神経成長因子産生促進剤
【課題】神経成長因子の産生を高めることにより神経細胞の生存と機能維持を促して神経系の老化を予防ないし改善し、また障害を受けた神経細胞に対してはその細胞自身の変成脱落を予防し、神経障害の進行を防止ないし改善する、高い神経成長因子産生促進活性を有する食用キノコ由来の破砕物又は抽出物を提供する。
【解決手段】シメジ属に属するキノコ、好ましくはシャカシメジ子実体又は菌糸体を乾燥した後破砕処理を行い、この破砕物１ｇに対してメタノール１０ｍｌを添加し、４℃にて２週間抽出処理を行って得られた抽出物、またはこれらを有効成分として含む神経成長因子産生促進剤及び神経成長因子産生促進活性を有する飲食品、飼料。
【解決手段】シメジ属に属するキノコ、好ましくはシャカシメジ子実体又は菌糸体を乾燥した後破砕処理を行い、この破砕物１ｇに対してメタノール１０ｍｌを添加し、４℃にて２週間抽出処理を行って得られた抽出物、またはこれらを有効成分として含む神経成長因子産生促進剤及び神経成長因子産生促進活性を有する飲食品、飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経成長因子（beta nerve growth factor、以下「ベータNGF」と略記）産生促進活性を有する組成物及びその製造方法並びにベータNGF産生促進剤などに関するものであり、さらに詳しくは、神経系の老化予防や神経障害の進行防止、あるいはこれら疾患の改善等に有効な安全性の高いベータNGF産生促進活性を有する組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会への移行に伴って老年型痴呆症が増加する傾向にあり、社会的な問題となりつつある。老年型痴呆症の原因となる疾患は数多く知られ、脳器質性障害による痴呆、脳以外の臓器疾患に付随した痴呆、およびストレスによる身体疾患に起因する痴呆に分類される。また、脳器質性障害による痴呆は、原因の違いにより脳血管性痴呆症とアルツハイマー型痴呆症とに分類される。
【０００３】
現在、脳血管性痴呆症に対しては脳血管拡張薬などがある程度の効果を示すことが知られているが、アルツハイマー型痴呆症に対しては、その発症原因が今なお不明であり、適切な治療方法も明らかになっていない。そのため、脳器質性障害による痴呆、特にアルツハイマー型痴呆症に対して有用な医薬や食品の開発が所望されている。
【０００４】
近年、神経細胞から分泌されるベータNGFなどの神経栄養因子が神経変性疾患に対して優れた効果を示すことが見出され、注目を集めている。ベータNGFは、神経組織の成長及び機能維持にとって重要かつ必要な因子である。ベータNGFは、末梢神経における知覚および交感神経の、ならびに中枢神経における大細胞性コリン作動性ニューロンの、成熟、分化、および生命維持に不可欠であり、脳損傷時の神経細胞の変性を防ぐという作用を示す。これにより、生体内においてベータNGFレベルを上昇させることは、アルツハイマー型痴呆症及び脳血管性痴呆症のような中枢機能障害、精髄障害、末梢神経損傷、糖尿病性神経障害、並びに筋萎縮変性側索硬化症のような抹消機能障害の治療に有用であると考えられる。
【０００５】
しかし、ベータNGFはモノマーで１３０００またはダイマーでは２６０００もの分子量を有するタンパク質であり、血液脳関門を通過することができない。そのため、例えば中枢機能障害の治療を目的とした場合には、脳室内投与が必要となる。さらに、ベータNGFの大量調製も困難である。このようにベータNGF自体の使用には多くの問題があり、ベータNGF自体を用いることは非常に困難である。
【０００６】
ベータNGFが、末梢神経系においては胎生期の知覚及び交感神経節神経細胞の分化及び成長を促進し、神経細胞突起の伸長を促すタンパク質であること、さらに成熟交感神経細胞にとっては一生を通じて生存及び機能維持に不可欠なタンパク質であることが知られている。たとえば、幼若動物に抗ベータNGF抗体を連続投与してベータNGFの生理活性を中和した場合には、交感神経節の顕著な萎縮や神経節神経細胞の死滅が観察されている（非特許文献１、２）。この現象は不可逆的であり、ベータNGFの生理的役割の重要性を証明するものである。また、ベータNGFの作用に関する応用研究も行なわれており、ベータNGFが神経軸索の再生にも有効であることが明らかにされている（非特許文献３）。
【０００７】
一方、中枢神経系におけるベータNGFの重要性も知られており、たとえば、中隔から海馬へ投射している神経路を切断したラットの脳室内にベータNGFを投与することによって、中隔のコリン作動性神経細胞の変性、脱落が抑制されること（非特許文献４、５）、老齢ラットの学習、記憶能力がベータNGFの脳室内投与で改善されること（非特許文献６）、脳虚血後に見られる海馬の錐体細胞の遅延性細胞死がベータNGFの前投与により抑制されること（非特許文献７）等が報告されている。
【０００８】
このように、ベータNGFが神経細胞の生存に不可欠な因子であることから、神経疾患や神経細胞障害の進行防止ないしは治療を目的として、ベータNGFの産生を促進する物質の検索が行なわれている。その結果、これまでにカテコールアミン類（非特許文献８）、コリン作動性アゴニスト（特許文献１）、桂皮酸アミド化合物（特許文献２）、ベンゾキノン誘導体（非特許文献９）、及びプロペントフィリン（非特許文献１０）にベータNGF産生促進作用のあることが報告されている。また、線維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor）、血小板由来成長因子（platelet-derived growth factor）、トランスフォーミング成長因子アルファ及びベータ（transforming growth factor α and β）、上皮細胞成長因子（epidermal growth factor）、及びインシュリン様成長因子（insulin-like growth factor）等のいわゆる細胞増殖因子にもベータNGFの産生を促進する活性が認められている（非特許文献１１）。
【０００９】
しかしながら、食生活を通じて上記疾患の予防又は進行防止を達成する観点からは、豊富な食経験があり、ベータNGF産生促進作用を有する食品由来の破砕物又は抽出物を好ましくは摂取することが望まれる。
【００１０】
ベータNGF産生を促進する食品由来の物質又は抽出物としては、ホップ又はアシタバから得られる破砕物又は抽出物（特許文献３）、ローズマリー由来のカルノジン酸（特許文献４）、緑茶由来のテアニン（特許文献５）、ガゴメコンブ由来のフコイダン（特許文献６）、プロタミン（特許文献７）、などが知られている。
【００１１】
また、茸類由来の物質又は抽出物としては、ヤマブシタケ抽出物（特許文献８）について多く報告があり、その他ブナハリタケ抽出物（非特許文献１２）やキヌガサタケ抽出物（特許文献９）、ケロウジ抽出物（特許文献１０）やマッシュルーム、シイタケ、エリンギ、エノキタケおよびブナシメジの水抽出物（特許文献１１）などが知られている。特に特許文献１１においては、ハラタケ目のキノコの水抽出物にベータNGF産生促進活性があると記載されているが、該特許実施例においてその活性が測定されたものはマッシュルーム、シイタケ、エリンギ、エノキタケおよびブナシメジに過ぎず、膨大な種類に及ぶ全てのハラタケ目のキノコの水のみの抽出物にベータNGF産生促進活性があるとする根拠には非常に乏しい。またブナシメジは「シメジ」と名がつくものの、シロタモギタケ属のキノコであり、シメジ属には属しないキノコである。
【非特許文献１】R. Levi‐Montalcina他、Physiological Review,48, 534−569, 1968
【非特許文献２】H. Thoenen他、Physiological Review, 60, 1284−1335, 1980
【非特許文献３】Rich他、Experimental Neurology, 105, 162−170, 1989
【非特許文献４】F. Hefti, Journal of Ncuroscience, 6, 2155−2162, 1986 : L. F.Kromer, Science, 235, 214−216, 1987
【非特許文献５】L. R. Williams他、Proceedings of National Academy of Sciences U. S. A. 83, 9231−9235, 1986
【非特許文献６】W. Fisher他、Nature, 329, 65−68, 1987
【非特許文献７】茂野他、医学のあゆみ、第145巻、579−580, 1988
【非特許文献８】Y.Furukawa他、Journal of Biological Chemistry, 261, 6039−6047, 1986
【特許文献１】特開昭６３−８３０２０号公報
【特許文献２】特開平２−１０４５６８号公報
【非特許文献９】R. Takeuchi他、FEBS Letter, 261, 63-66, 1990
【非特許文献１０】I. Shinoda他、Biochemical Pharmacology, 39, 1813−1816, 1990
【非特許文献１１】篠田 他、生化学、第６２巻、835頁、1990年
【特許文献３】再表２００３−００６０３７号公報
【特許文献４】特開２００１−２３３８３５号公報
【特許文献５】特開平７−１７３０５９号公報
【特許文献６】再表２０００−０６２７８５号公報
【特許文献７】特開平５−５１３２５号公報
【特許文献８】特開平７−７０１６８号公報
【非特許文献１２】Okuyama S, Terashima T, Kawamura Y, YokogoshiH 、Nutr Neurosci. 7, 741-47,2004
【特許文献９】特開平９−０２０７１４号公報
