直接的な化学的溶解のための方法および組成物
直接的な化学的溶解のための組成物は、アッセイ適合性のバッファー組成物およびアッセイ適合性の界面活性剤を含んでいる。検体貯蔵のための組成物と併せる場合、このような組成物は、生物学的試料中の細胞から溶解した核酸およびタンパク質に対する望ましくない修飾を防ぐ。このような組成物からの試料のアッセイは、遠心分離および長時間の高温処理加工などの高価で時間を要するステップを必要としない。本発明の直接的な化学的溶解のための組成物は、輸送媒体をデカントして除く必要なしに、または他の点で輸送媒体をアッセイ適合性のバッファーと交換する必要なしに、生物学的試料中の細胞から核酸の直接的な抽出を可能にする。細胞から核酸を抽出するために、試料をプロテイナーゼＫまたは別の酵素と併せる必要はない。細胞を溶解してアッセイ用の標的核酸を得る方法および直接的な化学的溶解のための組成物を試料と併せるためのキットも企図される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概ね、保存されている生物学的試料に対して診断的試験を行うための方法および組成物に関し、特に、このような保存されている試料に対して核酸の抽出および増幅の方法を行うことに関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる、２００９年９月３日出願の米国特許仮出願第６１／２３９，５５３号の出願日の利益を主張するものである。
【０００３】
医学診断および医学研究の分野において、研究を支援して、対象の状態を決定し、医学診断を行うために患者の現在の状態を決定し、治療または処置の現在の経過に対する患者の反応を決定するなどのために、試料（例えば、組織）は、患者または対象（例えば、ヒト患者、ヒト対象、ヒト疾患の実験動物モデル）から採取される。
【０００４】
医学診断を行うため、または科学研究において用いるためのいずれかの、分析用に得られる試料は、対象から除去されたときに試料を分解または腐敗から防ぐために、特別な輸送／保存の媒体中に配置されることが多い。このように、試料は、対象から除去されたときにそれがあった正確な条件にできるだけ近くある。これにより、試料は確実に、試料採取時の患者または対象の状態を正確に反映し、したがってその後の試料のあらゆる試験において最も正確な結果をもたらす。これら試験のいくつかは、核酸（例えば、デオキシ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ））の抽出および増幅を伴う。
【０００５】
生物学的試料からのＤＮＡおよび／またはＲＮＡの抽出は、他のステップの中でも、細胞壁の溶解（原核細胞の場合）、細胞膜の溶解（ある種の真核細胞の場合）、またはウイルスのカプシドの溶解（ウイルスの場合）を必要とする。その後の増幅は、部分的に、標的核酸内の特定の部位へのプライマーの付着を必要とする。
【０００６】
核酸の抽出およびその後の増幅には、利用可能な数々のプロトコールが存在する。これらプロトコールのいくつかは、ハイスループットの装置を利用するものである。ハイスループットの装置は、試料が好適な化学薬品と一緒に装置内に配置され、抽出および増幅のステップが操作者からのさらなる入力なしに行われる意味で自動的である（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（登録商標）ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ Ｑx ＡｍｐｌｉｆｉｅｄのＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｐａｃｋａｇｅ ＩｎｓｅｒｔによるＶｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、２００８年）。他のプロトコールはそれほど洗練された設備を利用しておらず、手操作の手順と呼ばれるのが典型的である。しかし、プロトコールにかかわらず、核酸を放出させるために細胞またはウイルスのカプシドを溶解する必要性、試料の残りから核酸を抽出するために酸化第二鉄などの粒子に核酸を付着させる必要性、および核酸を増幅するために標的核酸に対してプライマーを付着させる必要性が残っている。
【０００７】
輸送媒体（例えば、液体の細胞学的媒体）は、１つまたは複数の方法においてある種の細胞を保存する１つまたは複数の構成成分を含んでいるのが典型的である（例えば、細胞溶解による細胞壁または細胞膜の破壊を防ぐ）。さらに、これら構成成分のいくつかは、試料の保存および除染の二重の目的を果たしている。これら構成成分は、細胞膜および細胞壁を溶解する能力、抽出された核酸が核酸抽出に利用された粒子に付着する能力、および標的核酸を増殖する能力を妨害することが知られている。
【０００８】
ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）（Ｔｒｉｐａｔｈ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｃ．）溶液、またはＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．、ＭＡ）などの液体ベースの細胞学的組成物は、それらに曝露された試料から増幅可能な標的核酸を抽出する能力に有害に影響を及ぼす。この観察される有害効果を説明するのに、１）媒体中の構成成分による核酸の分解、２）媒体中の構成成分による核酸の化学的改変、および３）抽出および増幅用の核酸の放出を阻害する、組織中の細胞溶解メカニズムの阻害を含む、多くの理由が示唆されている。抽出されたＤＮＡに対する液体の細胞学的組成物の有害効果を避けるために、細胞は溶解前に組成物から抽出される。液体の細胞学的組成物を細胞からデカントするために、遠心分離が抽出に必要とされるのが典型的である。次いで、細胞をバッファー中に再懸濁し、酵素で溶解する。このような余分なステップは、例えば、前述のＶｉｐｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍなど、多くのハイスループットの自動化装置と適合性でないのが典型的である。自動化が関与しない状況でも、このようなステップはやはり時間を要するものである。これらのステップが必要とするさらなる時間は試験結果の獲得を遅らせることがあり、避けるのが好ましい。
【０００９】
核酸を精製するための媒体キットの一例は、ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｍｅｄｉａ Ｋｉｔである。この媒体キットは、非特許文献１に記載されている。ＱＩＡａｍｐの手順は、溶解、結合、洗浄、および溶出の４つのステップを有すると記載されている。この手順において、プロテイナーゼＫを用いて試料を溶解し、引き続きシリカゲルのライセート上に吸収することによって、核酸をＱＩＡｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに結合させる。ＱＩＡａｍｐの手順は証明されている方法であるが、わずか２５０μｌの液体の細胞学的媒体の精製に最適化されており、労働力を要し、時間を要する（すなわち、異なる温度でのインキュベート６５分、遠心分離５ステップ、減圧ろ過２ステップ、およびいくつかの混合ステップを含む１８ステップを必要とする）。このような多ステップ方法の使用が、以前は、液体の細胞学的媒体およびパラフィン包埋された組織など、固定された試料から核酸を上首尾に精製するのに必要とされていた。固定化された媒体からの核酸の精製は、媒体中の固定液が試料中の標的分子の望ましくない化学修飾を導入するので、新鮮な組織から精製するより困難であることはよく知られている。反応は、試料において架橋を生じることがあり、またはその他の点で核酸を修飾することがある。輸送媒体中の他の添加物も、望ましくない架橋を引き起こすことがある。例えば、輸送媒体中にホルマリンが存在することによる架橋は、非特許文献２に記載されている。ホルムアルデヒドも、非特許文献３に記載されている通り、核酸とタンパク質との間に架橋を生成する。非特許文献４に記載されている通り、ホルマリン固定されているパラフィンロウから採取した細胞からのＤＮＡ抽出は処理加工のステップ（例えば、長時間の煮沸）を必要とするのが典型的であり、処理加工のステップは増幅用のＤＮＡの量に有害に影響を及ぼし得る。Ｓｅｐｐ，Ｒらによると、試料の煮沸は、他の事項の中でも、プロテイナーゼＫを不活化するのに必要とされる。さらに、プロテイナーゼＫは、多くの固定液中の構成成分によって阻害され、それにより、直接的な使用は、タンパク質の架橋を破壊する上で有効性が限定されたものとなっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】the QIAmp MinElute Media Handbook dated February, 2004
【非特許文献２】Rai, V.K., et al. "Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic ribonuclease A : I-Structural and functional alterations", Lab. Invest. Vol. 84 (3) : 292-299 (March 2004)
【非特許文献３】Solomon, M.J., "Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking : A probe for in vivo chromatin structures," Proc Natl. Acad. Sci. Vol. 82, pp. 6470-6474 (October 1983)
【非特許文献４】Sepp, R., et al . "Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR, " J. Clin. Pathol. Vol. 47:318-323 (1994)
【発明の概要】
【００１１】
したがって、核酸に対する架橋および他の望ましくない修飾の問題を克服するが、試料に有害に影響を及ぼし得、またはプロセスを高価で時間を要するものにし得る、長時間の高温の処理加工を必要としない、組織ならびに他の細胞および細胞成分からＤＮＡを抽出するための方法および組成物が引き続き求められている。
【００１２】
検体貯蔵のための組成物と併せるための直接的な化学的溶解のための組成物は、アッセイ適合性のバッファー組成物と、アッセイ適合性の界面活性剤とを含んでいる。このような組成物は、生物学的試料中の細胞から溶解される核酸に対する望ましくない修飾を防ぎ、このような組成物からの試料のアッセイは、遠心分離および長時間の高温の処理加工などの高価で時間を要するステップを必要としない。
【００１３】
本発明の直接的な化学的溶解のための組成物は、細胞学的媒体をデカントして除く必要なく、または他の点で細胞学的媒体をアッセイ適合性のバッファーと交換する必要なく、生物学的試料中の細胞から核酸の直接的な抽出を可能にする。細胞の溶解は、試料が依然として直接的な化学的溶解のための組成物と併せられている場合に直接起こることがある。細胞から核酸を抽出するために、試料をプロテイナーゼＫまたはいくつかの他の酵素と併せる必要性はない。
【００１４】
一実施形態において、直接的な化学的溶解のための組成物は、試料の希釈、貯蔵、輸送などに用いられる液体ベースの細胞学的（ＬＢＣ）組成物に、添加剤として配置される。試料からＮＡを抽出する前に、試料は予温またはインキュベートされるので、直接的な化学的溶解のための組成物は試料の溶解を可能にする。ＬＢＣの例には、それだけには限定されないが、ＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣおよびＴｈｉｎＰｒｅｐ ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ ＬＢＣが含まれる。
【００１５】
一実施形態において、検体貯蔵のための組成物と併せるための直接的な化学的溶解のための組成物は、アッセイ適合性のバッファー組成物およびアッセイ適合性の界面活性剤を有する。好ましい実施形態において、アッセイ適合性のバッファー組成物は、バッファー成分および金属塩成分を有する。好ましい一実施形態において、直接的な化学的溶解のための組成物のｐＨは約６．６から約１０の範囲にある。
【００１６】
適切な金属塩の例には、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸ナトリウム（Ｃ2Ｈ3Ｎａ０2）、および硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2Ｓ０4）が含まれる。記載する実施形態において、直接的な化学的溶解のための組成物中の金属塩の濃度は少なくとも約０．０１Ｍである。好ましくは、塩はＮａＣｌであり、塩濃度は約０．０１Ｍから約１Ｍの範囲にある。
【００１７】
好ましい実施形態において、バッファー成分の濃度は約０．２Ｍから約２Ｍの範囲にある。適切なバッファー成分の例には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの酸塩が含まれる。
【００１８】
ある実施形態において、直接的な化学的溶解のための組成物は非イオン性界面活性剤も含む。適切な界面活性剤の例には、ポリエチレングリコールベースの非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｏｔｏｎ（登録商標）ｘ−１００として市販されている）が含まれる。適切な非イオン性界面活性剤のさらなる例には、ポリソルベート界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商業的にポリソルベート２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０として知られる）が含まれる。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｒｉｔｏｎ（登録商標）ｘ−１００は両方とも市販されている。好ましい実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．０１から約２パーセント（ｖ／ｖ）の範囲にある。
【００１９】
ある実施形態において、直接的な化学的溶解のための組成物はグリシンも含む。
【００２０】
好ましい一実施形態において、バッファー成分はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの酸塩であり、バッファー成分の濃度は約０．７５Ｍであり、ＮａＣｌ濃度は約０．１９Ｍであり、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル濃度は約０．７５パーセント（ｖ／ｖ）である、請求項１０に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【００２１】
本発明は、検体貯蔵のための組成物中に貯蔵される試料を分析するための方法も企図するものである。この方法において、試料を、上記に記載した通り、直接的な化学的溶解のための組成物と併せる。少なくとも試料の一部分を、少なくともいくらかの検体貯蔵のための組成物と一緒に検体貯蔵のための組成物から除去する。検体貯蔵のための組成物と併せた試料を、次いで、試料の除去された部分中の細胞の少なくとも一部分を溶解するのに十分な時間、少なくとも８０℃の温度でインキュベートする。核酸を試料から抽出し、次いで増幅する。抽出は、自動化または手操作のプロセスのいずれかを用いて起こり得る。ある実施形態において、標的核酸はＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかである。
【００２２】
一実施形態において、試料を、ａ）アッセイ適合性のバッファー組成物、およびｂ）アッセイ適合性の界面活性剤を含む直接的な化学的溶解のための組成物と併せる。試料の少なくとも一部分を検体貯蔵のための組成物から除去し、除去された部分は検体貯蔵のための組成物をやはり含んでいる。試料の除去された部分を、少なくとも８０℃である温度で、試料の除去された部分中の少なくとも一部分の細胞を溶解するのに十分な時間インキュベートする。上記に記載した通り、核酸を抽出し、増幅する。この実施形態において、試料の除去された部分は、溶解および抽出のステップの前に検体貯蔵のための媒体からさらに分離されない。抽出ステップは手操作でも、または自動化のいずれかでもよい。
【００２３】
本発明の他の実施形態は、直接的な化学的溶解によって、検体貯蔵のための組成物から除去した検体から核酸を抽出するための診断キットを含む。診断キットは、上記に記載した直接的な化学的溶解のための組成物を含む。組織試料を保存するために、検体貯蔵のための組成物が提供される。
【００２４】
一実施形態において、核酸を抽出するための診断キットは、ａ）アッセイ適合性のバッファー成分、およびｂ）非イオン性界面活性剤を有する直接的な化学的溶解のための組成物を有する検体貯蔵のための組成物を含み、検体貯蔵は組織試料を保存するために提供される。アッセイ適合性のバッファー組成物は、バッファー成分および金属塩を有する。一実施形態において、金属塩はＮａＣｌであり、直接的な化学的溶解のための組成物中のＮａＣｌの濃度は少なくとも０．０１Ｍであり、バッファー成分の濃度は約０．２Ｍから約２Ｍの範囲にある。直接的な化学的溶解のための組成物のｐＨは約７から約９の範囲にあり、非イオン性界面活性剤の濃度は約０．０１から約２パーセント（ｖ／ｖ）の範囲にある。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】直接的な化学的溶解のための組成物の一実施形態の効率に対するｐＨの効果を示す図である。
【図１Ｂ】直接的な化学的溶解のための組成物の一実施形態の効率に対するｐＨの効果を示す図である。
【図１Ｃ】直接的な化学的溶解のための組成物の一実施形態の効率に対するｐＨの効果を示す図である。
【図１Ｄ】直接的な化学的溶解のための組成物の一実施形態の効率に対するｐＨの効果を示す図である。
【図２】直接的な化学的溶解のための組成物の一実施形態および本明細書に開示する方法を用いて溶解される試料からのタンパク質のバイオマーカーの検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の少なくとも一つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、以下の発明を実施するための形態において記載され、または実施例によって例証される詳細に制限されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法において実践され、もしくは行われることが可能である。また、本明細書において用いられる言葉遣いおよび専門用語は記述を目的とするものであり、限定的なものとみなしてはならないことを理解されたい。以下は、本明細書において用いるある種の語の定義である。
【００２７】
直接的な化学的溶解のための組成物は、試料から化学的溶解のための組成物を分離する介在性のステップを必要とせずに、核酸（ＮＡ）のその抽出のための試料において、細胞の成分の溶解を可能にする組成物である。直接的な化学的溶解のための組成物はまた、これらの構成成分をアッセイ／検出する前に、化学的溶解のための組成物を試料から分離する必要なしに、試料の他の構成成分（例えば、タンパク質のバイオマーカー）のアッセイ／検出を可能にする。
