神経傷害の処置におけるシリマリンおよびシリビンの使用
【課題】新規神経傷害処置用組成物を提供する。
【解決手段】マリアアザミ(Silybum marianum)から単離されたフラボノリグナン類の混合物であるシリマリンまたはシリビンが神経保護活性を有し、脊髄傷害を有するラットの機能回復を改善するとの予期しない発見に基づき、神経傷害、例えば、脊髄傷害(ＳＣＩ)の処置し、または神経傷害からの回復を亢進させる。
【解決手段】マリアアザミ(Silybum marianum)から単離されたフラボノリグナン類の混合物であるシリマリンまたはシリビンが神経保護活性を有し、脊髄傷害を有するラットの機能回復を改善するとの予期しない発見に基づき、神経傷害、例えば、脊髄傷害(ＳＣＩ)の処置し、または神経傷害からの回復を亢進させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年７月２４日出願の米国仮出願６１／２２８,４３４の優先権を主張し、その内容を、その全体を引用することにより本明細書に包含させる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、神経傷害の処置のためのシリマリンまたはシリビンの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
マリアアザミ(Silybum marianum)から単離されたフラボノリグナン類の混合物であるシリマリンは、肝臓障害に一般的に使用されている。それはまた抗炎症性、細胞保護性、および抗癌性活性も示す。シリビンはシリマリン中の主フラボノリグナンであり、上記の治療効果を有することが判明している。
【０００４】
脊髄傷害(ＳＣＩ)は、感覚および運動調節の喪失に至る脊髄の損傷である。それは脊髄の疾患(例えば、フリードライヒ失調症)または物理的外傷(例えば、挫傷)が原因であり得る。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、シリマリンまたはシリビンが神経保護活性を有し、脊髄傷害を有するラットの機能回復を改善するとの予期しない発見に基づく。
【０００６】
従って、本発明は、処置を必要とする対象に有効量のシリマリンまたはシリビンを投与することによる、神経傷害(例えば、ＳＣＩ)の処置方法に関する。特に、シリマリンまたはシリビンを、傷害された神経領域に送達できる。一例として、それを注射により髄腔内に投与する。本発明の方法において使用するシリビンは単離された形態、すなわち、合成法により製造されたものであっても、天然源(例えば、Silybum marianum)から富化された形態でもよい。単離されたシリビン化合物は、乾燥重量でその化合物を少なくとも４０％含む調製物を言う。単離された化合物の純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、質量分析、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、ＮＭＲ、または任意の他の適当な方法で測定できる。
【０００７】
ここで使用する用語“処置”は、傷害、傷害の症状、または傷害に対する素因を治癒する、回復させる、緩和させる、軽減する、変化させる、治療する、寛解させる、改善する、または影響を与える目的で、神経傷害、傷害の症状、または傷害に対する素因を有する対象に、１種以上の活性成分を含む組成物を適用するまたは投与することを言う。ここで使用する“有効量”は、単独でまたは１種以上の他の活性剤と組み合わせて、対象に治療効果を与えるのに必要な各活性剤の量を意味する。有効量は、当業者には認識される通り、投与経路、選択した賦形剤、および他の薬剤との併用によって変わる。
【０００８】
本発明はまた、シリマリンまたはシリビンでＳＣＩ(例えば、挫傷性ＳＣＩ)からの回復を亢進させる方法にも関する。
【０００９】
また本発明の範囲内にあるのは、神経傷害処置用医薬の製造のための、シリマリンまたはシリビンの使用である。
【００１０】
本発明の１つ以上の態様の詳細を以下に明示する。本発明の他の特性または利点は、図面および数種の態様の詳細な記載、およびまた添付する特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１１】
図面の簡単な説明
前記の要約、ならびに下記の本発明の詳細な説明は、添付の図面と共に読んだときによりよく理解される。本発明を説明する目的で、現在好ましいと考えられる態様を図面に示す。しかしながら、本発明は示す厳密な配合および手段に限定されないことは理解されるべきである。
図面において：
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１はラット脊髄神経細胞−膠細胞培養におけるＬＰＳおよびカイニン酸誘発毒性に対するシリマリンおよびシリビンの効果を示し、ここで、(Ａ)は、各処置群(Ｃｏｎ＝コントロール群；ａ：Ｐ＜０.０５(ＬＰＳ対コントロール)；ｂ：Ｐ＜０.０５(ＬＰＳ＋ＳＭ対ＬＰＳ))における１.５mm２あたりのｉＮＯＳ陽性細胞の数を示し；(Ｂ)は、各処置群(Ｃｏｎ＝コントロール群)におけるｉＮＯＳおよびシクロオキシゲナーゼ−２(ＣＯＸ−２)レベルのウェスタンブロット分析を示す；そして(Ｃ)は、各処置群(ａ：Ｐ＜０.０５(ｔｒｅａｔｍｅｎｔ対コントロール)；ｂ：Ｐ＜０.０５(ＳＭ／ＬＰＳまたはＳＢ／ＬＰＳ対ＬＰＳ)；ＳＭ＝シリマリン；ＳＢ＝シリビン)における培養培地に放出される亜硝酸の量を示す。
【図２】図２は、混合膠細胞培養における細胞増殖およびＨ２Ｏ２誘発フリーラジカル形成に対するシリマリンおよびシリビンの効果を示し、ここで、(Ａ)は、各処置群における１.５mm２あたりのＢｒｄＵ陽性細胞の数を示し；そして(Ｂ)は、シリマリン(８０μM)およびシリビン(８０μM)によるＨ２Ｏ２誘発フリーラジカル形成(ＲＯＳ)の有効な阻害を示す。
【図３】図３は、(Ａ)脊髄または(Ｂ)皮質から調製した神経膠細胞培養におけるＨ２Ｏ２誘発フリーラジカル形成に対するシリマリンの用量依存的保護効果を示す。
【図４】図４(Ａ)は、脊髄性神経膠細胞培養におけるＨ２Ｏ２またはｔ−ＢＯＯＨ誘発フリーラジカル形成に対するシリマリン(８０μM)およびシリビン(８０μM)の効果を示す。図４(Ｂ)は、皮質性神経膠細胞培養におけるＨ２Ｏ２またはｔ−ＢＯＯＨ誘発フリーラジカル形成に対するシリマリン(８０μM)およびシリビン(８０μM)の効果を示す。図４(Ｃ)は、ミクログリア培養におけるＨ２Ｏ２またはｔ−ＢＯＯＨ誘発フリーラジカル形成に対するシリマリン(８０μM)の効果を示す。(＊ 各ＤＭＳＯ群と比較してＰ＜０.０５)
【図５】図５は、ＭＴＴアッセイにおけるシリマリンおよびシリビンの結果を示す。
【図６】図６は、挫傷性ＳＣＩラットにおける後肢機能の回復で証明される髄腔内投与したシリマリンの効果を示す(ＳＭ２０＝５０％ＰＥＧ中２０μg／μlのシリマリン、６μl／ラット；ＳＭ５＝５０％ＰＥＧ中５μg／μlのシリマリン、６μl／ラット；＊ 一元配置ＡＮＯＶＡおよびスチューデント・ニューマン・クールズ法でＰ＜０.０５)。
【図７】図７は、傷害された脊髄中心点においてシリマリン(ＳＭ)が傷害誘発ＥＤ１およびシクロオキシゲナーゼ−２(ＣＯＸ−２)発現を減少させることを示す、ラット脊髄中心点のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図８】図８は、シリマリン(１２０μg／ラット)の髄腔内投与後種々の時点での傷害された脊髄におけるシリビン保持を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な記載
本発明は、神経傷害の処置のため、およびかかる傷害からの回復を促進するためのシリマリンおよびシリビンの使用に関する。
【００１４】
