神経突起伸長剤
【課題】本発明は、上記問題を解決するものであり、その目的とするところは、老年型痴呆症等の原因の一つとして考えられている神経変性疾患の予防および／または治療に利用し得る、神経突起伸長剤を提供することにある。
【解決手段】神経細胞に対して神経突起を伸長し得る、神経突起伸長剤が開示されている。本発明の神経突起伸長剤は、以下の式（Ｉ）：
【化１】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である）で表されるカフェ酸またはその誘導体を有効成分として含有する。
【解決手段】神経細胞に対して神経突起を伸長し得る、神経突起伸長剤が開示されている。本発明の神経突起伸長剤は、以下の式（Ｉ）：
【化１】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である）で表されるカフェ酸またはその誘導体を有効成分として含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞に対して神経突起伸長作用を有する神経突起伸長剤に関し、より詳細には、神経突起の伸長を促すことにより、アルツハイマー型痴呆症、脳虚血病態、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患の予防および／または治療に有用な神経突起伸長剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会への移行に伴って老年型痴呆症が増加する傾向にある。これは非常に大きな社会問題となってきている。老年型痴呆症の原因となる疾患は数多く知られている。これらは、脳器質性障害による痴呆、脳以外の臓器疾患に付随した痴呆およびストレスによる身体疾患に起因する痴呆に大別される。特に、その原因の大半を占める脳器質性障害による痴呆は、原因の違いにより脳血管性痴呆症およびアルツハイマー型痴呆症とに分類される。
【０００３】
現在、脳血管性痴呆症に対しては、脳血管拡張薬などがある程度の効果を示すことが知られている。しかし、一方でアルツハイマー型痴呆症に対しては、その発症原因が今なお不明であり、未だ発症を含めその進行を阻止するのに適切な薬物療法も治療法も知られていない。そのため、脳器質性障害による痴呆、特にアルツハイマー型痴呆症に対して有用な医薬品の開発が所望されている。
【０００４】
近年は、神経細胞から分泌される神経成長因子（以下、ＮＧＦと呼ぶことがある）などの神経栄養因子が神経変性疾患に対して優れた効果を示すことが見出され、注目を集めている。ＮＧＦは、神経組織の成長および機能維持にとって重要かつ必要な因子である。ＮＧＦは、末梢神経における知覚および交感神経、ならびに中枢神経における大細胞性コリン作動性ニューロンの成熟、分化および生命維持に不可欠であり、脳損傷時の神経細胞の変性を防ぐという作用を示す。更に、ＮＧＦは、パーキンソン病やハンチントン病などの神経変性疾患に対しても有効であることが示唆されている。これにより、生体内においてＮＧＦレベルを上昇させることは、アルツハイマー型痴呆症、脳血管性痴呆症、パーキンソン病、ハンチントン病のような中枢機能障害、脊髄損傷、末梢神経損傷、糖尿病性神経障害、ならびに筋萎縮変性側索硬化症のような抹消機能障害の治療にも有用であると考えられている。
【０００５】
しかし、ＮＧＦは、モノマーでは１３０００およびダイマーでは２６０００もの分子量を有するタンパク質であり、血管脳関門を通過することができない。そのため、例えば、中枢機能障害の治療を目的とした場合には、脳室内投与が必要となる。さらに、ＮＧＦの大量調製も困難である。このようにＮＧＦ自体の使用には多くの問題がある。結果として、一般に、ＮＧＦ自体を臨床で用いることは非常に困難である。
【０００６】
一方で、古川らはカテコールアミン（エピネフリン、ノルエピネフリン）をＮＧＦ合成促進剤として使用している（非特許文献１参照。）。また、特許文献１にはテアニンがＮＧＦ合成促進剤として働くことが開示されている。同様に、特許文献２にはエイコサンペンタエン酸（ＥＰＡ）またはドコサエキサエン酸（ＤＨＡ）がＮＧＦ合成促進剤として働くことが開示されている。しかし、例えば、エピネフリンおよびノルエピネフリンはホルモン物質であるため、投与によって生体内におけるホルモンの量的バランスを崩すという問題がある。
【０００７】
また、特許文献３には、薬用ニンジンのアルコール抽出物が神経細胞賦活作用を有していることを開示しているが、神経細胞賦活作用を奏する物質までは具体的に特定されていない。
【０００８】
さらに、特許文献４は、天然物のうち食品一般にも利用される植物由来の抽出物を用いた神経突起伸長剤を開示する。特許文献４に記載の植物由来の抽出物は、ミカン科植物由来のポリアルコキシフラボノイドである。上記植物由来の抽出物は、生体に対する安全性を高める観点からは注目される一方で、天然物であることから、一年を通じて原料となる植物の生産量・収穫量の確保等が必ずしも安定しない。そこで、このような生産安定性を高める点から、同等またはそれ以上の神経突起伸長作用を有する他の神経突起伸長剤のバリエーションの拡大が所望されている。
【０００９】
【特許文献１】特開平７−１７３０５９号公報
【特許文献２】特開平８−１４３４５４号公報
【特許文献３】特開平６−３１６２７号公報
【特許文献４】特開２００２−６０３４０号公報
【非特許文献１】古川（Ｙ．Ｆｕｒｕｋａｗａ）ら、フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソシエティー・レターズ（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ），１９８６年第，２０８巻，第２５８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記問題を解決するものであり、その目的とするところは、老年型痴呆症等の原因の一つとして考えられている神経変性疾患の予防および／または治療に利用し得る、神経突起伸長剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下の式（Ｉ）：
【００１２】
【化１】
【００１３】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、神経突起伸長剤である。
【００１４】
１つの実施形態では、上記式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体は、カフェ酸メチルエステル、カフェ酸プロピルエステル、カフェ酸オクチルエステル、カフェ酸ベンジルエステルおよびカフェ酸フェネチルエステルからなる群より選択される少なくとも１種のカフェ酸エステルである。
【００１５】
本発明はまた、上記神経突起伸長剤を含有する、医薬品組成物である。
【００１６】
本発明はまた、以下の式（Ｉ）：
【００１７】
【化２】
【００１８】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、神経突起を伸長させ得る食品である旨の表示を付した飲食物である。
【００１９】
本発明はまた、以下の式（Ｉ）：
【００２０】
【化３】
【００２１】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である、但しフェネチル基を除く）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を内容組成物に対し、０．１重量％以上の割合で含有してなる、飲食物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の神経突起伸長剤は、以下の式（Ｉ）：
【００２３】
【化４】
【００２４】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する。
【００２５】