【００２８】
ＮＡの例には、一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡがある。本方法によって抽出することができるＮＡのさらなる例には、動物、植物、細菌、ウイルス、真菌、および寄生生物体からのゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡだけではなく、ミトコンドリアまたは葉緑体のＤＮＡまたはＲＮＡも含まれる。本方法によって抽出することができる他のクラスのＮＡの例には、ｍＲＮＡだけでなく、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、および小型の核ＲＮＡ、ならびにプラスミドＲＮＡも含まれる。本発明の方法によって抽出されるＤＮＡおよびＲＮＡは、完全に、もしくは部分的のいずれかで、一本鎖であってよく、または他の三次もしくは四次構造を有していてもよい。ＮＡを含んでいる試料は、白血球細胞などの生存能力のある試料、遺伝子組換え技術によって調製されるのが典型的であるベクターなどを含む宿主細胞の培養物、ウイルスまたはファージに感染している細胞、血液中のウイルス、および試料の微生物の培養物によって例証される。培養物は微生物を含んでいてよいが、その上清だけでも十分である。人工的な培養物だけではなく、天然に存在する培養物も適用可能である。微生物の塊を含む試料の場合は、適宜ホモジナイズまたは超音波処理を行って、良好な効率の抽出を達成してもよい。
【００２９】
代替の試料タイプには、それだけには限定されないが、感染性疾患または非感染性疾患の診断のための生物学的検体、環境検体、または食品もしくは水の試料が含まれる。標的のＮＡは特定の配列であっても、または１クラスのＮＡであってもよい。１クラスの核酸は、特定のアッセイ方法に対して、その化学的、物理的、または生物学的性質が、ＮＡ抽出に用いられる方法において効果的に抽出されることが予想され得るような分子である。必ずではないが、典型的に、１クラスのＮＡは全てのＤＮＡもしくはＤＮＡの類似体であり、または全てのＲＮＡもしくはＲＮＡの類似体である。他の標的は、タンパク質のバイオマーカーなどのタンパク質の配列であってよい。
【００３０】
標的化される生物体には、それだけには限定されないが、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１／２（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ １／２）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）、重症急性呼吸器症候群ウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザＡ／Ｂ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｂ）、単純ヘルペスウイルス１〜６（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓｅｓ １−６）、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、ウエストナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、呼吸器合胞体ウイルスＡ／Ｂ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ａ／Ｂ）、パラ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウムアビウムイントラセルラーレ複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ）、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、Ｂ群溶連菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、およびパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）が含まれ得る。
【００３１】
本発明の一態様において、標的核酸は、以下の１つまたは複数の源からの特定のＲＮＡまたはｃＤＮＡである：細菌の病原体、細菌の非病原体、ウイルスの病原体、ウイルスの非病原体、真菌の病原体、真菌の非病原体、酵母菌の病原体、酵母菌の非病原体、寄生体の病原体、寄生体の非病原体、植物、動物の生成物、食品、試料マトリックス内の全ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ、全体の原核生物のＲＮＡもしくはｃＤＮＡ、全体の真核生物のＲＮＡもしくはｃＤＮＡ、または全体のウイルスのＲＮＡもしくはｃＤＮＡ。
【００３２】
本発明の別の一態様において、探求される標的核酸は以下の１つまたは複数の源からのＤＮＡである：細菌の病原体、細菌の非病原体、ウイルスの病原体、ウイルスの非病原体、真菌の病原体、真菌の非病原体、酵母菌の病原体、酵母菌の非病原体、寄生体の病原体、寄生体の非病原体、植物、動物の生成物、食品、試料マトリックス内のＲＮＡ全体、原核生物のゲノムＤＮＡの全体、真核生物のゲノムＤＮＡの全体、または全体のウイルスのＲＮＡ。
【００３３】
本発明の別の一態様において、標的はタンパク質のバイオマーカーである。
【００３４】
検体貯蔵のための組成物は、試料中の細胞成分から核酸を抽出する前に、生物学的試料を貯蔵およびまたは輸送するのに用いられるあらゆる組成物である。上記に記載した通り、検体貯蔵のための組成物は、ＬＢＣ媒体、パラフィン媒体などを含む。
【００３５】
本明細書で用いられるアッセイ適合性は、試料（例えば、抽出された核酸／タンパク質）が曝されるアッセイに著しく有害に影響を及ぼさないあらゆる組成物である。例えば、アッセイ適合性の組成物は、タンパク質のバイオマーカーなど、核酸または他の試料の構成成分を検出するための下流のアッセイの能力に有害に影響を及ぼすやり方で、試料中の抽出された核酸を修飾しない。
【００３６】
一実施形態において、本明細書に記載する直接的な化学的溶解のための組成物は、２つの成分のアッセイ適合性のバッファー組成物を有する。アッセイ適合性のバッファー組成物は、単独で、または化学的溶解のための組成物の他の構成成分と、もしくは抽出された核酸の構成成分（例えば、検体貯蔵のための組成物の残部）と併せた場合のいずれかに、核酸を検出するための下流のアッセイの能力に有害に影響を及ぼすやり方で試料中の抽出された核酸を修飾しない。アッセイ適合性のバッファー組成物の第１の成分はアッセイ適合性のバッファーである。このようなバッファーは当業者にはよく知られており、本明細書において徹底的に列挙しない。適切なバッファーの例には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの酸塩（本明細書における、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ）が含まれる。直接的な化学的溶解のための組成物中のバッファーの最終の作業用濃度は、約０．２Ｍから約２Ｍの範囲にある。バッファー成分の濃度が約０．５Ｍから約１Ｍの範囲にあるのが好ましい。本明細書における濃度は全て、最終の作業用濃度として表される（すなわち、直接的な化学的溶解のための組成物が試料と併せられる濃度）。
【００３７】
アッセイ適合性のバッファーの第２の成分は塩である。適切な塩の例には、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｃ2Ｈ3Ｎａ０2（酢酸ナトリウム）および（ＮＨ4）2Ｓ０4（硫酸ナトリウム）が含まれる。好ましい実施形態において、塩は金属塩であり、最も好ましくはＮａＣｌである。直接的な化学的溶解のための組成物中の塩の濃度は、約０．０１Ｍから約１Ｍの範囲にある。好ましい実施形態において、金属塩の濃度は約０．１Ｍから約０．５Ｍであり、最も好ましくは約０．１Ｍから約０．４Ｍである。特定の直接的な化学的溶解のための組成物中の塩濃度は、組成物中のバッファー、ｐＨ、および界面活性剤（ある場合には）に依存する。
【００３８】
直接的な化学的溶解のための組成物はアッセイ適合性の界面活性剤も含む。適切な界面活性剤の例には、上記に記載したＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリソルベート２０）が含まれる。アッセイ適合性は上記で規定した通りである。好ましい一実施形態において、アッセイ適合性の界面活性剤はポリエチレングリコールベースの非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤の濃度は約０．０１から約２パーセント（ｖ／ｖ）の範囲にある。好ましい実施形態において、非イオン性界面活性剤はポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルである。アッセイ適合性の界面活性剤は当業者にはよく知られており、本明細書では詳しく論じない。
【００３９】
直接的な化学的溶解のための組成物は約６．６から約１０の範囲のｐＨを有する。好ましい実施形態において、ｐＨは約７から約９の範囲にある。
【００４０】
本明細書に記載する直接的な化学的溶解のための組成物は、抽出可能および増幅可能の両方のＮＡをもたらすために典型的にＮＡと媒体の構成成分との間に生じる架橋を低減することによって媒体に固定された試料からの核酸の抽出を促進する。一実施形態において、試料を直接的な化学的溶解と併せ、細胞の少なくとも一部分を化学的に溶解するために、およびＮＡ架橋が起こり、ＮＡを脱架橋する程度に約１００℃から約１３０℃の範囲の温度で約１０分から約３０分の範囲の時間インキュベートする。この後、試料からＮＡを抽出する。好ましい実施形態において、ＮＡはＤＮＡであり、ＤＮＡ抽出は酸化第二鉄粒子を用いてＤＮＡを磁気分離することによって遂行される。好ましい実施形態において、抽出のプロトコールはＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームと適合性である。このようなプロトコールは、ＤＮＡの酸化第二鉄粒子との結合、粒子から試料の残りの洗浄、および粒子からのＤＮＡの溶出をもたらす。抽出されたＤＮＡは適切な増幅および検出のアッセイ（例えば、リアルタイムＰＣＲ）にかけられる。
【００４１】
別の一実施形態において、試料を標的の抗原（例えば、タンパク質のバイオマーカー）に対して分析する。試料から抽出された抗原を検出するための従来のアッセイは当業者にはよく知られており、本明細書において詳しく記載しない。一例において、標的の抗原に結合し、アッセイするために抗体捕獲分子が用いられる。このような捕獲のための抗体法は、様々な異なるフォーマットにおいて日常的に用いられている。最も一般的に行われている技術の一つは、タンパク質の診断適用において日常的に用いられている酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。タンパク質検出方法の望ましい特徴は、これらが捕獲抗体に曝露され得、また場合によってはそれらの天然の形状を保持し、高次構造的に依存する抗体を標的の抗原に特異的に結合させるように、細胞から抗原を保存および回収の両方をする能力である。別の望ましい特徴は、正しい抗体分子を標的に対して選択的に結合させ、非特異的な相互作用を洗浄ステップの間に除去させる能力である。タンパク質のバイオマーカーの検出は、それゆえ、アッセイ適合性のバッファーが、特異的なタンパク質結合性の相互作用と適合性であり、促進することを必要とする。本明細書に記載する直接的な化学的溶解のための組成物は細胞を溶解するのに十分強力であり、それによってこれらの細胞のタンパク質含有物を遊離する。直接的な化学的溶解のための組成物は遊離されたタンパク質に有害に影響を及ぼさず、タンパク質をタンパク分解酵素から保護する。最後に、アッセイ適合性のバッファーは特異的な抗体の結合と適合性であり、変性効果、イオン相互作用などによりこれらのプロセスを妨害しない。
【００４２】
以下に、上記に記載した概念を具体的に説明するための実施例をいくつか提供する。以下の実施例は本発明の高度に特異的な実施形態であり、添付の特許請求の範囲と一致するやり方における以外は、本発明を限定するものと決して解釈してはならない。
【実施例１】
【００４３】
ＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ中に貯蔵された患者試料からのＨＰＶ ＤＮＡの抽出
直接的な化学的溶解のための組成物としての有効性を決定するために、２つの溶液を比較した。第１番目は１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含みｐＨ９．０を有する希釈液であった（本明細書における希釈液１）。第２の希釈液は３３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１６．６７ｍＭ ＮａＣｌを含みｐＨ７．８を有していた（本明細書における希釈液２）。患者由来の保存細胞を収集し、ＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ中２１日間貯蔵した。希釈液１および希釈液２は両方とも、本発明の直接的な化学的溶解のための組成物の実施形態である。
【００４４】
具体的に述べると、患者由来の保存細胞を約１２，５００細胞／ｍｌの濃度でＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ中に希釈した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）Ｖｉｐｅｒ（商標）ツール上でのアッセイ用に試験チューブ４８本を準備した。チューブ２４本は希釈液１を０．８５ｍｌ有し、２４本は同量の希釈液２を有した。希釈した患者由来の細胞（０．２５ｍｌ）を試料チューブ４８本の各々に加えた。試料と併せた後、最終の作業用バッファーの濃度は以下の通りであった：ｉ）希釈液１中、０．７７Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３８６Ｍ ＮａＣｌ、０．７７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、（ｐＨおよそ９．０）、およびｉｉ）希釈液２中、０．２５５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１２９Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨおよそ７．８）。
【００４５】
各群２４本から８本の試料を、ｉ）室温、ｉｉ）８０℃、またはｉｉｉ）１２０℃のいずれかで、全て２４時間インキュベートした。次いで、試料を室温で２５分間冷却した。次いで、酸化第二鉄（ＦＥＯ）粒子を用いて試料を改変Ｖｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲ ＤＮＡ抽出プロトコールに供し、予温またはインキュベートした試料０．８ｍｌを抽出に用いた。Ｖｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲ用の抽出プロトコールは市販されており、本明細書において詳しく記載しない。ＤＮＡが抽出される程度まで、試料用のＤＮＡを溶出／中和バッファー４００μｌ中に溶出した。溶出液（２０μｌ）をＰＣＲマスター混合物５μｌと混合し、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のプラスミドＤＮＡの標的２０コピー／反応を、ＰＣＲ阻害の試験用に各反応中に後スパイクした。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。ＤＮＡ検出を、得られたサイクル閾値（Ｃｔ）の値によって決定した。Ｃｔ値が約３０未満であれば、試料中に標的核酸が豊富にあることを示す強力な陽性反応を表す。Ｃｔ値が３０〜３５であれば、試料中に標的核酸が中程度から少量あることを示す中程度から低度の陽性反応を表す。Ｃｔ値が３５〜４５であれば、試料中に最小量の標的核酸があることを示す弱い反応を表す。Ｃｔ値が４５を超えれば、「Ｃｔなし」と表現され、ＤＮＡが検出されないことを示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
希釈液１中１２０℃のインキュベーションは、希釈液２中１２０℃のインキュベーションと比べてＨＰＶ１６およびＨＢＢのＣｔ値をそれぞれ１．９０および２．７７低減した。両方の希釈液中室温または８０℃でのインキュベーションは、ＨＰＶ１６およびＨＢＢに対して増幅をもたらさなかった。スパイクしたＨＰＶ４５およびＨＰＶ１８の検出により、アッセイ自体は作用したが、ＨＰＶ１６およびＨＢＢは低いインキュベート温度では検出されないことが確認され、溶解、抽出、または検出はこれらの試料中で生じなかったことを示していた。
【実施例２】
【００４９】
様々な希釈液および個々の希釈成分を用いたＳｕｒｅＰａｔｈからのＨＰＶ ＤＮＡの抽出
患者由来の保存細胞を、１２５００細胞／ｍｌでＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ中に希釈した。ＢＤ Ｖｉｐｅｒ試料チューブ４８本を準備した。各群にはチューブ８本が存在し、全６群（ａ〜ｆ）であった。各群において以下のバッファーの１つの０．８５ｍｌを加えた：
ａ．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）のみ、
ｂ．０．５Ｍ ＮａＣｌ、
ｃ．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、
ｄ．ａ＋ｂ＋ｃ。
【００５０】
希釈した患者の細胞（０．２５ｍｌ）を試料チューブ４８本の各々に加えた。試料と併せた後、最終の作業用バッファー濃度は以下の通りであった：ａ群 ０．７７Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｂ群０．３８６Ｍ ＮａＣｌ；ｃ群 ０．７７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；ならびにｄ群 ０．７７Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３８６Ｍ ＮａＣｌ、および０．７７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（バッファーａ、ｂ、およびｃの組合せ）。試料チューブ全てを１２０℃で２０分間インキュベートした。次いで、試料を２５分間室温に冷却した。次いで、試料をＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲツール上に搭載し、上記に記載した通り０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に試料から溶出した。溶出液（２０μｌ）を、ＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のプラスミドＤＮＡの標的２０コピー／反応を、ＰＣＲ阻害の試験に対する対照として各反応中に後スパイクした。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００５１】