【特許文献１０】特開平１１−２６９１２５号公報
【特許文献１１】再表２００３−７９７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前記のベータNGF産生を促進する食品由来の物質又は抽出物のベータNGF産生促進活性は低いという問題があった。本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ベータNGFの産生を高めることにより神経細胞の生存と機能維持を促して神経系の老化を予防ないし改善し、また障害を受けた神経細胞に対してはその細胞自身の変成脱落を予防し、神経障害の進行を防止ないし改善する、高いベータNGF産生促進活性を有するシメジ属に属するキノコ、好ましくはシャカシメジの破砕物又は抽出物からなる組成物を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ベータNGF産生促進作用を有する植物由来の破砕物又は抽出物の検討を鋭意行った結果、シメジ属に属するキノコ、好ましくはシャカシメジの子実体又は菌糸体の破砕物又は抽出物に高いベータNGF産生促進活性があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体から得られることを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する組成物を要旨とするものであり、好ましくは、
シメジ属に属するキノコが、ホンシメジ、シャカシメジ、カクミノシメジ及びハタケシメジから成る群から選ばれる1種以上である前記の組成物である。
【００１５】
また、本発明は、シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体を平均粒径１ｍｍ以下に破砕して破砕物を得ることを特徴とする前記した神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法を要旨とするものである。
【００１６】
また、別の本発明は、シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体から溶媒を用いて抽出物を得ることを特徴とする前記した神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法を要旨とするものであり、好ましくは、溶媒が、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、エーテル類及び二酸化炭素からなる群から選ばれる１種の溶媒又は２種以上を混合した溶媒である製造方法である。また、これらの二つの製造方法に係る発明において、好ましくは、シメジ属に属するキノコが、ホンシメジ、シャカシメジ、カクミノシメジ及びハタケシメジから成る群から選ばれる1種以上であるものである。
【００１７】
また、別の本発明は、前記した組成物を有効成分とすることを特徴とする神経成長因子産生促進剤を要旨とするものである。
【００１８】
また、別の本発明は、前記した組成物を含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飲食品を要旨とするものである。
【００１９】
さらに、別の本発明は、前記した組成物を含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飼料を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、食経験豊かなシメジ属に属するキノコ、好ましくはシャカシメジの子実体又は菌糸体の破砕物又は抽出物を薬学的組成物や食品組成物、飼料組成物として利用することにより、神経系の老化予防や神経障害の進行防止、あるいはこれら疾患の改善が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
本発明におけるシメジ属に属するキノコにはカクミノシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｙｋｏｓｐｏｒｕｍ）、スミゾメシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｅｍｉｔａｌｅ）、シャカシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｆｕｍｏｓｕｍ）、ホンシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｈｉｍｅｊｉ）、ハタケシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｃａｓｔｅｓ）、オシロイシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｎｎａｔｕｍ）が属し、シメジ属はハラタケ目キシメジ科の１つである。
【００２３】
本発明におけるシメジ属に属するキノコの１つであるシャカシメジ（Ｌｙｐｐｈｙｌｌｕｍ ｆｕｍｏｓｕｍ）は、秋にマツ類の混じったナラ林の地上に発生する菌根性茸類で、柄は塊茎状の太い根株から多数生じ、ときに枝分かれし、その先に直径０．５〜５ｃｍの傘をつける。小さな半球形の傘が、菌糸塊の表面にびっしりと並ぶ姿が釈迦の頭に似ているところからシャカシメジの名がついたと言われる。非常に食味の良い優秀な食用キノコの一つであり、当該キノコの発生地方においては長く食されているが、近年はその発生量が非常に少なくなっている。人工栽培の方法も検討されているが、現在のところ一般的に市場に流通するまでには至っていない。シャカシメジに含まれる成分の機能性については、子実体の溶媒抽出物にマウス前骨芽細胞であるＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞の分化誘導活性が知られている。
【００２４】
本発明におけるシメジ属に属するキノコであるホンシメジは（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｈｉｍｅｊｉ）はハラタケ目キシメジ科シメジ属の菌根菌であり別名はダイコクシメジ。「香りマツタケ、味シメジ」と言われるように、キノコのなかでも有数の強いうまみを持つ優れた食用菌として知られる。秋にコナラ林やアカマツ林でこれらの樹木に菌根をつくって生活し、子実体は地上に単生〜群生する。菌根菌であるため、これまで栽培ができなかったため希少であったが、最近では栽培下で子実体を形成することに成功している。ホンシメジに含まれる成分の機能性については、子実体の溶媒抽出物にマウス前骨芽細胞であるＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞の分化誘導活性が知られている。
【００２５】
本発明におけるシメジ属に属するキノコであるハタケシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｃａｓｔｅｓ）はホンシメジとならび、美味なキノコとして知られており、菌根菌でありながら腐朽菌としての性質を有しているために比較的容易に人工栽培が可能となったキノコである。ハタケシメジにはメラニン産生細胞であるB16 2F2株における細胞分化誘導活性を有することが報告されている。また、アトピー性皮膚炎改善効果、抗腫瘍活性やイソロイシルチロシンのアンジオテンシン変換酵素阻害活性、血中コレステロール及び中性脂肪上昇抑制効果などが知られている。
【００２６】
本発明におけるシメジ属に属するキノコであるカクミノシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｙｋｏｓｐｏｒｕｍ）、スミゾメシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｅｍｉｔａｌｅ）、オシロイシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｎｎａｔｕｍ）については、人工栽培法は確立されておらず、また特に機能性についても知られていない。
【００２７】
本発明で用いられるシメジ属に属するキノコの子実体は、天然のものでも人工栽培されたものでもよい。
【００２８】
また、本発明においては、シメジ属に属するキノコの菌糸体も用いることができる。菌糸体は液体培養法によって得ることができる。培地に使用する炭素源としては、グルコースなどの単糖の他、デキストリン、グリセロールなど通常用いられる炭素源が使用できる。また、窒素源としては無機又は有機窒素源が使用できるが、生育速度の観点からは有機窒素源を用いるほうが好ましい。また、必要に応じて微量元素やビタミン等の生育因子を添加することは通常の培養と何ら変わりはない。培養温度は１５℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２８℃、２０℃〜２５℃が最も好ましい。ｐＨは２．５〜８．０、好ましくは３．０〜７．０、３．５〜５．０が最も好ましい。培地成分には不溶成分を添加することが均一に生育させることができることから好ましい。培養期間は菌株により、数日から数週間程度に設定されうる。
【００２９】
本発明はシメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の破砕物又は抽出物を用いるものであり、シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の乾燥破砕物、該破砕物を各種溶媒で抽出した抽出物、該抽出物を濃縮乾燥したものなどが含まれる。本発明で使用するシメジ属に属するキノコとしては、子実体や菌糸体を使用することができるが、神経成長因子促進活性物質が多く含まれる点で、子実体を使用することが好ましい。