本発明に用いられる上記式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体は、特に限定されないが、好ましくはカフェ酸エステルであり、さらに好ましくは、カフェ酸メチルエステル、カフェ酸プロピルエステル、カフェ酸オクチルエステル、カフェ酸ベンジルエステルまたはカフェ酸フェネチルエステルである。
【００２６】
本発明に用いられる上記カフェ酸またはその誘導体のうち、一部のものは、天然物から抽出、または化学合成できるものであり、あるいは市販されているものである。その残りのものは、化学合成したもの、または市販されているものである。
【００２７】
天然物から抽出したものを用いる場合、例えば、カフェ酸フェネチルエステルは、プロポリスから当業者が通常用いる手段によって抽出し用いることができる。また、上記天然物由来の抽出物は必要に応じては当業者が通常用いる手段（例えば、カラムクロマトグラフィー）で精製して用いてもよい。
【００２８】
また、カフェ酸エステルを化学合成によって製造する場合、出発原料としてカフェ酸を使用し、所定のアルコールと化学反応させることによって、所定のカフェ酸エステルを容易に製造することができる。このような化学合成法自体も当業者に公知であり、例えば、ダ．クーニャ．エフ．エム（ｄａ Ｃｕｎｈａ ＦＭ）ら、フリー・ラジカル・リサーチ（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅｒａｒｃｈ），２００４年，第３８巻，第１１号，ｐ．１２４１−１２５３に記載の方法に準じて製造することができる。
【００２９】
本発明の神経突起伸長剤の含有量は、上記式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体を有効成分として含有する限り、特に限定されないが、神経突起伸長剤の重量を基準として、好ましくは０．００００１重量％〜５０重量％、さらに好ましくは０．０００１重量％〜３０重量％である。
【００３０】
また、本発明の神経突起伸長剤は、ローズマリーおよび／またはセージ由来の抽出物をさらに含有し得る。
【００３１】
上記植物由来の抽出物は、当業者が通常用いる手段で得ることができる。例えば上記植物の所定部位を、水、極性または非極性の溶媒、あるいはこれらの混合物を抽出溶媒として用い適切な条件で抽出して得ることができる。得られた上記植物由来の抽出物は、そのまま用いられてもよい。また、上記植物由来の抽出物は、必要に応じて水分を蒸発させた乾固物またはペースト状物の形態で用いられてもよい。また、上記植物由来の抽出物は必要に応じては当業者が通常用いる手段（例えば、カラムクロマトグラフィー）で精製して用いてもよい。
【００３２】
さらに、本発明の神経突起伸長剤に、式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体、および上記植物由来の抽出物を含有する場合、その混合比は、特に限定されないが、式（Ｉ）の化合物と上記植物由来の抽出物との重量比が、好ましくは１：９から９：１、より好ましくは３：７から７：３、さらにより好ましくは４：６から６：４である。
【００３３】
あるいは、本発明の神経突起伸長剤は、以下の式（ＩＩ）；
【００３４】
【化５】
【００３５】
で表されるカルノシン酸をさらに含有し得る。
【００３６】
上記式（ＩＩ）で表される化合物としては、市販されているもの、化学合成したもの、または種々の天然物から抽出したものが挙げられる。上記式（ＩＩ）で表される化合物は、特に限定されないが、好ましくはローズマリーおよび／またはセージ由来の抽出物に含有し得る形態で用いる。
【００３７】
また、本発明の神経突起伸長剤に、式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体、および上記カルノシン酸を含有する場合、その混合比は、特に限定はされないが、式（Ｉ）の化合物と上記植物由来の抽出物との重量比が、好ましくは１：９から９：１、より好ましくは３：７から７：３、さらにより好ましくは４：６から６：４である。
【００３８】
本発明の神経突起伸長剤において、上記植物由来の抽出物、およびカルノシン酸以外に添加剤が含有されてもよい。このような含有されてもよい添加剤としては、後述する用途および／またはその形態によって必ずしも限定されないが、例えば、水；アルコール；食肉加工品；米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、コンブ、ワカメ、テングサなどの一般食品材料およびそれらの粉末；デンプン、水飴、乳糖、グルコース、果糖、スクロース、マンニトールなどの糖類；香辛料、甘味料、食用油、ビタミン類などの一般的な食品添加物；界面活性剤；賦形剤；着色料；保存剤；コーティング助剤；ラクトース；デキストリン；コーンスターチ；ソルビトール；結晶セルロース；ポリビニルピロリドン；油分；保湿剤；増粘剤；防腐剤；香料；ならびにこれらの組合わせが挙げられる。本発明の神経突起伸長剤はさらに必要に応じて他の薬剤（漢方を包含する）を含有していてもよい。このような他の成分および／または他の薬剤の含有量は特に限定されず、当業者によって適切な量が選択され得る。
【００３９】
本発明の神経突起伸長剤は、非経口組成物または経口組成物のいずれかの形態で用いられていてもよく、例えば、医薬品、医薬部外品などの医薬組成物として、そのままあるいは他の医薬品と組合わせて用いられてもよく；家畜または養殖魚などの生産分野に利用される飼料組成物として、そのままあるいは他の資料用材料と組合わせて用いられてもよく；もしくは化粧品などの化粧組成物として、そのままあるいは他の化粧品材料と組合わせて用いられてもよい。
【００４０】
例えば、本発明の神経突起伸長剤が医薬品組成物として用いられる場合、その投与剤形は特に限定されず、日本薬局方に記載の方法にしたがって適切な剤形に加工される。投与剤形のより具体的な例としては、経口投与を目的とする医薬品組成物の場合、カプセル剤、錠剤、粉剤、顆粒剤、細粒剤、除放剤などの剤形が挙げられ、そして非経口投与を目的とする医薬品組成物の場合、静脈注射、皮下注射などの筋肉注射を目的とした注射剤、輸液剤、軟膏等の塗布剤、直腸投与のための坐剤などの剤形が挙げられる。用量は、対象となる者の体重等の条件によって容易に変動し得るため、当業者によって適宜選択され得る。
【００４１】
この医薬品組成物は、当業者に周知の方法によってその形態に加工され得、第３成分として、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油などの希釈剤が混合されていてもよい。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤などが混合されていてもよい。
【００４２】
また、別の例として、本発明の神経突起伸長剤が、食品組成物として用いられる場合、その形態は固形食品に限定されず、飲料（例えば、液体飲料）のようなものを包含される。より具体的な例としては液状、ペースト状、固形状等の形態でなる、茶飲料、コーヒー飲料、清涼飲料、乳飲料、菓子類、シロップ類、果実加工品、野菜加工品、漬物類、蓄肉製品、魚肉製品、珍味類、缶・ビン詰類、即席飲食物、内服役、肝油ドロップ、口中清涼剤、ゼリーなどが挙げられるが特にこれらに限定されない。上記のような食品組成物は、当業者に公知な手法を用いて製造することができる。
【００４３】
また、式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体が、食品組成物として用いられる場合、その形態は、本発明の神経突起伸長剤が、食品組成物として用いられる場合と同様の形態である。上記化合物が食品組成物に含有される場合、その含有量の下限は、食品組成物の重量を基準として、好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．５重量％以上、さらに好ましくは１重量％以上である。含有量の上限は、好ましくは１００重量％以下、より好ましくは５０重量％以下、さらに好ましくは１０重量％以下である。