【表３】
【００５２】
【表４】
【００５３】
上記のｄ）を用い、１２０℃でインキュベートしてＨＰＶタイプ１６、１８、および４５を検出した。他の個々の希釈成分（１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、および１％ Ｔｒｉｔｏｎ）は、ＨＰＶのタイプにかかわらず一貫したＤＮＡ検出をもたらさなかった。個々の各成分はＤＮＡ抽出の改善に寄与した。成分ａ、ｂ、およびｃを一緒に併せた場合に最良の結果が達成された。
【実施例３】
【００５４】
１２０℃の希釈液１および室温の希釈液２のインキュベートを用いたＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣからのＤＮＡ抽出の比較
ＳｕｒｅＰａｔｈ試料３６本を収集し、以下の２つのプロトコールにしたがって抽出した。
１）加熱なし実験
ＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）試料チューブ３６本に、実施例１に記載した希釈液２ ０．８５ｍｌを加えることによって準備した。ＳｕｒｅＰａｔｈ臨床試料（０．２５ｍｌ）を各チューブ中に加えた。試料と併せた後、最終の作業用バッファーの濃度は以下の通りであった：希釈液２に対して０．２５５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１２９Ｍ ＮａＣｌ （ｐＨおよそ７．８）。チューブ３６本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に試料から溶出した。溶出液（２０μｌ）をＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
２）加熱実験
ＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）試料チューブ３６本を準備し、これに実施例１に記載した希釈液１ ０．８５ｍｌを加えた。ＳｕｒｅＰａｔｈ臨床試料（０．２５ｍｌ）を各チューブ中に加えた。希釈液を試料と併せた後、最終の作業用バッファーの濃度は以下の通りであった：希釈液１中０．７７Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３８６Ｍ ＮａＣｌ、および０．７７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨおよそ９．０）。試料チューブ全てを１２０℃で２０分間インキュベートし、次いで２５分間室温に冷却した。チューブ３６本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に試料から溶出した。溶出液（２０μｌ）をＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。リアルタイムＰＣＲ ＨＰＶアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。ＨＰＶ４５およびＨＰＶ１８は検出されなかった。
【００５５】
【表５】
【００５６】
【表６】
【００５７】
平均して、加熱するインキュベーション／希釈液１のプロトコールは、希釈液２を用いた室温のインキュベーションのプロトコールに比べてＨＢＢの検出を４．２９Ｃｔ短縮した。タイプ１６のＨＰＶ ＤＮＡを有した試料（試料は全てＨＢＢ対照のＤＮＡを有することが推定され、一方で全ての試料が１つまたは複数のタイプのＨＰＶを有するわけではない）は短縮したＣｔ値での検出を表し、したがって加熱するインキュベーションおよび希釈液１でのプロトコールを用いた場合、室温のインキュベーションおよび希釈液２を用いたものに比べて、より検出可能になる。
【実施例４】
【００５８】
加熱あり、またはなしのＳｕｒｅＰａｔｈおよびＴｈｉｎＰｒｅｐ ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ ＬＢＣからのＤＮＡ抽出の比較
患者由来の保存細胞を、１２５００細胞／ｍｌで、ＳｕｒｅＰａｔｈまたはＴｈｉｎＰｒｅｐ陰性臨床検体のいずれか一方中に希釈した。ＢＤ Ｖｉｐｅｒ試料チューブ３２本を準備し、それらに希釈液１ ０．８５ｍｌを加えた。患者細胞をスパイクしたＳｕｒｅＰａｔｈ（０．２５ｍｌ）を試料チューブ１６本に加え、患者細胞をスパイクしたＴｈｉｎＰｒｅｐ（０．２５ｍｌ）を他の１６本の試料チューブに加えた。希釈液を試料と併せた後、最終の作業用バッファー濃度は実施例１に記載した通りであった。各群から８本の試料チューブを室温でインキュベートし、８本を１２０℃で２０分間インキュベートした。加熱したチューブを２５分間室温に冷却した。次いで、試料チューブをＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）プラットフォーム上に搭載し、試料０．８ｍｌをＤＮＡ抽出用に用いた。次いで、ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に溶出した。溶出液（２０μｌ）を、ＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５プラスミドＤＮＡ標的２０コピー／反応を、ＰＣＲ阻害の試験用に各試料中に後スパイクした。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００５９】
【表７】
【００６０】
【表８】
【００６１】
【表９】
【００６２】
希釈液１中１２０℃で検体をインキュベートすると、ＴｈｉｎＰｒｅｐおよびＳｕｒｅＰａｔｈ両方の試料に対するＨＢＢ Ｃｔ値を有意に短縮した。この低減（室温のインキュベーションに比べて）は、ＴｈｉｎＰｒｅｐ試料に対して０．９３Ｃｔであり、ＳｕｒｅＰａｔｈ試料に対して５．０８Ｃｔであった。加熱はＴｈｉｎＰｒｅｐからのＨＰＶ１６の検出に対して統計的に有意な効果がなかったが、ＳｕｒｅＰａｔｈからのＨＰＶ１６の検出を有意に改善した。
【実施例５】
【００６３】
様々なｐＨ、温度、および時間での希釈液１を用いたＳｕｒｅＰａｔｈからのＤＮＡの抽出
１１４℃で１０分間のインキュベーションのプロトコールを、実施例１に記載した希釈液１と併せて用いた（すなわち、１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、および１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ１００）。ｐＨの異なる（９．０および７．８）試料を用い、様々なインキュベーション温度およびインキュベーション時間で試験した。実施例１の希釈液２に対して、やはり、様々なｐＨを評価した（１６．６７ｍＭＮａＣｌおよび３３０ｍＭＴｒｉｓ）。
【００６４】
患者由来の保存細胞を、１２５００細胞／ｍｌの濃度でＳｕｒｅＰａｔｈ中に希釈した。試料チューブ５６本を、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームにおいて用いるために準備した。７群に各々８個の試料が存在した。７群の１本中に下記の各々のバッファー（０．８５ｍｌ）を加えた：
ａ．希釈液１、ｐＨ９．０（１２０℃、２０分インキュベーション）
ｂ．希釈液１、ｐＨ９．０（１２０℃、１０分インキュベーション）
ｃ．希釈液１、ｐＨ９．０（１１４℃、２０分インキュベーション）
ｄ．希釈液１、ｐＨ９．０（１１４℃、１０分インキュベーション）
ｅ．希釈液１、ｐＨ７．８（１２０℃、２０分インキュベーション）
ｆ．希釈液２、ｐＨ７．８（１２０℃、２０分インキュベーション）
ｇ．希釈液２、ｐＨ９．０（１２０℃、２０分インキュベーション）
【００６５】
希釈した患者試料のアリコート（０．２５ｍｌ）を各群の各チューブ中に加えた。希釈液を試料と併せた後、最終の作業用バッファー濃度は実施例１に記載した通りである。各群を、その特定された上記の温度および時間でインキュベートした。次いで、チューブを全て２５分間室温に冷却した。チューブを、それより、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）上に搭載し、０．８ｍｌを試料からのＤＮＡ抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に溶出した。各々の溶出液（２０μｌ）を、ＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のプラスミドＤＮＡの標的２０コピー／反応を、ＰＣＲ阻害のための試験に対して各反応中に後スパイクした。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００６６】
【表１０】
【００６７】
【表１１】
【００６８】
インキュベーションのプロトコール（１１４℃、１０分）は、より高温の加熱プロトコールを用いた場合に得られた程度のＨＰＶ１６に対する検出をもたらさなかった。しかし、用いたインキュベーションのプロトコールに関係なく、スパイクしたＨＰＶ４５およびＨＰＶ１８に対して同程度の検出が得られた。これより、１１４℃のプロトコールは、１２０℃のインキュベーションのプロトコールよりも低い程度のＤＮＡ抽出をもたらすことが結論づけられた。同様に、１２０℃１０分間のインキュベーションは、１２０℃２０分間のインキュベーションほどＨＰＶ１６ＤＮＡの抽出に対して効果的ではなかった。ｐＨ７．８の希釈液１を用いたＨＰＶ１６のＤＮＡの抽出および検出は、ｐＨ９．０で希釈液１を用いた抽出および検出に比べて（１２０℃２０分間のインキュベーションに対して）１Ｃｔ近くの改善を示した。希釈液１中１２０℃のインキュベーション後の抽出により、検出されたＰＣＲ複製物における標準偏差によって測定して、アッセイ変動性における有意な低減がもたらされた。
【実施例６】
【００６９】
希釈液の有効性に対するｐＨの効果
患者由来の保存細胞を、１２５００細胞／ｍｌで、ＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ媒体中に希釈した。試料チューブ４０本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム用に準備した。これらを５群に分けた。ｐＨの異なる、実施例１に記載した希釈液１（０．８５ｍｌ）を、各群におけるチューブに加えた。用いた希釈液は：
ａ．希釈液１、ｐＨ６．６
ｂ．希釈液１、ｐＨ６．７
ｃ．希釈液１、ｐＨ７．３
ｄ．希釈液１、ｐＨ８．０
ｅ．希釈液１、ｐＨ９．０、および
ｆ．希釈液１、ｐＨ１０．０。
【００７０】
希釈した保存患者細胞（０．２５ｍｌ）を各群の各チューブに加えた。各群を、１２０℃で２０分間インキュベートし、次いで、２５分間室温に冷却した。次いで、試料をＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に試料から溶出し、溶出液２０μｌをＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のプラスミドＤＮＡの標的２０コピーを、ＰＣＲ阻害に対して試験にするために各試料中に後スパイクした。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００７１】
【表１２】
【００７２】
【表１３】
【００７３】
図１Ａ〜Ｄの結果に関して、ｐＨが約７．３〜９の範囲にある希釈液１は、試料からのＨＰＶ検出の程度に関して最良の結果をもたらす。これは、試料からのＤＮＡの抽出は、ｐＨがこの範囲にある希釈液を用いる場合に最良であることを示している。スパイクしたＨＰＶ１８および４５の検出は全てのｐＨで基本的に同じであるので、ＨＰＶ１６およびＨＢＢの検出における改善は、ｐＨが７．３と９．０の範囲において得られるＤＮＡ抽出がよりよいことに起因する。
【実施例７】
【００７４】
ＤＮＡ抽出プロトコールの比較
患者由来の細胞を収集し、２つの等しい群に分けた。半分はＴｈｉｎＰｒｅｐ中に貯蔵し、他の半分はＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ中に貯蔵した。両群とも１．１４×１０7細胞／ｍｌの濃度であった。細胞濃度２．５×１０4細胞／ｍｌの保存物を、ＳｕｒｅＰａｔｈ媒体中１．１４×１０7細胞／ｍｌの保存物から調製した。この保存物を以下の抽出プロトコールに用いた。全ての抽出プロトコールの後に、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームを用いてＤＮＡ抽出を行った。
【００７５】
第１のプロトコールにおいて、ＳｕｒｅＰａｔｈ保存物の試料２２６μｌ ８本を、１３，０００ｇの力で５分間回転させた。得られた上清をデカントし、２ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテイナーゼＫをやはり含んでいた希釈液２（実施例１において記載）１ｍｌ中に再懸濁した。試料８本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームで用いるために試料チューブ中に移し、７０℃で１時間インキュベートした。この後、以下に記載するように、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上で抽出を行った。
【００７６】
第２のプロトコールにおいて、ＳｕｒｅＰａｔｈ保存物の試料（２２６μｌ）８本を、２ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテイナーゼＫをやはり含んでいた希釈液２ ７７４μｌの試料に加えることによって希釈した（１：４）。試料８本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームで用いるために試料チューブ中に移し、７０℃で１時間インキュベートした。この後、以下に記載するように、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上で抽出を行った。
【００７７】
第３のプロトコールにおいて、ＳｕｒｅＰａｔｈ保存物の試料（２５０μｌ）８本を、希釈液２（実施例１に記載）８５０μｌと併せた。試料８本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームで用いるために試料チューブ中に移し、１２０℃で２０分間インキュベートした。この後、以下に記載するように、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上で抽出を行った。
【００７８】
第４のプロトコールにおいて、ＳｕｒｅＰａｔｈ保存物の試料（２５０μｌ）８本を、希釈液１（実施例１に記載）８５０μｌと併せた。試料８本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームで用いるために試料チューブ中に移し、１２０℃で２０分間インキュベートした。この後、以下に記載する通り、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上で抽出を行った。
【００７９】
陰性対照として、希釈液２のアリコート８５０μｌ ８本を、汚染されていないＳｕｒｅＰａｔｈ媒体２５０μｌと併せた。この後、以下に記載する通り、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上で抽出を行った。
【００８０】
試料を全てＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中試料から溶出し、溶出液２０μｌをＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、およびヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００８１】
【表１４】
【００８２】
希釈液１中１２０℃のインキュベーションにより、ＨＰＶ１６に対して平均して最小のＣＴ値が得られた。これは、試験したプロトコールの中でも、希釈液１中でのインキュベーションが、試料からのＤＮＡの最良の抽出をもたらしたことを示している。希釈液２を用いる１２０℃のインキュベーションのプロトコールは、遠心沈澱なしの７０℃のプロテイナーゼＫでのインキュベーションから得られた結果よりもよい結果がもたらされた。具体的に述べると、希釈液１は、ｉ）７０℃のプロテイナーゼＫ処理（遠心沈澱後）、ｉｉ）プロテイナーゼＫ処理（遠心沈澱なし）、およびｉｉｉ）希釈液２中１２０℃のインキュベーションに比べた場合、ＨＰＶ１６の平均Ｃｔ値をそれぞれ０．９０、２．７２、および１．５低減し、ＨＢＢのＣｔ値をそれぞれ０．９７、２．４５、および１．７２低減した。
【実施例８】
【００８３】
血液をスパイクした試料からの抽出
プールしたＳｕｒｅＰａｔｈおよびＴｈｉｎＰｒｅｐの臨床陰性検体を全血と併せた。試料は１％、２％、５％、および１０％（試料体積あたりの血液の体積）を有していた。試料を全て、実施例１に記載した希釈液１中、１２０℃で２０分間インキュベートした。この後、先の実施例に記載したプロトコールを用いてＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上で抽出を行った。試料を全て、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に試料から溶出し、溶出液２０μｌをＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。リアルタイムＰＣＲ ＨＰＶアッセイをヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００８４】
【表１５】
【００８５】
【表１６】
【００８６】
アッセイは、ＬＢＣ検体中にしばしば見られる物質であり、ＰＣＲ反応の既知の阻害物質である高濃度の全血の影響を受けなかった。このＤＮＡ抽出方法は、臨床試料中に高濃度の全血が存在してもＰＣＲ増幅に適するＤＮＡを送達する。
【実施例９】
【００８７】
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織切片からのＤＮＡの抽出
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した頸部の生検組織切片を、実施例１に記載した希釈液１の２ｍｌ中１２０℃で２５分間インキュベートした。次いで、試料を室温に冷却した。冷却後、試料を、先に記載した、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上での抽出プロトコールに供した。試料を全てＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中試料から溶出し、溶出液５０μｌをＰＣＲマスター乾燥混合物中に加えた。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶサブタイプ１６、１８、４５、３１、５１、５２、５９、（３３、５８、５６、６６）、（３９、６８、３５）、およびヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００８８】
