磁気ビーズ及び微生物検出方法
【課題】 より簡易かつ高感度に微生物の検出を行うための磁気ビーズ及び微生物検出方法を提供する。
【解決手段】 サルモネラ２１の細胞表層の構成成分であるリポポリサッカライドと特異的に反応するポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズ（ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１）を用いて、サルモネラ２１を捕捉する。そして、そのポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を磁気ビーズ分離用磁石２５により分離し、分離されたポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１により捕捉されているサルモネラ２１に、ビオチン標識抗体３２を結合させ、さらに、アビジン・ルシフェラーゼ複合体３３を結合させる。そして、ルシフェリンを基質とする発光反応により、サルモネラ２１を検出する。
【解決手段】 サルモネラ２１の細胞表層の構成成分であるリポポリサッカライドと特異的に反応するポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズ（ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１）を用いて、サルモネラ２１を捕捉する。そして、そのポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を磁気ビーズ分離用磁石２５により分離し、分離されたポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１により捕捉されているサルモネラ２１に、ビオチン標識抗体３２を結合させ、さらに、アビジン・ルシフェラーゼ複合体３３を結合させる。そして、ルシフェリンを基質とする発光反応により、サルモネラ２１を検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素免疫測定法により微生物を検出するための磁気ビーズ及び微生物検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
飲食物がサルモネラ等に汚染されている場合には食中毒等の危険があるため、従来から、サルモネラの検出方法や、検出キットが多数開発されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
サルモネラの検出には、酵素免疫測定法等を用いることができる。この酵素免疫測定法は、例えば、ウェルに固定化した抗体とサルモネラの抗原（鞭毛等の抗原）とを反応させ、さらに、酵素で標識された抗体をサルモネラに反応させ、その酵素に対する基質を添加し発色させる。
【０００４】
また、免疫磁気分離法によりサルモネラを検出するためのキットが開発されている。この方法では、鉄粒子を含むポリスチレンビーズにサルモネラの特異抗体を結合させたものを用いて、液体培養したサルモネラを分離することができる。そして、分離したサルモネラを培養する。また、免疫磁気分離法と酵素免疫測定法とを併用して、免疫磁気分離法によりサルモネラを濃縮し、次いで、酵素免疫測定法によりサルモネラを検出する方法も開発されている。
【非特許文献１】伊藤 武、「食品からのサルモネラ簡易検査法の進展」、食品工業、株式会社光琳、１９９５年１２月３０日、３８巻、２４号、ｐ．３８−４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、上記の従来の酵素免疫測定法では、菌捕捉用固相としてプラスチック製ウェルを採用しているため、固定化できる捕捉用抗体量が制限され、検出感度や検出範囲が不十分である。また、検出系に発色法を採用しているため、検出感度が発光法に比べて劣っている。さらに、免疫測定用の抗原を増殖させるために、菌増殖用の培養工程の他に、免疫測定用の培養行程が必要である。
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、より簡易かつ高感度に微生物の検出を行うための磁気ビーズ及び微生物検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の磁気ビーズは、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化し、前記リガンドと前記レセプタとの特異的な反応により前記微生物を捕捉可能である。これによれば、磁気ビーズに固定化されたリガンドと特異的に反応するレセプタを細胞表層に有する微生物を捕捉できる。
【０００８】
この磁気ビーズにおいて、前記リガンドをポリミキシンＢとすることができる。これによれば、ポリミキシンＢと特異的に反応するレセプタを細胞表層に有する微生物を、磁気ビーズにより捕捉できる。
【０００９】
本発明の微生物検出方法は、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応をするリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて、前記リガンドと前記レセプタとの特
異的な反応により前記磁気ビーズにより微生物を捕捉し、前記磁気ビーズを磁気ビーズ分離用磁石により分離し、分離された磁気ビーズに固定化されたリガンドにより捕捉されている微生物を発光法により検出する。これによれば、磁気ビーズに固定化されたリガンドと特異的に反応するレセプタを細胞表層に有する微生物を捕捉し、その微生物を分離できる。そして、その微生物を発光法により検出できる。従って、磁気ビーズと磁気ビーズ分離磁石とを用いることで、より簡単に微生物の捕捉や、未反応物質の除去や洗浄を行うことができるとともに、磁気ビーズを増やすことにより、多量の捕捉体で微生物の捕捉を行うことができる。また、捕捉された微生物の検出を発光法により行うため、発色法等と比べて、より高感度に検出を行うことができる。従って、微生物の検出を、より簡易かつ高感度に行うことができる。
【００１０】
この微生物検出方法において、前記発光法は、前記微生物が有する抗原に特異的に反応するビオチン標識抗体を導入し、さらに、アビジン又はストレプトアビジンとルシフェラーゼの複合体を導入することにより、ルシフェリンを基質とする発光反応により検出を行うことによるものとすることができる。これによれば、より高感度に微生物を検出できる。
【００１１】