【００４４】
本発明の神経突起伸長剤、または上記化合物を含有する食品組成物は、必要に応じて上記のような食品添加剤として許容され得る添加剤とともに、例えば、神経突起を伸長し得る食品である旨の表示を付した飲食物として用いることができる。このような機能の表示を付した飲食品の例としては、特定保健用食品が挙げられる。なお、上記機能の表示は、神経突起を伸長させ得る食品である旨の表示のみに限定されない。このような表示に付されるべき他の機能の例としては、老年型痴呆症が気になる方の食品である旨；神経疾患でお困りの方の食品である旨；などが挙げられる。表示は、使用者にとって上記のような機能が実質的に理解され得る様式で表されておればよく、例えば、当該食品の外装または内装パッケージ、商品カタログ、ポスターなどに対して行われ得る。
【００４５】
さらに別の例として、本発明の神経突起伸長剤が化粧料組成物として用いられる場合、その形態としては、ローション、乳液、クリーム、パウダーなどが挙げられるが、特にこれらに限定はされない。本発明の神経突起伸長剤を含有するこのような化粧料組成物は、当業者に公知の手法を用いて製造され得る。
【００４６】
本発明の神経突起伸長剤は、その使用形態に応じて当該分野で通常用いる方法によって製造され、その形態に応じた方法で適宜に適量摂取また適用することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明は実施例によって具体的に記述する。しかし、これによって本発明は制限されるものではい。
【００４８】
＜参考例１＞
３．６ｇのカフェ酸（シグマ社製）と５．２４ｇのトリフェニルフォスフィン（和光純薬製）、および０．６４ｇのメタノール（和光純薬製）を所定のテトラヒドロフラン（和光純薬製）に溶解した。次いで、容器内を窒素置換し、氷浴中で上記溶液に２０ｍｍｏｌのアゾジカルボン酸（東京化成製）を加え、室温にて４時間攪拌した。攪拌終了後、上記溶液を濃縮し、シリカゲルカラム（溶離液；ジクロロメタン：イソプロパノール＝９６：４）により分離精製し、精製物（４７５ｍｇ）を得た。次いで、ＮＭＲで測定し、得られた精製物が、カフェ酸メチルエステルであることを確認した。確認後、カフェ酸メチルエステルを被検物質Ａとした。
【００４９】
＜参考例２＞
３．６ｇのカフェ酸（シグマ社製）と５．２４ｇのトリフェニルフォスフィン（和光純薬製）、および１．２ｇのｎ−プロパノール（和光純薬製）を所定のテトラヒドロフラン（和光純薬製）に溶解した。次いで、容器内を窒素置換し、氷浴中で上記溶液に２０ｍｍｏｌのアゾジカルボン酸（東京化成製）を加え、室温にて４時間攪拌した。攪拌終了後、上記溶液を濃縮し、シリカゲルカラム（溶離液：ジクロロメタン／イソプロパノール＝９６／４）により分離精製し、精製物（１３０ｍｇ）を得た。ＮＭＲで測定し、得られた精製物が、カフェ酸プロピルエステルであることを確認した。確認後、カフェ酸プロピルエステルを被検物質Ｂとした。
【００５０】
＜参考例３＞
３．６ｇのカフェ酸（シグマ社製）と５．２４ｇのトリフェニルフォスフィン（和光純薬製）、および２．６ｇのｎ−オクタノール（和光純薬製）を所定のテトラヒドロフラン（和光純薬製）に溶解した。次いで、容器内を窒素置換し、氷浴中で上記溶液に２０ｍｍｏｌのアゾジカルボン酸（東京化成製）を加え、室温にて４時間攪拌した。攪拌終了後、上記溶液を濃縮し、シリカゲルカラム（溶離液：ジクロロメタン／イソプロパノール＝９６／４）により分離精製し、精製物（５６５ｍｇ）を得た。次いで、ＮＭＲで測定し、得られた精製物が、カフェ酸オクチルエステルであることを確認した。確認後、カフェ酸オクチルエステルを被検物質Ｃとした。
【００５１】
＜参考例４＞
３．６ｇのカフェ酸（シグマ社製）と５．２４ｇのトリフェニルフォスフィン（和光純薬製）、および２．２ｇのベンジルアルコール（和光純薬製）を所定のテトラヒドロフラン（和光純薬製）に溶解した。次いで、容器内を窒素置換し、氷浴中で上記溶液に２０ｍｍｏｌのアゾジカルボン酸（東京化成製）を加え、室温にて４時間攪拌した。攪拌終了後、上記溶液を濃縮し、シリカゲルカラム（溶離液：ジクロロメタン／イソプロパノール＝９６／４）により分離精製し、精製物（４１２ｍｇ）を得た。次いで、ＮＭＲで測定し、得られた精製物が、カフェ酸ベンジルエステルであることを確認した。確認後、カフェ酸ベンジルエステルを被検物質Ｄとした。
【００５２】
＜実施例１＞
ＮＧＦに応答して神経突起を伸長することが知られているラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を、コラーゲンコーティングされた２４ウェル培養プレート（ＩＷＡＫＩ社製）にて牛胎児血清１％、ウマ血清１％の割合で含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製、以後分化培地と省略する）に１０５細胞／穴になるように播種し、３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００５３】
次いで、参考例１で得られた被検物質Ａ（カフェ酸メチルエステル）が分化培地に対して１０μＭの濃度になるように含有する分化培地を調製した。次いで、調製した分化培地を上記で予め培養した細胞に添加し、３７℃にて５％のＣＯ２条件下で２日間培養を行った。培養後、細胞を倒立顕微鏡（ＴＥ２０００Ｅ、ＮＩＫＯＮ社製）にて２００倍の倍率で顕微鏡観察し、次いで、細胞の写真撮影を行った。次いで、ジャグジート．エス．ギル（Ｊａｇｊｉｔ Ｓ．Ｇｉｌｌ）ら、モレキュラー・ブレイン・リサーチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅｒａｒｃｈ），１９９８年，第５７巻，ｐ．１２３−１３１に記載の方法に準じて、神経突起が伸長している細胞数を目視によりカウントした。次いで、所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率（小数点以下四捨五入）を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した。結果を表１に示す。また、被検物質Ａ（カフェ酸メチルエステル）を含有した分化培地を添加した細胞の写真を図１に示す。
【００５４】
＜実施例２＞
上記実施例１と同様の条件にて、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００５５】
次いで、参考例２で得られた被検物質Ｂ（カフェ酸プロピルエステル）が分化培地に対して１０μＭの濃度になるように含有する分化培地を調製した。次いで、上記で調製した分化培地を上記実施例１と同様の条件で培養し、次いで、上記と同様に所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した（小数点以下四捨五入）。結果を表１に示す。また、被検物質Ｂ（カフェ酸プロピルエステル）を含有した分化培地を添加した細胞の写真を図２に示す。
【００５６】
＜実施例３＞
上記実施例１と同様の条件にて、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００５７】
次いで、参考例３で得られた被検物質Ｃ（カフェ酸オクチルエステル）が分化培地に対して１０μＭの濃度になるように含有する分化培地を調製した。次いで、上記で調製した分化培地を上記実施例１と同様の条件で培養し、次いで、上記と同様に所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した（小数点以下四捨五入）。結果を表１に示す。また、被検物質Ｃ（カフェ酸オクチルエステル）を含有した分化培地を添加した細胞の写真を図３に示す。
【００５８】
＜実施例４＞
上記実施例１と同様の条件にて、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００５９】