【表１７】
【００８９】
個々の試料２２個中２０個において、ＨＰＶ ＤＮＡのいくつかのサブタイプ（１つまたは複数）が上首尾に検出された。ヒト内在性ベータグロブリン遺伝子が、試料２２個中２１個に検出された。リアルタイムＰＣＲ、ならびにＨＰＶサブタイプ特異的なプライマーおよびＨＢＢに対してベータグロブリン特異的なプライマーを用いた。ベータグロブリンの結果は、現在のＤＮＡ抽出方法に付随する明らかなＰＣＲの阻害は存在しなかったことを指摘している。１試料においてベータグロブリンのシグナルを検出できず、第二にベータグロブリンおよびＨＰＶシグナルの両方を検出できなかったのは、ＤＮＡ抽出用に処理加工された切片中に十分な標的の細胞がなかったことによる可能性がある。
【実施例１０】
【００９０】
直接的な化学的溶解用の希釈液１を用いたＳｕｒＰａｔｈおよびＴｈｉｎＰｒｅｐ ＬＢＣ媒体中に貯蔵された患者由来の細胞からのＨＰＶ ＤＮＡの抽出
患者由来の保存細胞を、５０００細胞／ｍｌで、ＳｕｒｅＰａｔｈおよびＴｈｉｎｐｒｅｐ ＬＢＣ中に希釈した。各試料タイプ１６本のチューブは以下の希釈液０．０５ｍｌを有していた：１．５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．３８６Ｍ ＮａＣｌ、および１．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）。希釈液のｐＨは７．９であった。ＳｕｒｅＰａｔｈおよびＴｈｉｎＰｒｅｐ中の希釈した患者由来の細胞（０．５ｍｌ）を、希釈液を有する試料チューブの各々に加えた。試料と併せた後、最終の作業用バッファーの濃度は以下の通りであった：０．７５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１９３Ｍ ＮａＣｌ、および０．７５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）（ｐＨおよそ７．９）。併せた溶液を、直接的な化学的溶解として１２０℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲプラットフォーム上の抽出用に調製した。先に記載した抽出のプロトコールを用いた。すなわち、試料を全てＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。試料の半分は抽出の間に溶解のステップがあり、試料の半分にはなかった。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中試料から溶出し、溶出液２０μｌをＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５プラスミドＤＮＡの標的２０コピーを、ＰＣＲ阻害に対して試験するために、各試料中に後スパイクした。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。アッセイの結果を以下に記載する。
【００９１】
【表１８】
【００９２】
【表１９】
【００９３】
抽出したＤＮＡ（すなわち、ＨＰＶ１６およびＨＢＢ）ならびにスパイクしたＤＮＡ（すなわち、ＨＰＶ４５およびＨＰＶ１８）の両方に対するＤＮＡの収率は、ＮＡ抽出の間の溶解ありおよび溶解なしの両方に対してほぼ同じである（すなわち、本明細書に記載する組成物および方法の一例を用いる直接的な化学的溶解）。これは、ＴｈｉｎＰｒｅｐ（ＴＰ）およびＳｕｒｅＰａｔｈ（ＳＰ）両方の媒体に対して当てはまった。これは、本明細書に記載する組成物および方法は、他の酵素的または化学的な溶解ステップを必要とせずに、試料中の細胞の直接的な化学的溶解として供することを示している。
【実施例１１】
【００９４】
直接的な化学的溶解用の希釈液を用いたＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ媒体中に貯蔵された患者由来の細胞からのＶｉｐｅｒ ＤＮＡ抽出の能力
１か月間ＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ中に貯蔵したＣ３３Ａ細胞を、１０8、１０7、１０6、１０5、ｌＯ4、１０3、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５細胞／ｍｌに希釈した。各濃度には４本の反復が含まれた。各濃度のＳｕｒｅＰａｔｈ細胞保存物０．２５ｍｌ（各濃度０．２５ｍｌ）をＨＰＶ希釈液（１．０Ｍ Ｔｒｉｓ、０．２５７Ｍ ＮａＣｌ、および１．０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）；ｐＨ７．９）０．７５ｍｌと混合した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）；ｐＨ７．９）。希釈液を試料と併せた後、直接的な化学的溶解のための組成物の最終の作業用濃度は、０．７５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１９３Ｍ ＮａＣｌ、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）０．７５％であった（ｐＨおよそ７．９）。希釈液中の試料を１２０℃で２０分間予め温め、次いで室温に冷却した。これらの試料（０．８ｍｌ）をＶｉｐｅｒ ＸＴＲ装置を用いて抽出し、最終体積４００μＬに中に溶出した。ＤＮＡ溶出物（２０μＬ）を、リアルタイムＰＣＲ中ＰＣＲマスター混合物（５μＬ）と混合して、抽出したＨＢＢ ＤＮＡのコピー数を定量化した。ＰＣＲに、１００，０００、１０，０００、１０００、１００、１０、１コピー／反応の精製したヒトゲノムＤＮＡを加え、試料のＤＮＡの定量化に用いた。抽出の効率を、投入した細胞数に基づき、リアルタイムＰＣＲおよび合計のＨＢＢコピーによって定量化した抽出したＨＢＢコピーの比率から計算した。
【００９５】
【表２０】
【００９６】
ＳｕｒｅＰａｔｈ媒体からの抽出の能力を、上記に記載した希釈液を用いて表１１に図示する。表１１は、直接的な化学的溶解およびその後のＤＮＡ抽出は、モデル系としてＳｕｒｅＰａｔｈ媒体中ヒト頸部癌細胞系を用いて、６ｌｏｇを超える直線状のダイナミックレンジをもたらし、平均の効率は５８％であったことを示している。
【実施例１２】
【００９７】
直接的な化学的溶解ＨＰＶ希釈液の、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のタンパク質バイオマーカー検出との適合性
ＳｉＨａ細胞を、作業濃度６．７×１０6細胞／ｍｌのＨＰＶ希釈液中室温で再懸濁し、無希釈で、およびリン酸緩衝食塩水０．１％Ｔｗｅｅｎ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中２倍の段階希釈で用いた。標的の抗原を、標準のサンドイッチ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）において検出した。標的の抗原を、一次抗原を用いてマイクロウエルプレートの表面に対して結合させ、その後、ストレプトアビジンおよび西洋ワサビのペルオキシダーゼとコンジュゲートしている二次抗体、ならびに化学発光の基質を用いて検出した。図２は、４つの標的の分析物各々に対する結果を示すものであり（ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＨＰＶ１６ ＥＩＥ４、ＭＣＭ２、およびＭＣＭ６）、標的の抗原は容易に検出された。抗原の完全性は標的の抗原２つ（ＭＣＭ２およびＭＣＭ６）に対するウエスタン免疫ブロッティングによって確認され、この場合標的のタンパク質は両方とも全長であることが見出され（およそ１００キロダルトン）、著しい分解生成物はなかった（データ図示せず）。これらの結果は、ＨＰＶ希釈バッファーはタンパク質バイオマーカーの回収および検出に適合性であり、核酸の一次的な検出およびその後の、またはその前の、疾患の検出をさらに改善または洗練するためのタンパク質のバイオマーカーの検出に用いられ得ることを実証するものである。
【００９８】
本明細書に引用する参照は全て、個々の各出版物または特許または特許出願が、全ての目的でその全文において参照によって組み入れられると具体的かつ個々に指摘されたように、その全文において参照によって、および同程度の目的で本明細書に組み入れられる。
【００９９】
当業者には明らかである通り、本発明の多くの改変および変形を、その精神および範囲から逸脱することなしに行うことができる。本明細書に記載する特定の実施形態は例示のみによって提供されるものであり、本発明は、それに対してこのような特許請求の範囲が権利を与えられる同等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概ね、保存されている生物学的試料に対して診断的試験を行うための方法および組成物に関し、特に、このような保存されている試料に対して核酸の抽出および増幅の方法を行うことに関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照によって本明細書に組み入れられる、２００９年９月３日出願の米国特許仮出願第６１／２３９，５５３号の出願日の利益を主張するものである。
【０００３】
医学診断および医学研究の分野において、研究を支援して、対象の状態を決定し、医学診断を行うために患者の現在の状態を決定し、治療または処置の現在の経過に対する患者の反応を決定するなどのために、試料（例えば、組織）は、患者または対象（例えば、ヒト患者、ヒト対象、ヒト疾患の実験動物モデル）から採取される。
【０００４】
医学診断を行うため、または科学研究において用いるためのいずれかの、分析用に得られる試料は、対象から除去されたときに試料を分解または腐敗から防ぐために、特別な輸送／保存の媒体中に配置されることが多い。このように、試料は、対象から除去されたときにそれがあった正確な条件にできるだけ近くある。これにより、試料は確実に、試料採取時の患者または対象の状態を正確に反映し、したがってその後の試料のあらゆる試験において最も正確な結果をもたらす。これら試験のいくつかは、核酸（例えば、デオキシ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ））の抽出および増幅を伴う。
【０００５】
生物学的試料からのＤＮＡおよび／またはＲＮＡの抽出は、他のステップの中でも、細胞壁の溶解（原核細胞の場合）、細胞膜の溶解（ある種の真核細胞の場合）、またはウイルスのカプシドの溶解（ウイルスの場合）を必要とする。その後の増幅は、部分的に、標的核酸内の特定の部位へのプライマーの付着を必要とする。
【０００６】
核酸の抽出およびその後の増幅には、利用可能な数々のプロトコールが存在する。これらプロトコールのいくつかは、ハイスループットの装置を利用するものである。ハイスループットの装置は、試料が好適な化学薬品と一緒に装置内に配置され、抽出および増幅のステップが操作者からのさらなる入力なしに行われる意味で自動的である（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（登録商標）ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ Ｑx ＡｍｐｌｉｆｉｅｄのＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｐａｃｋａｇｅ ＩｎｓｅｒｔによるＶｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、２００８年）。他のプロトコールはそれほど洗練された設備を利用しておらず、手操作の手順と呼ばれるのが典型的である。しかし、プロトコールにかかわらず、核酸を放出させるために細胞またはウイルスのカプシドを溶解する必要性、試料の残りから核酸を抽出するために酸化第二鉄などの粒子に核酸を付着させる必要性、および核酸を増幅するために標的核酸に対してプライマーを付着させる必要性が残っている。
【０００７】
輸送媒体（例えば、液体の細胞学的媒体）は、１つまたは複数の方法においてある種の細胞を保存する１つまたは複数の構成成分を含んでいるのが典型的である（例えば、細胞溶解による細胞壁または細胞膜の破壊を防ぐ）。さらに、これら構成成分のいくつかは、試料の保存および除染の二重の目的を果たしている。これら構成成分は、細胞膜および細胞壁を溶解する能力、抽出された核酸が核酸抽出に利用された粒子に付着する能力、および標的核酸を増殖する能力を妨害することが知られている。
【０００８】
ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）（Ｔｒｉｐａｔｈ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｃ．）溶液、またはＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液（Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．、ＭＡ）などの液体ベースの細胞学的組成物は、それらに曝露された試料から増幅可能な標的核酸を抽出する能力に有害に影響を及ぼす。この観察される有害効果を説明するのに、１）媒体中の構成成分による核酸の分解、２）媒体中の構成成分による核酸の化学的改変、および３）抽出および増幅用の核酸の放出を阻害する、組織中の細胞溶解メカニズムの阻害を含む、多くの理由が示唆されている。抽出されたＤＮＡに対する液体の細胞学的組成物の有害効果を避けるために、細胞は溶解前に組成物から抽出される。液体の細胞学的組成物を細胞からデカントするために、遠心分離が抽出に必要とされるのが典型的である。次いで、細胞をバッファー中に再懸濁し、酵素で溶解する。このような余分なステップは、例えば、前述のＶｉｐｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍなど、多くのハイスループットの自動化装置と適合性でないのが典型的である。自動化が関与しない状況でも、このようなステップはやはり時間を要するものである。これらのステップが必要とするさらなる時間は試験結果の獲得を遅らせることがあり、避けるのが好ましい。
【０００９】
核酸を精製するための媒体キットの一例は、ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｍｅｄｉａ Ｋｉｔである。この媒体キットは、非特許文献１に記載されている。ＱＩＡａｍｐの手順は、溶解、結合、洗浄、および溶出の４つのステップを有すると記載されている。この手順において、プロテイナーゼＫを用いて試料を溶解し、引き続きシリカゲルのライセート上に吸収することによって、核酸をＱＩＡｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに結合させる。ＱＩＡａｍｐの手順は証明されている方法であるが、わずか２５０μｌの液体の細胞学的媒体の精製に最適化されており、労働力を要し、時間を要する（すなわち、異なる温度でのインキュベート６５分、遠心分離５ステップ、減圧ろ過２ステップ、およびいくつかの混合ステップを含む１８ステップを必要とする）。このような多ステップ方法の使用が、以前は、液体の細胞学的媒体およびパラフィン包埋された組織など、固定された試料から核酸を上首尾に精製するのに必要とされていた。固定化された媒体からの核酸の精製は、媒体中の固定液が試料中の標的分子の望ましくない化学修飾を導入するので、新鮮な組織から精製するより困難であることはよく知られている。反応は、試料において架橋を生じることがあり、またはその他の点で核酸を修飾することがある。輸送媒体中の他の添加物も、望ましくない架橋を引き起こすことがある。例えば、輸送媒体中にホルマリンが存在することによる架橋は、非特許文献２に記載されている。ホルムアルデヒドも、非特許文献３に記載されている通り、核酸とタンパク質との間に架橋を生成する。非特許文献４に記載されている通り、ホルマリン固定されているパラフィンロウから採取した細胞からのＤＮＡ抽出は処理加工のステップ（例えば、長時間の煮沸）を必要とするのが典型的であり、処理加工のステップは増幅用のＤＮＡの量に有害に影響を及ぼし得る。Ｓｅｐｐ，Ｒらによると、試料の煮沸は、他の事項の中でも、プロテイナーゼＫを不活化するのに必要とされる。さらに、プロテイナーゼＫは、多くの固定液中の構成成分によって阻害され、それにより、直接的な使用は、タンパク質の架橋を破壊する上で有効性が限定されたものとなっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】the QIAmp MinElute Media Handbook dated February, 2004
【非特許文献２】Rai, V.K., et al. "Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic ribonuclease A : I-Structural and functional alterations", Lab. Invest. Vol. 84 (3) : 292-299 (March 2004)
【非特許文献３】Solomon, M.J., "Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking : A probe for in vivo chromatin structures," Proc Natl. Acad. Sci. Vol. 82, pp. 6470-6474 (October 1983)
【非特許文献４】Sepp, R., et al . "Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR, " J. Clin. Pathol. Vol. 47:318-323 (1994)
【発明の概要】
【００１１】
したがって、核酸に対する架橋および他の望ましくない修飾の問題を克服するが、試料に有害に影響を及ぼし得、またはプロセスを高価で時間を要するものにし得る、長時間の高温の処理加工を必要としない、組織ならびに他の細胞および細胞成分からＤＮＡを抽出するための方法および組成物が引き続き求められている。
【００１２】
検体貯蔵のための組成物と併せるための直接的な化学的溶解のための組成物は、アッセイ適合性のバッファー組成物と、アッセイ適合性の界面活性剤とを含んでいる。このような組成物は、生物学的試料中の細胞から溶解される核酸に対する望ましくない修飾を防ぎ、このような組成物からの試料のアッセイは、遠心分離および長時間の高温の処理加工などの高価で時間を要するステップを必要としない。
【００１３】
本発明の直接的な化学的溶解のための組成物は、細胞学的媒体をデカントして除く必要なく、または他の点で細胞学的媒体をアッセイ適合性のバッファーと交換する必要なく、生物学的試料中の細胞から核酸の直接的な抽出を可能にする。細胞の溶解は、試料が依然として直接的な化学的溶解のための組成物と併せられている場合に直接起こることがある。細胞から核酸を抽出するために、試料をプロテイナーゼＫまたはいくつかの他の酵素と併せる必要性はない。
【００１４】