【００３０】
シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の乾燥条件は特に限定されるものではなく、公知の方法が利用できる。例えば常温乾燥、加熱乾燥や凍結乾燥、減圧乾燥、真空乾燥などの方法が利用でき、好ましくは経済的な３０〜１００℃での加熱乾燥であり、５０〜８０℃での加熱乾燥がさらに好ましい。乾燥機は、例えばドラムドライヤーや流動層式乾燥機、棚式乾燥機、振動乾燥機、ロータリードライヤーなどの機械装置類が挙げられるが特に限定するものではない。
【００３１】
シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の乾燥後、公知の破砕方法によって乾燥物を破砕することが出来る。破砕する方法は特に限定しないが、破砕物の粒径が１ｍｍ以下になるように調整できる破砕機を使用することが好ましい。例えば、乾式石臼式破砕機、ローラーミル、カッターミル、ボールミル、ジェットミル、ハンマーミルなどが挙げられるが特に限定するものではない。
【００３２】
以上のようにして得られたシメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の破砕物は、そのままで、あるいは必要に応じて他の成分を加えることで本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物となる。
【００３３】
また、シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体から抽出物を得る際に用いられる抽出溶媒としては、例えば水、二酸化炭素、低級１価アルコール（メチルアルコール、エチルアルコール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等）、低級エステル（酢酸エチル等）、炭化水素（ベンゼン、ヘキサン、ペンタン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル類（ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジプロピルエーテル等）、アセトニトリル等が挙げられ、それらの一種又は二種以上を用いることができる。好ましくは水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、エーテル類、二酸化炭素である。最も好ましくはエタノール、ヘキサン、二酸化炭素である。
【００３４】
抽出を行うには、シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体に溶媒を添加してもよいが、できれば上記したようにシメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体を破砕した後、破砕物に対して溶媒を添加する方が好ましい。
【００３５】
抽出温度は、抽出溶媒が液体状態であり、抽出中にシメジ属に属するキノコに含まれるベータNFG産生促進物質が変質しない条件であれば特に限定しない。抽出温度は使用する溶媒の種類によって適宜選択すればよいが、好ましくは４０℃以下であり、さらに好ましくは１０℃以下である。また抽出時間は５時間以上が好ましく、さらに好ましくは1週間以上であり、最も好ましくは２０日以上である。
【００３６】
抽出後、破砕物と溶媒との混合物は公知の方法によって固液分離し、抽出液のみを回収すればよい。固液分離する方法としては遠心分離、フィルタープレス、吸引ろ過などが挙げられるが特に限定しない。さらに、必要に応じて抽出液を濃縮・乾燥することもできる。
【００３７】
以上のようにして得られたシメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の抽出物は、そのままで、あるいは必要に応じて他の成分を加えることで本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物となる。
【００３８】
組成物に含まれ得る他の成分としては、本発明におけるベータNGF産生促進活性を低下させないものであれば混合することが可能であり、例えば従来から用いられている薬学的に許容された界面活性剤、溶媒、増粘剤、安定剤、保存料、酸化防止剤、香味料、等のような添加剤と混合されることができる。
【００３９】
組成物の形態としては、錠剤、液体、カプセル、軟カプセル、ペースト若しくはトローチ、ガム又は飲用可能な溶液若しくは乳濁液、ドライ経口サプリメント、ウェット経口サプリメントなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これらの形態は従来から知られている方法によって作製することができる。
【００４０】
本発明のベータNGF産生促進剤は、上記した本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物を有効成分として含むものである。有効成分の含有量としては、摂取する対象者の年齢、体重などによって変わり得るが、成人１日あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ服用できるように含有するのが好ましく、さらに０．１〜１０ｍｇ／ｋｇが好ましく、０．５〜５ｍｇ／ｋｇが最も好ましい。
【００４１】
本発明のベータNGF産生促進剤に含まれる各種添加剤としては、界面活性剤、賦形剤、着色料、保存料、コーティング助剤ならびにこれらの組合せが挙げられる。これら添加剤は、通常の医薬品製造における添加剤であれば特に限定されず、より具体的な例としては、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、デキストリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース塩、ステアリン酸及びその塩、タルクなどの添加剤であり、これらの組合せが挙げられる。さらに、香辛料、甘味料などを添加してもよい。またさらに、必要に応じて他の薬剤や食品粉砕物、食品抽出物を添加してもよい。
【００４２】
本発明のベータNGF産生促進剤の投与剤形も特に限定されず、日本薬局方に従って適切な剤形に製造される。具体的には、カプセル剤、錠剤、粉剤、除放剤などの剤形に製造される。
【００４３】
本発明のベータNGF産生促進活性を有する飲食品は、上記した本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物を含有するものである。有効成分の含有量は１日あたりの摂取量が０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇになるようそれぞれの飲食品の形態に合わせて設定すればよく、さらには０．１〜１０ｍｇ／ｋｇが好ましく、０．５〜５ｍｇ／ｋｇが最も好ましい。
【００４４】
本発明のベータNGF産生促進活性を有する飲食品に混合され得る他の材料としては、一般に食品用材料として使用され得るものが挙げられる。例としては、米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、昆布などから得られる多糖類、大豆や乳製品、動物原料などから得られるタンパク質、グルコース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マンニトール、キシリトールや各種オリゴ糖などの糖類、ならびにこれらの組合せが挙げられる。さらに、香辛料、着色料、甘味料、酸味料、食用油、ビタミンや他の食品破砕物、食品抽出物などを添加してもよい。これら適切な材料及び添加剤は単独又は組合せて使用される。またさらに、必要に応じて水を添加して所望の形状に加工してもよい。
【００４５】
飲食品の具体例としては、菓子類（ガム、キャンディー、キャラメル、チョコレート、クッキー、スナック菓子、ゼリー、グミ、錠菓等）、麺類（そば、うどん、ラーメン等）、乳製品（ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト等）、調味料（味噌、醤油等）、スープ類、飲料（ジュース、コーヒー、紅茶、茶、炭酸飲料、スポーツ飲料等）をはじめとする一般食品や健康食品（錠剤、カプセル等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、インスタント食品に本発明の抽出物を添加してもよい。例えば、抽出物を粉末セルロースとともにスプレードライまたは凍結乾燥したものを、粉末、顆粒、打錠又は溶液にすることで容易に飲食品に含有させることができる。
【００４６】
本発明のベータNGF産生促進活性を有する飼料は、上記した本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物を含有するものであり、すべての家畜や家禽、愛玩動物に適用することが可能である。本発明の飼料を適用し得る家畜や家禽類としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ等の家畜、ニワトリ、七面鳥、カモ、ウズラ等の産業上飼育する動物のことである。また本発明を適用しうる愛玩動物とは犬、猫、ハムスターや小型の鳥類等の個人の趣味で飼育する動物や鳥類のことである。飼料組成物としてこれ単独で投与しても良く、さらには飼料 に直接添加しても良く、この使用形態は特に限定されない。飼料 に添加する場合、添加方法、添加時期等は特に限定されるものではない。