次いで、参考例４で得られた被検物質Ｄ（カフェ酸ベンジルエステル）が分化培地に対して１０μＭの濃度になるように含有する分化培地を調製した。次いで、上記で調製した分化培地を上記実施例１と同様の条件で培養し、次いで、上記と同様に所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した（小数点以下四捨五入）。結果を表１に示す。また、被検物質Ｄ（カフェ酸ベンジルエステル）を含有した分化培地を添加した細胞の写真を図４に示す。
【００６０】
＜実施例５＞
上記実施例１と同様の条件にて、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００６１】
次いで、カフェ酸フェネチルエステル（シグマ社製）を被検物質Ｅとして、分化培地に対して１０μＭの濃度になるように含有する分化培地を調製した。次いで、上記で調製した分化培地を上記実施例１と同様の条件で培養し、次いで、上記と同様に所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した（小数点以下四捨五入）。結果を表１に示す。また、被検物質Ｅ（カフェ酸フェネチルエステル）を含有した分化培地を添加した細胞の写真を図５に示す。
【００６２】
＜比較例１＞
上記実施例１と同様の条件にて、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００６３】
次いで、被検物質無添加の分化培地を調製した。次いで、上記で調製した分化培地を上記実施例１と同様の条件で培養し、次いで、上記と同様に所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した（小数点以下四捨五入）。この結果をコントロールとした。結果を表１に示す。また、被検物質無添加の分化培地を添加した細胞の写真を図６に示す。
【００６４】
＜比較例２＞
上記実施例１と同様の条件にて、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００６５】
次いで、分化培地に対して１０ｎｇ／ｍｌの濃度になるようにＮＧＦを含有する分化培地を調製した。次いで、上記で調製したそれぞれの分化培地を上記実施例１と同様の条件で培養し、次いで、上記と同様に所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率（小数点以下四捨五入）を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した。この結果を陽性対照とした。結果を表１に示す。また、ＮＧＦを含有した分化培地を添加した細胞の写真を図７に示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
表１に示されるように、実施例１（被検物質Ａ）、実施例２（被検物質Ｂ）、実施例３（被検物質Ｃ）、実施例４（被検物質Ｄ）、および実施例５（被検物質Ｅ）の神経突起の伸長した細胞の割合（％）は、比較例1（被検物質無添加）に比べて高い値であった。また、図１〜５に示されるように、比較例1（被検物質無添加）の神経突起がほとんど伸長していないの対して、実施例１（被検物質Ａ）、実施例２（被検物質Ｂ）、実施例３（被検物質Ｃ）、実施例４（被検物質Ｄ）、および実施例５（被検物質Ｅ）の神経突起が伸長していることが確認できる。このことから、上記カフェ酸またはその誘導体が細胞での神経突起の伸長作用を有することが分かる。よって、カフェ酸またはその誘導体が神経突起伸長剤として有用であることが分かる。
【００６８】
＜実施例６：食品の製造＞
参考例１で得たカフェ酸メチルエステルを用いて、以下の組成を有する食品を調製する。
【００６９】
成分 重量（ｇ）
カフェ酸メチルエステル １．０
大豆サポニン ３．０
黒酢エキス ２．０
リンゴファイバー ２．０
レシチン １．０
フラクトオリゴ糖 ２．０
果糖 １．０
粉末酢 ０．１
シクロデキストリン １．０
蜂蜜 １．０
骨粉 １．０
デキストリン ４．９
【００７０】
各成分を混合した後、水を噴霧して造粒を行い、入風温度８０℃で乾燥して、顆粒状食品を得る。
【００７１】
＜実施例７：硬ゼラチンカプセルの製造＞
参考例２で得たカフェ酸プロピルエステルを用いて、以下の組成を有する硬ゼラチンカプセルを調製する。
【００７２】
成分 重量（ｍｇ／カプセル）
カフェ酸プロピルエステル ２０
デンプン １００
セルロース １００
【００７３】
各成分を混合し均一に混合した後、ゼラチンカプセルに封入し、硬ゼラチンカプセルを得る。
【００７４】
＜実施例８：錠剤の製造＞
参考例３で得たカフェ酸オクチルエステルを用いて、以下の組成を有する錠剤を調製する。
【００７５】
成分 重量（ｍｇ／錠剤）
カフェ酸オクチルエステル ２５０
セルロース ４００
二酸化ケイ素 １０
ステアリン酸 ５
【００７６】
各成分を混合し均一に混合した後、打錠し、錠剤を得る。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、神経細胞の神経突起を伸長し得る神経突起伸長剤を提供する。本発明の神経突起伸長剤は、医薬品、医薬部外品または食品組成物等として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】実施例１で得られた、カフェ酸メチルエステルを含有した分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図２】実施例２で得られた、カフェ酸プロピルエステルを含有した分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図３】実施例３で得られた、カフェ酸オクチルエステルを含有した分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図４】実施例４で得られた、カフェ酸ベンジルエステルを含有した分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図５】実施例５で得られた、カフェ酸フェネチルエステルを含有した分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図６】比較例１で得られた、被検物質無添加培地の分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図７】比較例２で得られた、ＮＧＦを含有した分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞に対して神経突起伸長作用を有する神経突起伸長剤に関し、より詳細には、神経突起の伸長を促すことにより、アルツハイマー型痴呆症、脳虚血病態、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患の予防および／または治療に有用な神経突起伸長剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会への移行に伴って老年型痴呆症が増加する傾向にある。これは非常に大きな社会問題となってきている。老年型痴呆症の原因となる疾患は数多く知られている。これらは、脳器質性障害による痴呆、脳以外の臓器疾患に付随した痴呆およびストレスによる身体疾患に起因する痴呆に大別される。特に、その原因の大半を占める脳器質性障害による痴呆は、原因の違いにより脳血管性痴呆症およびアルツハイマー型痴呆症とに分類される。
【０００３】
現在、脳血管性痴呆症に対しては、脳血管拡張薬などがある程度の効果を示すことが知られている。しかし、一方でアルツハイマー型痴呆症に対しては、その発症原因が今なお不明であり、未だ発症を含めその進行を阻止するのに適切な薬物療法も治療法も知られていない。そのため、脳器質性障害による痴呆、特にアルツハイマー型痴呆症に対して有用な医薬品の開発が所望されている。