一実施形態において、直接的な化学的溶解のための組成物は、試料の希釈、貯蔵、輸送などに用いられる液体ベースの細胞学的（ＬＢＣ）組成物に、添加剤として配置される。試料からＮＡを抽出する前に、試料は予温またはインキュベートされるので、直接的な化学的溶解のための組成物は試料の溶解を可能にする。ＬＢＣの例には、それだけには限定されないが、ＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣおよびＴｈｉｎＰｒｅｐ ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ ＬＢＣが含まれる。
【００１５】
一実施形態において、検体貯蔵のための組成物と併せるための直接的な化学的溶解のための組成物は、アッセイ適合性のバッファー組成物およびアッセイ適合性の界面活性剤を有する。好ましい実施形態において、アッセイ適合性のバッファー組成物は、バッファー成分および金属塩成分を有する。好ましい一実施形態において、直接的な化学的溶解のための組成物のｐＨは約６．６から約１０の範囲にある。
【００１６】
適切な金属塩の例には、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸ナトリウム（Ｃ2Ｈ3Ｎａ０2）、および硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2Ｓ０4）が含まれる。記載する実施形態において、直接的な化学的溶解のための組成物中の金属塩の濃度は少なくとも約０．０１Ｍである。好ましくは、塩はＮａＣｌであり、塩濃度は約０．０１Ｍから約１Ｍの範囲にある。
【００１７】
好ましい実施形態において、バッファー成分の濃度は約０．２Ｍから約２Ｍの範囲にある。適切なバッファー成分の例には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの酸塩が含まれる。
【００１８】
ある実施形態において、直接的な化学的溶解のための組成物は非イオン性界面活性剤も含む。適切な界面活性剤の例には、ポリエチレングリコールベースの非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｏｔｏｎ（登録商標）ｘ−１００として市販されている）が含まれる。適切な非イオン性界面活性剤のさらなる例には、ポリソルベート界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商業的にポリソルベート２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０として知られる）が含まれる。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｒｉｔｏｎ（登録商標）ｘ−１００は両方とも市販されている。好ましい実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．０１から約２パーセント（ｖ／ｖ）の範囲にある。
【００１９】
ある実施形態において、直接的な化学的溶解のための組成物はグリシンも含む。
【００２０】
好ましい一実施形態において、バッファー成分はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの酸塩であり、バッファー成分の濃度は約０．７５Ｍであり、ＮａＣｌ濃度は約０．１９Ｍであり、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル濃度は約０．７５パーセント（ｖ／ｖ）である、請求項１０に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【００２１】
本発明は、検体貯蔵のための組成物中に貯蔵される試料を分析するための方法も企図するものである。この方法において、試料を、上記に記載した通り、直接的な化学的溶解のための組成物と併せる。少なくとも試料の一部分を、少なくともいくらかの検体貯蔵のための組成物と一緒に検体貯蔵のための組成物から除去する。検体貯蔵のための組成物と併せた試料を、次いで、試料の除去された部分中の細胞の少なくとも一部分を溶解するのに十分な時間、少なくとも８０℃の温度でインキュベートする。核酸を試料から抽出し、次いで増幅する。抽出は、自動化または手操作のプロセスのいずれかを用いて起こり得る。ある実施形態において、標的核酸はＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかである。
【００２２】
一実施形態において、試料を、ａ）アッセイ適合性のバッファー組成物、およびｂ）アッセイ適合性の界面活性剤を含む直接的な化学的溶解のための組成物と併せる。試料の少なくとも一部分を検体貯蔵のための組成物から除去し、除去された部分は検体貯蔵のための組成物をやはり含んでいる。試料の除去された部分を、少なくとも８０℃である温度で、試料の除去された部分中の少なくとも一部分の細胞を溶解するのに十分な時間インキュベートする。上記に記載した通り、核酸を抽出し、増幅する。この実施形態において、試料の除去された部分は、溶解および抽出のステップの前に検体貯蔵のための媒体からさらに分離されない。抽出ステップは手操作でも、または自動化のいずれかでもよい。
【００２３】
本発明の他の実施形態は、直接的な化学的溶解によって、検体貯蔵のための組成物から除去した検体から核酸を抽出するための診断キットを含む。診断キットは、上記に記載した直接的な化学的溶解のための組成物を含む。組織試料を保存するために、検体貯蔵のための組成物が提供される。
【００２４】
一実施形態において、核酸を抽出するための診断キットは、ａ）アッセイ適合性のバッファー成分、およびｂ）非イオン性界面活性剤を有する直接的な化学的溶解のための組成物を有する検体貯蔵のための組成物を含み、検体貯蔵は組織試料を保存するために提供される。アッセイ適合性のバッファー組成物は、バッファー成分および金属塩を有する。一実施形態において、金属塩はＮａＣｌであり、直接的な化学的溶解のための組成物中のＮａＣｌの濃度は少なくとも０．０１Ｍであり、バッファー成分の濃度は約０．２Ｍから約２Ｍの範囲にある。直接的な化学的溶解のための組成物のｐＨは約７から約９の範囲にあり、非イオン性界面活性剤の濃度は約０．０１から約２パーセント（ｖ／ｖ）の範囲にある。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】直接的な化学的溶解のための組成物の一実施形態の効率に対するｐＨの効果を示す図である。
【図１Ｂ】直接的な化学的溶解のための組成物の一実施形態の効率に対するｐＨの効果を示す図である。
【図１Ｃ】直接的な化学的溶解のための組成物の一実施形態の効率に対するｐＨの効果を示す図である。
【図１Ｄ】直接的な化学的溶解のための組成物の一実施形態の効率に対するｐＨの効果を示す図である。
【図２】直接的な化学的溶解のための組成物の一実施形態および本明細書に開示する方法を用いて溶解される試料からのタンパク質のバイオマーカーの検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の少なくとも一つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、以下の発明を実施するための形態において記載され、または実施例によって例証される詳細に制限されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法において実践され、もしくは行われることが可能である。また、本明細書において用いられる言葉遣いおよび専門用語は記述を目的とするものであり、限定的なものとみなしてはならないことを理解されたい。以下は、本明細書において用いるある種の語の定義である。
【００２７】
直接的な化学的溶解のための組成物は、試料から化学的溶解のための組成物を分離する介在性のステップを必要とせずに、核酸（ＮＡ）のその抽出のための試料において、細胞の成分の溶解を可能にする組成物である。直接的な化学的溶解のための組成物はまた、これらの構成成分をアッセイ／検出する前に、化学的溶解のための組成物を試料から分離する必要なしに、試料の他の構成成分（例えば、タンパク質のバイオマーカー）のアッセイ／検出を可能にする。
【００２８】
ＮＡの例には、一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡがある。本方法によって抽出することができるＮＡのさらなる例には、動物、植物、細菌、ウイルス、真菌、および寄生生物体からのゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡだけではなく、ミトコンドリアまたは葉緑体のＤＮＡまたはＲＮＡも含まれる。本方法によって抽出することができる他のクラスのＮＡの例には、ｍＲＮＡだけでなく、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、および小型の核ＲＮＡ、ならびにプラスミドＲＮＡも含まれる。本発明の方法によって抽出されるＤＮＡおよびＲＮＡは、完全に、もしくは部分的のいずれかで、一本鎖であってよく、または他の三次もしくは四次構造を有していてもよい。ＮＡを含んでいる試料は、白血球細胞などの生存能力のある試料、遺伝子組換え技術によって調製されるのが典型的であるベクターなどを含む宿主細胞の培養物、ウイルスまたはファージに感染している細胞、血液中のウイルス、および試料の微生物の培養物によって例証される。培養物は微生物を含んでいてよいが、その上清だけでも十分である。人工的な培養物だけではなく、天然に存在する培養物も適用可能である。微生物の塊を含む試料の場合は、適宜ホモジナイズまたは超音波処理を行って、良好な効率の抽出を達成してもよい。
【００２９】
代替の試料タイプには、それだけには限定されないが、感染性疾患または非感染性疾患の診断のための生物学的検体、環境検体、または食品もしくは水の試料が含まれる。標的のＮＡは特定の配列であっても、または１クラスのＮＡであってもよい。１クラスの核酸は、特定のアッセイ方法に対して、その化学的、物理的、または生物学的性質が、ＮＡ抽出に用いられる方法において効果的に抽出されることが予想され得るような分子である。必ずではないが、典型的に、１クラスのＮＡは全てのＤＮＡもしくはＤＮＡの類似体であり、または全てのＲＮＡもしくはＲＮＡの類似体である。他の標的は、タンパク質のバイオマーカーなどのタンパク質の配列であってよい。
【００３０】
標的化される生物体には、それだけには限定されないが、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１／２（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ １／２）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）、重症急性呼吸器症候群ウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザＡ／Ｂ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｂ）、単純ヘルペスウイルス１〜６（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓｅｓ １−６）、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、ウエストナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、呼吸器合胞体ウイルスＡ／Ｂ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ａ／Ｂ）、パラ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウムアビウムイントラセルラーレ複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ）、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、Ｂ群溶連菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、およびパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）が含まれ得る。
【００３１】
本発明の一態様において、標的核酸は、以下の１つまたは複数の源からの特定のＲＮＡまたはｃＤＮＡである：細菌の病原体、細菌の非病原体、ウイルスの病原体、ウイルスの非病原体、真菌の病原体、真菌の非病原体、酵母菌の病原体、酵母菌の非病原体、寄生体の病原体、寄生体の非病原体、植物、動物の生成物、食品、試料マトリックス内の全ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ、全体の原核生物のＲＮＡもしくはｃＤＮＡ、全体の真核生物のＲＮＡもしくはｃＤＮＡ、または全体のウイルスのＲＮＡもしくはｃＤＮＡ。
【００３２】
本発明の別の一態様において、探求される標的核酸は以下の１つまたは複数の源からのＤＮＡである：細菌の病原体、細菌の非病原体、ウイルスの病原体、ウイルスの非病原体、真菌の病原体、真菌の非病原体、酵母菌の病原体、酵母菌の非病原体、寄生体の病原体、寄生体の非病原体、植物、動物の生成物、食品、試料マトリックス内のＲＮＡ全体、原核生物のゲノムＤＮＡの全体、真核生物のゲノムＤＮＡの全体、または全体のウイルスのＲＮＡ。
【００３３】
本発明の別の一態様において、標的はタンパク質のバイオマーカーである。
【００３４】
検体貯蔵のための組成物は、試料中の細胞成分から核酸を抽出する前に、生物学的試料を貯蔵およびまたは輸送するのに用いられるあらゆる組成物である。上記に記載した通り、検体貯蔵のための組成物は、ＬＢＣ媒体、パラフィン媒体などを含む。
【００３５】
本明細書で用いられるアッセイ適合性は、試料（例えば、抽出された核酸／タンパク質）が曝されるアッセイに著しく有害に影響を及ぼさないあらゆる組成物である。例えば、アッセイ適合性の組成物は、タンパク質のバイオマーカーなど、核酸または他の試料の構成成分を検出するための下流のアッセイの能力に有害に影響を及ぼすやり方で、試料中の抽出された核酸を修飾しない。
【００３６】
一実施形態において、本明細書に記載する直接的な化学的溶解のための組成物は、２つの成分のアッセイ適合性のバッファー組成物を有する。アッセイ適合性のバッファー組成物は、単独で、または化学的溶解のための組成物の他の構成成分と、もしくは抽出された核酸の構成成分（例えば、検体貯蔵のための組成物の残部）と併せた場合のいずれかに、核酸を検出するための下流のアッセイの能力に有害に影響を及ぼすやり方で試料中の抽出された核酸を修飾しない。アッセイ適合性のバッファー組成物の第１の成分はアッセイ適合性のバッファーである。このようなバッファーは当業者にはよく知られており、本明細書において徹底的に列挙しない。適切なバッファーの例には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの酸塩（本明細書における、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ）が含まれる。直接的な化学的溶解のための組成物中のバッファーの最終の作業用濃度は、約０．２Ｍから約２Ｍの範囲にある。バッファー成分の濃度が約０．５Ｍから約１Ｍの範囲にあるのが好ましい。本明細書における濃度は全て、最終の作業用濃度として表される（すなわち、直接的な化学的溶解のための組成物が試料と併せられる濃度）。
【００３７】
アッセイ適合性のバッファーの第２の成分は塩である。適切な塩の例には、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｃ2Ｈ3Ｎａ０2（酢酸ナトリウム）および（ＮＨ4）2Ｓ０4（硫酸ナトリウム）が含まれる。好ましい実施形態において、塩は金属塩であり、最も好ましくはＮａＣｌである。直接的な化学的溶解のための組成物中の塩の濃度は、約０．０１Ｍから約１Ｍの範囲にある。好ましい実施形態において、金属塩の濃度は約０．１Ｍから約０．５Ｍであり、最も好ましくは約０．１Ｍから約０．４Ｍである。特定の直接的な化学的溶解のための組成物中の塩濃度は、組成物中のバッファー、ｐＨ、および界面活性剤（ある場合には）に依存する。
【００３８】
直接的な化学的溶解のための組成物はアッセイ適合性の界面活性剤も含む。適切な界面活性剤の例には、上記に記載したＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリソルベート２０）が含まれる。アッセイ適合性は上記で規定した通りである。好ましい一実施形態において、アッセイ適合性の界面活性剤はポリエチレングリコールベースの非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤の濃度は約０．０１から約２パーセント（ｖ／ｖ）の範囲にある。好ましい実施形態において、非イオン性界面活性剤はポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルである。アッセイ適合性の界面活性剤は当業者にはよく知られており、本明細書では詳しく論じない。
【００３９】
直接的な化学的溶解のための組成物は約６．６から約１０の範囲のｐＨを有する。好ましい実施形態において、ｐＨは約７から約９の範囲にある。
【００４０】
本明細書に記載する直接的な化学的溶解のための組成物は、抽出可能および増幅可能の両方のＮＡをもたらすために典型的にＮＡと媒体の構成成分との間に生じる架橋を低減することによって媒体に固定された試料からの核酸の抽出を促進する。一実施形態において、試料を直接的な化学的溶解と併せ、細胞の少なくとも一部分を化学的に溶解するために、およびＮＡ架橋が起こり、ＮＡを脱架橋する程度に約１００℃から約１３０℃の範囲の温度で約１０分から約３０分の範囲の時間インキュベートする。この後、試料からＮＡを抽出する。好ましい実施形態において、ＮＡはＤＮＡであり、ＤＮＡ抽出は酸化第二鉄粒子を用いてＤＮＡを磁気分離することによって遂行される。好ましい実施形態において、抽出のプロトコールはＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームと適合性である。このようなプロトコールは、ＤＮＡの酸化第二鉄粒子との結合、粒子から試料の残りの洗浄、および粒子からのＤＮＡの溶出をもたらす。抽出されたＤＮＡは適切な増幅および検出のアッセイ（例えば、リアルタイムＰＣＲ）にかけられる。
【００４１】