この微生物検出方法において、前記リガンドをポリミキシンＢとし、前記リガンドにより捕捉される微生物を、リポポリサッカライドを細胞表層の構成成分とする微生物とすることができる。これによれば、ポリミキシンＢが固定化された磁気ビーズを用いて、より簡易かつ高感度に、リポポリサッカライドを細胞表層の構成成分とする微生物を検出できる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、より簡易かつ高感度に微生物の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を具体化した実施形態について説明する。
本発明における微生物検出方法では、酵素反応と免疫反応（抗原抗体反応）を利用する酵素免疫測定法により、微生物の検出を行う。本発明における微生物検出方法では、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて微生物を捕捉し、発光法により捕捉された微生物の検出を行う。この微生物検出方法では、（ａ）リガンドを固定化した磁気ビーズにより微生物を捕捉する工程、（ｂ）捕捉された微生物を分離する工程、（ｃ）捕捉された微生物を発光法により検出する工程を含む。
【００１４】
まず、リガンドを固定化した磁気ビーズについて説明する。
＜リガンドを固定化した磁気ビーズ＞
本発明では、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて微生物を捕捉する。従って、磁気ビーズに固定化するリガンドとしては、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に結合するものを用いる。なお、微生物の細胞膜と外膜又は細胞壁とをまとめて細胞表層と総称する。
【００１５】
本実施形態では、磁気ビーズに固定化するリガンドとして、ポリミキシンＢを用いる。このポリミキシンＢは、グラム陰性菌の外膜の構成成分であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）と特異的に結合することが知られている。従って、ポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズを用いれば、ポリミキシンＢとリポポリサッカライドとの特異的な結合により、細胞表層の構成成分にリポポリサッカライドを含む微生物を捕捉することができる。細胞表層の構成成分にリポポリサッカライドを含む微生物として、グラム陰性菌であるサルモネラ（Salmonella）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）や大腸菌（Escherichia coli）
等がある。
【００１６】
また、黄色ぶどう球菌 (Staphylococcus aureus)の細胞壁の構成成分であるプロテインＡ（protein Ａ） と特異的に結合する特定の免疫グロブリン分子を固定化した磁気ビー
ズを用いれば、黄色ぶどう球菌の捕捉が可能となる。なお、プロテインＡは、ヒト、マウス、ウサギ等の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃフラグメントと特異的に結合することが知られている（ただし、ヒトＩｇＧ３とは結合しない）。
【００１７】
磁気ビーズは、微生物を捕捉し分離するのに適した大きさであることが好ましい。例えば、サルモネラを捕捉し分離する場合、直径４．５μｍの磁気ビーズの方が、直径２．８μｍの磁気ビーズよりも適しているという実験結果が得られている。
【００１８】
＜微生物検出方法＞
次に、本発明の微生物検出方法を、図１を用いて説明する。なお、ここでは、ポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズを用いてサルモネラを捕捉し、サルモネラの検出を行う場合について説明するが、本発明における磁気ビーズに固定化するリガンド及び検出対象の微生物は、これに限定されるものではない。
【００１９】
まず、サルモネラの検出を行うための培養液を用意し、自動分注装置を用いて、以下の（ａ），（ｂ），（ｃ−１），（ｃ−２）の工程を実行する。
（ａ）リガンドを固定化した磁気ビーズにより微生物を捕捉する工程
まず、自動分注装置を用いて、サルモネラの検出を行う培養液に、ポリミキシンＢ２２を固定化した磁気ビーズ２３（ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１）を添加して、例えば「３７℃で１５分間」の条件下でインキュベートする。ここで、サルモネラが含まれる培養液（サルモネラ培養液）にポリミキシンＢ固定化磁気ビーズを添加した状態を図１の（１）に示す。このように、自動分注装置の容器内のサルモネラ培養液中にサルモネラ２１と、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１が浮遊している状態となる。そして、例えば「３７℃で１５分間」という条件下でインキュベートすると、（２）に示すように、サルモネラ２１の細胞表層の構成成分であるリポポリサッカライドとポリミキシンＢ２２とが特異的に結合する。この結果、サルモネラ２１がポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉される。
【００２０】
（ｂ）捕捉された微生物を分離する工程
次に、（３）に示すように、自動分注装置の磁気ビーズ分離用磁石２５により、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を集める。具体的には、磁気ビーズ分離用磁石２５を、サルモネラ培養液が入れられた容器の壁側に近づける。これにより、磁気ビーズ分離用磁石２５にポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１が引き寄せられ、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を容器の壁面に集めることができる。
【００２１】
そして、反応液を廃棄することによりポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を回収できる。これにより、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１により捕捉されたサルモネラ２１が分離される。
【００２２】
そして、洗浄液を注入して、サルモネラ２１が捕捉されたポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を洗浄する。これにより、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されていないサルモネラ２１等を含むサルモネラ培養液が除去される。
【００２３】
（ｃ）捕捉された微生物を発光法により検出する工程
（ｃ−１）ビオチン修飾抗体を反応させる工程
次に、洗浄後の、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されたサルモネラ２１に