【０００４】
近年は、神経細胞から分泌される神経成長因子（以下、ＮＧＦと呼ぶことがある）などの神経栄養因子が神経変性疾患に対して優れた効果を示すことが見出され、注目を集めている。ＮＧＦは、神経組織の成長および機能維持にとって重要かつ必要な因子である。ＮＧＦは、末梢神経における知覚および交感神経、ならびに中枢神経における大細胞性コリン作動性ニューロンの成熟、分化および生命維持に不可欠であり、脳損傷時の神経細胞の変性を防ぐという作用を示す。更に、ＮＧＦは、パーキンソン病やハンチントン病などの神経変性疾患に対しても有効であることが示唆されている。これにより、生体内においてＮＧＦレベルを上昇させることは、アルツハイマー型痴呆症、脳血管性痴呆症、パーキンソン病、ハンチントン病のような中枢機能障害、脊髄損傷、末梢神経損傷、糖尿病性神経障害、ならびに筋萎縮変性側索硬化症のような抹消機能障害の治療にも有用であると考えられている。
【０００５】
しかし、ＮＧＦは、モノマーでは１３０００およびダイマーでは２６０００もの分子量を有するタンパク質であり、血管脳関門を通過することができない。そのため、例えば、中枢機能障害の治療を目的とした場合には、脳室内投与が必要となる。さらに、ＮＧＦの大量調製も困難である。このようにＮＧＦ自体の使用には多くの問題がある。結果として、一般に、ＮＧＦ自体を臨床で用いることは非常に困難である。
【０００６】
一方で、古川らはカテコールアミン（エピネフリン、ノルエピネフリン）をＮＧＦ合成促進剤として使用している（非特許文献１参照。）。また、特許文献１にはテアニンがＮＧＦ合成促進剤として働くことが開示されている。同様に、特許文献２にはエイコサンペンタエン酸（ＥＰＡ）またはドコサエキサエン酸（ＤＨＡ）がＮＧＦ合成促進剤として働くことが開示されている。しかし、例えば、エピネフリンおよびノルエピネフリンはホルモン物質であるため、投与によって生体内におけるホルモンの量的バランスを崩すという問題がある。
【０００７】
また、特許文献３には、薬用ニンジンのアルコール抽出物が神経細胞賦活作用を有していることを開示しているが、神経細胞賦活作用を奏する物質までは具体的に特定されていない。
【０００８】
さらに、特許文献４は、天然物のうち食品一般にも利用される植物由来の抽出物を用いた神経突起伸長剤を開示する。特許文献４に記載の植物由来の抽出物は、ミカン科植物由来のポリアルコキシフラボノイドである。上記植物由来の抽出物は、生体に対する安全性を高める観点からは注目される一方で、天然物であることから、一年を通じて原料となる植物の生産量・収穫量の確保等が必ずしも安定しない。そこで、このような生産安定性を高める点から、同等またはそれ以上の神経突起伸長作用を有する他の神経突起伸長剤のバリエーションの拡大が所望されている。
【０００９】
【特許文献１】特開平７−１７３０５９号公報
【特許文献２】特開平８−１４３４５４号公報
【特許文献３】特開平６−３１６２７号公報
【特許文献４】特開２００２−６０３４０号公報
【非特許文献１】古川（Ｙ．Ｆｕｒｕｋａｗａ）ら、フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソシエティー・レターズ（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ），１９８６年第，２０８巻，第２５８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記問題を解決するものであり、その目的とするところは、老年型痴呆症等の原因の一つとして考えられている神経変性疾患の予防および／または治療に利用し得る、神経突起伸長剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下の式（Ｉ）：
【００１２】
【化１】
【００１３】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、神経突起伸長剤である。
【００１４】
１つの実施形態では、上記式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体は、カフェ酸メチルエステル、カフェ酸プロピルエステル、カフェ酸オクチルエステル、カフェ酸ベンジルエステルおよびカフェ酸フェネチルエステルからなる群より選択される少なくとも１種のカフェ酸エステルである。
【００１５】
本発明はまた、上記神経突起伸長剤を含有する、医薬品組成物である。
【００１６】
本発明はまた、以下の式（Ｉ）：
【００１７】
【化２】
【００１８】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、神経突起を伸長させ得る食品である旨の表示を付した飲食物である。
【００１９】
本発明はまた、以下の式（Ｉ）：
【００２０】
【化３】
【００２１】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である、但しフェネチル基を除く）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を内容組成物に対し、０．１重量％以上の割合で含有してなる、飲食物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の神経突起伸長剤は、以下の式（Ｉ）：
【００２３】
【化４】
【００２４】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する。
【００２５】
本発明に用いられる上記式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体は、特に限定されないが、好ましくはカフェ酸エステルであり、さらに好ましくは、カフェ酸メチルエステル、カフェ酸プロピルエステル、カフェ酸オクチルエステル、カフェ酸ベンジルエステルまたはカフェ酸フェネチルエステルである。
【００２６】
本発明に用いられる上記カフェ酸またはその誘導体のうち、一部のものは、天然物から抽出、または化学合成できるものであり、あるいは市販されているものである。その残りのものは、化学合成したもの、または市販されているものである。
【００２７】
天然物から抽出したものを用いる場合、例えば、カフェ酸フェネチルエステルは、プロポリスから当業者が通常用いる手段によって抽出し用いることができる。また、上記天然物由来の抽出物は必要に応じては当業者が通常用いる手段（例えば、カラムクロマトグラフィー）で精製して用いてもよい。
【００２８】
また、カフェ酸エステルを化学合成によって製造する場合、出発原料としてカフェ酸を使用し、所定のアルコールと化学反応させることによって、所定のカフェ酸エステルを容易に製造することができる。このような化学合成法自体も当業者に公知であり、例えば、ダ．クーニャ．エフ．エム（ｄａ Ｃｕｎｈａ ＦＭ）ら、フリー・ラジカル・リサーチ（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅｒａｒｃｈ），２００４年，第３８巻，第１１号，ｐ．１２４１−１２５３に記載の方法に準じて製造することができる。
【００２９】
本発明の神経突起伸長剤の含有量は、上記式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体を有効成分として含有する限り、特に限定されないが、神経突起伸長剤の重量を基準として、好ましくは０．００００１重量％〜５０重量％、さらに好ましくは０．０００１重量％〜３０重量％である。
【００３０】
また、本発明の神経突起伸長剤は、ローズマリーおよび／またはセージ由来の抽出物をさらに含有し得る。
【００３１】