本発明の飼料に含まれる有効成分の含有量は、1日あたりの有効成分の給餌量として０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇになるようそれぞれの飼料の形態に合わせて設定すればよく、さらには０．１〜１０ｍｇ／ｋｇが好ましく、０．５〜５ｍｇ／ｋｇが最も好ましい。
【００４７】
本発明の飼料に混合され得る他の材料としては、例えばトウモロコシ、マイロ、大豆、大豆粕、小麦、大麦、米、燕麦、魚粉、脱脂粉乳、ビートパルプペレット、ふすまペレット、グレインスクリーニングペレット、アルファルファペレット、タピオカペレット、コーンコブミール、コットンハルペレット、甘藷チップ、ホミニフィード、ビール粕、ヘイキューブ、ミニキューブ、アルファルファ ベールドヘイ、スーダングラス、稲わら、ライグラスストロー、フェスキューストロー、バミューダストロー、チモシーヘイ、オーツヘイ、糖蜜、ルーピン、カノーラ、菜種粕、綿実、コーングルテンミール、コーングルテンフィード、ソイハルペレット、ホエイパウダー、ビール酵母、コレステロールなどのほか、薬学的に許容され得るビタミン類やミネラル類、飼料添加物、動物医薬品などが挙げられ、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
なお、ベータNGF産生促進活性の測定は以下のようにして行った。
〔ヒトグリオブラストーマによるベータNGFの産生〕
終濃度が10％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、110mg/mlピルビン酸ナトリウム、１％ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸溶液：インビトロジェン株式会社）を含むＥＭＥＭ培地に、12.5 x104細胞/mlの濃度になるよう調製したヒトグリオブラストーマ（神経膠芽腫）Ｔ９８Ｇ細胞懸濁液を、２４穴マルチプレートの各穴に接種し、３日間培養した。その後、5mg/mlのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むOpti-MEM培地に交換し、さらに４日間培養した。再度培地交換し、上記で調製した抽出物ＤＭＳＯ溶液を、各抽出物の固形分終濃度が200μg/mlになるよう添加し、4日間培養した。培養上清を回収し、ベータNGF量を測定した。
【００４９】
〔培養上清中のベータNGFの測定法〕
ベータNGFの測定はR&Dシステム社の「ベータNGF、Human, DuoSet Kit」を使用した。ポリスチレン製の９６穴マルチプレートに、Capture Antibodyとしてマウス抗ヒトベータNGF抗体溶液を各穴に１００μlづつ分注し、室温で一夜放置した。マイクロプレートに吸着されなかった抗体を除去後、Wash Buffer（0.05% Tween20を含むPBS）で各穴を３回洗浄した。各穴に300μｌのReagent Diluent（１％BSAを含むPBS）を加えて1時間以上、室温でブロッキングをし、Wash Buffer（0.05% Tween20を含むPBS）で各穴を３回洗浄した。標準溶液としてのヒト組み換えベータNGF溶液あるいは、上記の実験により得られた各培養上清１００μlを各穴に分注し、室温で２時間放置した後、標準溶液あるいは、培養上清を除去した。さらに各穴を３回づつ洗浄した。Detection Antibodyとしてヒツジ抗ヒトベータNGF抗体溶液を各穴に１００μlづつ分注し、室温で２時間放置した後、ホースラーディッシュ由来パーオキシダーゼを各穴に１００μｌづつ加えて遮光して室温で２０分間静置し、Wash Buffer（0.05% Tween20を含むPBS）で各穴を３回洗浄した。各穴にSubstrate Solution（過酸化水素とテトラメチルベンジジンの混合液）を１００μｌづつ加え室温で２０分間反応させた。Stop Solutionとして２Nの硫酸を５０μｌづつ加え、直ちに吸光度計にて450/540nmの吸光度を測定し、標準曲線よりベータNGF量を算出した。
【００５０】
実施例１
〔キノコ子実体抽出物の調製〕
ハラタケ目キシメジ科シメジ属に属するシャカシメジ、スッポンタケ目スッポンタケ科キヌガサタケ属に属するキヌガサタケ、ヒダナシタケ目イボタケ科コウタケ属に属するケロウジ、ヒダナシタケ目エゾハリタケ科エゾハリタケ属に属するブナハリタケ及びサンゴハリタケ科のヤマブシタケについて市販品を購入し、それらの子実体を８０℃で熱風乾燥し、回転刃付ブレンダーで破砕処理を行い、１ｍｍ以下の破砕物を得た。この破砕物１ｇに対してメタノール１０ｍｌを添加し、４℃にて２週間抽出処理を行った。また、シャカシメジについては、さらに水、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、ジエチルエーテルを用いて同様の抽出処理を行った。これらの各抽出物を遠心分離（3000rpm、10分間）して上清を回収し、上清を減圧下で乾燥させ、固形分を測定した。この乾燥物を再度、DMSO（ジメチルスルホキシド）に溶解し、ベータNGF産生促進活性を試験した。
【００５１】
〔シャカシメジ菌糸体抽出物の調製〕
シャカシメジの子実体から内部の組織を無菌的に切り出した。この組織をポテトデキストロース寒天培地に移し、２５℃で２０日間培養した。２０日後成長した菌糸体を寒天培地に継代培養した。この操作を二度繰り返し、得られた菌糸体をポテトデキストロース液体培地に移植し、４０日間、静地培養した。４０日後、培養液と菌糸体をろ紙を用いてろ別した。このようにして得られたシャカシメジ菌糸体を８０℃で熱風乾燥し、回転刃付ブレンダーで破砕処理を行い、1mm以下の破砕物を得た。この破砕物１ｇに対してメタノール１０ｍｌを添加し、上記子実体破砕物と同様に抽出してベータNGF産生促進活性を試験した。
【００５２】
〔アシタバ抽出物の調製〕
アシタバ葉を８０℃で熱風乾燥し、回転刃付ブレンダーで破砕処理を行い、1mm以下の破砕物を得た。この破砕物１ｇに対してメタノール１０ｍｌを添加し、前記子実体破砕物と同様に抽出してベータNGF産生促進活性を試験した。
【００５３】
結果を表１に示した。表１に示した結果から、シャカシメジ抽出物、特にシャカシメジ子実体メタノール抽出物のNGF産生促進作用が極めて高いことが分かる。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実施例２
上記実施例１で得たシャカシメジ子実体及びヤマブシタケ子実体、アシタバの各メタノール抽出物ＤＭＳＯ溶液を固形分終濃度が２５、５０、１００、２００、４００μg/mlとなるように加える以外は同様にして、ヒトグリオハイブリドーマＴ９８Ｇ細胞を用いてベータＮＧＦを培養上清中に産生させ、ベータNGF量を測定した。
結果を図１に示した。図１からシャカシメジ子実体のベータNGF産生促進作用が極めて高いことが分かる。
【００５６】
実施例３
下記の表２に記載した各キノコの子実体を入手し、メタノール抽出物を実施例１と同様の方法で作成し、同様の試験を行った。
【００５７】
結果、シメジ属に属するキノコから得られる子実体にはいずれも高いベータNGF産生促進活性が認められた。
【００５８】
【表２】
【００５９】
実施例４
採取地の異なるシャカシメジとホンシメジの子実体をそれぞれ5株購入し、実施例１と同様にメタノール抽出物を得て、ベータNGF産生促進作用を測定した。
【００６０】
結果、表３に示すように、採取地が異なることで各子実体メタノール抽出物におけるベータNGF産生促進作用に若干の変動があるものの、いずれも高いベータNGF産生促進作用が確認された。
【００６１】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】シャカシメジ子実体及びヤマブシタケ子実体、アシタバのメタノール抽出物のベータNGF産生促進作用の濃度依存性を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経成長因子（beta nerve growth factor、以下「ベータNGF」と略記）産生促進活性を有する組成物及びその製造方法並びにベータNGF産生促進剤などに関するものであり、さらに詳しくは、神経系の老化予防や神経障害の進行防止、あるいはこれら疾患の改善等に有効な安全性の高いベータNGF産生促進活性を有する組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会への移行に伴って老年型痴呆症が増加する傾向にあり、社会的な問題となりつつある。老年型痴呆症の原因となる疾患は数多く知られ、脳器質性障害による痴呆、脳以外の臓器疾患に付随した痴呆、およびストレスによる身体疾患に起因する痴呆に分類される。また、脳器質性障害による痴呆は、原因の違いにより脳血管性痴呆症とアルツハイマー型痴呆症とに分類される。
【０００３】
現在、脳血管性痴呆症に対しては脳血管拡張薬などがある程度の効果を示すことが知られているが、アルツハイマー型痴呆症に対しては、その発症原因が今なお不明であり、適切な治療方法も明らかになっていない。そのため、脳器質性障害による痴呆、特にアルツハイマー型痴呆症に対して有用な医薬や食品の開発が所望されている。
【０００４】
近年、神経細胞から分泌されるベータNGFなどの神経栄養因子が神経変性疾患に対して優れた効果を示すことが見出され、注目を集めている。ベータNGFは、神経組織の成長及び機能維持にとって重要かつ必要な因子である。ベータNGFは、末梢神経における知覚および交感神経の、ならびに中枢神経における大細胞性コリン作動性ニューロンの、成熟、分化、および生命維持に不可欠であり、脳損傷時の神経細胞の変性を防ぐという作用を示す。これにより、生体内においてベータNGFレベルを上昇させることは、アルツハイマー型痴呆症及び脳血管性痴呆症のような中枢機能障害、精髄障害、末梢神経損傷、糖尿病性神経障害、並びに筋萎縮変性側索硬化症のような抹消機能障害の治療に有用であると考えられる。