、（４）に示すビオチン標識抗体３２を加える。このビオチン標識抗体３２は、抗体２６にビオチン２７が標識されている。このビオチン標識抗体３２は、サルモネラの表面に存在する抗原（例えば、細胞表層の構成成分）と特異的に結合する抗体である。なお、この反応液中では、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されたサルモネラ２１は、磁気ビーズ分離用磁石２５に引き寄せられて、容器の壁側に集められている。
【００２４】
この反応液を、例えば「３７℃で１５分間」という条件下でインキュベートする。これにより、ビオチン標識抗体３２と、サルモネラ２１の表面の抗原とが特異的に結合する。この抗原とビオチン標識抗体３２との結合により、（４）に示すように、サルモネラ２１の表面にビオチン標識抗体３２が結合される。
【００２５】
そして、上記のようにインキュベートを行った後、反応液を廃棄し、洗浄液を注入して、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されたサルモネラ２１を洗浄する。これにより、未反応のビオチン標識抗体３２等が除去される。
【００２６】
（ｃ−２）アビジン・ルシフェラーゼ複合体を反応させる工程
次に、洗浄後の、ビオチン標識抗体３２が結合したサルモネラ２１に、図１の（５）に示すアビジン・ルシフェラーゼ複合体３３を含む検出試薬を添加する。なお、この反応液中では、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉された、ビオチン標識抗体３２が結合したサルモネラ２１は、磁気ビーズ分離用磁石２５に引き寄せられ、容器の壁面に集められている。図１の（５）に示すように、アビジン・ルシフェラーゼ複合体３３は、アビジン２８とルシフェラーゼ２９とを含む複合体である。
【００２７】
なお、アビジンとルシフェラーゼとを含む複合体におけるアビジンとルシフェラーゼとの結合については特に限定されるものではない。例えば、アビジンにビオチンを介してルシフェラーゼを結合させたアビジン・ビオチン結合ルシフェラーゼを用いる。また、アビジンに代えてストレプトアビジンを用いた、ストレプトアビジンとルシフェラーゼとの複合体を用いてもよい。
【００２８】
そして、このアビジン・ルシフェラーゼ複合体３３を含む検出試薬を添加した反応液を、例えば「３７℃で１５分間」という条件下でインキュベートする。これにより、図１の（５）に示すように、アビジン・ルシフェラーゼ複合体３３のアビジン２８と、ビオチン標識抗体３２のビオチン２７とが結合する。
【００２９】
そして、上記のようにインキュベートを行った後、反応液を廃棄し、洗浄液を注入して、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されたサルモネラ２１を洗浄する。ここで、未反応のアビジン・ルシフェラーゼ複合体３３等が除去される。
【００３０】
（ｃ−３）酵素基質を含む発光試薬を反応させる工程
次に、酵素基質を含む発光試薬を添加する。この発光試薬は、ルシフェリン（基質）、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋を含む。これにより、公知の反応機構（生化学辞典 第２版，東京化学同人，１４４０ページ（１９９０））により生物発光が生じる。
【００３１】
（ｃ−４）測光工程
この生物発光の発光量を公知の手段を用いて測定する。例えば、発光量の測定によりＡＴＰの測定を行う機能を有するＡＴＰアナライザを用いる。本実施形態では測定時間として１５秒を用いる。培養液中にサルモネラが存在する場合、この測光工程において発光が測定されることでサルモネラが検出される。
【００３２】
上記実施形態によれば、以下に示す効果を得ることができる。
・ 上記実施形態では、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化した磁気ビーズを用いる。このため、磁気ビーズに固定化されたリガンドと反応するレセプタを細胞表層に有する微生物を、磁気ビーズにより捕捉できる。
【００３３】
・ 上記実施形態では、サルモネラ等のグラム陰性菌の細胞表層の構成成分であるリポポリサッカライドと特異的に反応するポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズを用いる。このため、サルモネラ等のグラム陰性菌を磁気ビーズにより捕捉できる。
【００３４】
・ 上記実施形態では、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて、その磁気ビーズにより微生物を捕捉する。そして、その磁気ビーズを磁気ビーズ分離用磁石により分離し、分離された磁気ビーズにより捕捉されている微生物を発光法により検出する。このため、磁気ビーズと磁気ビーズ分離磁石とを用いることで、より簡単に微生物の分離や、未反応物質の除去や洗浄を行うことができるとともに、磁気ビーズを増やすことにより、多量の捕捉体で微生物の捕捉を行うことができる。また、捕捉された微生物の検出を発光法により行うため、発色法等と比べて、より高感度に検出を行うことができる。従って、微生物の検出を、より簡易かつ高感度に行うことができる。
【００３５】
・ 上記実施形態では、前記微生物が有する抗原に特異的に反応するビオチン標識抗体を導入し、さらに、アビジン・ルシフェラーゼ複合体を導入することにより、ルシフェリンを基質とする発光反応により検出を行う。このため、捕捉された微生物を、この微生物とビオチン標識抗体を介して結合したアビジン・ルシフェラーゼ複合体のルシフェラーゼにより触媒されるルシフェリンを基質とする発光反応により検出できる。従って、より高感度に微生物を検出できる。
【００３６】
・ 上記実施形態では、サルモネラ等のグラム陰性菌の細胞表層の構成成分であるリポポリサッカライドと特異的に反応するポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズ（ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ）を用いて、サルモネラ等のグラム陰性菌を捕捉する。そして、そのポリミキシンＢ固定化磁気ビーズを磁気ビーズ分離用磁石により分離し、分離されたポリミキシンＢ固定化磁気ビーズに捕捉されているサルモネラ等のグラム陰性菌を発光法により検出する。このため、磁気ビーズと磁気ビーズ分離磁石とを用いることで、より簡単にサルモネラの分離や、未反応物質の除去や洗浄を行うことができるとともに、磁気ビーズを増やすことにより、多量の捕捉体でサルモネラの捕捉を行うことができる。また、捕捉されたサルモネラの検出を発光法により行うため、発色法等と比べて、より高感度に検出を行うことができる。従って、サルモネラの検出を、より簡易かつ高感度に行うことができる。
【００３７】