ここで使用するとき、句“ＳＣＩからの回復”は、ＳＣＩを有する対象の病態の改善および／または傷害された脊髄の身体機能の(少なくとも部分的な)回復を言う。例えば、本発明の実施例において使用する動物モデルにおいて、ラットの脊髄のＴ９−Ｔ１０領域を挫傷により(contusively)傷害した。かかる場合、ＳＣＩからの回復は、後肢の運動障害により証明された。
【００１５】
シリマリンは、基準が決められたマリアアザミSilybum marianum Gaertn(Carduus marianus Lとしても既知)の種子および果実からの抽出物であり、その主成分として、フラボノリグナン類であるシリビン(シリビニンと同義)を含む。シリマリンは任意の慣用法で製造してよく、例えば、Barreto et al. (Extraction of nutraceuticals from milk thistle. Hot water extraction; Appl. Biochem Biotechnol. 108:881-9, 2003), Wallace et al. (Extraction of nutraceuticals from milk thistle:part II. Extraction with organic solvents; Appl. Biotechnol. 105-108:891-903, 2003)およびWallace et al. (Batch solvent extraction of flavanolignans from milk thistle; Phyotchemical Analysis. 16:7-16, 2005)に開示された技術を参照のこと。あるいは、それはSigma-Aldrich(St. Louis, MO)のような販売社から購入できる。
【００１６】
シリビン、すなわち、シリビニンまたは２,３−ジヒドロ−３−(４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル)−２−(ヒドロキシメチル)−６−(３,５,７−トリヒドロキシ−４−オキソベンゾピラン−２−イル)ベンゾジオキシンは２個のジアステレオマー形態を有する。両方の異性体を天然源から単離でき、または合成法により製造できる。シリマリンと同様、シリビンもSigma-Aldrich(St. Louis, MO)および他の供給者から商業的に入手可能である。
【００１７】
特に、良好な効果を達成するために、シリマリンまたはシリビンを傷害された神経領域に直接投与し得る。一つの態様において、シリマリンまたはシリビンを髄腔内に投与する、すなわち、脊髄および脳を満たす脳脊髄液内に注射する。
【００１８】
送達を促進するために、シリマリンまたはシリビンを、適当な薬学的に許容される担体と医薬組成物に製剤し得る。ここで使用する用語“薬学的に許容される担体”は、組成物中の活性成分と融和性であり、好ましくは、活性成分を安定化でき、そして処置する対象に対して有害ではない担体を言う。例示的担体は、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを含み、これらに限定されない。
【００１９】
ＳＣＩの領域に投与すべきシリマリンまたはシリビンの量は、対象の状態およびＳＣＩのタイプおよび重症度のような多くの因子を考慮して決められる。シリマリンまたはシリビンの量は、ＳＣＩを有する対象に投与するとき、所望の効果を達成しなければならず、すなわち、傷害された領域を回復させるおよび／または傷害された脊髄の機能の回復を少なくとも部分的に促進しなければならない。適当な量は、過度の実験をせずに当業者は本明細書の開示を考慮して容易に決定できる。
【００２０】
本発明をさらに下記の実施例により説明する。これらの実施例は説明の目的で提供するものであり、いかなる方法でも本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
【実施例】
【００２１】
化学物質
シリマリンおよびシリビンをSigma-Aldrich(St. Louis, MO)から購入した(それぞれ製品番号S0292およびS0417)。全てのインビトロ培養実験についてシリマリンまたはシリビニンをジメチル−スルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、培養培地で新たに希釈した。
液体クロマトグラフィーグレート溶媒および試薬をE. Merck(Darmstadt, Germany)から得た。
他の試薬は、特記しない限りSigma-Aldrichから購入した。
【００２２】
混合神経細胞／膠細胞培養
混合神経細胞−膠細胞培養を、Hung et al. (Mol. 脳 Res. 75(2000):330-336)およびTsai et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 1042(2005):338-348)に記載の通り、妊娠１５日目の胎生期Sprague-Dawleyラット胎児の皮質または脊髄領域から調製した。簡単に言うと、細胞をパパイン／プロテアーゼ／デオキシリボヌクレアーゼＩ(０.１％：０.１％：０.０３％)混合物で分離させ、ポリ−リシン被覆皿に１−２×１０５細胞／cm２の密度でプレーティングした。細胞を１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)添加ダルベッコ修飾イーグル培地(ＤＭＥＭ)に維持した。
【００２３】
混合膠細胞培養
混合膠細胞培養を、Tsai and Lee(Free Radical Biology & Medicine 24(1998):705-713)に記載の通り、新生仔Spraque-Dawleyラットの大脳皮質または脊髄から調製した。簡単に言うと、磨砕した皮質または脊髄をナイロン布(８０および１０μm)を通し、７５cm２フラスコにプレーティングし、５.５mM グルコースを含み、１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を添加したＤＭＥＭに維持した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気の水飽和雰囲気中でインキュベートした。培養物から汚染細胞を無くすために、培養物を、培養１０日目に一夜、１８０rpmで振盪させ、浮遊細胞を除去することにより精製した。フラスコ中の培養物を多ウェルプレートに再プレーティングした。培養物は、グリア線維酸性タンパク質(ＧＦＡＰ)での染色に９０％を超える陽性を示した。
【００２４】
ミクログリア培養
ミクログリア培養を、ラット混合膠細胞培養から精製した(Tzeng and Huang, J. Cell Biochem. 90(2)(2003):227-33)。簡単に言うと、培養１０〜１４日後、浮遊細胞および混合膠細胞層に弱く付着している細胞をフラスコを振盪させることにより単離した。得られた細胞懸濁液を多ウェルプレート(Corning, USA)に移し、３７℃で付着させた。非接着細胞を３０分後に除去し、ミクログリアを強く付着する細胞として単離した。ミクログリアの純度は、イオン化カルシウム結合アダプター分子１(ＩＢＡ１、Wako Chemicals, Japan)またはＥＤ−１(Serotec, UK)の免疫染色で測定して、９６％を超えた。
【００２５】
動物
Sprague-Dawley(ＳＤ)ラットを、Animal Center of National Yang-Ming UniversityまたはNational Science Council, Taiwanから得た。２４０−２８０ｇの雌成熟ＳＤラットを、誘導性挫傷性ＳＣＩモデルとして使用した。動物の取り扱いおよび実験プロトコールは、Taipei Veteran General Hospitalの動物実験委員会により注意深く検閲され、承認された。
【００２６】
脊髄挫傷