別の一実施形態において、試料を標的の抗原（例えば、タンパク質のバイオマーカー）に対して分析する。試料から抽出された抗原を検出するための従来のアッセイは当業者にはよく知られており、本明細書において詳しく記載しない。一例において、標的の抗原に結合し、アッセイするために抗体捕獲分子が用いられる。このような捕獲のための抗体法は、様々な異なるフォーマットにおいて日常的に用いられている。最も一般的に行われている技術の一つは、タンパク質の診断適用において日常的に用いられている酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。タンパク質検出方法の望ましい特徴は、これらが捕獲抗体に曝露され得、また場合によってはそれらの天然の形状を保持し、高次構造的に依存する抗体を標的の抗原に特異的に結合させるように、細胞から抗原を保存および回収の両方をする能力である。別の望ましい特徴は、正しい抗体分子を標的に対して選択的に結合させ、非特異的な相互作用を洗浄ステップの間に除去させる能力である。タンパク質のバイオマーカーの検出は、それゆえ、アッセイ適合性のバッファーが、特異的なタンパク質結合性の相互作用と適合性であり、促進することを必要とする。本明細書に記載する直接的な化学的溶解のための組成物は細胞を溶解するのに十分強力であり、それによってこれらの細胞のタンパク質含有物を遊離する。直接的な化学的溶解のための組成物は遊離されたタンパク質に有害に影響を及ぼさず、タンパク質をタンパク分解酵素から保護する。最後に、アッセイ適合性のバッファーは特異的な抗体の結合と適合性であり、変性効果、イオン相互作用などによりこれらのプロセスを妨害しない。
【００４２】
以下に、上記に記載した概念を具体的に説明するための実施例をいくつか提供する。以下の実施例は本発明の高度に特異的な実施形態であり、添付の特許請求の範囲と一致するやり方における以外は、本発明を限定するものと決して解釈してはならない。
【実施例１】
【００４３】
ＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ中に貯蔵された患者試料からのＨＰＶ ＤＮＡの抽出
直接的な化学的溶解のための組成物としての有効性を決定するために、２つの溶液を比較した。第１番目は１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含みｐＨ９．０を有する希釈液であった（本明細書における希釈液１）。第２の希釈液は３３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１６．６７ｍＭ ＮａＣｌを含みｐＨ７．８を有していた（本明細書における希釈液２）。患者由来の保存細胞を収集し、ＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ中２１日間貯蔵した。希釈液１および希釈液２は両方とも、本発明の直接的な化学的溶解のための組成物の実施形態である。
【００４４】
具体的に述べると、患者由来の保存細胞を約１２，５００細胞／ｍｌの濃度でＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ中に希釈した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）Ｖｉｐｅｒ（商標）ツール上でのアッセイ用に試験チューブ４８本を準備した。チューブ２４本は希釈液１を０．８５ｍｌ有し、２４本は同量の希釈液２を有した。希釈した患者由来の細胞（０．２５ｍｌ）を試料チューブ４８本の各々に加えた。試料と併せた後、最終の作業用バッファーの濃度は以下の通りであった：ｉ）希釈液１中、０．７７Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３８６Ｍ ＮａＣｌ、０．７７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、（ｐＨおよそ９．０）、およびｉｉ）希釈液２中、０．２５５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１２９Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨおよそ７．８）。
【００４５】
各群２４本から８本の試料を、ｉ）室温、ｉｉ）８０℃、またはｉｉｉ）１２０℃のいずれかで、全て２４時間インキュベートした。次いで、試料を室温で２５分間冷却した。次いで、酸化第二鉄（ＦＥＯ）粒子を用いて試料を改変Ｖｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲ ＤＮＡ抽出プロトコールに供し、予温またはインキュベートした試料０．８ｍｌを抽出に用いた。Ｖｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲ用の抽出プロトコールは市販されており、本明細書において詳しく記載しない。ＤＮＡが抽出される程度まで、試料用のＤＮＡを溶出／中和バッファー４００μｌ中に溶出した。溶出液（２０μｌ）をＰＣＲマスター混合物５μｌと混合し、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のプラスミドＤＮＡの標的２０コピー／反応を、ＰＣＲ阻害の試験用に各反応中に後スパイクした。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。ＤＮＡ検出を、得られたサイクル閾値（Ｃｔ）の値によって決定した。Ｃｔ値が約３０未満であれば、試料中に標的核酸が豊富にあることを示す強力な陽性反応を表す。Ｃｔ値が３０〜３５であれば、試料中に標的核酸が中程度から少量あることを示す中程度から低度の陽性反応を表す。Ｃｔ値が３５〜４５であれば、試料中に最小量の標的核酸があることを示す弱い反応を表す。Ｃｔ値が４５を超えれば、「Ｃｔなし」と表現され、ＤＮＡが検出されないことを示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
希釈液１中１２０℃のインキュベーションは、希釈液２中１２０℃のインキュベーションと比べてＨＰＶ１６およびＨＢＢのＣｔ値をそれぞれ１．９０および２．７７低減した。両方の希釈液中室温または８０℃でのインキュベーションは、ＨＰＶ１６およびＨＢＢに対して増幅をもたらさなかった。スパイクしたＨＰＶ４５およびＨＰＶ１８の検出により、アッセイ自体は作用したが、ＨＰＶ１６およびＨＢＢは低いインキュベート温度では検出されないことが確認され、溶解、抽出、または検出はこれらの試料中で生じなかったことを示していた。
【実施例２】
【００４９】
様々な希釈液および個々の希釈成分を用いたＳｕｒｅＰａｔｈからのＨＰＶ ＤＮＡの抽出
患者由来の保存細胞を、１２５００細胞／ｍｌでＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ中に希釈した。ＢＤ Ｖｉｐｅｒ試料チューブ４８本を準備した。各群にはチューブ８本が存在し、全６群（ａ〜ｆ）であった。各群において以下のバッファーの１つの０．８５ｍｌを加えた：
ａ．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）のみ、
ｂ．０．５Ｍ ＮａＣｌ、
ｃ．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、
ｄ．ａ＋ｂ＋ｃ。
【００５０】
希釈した患者の細胞（０．２５ｍｌ）を試料チューブ４８本の各々に加えた。試料と併せた後、最終の作業用バッファー濃度は以下の通りであった：ａ群 ０．７７Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｂ群０．３８６Ｍ ＮａＣｌ；ｃ群 ０．７７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；ならびにｄ群 ０．７７Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３８６Ｍ ＮａＣｌ、および０．７７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（バッファーａ、ｂ、およびｃの組合せ）。試料チューブ全てを１２０℃で２０分間インキュベートした。次いで、試料を２５分間室温に冷却した。次いで、試料をＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲツール上に搭載し、上記に記載した通り０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に試料から溶出した。溶出液（２０μｌ）を、ＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のプラスミドＤＮＡの標的２０コピー／反応を、ＰＣＲ阻害の試験に対する対照として各反応中に後スパイクした。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００５１】
【表３】
【００５２】
【表４】
【００５３】
上記のｄ）を用い、１２０℃でインキュベートしてＨＰＶタイプ１６、１８、および４５を検出した。他の個々の希釈成分（１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、および１％ Ｔｒｉｔｏｎ）は、ＨＰＶのタイプにかかわらず一貫したＤＮＡ検出をもたらさなかった。個々の各成分はＤＮＡ抽出の改善に寄与した。成分ａ、ｂ、およびｃを一緒に併せた場合に最良の結果が達成された。
【実施例３】
【００５４】
１２０℃の希釈液１および室温の希釈液２のインキュベートを用いたＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣからのＤＮＡ抽出の比較
ＳｕｒｅＰａｔｈ試料３６本を収集し、以下の２つのプロトコールにしたがって抽出した。
１）加熱なし実験
ＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）試料チューブ３６本に、実施例１に記載した希釈液２ ０．８５ｍｌを加えることによって準備した。ＳｕｒｅＰａｔｈ臨床試料（０．２５ｍｌ）を各チューブ中に加えた。試料と併せた後、最終の作業用バッファーの濃度は以下の通りであった：希釈液２に対して０．２５５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１２９Ｍ ＮａＣｌ （ｐＨおよそ７．８）。チューブ３６本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に試料から溶出した。溶出液（２０μｌ）をＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
２）加熱実験
ＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）試料チューブ３６本を準備し、これに実施例１に記載した希釈液１ ０．８５ｍｌを加えた。ＳｕｒｅＰａｔｈ臨床試料（０．２５ｍｌ）を各チューブ中に加えた。希釈液を試料と併せた後、最終の作業用バッファーの濃度は以下の通りであった：希釈液１中０．７７Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３８６Ｍ ＮａＣｌ、および０．７７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨおよそ９．０）。試料チューブ全てを１２０℃で２０分間インキュベートし、次いで２５分間室温に冷却した。チューブ３６本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に試料から溶出した。溶出液（２０μｌ）をＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。リアルタイムＰＣＲ ＨＰＶアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。ＨＰＶ４５およびＨＰＶ１８は検出されなかった。
【００５５】
【表５】
【００５６】
【表６】
【００５７】
平均して、加熱するインキュベーション／希釈液１のプロトコールは、希釈液２を用いた室温のインキュベーションのプロトコールに比べてＨＢＢの検出を４．２９Ｃｔ短縮した。タイプ１６のＨＰＶ ＤＮＡを有した試料（試料は全てＨＢＢ対照のＤＮＡを有することが推定され、一方で全ての試料が１つまたは複数のタイプのＨＰＶを有するわけではない）は短縮したＣｔ値での検出を表し、したがって加熱するインキュベーションおよび希釈液１でのプロトコールを用いた場合、室温のインキュベーションおよび希釈液２を用いたものに比べて、より検出可能になる。
【実施例４】
【００５８】
加熱あり、またはなしのＳｕｒｅＰａｔｈおよびＴｈｉｎＰｒｅｐ ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ ＬＢＣからのＤＮＡ抽出の比較
患者由来の保存細胞を、１２５００細胞／ｍｌで、ＳｕｒｅＰａｔｈまたはＴｈｉｎＰｒｅｐ陰性臨床検体のいずれか一方中に希釈した。ＢＤ Ｖｉｐｅｒ試料チューブ３２本を準備し、それらに希釈液１ ０．８５ｍｌを加えた。患者細胞をスパイクしたＳｕｒｅＰａｔｈ（０．２５ｍｌ）を試料チューブ１６本に加え、患者細胞をスパイクしたＴｈｉｎＰｒｅｐ（０．２５ｍｌ）を他の１６本の試料チューブに加えた。希釈液を試料と併せた後、最終の作業用バッファー濃度は実施例１に記載した通りであった。各群から８本の試料チューブを室温でインキュベートし、８本を１２０℃で２０分間インキュベートした。加熱したチューブを２５分間室温に冷却した。次いで、試料チューブをＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）プラットフォーム上に搭載し、試料０．８ｍｌをＤＮＡ抽出用に用いた。次いで、ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に溶出した。溶出液（２０μｌ）を、ＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５プラスミドＤＮＡ標的２０コピー／反応を、ＰＣＲ阻害の試験用に各試料中に後スパイクした。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００５９】
【表７】
【００６０】
【表８】
【００６１】
【表９】
【００６２】
希釈液１中１２０℃で検体をインキュベートすると、ＴｈｉｎＰｒｅｐおよびＳｕｒｅＰａｔｈ両方の試料に対するＨＢＢ Ｃｔ値を有意に短縮した。この低減（室温のインキュベーションに比べて）は、ＴｈｉｎＰｒｅｐ試料に対して０．９３Ｃｔであり、ＳｕｒｅＰａｔｈ試料に対して５．０８Ｃｔであった。加熱はＴｈｉｎＰｒｅｐからのＨＰＶ１６の検出に対して統計的に有意な効果がなかったが、ＳｕｒｅＰａｔｈからのＨＰＶ１６の検出を有意に改善した。
【実施例５】
【００６３】
様々なｐＨ、温度、および時間での希釈液１を用いたＳｕｒｅＰａｔｈからのＤＮＡの抽出
１１４℃で１０分間のインキュベーションのプロトコールを、実施例１に記載した希釈液１と併せて用いた（すなわち、１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、および１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ１００）。ｐＨの異なる（９．０および７．８）試料を用い、様々なインキュベーション温度およびインキュベーション時間で試験した。実施例１の希釈液２に対して、やはり、様々なｐＨを評価した（１６．６７ｍＭＮａＣｌおよび３３０ｍＭＴｒｉｓ）。
【００６４】
患者由来の保存細胞を、１２５００細胞／ｍｌの濃度でＳｕｒｅＰａｔｈ中に希釈した。試料チューブ５６本を、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームにおいて用いるために準備した。７群に各々８個の試料が存在した。７群の１本中に下記の各々のバッファー（０．８５ｍｌ）を加えた：
ａ．希釈液１、ｐＨ９．０（１２０℃、２０分インキュベーション）
ｂ．希釈液１、ｐＨ９．０（１２０℃、１０分インキュベーション）
ｃ．希釈液１、ｐＨ９．０（１１４℃、２０分インキュベーション）
ｄ．希釈液１、ｐＨ９．０（１１４℃、１０分インキュベーション）
ｅ．希釈液１、ｐＨ７．８（１２０℃、２０分インキュベーション）
ｆ．希釈液２、ｐＨ７．８（１２０℃、２０分インキュベーション）
ｇ．希釈液２、ｐＨ９．０（１２０℃、２０分インキュベーション）
【００６５】
希釈した患者試料のアリコート（０．２５ｍｌ）を各群の各チューブ中に加えた。希釈液を試料と併せた後、最終の作業用バッファー濃度は実施例１に記載した通りである。各群を、その特定された上記の温度および時間でインキュベートした。次いで、チューブを全て２５分間室温に冷却した。チューブを、それより、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）上に搭載し、０．８ｍｌを試料からのＤＮＡ抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に溶出した。各々の溶出液（２０μｌ）を、ＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のプラスミドＤＮＡの標的２０コピー／反応を、ＰＣＲ阻害のための試験に対して各反応中に後スパイクした。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００６６】
【表１０】
【００６７】
【表１１】
【００６８】
インキュベーションのプロトコール（１１４℃、１０分）は、より高温の加熱プロトコールを用いた場合に得られた程度のＨＰＶ１６に対する検出をもたらさなかった。しかし、用いたインキュベーションのプロトコールに関係なく、スパイクしたＨＰＶ４５およびＨＰＶ１８に対して同程度の検出が得られた。これより、１１４℃のプロトコールは、１２０℃のインキュベーションのプロトコールよりも低い程度のＤＮＡ抽出をもたらすことが結論づけられた。同様に、１２０℃１０分間のインキュベーションは、１２０℃２０分間のインキュベーションほどＨＰＶ１６ＤＮＡの抽出に対して効果的ではなかった。ｐＨ７．８の希釈液１を用いたＨＰＶ１６のＤＮＡの抽出および検出は、ｐＨ９．０で希釈液１を用いた抽出および検出に比べて（１２０℃２０分間のインキュベーションに対して）１Ｃｔ近くの改善を示した。希釈液１中１２０℃のインキュベーション後の抽出により、検出されたＰＣＲ複製物における標準偏差によって測定して、アッセイ変動性における有意な低減がもたらされた。
【実施例６】
【００６９】
希釈液の有効性に対するｐＨの効果
患者由来の保存細胞を、１２５００細胞／ｍｌで、ＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ媒体中に希釈した。試料チューブ４０本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム用に準備した。これらを５群に分けた。ｐＨの異なる、実施例１に記載した希釈液１（０．８５ｍｌ）を、各群におけるチューブに加えた。用いた希釈液は：
ａ．希釈液１、ｐＨ６．６
ｂ．希釈液１、ｐＨ６．７
ｃ．希釈液１、ｐＨ７．３
ｄ．希釈液１、ｐＨ８．０
ｅ．希釈液１、ｐＨ９．０、および
ｆ．希釈液１、ｐＨ１０．０。
【００７０】
希釈した保存患者細胞（０．２５ｍｌ）を各群の各チューブに加えた。各群を、１２０℃で２０分間インキュベートし、次いで、２５分間室温に冷却した。次いで、試料をＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に試料から溶出し、溶出液２０μｌをＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のプラスミドＤＮＡの標的２０コピーを、ＰＣＲ阻害に対して試験にするために各試料中に後スパイクした。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００７１】