・ 上記実施形態では、ビオチン標識抗体と結合する抗原として、ビオチン標識抗体が微生物の表面に結合可能な状態の抗原、例えば、細胞表層の構成成分である抗原を用いる。これにより、免疫測定用の培養工程が不要となり、より簡易に微生物の検出を行うことができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により、本発明の酵素免疫測定法による微生物検出方法について、具体的に説明する。なお、本発明は、これによって限定されるものではない。ここでは、鶏肉及び液卵由来の培養液を用いて、食品衛生検査指針に基づくいわゆる公定法と、本発明の微生物検出方法とにより、それぞれ微生物の検出を行い、本発明の酵素免疫測定法による微生物検出方法の評価を行った。
【００３９】
（培養液の調整）
まず、測定に用いる鶏肉及び卵液を用意した。具体的には、表１に示すように、鶏肉については１０種類の製品をサンプルとした。また、卵液については、５種類の異なる殺菌条件でそれぞれ殺菌した検体をサンプルとし、さらに、３種類の異なる殺菌条件でそれぞれ殺菌しサルモネラを接種した検体をサンプルとした。そして、これらの鶏肉及び液卵について、ＢＰＷ（緩衝化されたペプトン水（Buffered Peptone Water））と、ＲＶ（ラパポルト−バシリアディス（Rappaport- Vassiliadis））とを用いて２段階培養を行った。
【００４０】
（本発明の微生物検出方法の各工程の実施）
次に、自動分注装置を用いて、以下の作業を行った。
各培養液について1.0ｍｌずつ採取して容器に注入し、それぞれポリミキシンＢ固定化
磁気ビーズ20μｌを加えた。そして、各培養液を３７℃で１５分間インキュベートした。そして、自動分注装置に備えられた磁気ビーズ分離用磁石により、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズを分離し、培養液を廃棄して、洗浄液1.0ｍｌを注入して洗浄した。なお、こ
こでは、１回のみ洗浄を行った。
【００４１】
次に、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズが磁気ビーズ分離用磁石により分離されている各容器から、洗浄液を廃棄し、この容器に、ビオチン修飾抗体0.5ｍｌを注入した。そし
て、各容器の溶液を、３７℃で１５分間インキュベートした。そして、各容器中の溶液を廃棄し、洗浄液1.0ｍｌを注入して、合計２回、洗浄を繰り返した。
【００４２】
次に、各容器の洗浄液を廃棄し、アビジン・ビオチン結合ルシフェラーゼを含む検出試薬0.2ｍｌをそれぞれ注入した。そして、そして、各容器の溶液を、３７℃で１５分間イ
ンキュベートした。そして、各容器中の溶液を廃棄し、洗浄液1.0ｍｌを注入して、合計
２回、洗浄を繰り返した。
【００４３】
上記の作業を行った後、手動で、酵素基質を含む発光試薬0.1ｍｌを各容器の溶液に注
入した。そして、ＡＴＰアナライザを用いて、発光量の測定を行った。
（実験結果）
実験結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
本発明の微生物検出方法による発光量の測定結果（Immuno Assay（信号値））は、鶏肉に関しては、５つのサンプル（１，２，３，８，１０）で高い数値となっており、残りの５つのサンプルは低い数値となった。つまり、検出結果は、５つのサンプルが陽性（ポジティブ）で、残りの５つのサンプルが陰性（ネガティブ）となった。この検出結果と、公定法による検出結果との一致率は１００％となった。
【００４５】
卵液に関しては、殺菌を行った５つのサンプル（１，２，３，４，５）は、いずれの殺菌条件とも、本発明の微生物検出方法による発光量の測定結果（Immuno Assay（信号値）
）は、低い数値を示した。つまり、異なる殺菌条件により殺菌を行った５つのサンプルについては、検出結果は、いずれも陰性となった。また、サルモネラを接種した３つのサンプル（６，７，８）は、発光量の測定結果は、いずれも高い数値を示した。つまり、この３つのサンプルについては、検出結果は、いずれも陽性となった。
【００４６】
公定法による検出結果も、異なる殺菌条件により殺菌を行った５つのサンプル（１，２，３，４，５）は、いずれの殺菌条件とも、陰性となり、サルモネラを接種した３つのサンプル（６，７，８）は、いずれも陽性となった。つまり、卵液を用いた測定においても、本発明の微生物検出方法による発光量の測定結果に基づく検出結果と、公定法による検出結果との一致率は１００％となった。なお、ネガティブコントロールとして、ＲＶを用いて６回発光量の測定を行ったが、信号値は、いずれも低い数値を示した。
【００４７】
以上の実験結果により、本発明の微生物検出方法により、従来の公定法の場合と同様に、サルモネラを検出可能であることが示された。
次に、上記実施形態から把握できる請求項に記載した発明以外の技術的思想について、効果とともに以下に記載する。
【００４８】
（１） 前記磁気ビーズに固定化されたリガンドはプロテインＡと特異的に反応する特定の免疫グロブリン分子であり、前記レセプタはプロテインＡであり、前記リガンドにより捕捉される微生物は黄色ぶどう球菌であることを特徴とする請求項３又は４に記載の微生物検出方法。
【００４９】
これによれば、プロテインＡと特異的に反応する特定の免疫グロブリン分子が固定化された磁気ビーズを用いて、より簡易かつ高感度に黄色ぶどう球菌を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の微生物検出方法を説明するための模式図。
【符号の説明】
【００５１】
２１…サルモネラ、２５…磁気ビーズ分離用磁石、３１…ポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズとしてのポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ、３２…ビオチン標識抗体、３３…アビジン又はストレプトアビジンとルシフェラーゼの複合体としてのアビジン・ルシフェラーゼ複合体。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素免疫測定法により微生物を検出するための磁気ビーズ及び微生物検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
飲食物がサルモネラ等に汚染されている場合には食中毒等の危険があるため、従来から、サルモネラの検出方法や、検出キットが多数開発されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
サルモネラの検出には、酵素免疫測定法等を用いることができる。この酵素免疫測定法は、例えば、ウェルに固定化した抗体とサルモネラの抗原（鞭毛等の抗原）とを反応させ、さらに、酵素で標識された抗体をサルモネラに反応させ、その酵素に対する基質を添加し発色させる。