【０００５】
しかし、ベータNGFはモノマーで１３０００またはダイマーでは２６０００もの分子量を有するタンパク質であり、血液脳関門を通過することができない。そのため、例えば中枢機能障害の治療を目的とした場合には、脳室内投与が必要となる。さらに、ベータNGFの大量調製も困難である。このようにベータNGF自体の使用には多くの問題があり、ベータNGF自体を用いることは非常に困難である。
【０００６】
ベータNGFが、末梢神経系においては胎生期の知覚及び交感神経節神経細胞の分化及び成長を促進し、神経細胞突起の伸長を促すタンパク質であること、さらに成熟交感神経細胞にとっては一生を通じて生存及び機能維持に不可欠なタンパク質であることが知られている。たとえば、幼若動物に抗ベータNGF抗体を連続投与してベータNGFの生理活性を中和した場合には、交感神経節の顕著な萎縮や神経節神経細胞の死滅が観察されている（非特許文献１、２）。この現象は不可逆的であり、ベータNGFの生理的役割の重要性を証明するものである。また、ベータNGFの作用に関する応用研究も行なわれており、ベータNGFが神経軸索の再生にも有効であることが明らかにされている（非特許文献３）。
【０００７】
一方、中枢神経系におけるベータNGFの重要性も知られており、たとえば、中隔から海馬へ投射している神経路を切断したラットの脳室内にベータNGFを投与することによって、中隔のコリン作動性神経細胞の変性、脱落が抑制されること（非特許文献４、５）、老齢ラットの学習、記憶能力がベータNGFの脳室内投与で改善されること（非特許文献６）、脳虚血後に見られる海馬の錐体細胞の遅延性細胞死がベータNGFの前投与により抑制されること（非特許文献７）等が報告されている。
【０００８】
このように、ベータNGFが神経細胞の生存に不可欠な因子であることから、神経疾患や神経細胞障害の進行防止ないしは治療を目的として、ベータNGFの産生を促進する物質の検索が行なわれている。その結果、これまでにカテコールアミン類（非特許文献８）、コリン作動性アゴニスト（特許文献１）、桂皮酸アミド化合物（特許文献２）、ベンゾキノン誘導体（非特許文献９）、及びプロペントフィリン（非特許文献１０）にベータNGF産生促進作用のあることが報告されている。また、線維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor）、血小板由来成長因子（platelet-derived growth factor）、トランスフォーミング成長因子アルファ及びベータ（transforming growth factor α and β）、上皮細胞成長因子（epidermal growth factor）、及びインシュリン様成長因子（insulin-like growth factor）等のいわゆる細胞増殖因子にもベータNGFの産生を促進する活性が認められている（非特許文献１１）。
【０００９】
しかしながら、食生活を通じて上記疾患の予防又は進行防止を達成する観点からは、豊富な食経験があり、ベータNGF産生促進作用を有する食品由来の破砕物又は抽出物を好ましくは摂取することが望まれる。
【００１０】
ベータNGF産生を促進する食品由来の物質又は抽出物としては、ホップ又はアシタバから得られる破砕物又は抽出物（特許文献３）、ローズマリー由来のカルノジン酸（特許文献４）、緑茶由来のテアニン（特許文献５）、ガゴメコンブ由来のフコイダン（特許文献６）、プロタミン（特許文献７）、などが知られている。
【００１１】
また、茸類由来の物質又は抽出物としては、ヤマブシタケ抽出物（特許文献８）について多く報告があり、その他ブナハリタケ抽出物（非特許文献１２）やキヌガサタケ抽出物（特許文献９）、ケロウジ抽出物（特許文献１０）やマッシュルーム、シイタケ、エリンギ、エノキタケおよびブナシメジの水抽出物（特許文献１１）などが知られている。特に特許文献１１においては、ハラタケ目のキノコの水抽出物にベータNGF産生促進活性があると記載されているが、該特許実施例においてその活性が測定されたものはマッシュルーム、シイタケ、エリンギ、エノキタケおよびブナシメジに過ぎず、膨大な種類に及ぶ全てのハラタケ目のキノコの水のみの抽出物にベータNGF産生促進活性があるとする根拠には非常に乏しい。またブナシメジは「シメジ」と名がつくものの、シロタモギタケ属のキノコであり、シメジ属には属しないキノコである。
【非特許文献１】R. Levi‐Montalcina他、Physiological Review,48, 534−569, 1968
【非特許文献２】H. Thoenen他、Physiological Review, 60, 1284−1335, 1980
【非特許文献３】Rich他、Experimental Neurology, 105, 162−170, 1989
【非特許文献４】F. Hefti, Journal of Ncuroscience, 6, 2155−2162, 1986 : L. F.Kromer, Science, 235, 214−216, 1987
【非特許文献５】L. R. Williams他、Proceedings of National Academy of Sciences U. S. A. 83, 9231−9235, 1986
【非特許文献６】W. Fisher他、Nature, 329, 65−68, 1987
【非特許文献７】茂野他、医学のあゆみ、第145巻、579−580, 1988
【非特許文献８】Y.Furukawa他、Journal of Biological Chemistry, 261, 6039−6047, 1986
【特許文献１】特開昭６３−８３０２０号公報
【特許文献２】特開平２−１０４５６８号公報
【非特許文献９】R. Takeuchi他、FEBS Letter, 261, 63-66, 1990
【非特許文献１０】I. Shinoda他、Biochemical Pharmacology, 39, 1813−1816, 1990
【非特許文献１１】篠田 他、生化学、第６２巻、835頁、1990年
【特許文献３】再表２００３−００６０３７号公報
【特許文献４】特開２００１−２３３８３５号公報
【特許文献５】特開平７−１７３０５９号公報
【特許文献６】再表２０００−０６２７８５号公報
【特許文献７】特開平５−５１３２５号公報
【特許文献８】特開平７−７０１６８号公報
【非特許文献１２】Okuyama S, Terashima T, Kawamura Y, YokogoshiH 、Nutr Neurosci. 7, 741-47,2004
【特許文献９】特開平９−０２０７１４号公報
【特許文献１０】特開平１１−２６９１２５号公報
【特許文献１１】再表２００３−７９７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前記のベータNGF産生を促進する食品由来の物質又は抽出物のベータNGF産生促進活性は低いという問題があった。本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ベータNGFの産生を高めることにより神経細胞の生存と機能維持を促して神経系の老化を予防ないし改善し、また障害を受けた神経細胞に対してはその細胞自身の変成脱落を予防し、神経障害の進行を防止ないし改善する、高いベータNGF産生促進活性を有するシメジ属に属するキノコ、好ましくはシャカシメジの破砕物又は抽出物からなる組成物を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ベータNGF産生促進作用を有する植物由来の破砕物又は抽出物の検討を鋭意行った結果、シメジ属に属するキノコ、好ましくはシャカシメジの子実体又は菌糸体の破砕物又は抽出物に高いベータNGF産生促進活性があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体から得られることを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する組成物を要旨とするものであり、好ましくは、
シメジ属に属するキノコが、ホンシメジ、シャカシメジ、カクミノシメジ及びハタケシメジから成る群から選ばれる1種以上である前記の組成物である。
【００１５】
また、本発明は、シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体を平均粒径１ｍｍ以下に破砕して破砕物を得ることを特徴とする前記した神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法を要旨とするものである。
【００１６】
また、別の本発明は、シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体から溶媒を用いて抽出物を得ることを特徴とする前記した神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法を要旨とするものであり、好ましくは、溶媒が、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、エーテル類及び二酸化炭素からなる群から選ばれる１種の溶媒又は２種以上を混合した溶媒である製造方法である。また、これらの二つの製造方法に係る発明において、好ましくは、シメジ属に属するキノコが、ホンシメジ、シャカシメジ、カクミノシメジ及びハタケシメジから成る群から選ばれる1種以上であるものである。
【００１７】
また、別の本発明は、前記した組成物を有効成分とすることを特徴とする神経成長因子産生促進剤を要旨とするものである。
【００１８】
