突然変異の可能性を判定する方法
本発明は、フィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を非侵襲的に測定する方法を対象とする。本発明の方法は、（ｉ）個体の角質層から振動スペクトル得ること；（ｉｉ）振動スペクトルから局所の天然保湿因子の量を判定すること；（ｉｉｉ）任意にステップ（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すこと；および（ｉｖ）個体の局所の天然保湿因子の量を基準値と比較することを含み、前記角質層は、フィラグリンをコードする遺伝子の前記１つまたは複数の機能喪失型突然変異が、天然保湿因子の濃度に影響を与える他の要因によりも天然保湿因子の濃度に対して強い影響力を与える、前記個体の身体部位の角質層である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィラグリンをコードする遺伝子において１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を非侵襲的に測定する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
皮膚科の主要な問題にアトピー性皮膚炎（ＡＤ：ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）がある。先進国におけるアトピー性皮膚炎の有病率は１５％〜２０％に及ぶと推定される。［ロール（Ｒｏｌｌ）ら著、カレントオピニオンインアレルギーアンドクリニカルイムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２００４年、第４巻（５）、ｐ．３７３−３７８］アトピー性皮膚炎は、ヘルスケア全体の大きな負担になっている。
【０００３】
皮膚は、真皮および表皮の２層に分けられる。表皮の最外層である角質層は、水分の喪失および有害物質の侵入から体を保護する主要なバリアである。アトピー性皮膚炎は、バリア機能障害が主要事象である可能性が高い。
【０００４】
アトピー性皮膚炎は、皮膚の痒み、炎症を特徴とするありふれた慢性炎症性皮膚疾患である。［ロールら著、カレントオピニオンインアレルギーアンドクリニカルイムノロジー、２００４年、第４巻（５）、ｐ．３７３−３７８およびステムラー（Ｓｔｅｍｍｌｅｒ）ら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）２００７年、第１２７巻、ｐ．７２２−７２４］また、アトピー性皮膚炎の素因がある人は、美容業および料理業などのある種の職業に携われない恐れがあることもよく知られている。
【０００５】
現在では、低年齢児のアトピー性皮膚炎の発症素因を早期に検出し、皮膚バリアの標的処置を行えば、その後のアトピー症候群の発症を予防できると考えられている。
【０００６】
タンパク質フィラグリンは、皮膚バリアの形成および維持に決定的に重要である。このタンパク質は、ケラチン繊維が安定なマクロ構造をとるのに必須であり、かつ天然保湿因子（ＮＭＦ：ｎａｔｕｒａｌ ｍｏｉｓｔｕｒｉｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）の産生のためのアミノ酸を与える。
【０００７】
アトピー性皮膚炎には、フィラグリンをコードする遺伝子における機能喪失型突然変異が関係していると考えられてきた。［ロールら著、カレントオピニオンインアレルギーアンドクリニカルイムノロジー、２００４年、第４巻（５）、ｐ．３７３−３７８；ステムラーら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００７年、第１２７巻、ｐ．７２２−７２４；サンディランズ（Ｓａｎｄｉｌａｎｄｓ）ら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００６年、第１２６巻、ｐ．１７７０−１７７５；サンディランズら著、ネイチャージェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、２００６年、第３８巻、ｐ．３３７−３４２；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら著、ネイチャージェネティクス、２００７年、第３９巻、ｐ．６５０−６５４］フィラグリンの産生能が部分的または完全に喪失すると、バリア機能障害が起こる。そのため、体はアレルゲン曝露を受けやすくなり、結果としてアトピー性皮膚炎が起こる恐れがある。フィラグリン遺伝子における機能喪失型突然変異は、先進国の主要問題であると同時に深刻化する問題であるアトピー性皮膚炎および喘息の強い素因である。［サンディランズら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００６年、第１２６巻、ｐ．１７７０−１７７５；サンディランズら著、ネイチャージェネティクス、２００６年、第３８巻、ｐ．３３７−３４２；スミスら著、ネイチャージェネティクス、２００７年、第３９巻、ｐ．６５０−６５４；およびアービン（Ｉｒｖｉｎｅ）ら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００６年、第１２６巻、ｐ．１２００−１２０２］ただし、フィラグリン遺伝子おける機能喪失型突然変異とアトピー性皮膚炎とに相関関係はあるものの、直接的な関係は認められない。遺伝子突然変異を持たない人がアトピー性皮膚炎を発症する場合もあり、遺伝子突然変異を持つ人が必ずしもアトピー性皮膚炎であるとは限らない。