【０００４】
また、免疫磁気分離法によりサルモネラを検出するためのキットが開発されている。この方法では、鉄粒子を含むポリスチレンビーズにサルモネラの特異抗体を結合させたものを用いて、液体培養したサルモネラを分離することができる。そして、分離したサルモネラを培養する。また、免疫磁気分離法と酵素免疫測定法とを併用して、免疫磁気分離法によりサルモネラを濃縮し、次いで、酵素免疫測定法によりサルモネラを検出する方法も開発されている。
【非特許文献１】伊藤 武、「食品からのサルモネラ簡易検査法の進展」、食品工業、株式会社光琳、１９９５年１２月３０日、３８巻、２４号、ｐ．３８−４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、上記の従来の酵素免疫測定法では、菌捕捉用固相としてプラスチック製ウェルを採用しているため、固定化できる捕捉用抗体量が制限され、検出感度や検出範囲が不十分である。また、検出系に発色法を採用しているため、検出感度が発光法に比べて劣っている。さらに、免疫測定用の抗原を増殖させるために、菌増殖用の培養工程の他に、免疫測定用の培養行程が必要である。
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、より簡易かつ高感度に微生物の検出を行うための磁気ビーズ及び微生物検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の磁気ビーズは、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化し、前記リガンドと前記レセプタとの特異的な反応により前記微生物を捕捉可能である。これによれば、磁気ビーズに固定化されたリガンドと特異的に反応するレセプタを細胞表層に有する微生物を捕捉できる。
【０００８】
この磁気ビーズにおいて、前記リガンドをポリミキシンＢとすることができる。これによれば、ポリミキシンＢと特異的に反応するレセプタを細胞表層に有する微生物を、磁気ビーズにより捕捉できる。
【０００９】
本発明の微生物検出方法は、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応をするリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて、前記リガンドと前記レセプタとの特
異的な反応により前記磁気ビーズにより微生物を捕捉し、前記磁気ビーズを磁気ビーズ分離用磁石により分離し、分離された磁気ビーズに固定化されたリガンドにより捕捉されている微生物を発光法により検出する。これによれば、磁気ビーズに固定化されたリガンドと特異的に反応するレセプタを細胞表層に有する微生物を捕捉し、その微生物を分離できる。そして、その微生物を発光法により検出できる。従って、磁気ビーズと磁気ビーズ分離磁石とを用いることで、より簡単に微生物の捕捉や、未反応物質の除去や洗浄を行うことができるとともに、磁気ビーズを増やすことにより、多量の捕捉体で微生物の捕捉を行うことができる。また、捕捉された微生物の検出を発光法により行うため、発色法等と比べて、より高感度に検出を行うことができる。従って、微生物の検出を、より簡易かつ高感度に行うことができる。
【００１０】
この微生物検出方法において、前記発光法は、前記微生物が有する抗原に特異的に反応するビオチン標識抗体を導入し、さらに、アビジン又はストレプトアビジンとルシフェラーゼの複合体を導入することにより、ルシフェリンを基質とする発光反応により検出を行うことによるものとすることができる。これによれば、より高感度に微生物を検出できる。
【００１１】
この微生物検出方法において、前記リガンドをポリミキシンＢとし、前記リガンドにより捕捉される微生物を、リポポリサッカライドを細胞表層の構成成分とする微生物とすることができる。これによれば、ポリミキシンＢが固定化された磁気ビーズを用いて、より簡易かつ高感度に、リポポリサッカライドを細胞表層の構成成分とする微生物を検出できる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、より簡易かつ高感度に微生物の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を具体化した実施形態について説明する。
本発明における微生物検出方法では、酵素反応と免疫反応（抗原抗体反応）を利用する酵素免疫測定法により、微生物の検出を行う。本発明における微生物検出方法では、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて微生物を捕捉し、発光法により捕捉された微生物の検出を行う。この微生物検出方法では、（ａ）リガンドを固定化した磁気ビーズにより微生物を捕捉する工程、（ｂ）捕捉された微生物を分離する工程、（ｃ）捕捉された微生物を発光法により検出する工程を含む。
【００１４】
まず、リガンドを固定化した磁気ビーズについて説明する。
＜リガンドを固定化した磁気ビーズ＞
本発明では、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて微生物を捕捉する。従って、磁気ビーズに固定化するリガンドとしては、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に結合するものを用いる。なお、微生物の細胞膜と外膜又は細胞壁とをまとめて細胞表層と総称する。
【００１５】
本実施形態では、磁気ビーズに固定化するリガンドとして、ポリミキシンＢを用いる。このポリミキシンＢは、グラム陰性菌の外膜の構成成分であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）と特異的に結合することが知られている。従って、ポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズを用いれば、ポリミキシンＢとリポポリサッカライドとの特異的な結合により、細胞表層の構成成分にリポポリサッカライドを含む微生物を捕捉することができる。細胞表層の構成成分にリポポリサッカライドを含む微生物として、グラム陰性菌であるサルモネラ（Salmonella）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）や大腸菌（Escherichia coli）
等がある。
【００１６】
また、黄色ぶどう球菌 (Staphylococcus aureus)の細胞壁の構成成分であるプロテインＡ（protein Ａ） と特異的に結合する特定の免疫グロブリン分子を固定化した磁気ビー