上記植物由来の抽出物は、当業者が通常用いる手段で得ることができる。例えば上記植物の所定部位を、水、極性または非極性の溶媒、あるいはこれらの混合物を抽出溶媒として用い適切な条件で抽出して得ることができる。得られた上記植物由来の抽出物は、そのまま用いられてもよい。また、上記植物由来の抽出物は、必要に応じて水分を蒸発させた乾固物またはペースト状物の形態で用いられてもよい。また、上記植物由来の抽出物は必要に応じては当業者が通常用いる手段（例えば、カラムクロマトグラフィー）で精製して用いてもよい。
【００３２】
さらに、本発明の神経突起伸長剤に、式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体、および上記植物由来の抽出物を含有する場合、その混合比は、特に限定されないが、式（Ｉ）の化合物と上記植物由来の抽出物との重量比が、好ましくは１：９から９：１、より好ましくは３：７から７：３、さらにより好ましくは４：６から６：４である。
【００３３】
あるいは、本発明の神経突起伸長剤は、以下の式（ＩＩ）；
【００３４】
【化５】
【００３５】
で表されるカルノシン酸をさらに含有し得る。
【００３６】
上記式（ＩＩ）で表される化合物としては、市販されているもの、化学合成したもの、または種々の天然物から抽出したものが挙げられる。上記式（ＩＩ）で表される化合物は、特に限定されないが、好ましくはローズマリーおよび／またはセージ由来の抽出物に含有し得る形態で用いる。
【００３７】
また、本発明の神経突起伸長剤に、式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体、および上記カルノシン酸を含有する場合、その混合比は、特に限定はされないが、式（Ｉ）の化合物と上記植物由来の抽出物との重量比が、好ましくは１：９から９：１、より好ましくは３：７から７：３、さらにより好ましくは４：６から６：４である。
【００３８】
本発明の神経突起伸長剤において、上記植物由来の抽出物、およびカルノシン酸以外に添加剤が含有されてもよい。このような含有されてもよい添加剤としては、後述する用途および／またはその形態によって必ずしも限定されないが、例えば、水；アルコール；食肉加工品；米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、コンブ、ワカメ、テングサなどの一般食品材料およびそれらの粉末；デンプン、水飴、乳糖、グルコース、果糖、スクロース、マンニトールなどの糖類；香辛料、甘味料、食用油、ビタミン類などの一般的な食品添加物；界面活性剤；賦形剤；着色料；保存剤；コーティング助剤；ラクトース；デキストリン；コーンスターチ；ソルビトール；結晶セルロース；ポリビニルピロリドン；油分；保湿剤；増粘剤；防腐剤；香料；ならびにこれらの組合わせが挙げられる。本発明の神経突起伸長剤はさらに必要に応じて他の薬剤（漢方を包含する）を含有していてもよい。このような他の成分および／または他の薬剤の含有量は特に限定されず、当業者によって適切な量が選択され得る。
【００３９】
本発明の神経突起伸長剤は、非経口組成物または経口組成物のいずれかの形態で用いられていてもよく、例えば、医薬品、医薬部外品などの医薬組成物として、そのままあるいは他の医薬品と組合わせて用いられてもよく；家畜または養殖魚などの生産分野に利用される飼料組成物として、そのままあるいは他の資料用材料と組合わせて用いられてもよく；もしくは化粧品などの化粧組成物として、そのままあるいは他の化粧品材料と組合わせて用いられてもよい。
【００４０】
例えば、本発明の神経突起伸長剤が医薬品組成物として用いられる場合、その投与剤形は特に限定されず、日本薬局方に記載の方法にしたがって適切な剤形に加工される。投与剤形のより具体的な例としては、経口投与を目的とする医薬品組成物の場合、カプセル剤、錠剤、粉剤、顆粒剤、細粒剤、除放剤などの剤形が挙げられ、そして非経口投与を目的とする医薬品組成物の場合、静脈注射、皮下注射などの筋肉注射を目的とした注射剤、輸液剤、軟膏等の塗布剤、直腸投与のための坐剤などの剤形が挙げられる。用量は、対象となる者の体重等の条件によって容易に変動し得るため、当業者によって適宜選択され得る。
【００４１】
この医薬品組成物は、当業者に周知の方法によってその形態に加工され得、第３成分として、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油などの希釈剤が混合されていてもよい。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤などが混合されていてもよい。
【００４２】
また、別の例として、本発明の神経突起伸長剤が、食品組成物として用いられる場合、その形態は固形食品に限定されず、飲料（例えば、液体飲料）のようなものを包含される。より具体的な例としては液状、ペースト状、固形状等の形態でなる、茶飲料、コーヒー飲料、清涼飲料、乳飲料、菓子類、シロップ類、果実加工品、野菜加工品、漬物類、蓄肉製品、魚肉製品、珍味類、缶・ビン詰類、即席飲食物、内服役、肝油ドロップ、口中清涼剤、ゼリーなどが挙げられるが特にこれらに限定されない。上記のような食品組成物は、当業者に公知な手法を用いて製造することができる。
【００４３】
また、式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体が、食品組成物として用いられる場合、その形態は、本発明の神経突起伸長剤が、食品組成物として用いられる場合と同様の形態である。上記化合物が食品組成物に含有される場合、その含有量の下限は、食品組成物の重量を基準として、好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．５重量％以上、さらに好ましくは１重量％以上である。含有量の上限は、好ましくは１００重量％以下、より好ましくは５０重量％以下、さらに好ましくは１０重量％以下である。
【００４４】
本発明の神経突起伸長剤、または上記化合物を含有する食品組成物は、必要に応じて上記のような食品添加剤として許容され得る添加剤とともに、例えば、神経突起を伸長し得る食品である旨の表示を付した飲食物として用いることができる。このような機能の表示を付した飲食品の例としては、特定保健用食品が挙げられる。なお、上記機能の表示は、神経突起を伸長させ得る食品である旨の表示のみに限定されない。このような表示に付されるべき他の機能の例としては、老年型痴呆症が気になる方の食品である旨；神経疾患でお困りの方の食品である旨；などが挙げられる。表示は、使用者にとって上記のような機能が実質的に理解され得る様式で表されておればよく、例えば、当該食品の外装または内装パッケージ、商品カタログ、ポスターなどに対して行われ得る。
【００４５】
さらに別の例として、本発明の神経突起伸長剤が化粧料組成物として用いられる場合、その形態としては、ローション、乳液、クリーム、パウダーなどが挙げられるが、特にこれらに限定はされない。本発明の神経突起伸長剤を含有するこのような化粧料組成物は、当業者に公知の手法を用いて製造され得る。
【００４６】
本発明の神経突起伸長剤は、その使用形態に応じて当該分野で通常用いる方法によって製造され、その形態に応じた方法で適宜に適量摂取また適用することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明は実施例によって具体的に記述する。しかし、これによって本発明は制限されるものではい。
【００４８】
＜参考例１＞
３．６ｇのカフェ酸（シグマ社製）と５．２４ｇのトリフェニルフォスフィン（和光純薬製）、および０．６４ｇのメタノール（和光純薬製）を所定のテトラヒドロフラン（和光純薬製）に溶解した。次いで、容器内を窒素置換し、氷浴中で上記溶液に２０ｍｍｏｌのアゾジカルボン酸（東京化成製）を加え、室温にて４時間攪拌した。攪拌終了後、上記溶液を濃縮し、シリカゲルカラム（溶離液；ジクロロメタン：イソプロパノール＝９６：４）により分離精製し、精製物（４７５ｍｇ）を得た。次いで、ＮＭＲで測定し、得られた精製物が、カフェ酸メチルエステルであることを確認した。確認後、カフェ酸メチルエステルを被検物質Ａとした。