挫傷性ＳＣＩを、ＮＹＵ重り落下装置を使用して誘発させた。雌成熟ＳＤラットを麻酔した。背部椎弓切除術を、第９胸椎(Ｔ)位置で行った。Ｔ９−Ｔ１０脊髄の背部表面を、１０ｇの棒の５０mmの高さから落とすことにより損傷させた。硬膜は物理的に無傷のままであったが、重りの落下による傷害は体軸方向に数脊髄骨にわたり伸びる特徴的な卵形の壊死帯をもたらした(Grossman et al., Exp Neurol. 168(2)(2001):283-9;Widenfalk et al., J Neurosci. 21(10)(2001):3457-75)。
【００２７】
実施例１：シリマリンは、脊髄神経膠細胞培養における細胞型に影響しない。
細胞播種２日目に、混合神経細胞／膠細胞培養をシリマリン(４０μM)と３日間インキュベートした。次いで細胞を、神経細胞、星状膠細胞またはミクログリアマーカーについて免疫組織化学に処理した。
初代神経膠細胞培養をポリ−リシン被覆プレートにプレーティングし、４％パラホルムアルデヒド溶液で２０分間固定した。細胞を０.２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過性にした。次いで細胞を、抗βIIIチューブリン(Covance MMS-435P)、抗ＧＦＡＰ(Chemicon AB 5804)および抗ＥＤ１(Serotec MCA 341)抗体を含む一次抗体および各蛍光標識した二次抗体(Jackson ImmunoResearch Inc.)で染色した。βIIIチューブリンは神経細胞特異的マーカーであり、ＧＦＡＰは星状膠細胞マーカーであり、そしてＥＤ１はミクログリアマーカーである。脊髄神経細胞または非神経細胞の画像を、蛍光レンズ(fluorescence optics)を備えた蛍光顕微鏡で得た。神経細胞または免疫反応性細胞の画像をＣＣＤカメラで撮った。
この結果によると(データは示していない)、シリマリンは、脊髄培養における神経細胞生存および非神経細胞数に影響しない。
【００２８】
実施例２：シリマリンは、ＬＰＳおよびカイニン酸誘発毒性から脊髄神経膠細胞培養を保護する。
細胞播種２日目に、混合神経膠細胞培養を、内毒死リポポリサッカライド(ＬＰＳ、１.２μg／ml)または外毒素カイニン酸(ＫＡ、１５０μM)の存在下または非存在下、２日間シリマリン(４０μM)で処理した。培地を、硝酸／亜硝酸遊離のアッセイのために回収し、細胞を免疫組織化学およびウェスタンブロット分析のために採取した。
パラホルムアルデヒド固定およびｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００透過処理後、細胞を一次抗体抗ＩＬ−１β(Chemicon)と一夜(４℃)インキュベートし、続いてロバ抗ヤギ４８８(Alexa)またはロバ抗マウスｃｙ３(Jackson Lab)と室温で９０分間インキュベートした。この結果によると(データは示していない)、ＬＰＳまたはＫＡ処理は、脊髄培養においてＩＬ−１β発現を誘発した。
細胞をまた誘導型一酸化窒素合成酵素(ｉＮＯＳ)およびシクロオキシゲナーゼ−２(ＣＯＸ−２)発現についてのウェスタンブロット分析のために処理した。簡単に言うと、等量の細胞ライセートタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、分離した。電気泳動を標準法に従い行った。電気泳動後、ゲルをＰＶＤＦ膜(Millipore, USA)に移し、一夜、４℃でｉＮＯＳ(BD transduction, USA)またはＣＯＸ−２(Cayman)に対する抗体とインキュベートした。ブロットをロバ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)接合二次抗体(Santa Cruz)またはヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ接合二次抗体(Santa Cruz)と１時間インキュベートし、ＨＲＰ検出をSuperSignal Chemiluminescent Substrate(Pierce, USA)を使用して行った。
ＮＯ産生をグリース(Griess)試薬との比色反応を使用して、培地中の亜硝酸の蓄積としてアッセイした。簡単に言うと、ＬＰＳ処理２日後、培養上清(１５０μl)を集め、１％スルファニルアミド／０.１％ナフチルエチレンジアミンジヒドロクロライド／２％リン酸を含む５０μlのグリース試薬と混合し、室温で１０分間インキュベートした。吸光度を５４０nmで測定した。ナトリウム亜硝酸(ＮａＮＯ２)を二酸化窒素(ＮＯ２)を計算するための標準として使用した。
図１(Ａ)から(Ｃ)に示す通り、ＬＰＳはＣＯＸ−２およびｉＮＯＳ発現の増加、ｉＮＯＳ陽性細胞数の増加、および硝酸／亜硝酸レベルで示される一酸化窒素(ＮＯ)の遊離の増加を誘発した。シリマリンはＬＰＳまたはＫＡ刺激を有効に減少させた。シリビンはＬＰＳ誘発ＮＯ遊離を顕著に減少させた。
【００２９】
実施例３：シリマリンおよびシリビンは混合膠細胞培養における細胞増殖を阻止する。
混合膠細胞培養の増殖性活性を、細胞を、有糸分裂のＳ期に遺伝物質に取り込まれるチミジン類似体である５−ブロモ−２−デオキシウリジン(ＢｒｄＵ)で処理することにより試験した。
シリマリンまたはシリビン(２０〜８０μM)を、サブコンフルエント膠細胞に２日間添加した。細胞固定２時間前に、増殖細胞により取り込まれ得る５−ブロモ−２−デオキシウリジン(ＢｒｄＵ、１０μM)を培養細胞に添加した。４％パラホルムアルデヒド(aldhyde)で固定後(３０分間、室温)、細胞を２Ｍ ＨＣｌで処理し(１０分間、３７℃)、そのＤＮＡを変性させた。次いで細胞を、ｐＨが６.５以上に到達するまでＰＢＳで繰り返し洗浄した。細胞をさらにマウス抗ＢｒｄＵ(１：１００、Chemicon, Temecula, CA)およびウサギ抗ＧＦＡＰ(１：３００、Chemicon)抗体(４℃、一夜)で二重処理し、続いてＦＩＴＣおよびローダミン接合二次抗体(室温、９０分間)とインキュベートした。７個の無作為の視野を各ウェルで捕捉し、ＢｒｄＵ取り込み細胞を計数した。ＢｒｄＵ／総細胞の比を計算した。
図２(Ａ)に示す通り、シリマリンおよびシリビンの両方とも膠細胞増殖を有効に減少させた(ＢｒｄＵ(＋)／ＧＦＡＰ(＋)の比率により表示)。
【００３０】
実施例４：シリマリンおよびシリビンは、脊髄星状膠細胞、ミクログリアおよび神経膠細胞培養および皮質性神経膠細胞培養における毒素誘発フリーラジカル形成を減少させる。
抗酸化活性は、フリーラジカル損傷が種々の物質の神経毒性作用ならびに炎症、虚血および再灌流、アテローム性動脈硬化症および加齢のような過程の病因において重要な役割を有するため、神経保護剤の重要な作用機序である。フリーラジカルレベル(酸化的ストレス)を、Ｈ２Ｏ２またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド(ｔ−ＢＯＯＨ)での攻撃により細胞に誘発できる(図３(Ｃ)、図４(Ａ−Ｂ)および図５(Ａ−Ｃ)の“コントロール”参照)。
本実施例において、酸化的ストレスを、混合膠細胞、ミクログリアまたは混合神経膠細胞培養を種々のフリーラジカル発生剤で処理することにより誘発し、シリマリンおよびシリビンの抗酸化活性を、蛍光マイクロプレートリーダーで使用するために改変したＤＣＦアッセイにより試験した。細胞内活性酸素種(ＲＯＳ)の形成を、細胞内酸化剤産生の検出のための感受性で広く使用されているプローブである非蛍光２',７'−ジクロロジヒドロフルオレッセインジアセテート(ＤＣＦ−ＤＡ)により検出した。ＤＣＦ−ＤＡは細胞に自由に入り、細胞内エステラーゼで親水性(故に“捕捉された”)、非蛍光レポーター分子ＤＣＦに修飾される。ＤＣＦの酸化は非常に蛍光性のＤＣＦを産生し、それはフローサイトメトリーまたは他の蛍光検出法により検出できる。
ＤＣＦアッセイのために、培養物を最初に無血清培地(ＤＭＥＭ＋Ｎ２)中４０μM ＤＣＦ−ＤＡ(Molecular Probe D-399;Invitrogen, Carlsbad, CA)で１時間負荷した。次いで、培地をＨ２Ｏ２(神経細胞に１mM；非神経細胞に３mM)およびｔ−ＢＯＯＨ(０.７５mM)を含む毒素を含む増殖培地に２時間変えた。シリマリンまたはシリビンの(２０〜１６０μMにわたる)投与量を培養毒素処理開始後１０分以内に添加した。得られた蛍光ＤＣＦレベルを蛍光プレートリーダーで４８５nm／５３８nmの励起／発光で測定した。