ズを用いれば、黄色ぶどう球菌の捕捉が可能となる。なお、プロテインＡは、ヒト、マウス、ウサギ等の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃフラグメントと特異的に結合することが知られている（ただし、ヒトＩｇＧ３とは結合しない）。
【００１７】
磁気ビーズは、微生物を捕捉し分離するのに適した大きさであることが好ましい。例えば、サルモネラを捕捉し分離する場合、直径４．５μｍの磁気ビーズの方が、直径２．８μｍの磁気ビーズよりも適しているという実験結果が得られている。
【００１８】
＜微生物検出方法＞
次に、本発明の微生物検出方法を、図１を用いて説明する。なお、ここでは、ポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズを用いてサルモネラを捕捉し、サルモネラの検出を行う場合について説明するが、本発明における磁気ビーズに固定化するリガンド及び検出対象の微生物は、これに限定されるものではない。
【００１９】
まず、サルモネラの検出を行うための培養液を用意し、自動分注装置を用いて、以下の（ａ），（ｂ），（ｃ−１），（ｃ−２）の工程を実行する。
（ａ）リガンドを固定化した磁気ビーズにより微生物を捕捉する工程
まず、自動分注装置を用いて、サルモネラの検出を行う培養液に、ポリミキシンＢ２２を固定化した磁気ビーズ２３（ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１）を添加して、例えば「３７℃で１５分間」の条件下でインキュベートする。ここで、サルモネラが含まれる培養液（サルモネラ培養液）にポリミキシンＢ固定化磁気ビーズを添加した状態を図１の（１）に示す。このように、自動分注装置の容器内のサルモネラ培養液中にサルモネラ２１と、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１が浮遊している状態となる。そして、例えば「３７℃で１５分間」という条件下でインキュベートすると、（２）に示すように、サルモネラ２１の細胞表層の構成成分であるリポポリサッカライドとポリミキシンＢ２２とが特異的に結合する。この結果、サルモネラ２１がポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉される。
【００２０】
（ｂ）捕捉された微生物を分離する工程
次に、（３）に示すように、自動分注装置の磁気ビーズ分離用磁石２５により、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を集める。具体的には、磁気ビーズ分離用磁石２５を、サルモネラ培養液が入れられた容器の壁側に近づける。これにより、磁気ビーズ分離用磁石２５にポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１が引き寄せられ、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を容器の壁面に集めることができる。
【００２１】
そして、反応液を廃棄することによりポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を回収できる。これにより、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１により捕捉されたサルモネラ２１が分離される。
【００２２】
そして、洗浄液を注入して、サルモネラ２１が捕捉されたポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１を洗浄する。これにより、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されていないサルモネラ２１等を含むサルモネラ培養液が除去される。
【００２３】
（ｃ）捕捉された微生物を発光法により検出する工程
（ｃ−１）ビオチン修飾抗体を反応させる工程
次に、洗浄後の、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されたサルモネラ２１に
、（４）に示すビオチン標識抗体３２を加える。このビオチン標識抗体３２は、抗体２６にビオチン２７が標識されている。このビオチン標識抗体３２は、サルモネラの表面に存在する抗原（例えば、細胞表層の構成成分）と特異的に結合する抗体である。なお、この反応液中では、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されたサルモネラ２１は、磁気ビーズ分離用磁石２５に引き寄せられて、容器の壁側に集められている。
【００２４】
この反応液を、例えば「３７℃で１５分間」という条件下でインキュベートする。これにより、ビオチン標識抗体３２と、サルモネラ２１の表面の抗原とが特異的に結合する。この抗原とビオチン標識抗体３２との結合により、（４）に示すように、サルモネラ２１の表面にビオチン標識抗体３２が結合される。
【００２５】
そして、上記のようにインキュベートを行った後、反応液を廃棄し、洗浄液を注入して、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されたサルモネラ２１を洗浄する。これにより、未反応のビオチン標識抗体３２等が除去される。
【００２６】
（ｃ−２）アビジン・ルシフェラーゼ複合体を反応させる工程
次に、洗浄後の、ビオチン標識抗体３２が結合したサルモネラ２１に、図１の（５）に示すアビジン・ルシフェラーゼ複合体３３を含む検出試薬を添加する。なお、この反応液中では、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉された、ビオチン標識抗体３２が結合したサルモネラ２１は、磁気ビーズ分離用磁石２５に引き寄せられ、容器の壁面に集められている。図１の（５）に示すように、アビジン・ルシフェラーゼ複合体３３は、アビジン２８とルシフェラーゼ２９とを含む複合体である。
【００２７】
なお、アビジンとルシフェラーゼとを含む複合体におけるアビジンとルシフェラーゼとの結合については特に限定されるものではない。例えば、アビジンにビオチンを介してルシフェラーゼを結合させたアビジン・ビオチン結合ルシフェラーゼを用いる。また、アビジンに代えてストレプトアビジンを用いた、ストレプトアビジンとルシフェラーゼとの複合体を用いてもよい。
【００２８】
そして、このアビジン・ルシフェラーゼ複合体３３を含む検出試薬を添加した反応液を、例えば「３７℃で１５分間」という条件下でインキュベートする。これにより、図１の（５）に示すように、アビジン・ルシフェラーゼ複合体３３のアビジン２８と、ビオチン標識抗体３２のビオチン２７とが結合する。
【００２９】
そして、上記のようにインキュベートを行った後、反応液を廃棄し、洗浄液を注入して、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ３１に捕捉されたサルモネラ２１を洗浄する。ここで、未反応のアビジン・ルシフェラーゼ複合体３３等が除去される。