また、別の本発明は、前記した組成物を含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飲食品を要旨とするものである。
【００１９】
さらに、別の本発明は、前記した組成物を含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飼料を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、食経験豊かなシメジ属に属するキノコ、好ましくはシャカシメジの子実体又は菌糸体の破砕物又は抽出物を薬学的組成物や食品組成物、飼料組成物として利用することにより、神経系の老化予防や神経障害の進行防止、あるいはこれら疾患の改善が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
本発明におけるシメジ属に属するキノコにはカクミノシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｙｋｏｓｐｏｒｕｍ）、スミゾメシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｅｍｉｔａｌｅ）、シャカシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｆｕｍｏｓｕｍ）、ホンシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｈｉｍｅｊｉ）、ハタケシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｃａｓｔｅｓ）、オシロイシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｎｎａｔｕｍ）が属し、シメジ属はハラタケ目キシメジ科の１つである。
【００２３】
本発明におけるシメジ属に属するキノコの１つであるシャカシメジ（Ｌｙｐｐｈｙｌｌｕｍ ｆｕｍｏｓｕｍ）は、秋にマツ類の混じったナラ林の地上に発生する菌根性茸類で、柄は塊茎状の太い根株から多数生じ、ときに枝分かれし、その先に直径０．５〜５ｃｍの傘をつける。小さな半球形の傘が、菌糸塊の表面にびっしりと並ぶ姿が釈迦の頭に似ているところからシャカシメジの名がついたと言われる。非常に食味の良い優秀な食用キノコの一つであり、当該キノコの発生地方においては長く食されているが、近年はその発生量が非常に少なくなっている。人工栽培の方法も検討されているが、現在のところ一般的に市場に流通するまでには至っていない。シャカシメジに含まれる成分の機能性については、子実体の溶媒抽出物にマウス前骨芽細胞であるＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞の分化誘導活性が知られている。
【００２４】
本発明におけるシメジ属に属するキノコであるホンシメジは（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｈｉｍｅｊｉ）はハラタケ目キシメジ科シメジ属の菌根菌であり別名はダイコクシメジ。「香りマツタケ、味シメジ」と言われるように、キノコのなかでも有数の強いうまみを持つ優れた食用菌として知られる。秋にコナラ林やアカマツ林でこれらの樹木に菌根をつくって生活し、子実体は地上に単生〜群生する。菌根菌であるため、これまで栽培ができなかったため希少であったが、最近では栽培下で子実体を形成することに成功している。ホンシメジに含まれる成分の機能性については、子実体の溶媒抽出物にマウス前骨芽細胞であるＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞の分化誘導活性が知られている。
【００２５】
本発明におけるシメジ属に属するキノコであるハタケシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｄｅｃａｓｔｅｓ）はホンシメジとならび、美味なキノコとして知られており、菌根菌でありながら腐朽菌としての性質を有しているために比較的容易に人工栽培が可能となったキノコである。ハタケシメジにはメラニン産生細胞であるB16 2F2株における細胞分化誘導活性を有することが報告されている。また、アトピー性皮膚炎改善効果、抗腫瘍活性やイソロイシルチロシンのアンジオテンシン変換酵素阻害活性、血中コレステロール及び中性脂肪上昇抑制効果などが知られている。
【００２６】
本発明におけるシメジ属に属するキノコであるカクミノシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｙｋｏｓｐｏｒｕｍ）、スミゾメシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｓｅｍｉｔａｌｅ）、オシロイシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｎｎａｔｕｍ）については、人工栽培法は確立されておらず、また特に機能性についても知られていない。
【００２７】
本発明で用いられるシメジ属に属するキノコの子実体は、天然のものでも人工栽培されたものでもよい。
【００２８】
また、本発明においては、シメジ属に属するキノコの菌糸体も用いることができる。菌糸体は液体培養法によって得ることができる。培地に使用する炭素源としては、グルコースなどの単糖の他、デキストリン、グリセロールなど通常用いられる炭素源が使用できる。また、窒素源としては無機又は有機窒素源が使用できるが、生育速度の観点からは有機窒素源を用いるほうが好ましい。また、必要に応じて微量元素やビタミン等の生育因子を添加することは通常の培養と何ら変わりはない。培養温度は１５℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２８℃、２０℃〜２５℃が最も好ましい。ｐＨは２．５〜８．０、好ましくは３．０〜７．０、３．５〜５．０が最も好ましい。培地成分には不溶成分を添加することが均一に生育させることができることから好ましい。培養期間は菌株により、数日から数週間程度に設定されうる。
【００２９】
本発明はシメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の破砕物又は抽出物を用いるものであり、シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の乾燥破砕物、該破砕物を各種溶媒で抽出した抽出物、該抽出物を濃縮乾燥したものなどが含まれる。本発明で使用するシメジ属に属するキノコとしては、子実体や菌糸体を使用することができるが、神経成長因子促進活性物質が多く含まれる点で、子実体を使用することが好ましい。
【００３０】
シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の乾燥条件は特に限定されるものではなく、公知の方法が利用できる。例えば常温乾燥、加熱乾燥や凍結乾燥、減圧乾燥、真空乾燥などの方法が利用でき、好ましくは経済的な３０〜１００℃での加熱乾燥であり、５０〜８０℃での加熱乾燥がさらに好ましい。乾燥機は、例えばドラムドライヤーや流動層式乾燥機、棚式乾燥機、振動乾燥機、ロータリードライヤーなどの機械装置類が挙げられるが特に限定するものではない。
【００３１】
シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の乾燥後、公知の破砕方法によって乾燥物を破砕することが出来る。破砕する方法は特に限定しないが、破砕物の粒径が１ｍｍ以下になるように調整できる破砕機を使用することが好ましい。例えば、乾式石臼式破砕機、ローラーミル、カッターミル、ボールミル、ジェットミル、ハンマーミルなどが挙げられるが特に限定するものではない。
【００３２】
以上のようにして得られたシメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の破砕物は、そのままで、あるいは必要に応じて他の成分を加えることで本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物となる。
【００３３】
また、シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体から抽出物を得る際に用いられる抽出溶媒としては、例えば水、二酸化炭素、低級１価アルコール（メチルアルコール、エチルアルコール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等）、低級エステル（酢酸エチル等）、炭化水素（ベンゼン、ヘキサン、ペンタン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル類（ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジプロピルエーテル等）、アセトニトリル等が挙げられ、それらの一種又は二種以上を用いることができる。好ましくは水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、エーテル類、二酸化炭素である。最も好ましくはエタノール、ヘキサン、二酸化炭素である。
【００３４】
抽出を行うには、シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体に溶媒を添加してもよいが、できれば上記したようにシメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体を破砕した後、破砕物に対して溶媒を添加する方が好ましい。
【００３５】