【表１２】
【００７２】
【表１３】
【００７３】
図１Ａ〜Ｄの結果に関して、ｐＨが約７．３〜９の範囲にある希釈液１は、試料からのＨＰＶ検出の程度に関して最良の結果をもたらす。これは、試料からのＤＮＡの抽出は、ｐＨがこの範囲にある希釈液を用いる場合に最良であることを示している。スパイクしたＨＰＶ１８および４５の検出は全てのｐＨで基本的に同じであるので、ＨＰＶ１６およびＨＢＢの検出における改善は、ｐＨが７．３と９．０の範囲において得られるＤＮＡ抽出がよりよいことに起因する。
【実施例７】
【００７４】
ＤＮＡ抽出プロトコールの比較
患者由来の細胞を収集し、２つの等しい群に分けた。半分はＴｈｉｎＰｒｅｐ中に貯蔵し、他の半分はＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ中に貯蔵した。両群とも１．１４×１０7細胞／ｍｌの濃度であった。細胞濃度２．５×１０4細胞／ｍｌの保存物を、ＳｕｒｅＰａｔｈ媒体中１．１４×１０7細胞／ｍｌの保存物から調製した。この保存物を以下の抽出プロトコールに用いた。全ての抽出プロトコールの後に、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームを用いてＤＮＡ抽出を行った。
【００７５】
第１のプロトコールにおいて、ＳｕｒｅＰａｔｈ保存物の試料２２６μｌ ８本を、１３，０００ｇの力で５分間回転させた。得られた上清をデカントし、２ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテイナーゼＫをやはり含んでいた希釈液２（実施例１において記載）１ｍｌ中に再懸濁した。試料８本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームで用いるために試料チューブ中に移し、７０℃で１時間インキュベートした。この後、以下に記載するように、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上で抽出を行った。
【００７６】
第２のプロトコールにおいて、ＳｕｒｅＰａｔｈ保存物の試料（２２６μｌ）８本を、２ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテイナーゼＫをやはり含んでいた希釈液２ ７７４μｌの試料に加えることによって希釈した（１：４）。試料８本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームで用いるために試料チューブ中に移し、７０℃で１時間インキュベートした。この後、以下に記載するように、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上で抽出を行った。
【００７７】
第３のプロトコールにおいて、ＳｕｒｅＰａｔｈ保存物の試料（２５０μｌ）８本を、希釈液２（実施例１に記載）８５０μｌと併せた。試料８本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームで用いるために試料チューブ中に移し、１２０℃で２０分間インキュベートした。この後、以下に記載するように、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上で抽出を行った。
【００７８】
第４のプロトコールにおいて、ＳｕｒｅＰａｔｈ保存物の試料（２５０μｌ）８本を、希釈液１（実施例１に記載）８５０μｌと併せた。試料８本をＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォームで用いるために試料チューブ中に移し、１２０℃で２０分間インキュベートした。この後、以下に記載する通り、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上で抽出を行った。
【００７９】
陰性対照として、希釈液２のアリコート８５０μｌ ８本を、汚染されていないＳｕｒｅＰａｔｈ媒体２５０μｌと併せた。この後、以下に記載する通り、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上で抽出を行った。
【００８０】
試料を全てＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中試料から溶出し、溶出液２０μｌをＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、およびヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００８１】
【表１４】
【００８２】
希釈液１中１２０℃のインキュベーションにより、ＨＰＶ１６に対して平均して最小のＣＴ値が得られた。これは、試験したプロトコールの中でも、希釈液１中でのインキュベーションが、試料からのＤＮＡの最良の抽出をもたらしたことを示している。希釈液２を用いる１２０℃のインキュベーションのプロトコールは、遠心沈澱なしの７０℃のプロテイナーゼＫでのインキュベーションから得られた結果よりもよい結果がもたらされた。具体的に述べると、希釈液１は、ｉ）７０℃のプロテイナーゼＫ処理（遠心沈澱後）、ｉｉ）プロテイナーゼＫ処理（遠心沈澱なし）、およびｉｉｉ）希釈液２中１２０℃のインキュベーションに比べた場合、ＨＰＶ１６の平均Ｃｔ値をそれぞれ０．９０、２．７２、および１．５低減し、ＨＢＢのＣｔ値をそれぞれ０．９７、２．４５、および１．７２低減した。
【実施例８】
【００８３】
血液をスパイクした試料からの抽出
プールしたＳｕｒｅＰａｔｈおよびＴｈｉｎＰｒｅｐの臨床陰性検体を全血と併せた。試料は１％、２％、５％、および１０％（試料体積あたりの血液の体積）を有していた。試料を全て、実施例１に記載した希釈液１中、１２０℃で２０分間インキュベートした。この後、先の実施例に記載したプロトコールを用いてＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上で抽出を行った。試料を全て、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中に試料から溶出し、溶出液２０μｌをＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。リアルタイムＰＣＲ ＨＰＶアッセイをヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００８４】
【表１５】
【００８５】
【表１６】
【００８６】
アッセイは、ＬＢＣ検体中にしばしば見られる物質であり、ＰＣＲ反応の既知の阻害物質である高濃度の全血の影響を受けなかった。このＤＮＡ抽出方法は、臨床試料中に高濃度の全血が存在してもＰＣＲ増幅に適するＤＮＡを送達する。
【実施例９】
【００８７】
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織切片からのＤＮＡの抽出
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した頸部の生検組織切片を、実施例１に記載した希釈液１の２ｍｌ中１２０℃で２５分間インキュベートした。次いで、試料を室温に冷却した。冷却後、試料を、先に記載した、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）プラットフォーム上での抽出プロトコールに供した。試料を全てＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中試料から溶出し、溶出液５０μｌをＰＣＲマスター乾燥混合物中に加えた。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶサブタイプ１６、１８、４５、３１、５１、５２、５９、（３３、５８、５６、６６）、（３９、６８、３５）、およびヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。
【００８８】
【表１７】
【００８９】
個々の試料２２個中２０個において、ＨＰＶ ＤＮＡのいくつかのサブタイプ（１つまたは複数）が上首尾に検出された。ヒト内在性ベータグロブリン遺伝子が、試料２２個中２１個に検出された。リアルタイムＰＣＲ、ならびにＨＰＶサブタイプ特異的なプライマーおよびＨＢＢに対してベータグロブリン特異的なプライマーを用いた。ベータグロブリンの結果は、現在のＤＮＡ抽出方法に付随する明らかなＰＣＲの阻害は存在しなかったことを指摘している。１試料においてベータグロブリンのシグナルを検出できず、第二にベータグロブリンおよびＨＰＶシグナルの両方を検出できなかったのは、ＤＮＡ抽出用に処理加工された切片中に十分な標的の細胞がなかったことによる可能性がある。
【実施例１０】
【００９０】
直接的な化学的溶解用の希釈液１を用いたＳｕｒＰａｔｈおよびＴｈｉｎＰｒｅｐ ＬＢＣ媒体中に貯蔵された患者由来の細胞からのＨＰＶ ＤＮＡの抽出
患者由来の保存細胞を、５０００細胞／ｍｌで、ＳｕｒｅＰａｔｈおよびＴｈｉｎｐｒｅｐ ＬＢＣ中に希釈した。各試料タイプ１６本のチューブは以下の希釈液０．０５ｍｌを有していた：１．５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．３８６Ｍ ＮａＣｌ、および１．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）。希釈液のｐＨは７．９であった。ＳｕｒｅＰａｔｈおよびＴｈｉｎＰｒｅｐ中の希釈した患者由来の細胞（０．５ｍｌ）を、希釈液を有する試料チューブの各々に加えた。試料と併せた後、最終の作業用バッファーの濃度は以下の通りであった：０．７５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１９３Ｍ ＮａＣｌ、および０．７５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）（ｐＨおよそ７．９）。併せた溶液を、直接的な化学的溶解として１２０℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を、ＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲプラットフォーム上の抽出用に調製した。先に記載した抽出のプロトコールを用いた。すなわち、試料を全てＢＤ Ｖｉｐｅｒ ＸＴＲ（商標）上に搭載し、試料０．８ｍｌを抽出に用いた。試料の半分は抽出の間に溶解のステップがあり、試料の半分にはなかった。ＤＮＡを、溶出／中和バッファー４００μｌ中試料から溶出し、溶出液２０μｌをＰＣＲマスター混合物５μｌと混合した。ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５プラスミドＤＮＡの標的２０コピーを、ＰＣＲ阻害に対して試験するために、各試料中に後スパイクした。リアルタイムＰＣＲアッセイをＨＰＶ１６、１８、および４５、ならびにヒトＤＮＡ内在性の対照遺伝子ＨＢＢの検出に用いた。アッセイの結果を以下に記載する。
【００９１】
【表１８】
【００９２】
【表１９】
【００９３】
抽出したＤＮＡ（すなわち、ＨＰＶ１６およびＨＢＢ）ならびにスパイクしたＤＮＡ（すなわち、ＨＰＶ４５およびＨＰＶ１８）の両方に対するＤＮＡの収率は、ＮＡ抽出の間の溶解ありおよび溶解なしの両方に対してほぼ同じである（すなわち、本明細書に記載する組成物および方法の一例を用いる直接的な化学的溶解）。これは、ＴｈｉｎＰｒｅｐ（ＴＰ）およびＳｕｒｅＰａｔｈ（ＳＰ）両方の媒体に対して当てはまった。これは、本明細書に記載する組成物および方法は、他の酵素的または化学的な溶解ステップを必要とせずに、試料中の細胞の直接的な化学的溶解として供することを示している。
【実施例１１】
【００９４】
直接的な化学的溶解用の希釈液を用いたＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ媒体中に貯蔵された患者由来の細胞からのＶｉｐｅｒ ＤＮＡ抽出の能力
１か月間ＳｕｒｅＰａｔｈ ＬＢＣ中に貯蔵したＣ３３Ａ細胞を、１０8、１０7、１０6、１０5、ｌＯ4、１０3、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５細胞／ｍｌに希釈した。各濃度には４本の反復が含まれた。各濃度のＳｕｒｅＰａｔｈ細胞保存物０．２５ｍｌ（各濃度０．２５ｍｌ）をＨＰＶ希釈液（１．０Ｍ Ｔｒｉｓ、０．２５７Ｍ ＮａＣｌ、および１．０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）；ｐＨ７．９）０．７５ｍｌと混合した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）；ｐＨ７．９）。希釈液を試料と併せた後、直接的な化学的溶解のための組成物の最終の作業用濃度は、０．７５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１９３Ｍ ＮａＣｌ、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）０．７５％であった（ｐＨおよそ７．９）。希釈液中の試料を１２０℃で２０分間予め温め、次いで室温に冷却した。これらの試料（０．８ｍｌ）をＶｉｐｅｒ ＸＴＲ装置を用いて抽出し、最終体積４００μＬに中に溶出した。ＤＮＡ溶出物（２０μＬ）を、リアルタイムＰＣＲ中ＰＣＲマスター混合物（５μＬ）と混合して、抽出したＨＢＢ ＤＮＡのコピー数を定量化した。ＰＣＲに、１００，０００、１０，０００、１０００、１００、１０、１コピー／反応の精製したヒトゲノムＤＮＡを加え、試料のＤＮＡの定量化に用いた。抽出の効率を、投入した細胞数に基づき、リアルタイムＰＣＲおよび合計のＨＢＢコピーによって定量化した抽出したＨＢＢコピーの比率から計算した。
【００９５】
【表２０】
【００９６】
ＳｕｒｅＰａｔｈ媒体からの抽出の能力を、上記に記載した希釈液を用いて表１１に図示する。表１１は、直接的な化学的溶解およびその後のＤＮＡ抽出は、モデル系としてＳｕｒｅＰａｔｈ媒体中ヒト頸部癌細胞系を用いて、６ｌｏｇを超える直線状のダイナミックレンジをもたらし、平均の効率は５８％であったことを示している。
【実施例１２】
【００９７】
直接的な化学的溶解ＨＰＶ希釈液の、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のタンパク質バイオマーカー検出との適合性
ＳｉＨａ細胞を、作業濃度６．７×１０6細胞／ｍｌのＨＰＶ希釈液中室温で再懸濁し、無希釈で、およびリン酸緩衝食塩水０．１％Ｔｗｅｅｎ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中２倍の段階希釈で用いた。標的の抗原を、標準のサンドイッチ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）において検出した。標的の抗原を、一次抗原を用いてマイクロウエルプレートの表面に対して結合させ、その後、ストレプトアビジンおよび西洋ワサビのペルオキシダーゼとコンジュゲートしている二次抗体、ならびに化学発光の基質を用いて検出した。図２は、４つの標的の分析物各々に対する結果を示すものであり（ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＨＰＶ１６ ＥＩＥ４、ＭＣＭ２、およびＭＣＭ６）、標的の抗原は容易に検出された。抗原の完全性は標的の抗原２つ（ＭＣＭ２およびＭＣＭ６）に対するウエスタン免疫ブロッティングによって確認され、この場合標的のタンパク質は両方とも全長であることが見出され（およそ１００キロダルトン）、著しい分解生成物はなかった（データ図示せず）。これらの結果は、ＨＰＶ希釈バッファーはタンパク質バイオマーカーの回収および検出に適合性であり、核酸の一次的な検出およびその後の、またはその前の、疾患の検出をさらに改善または洗練するためのタンパク質のバイオマーカーの検出に用いられ得ることを実証するものである。
【００９８】
本明細書に引用する参照は全て、個々の各出版物または特許または特許出願が、全ての目的でその全文において参照によって組み入れられると具体的かつ個々に指摘されたように、その全文において参照によって、および同程度の目的で本明細書に組み入れられる。
【００９９】
当業者には明らかである通り、本発明の多くの改変および変形を、その精神および範囲から逸脱することなしに行うことができる。本明細書に記載する特定の実施形態は例示のみによって提供されるものであり、本発明は、それに対してこのような特許請求の範囲が権利を与えられる同等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）アッセイ適合性のバッファー組成物と、
ｂ）アッセイ適合性の界面活性剤と
を含む、検体貯蔵のための組成物と併せるための直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項２】
アッセイ適合性のバッファー組成物はバッファー成分および金属塩成分をさらに含む、請求項１に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項３】
ｐＨは約６．６から約１０の範囲にある、請求項２に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項４】
金属塩成分は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸ナトリウム（Ｃ2Ｈ3Ｎａ０2）、および硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2Ｓ０4）からなる群から選択され、直接的な化学的溶解のための組成物中の金属塩の濃度は少なくとも約０．０１Ｍである、請求項２に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項５】
バッファー成分の濃度は約０．２Ｍから約２Ｍの範囲にある、請求項４に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項６】
金属塩成分はＮａＣｌであり、ＮａＣｌ濃度は約０．０１Ｍから約１Ｍの範囲にある、請求項５に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項７】
バッファー成分は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの酸塩からなる群から選択される、請求項６に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤はポリエチレングリコールベースの非イオン性界面活性剤である、請求項７に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項９】
非イオン性界面活性剤の濃度は約０．０１から約２パーセント（ｖ／ｖ）の範囲にある、請求項７に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項１０】