【０００８】
欧州系の人は約１０％がフィラグリン遺伝子の突然変異を持っている。［サンディランズら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００６年、第１２６巻、ｐ．１７７０−１７７５］フィラグリン遺伝子のホモ接合型変異は、フィラグリンの産生能の完全な喪失を示す。
【０００９】
フィラグリン遺伝子の突然変異を判定する既知の方法は、特殊な遺伝子型判定法を用いる。たとえば、米国特許出願公開第２００３／０１２４５５３号を参照されたい。フィラグリンをコードする遺伝子に特異的な突然変異を検出するには、特定の生化学的分析が必要である。遺伝子型判定法では、複数サイクルのＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）増幅およびシーケンシングを行い、フィラグリンをコードするＤＮＡを単離し、増幅する必要がある。次いで特定の遺伝子型判定アッセイにより各フィラグリン突然変異を解析する。こうしたアッセイの大部分は市販されておらず、フィラグリン遺伝子突然変異を研究している研究機関の中には、独自にアッセイを開発してきたところもある。サンディランズら著、ネイチャージェネティクス、２００６年、第３８巻、ｐ．３３７−３４２にはフィラグリン突然変異の１５種の変異体の解析が記載されている。こうした遺伝子型判定方法は費用と時間がかかるうえ、非常に特殊な研究施設および人員を必要とする。遺伝子型判定方法は、集団スクリーニングの目的には不適である。
【００１０】
したがって、フィラグリン遺伝子に機能喪失型突然変異が存在する可能性を集団スクリーニングする短時間で簡便な方法が求められている。
【００１１】
さらに、疾患を正しく診断し、適切な処置を選択するため、アトピー性皮膚炎患者にフィラグリン遺伝子における機能喪失型突然変異が存在するかどうかを判定する短時間で簡便な方法も求められている。
【００１２】
インビボでの角質層のラマン分光測定によって、その主な供給源がタンパク質フィラグリンであり天然保湿因子（ＮＭＦ）と総称される、アミノ酸とアミノ酸誘導体との複合体の相対濃度を判定することができる。フィラグリンは角質層の底部の狭い領域に存在し、そこで酵素分解されＮＭＦになる。［スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら著、バイオケミカエトバイオフィジカアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）、１９８２年、第７１９巻（１）、ｐ．１１０−１１７およびローリングス（Ｒａｗｌｉｎｇｓ）ら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、１９９４年、第１０３巻、ｐ．７３１−７４１］このため、フィラグリンをコードする遺伝子における機能喪失型突然変異は、皮膚内のＮＭＦ量に関与している。しかしながら、皮膚内のＮＭＦ量は他の多くの要因によって決まるものであり、機能喪失型遺伝子突然変異よりもはるかに大きな影響を与えるものもある。
【００１３】
したがって、フィラグリン遺伝子に機能喪失型突然変異があると、皮膚内のＮＭＦ量が減少する場合があるけれども、その逆はまず起こらない。一方、ＮＭＦ量が異常に少なくても遺伝子突然変異が原因とは限らない。遺伝子転写およびプロフィラグリン産生のプロセス、フィラグリンへの酵素的プロセシング、およびその後のフィラグリンからＮＭＦへの酵素／タンパク質分解は多くの要因の影響を受けるためである。とりわけ、このことが原因で、同じ機能的プロフィラグリン遺伝子が至るところに存在するにもかかわらず、ＮＭＦ量は身体の部位によって大きく異なる。さらに、ＮＭＦ量は年齢、入浴、石鹸による洗浄および環境などの要因にも影響される。これは、たとえば、フィラグリン（本質的にフィラグリン遺伝子がコードするタンパク質であるプロフィラグリンの酵素的プロセシングの産物）の酵素およびタンパク質分解によるＮＭＦ生成のプロセスについて記載しているローリングスら［ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、１９９４年、第１０３巻、ｐ．７３１−７４１］により説明されている。ローリングスらは、病状とＮＭＦの欠損との相関関係、およびＮＭＦの産生能の欠如が、単純な乾燥症から重度の乾癬に至る皮膚の病に関与する重要なメカニズムである可能性があることを記載している。また、ローリングスらは、洗浄により表面の角質層からＮＭＦの大部分が流れ出ることについても言及している。さらに、合成活性の低下に起因して、角質層のＮＭＦ量が加齢に伴い２分の１以上と大きく減少することも指摘している。