を感じる。
４点：「はっきりとした刺激」と「我慢できない刺激」との中間の強さの刺激を感じる。
５点：我慢できない刺激を感じる。
【０１０６】
〔スティンガーの選択〕
被験者のなかから、試験用シートについて、前記平均値が３以上であり、かつ対照シートについて、前記平均値が１以下である被験者をスティンガーとして採用した。
【０１０７】
（４）顔におけるスティンギングテスト
前記（３）において、前記（３）で選ばれたスティンガーを被験者とし、試料として、５０体積％エチルアルコール水溶液、５０体積％プロピレングリコール水溶液、５０体積％グリセリン水溶液または５０体積％ジプロピレングリコール水溶液を用い、前記（３）と同様にして刺激の強さを評価した。その結果を表６に示す。
【０１０８】
【表６】
【０１０９】
（５）ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれによる生理学的事象とスティンギングスコア（最大値）の平均値との関係
前記（１）で算出されたＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト（表４参照）と前記（４）のスティンギングテストによる顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値（表６参照）とを、試料ごとにプロットし、顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を調べた。実施例２において、顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図３に示す。
【０１１０】
また、前記（２）で算出されたＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト（表５参照）と前記（４）のスティンギングテストによる顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値（表６参照）とを、試料ごとにプロットし、顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を調べた。実施例２において、顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図４に示す。
【０１１１】
図３に示された結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値の大きさは、顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値の大きさに比例して大きくなっていることがわかる。また、図３において、前記プロットに基づいて作成された近似直線は、式：ｙ＝０．２０８３ｘ−０．１４６４で表され、かかる近似直線のＲ２乗値は、０．８６９７である。Ｒ２乗値が１に近いほど、信頼性が高いと判断されることから、前記近似直線は、十分な信頼性を有することがわかる。したがって、顔におけるスティンギングスコア（最大値）の平均値とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとには、相関性があることがわかる。
【０１１２】
また、図４に示された結果から、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値の大きさは、顔におけるスティンギングスコアの最大値の平均値の大きさに比例して大きくなっていることがわかる。また、図４において、前記プロットに基づいて作成された近似直線は、式：ｙ＝０．３７１１ｘ−０．２７２４で表され、近似直線のＲ２乗値は、０．８７８７である。Ｒ２乗値が１に近いほど、信頼性が高いと判断されることから、前記近似直線は、十分な信頼性を有することがわかる。したがって、顔におけるスティンギングスコアの最大値の平均値とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストとには、相関性があることがわかる。
【０１１３】
さらに、表４および表５に示された結果から、試料に用いたアルコールの種類を、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストそれぞれの値の大きさの順に並べると、いずれもジプロピレングリコール、エチルアルコール、プロピレングリコールおよびグリセリンの順であることがわかる。一方、表６に示された結果から、試料に用いたアルコールの種類を、スティンギングスコア（最大値）の平均値の大きさの順に並べると、ジプロピレングリコール、エチルアルコール、プロピレングリコールおよびグリセリンの順であることがわかる。したがって、これらの結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストに基づいて皮膚外用剤を分類することができ、かつ皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さを評価することができることが示唆される。
【０１１４】
以上の結果より、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象とスティンギングテストの結果とには相関性があることから、アルコールを含む皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させ、かかる皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、迅速かつ簡便な操作で顔の皮膚に対するアルコールを含む皮膚外用剤の刺激を定量的に具体的な数値で評価することができる。
【０１１５】
また、以上の結果より、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストに基づいて顔の皮膚に対する皮膚外用剤の刺激の強さごとに皮膚外用剤を分類することができることが示唆される。
【０１１６】
さらに、以上の結果より、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞に代えて、ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１の両方を発現するＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞を用いた場合にも、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれを用いた場合と同様に評価することができることが示唆される。
【０１１７】
これらの結果より、本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、アルコールを含む化粧料などの皮膚外用剤をＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させるか、またはＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞に接触させ、皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することによって迅速かつ簡便な操作で定量的に皮膚外用剤を評価することができることがわかる。さらに、前記生理学的事象は、同一条件下に同時に何回も並行して測定することができるため、本発明の皮膚外用剤の評価方法によれば、迅速かつ高い処理効率で多種類の皮膚外用剤を評価することができることがわかる。
【０１１８】
（実施例３）
（１）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