【００４９】
＜参考例２＞
３．６ｇのカフェ酸（シグマ社製）と５．２４ｇのトリフェニルフォスフィン（和光純薬製）、および１．２ｇのｎ−プロパノール（和光純薬製）を所定のテトラヒドロフラン（和光純薬製）に溶解した。次いで、容器内を窒素置換し、氷浴中で上記溶液に２０ｍｍｏｌのアゾジカルボン酸（東京化成製）を加え、室温にて４時間攪拌した。攪拌終了後、上記溶液を濃縮し、シリカゲルカラム（溶離液：ジクロロメタン／イソプロパノール＝９６／４）により分離精製し、精製物（１３０ｍｇ）を得た。ＮＭＲで測定し、得られた精製物が、カフェ酸プロピルエステルであることを確認した。確認後、カフェ酸プロピルエステルを被検物質Ｂとした。
【００５０】
＜参考例３＞
３．６ｇのカフェ酸（シグマ社製）と５．２４ｇのトリフェニルフォスフィン（和光純薬製）、および２．６ｇのｎ−オクタノール（和光純薬製）を所定のテトラヒドロフラン（和光純薬製）に溶解した。次いで、容器内を窒素置換し、氷浴中で上記溶液に２０ｍｍｏｌのアゾジカルボン酸（東京化成製）を加え、室温にて４時間攪拌した。攪拌終了後、上記溶液を濃縮し、シリカゲルカラム（溶離液：ジクロロメタン／イソプロパノール＝９６／４）により分離精製し、精製物（５６５ｍｇ）を得た。次いで、ＮＭＲで測定し、得られた精製物が、カフェ酸オクチルエステルであることを確認した。確認後、カフェ酸オクチルエステルを被検物質Ｃとした。
【００５１】
＜参考例４＞
３．６ｇのカフェ酸（シグマ社製）と５．２４ｇのトリフェニルフォスフィン（和光純薬製）、および２．２ｇのベンジルアルコール（和光純薬製）を所定のテトラヒドロフラン（和光純薬製）に溶解した。次いで、容器内を窒素置換し、氷浴中で上記溶液に２０ｍｍｏｌのアゾジカルボン酸（東京化成製）を加え、室温にて４時間攪拌した。攪拌終了後、上記溶液を濃縮し、シリカゲルカラム（溶離液：ジクロロメタン／イソプロパノール＝９６／４）により分離精製し、精製物（４１２ｍｇ）を得た。次いで、ＮＭＲで測定し、得られた精製物が、カフェ酸ベンジルエステルであることを確認した。確認後、カフェ酸ベンジルエステルを被検物質Ｄとした。
【００５２】
＜実施例１＞
ＮＧＦに応答して神経突起を伸長することが知られているラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を、コラーゲンコーティングされた２４ウェル培養プレート（ＩＷＡＫＩ社製）にて牛胎児血清１％、ウマ血清１％の割合で含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製、以後分化培地と省略する）に１０５細胞／穴になるように播種し、３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００５３】
次いで、参考例１で得られた被検物質Ａ（カフェ酸メチルエステル）が分化培地に対して１０μＭの濃度になるように含有する分化培地を調製した。次いで、調製した分化培地を上記で予め培養した細胞に添加し、３７℃にて５％のＣＯ２条件下で２日間培養を行った。培養後、細胞を倒立顕微鏡（ＴＥ２０００Ｅ、ＮＩＫＯＮ社製）にて２００倍の倍率で顕微鏡観察し、次いで、細胞の写真撮影を行った。次いで、ジャグジート．エス．ギル（Ｊａｇｊｉｔ Ｓ．Ｇｉｌｌ）ら、モレキュラー・ブレイン・リサーチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅｒａｒｃｈ），１９９８年，第５７巻，ｐ．１２３−１３１に記載の方法に準じて、神経突起が伸長している細胞数を目視によりカウントした。次いで、所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率（小数点以下四捨五入）を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した。結果を表１に示す。また、被検物質Ａ（カフェ酸メチルエステル）を含有した分化培地を添加した細胞の写真を図１に示す。
【００５４】
＜実施例２＞
上記実施例１と同様の条件にて、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００５５】
次いで、参考例２で得られた被検物質Ｂ（カフェ酸プロピルエステル）が分化培地に対して１０μＭの濃度になるように含有する分化培地を調製した。次いで、上記で調製した分化培地を上記実施例１と同様の条件で培養し、次いで、上記と同様に所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した（小数点以下四捨五入）。結果を表１に示す。また、被検物質Ｂ（カフェ酸プロピルエステル）を含有した分化培地を添加した細胞の写真を図２に示す。
【００５６】
＜実施例３＞
上記実施例１と同様の条件にて、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００５７】
次いで、参考例３で得られた被検物質Ｃ（カフェ酸オクチルエステル）が分化培地に対して１０μＭの濃度になるように含有する分化培地を調製した。次いで、上記で調製した分化培地を上記実施例１と同様の条件で培養し、次いで、上記と同様に所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した（小数点以下四捨五入）。結果を表１に示す。また、被検物質Ｃ（カフェ酸オクチルエステル）を含有した分化培地を添加した細胞の写真を図３に示す。
【００５８】
＜実施例４＞
上記実施例１と同様の条件にて、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００５９】
次いで、参考例４で得られた被検物質Ｄ（カフェ酸ベンジルエステル）が分化培地に対して１０μＭの濃度になるように含有する分化培地を調製した。次いで、上記で調製した分化培地を上記実施例１と同様の条件で培養し、次いで、上記と同様に所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した（小数点以下四捨五入）。結果を表１に示す。また、被検物質Ｄ（カフェ酸ベンジルエステル）を含有した分化培地を添加した細胞の写真を図４に示す。
【００６０】
＜実施例５＞
上記実施例１と同様の条件にて、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００６１】
次いで、カフェ酸フェネチルエステル（シグマ社製）を被検物質Ｅとして、分化培地に対して１０μＭの濃度になるように含有する分化培地を調製した。次いで、上記で調製した分化培地を上記実施例１と同様の条件で培養し、次いで、上記と同様に所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した（小数点以下四捨五入）。結果を表１に示す。また、被検物質Ｅ（カフェ酸フェネチルエステル）を含有した分化培地を添加した細胞の写真を図５に示す。
【００６２】
＜比較例１＞
上記実施例１と同様の条件にて、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００６３】
次いで、被検物質無添加の分化培地を調製した。次いで、上記で調製した分化培地を上記実施例１と同様の条件で培養し、次いで、上記と同様に所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した（小数点以下四捨五入）。この結果をコントロールとした。結果を表１に示す。また、被検物質無添加の分化培地を添加した細胞の写真を図６に示す。
【００６４】
＜比較例２＞
上記実施例１と同様の条件にて、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞株ＰＣ１２ｈ細胞を３７℃にて５％のＣＯ２条件下で二日間培養した。
【００６５】