非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、およびポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルからなる群から選択される、請求項９に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項１１】
バッファー成分はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの酸塩であり、バッファー成分の濃度は約０．７５Ｍであり、ＮａＣｌの濃度は約０．１９Ｍであり、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルの濃度は約０．７５パーセント（ｖ／ｖ）である、請求項１０に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項１２】
グリシンをさらに含む、請求項１１に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項１３】
試料を、ａ）アッセイ適合性のバッファー組成物、およびｂ）アッセイ適合性の界面活性剤を含む直接的な化学的溶解のための組成物と併せるステップと、
検体貯蔵のための組成物から少なくとも試料の一部分を除去するステップであって、除去された部分も検体貯蔵のための組成物を含んでいるステップと、
試料の除去された部分を、少なくとも８０℃である温度で、試料の除去された部分中の細胞の少なくとも一部分を溶解するのに十分な時間インキュベートするステップと、
試料の除去された部分から標的を抽出するステップと、
試料の除去された部分中の標的をアッセイするステップと
を含む、検体貯蔵のための組成物中に貯蔵される試料を分析するための方法。
【請求項１４】
標的は標的核酸であり、アッセイは標的核酸に対する増幅アッセイである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的核酸はＤＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的核酸はＲＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
試料は血液試料である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
試料は、膣の細胞、頸部の細胞、子宮頸管の細胞、肛門の細胞、剥脱した細胞、口腔の細胞、咽頭の細胞、および腹膜の細胞からなる群から選択される細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
細胞は、スワブ、ブラシ、ブルーム（ｂｒｏｏｍ）、または生検によって採集される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
検体貯蔵のための組成物は、ホルムアルデヒド、ギ酸、メタノール、エタノール、緩衝ホルマリン、ＥＤＴＡ、ポリペプチド、ポリアミノ酸、および多糖からなる群から選択される少なくとも１つの構成成分を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
輸送媒体は緩衝ホルマリンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
試料の除去された部分は、溶解および抽出のステップの前に検体貯蔵のための媒体からさらに分離されない、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
直接的な化学的溶解のための組成物のｐＨは約６．６から約１０の範囲にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
アッセイ適合性のバッファー組成物はバッファー成分および金属塩を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
金属塩はＮａＣｌであり、直接的な化学的溶解のための組成物中のＮａＣｌ濃度は少なくとも約０．０１Ｍである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
バッファー成分の濃度は約０．２Ｍから約２Ｍの範囲にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＮａＣｌの濃度は約０．０１Ｍから約１Ｍの範囲にある、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
非イオン性界面活性剤の濃度は約０．０１から約２パーセント（ｖ／ｖ）の範囲にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
バッファー成分はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの酸塩であり、バッファーの濃度は約０．７５Ｍであり、ＮａＣｌ濃度は約０．１９Ｍであり、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルの濃度は約０．７５パーセント（ｖ／ｖ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
抽出のステップは手操作のプロセスによって行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項３１】
増幅ステップのステップは手操作のプロセスによって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項３２】
抽出のステップおよび増幅のステップは自動化されたプロセスによって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項３３】
標的はタンパク質であり、アッセイはタンパク質に対する検出アッセイである、請求項１３に記載の方法。
【請求項３４】
タンパク質はバイオマーカーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
バイオマーカーは抗体および抗原からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
アッセイは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
検体貯蔵のための組成物を、ａ）アッセイ適合性のバッファー成分、およびｂ）非イオン性界面活性剤を含む直接的な化学的溶解のための組成物と一緒に含み、検体貯蔵は組織試料を保存するために提供される、細胞成分から標的分子を抽出するための診断キット。
【請求項３８】
アッセイ適合性のバッファー組成物はバッファー成分および金属塩を含む、請求項３７に記載の診断キット。
【請求項３９】
金属塩はＮａＣｌであり、直接的な化学的溶解のための組成物中のＮａＣｌの濃度は少なくとも約０．０１Ｍである、請求項３８に記載の診断キット。
【請求項４０】
バッファー成分の濃度は約０．２Ｍから約２Ｍの範囲にある、請求項３７に記載の診断キット。
【請求項４１】
直接的な化学的溶解のための組成物は約７から約９の範囲のｐＨを有する、請求項４０に記載の診断キット。
【請求項４２】
非イオン性界面活性剤の濃度は約０．０１から約２パーセント（ｖ／ｖ）の範囲にある、請求項４０に記載の診断キット。
【請求項１】
ａ）アッセイ適合性のバッファー組成物と、
ｂ）アッセイ適合性の界面活性剤と
を含む、検体貯蔵のための組成物と併せるための直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項２】
アッセイ適合性のバッファー組成物はバッファー成分および金属塩成分をさらに含む、請求項１に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項３】
ｐＨは約６．６から約１０の範囲にある、請求項２に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項４】
金属塩成分は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸ナトリウム（Ｃ2Ｈ3Ｎａ０2）、および硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2Ｓ０4）からなる群から選択され、直接的な化学的溶解のための組成物中の金属塩の濃度は少なくとも約０．０１Ｍである、請求項２に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項５】
バッファー成分の濃度は約０．２Ｍから約２Ｍの範囲にある、請求項４に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項６】
金属塩成分はＮａＣｌであり、ＮａＣｌ濃度は約０．０１Ｍから約１Ｍの範囲にある、請求項５に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項７】
バッファー成分は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの酸塩からなる群から選択される、請求項６に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤はポリエチレングリコールベースの非イオン性界面活性剤である、請求項７に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項９】
非イオン性界面活性剤の濃度は約０．０１から約２パーセント（ｖ／ｖ）の範囲にある、請求項７に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項１０】
非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、およびポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルからなる群から選択される、請求項９に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項１１】
バッファー成分はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの酸塩であり、バッファー成分の濃度は約０．７５Ｍであり、ＮａＣｌの濃度は約０．１９Ｍであり、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルの濃度は約０．７５パーセント（ｖ／ｖ）である、請求項１０に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項１２】
グリシンをさらに含む、請求項１１に記載の直接的な化学的溶解のための組成物。
【請求項１３】
試料を、ａ）アッセイ適合性のバッファー組成物、およびｂ）アッセイ適合性の界面活性剤を含む直接的な化学的溶解のための組成物と併せるステップと、
検体貯蔵のための組成物から少なくとも試料の一部分を除去するステップであって、除去された部分も検体貯蔵のための組成物を含んでいるステップと、
試料の除去された部分を、少なくとも８０℃である温度で、試料の除去された部分中の細胞の少なくとも一部分を溶解するのに十分な時間インキュベートするステップと、
試料の除去された部分から標的を抽出するステップと、
試料の除去された部分中の標的をアッセイするステップと
を含む、検体貯蔵のための組成物中に貯蔵される試料を分析するための方法。
【請求項１４】
標的は標的核酸であり、アッセイは標的核酸に対する増幅アッセイである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的核酸はＤＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的核酸はＲＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
試料は血液試料である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
試料は、膣の細胞、頸部の細胞、子宮頸管の細胞、肛門の細胞、剥脱した細胞、口腔の細胞、咽頭の細胞、および腹膜の細胞からなる群から選択される細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
細胞は、スワブ、ブラシ、ブルーム（ｂｒｏｏｍ）、または生検によって採集される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
検体貯蔵のための組成物は、ホルムアルデヒド、ギ酸、メタノール、エタノール、緩衝ホルマリン、ＥＤＴＡ、ポリペプチド、ポリアミノ酸、および多糖からなる群から選択される少なくとも１つの構成成分を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
輸送媒体は緩衝ホルマリンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
試料の除去された部分は、溶解および抽出のステップの前に検体貯蔵のための媒体からさらに分離されない、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
直接的な化学的溶解のための組成物のｐＨは約６．６から約１０の範囲にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
アッセイ適合性のバッファー組成物はバッファー成分および金属塩を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
金属塩はＮａＣｌであり、直接的な化学的溶解のための組成物中のＮａＣｌ濃度は少なくとも約０．０１Ｍである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
バッファー成分の濃度は約０．２Ｍから約２Ｍの範囲にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＮａＣｌの濃度は約０．０１Ｍから約１Ｍの範囲にある、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
非イオン性界面活性剤の濃度は約０．０１から約２パーセント（ｖ／ｖ）の範囲にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
バッファー成分はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの酸塩であり、バッファーの濃度は約０．７５Ｍであり、ＮａＣｌ濃度は約０．１９Ｍであり、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテルの濃度は約０．７５パーセント（ｖ／ｖ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
抽出のステップは手操作のプロセスによって行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項３１】
増幅ステップのステップは手操作のプロセスによって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項３２】
抽出のステップおよび増幅のステップは自動化されたプロセスによって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項３３】
標的はタンパク質であり、アッセイはタンパク質に対する検出アッセイである、請求項１３に記載の方法。
【請求項３４】
タンパク質はバイオマーカーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
バイオマーカーは抗体および抗原からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
アッセイは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
検体貯蔵のための組成物を、ａ）アッセイ適合性のバッファー成分、およびｂ）非イオン性界面活性剤を含む直接的な化学的溶解のための組成物と一緒に含み、検体貯蔵は組織試料を保存するために提供される、細胞成分から標的分子を抽出するための診断キット。
【請求項３８】
アッセイ適合性のバッファー組成物はバッファー成分および金属塩を含む、請求項３７に記載の診断キット。
【請求項３９】
金属塩はＮａＣｌであり、直接的な化学的溶解のための組成物中のＮａＣｌの濃度は少なくとも約０．０１Ｍである、請求項３８に記載の診断キット。
【請求項４０】
バッファー成分の濃度は約０．２Ｍから約２Ｍの範囲にある、請求項３７に記載の診断キット。
【請求項４１】
直接的な化学的溶解のための組成物は約７から約９の範囲のｐＨを有する、請求項４０に記載の診断キット。
【請求項４２】
非イオン性界面活性剤の濃度は約０．０１から約２パーセント（ｖ／ｖ）の範囲にある、請求項４０に記載の診断キット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５０３６３９（Ｐ２０１３−５０３６３９Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２８０４０（Ｐ２０１２−５２８０４０）
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７６５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８８８７
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５９５１１７０９１）ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー (539)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】１ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ ０７４１７−１８８０， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７６５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８８８７
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５９５１１７０９１）ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー (539)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】１ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ ０７４１７−１８８０， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]