加えて、フィラグリンからＮＭＦへの変換は水分活性に左右され、角質層が、曝される環境条件に合わせてこのプロセスを調整していることも述べている。ＮＭＦ量は、臨床的に正常な皮膚を持つ個体間で大きく異なることが明らかになっている。身体の部位との関連で変化するのと同様に、年齢および季節的要因に応じて変化することも明らかにされている。［ファンデルポール（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌ）ら著、アブストラクトＩＦＳＣＣミーティング（Ａｂｓｔｒａｃｔ ＩＦＳＣＣ ｍｅｅｔｉｎｇ）、アムステルダム、オランダ、２００７年９月２４〜２７日およびファンデルポールら著、アブストラクトＩＳＢＳナショナルミーティング（Ａｂｓｔｒａｃｔ ＩＳＢＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ）、ストーンマウンテン（Ｓｔｏｎｅ Ｍｏｕｎｔａｉｎ）ＧＡ、米国、２００６年１０月１２〜１４日］。
【００１４】
また、アトピー性皮膚炎の観点から記載されてきた異常な落屑などの作用が、皮膚内のＮＭＦ量にどの程度影響を与えるかは不明である。
【００１５】
皮膚状態の処置の有効性の臨床徴候が観察できるようになるには、処置の開始からしばらく経ってからであることも珍しくない。たとえば、ラプティバ（Ｒａｐｔｉｖａ）（登録商標）（エファリズマブ、メルクセローノインターナショナル（Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）Ｓ．Ａ．、ジュネーブ、スイス）を用いた乾癬処置のオランダのガイドラインによれば、処置を１２週間継続してから処置の継続または中止を臨床医が決定する。一方で、臨床的改善は、根底にある分子的変化に遅行する。このため、ＮＭＦ量の変化などの分子的変化をモニターする方法を用いれば、従来の臨床評価よりもかなり速く皮膚処置の有効性を判定できると考えられる。
【００１６】
本発明は、被検体、特にヒト被験者においてフィラグリン遺伝子の１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を迅速かつ非侵襲的に測定する方法および器具を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明はさらに、フィラグリン遺伝子におけるホモ接合機能喪失型突然変異とヘテロ接合機能喪失型突然変異とを識別する迅速かつ客観的な方法を提供することを目的とする。
【００１８】
本発明はさらに、局部塗布した生成物の浸透性および／または作用の判定に関する試験に好適な個体の集団を構成するための迅速かつ客観的な方法を提供すること、すなわち、各個体を試験群に含めるか、除外するかの客観的な指標を提供することを目的とする。
【００１９】
本発明はさらに、職業性の皮膚病を発症するリスクが高いため、ある種の職業または活動に個体が不適であるか、あるいは少なくとも好適とは言い難いかどうかを判定する客観的方法を提供することを目的とする。
【００２０】
本発明はさらに、フィラグリン遺伝子における１つまたは複数の機能喪失型突然変異に関連する皮膚状態の素因を低年齢児が持つかどうかを判定し、それにより予防処置による介入を早期実施できるようにし、および／または追加の診断検査を患者に指示するための集団スクリーニングを容易にする客観的方法を提供することを目的とする。
【００２１】
本発明はさらに、アトピー性皮膚炎に罹患している個体がフィラグリンの欠損が原因で皮膚バリアに障害があるかどうかを判定し、それに合わせて療法を調整する客観的方法を提供することを目的とする。
【００２２】
本発明はさらに、アトピー性皮膚炎の治療処置の有効性を判定する客観的方法を提供することを目的とする。
【００２３】
本発明はさらに、改善の臨床徴候が認められる前にアトピー性皮膚炎の治療処置の有効性を判定する客観的方法を提供することを目的とする。
【００２４】
本発明はさらに、皮膚疾患の療法または処置の結果を予測する迅速かつ客観的な方法を提供することを目的とする。
【００２５】
本発明はさらに、パーソナルケア製品による皮膚処置の作用を予測する迅速かつ客観的な方法を提供することを目的とする。
【００２６】
本発明はさらに、皮膚疾患の適切な処置または療法を選択する指針となる迅速かつ客観的な方法を提供することを目的とする。
【００２７】
本発明はさらに、皮膚ケア用のパーソナルケア製品の選択の指針となる迅速かつ客観的な方法を提供することを目的とする。
【００２８】
本発明はさらに、ある種の環境条件、化学製品およびその他の事項に対する皮膚曝露の影響を予測する迅速かつ客観的な方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２９】
第１の態様では、本発明は、個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を非侵襲的に測定する方法であって、
（ｉ）個体の角質層から振動スペクトルを得ること；
（ｉｉ）得られた振動スペクトルから局所の天然保湿因子の量を判定すること；
（ｉｉｉ）任意にステップ（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すこと；および