【００３１】
図２(Ｂ)、図３(Ａ)および(Ｂ)、および図４(Ａ)から(Ｃ)に示す通り、シリマリンおよびシリビンの両方とも、脊髄混合膠細胞培養(図２(Ｂ))、脊髄混合神経膠細胞培養(図３(Ａ)；図４(Ａ))、皮質性混合神経膠細胞培養(図３(Ｂ)、図４(Ｂ))および脊髄ミクログリア培養(図４(Ｃ))を含む全ての培養試験においてＨ２Ｏ２またはｔ−ＢＯＯＨ誘発フリーラジカル形成を顕著に減少させたため、強い抗酸化剤である。重要なことに、２０μM〜１６０μMの範囲のシリマリンは、脊髄性または皮質性混合神経細胞−膠細胞培養におけるＨ２Ｏ２誘発フリーラジカルの減少に有効である(図３(Ａ)および(Ｂ))。
【００３２】
ＭＴＴ(３−(４,５−ジメチルチアゾール−２−イル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウム)減少の程度を、細胞生存能の測定のためにまたは生存細胞の代謝活性を測定するために使用する。ＭＴＴは、生存細胞のミトコンドリア酵素により青色ホルマザン産物に還元され、それは代謝機能の完全さに比例する(Edmondson et al., J. Tiss. Cult. Meth. 11(1998):15-17)。ＭＴＴアッセイのために、培養物を上記の通り毒素およびシリマリンまたはシリビンで２時間処理した。処理後、培養培地をウェルから除去し、グルコース(５mM)添加ＰＢＳ中０.５mg／mLのＭＴＴに置き換えた。２時間、３７℃でインキュベーション後、この溶液を除き、青色ホルマザン結晶を酸性イソプロパノールに可溶化した。得られた溶液の光学密度を分光光度計で５７０nmで測定した。
【００３３】
図５に示す通り、シリマリンおよびシリビンはＭＴＴ還元を強く増強した。ＭＴＴ還元アッセイは、ＭＴＴテトラゾリウム塩をホルマザンに還元する代謝活性細胞の能力に依存する。還元ピリジンヌクレオチド補因子、ＮＡＤＨは大部分のＭＴＴ還元を担う。これは、シリマリンおよびシリビンの強い抗酸化特性を示す。
【００３４】
実施例５：挫傷性ＳＣＩに対するシリマリンの髄腔内投与の効果
高濃度の(純粋)ＤＭＳＯの直接輸液が神経毒性を引き起こし得るため、別のより安全な薬剤であるポリエチレングリコール(ＰＥＧ；ＭＷ２０００Da)を、髄腔内注射のためにシリマリンを溶解するために使用した。親水性ポリマーであるＰＥＧは安全であり、急性脊髄傷害に対して神経保護的であることが証明されている。(Shi and Borgens, J. Neurophysiol. 81(1999):2406-2414;Shi et al., J. Neurotrauma 16(1999):727-738;Shi and Borgens, J. Neurocytol. 29(2000):633-644)。ＰＥＧ(５０％)の溶液を塩水で調製した。次いでシリマリンを５または２０mg／ml濃度でＰＥＧ溶液に溶解した。シリマリンを含むまたは含まない６μlのＰＥＧを、挫傷性傷害誘発後３０分以内に傷害された脊髄の中心点に髄腔内投与した。皮膚を縫合し、後肢機能(ＢＢＢスケール)を上記の脊髄傷害後２日目および毎週モニターした。図６に示す通り、髄腔内シリマリン注射(２０μg／μl)はＳＣＩラットにおける機能回復を顕著に促進し、シリマリンの媒体であるＰＥＧは神経保護的ではない。傷害５週後、ラットに麻酔し、４％パラホルムアルデヒドを血管内に灌流させた。次いで、脊髄を矢状に切断し(１０μm厚)、抗神経フィラメント(神経細胞用)または抗ＥＤ１(活性化ミクログリア用)での免疫組織化学的染色について処理した。この結果によると(データは示していない)、シリマリン処理脊髄において脊髄軸索(神経フィラメント陽性)は良好に保護され、ミクログリア活性化(ＥＤ−１)の程度が低いことが判明した。
【００３５】
外傷性脊髄傷害は破壊的であり、一次および二次傷害カスケードの両方を含む一連の細胞的および分子的事象を開始させる。脊髄の傷害は、炎症応答を引き起こし、これは最初にさらなる組織損傷をもたらす。故に、脊髄傷害の初期炎症応答の減弱は、組織傷害の程度を、そしてそれ故にその後の身体障害を減縮する可能性がある。シリマリンの髄腔内投与を行ったまたは行っていないＳＣＩラットを、傷害３日後に殺した。傷害された脊髄の中心点を直ぐに摘出し、氷冷抽出緩衝液(７Ｍ ウレア、２Ｍ チオウレア、４％ＣＨＡＰＳ、４０mM Ｔｒｉｓ緩衝液(ｐＨ７.５)およびプロテアーゼ阻害剤(Roche 11836145001))中で均質化した。Bradford法(Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories)を使用して、タンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、分離した。移した後、得られたＰＶＤＦ膜を抗ＣＯＸ−２、抗ＥＤ−１および抗アクチン抗体で試験した。図６の結果に一致して、図７に示す通り、髄腔内投与したシリマリンは、傷害３日後の傷害された脊髄で炎症促進性酵素であるＣＯＸ−２の発現を低下させ、ＥＤ−１(＋)ミクログリア浸潤を阻止した。
【００３６】
髄腔内シリマリンの位置は、全身的皮下(ｓｃ)投与されたものと異なり得る。ＳＣＩラットに、シリマリン(１２０μg／６μl／ラット)を髄腔内投与した。傷害１日、２日、７および１４日後、脊髄中心点を摘出し、５体積の５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)中で均質化した。組織ホモジネートをさらに等体積の溶媒(ブタノール：メタノール、９５：５；ｖ／ｖ)で抽出した。遠心分離後、得られた有機層を回収し、濃縮し、ＵＶ検出器を備えたＨＰＬＣ装置に直接注入した。図８は、脊髄において達成されるシリマリン暴露の経時変化を示す(薬物動態学)。シリマリンの位置は傷害された脊髄中心点に限定される。注射２週目で、約８μg／組織ｇのシリマリンがまだ残っていた。故に、シリマリンの薬物動態学の差異が、髄腔内シリマリン注射の有効な結果に寄与している可能性がある。
【００３７】
当業者には、上記の態様を、その広い発明的概念から逸脱することなく変え得ることが認識されよう。それ故に、本発明は開示した特定の態様に限定されず、添付の特許請求の範囲に定義する本発明の精神および範囲内の改変を包含することを意図することは理解される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年７月２４日出願の米国仮出願６１／２２８,４３４の優先権を主張し、その内容を、その全体を引用することにより本明細書に包含させる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、神経傷害の処置のためのシリマリンまたはシリビンの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
マリアアザミ(Silybum marianum)から単離されたフラボノリグナン類の混合物であるシリマリンは、肝臓障害に一般的に使用されている。それはまた抗炎症性、細胞保護性、および抗癌性活性も示す。シリビンはシリマリン中の主フラボノリグナンであり、上記の治療効果を有することが判明している。
【０００４】
脊髄傷害(ＳＣＩ)は、感覚および運動調節の喪失に至る脊髄の損傷である。それは脊髄の疾患(例えば、フリードライヒ失調症)または物理的外傷(例えば、挫傷)が原因であり得る。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、シリマリンまたはシリビンが神経保護活性を有し、脊髄傷害を有するラットの機能回復を改善するとの予期しない発見に基づく。
【０００６】