実施例１の（１）において、試料として、前記溶媒Ａによって、表７の試料番号１の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が１０体積％となるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、表７の試料番号２の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が１０体積％となるように希釈した溶液または前記溶媒Ａによって、表７の試料番号３の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が１０体積％となるように希釈した溶液を用いたことを除き、前記実施例１の（１）と同様にして、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。なお、表７中、「％」は、体積％を示す。
【０１１９】
【表７】
【０１２０】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、前記式（Ｉ）に基づいて、Δ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。なお、式（Ｉ）中、対照は、溶媒Ａである。
【０１２１】
実施例３において、皮膚外用剤の種類とＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図５に示す。
【０１２２】
（２）ＴＲＰＶ１発現細胞による評価
実施例１の（２）において、試料として、前記溶媒Ａによって、表７の試料番号１の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が１０体積％となるように希釈した溶液、前記溶媒Ａによって、表７の試料番号２の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が１０体積％となるように希釈した溶液または前記溶媒Ａによって、表７の試料番号３の皮膚外用剤を皮膚外用剤濃度が１０体積％となるように希釈した溶液を用いたことを除き、前記実施例１の（２）と同様にして、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。
【０１２３】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、前記式（Ｉ）に基づいて、Δ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【０１２４】
実施例３において、皮膚外用剤の種類とＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストとの関係を図６に示す。
【０１２５】
（３）顔におけるスティンギングテスト
実施例３の（４）において、被験者として、３０名の健常男性からなるスティンガーを用い、試料として、表７に示される試料番号１〜３の皮膚外用剤を用いたことを除き、前記実施例３の（４）と同様にして刺激の強さを評価した。その結果を表８に示す。
【０１２６】
【表８】
【０１２７】
（５）ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれによる生理学的事象とスティンギングスコアの最大値の平均値との関係
ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニスト（図５参照）およびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニスト（図６参照）それぞれの値の大きさに基づき、顔の皮膚に対する各試料の刺激を評価した。
【０１２８】
図５および図６に示された結果から、試料の種類を、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストおよびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストそれぞれの値の大きさの順に並べると、いずれも試料１、試料２および試料３の順であることがわかる。これらの結果は、顔におけるスティンギングテストの結果と一致している。
【０１２９】
したがって、これらの結果から、顔の皮膚に対する刺激は、試料１が最も強く、試料３が最も弱いことが示唆される。
【０１３０】
以上の結果より、アルコールを含む皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１発現細胞それぞれに接触させ、かかる皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１およびＴＲＰＶ１それぞれを介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、迅速かつ簡便な操作で顔の皮膚に対するアルコールを含む皮膚外用剤の刺激を定量的に具体的な数値で評価することができる。
【０１３１】
また、以上の結果より、ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＶ１それぞれにおけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストおよびＴＲＰＶ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比皮膚外用剤／Δ蛍光強度比アゴニストに基づいてアルコールを含む皮膚外用剤を分類することができ、かつ皮膚に対するアルコールを含む皮膚外用剤の刺激の強さを評価することができることが示唆される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールを含む皮膚外用剤の評価方法であって、前記皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも１種と接触させ、前記皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および／または前記皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする皮膚外用剤の評価方法。
【請求項２】
生理学的事象が、前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さごとに前記皮膚外用剤を分類する請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激を評価する請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項１】
アルコールを含む皮膚外用剤の評価方法であって、前記皮膚外用剤を、ＴＲＰＡ１発現細胞、ＴＲＰＶ１発現細胞およびＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１共発現細胞からなる群より選ばれた少なくとも１種と接触させ、前記皮膚外用剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および／または前記皮膚外用剤によりＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする皮膚外用剤の評価方法。
【請求項２】
生理学的事象が、前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激の強さごとに前記皮膚外用剤を分類する請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記皮膚外用剤との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化の度合いをヒトの皮膚に対する刺激の強さの指標として用い、ヒトの皮膚に対する前記皮膚外用剤の刺激を評価する請求項１または２に記載の評価方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−２０９１２３（Ｐ２０１１−２０９１２３Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７７３６１（Ｐ２０１０−７７３６１）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【Ｆターム（参考）】
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