（ｉｖ）個体の局所の天然保湿因子の量を基準値と比較すること
を含み、前記角質層は、フィラグリンをコードする遺伝子の前記１つまたは複数の機能喪失型突然変異が、天然保湿因子の濃度に影響を与える他の要素よりも天然保湿因子の濃度に強い影響を与える、前記個体の身体部位の角質層である、測定法を対象とする。
【００３０】
さらに、本発明は、個体のフィラグリン遺伝子におけるホモ接合機能喪失型突然変異とヘテロ接合機能喪失型突然変異を区別する方法であって、天然保湿因子の量に応じて機能喪失型突然変異を分類することを含む、方法を対象とする。
【００３１】
さらに、本発明は、皮膚疾患の処置を受けている個体の療法または処置が所望の効果を上げる可能性があるかどうかを予測する方法であって、
− 本発明に記載の方法により前記皮膚疾患の処置を受けている一群の個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を判定すること；
− 一群の個体の角質層における天然保湿因子の量と処置の効果との相関関係を判定すること；
− 前記個体の角質層の天然保湿因子の量を判定すること；
− 前記相関関係により前記個体の前記療法または処置が有効であるかどうかを予測すること
を含む、方法を対象とする。
【００３２】
本発明はさらに、個体による皮膚のパーソナルケア製品の使用効果を予測する方法であって、
− 本発明に記載の方法により前記皮膚のパーソナルケア製品を使用している一群の個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を判定すること；
− 前記群の個体の角質層における天然保湿因子の量と前記皮膚のパーソナルケア製品の使用効果との相関関係を判定すること；
− 前記個体の角質層の天然保湿因子の量を判定すること；
− 前記相関関係を用いて前記個体による前記皮膚のパーソナルケア製品の使用効果を予測すること
を含む、方法も対象とする。
【００３３】
さらに、本発明は、環境条件、化学製品または他の事項に対する個体の曝露の影響を予測する方法であって、
− 本発明に記載の方法を用いて、前記環境条件、化学製品または他の事項に曝露される一群の個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を判定すること；
− 一群の個体の角質層における天然保湿因子の量と曝露の影響との相関関係を判定すること；
− 前記個体の角質層の天然保湿因子の量を判定すること；
− 前記相関関係を用いて前記環境条件、化学製品または他の事項に対する前記個体の曝露の影響を予測すること
を含む、方法を対象とする。
【００３４】
さらに、本発明は、アトピー性皮膚炎に罹患している個体を処置する方法であって、フィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異がその個体に存在する可能性があるかどうかを判定すること、および前記判定結果に基づき療法を調整することを含む、方法を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】フィラグリン突然変異を持たない個体の腕の角質層のラマンスペクトルである。黒の領域（番号１および２）はＮＭＦのラマンバンドを示す。灰色の部分（番号３）は角質層組織のラマンバンドを示す。
【図２】フィラグリン突然変異を持つ個体の腕の角質層のラマンスペクトルである。黒の領域（番号１および２）はＮＭＦのラマンバンドを示す。灰色の部分（番号３）は、角質層組織のラマンバンドを示す。
【図３】振動シグナルからＮＭＦ量を判定する一方法を図示する、角質層のラマンスペクトルである。
【図４】天然保湿因子のラマンスペクトルである。
【図５】ヒト皮膚のラマンスペクトルである。
【図６】フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない個体の天然保湿因子の皮膚の深さプロファイルである
【図７】フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持つ個体の天然保湿因子の皮膚の深さプロファイルである。
【図８】フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない個体の腕における天然保湿因子の相対量を示す。破線はＮＭＦ量の中央値を示す。
【図９】フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持つ個体の腕における天然保湿因子の相対量を示す。破線は、フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない個体の腕におけるＮＭＦ量の中央値を示す。
【図１０】フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない個体の母指球における天然保湿因子の相対量を示す。破線はＮＭＦ量の中央値を示す。