抽出温度は、抽出溶媒が液体状態であり、抽出中にシメジ属に属するキノコに含まれるベータNFG産生促進物質が変質しない条件であれば特に限定しない。抽出温度は使用する溶媒の種類によって適宜選択すればよいが、好ましくは４０℃以下であり、さらに好ましくは１０℃以下である。また抽出時間は５時間以上が好ましく、さらに好ましくは1週間以上であり、最も好ましくは２０日以上である。
【００３６】
抽出後、破砕物と溶媒との混合物は公知の方法によって固液分離し、抽出液のみを回収すればよい。固液分離する方法としては遠心分離、フィルタープレス、吸引ろ過などが挙げられるが特に限定しない。さらに、必要に応じて抽出液を濃縮・乾燥することもできる。
【００３７】
以上のようにして得られたシメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の抽出物は、そのままで、あるいは必要に応じて他の成分を加えることで本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物となる。
【００３８】
組成物に含まれ得る他の成分としては、本発明におけるベータNGF産生促進活性を低下させないものであれば混合することが可能であり、例えば従来から用いられている薬学的に許容された界面活性剤、溶媒、増粘剤、安定剤、保存料、酸化防止剤、香味料、等のような添加剤と混合されることができる。
【００３９】
組成物の形態としては、錠剤、液体、カプセル、軟カプセル、ペースト若しくはトローチ、ガム又は飲用可能な溶液若しくは乳濁液、ドライ経口サプリメント、ウェット経口サプリメントなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これらの形態は従来から知られている方法によって作製することができる。
【００４０】
本発明のベータNGF産生促進剤は、上記した本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物を有効成分として含むものである。有効成分の含有量としては、摂取する対象者の年齢、体重などによって変わり得るが、成人１日あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ服用できるように含有するのが好ましく、さらに０．１〜１０ｍｇ／ｋｇが好ましく、０．５〜５ｍｇ／ｋｇが最も好ましい。
【００４１】
本発明のベータNGF産生促進剤に含まれる各種添加剤としては、界面活性剤、賦形剤、着色料、保存料、コーティング助剤ならびにこれらの組合せが挙げられる。これら添加剤は、通常の医薬品製造における添加剤であれば特に限定されず、より具体的な例としては、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、デキストリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース塩、ステアリン酸及びその塩、タルクなどの添加剤であり、これらの組合せが挙げられる。さらに、香辛料、甘味料などを添加してもよい。またさらに、必要に応じて他の薬剤や食品粉砕物、食品抽出物を添加してもよい。
【００４２】
本発明のベータNGF産生促進剤の投与剤形も特に限定されず、日本薬局方に従って適切な剤形に製造される。具体的には、カプセル剤、錠剤、粉剤、除放剤などの剤形に製造される。
【００４３】
本発明のベータNGF産生促進活性を有する飲食品は、上記した本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物を含有するものである。有効成分の含有量は１日あたりの摂取量が０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇになるようそれぞれの飲食品の形態に合わせて設定すればよく、さらには０．１〜１０ｍｇ／ｋｇが好ましく、０．５〜５ｍｇ／ｋｇが最も好ましい。
【００４４】
本発明のベータNGF産生促進活性を有する飲食品に混合され得る他の材料としては、一般に食品用材料として使用され得るものが挙げられる。例としては、米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、昆布などから得られる多糖類、大豆や乳製品、動物原料などから得られるタンパク質、グルコース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マンニトール、キシリトールや各種オリゴ糖などの糖類、ならびにこれらの組合せが挙げられる。さらに、香辛料、着色料、甘味料、酸味料、食用油、ビタミンや他の食品破砕物、食品抽出物などを添加してもよい。これら適切な材料及び添加剤は単独又は組合せて使用される。またさらに、必要に応じて水を添加して所望の形状に加工してもよい。
【００４５】
飲食品の具体例としては、菓子類（ガム、キャンディー、キャラメル、チョコレート、クッキー、スナック菓子、ゼリー、グミ、錠菓等）、麺類（そば、うどん、ラーメン等）、乳製品（ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト等）、調味料（味噌、醤油等）、スープ類、飲料（ジュース、コーヒー、紅茶、茶、炭酸飲料、スポーツ飲料等）をはじめとする一般食品や健康食品（錠剤、カプセル等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、インスタント食品に本発明の抽出物を添加してもよい。例えば、抽出物を粉末セルロースとともにスプレードライまたは凍結乾燥したものを、粉末、顆粒、打錠又は溶液にすることで容易に飲食品に含有させることができる。
【００４６】
本発明のベータNGF産生促進活性を有する飼料は、上記した本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物を含有するものであり、すべての家畜や家禽、愛玩動物に適用することが可能である。本発明の飼料を適用し得る家畜や家禽類としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ等の家畜、ニワトリ、七面鳥、カモ、ウズラ等の産業上飼育する動物のことである。また本発明を適用しうる愛玩動物とは犬、猫、ハムスターや小型の鳥類等の個人の趣味で飼育する動物や鳥類のことである。飼料組成物としてこれ単独で投与しても良く、さらには飼料 に直接添加しても良く、この使用形態は特に限定されない。飼料 に添加する場合、添加方法、添加時期等は特に限定されるものではない。
本発明の飼料に含まれる有効成分の含有量は、1日あたりの有効成分の給餌量として０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇになるようそれぞれの飼料の形態に合わせて設定すればよく、さらには０．１〜１０ｍｇ／ｋｇが好ましく、０．５〜５ｍｇ／ｋｇが最も好ましい。
【００４７】
本発明の飼料に混合され得る他の材料としては、例えばトウモロコシ、マイロ、大豆、大豆粕、小麦、大麦、米、燕麦、魚粉、脱脂粉乳、ビートパルプペレット、ふすまペレット、グレインスクリーニングペレット、アルファルファペレット、タピオカペレット、コーンコブミール、コットンハルペレット、甘藷チップ、ホミニフィード、ビール粕、ヘイキューブ、ミニキューブ、アルファルファ ベールドヘイ、スーダングラス、稲わら、ライグラスストロー、フェスキューストロー、バミューダストロー、チモシーヘイ、オーツヘイ、糖蜜、ルーピン、カノーラ、菜種粕、綿実、コーングルテンミール、コーングルテンフィード、ソイハルペレット、ホエイパウダー、ビール酵母、コレステロールなどのほか、薬学的に許容され得るビタミン類やミネラル類、飼料添加物、動物医薬品などが挙げられ、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
なお、ベータNGF産生促進活性の測定は以下のようにして行った。
〔ヒトグリオブラストーマによるベータNGFの産生〕
終濃度が10％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、110mg/mlピルビン酸ナトリウム、１％ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸溶液：インビトロジェン株式会社）を含むＥＭＥＭ培地に、12.5 x104細胞/mlの濃度になるよう調製したヒトグリオブラストーマ（神経膠芽腫）Ｔ９８Ｇ細胞懸濁液を、２４穴マルチプレートの各穴に接種し、３日間培養した。その後、5mg/mlのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むOpti-MEM培地に交換し、さらに４日間培養した。再度培地交換し、上記で調製した抽出物ＤＭＳＯ溶液を、各抽出物の固形分終濃度が200μg/mlになるよう添加し、4日間培養した。培養上清を回収し、ベータNGF量を測定した。
【００４９】
〔培養上清中のベータNGFの測定法〕