従って、本発明は、処置を必要とする対象に有効量のシリマリンまたはシリビンを投与することによる、神経傷害(例えば、ＳＣＩ)の処置方法に関する。特に、シリマリンまたはシリビンを、傷害された神経領域に送達できる。一例として、それを注射により髄腔内に投与する。本発明の方法において使用するシリビンは単離された形態、すなわち、合成法により製造されたものであっても、天然源(例えば、Silybum marianum)から富化された形態でもよい。単離されたシリビン化合物は、乾燥重量でその化合物を少なくとも４０％含む調製物を言う。単離された化合物の純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、質量分析、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、ＮＭＲ、または任意の他の適当な方法で測定できる。
【０００７】
ここで使用する用語“処置”は、傷害、傷害の症状、または傷害に対する素因を治癒する、回復させる、緩和させる、軽減する、変化させる、治療する、寛解させる、改善する、または影響を与える目的で、神経傷害、傷害の症状、または傷害に対する素因を有する対象に、１種以上の活性成分を含む組成物を適用するまたは投与することを言う。ここで使用する“有効量”は、単独でまたは１種以上の他の活性剤と組み合わせて、対象に治療効果を与えるのに必要な各活性剤の量を意味する。有効量は、当業者には認識される通り、投与経路、選択した賦形剤、および他の薬剤との併用によって変わる。
【０００８】
本発明はまた、シリマリンまたはシリビンでＳＣＩ(例えば、挫傷性ＳＣＩ)からの回復を亢進させる方法にも関する。
【０００９】
また本発明の範囲内にあるのは、神経傷害処置用医薬の製造のための、シリマリンまたはシリビンの使用である。
【００１０】
本発明の１つ以上の態様の詳細を以下に明示する。本発明の他の特性または利点は、図面および数種の態様の詳細な記載、およびまた添付する特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１１】
図面の簡単な説明
前記の要約、ならびに下記の本発明の詳細な説明は、添付の図面と共に読んだときによりよく理解される。本発明を説明する目的で、現在好ましいと考えられる態様を図面に示す。しかしながら、本発明は示す厳密な配合および手段に限定されないことは理解されるべきである。
図面において：
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１はラット脊髄神経細胞−膠細胞培養におけるＬＰＳおよびカイニン酸誘発毒性に対するシリマリンおよびシリビンの効果を示し、ここで、(Ａ)は、各処置群(Ｃｏｎ＝コントロール群；ａ：Ｐ＜０.０５(ＬＰＳ対コントロール)；ｂ：Ｐ＜０.０５(ＬＰＳ＋ＳＭ対ＬＰＳ))における１.５mm２あたりのｉＮＯＳ陽性細胞の数を示し；(Ｂ)は、各処置群(Ｃｏｎ＝コントロール群)におけるｉＮＯＳおよびシクロオキシゲナーゼ−２(ＣＯＸ−２)レベルのウェスタンブロット分析を示す；そして(Ｃ)は、各処置群(ａ：Ｐ＜０.０５(ｔｒｅａｔｍｅｎｔ対コントロール)；ｂ：Ｐ＜０.０５(ＳＭ／ＬＰＳまたはＳＢ／ＬＰＳ対ＬＰＳ)；ＳＭ＝シリマリン；ＳＢ＝シリビン)における培養培地に放出される亜硝酸の量を示す。
【図２】図２は、混合膠細胞培養における細胞増殖およびＨ２Ｏ２誘発フリーラジカル形成に対するシリマリンおよびシリビンの効果を示し、ここで、(Ａ)は、各処置群における１.５mm２あたりのＢｒｄＵ陽性細胞の数を示し；そして(Ｂ)は、シリマリン(８０μM)およびシリビン(８０μM)によるＨ２Ｏ２誘発フリーラジカル形成(ＲＯＳ)の有効な阻害を示す。
【図３】図３は、(Ａ)脊髄または(Ｂ)皮質から調製した神経膠細胞培養におけるＨ２Ｏ２誘発フリーラジカル形成に対するシリマリンの用量依存的保護効果を示す。
【図４】図４(Ａ)は、脊髄性神経膠細胞培養におけるＨ２Ｏ２またはｔ−ＢＯＯＨ誘発フリーラジカル形成に対するシリマリン(８０μM)およびシリビン(８０μM)の効果を示す。図４(Ｂ)は、皮質性神経膠細胞培養におけるＨ２Ｏ２またはｔ−ＢＯＯＨ誘発フリーラジカル形成に対するシリマリン(８０μM)およびシリビン(８０μM)の効果を示す。図４(Ｃ)は、ミクログリア培養におけるＨ２Ｏ２またはｔ−ＢＯＯＨ誘発フリーラジカル形成に対するシリマリン(８０μM)の効果を示す。(＊ 各ＤＭＳＯ群と比較してＰ＜０.０５)
【図５】図５は、ＭＴＴアッセイにおけるシリマリンおよびシリビンの結果を示す。
【図６】図６は、挫傷性ＳＣＩラットにおける後肢機能の回復で証明される髄腔内投与したシリマリンの効果を示す(ＳＭ２０＝５０％ＰＥＧ中２０μg／μlのシリマリン、６μl／ラット；ＳＭ５＝５０％ＰＥＧ中５μg／μlのシリマリン、６μl／ラット；＊ 一元配置ＡＮＯＶＡおよびスチューデント・ニューマン・クールズ法でＰ＜０.０５)。
【図７】図７は、傷害された脊髄中心点においてシリマリン(ＳＭ)が傷害誘発ＥＤ１およびシクロオキシゲナーゼ−２(ＣＯＸ−２)発現を減少させることを示す、ラット脊髄中心点のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図８】図８は、シリマリン(１２０μg／ラット)の髄腔内投与後種々の時点での傷害された脊髄におけるシリビン保持を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な記載
本発明は、神経傷害の処置のため、およびかかる傷害からの回復を促進するためのシリマリンおよびシリビンの使用に関する。
【００１４】
ここで使用するとき、句“ＳＣＩからの回復”は、ＳＣＩを有する対象の病態の改善および／または傷害された脊髄の身体機能の(少なくとも部分的な)回復を言う。例えば、本発明の実施例において使用する動物モデルにおいて、ラットの脊髄のＴ９−Ｔ１０領域を挫傷により(contusively)傷害した。かかる場合、ＳＣＩからの回復は、後肢の運動障害により証明された。
【００１５】
シリマリンは、基準が決められたマリアアザミSilybum marianum Gaertn(Carduus marianus Lとしても既知)の種子および果実からの抽出物であり、その主成分として、フラボノリグナン類であるシリビン(シリビニンと同義)を含む。シリマリンは任意の慣用法で製造してよく、例えば、Barreto et al. (Extraction of nutraceuticals from milk thistle. Hot water extraction; Appl. Biochem Biotechnol. 108:881-9, 2003), Wallace et al. (Extraction of nutraceuticals from milk thistle:part II. Extraction with organic solvents; Appl. Biotechnol. 105-108:891-903, 2003)およびWallace et al. (Batch solvent extraction of flavanolignans from milk thistle; Phyotchemical Analysis. 16:7-16, 2005)に開示された技術を参照のこと。あるいは、それはSigma-Aldrich(St. Louis, MO)のような販売社から購入できる。
【００１６】
シリビン、すなわち、シリビニンまたは２,３−ジヒドロ−３−(４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル)−２−(ヒドロキシメチル)−６−(３,５,７−トリヒドロキシ−４−オキソベンゾピラン−２−イル)ベンゾジオキシンは２個のジアステレオマー形態を有する。両方の異性体を天然源から単離でき、または合成法により製造できる。シリマリンと同様、シリビンもSigma-Aldrich(St. Louis, MO)および他の供給者から商業的に入手可能である。
【００１７】
特に、良好な効果を達成するために、シリマリンまたはシリビンを傷害された神経領域に直接投与し得る。一つの態様において、シリマリンまたはシリビンを髄腔内に投与する、すなわち、脊髄および脳を満たす脳脊髄液内に注射する。