【図１１】フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持つ個体の母指球における天然保湿因子の相対量を示す。破線は、フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない個体の母指球におけるＮＭＦ量の中央値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
「振動分光」という語は、本明細書で使用する場合、分子の振動モードおよび／または回転モードの解析が可能な任意の分光学的手法と定義する。
【００３７】
「ラマン分光」という語は、本明細書で使用する場合、ある系において振動モードおよび／または回転モードの調査に用いる分光学的手法と定義し、通常、可視、近赤外または近紫外領域のレーザーからの単色光の非弾性散乱（ラマン散乱とも呼ばれる）を利用する。入射レーザー光は系の振動エネルギーおよび／または回転エネルギーの量を増減させ、その結果、レーザーの光子エネルギーが変化する場合がある。このレーザーの光子エネルギーの変化によりスペクトルシフトが起こり、系の振動モードおよび／または回転モードに関する情報が得られる。一般に、レーザービームをサンプルに照射する。照射スポットからの光はレンズで集光され、スペクトロメーターを通して送られる。（弾性レイリー散乱による）レーザー線に近い波長は除外され、レーザー線から離れた一定のスペクトル窓の波長が検出器に分散される。
【００３８】
ラマンスペクトルは、入射光に照射されたときに目的分子から放射される、非常に狭い一連のスペクトル線である。各スペクトル線の幅は入射光のスペクトル幅に強く影響されるため、レーザーなどの単色性に優れた光源を使用する。各ラマン線の波長は、ラマン線と入射光との波数の差である、入射光に対する波数シフトで表す。絶対波数でないラマン線の波数シフトは、分子内の特定の原子団に特有である。ラマンスペクトルは、分子構造により、特にメチレン、エチレン、アミド、ホスファートまたはスルフィドなどの原子団により決定されるその分子の振動モードおよび／または回転モードを測定する。
【００３９】
生物学におけるラマン分光は、巨大分子または関連する小分子の振動モードおよび／または回転モードの変化に関係して使用されるのが大部分である。原子団における１本のラマン線の波数シフトの変化あるいは２本以上のラマン線の相対強度の変化は、巨大分子における立体構造変化を示すと解釈されている。このため、ラマン分光は主に、生物学において分子および分子動力学の定性試験に使用されている。ラマンスペクトルを容易かつ明確に解釈するため、この手法の使用は主として精製材料およびその酵素反応などの系に限定されてきた。しかしながら、ラマンスペクトルは原子団に特有の振動および／または回転に基礎を置いているため、フィンガープリンティングと同様の方法により分子の混合物を原子団の組成物として特徴付けを行い、定量するために使用することもできる。ラマンスペクトルはサンプルの組成を化学物質のリストとして完全に決定することはできないが、一方で、最も多く含まれる分子種であれば、自然環境における分子組成および経時的変化の概略を与える。
【００４０】
「局所の天然保湿因子の量」という語は、本明細書で使用する場合、前腕の手のひら側または母指球（手のひら）など、身体の所定の部位における角質層内、および皮膚表面下の所定距離の角質層内のＮＭＦ量またはＮＭＦ濃度と定義する。
【００４１】
本発明は、多くの要因が皮膚の角質層（ｃｏｒｎｅｕｍ ｓｔｒａｔｕｍ）内のＮＭＦ量のＮＭＦ濃度に影響を与えており、したがって、ＮＭＦ量に対する機能喪失型遺伝子突然変異の作用は顕在化しないものの、プロフィラグリン（ｐｒｏｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の機能喪失型突然変異以外の要因およびプロセスによりＮＭＦ濃度が比較的影響を受けない部位が個体の身体に存在するとの知見に基づく。この知見によれば、好適な測定手法を選択すれば、個体がフィラグリン遺伝子における機能喪失型突然変異を持っていることにより、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎などに対するリスクが高いという信頼できる診断が得られる。フィラグリン産生に障害があると、個体の角質層内のＮＭＦが正常濃度よりも低くなることが明らかになっているが、これを振動分光により検出することができる。これまでに遺伝子突然変異の存在を判定する方法としてＮＭＦ濃度を用いることは示唆されたことがなかったが、驚くべきことにこれが可能になりそうである。
【００４２】
フィラグリン遺伝子における１つまたは複数の機能喪失型突然変異が、ＮＭＦ濃度に影響を与える他の要因よりもＮＭＦ濃度に対して強い影響を及ぼす個体の身体部位は、以下のように発見することができる。
【００４３】