次いで、分化培地に対して１０ｎｇ／ｍｌの濃度になるようにＮＧＦを含有する分化培地を調製した。次いで、上記で調製したそれぞれの分化培地を上記実施例１と同様の条件で培養し、次いで、上記と同様に所定の面積での全細胞数に対する神経突起が伸長している細胞数の百分率（小数点以下四捨五入）を神経突起の伸長した細胞の割合として算出した。この結果を陽性対照とした。結果を表１に示す。また、ＮＧＦを含有した分化培地を添加した細胞の写真を図７に示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
表１に示されるように、実施例１（被検物質Ａ）、実施例２（被検物質Ｂ）、実施例３（被検物質Ｃ）、実施例４（被検物質Ｄ）、および実施例５（被検物質Ｅ）の神経突起の伸長した細胞の割合（％）は、比較例1（被検物質無添加）に比べて高い値であった。また、図１〜５に示されるように、比較例1（被検物質無添加）の神経突起がほとんど伸長していないの対して、実施例１（被検物質Ａ）、実施例２（被検物質Ｂ）、実施例３（被検物質Ｃ）、実施例４（被検物質Ｄ）、および実施例５（被検物質Ｅ）の神経突起が伸長していることが確認できる。このことから、上記カフェ酸またはその誘導体が細胞での神経突起の伸長作用を有することが分かる。よって、カフェ酸またはその誘導体が神経突起伸長剤として有用であることが分かる。
【００６８】
＜実施例６：食品の製造＞
参考例１で得たカフェ酸メチルエステルを用いて、以下の組成を有する食品を調製する。
【００６９】
成分 重量（ｇ）
カフェ酸メチルエステル １．０
大豆サポニン ３．０
黒酢エキス ２．０
リンゴファイバー ２．０
レシチン １．０
フラクトオリゴ糖 ２．０
果糖 １．０
粉末酢 ０．１
シクロデキストリン １．０
蜂蜜 １．０
骨粉 １．０
デキストリン ４．９
【００７０】
各成分を混合した後、水を噴霧して造粒を行い、入風温度８０℃で乾燥して、顆粒状食品を得る。
【００７１】
＜実施例７：硬ゼラチンカプセルの製造＞
参考例２で得たカフェ酸プロピルエステルを用いて、以下の組成を有する硬ゼラチンカプセルを調製する。
【００７２】
成分 重量（ｍｇ／カプセル）
カフェ酸プロピルエステル ２０
デンプン １００
セルロース １００
【００７３】
各成分を混合し均一に混合した後、ゼラチンカプセルに封入し、硬ゼラチンカプセルを得る。
【００７４】
＜実施例８：錠剤の製造＞
参考例３で得たカフェ酸オクチルエステルを用いて、以下の組成を有する錠剤を調製する。
【００７５】
成分 重量（ｍｇ／錠剤）
カフェ酸オクチルエステル ２５０
セルロース ４００
二酸化ケイ素 １０
ステアリン酸 ５
【００７６】
各成分を混合し均一に混合した後、打錠し、錠剤を得る。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、神経細胞の神経突起を伸長し得る神経突起伸長剤を提供する。本発明の神経突起伸長剤は、医薬品、医薬部外品または食品組成物等として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】実施例１で得られた、カフェ酸メチルエステルを含有した分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図２】実施例２で得られた、カフェ酸プロピルエステルを含有した分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図３】実施例３で得られた、カフェ酸オクチルエステルを含有した分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図４】実施例４で得られた、カフェ酸ベンジルエステルを含有した分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図５】実施例５で得られた、カフェ酸フェネチルエステルを含有した分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図６】比較例１で得られた、被検物質無添加培地の分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図７】比較例２で得られた、ＮＧＦを含有した分化培地を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）：
【化１】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、神経突起伸長剤。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体が、カフェ酸メチルエステル、カフェ酸プロピルエステル、カフェ酸オクチルエステル、カフェ酸ベンジルエステルおよびカフェ酸フェネチルエステルからなる群より選択される少なくとも１種のカフェ酸エステルである、請求項１に記載の神経突起伸長剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の神経突起伸長剤を含有する、医薬品組成物。
【請求項４】
以下の式（Ｉ）：
【化２】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、神経突起を伸長させ得る食品である旨の表示を付した飲食物。
【請求項５】
以下の式（Ｉ）：
【化３】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である、但しフェネチル基を除く）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を内容組成物に対し、０．１重量％以上の割合で含有してなる、飲食物。
【請求項１】
以下の式（Ｉ）：
【化１】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、神経突起伸長剤。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で表されるカフェ酸またはその誘導体が、カフェ酸メチルエステル、カフェ酸プロピルエステル、カフェ酸オクチルエステル、カフェ酸ベンジルエステルおよびカフェ酸フェネチルエステルからなる群より選択される少なくとも１種のカフェ酸エステルである、請求項１に記載の神経突起伸長剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の神経突起伸長剤を含有する、医薬品組成物。
【請求項４】
以下の式（Ｉ）：
【化２】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、神経突起を伸長させ得る食品である旨の表示を付した飲食物。
【請求項５】
以下の式（Ｉ）：
【化３】
（ここで、Ｒ１は水素原子、分岐または環を形成していてもよいＣ１からＣ８のアルキル基、分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアラルキル基、または分岐していてもよいＣ１からＣ４のアルキル基で置換されていてもよいアリール基である、但しフェネチル基を除く）で表されるカフェ酸またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を内容組成物に対し、０．１重量％以上の割合で含有してなる、飲食物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００７−２３０９４６（Ｐ２００７−２３０９４６Ａ）
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５６７４３（Ｐ２００６−５６７４３）
【出願日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【Ｆターム（参考）】
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