【００３０】
（ｃ−３）酵素基質を含む発光試薬を反応させる工程
次に、酵素基質を含む発光試薬を添加する。この発光試薬は、ルシフェリン（基質）、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋を含む。これにより、公知の反応機構（生化学辞典 第２版，東京化学同人，１４４０ページ（１９９０））により生物発光が生じる。
【００３１】
（ｃ−４）測光工程
この生物発光の発光量を公知の手段を用いて測定する。例えば、発光量の測定によりＡＴＰの測定を行う機能を有するＡＴＰアナライザを用いる。本実施形態では測定時間として１５秒を用いる。培養液中にサルモネラが存在する場合、この測光工程において発光が測定されることでサルモネラが検出される。
【００３２】
上記実施形態によれば、以下に示す効果を得ることができる。
・ 上記実施形態では、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化した磁気ビーズを用いる。このため、磁気ビーズに固定化されたリガンドと反応するレセプタを細胞表層に有する微生物を、磁気ビーズにより捕捉できる。
【００３３】
・ 上記実施形態では、サルモネラ等のグラム陰性菌の細胞表層の構成成分であるリポポリサッカライドと特異的に反応するポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズを用いる。このため、サルモネラ等のグラム陰性菌を磁気ビーズにより捕捉できる。
【００３４】
・ 上記実施形態では、微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて、その磁気ビーズにより微生物を捕捉する。そして、その磁気ビーズを磁気ビーズ分離用磁石により分離し、分離された磁気ビーズにより捕捉されている微生物を発光法により検出する。このため、磁気ビーズと磁気ビーズ分離磁石とを用いることで、より簡単に微生物の分離や、未反応物質の除去や洗浄を行うことができるとともに、磁気ビーズを増やすことにより、多量の捕捉体で微生物の捕捉を行うことができる。また、捕捉された微生物の検出を発光法により行うため、発色法等と比べて、より高感度に検出を行うことができる。従って、微生物の検出を、より簡易かつ高感度に行うことができる。
【００３５】
・ 上記実施形態では、前記微生物が有する抗原に特異的に反応するビオチン標識抗体を導入し、さらに、アビジン・ルシフェラーゼ複合体を導入することにより、ルシフェリンを基質とする発光反応により検出を行う。このため、捕捉された微生物を、この微生物とビオチン標識抗体を介して結合したアビジン・ルシフェラーゼ複合体のルシフェラーゼにより触媒されるルシフェリンを基質とする発光反応により検出できる。従って、より高感度に微生物を検出できる。
【００３６】
・ 上記実施形態では、サルモネラ等のグラム陰性菌の細胞表層の構成成分であるリポポリサッカライドと特異的に反応するポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズ（ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ）を用いて、サルモネラ等のグラム陰性菌を捕捉する。そして、そのポリミキシンＢ固定化磁気ビーズを磁気ビーズ分離用磁石により分離し、分離されたポリミキシンＢ固定化磁気ビーズに捕捉されているサルモネラ等のグラム陰性菌を発光法により検出する。このため、磁気ビーズと磁気ビーズ分離磁石とを用いることで、より簡単にサルモネラの分離や、未反応物質の除去や洗浄を行うことができるとともに、磁気ビーズを増やすことにより、多量の捕捉体でサルモネラの捕捉を行うことができる。また、捕捉されたサルモネラの検出を発光法により行うため、発色法等と比べて、より高感度に検出を行うことができる。従って、サルモネラの検出を、より簡易かつ高感度に行うことができる。
【００３７】
・ 上記実施形態では、ビオチン標識抗体と結合する抗原として、ビオチン標識抗体が微生物の表面に結合可能な状態の抗原、例えば、細胞表層の構成成分である抗原を用いる。これにより、免疫測定用の培養工程が不要となり、より簡易に微生物の検出を行うことができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により、本発明の酵素免疫測定法による微生物検出方法について、具体的に説明する。なお、本発明は、これによって限定されるものではない。ここでは、鶏肉及び液卵由来の培養液を用いて、食品衛生検査指針に基づくいわゆる公定法と、本発明の微生物検出方法とにより、それぞれ微生物の検出を行い、本発明の酵素免疫測定法による微生物検出方法の評価を行った。
【００３９】
（培養液の調整）
まず、測定に用いる鶏肉及び卵液を用意した。具体的には、表１に示すように、鶏肉については１０種類の製品をサンプルとした。また、卵液については、５種類の異なる殺菌条件でそれぞれ殺菌した検体をサンプルとし、さらに、３種類の異なる殺菌条件でそれぞれ殺菌しサルモネラを接種した検体をサンプルとした。そして、これらの鶏肉及び液卵について、ＢＰＷ（緩衝化されたペプトン水（Buffered Peptone Water））と、ＲＶ（ラパポルト−バシリアディス（Rappaport- Vassiliadis））とを用いて２段階培養を行った。
【００４０】
（本発明の微生物検出方法の各工程の実施）
次に、自動分注装置を用いて、以下の作業を行った。
各培養液について1.0ｍｌずつ採取して容器に注入し、それぞれポリミキシンＢ固定化
磁気ビーズ20μｌを加えた。そして、各培養液を３７℃で１５分間インキュベートした。そして、自動分注装置に備えられた磁気ビーズ分離用磁石により、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズを分離し、培養液を廃棄して、洗浄液1.0ｍｌを注入して洗浄した。なお、こ
こでは、１回のみ洗浄を行った。
【００４１】
次に、ポリミキシンＢ固定化磁気ビーズが磁気ビーズ分離用磁石により分離されている各容器から、洗浄液を廃棄し、この容器に、ビオチン修飾抗体0.5ｍｌを注入した。そし
て、各容器の溶液を、３７℃で１５分間インキュベートした。そして、各容器中の溶液を廃棄し、洗浄液1.0ｍｌを注入して、合計２回、洗浄を繰り返した。
【００４２】
次に、各容器の洗浄液を廃棄し、アビジン・ビオチン結合ルシフェラーゼを含む検出試薬0.2ｍｌをそれぞれ注入した。そして、そして、各容器の溶液を、３７℃で１５分間イ
ンキュベートした。そして、各容器中の溶液を廃棄し、洗浄液1.0ｍｌを注入して、合計
２回、洗浄を繰り返した。
【００４３】
上記の作業を行った後、手動で、酵素基質を含む発光試薬0.1ｍｌを各容器の溶液に注