試験用身体部位の選択後、フィラグリン遺伝子の既知の機能喪失型突然変異を持つ一群の１例または複数例の個体の試験用身体部位の角質層から振動スペクトルを得て、振動スペクトルの解析により試験用身体部位の天然保湿因子の量を判定する。さらに、フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない一群の１例または複数例の個体の試験用身体部位の角質層から振動スペクトルを得る。やはり、振動スペクトルの解析により試験用身体部位の天然保湿因子の量を判定する。最後に、フィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の既知の機能喪失型突然変異を持つ一群の個体における試験用身体部位の角質層内の天然保湿因子の量が、フィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない一群の個体よりも少ないかどうかを評価して、試験用身体部位のフィラグリンをコードする遺伝子の機能喪失型突然変異が、天然保湿因子の濃度に影響を与える他の要因よりも天然保湿因子の濃度に対して強い影響を及ぼすかどうかを判定する。フィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の既知の機能喪失型突然変異を持つ一群の個体およびフィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない一群の個体はそれぞれ、好ましくは少なくとも６例の個体、一層好ましくは少なくとも１２例の個体を含む。
【００４４】
本発明の方法を用いれば、角質層内の検出可能なＮＭＦ量がある程度少ない可能性がある、フィラグリン突然変異のヘテロ接合キャリアと、角質層内の検出可能なＮＭＦがほぼ完全に存在しない可能性がある、フィラグリン突然変異のホモ接合キャリアとを区別できる。
【００４５】
本発明の方法によれば、個体の角質層の振動スペクトルまたはその選択部分を測定する。振動スペクトルは、任意の振動分光手法を用いて測定することができる。好ましい分光法はラマン分光法である。他の分光法として、たとえば、ボーマナン（Ｂｏｍｍａｎｎａｎ）ら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、１９９０年、第９５巻（４）、ｐ．４０３−４０８に記載されているような近赤外分光法、フーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ：Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ）分光法または減衰全反射（ＡＴＲ：ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｏｔａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）赤外分光法などの赤外分光法が挙げられる。
【００４６】
振動スペクトルは、サンプルの分子組成を表す。以下のやり方のいずれかで振動スペクトルから角質層内のＮＭＦ量を測定することができる。
【００４７】
一実施形態では、内部基準の振動シグナルの強度に対するＮＭＦの振動シグナルの強度としてＮＭＦ量を測定する。好適な内部基準は、たとえば、ケラチンのシグナルである。したがって、ＮＭＦのシグナル強度とケラチンのシグナル強度との比としてＮＭＦ量を測定してもよい。ただし、ＮＭＦを共に構成する分子化合物群に属さない、皮膚に共通の他の成分を好適な内部基準として用いても構わない。たとえば、そうした内部基準は、ＮＭＦを共に構成する分子化合物の全部または大部分を除去した後の角質層組織のサンプルの振動シグナルであってもよい。角質層のサンプルからＮＭＦを抽出する方法は、キャスパース（Ｃａｓｐｅｒｓ）ら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００１年、第１１６巻、ｐ．４３４−４４２に記載されている。この論文では、ＮＭＦ量の個体間のばらつきを検出する可能性のほか、ラマン分光を用いて追加の特定を行わない、疾患のプロセスおよび処置に起因する皮膚内の分子の濃度差の研究が示唆されている。
【００４８】
シグナル強度は、ＮＭＦシグナルの関与が有力である１つまたは複数の波長幅、および内部基準シグナルの関与が有力である１つまたは複数の波長幅における振動シグナルから好適に判定することができる。次いで、ＮＭＦシグナルの関与が有力である１つまたは複数の波長幅の曲線下面積Ａ１からＮＭＦのシグナル強度を判定すればよい（図１および図２の番号１および２の領域を参照されたい）。基準シグナル強度については、内部基準からのシグナルの関与が有力である１つまたは複数の波長幅の曲線下面積Ａ２から判定すればよい（図１および図２の番号３の領域を参照されたい）。したがって、ＮＭＦ量（Ｒ）の有用な指標は、Ｒ＝Ａ１／Ａ２の比から得ることができる。
【００４９】
別の実施形態では、ＮＭＦシグナルの関与が有力である１つまたは複数の波長幅、内部基準シグナルの関与が有力である１つまたは複数の波長幅、およびほとんどあるいはまったくラマンシグナルが予測されないため、バックグラウンドのシグナル強度の推定に役立つ場合がある１つまたは（ｏｒｅ）複数のスペクトル間隔からシグナル強度を測定する。次いで図３に示すように、ＮＭＦシグナルが有力な曲線下面積Ａ３および内部基準シグナルの曲線下面積Ａ４からＮＭＦ量を判定することができる。曲線下面積については、以下の式に従って様々な波長幅で測定したシグナル強度から判定することができる。式中、Ｉｎはスペクトル間隔ｎから測定したシグナル強度、Ａｎはスペクトル間隔ｎの曲線下面積、ｘｎはスペクトル間隔ｎの中心波数、ｙｎはスペクトル間隔ｎの平均シグナル強度、およびｄｎはスペクトル間隔ｎの幅である（図３を参照）。ＮＭＦの曲線下面積Ａ３は、以下を用いて判定することができる。