【００１８】
送達を促進するために、シリマリンまたはシリビンを、適当な薬学的に許容される担体と医薬組成物に製剤し得る。ここで使用する用語“薬学的に許容される担体”は、組成物中の活性成分と融和性であり、好ましくは、活性成分を安定化でき、そして処置する対象に対して有害ではない担体を言う。例示的担体は、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを含み、これらに限定されない。
【００１９】
ＳＣＩの領域に投与すべきシリマリンまたはシリビンの量は、対象の状態およびＳＣＩのタイプおよび重症度のような多くの因子を考慮して決められる。シリマリンまたはシリビンの量は、ＳＣＩを有する対象に投与するとき、所望の効果を達成しなければならず、すなわち、傷害された領域を回復させるおよび／または傷害された脊髄の機能の回復を少なくとも部分的に促進しなければならない。適当な量は、過度の実験をせずに当業者は本明細書の開示を考慮して容易に決定できる。
【００２０】
本発明をさらに下記の実施例により説明する。これらの実施例は説明の目的で提供するものであり、いかなる方法でも本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
【実施例】
【００２１】
化学物質
シリマリンおよびシリビンをSigma-Aldrich(St. Louis, MO)から購入した(それぞれ製品番号S0292およびS0417)。全てのインビトロ培養実験についてシリマリンまたはシリビニンをジメチル−スルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、培養培地で新たに希釈した。
液体クロマトグラフィーグレート溶媒および試薬をE. Merck(Darmstadt, Germany)から得た。
他の試薬は、特記しない限りSigma-Aldrichから購入した。
【００２２】
混合神経細胞／膠細胞培養
混合神経細胞−膠細胞培養を、Hung et al. (Mol. 脳 Res. 75(2000):330-336)およびTsai et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 1042(2005):338-348)に記載の通り、妊娠１５日目の胎生期Sprague-Dawleyラット胎児の皮質または脊髄領域から調製した。簡単に言うと、細胞をパパイン／プロテアーゼ／デオキシリボヌクレアーゼＩ(０.１％：０.１％：０.０３％)混合物で分離させ、ポリ−リシン被覆皿に１−２×１０５細胞／cm２の密度でプレーティングした。細胞を１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)添加ダルベッコ修飾イーグル培地(ＤＭＥＭ)に維持した。
【００２３】
混合膠細胞培養
混合膠細胞培養を、Tsai and Lee(Free Radical Biology & Medicine 24(1998):705-713)に記載の通り、新生仔Spraque-Dawleyラットの大脳皮質または脊髄から調製した。簡単に言うと、磨砕した皮質または脊髄をナイロン布(８０および１０μm)を通し、７５cm２フラスコにプレーティングし、５.５mM グルコースを含み、１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を添加したＤＭＥＭに維持した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気の水飽和雰囲気中でインキュベートした。培養物から汚染細胞を無くすために、培養物を、培養１０日目に一夜、１８０rpmで振盪させ、浮遊細胞を除去することにより精製した。フラスコ中の培養物を多ウェルプレートに再プレーティングした。培養物は、グリア線維酸性タンパク質(ＧＦＡＰ)での染色に９０％を超える陽性を示した。
【００２４】
ミクログリア培養
ミクログリア培養を、ラット混合膠細胞培養から精製した(Tzeng and Huang, J. Cell Biochem. 90(2)(2003):227-33)。簡単に言うと、培養１０〜１４日後、浮遊細胞および混合膠細胞層に弱く付着している細胞をフラスコを振盪させることにより単離した。得られた細胞懸濁液を多ウェルプレート(Corning, USA)に移し、３７℃で付着させた。非接着細胞を３０分後に除去し、ミクログリアを強く付着する細胞として単離した。ミクログリアの純度は、イオン化カルシウム結合アダプター分子１(ＩＢＡ１、Wako Chemicals, Japan)またはＥＤ−１(Serotec, UK)の免疫染色で測定して、９６％を超えた。
【００２５】
動物
Sprague-Dawley(ＳＤ)ラットを、Animal Center of National Yang-Ming UniversityまたはNational Science Council, Taiwanから得た。２４０−２８０ｇの雌成熟ＳＤラットを、誘導性挫傷性ＳＣＩモデルとして使用した。動物の取り扱いおよび実験プロトコールは、Taipei Veteran General Hospitalの動物実験委員会により注意深く検閲され、承認された。
【００２６】
脊髄挫傷
挫傷性ＳＣＩを、ＮＹＵ重り落下装置を使用して誘発させた。雌成熟ＳＤラットを麻酔した。背部椎弓切除術を、第９胸椎(Ｔ)位置で行った。Ｔ９−Ｔ１０脊髄の背部表面を、１０ｇの棒の５０mmの高さから落とすことにより損傷させた。硬膜は物理的に無傷のままであったが、重りの落下による傷害は体軸方向に数脊髄骨にわたり伸びる特徴的な卵形の壊死帯をもたらした(Grossman et al., Exp Neurol. 168(2)(2001):283-9;Widenfalk et al., J Neurosci. 21(10)(2001):3457-75)。
【００２７】
実施例１：シリマリンは、脊髄神経膠細胞培養における細胞型に影響しない。
細胞播種２日目に、混合神経細胞／膠細胞培養をシリマリン(４０μM)と３日間インキュベートした。次いで細胞を、神経細胞、星状膠細胞またはミクログリアマーカーについて免疫組織化学に処理した。
初代神経膠細胞培養をポリ−リシン被覆プレートにプレーティングし、４％パラホルムアルデヒド溶液で２０分間固定した。細胞を０.２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過性にした。次いで細胞を、抗βIIIチューブリン(Covance MMS-435P)、抗ＧＦＡＰ(Chemicon AB 5804)および抗ＥＤ１(Serotec MCA 341)抗体を含む一次抗体および各蛍光標識した二次抗体(Jackson ImmunoResearch Inc.)で染色した。βIIIチューブリンは神経細胞特異的マーカーであり、ＧＦＡＰは星状膠細胞マーカーであり、そしてＥＤ１はミクログリアマーカーである。脊髄神経細胞または非神経細胞の画像を、蛍光レンズ(fluorescence optics)を備えた蛍光顕微鏡で得た。神経細胞または免疫反応性細胞の画像をＣＣＤカメラで撮った。
この結果によると(データは示していない)、シリマリンは、脊髄培養における神経細胞生存および非神経細胞数に影響しない。
【００２８】
実施例２：シリマリンは、ＬＰＳおよびカイニン酸誘発毒性から脊髄神経膠細胞培養を保護する。
細胞播種２日目に、混合神経膠細胞培養を、内毒死リポポリサッカライド(ＬＰＳ、１.２μg／ml)または外毒素カイニン酸(ＫＡ、１５０μM)の存在下または非存在下、２日間シリマリン(４０μM)で処理した。培地を、硝酸／亜硝酸遊離のアッセイのために回収し、細胞を免疫組織化学およびウェスタンブロット分析のために採取した。