入した。そして、ＡＴＰアナライザを用いて、発光量の測定を行った。
（実験結果）
実験結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
本発明の微生物検出方法による発光量の測定結果（Immuno Assay（信号値））は、鶏肉に関しては、５つのサンプル（１，２，３，８，１０）で高い数値となっており、残りの５つのサンプルは低い数値となった。つまり、検出結果は、５つのサンプルが陽性（ポジティブ）で、残りの５つのサンプルが陰性（ネガティブ）となった。この検出結果と、公定法による検出結果との一致率は１００％となった。
【００４５】
卵液に関しては、殺菌を行った５つのサンプル（１，２，３，４，５）は、いずれの殺菌条件とも、本発明の微生物検出方法による発光量の測定結果（Immuno Assay（信号値）
）は、低い数値を示した。つまり、異なる殺菌条件により殺菌を行った５つのサンプルについては、検出結果は、いずれも陰性となった。また、サルモネラを接種した３つのサンプル（６，７，８）は、発光量の測定結果は、いずれも高い数値を示した。つまり、この３つのサンプルについては、検出結果は、いずれも陽性となった。
【００４６】
公定法による検出結果も、異なる殺菌条件により殺菌を行った５つのサンプル（１，２，３，４，５）は、いずれの殺菌条件とも、陰性となり、サルモネラを接種した３つのサンプル（６，７，８）は、いずれも陽性となった。つまり、卵液を用いた測定においても、本発明の微生物検出方法による発光量の測定結果に基づく検出結果と、公定法による検出結果との一致率は１００％となった。なお、ネガティブコントロールとして、ＲＶを用いて６回発光量の測定を行ったが、信号値は、いずれも低い数値を示した。
【００４７】
以上の実験結果により、本発明の微生物検出方法により、従来の公定法の場合と同様に、サルモネラを検出可能であることが示された。
次に、上記実施形態から把握できる請求項に記載した発明以外の技術的思想について、効果とともに以下に記載する。
【００４８】
（１） 前記磁気ビーズに固定化されたリガンドはプロテインＡと特異的に反応する特定の免疫グロブリン分子であり、前記レセプタはプロテインＡであり、前記リガンドにより捕捉される微生物は黄色ぶどう球菌であることを特徴とする請求項３又は４に記載の微生物検出方法。
【００４９】
これによれば、プロテインＡと特異的に反応する特定の免疫グロブリン分子が固定化された磁気ビーズを用いて、より簡易かつ高感度に黄色ぶどう球菌を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の微生物検出方法を説明するための模式図。
【符号の説明】
【００５１】
２１…サルモネラ、２５…磁気ビーズ分離用磁石、３１…ポリミキシンＢを固定化した磁気ビーズとしてのポリミキシンＢ固定化磁気ビーズ、３２…ビオチン標識抗体、３３…アビジン又はストレプトアビジンとルシフェラーゼの複合体としてのアビジン・ルシフェラーゼ複合体。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化し、前記リガンドと前記レセプタとの特異的な反応により前記微生物を捕捉可能な磁気ビーズ。
【請求項２】
前記リガンドはポリミキシンＢであることを特徴とする請求項１に記載の磁気ビーズ。
【請求項３】
微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応をするリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて、前記リガンドと前記レセプタとの特異的な反応により前記磁気ビーズにより微生物を捕捉し、前記磁気ビーズを磁気ビーズ分離用磁石により分離し、分離された磁気ビーズに固定化されたリガンドにより捕捉されている微生物を発光法により検出することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項４】
前記発光法は、
前記微生物が有する抗原に特異的に反応するビオチン標識抗体を導入し、さらに、アビジン又はストレプトアビジンとルシフェラーゼの複合体を導入することにより、ルシフェリンを基質とする発光反応により検出を行うことを特徴とする請求項３に記載の微生物検出方法。
【請求項５】
前記リガンドはポリミキシンＢであり、前記リガンドにより捕捉される微生物はリポポリサッカライドを細胞表層の構成成分とする微生物であるであることを特徴とする請求項３又は４に記載の微生物検出方法。
【請求項１】
微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応するリガンドを固定化し、前記リガンドと前記レセプタとの特異的な反応により前記微生物を捕捉可能な磁気ビーズ。
【請求項２】
前記リガンドはポリミキシンＢであることを特徴とする請求項１に記載の磁気ビーズ。
【請求項３】
微生物の細胞表層の構成成分であるレセプタと特異的に反応をするリガンドを固定化した磁気ビーズを用いて、前記リガンドと前記レセプタとの特異的な反応により前記磁気ビーズにより微生物を捕捉し、前記磁気ビーズを磁気ビーズ分離用磁石により分離し、分離された磁気ビーズに固定化されたリガンドにより捕捉されている微生物を発光法により検出することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項４】
前記発光法は、
前記微生物が有する抗原に特異的に反応するビオチン標識抗体を導入し、さらに、アビジン又はストレプトアビジンとルシフェラーゼの複合体を導入することにより、ルシフェリンを基質とする発光反応により検出を行うことを特徴とする請求項３に記載の微生物検出方法。
【請求項５】
前記リガンドはポリミキシンＢであり、前記リガンドにより捕捉される微生物はリポポリサッカライドを細胞表層の構成成分とする微生物であるであることを特徴とする請求項３又は４に記載の微生物検出方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−１７５５４（Ｐ２００６−１７５５４Ａ）
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１９４８０９（Ｐ２００４−１９４８０９）
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【出願人】（０００００２８５３）ダイキン工業株式会社 (7,604)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【出願人】（０００００２８５３）ダイキン工業株式会社 (7,604)
【Ｆターム（参考）】
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