【００５０】
【数１】
【００５１】
内部基準シグナルの曲線下面積Ａ４は以下を用いて判定することができる。
【００５２】
【数２】
【００５３】
ここで、以下の曲線下面積Ａ３とＡ４との比からＮＭＦ量の指標を得ることができる。
ＣＮＭＦ＝Ａ３／Ａ４
【００５４】
当業者であれば、他のシグナル強度比を用いてもＮＭＦ量の推定値が得られることを理解するであろう。本発明の方法の場合、ＮＭＦ量測定の指標がＮＭＦ量と比例関係にあることは重要ではない。たとえば、指標はＮＭＦ量と単調関係にあれば十分である。
【００５５】
好ましい実施形態では、内部基準の振動シグナルの強度に対するＮＭＦの振動シグナルの強度からＮＭＦ量を測定する。好適な内部基準は、たとえば、ケラチンである。
【００５６】
好ましい実施形態では、スペクトルフィッティングによりＮＭＦ量を判定する。皮膚の振動スペクトルまたは皮膚の振動スペクトルの大部分を含む一連の基準振動スペクトルから、皮膚の振動スペクトルに対する各基準スペクトルの寄与を判定する。相対的寄与は、基準スペクトルまたは基準スペクトルの選択したスペクトル領域を皮膚の振動スペクトルまたは皮膚の振動スペクトルの選択したスペクトル領域にフィッティングさせれば判定することができる。フィッティング係数は、各基準スペクトルの相対的寄与である。［キャスパースら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００１年、第１１６巻、ｐ．４３４−４４２］好ましくは、基準スペクトルの１つは、ＮＭＦのスペクトルである。あるいは、１個または複数個の基準スペクトルは、ＮＭＦの成分のスペクトルである。基準スペクトルのセットをインビトロで純粋な皮膚成分、純粋な皮膚成分の溶液および／または純粋な皮膚成分の集合体から集めてもよい。基準スペクトルに用いてもよい特に好ましい皮膚成分は、ケラチンである。
【００５７】
別の実施形態では、ＮＭＦの振動スペクトルまたはＮＭＦの成分のスペクトルにおける１つまたは複数のピークの強度、および内部基準のスペクトルにおける１つまたは複数のピークの強度を算出してＮＭＦ量を測定する。好適な内部基準は、たとえば、ケラチンである。ただし、ＮＭＦを共に構成する分子化合物群に属さない、角質層に共通の他の成分を好適な内部基準として用いても構わない。
【００５８】
振動スペクトル、具体的にはラマンスペクトルは、振動スペクトルから角質層内のＮＭＦ量を算出するようにプログラムされたパーソナルコンピューターを用いてリアルタイムで自動解析することができる。これを用いれば、解析結果をすぐに利用できる。別の実施形態では、振動スペクトルを保管して後で解析する。
【００５９】
好ましくは、インビボで皮膚の振動スペクトルを直接記録してＮＭＦ量を判定する。ただし、エキソビボで個体から採取した角質層サンプルの振動スペクトルを記録してＮＭＦ量を判定してもよい。
【００６０】
本発明の特別な実施形態では、皮膚の表面までの距離に応じて振動スペクトルを測定することで局所のＮＭＦ量を判定する。こうすれば、いわゆるＮＭＦの深さプロファイルが得られる。
【００６１】
別の実施形態では、所定の身体部位の皮膚表面から最適な一定距離離れたところ、好ましくは角質層の中心部の振動スペクトルを測定して皮膚内のＮＭＦ量を判定する。母指球の角質層の振動スペクトルは、皮膚表面下１〜７０μｍ、好ましくは皮膚表面下２〜５０μｍ、一層好ましくは皮膚表面下３〜３０μｍのところで測定してもよい。たとえば、前腕の手のひら側の角質層の振動スペクトルは、皮膚表面下１〜１０μｍ、好ましくは皮膚表面下２〜８μｍ、一層好ましくは皮膚表面下３〜６μｍで測定してもよい。
【００６２】
別の実施形態では、角質層の全層または特定の深さ距離における平均ＮＭＦ量として角質層内のＮＭＦ量全体を判定する。ＮＭＦ量は、皮膚表面下のいくつもの距離で、たとえば、皮膚下の３つの距離で測定してもよい。母指球について測定する場合、好ましくは皮膚表面下約３０、４０および５０μｍでＮＭＦ量を測定する。前腕内側について測定する場合、好ましくは皮膚表面下約４、６および８μｍでＮＭＦ量を測定する。その後、様々な深さで測定したＮＭＦ量を平均すればＮＭＦ量の単一値を得ることができる。
【００６３】
別の実施形態では、角質層の全層または層の一部における平均ＮＭＦ量として角質層内のＮＭＦ量全体を測定する。ラマン機器は、角質層の全層または層の一部として大きさ、軸方向寸法ごとに同じ深さ分解能を持つことができる。振動スペクトルは、所定の身体部位の皮膚表面から最適な一定距離離れたところ、好ましくは角質層（ｓｔｒａｔｕｍ）の中心部から測定することができる。このため、角質層の全層または層の一部の振動スペクトルは、１回の測定で測定することができる。
【００６４】
別の実施形態では、本方法を用いて、異常なＮＭＦ量と関連する皮膚状態、たとえば、アトピー性皮膚炎の処置を受けている患者の角質層内のＮＭＦ量における変化または変化のないことをモニターする。こうした実施形態では、本方法は、処置の有効性に直接関係する臨床情報を提供する。