パラホルムアルデヒド固定およびｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００透過処理後、細胞を一次抗体抗ＩＬ−１β(Chemicon)と一夜(４℃)インキュベートし、続いてロバ抗ヤギ４８８(Alexa)またはロバ抗マウスｃｙ３(Jackson Lab)と室温で９０分間インキュベートした。この結果によると(データは示していない)、ＬＰＳまたはＫＡ処理は、脊髄培養においてＩＬ−１β発現を誘発した。
細胞をまた誘導型一酸化窒素合成酵素(ｉＮＯＳ)およびシクロオキシゲナーゼ−２(ＣＯＸ−２)発現についてのウェスタンブロット分析のために処理した。簡単に言うと、等量の細胞ライセートタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、分離した。電気泳動を標準法に従い行った。電気泳動後、ゲルをＰＶＤＦ膜(Millipore, USA)に移し、一夜、４℃でｉＮＯＳ(BD transduction, USA)またはＣＯＸ−２(Cayman)に対する抗体とインキュベートした。ブロットをロバ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)接合二次抗体(Santa Cruz)またはヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ接合二次抗体(Santa Cruz)と１時間インキュベートし、ＨＲＰ検出をSuperSignal Chemiluminescent Substrate(Pierce, USA)を使用して行った。
ＮＯ産生をグリース(Griess)試薬との比色反応を使用して、培地中の亜硝酸の蓄積としてアッセイした。簡単に言うと、ＬＰＳ処理２日後、培養上清(１５０μl)を集め、１％スルファニルアミド／０.１％ナフチルエチレンジアミンジヒドロクロライド／２％リン酸を含む５０μlのグリース試薬と混合し、室温で１０分間インキュベートした。吸光度を５４０nmで測定した。ナトリウム亜硝酸(ＮａＮＯ２)を二酸化窒素(ＮＯ２)を計算するための標準として使用した。
図１(Ａ)から(Ｃ)に示す通り、ＬＰＳはＣＯＸ−２およびｉＮＯＳ発現の増加、ｉＮＯＳ陽性細胞数の増加、および硝酸／亜硝酸レベルで示される一酸化窒素(ＮＯ)の遊離の増加を誘発した。シリマリンはＬＰＳまたはＫＡ刺激を有効に減少させた。シリビンはＬＰＳ誘発ＮＯ遊離を顕著に減少させた。
【００２９】
実施例３：シリマリンおよびシリビンは混合膠細胞培養における細胞増殖を阻止する。
混合膠細胞培養の増殖性活性を、細胞を、有糸分裂のＳ期に遺伝物質に取り込まれるチミジン類似体である５−ブロモ−２−デオキシウリジン(ＢｒｄＵ)で処理することにより試験した。
シリマリンまたはシリビン(２０〜８０μM)を、サブコンフルエント膠細胞に２日間添加した。細胞固定２時間前に、増殖細胞により取り込まれ得る５−ブロモ−２−デオキシウリジン(ＢｒｄＵ、１０μM)を培養細胞に添加した。４％パラホルムアルデヒド(aldhyde)で固定後(３０分間、室温)、細胞を２Ｍ ＨＣｌで処理し(１０分間、３７℃)、そのＤＮＡを変性させた。次いで細胞を、ｐＨが６.５以上に到達するまでＰＢＳで繰り返し洗浄した。細胞をさらにマウス抗ＢｒｄＵ(１：１００、Chemicon, Temecula, CA)およびウサギ抗ＧＦＡＰ(１：３００、Chemicon)抗体(４℃、一夜)で二重処理し、続いてＦＩＴＣおよびローダミン接合二次抗体(室温、９０分間)とインキュベートした。７個の無作為の視野を各ウェルで捕捉し、ＢｒｄＵ取り込み細胞を計数した。ＢｒｄＵ／総細胞の比を計算した。
図２(Ａ)に示す通り、シリマリンおよびシリビンの両方とも膠細胞増殖を有効に減少させた(ＢｒｄＵ(＋)／ＧＦＡＰ(＋)の比率により表示)。
【００３０】
実施例４：シリマリンおよびシリビンは、脊髄星状膠細胞、ミクログリアおよび神経膠細胞培養および皮質性神経膠細胞培養における毒素誘発フリーラジカル形成を減少させる。
抗酸化活性は、フリーラジカル損傷が種々の物質の神経毒性作用ならびに炎症、虚血および再灌流、アテローム性動脈硬化症および加齢のような過程の病因において重要な役割を有するため、神経保護剤の重要な作用機序である。フリーラジカルレベル(酸化的ストレス)を、Ｈ２Ｏ２またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド(ｔ−ＢＯＯＨ)での攻撃により細胞に誘発できる(図３(Ｃ)、図４(Ａ−Ｂ)および図５(Ａ−Ｃ)の“コントロール”参照)。
本実施例において、酸化的ストレスを、混合膠細胞、ミクログリアまたは混合神経膠細胞培養を種々のフリーラジカル発生剤で処理することにより誘発し、シリマリンおよびシリビンの抗酸化活性を、蛍光マイクロプレートリーダーで使用するために改変したＤＣＦアッセイにより試験した。細胞内活性酸素種(ＲＯＳ)の形成を、細胞内酸化剤産生の検出のための感受性で広く使用されているプローブである非蛍光２',７'−ジクロロジヒドロフルオレッセインジアセテート(ＤＣＦ−ＤＡ)により検出した。ＤＣＦ−ＤＡは細胞に自由に入り、細胞内エステラーゼで親水性(故に“捕捉された”)、非蛍光レポーター分子ＤＣＦに修飾される。ＤＣＦの酸化は非常に蛍光性のＤＣＦを産生し、それはフローサイトメトリーまたは他の蛍光検出法により検出できる。
ＤＣＦアッセイのために、培養物を最初に無血清培地(ＤＭＥＭ＋Ｎ２)中４０μM ＤＣＦ−ＤＡ(Molecular Probe D-399;Invitrogen, Carlsbad, CA)で１時間負荷した。次いで、培地をＨ２Ｏ２(神経細胞に１mM；非神経細胞に３mM)およびｔ−ＢＯＯＨ(０.７５mM)を含む毒素を含む増殖培地に２時間変えた。シリマリンまたはシリビンの(２０〜１６０μMにわたる)投与量を培養毒素処理開始後１０分以内に添加した。得られた蛍光ＤＣＦレベルを蛍光プレートリーダーで４８５nm／５３８nmの励起／発光で測定した。
【００３１】
図２(Ｂ)、図３(Ａ)および(Ｂ)、および図４(Ａ)から(Ｃ)に示す通り、シリマリンおよびシリビンの両方とも、脊髄混合膠細胞培養(図２(Ｂ))、脊髄混合神経膠細胞培養(図３(Ａ)；図４(Ａ))、皮質性混合神経膠細胞培養(図３(Ｂ)、図４(Ｂ))および脊髄ミクログリア培養(図４(Ｃ))を含む全ての培養試験においてＨ２Ｏ２またはｔ−ＢＯＯＨ誘発フリーラジカル形成を顕著に減少させたため、強い抗酸化剤である。重要なことに、２０μM〜１６０μMの範囲のシリマリンは、脊髄性または皮質性混合神経細胞−膠細胞培養におけるＨ２Ｏ２誘発フリーラジカルの減少に有効である(図３(Ａ)および(Ｂ))。
【００３２】
ＭＴＴ(３−(４,５−ジメチルチアゾール−２−イル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウム)減少の程度を、細胞生存能の測定のためにまたは生存細胞の代謝活性を測定するために使用する。ＭＴＴは、生存細胞のミトコンドリア酵素により青色ホルマザン産物に還元され、それは代謝機能の完全さに比例する(Edmondson et al., J. Tiss. Cult. Meth. 11(1998):15-17)。ＭＴＴアッセイのために、培養物を上記の通り毒素およびシリマリンまたはシリビンで２時間処理した。処理後、培養培地をウェルから除去し、グルコース(５mM)添加ＰＢＳ中０.５mg／mLのＭＴＴに置き換えた。２時間、３７℃でインキュベーション後、この溶液を除き、青色ホルマザン結晶を酸性イソプロパノールに可溶化した。得られた溶液の光学密度を分光光度計で５７０nmで測定した。
【００３３】
図５に示す通り、シリマリンおよびシリビンはＭＴＴ還元を強く増強した。ＭＴＴ還元アッセイは、ＭＴＴテトラゾリウム塩をホルマザンに還元する代謝活性細胞の能力に依存する。還元ピリジンヌクレオチド補因子、ＮＡＤＨは大部分のＭＴＴ還元を担う。これは、シリマリンおよびシリビンの強い抗酸化特性を示す。
【００３４】
実施例５：挫傷性ＳＣＩに対するシリマリンの髄腔内投与の効果