ベータNGFの測定はR&Dシステム社の「ベータNGF、Human, DuoSet Kit」を使用した。ポリスチレン製の９６穴マルチプレートに、Capture Antibodyとしてマウス抗ヒトベータNGF抗体溶液を各穴に１００μlづつ分注し、室温で一夜放置した。マイクロプレートに吸着されなかった抗体を除去後、Wash Buffer（0.05% Tween20を含むPBS）で各穴を３回洗浄した。各穴に300μｌのReagent Diluent（１％BSAを含むPBS）を加えて1時間以上、室温でブロッキングをし、Wash Buffer（0.05% Tween20を含むPBS）で各穴を３回洗浄した。標準溶液としてのヒト組み換えベータNGF溶液あるいは、上記の実験により得られた各培養上清１００μlを各穴に分注し、室温で２時間放置した後、標準溶液あるいは、培養上清を除去した。さらに各穴を３回づつ洗浄した。Detection Antibodyとしてヒツジ抗ヒトベータNGF抗体溶液を各穴に１００μlづつ分注し、室温で２時間放置した後、ホースラーディッシュ由来パーオキシダーゼを各穴に１００μｌづつ加えて遮光して室温で２０分間静置し、Wash Buffer（0.05% Tween20を含むPBS）で各穴を３回洗浄した。各穴にSubstrate Solution（過酸化水素とテトラメチルベンジジンの混合液）を１００μｌづつ加え室温で２０分間反応させた。Stop Solutionとして２Nの硫酸を５０μｌづつ加え、直ちに吸光度計にて450/540nmの吸光度を測定し、標準曲線よりベータNGF量を算出した。
【００５０】
実施例１
〔キノコ子実体抽出物の調製〕
ハラタケ目キシメジ科シメジ属に属するシャカシメジ、スッポンタケ目スッポンタケ科キヌガサタケ属に属するキヌガサタケ、ヒダナシタケ目イボタケ科コウタケ属に属するケロウジ、ヒダナシタケ目エゾハリタケ科エゾハリタケ属に属するブナハリタケ及びサンゴハリタケ科のヤマブシタケについて市販品を購入し、それらの子実体を８０℃で熱風乾燥し、回転刃付ブレンダーで破砕処理を行い、１ｍｍ以下の破砕物を得た。この破砕物１ｇに対してメタノール１０ｍｌを添加し、４℃にて２週間抽出処理を行った。また、シャカシメジについては、さらに水、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、ジエチルエーテルを用いて同様の抽出処理を行った。これらの各抽出物を遠心分離（3000rpm、10分間）して上清を回収し、上清を減圧下で乾燥させ、固形分を測定した。この乾燥物を再度、DMSO（ジメチルスルホキシド）に溶解し、ベータNGF産生促進活性を試験した。
【００５１】
〔シャカシメジ菌糸体抽出物の調製〕
シャカシメジの子実体から内部の組織を無菌的に切り出した。この組織をポテトデキストロース寒天培地に移し、２５℃で２０日間培養した。２０日後成長した菌糸体を寒天培地に継代培養した。この操作を二度繰り返し、得られた菌糸体をポテトデキストロース液体培地に移植し、４０日間、静地培養した。４０日後、培養液と菌糸体をろ紙を用いてろ別した。このようにして得られたシャカシメジ菌糸体を８０℃で熱風乾燥し、回転刃付ブレンダーで破砕処理を行い、1mm以下の破砕物を得た。この破砕物１ｇに対してメタノール１０ｍｌを添加し、上記子実体破砕物と同様に抽出してベータNGF産生促進活性を試験した。
【００５２】
〔アシタバ抽出物の調製〕
アシタバ葉を８０℃で熱風乾燥し、回転刃付ブレンダーで破砕処理を行い、1mm以下の破砕物を得た。この破砕物１ｇに対してメタノール１０ｍｌを添加し、前記子実体破砕物と同様に抽出してベータNGF産生促進活性を試験した。
【００５３】
結果を表１に示した。表１に示した結果から、シャカシメジ抽出物、特にシャカシメジ子実体メタノール抽出物のNGF産生促進作用が極めて高いことが分かる。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実施例２
上記実施例１で得たシャカシメジ子実体及びヤマブシタケ子実体、アシタバの各メタノール抽出物ＤＭＳＯ溶液を固形分終濃度が２５、５０、１００、２００、４００μg/mlとなるように加える以外は同様にして、ヒトグリオハイブリドーマＴ９８Ｇ細胞を用いてベータＮＧＦを培養上清中に産生させ、ベータNGF量を測定した。
結果を図１に示した。図１からシャカシメジ子実体のベータNGF産生促進作用が極めて高いことが分かる。
【００５６】
実施例３
下記の表２に記載した各キノコの子実体を入手し、メタノール抽出物を実施例１と同様の方法で作成し、同様の試験を行った。
【００５７】
結果、シメジ属に属するキノコから得られる子実体にはいずれも高いベータNGF産生促進活性が認められた。
【００５８】
【表２】
【００５９】
実施例４
採取地の異なるシャカシメジとホンシメジの子実体をそれぞれ5株購入し、実施例１と同様にメタノール抽出物を得て、ベータNGF産生促進作用を測定した。
【００６０】
結果、表３に示すように、採取地が異なることで各子実体メタノール抽出物におけるベータNGF産生促進作用に若干の変動があるものの、いずれも高いベータNGF産生促進作用が確認された。
【００６１】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】シャカシメジ子実体及びヤマブシタケ子実体、アシタバのメタノール抽出物のベータNGF産生促進作用の濃度依存性を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体から得られることを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する組成物。
【請求項２】
シメジ属に属するキノコが、ホンシメジ、シャカシメジ、カクミノシメジ及びハタケシメジから成る群から選ばれる1種以上であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体を平均粒径１ｍｍ以下に破砕して破砕物を得ることを特徴とする請求項１記載の神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法。
【請求項４】
シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体から溶媒を用いて抽出物を得ることを特徴とする請求項１記載の神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法。
【請求項５】
シメジ属に属するキノコが、ホンシメジ、シャカシメジ、カクミノシメジ及びハタケシメジから成る群から選ばれる1種以上であることを特徴とする請求項３又は４記載の組成物の製造方法。
【請求項６】
溶媒が、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、エーテル類及び二酸化炭素からなる群から選ばれる１種の溶媒又は２種以上を混合した溶媒である請求項４又は５記載の神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法。
【請求項７】
請求項１又は２記載の組成物を有効成分とすることを特徴とする神経成長因子産生促進剤。
【請求項８】
請求項１又は２記載の組成物を含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飲食品。
【請求項９】
請求項１又は２記載の組成物を含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飼料。
【請求項１】
シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体から得られることを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する組成物。
【請求項２】
シメジ属に属するキノコが、ホンシメジ、シャカシメジ、カクミノシメジ及びハタケシメジから成る群から選ばれる1種以上であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体を平均粒径１ｍｍ以下に破砕して破砕物を得ることを特徴とする請求項１記載の神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法。
【請求項４】
シメジ属に属するキノコの子実体又は菌糸体から溶媒を用いて抽出物を得ることを特徴とする請求項１記載の神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法。
【請求項５】
シメジ属に属するキノコが、ホンシメジ、シャカシメジ、カクミノシメジ及びハタケシメジから成る群から選ばれる1種以上であることを特徴とする請求項３又は４記載の組成物の製造方法。
【請求項６】
溶媒が、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトン、エーテル類及び二酸化炭素からなる群から選ばれる１種の溶媒又は２種以上を混合した溶媒である請求項４又は５記載の神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法。
【請求項７】
請求項１又は２記載の組成物を有効成分とすることを特徴とする神経成長因子産生促進剤。
【請求項８】
請求項１又は２記載の組成物を含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飲食品。
【請求項９】
請求項１又は２記載の組成物を含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飼料。
【図１】
【公開番号】特開２００７−１３７８７８（Ｐ２００７−１３７８７８Ａ）
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８６３０７（Ｐ２００６−２８６３０７）
【出願日】平成１８年１０月２０日（２００６．１０．２０）
【出願人】（０００００４５０３）ユニチカ株式会社 (1,214)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２０日（２００６．１０．２０）
【出願人】（０００００４５０３）ユニチカ株式会社 (1,214)
【Ｆターム（参考）】
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