高濃度の(純粋)ＤＭＳＯの直接輸液が神経毒性を引き起こし得るため、別のより安全な薬剤であるポリエチレングリコール(ＰＥＧ；ＭＷ２０００Da)を、髄腔内注射のためにシリマリンを溶解するために使用した。親水性ポリマーであるＰＥＧは安全であり、急性脊髄傷害に対して神経保護的であることが証明されている。(Shi and Borgens, J. Neurophysiol. 81(1999):2406-2414;Shi et al., J. Neurotrauma 16(1999):727-738;Shi and Borgens, J. Neurocytol. 29(2000):633-644)。ＰＥＧ(５０％)の溶液を塩水で調製した。次いでシリマリンを５または２０mg／ml濃度でＰＥＧ溶液に溶解した。シリマリンを含むまたは含まない６μlのＰＥＧを、挫傷性傷害誘発後３０分以内に傷害された脊髄の中心点に髄腔内投与した。皮膚を縫合し、後肢機能(ＢＢＢスケール)を上記の脊髄傷害後２日目および毎週モニターした。図６に示す通り、髄腔内シリマリン注射(２０μg／μl)はＳＣＩラットにおける機能回復を顕著に促進し、シリマリンの媒体であるＰＥＧは神経保護的ではない。傷害５週後、ラットに麻酔し、４％パラホルムアルデヒドを血管内に灌流させた。次いで、脊髄を矢状に切断し(１０μm厚)、抗神経フィラメント(神経細胞用)または抗ＥＤ１(活性化ミクログリア用)での免疫組織化学的染色について処理した。この結果によると(データは示していない)、シリマリン処理脊髄において脊髄軸索(神経フィラメント陽性)は良好に保護され、ミクログリア活性化(ＥＤ−１)の程度が低いことが判明した。
【００３５】
外傷性脊髄傷害は破壊的であり、一次および二次傷害カスケードの両方を含む一連の細胞的および分子的事象を開始させる。脊髄の傷害は、炎症応答を引き起こし、これは最初にさらなる組織損傷をもたらす。故に、脊髄傷害の初期炎症応答の減弱は、組織傷害の程度を、そしてそれ故にその後の身体障害を減縮する可能性がある。シリマリンの髄腔内投与を行ったまたは行っていないＳＣＩラットを、傷害３日後に殺した。傷害された脊髄の中心点を直ぐに摘出し、氷冷抽出緩衝液(７Ｍ ウレア、２Ｍ チオウレア、４％ＣＨＡＰＳ、４０mM Ｔｒｉｓ緩衝液(ｐＨ７.５)およびプロテアーゼ阻害剤(Roche 11836145001))中で均質化した。Bradford法(Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories)を使用して、タンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、分離した。移した後、得られたＰＶＤＦ膜を抗ＣＯＸ−２、抗ＥＤ−１および抗アクチン抗体で試験した。図６の結果に一致して、図７に示す通り、髄腔内投与したシリマリンは、傷害３日後の傷害された脊髄で炎症促進性酵素であるＣＯＸ−２の発現を低下させ、ＥＤ−１(＋)ミクログリア浸潤を阻止した。
【００３６】
髄腔内シリマリンの位置は、全身的皮下(ｓｃ)投与されたものと異なり得る。ＳＣＩラットに、シリマリン(１２０μg／６μl／ラット)を髄腔内投与した。傷害１日、２日、７および１４日後、脊髄中心点を摘出し、５体積の５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)中で均質化した。組織ホモジネートをさらに等体積の溶媒(ブタノール：メタノール、９５：５；ｖ／ｖ)で抽出した。遠心分離後、得られた有機層を回収し、濃縮し、ＵＶ検出器を備えたＨＰＬＣ装置に直接注入した。図８は、脊髄において達成されるシリマリン暴露の経時変化を示す(薬物動態学)。シリマリンの位置は傷害された脊髄中心点に限定される。注射２週目で、約８μg／組織ｇのシリマリンがまだ残っていた。故に、シリマリンの薬物動態学の差異が、髄腔内シリマリン注射の有効な結果に寄与している可能性がある。
【００３７】
当業者には、上記の態様を、その広い発明的概念から逸脱することなく変え得ることが認識されよう。それ故に、本発明は開示した特定の態様に限定されず、添付の特許請求の範囲に定義する本発明の精神および範囲内の改変を包含することを意図することは理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分としてシリマリンまたはシリビンを含む、神経傷害処置用組成物。
【請求項２】
神経傷害が脊髄傷害(ＳＣＩ)である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＳＣＩが挫傷性ＳＣＩである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
髄腔内投与する、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
傷害された神経領域に投与する、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
活性成分としてシリマリンまたはシリビンを含む、ＳＣＩからの回復を亢進させるための組成物。
【請求項７】
ＳＣＩが挫傷性ＳＣＩである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
髄腔内に投与する、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
傷害された神経領域に投与する、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項１０】
神経傷害の処置またはＳＣＩからの回復の亢進のための医薬の製造における、シリマリンまたはシリビンの使用。
【請求項１】
活性成分としてシリマリンまたはシリビンを含む、神経傷害処置用組成物。
【請求項２】
神経傷害が脊髄傷害(ＳＣＩ)である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＳＣＩが挫傷性ＳＣＩである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
髄腔内投与する、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
傷害された神経領域に投与する、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
活性成分としてシリマリンまたはシリビンを含む、ＳＣＩからの回復を亢進させるための組成物。
【請求項７】
ＳＣＩが挫傷性ＳＣＩである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
髄腔内に投与する、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
傷害された神経領域に投与する、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項１０】
神経傷害の処置またはＳＣＩからの回復の亢進のための医薬の製造における、シリマリンまたはシリビンの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−２６２９３（Ｐ２０１１−２６２９３Ａ）
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−９５０７３（Ｐ２０１０−９５０７３）
【出願日】平成２２年４月１６日（２０１０．４．１６）
【出願人】（５０２２９０２６６）
【氏名又は名称原語表記】Ｔａｉｐｅｉ Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９５０７３（Ｐ２０１０−９５０７３）
【出願日】平成２２年４月１６日（２０１０．４．１６）
【出願人】（５０２２９０２６６）
【氏名又は名称原語表記】Ｔａｉｐｅｉ Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ
【Ｆターム（参考）】
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