【００６５】
個体の角質層からは１個または複数個の振動スペクトルを測定することができる。複数個のスペクトル、たとえば、少なくとも２個のスペクトル、好ましくは少なくとも５個のスペクトル、一層好ましくは少なくとも１０個のスペクトルを測定することが好ましい。ＮＭＦ量の生物学的な横方向の変化を平均するため、若干異なる部位でＮＭＦ量の測定を数回（２〜１０回など）繰り返してもよい。若干異なる部位は、たとえば、０．０５〜１ｍｍ、好ましくは０．１〜０．７５ｍｍ、一層好ましくは０．２〜０．５ｍｍにわたって平行移動させてもよい。
【００６６】
特に好ましい実施形態では、個体の母指球の振動スペクトルを記録する。振動スペクトルを得るのに好ましい別の部位としては、個体の前腕の手のひら側がある。ただし、原則として、個体の体表であれば他のどのような部分の振動スペクトルを記録してもよい。
【００６７】
好ましくは、振動スペクトルはラマン分光により測定する。特別な実施形態では、キャスパースらが記載したようなインビボ共焦点ラマンマイクロスペクトロメーターを用いて振動スペクトルを記録してもよい。［キャスパースら著、バイオスペクトロスコピー（Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、１９９８年、第４巻、ｐ．３１−３９およびキャスパースら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００１年、第１１６巻、ｐ．４３４−４４２］インビボ共焦点ラマンマイクロスペクトロメーターの別の例として、モデル３５１０皮膚組成物アナライザー（Ｓｋｉｎ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ）（リバーダイアグノスティックス（Ｒｉｖｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ロッテルダム、オランダ）がある。しかしながら、本発明の方法を実施するには、単純なラマンスペクトロメーターも好適である。
【００６８】
単純かつ安価な実施形態では、皮膚表面から一定の距離のところにレーザー光を集光させる。厚さが１００μｍ程度の比較的厚い母指球の角質層の場合、この一定距離は、皮膚表面下１〜７０μｍ、好ましくは２〜５０μｍ、一層好ましくは３〜３０μｍであってもよい。前腕の手のひら側など１２〜２５μｍの比較的薄いの角質層の場合、一定距離は、１〜１０μｍ、好ましくは２〜８μｍ、一層好ましくは３〜６μｍであってもよい。この距離であれば、モデル３５１０皮膚組成物アナライザー（リバーダイアグノスティックス）などの市販されている共焦点システムの一部である正確なダイナミックフォーカス装置は必要ない。こうした正確なダイナミックフォーカス装置を用いると、本発明による方法を実施するための機器費用が必要以上にかさむことになる。
【００６９】
ラマンスペクトロメーターは高い空間分解能を備えている必要はない。実際のところ、中程度または低い空間分解能でも、１回の測定で、たとえば、角質層の比較的大きな部分１個からシグナルを集められるため有用である場合がある。したがって、光の照射および検出の経路には、比較的簡便で割安な光学的要素を用いてもよい。
【００７０】
さらに、スペクトル分解能が低くてもラマンスペクトルの複数の選択部分を検出し、正常なＮＭＦ量と異常なＮＭＦ量を識別するのに十分な情報を与えるラマンスペクトロメーターを用いて構わない。ＮＭＦのシグナルの関与は主に３つのスペクトル窓８００〜９００ｃｍ−１、１２８０〜１４８０ｃｍ−１および１６４０〜１６６０ｃｍ−１で起こる。図４を参照されたい。好ましい実施形態では、前述のスペクトル領域の１つまたは複数からＮＭＦのラマンシグナルを記録し、重複しないあるいは部分的に重複するスペクトル領域から内部標準のラマンスペクトルを記録する。図５を参照されたい。
【００７１】
市販されているラマン皮膚アナライザーを用いても構わない。たとえば、モデル３５１０皮膚組成物アナライザー（リバーダイアグノスティックス）を用いてもよい。このシステムは、皮膚の分子組成を迅速かつ非侵襲的に解析できるように設計されている。この装置を用いれば、皮膚表面下の一定範囲の深さで皮膚のラマンスペクトルを測定することができ、したがって、皮膚表面までの距離に応じて皮膚内の分子濃度または量の定量的および半定量的解析が可能になる。
【００７２】
本発明の方法により、個々の個体がある種の職業（美容師またはコックなど）または活動に不適であるか、または少なくとも好適とは言い難いかどうかを判定することができる。
【００７３】
さらに、本発明の方法により、天然保湿因子の量に応じて機能喪失型突然変異を分類することで、個体のフィラグリン遺伝子におけるホモ接合機能喪失型突然変異とヘテロ接合機能喪失型突然変異とを区別することもできる。角質層内の検出可能なＮＭＦ量がある程度少なければ、フィラグリン突然変異のヘテロ接合キャリアであることが示唆されるのに対し、角質層内に検出可能なＮＭＦがほぼ完全に存在しなければ、フィラグリン突然変異のホモ接合キャリアであることが示唆される。
【００７４】
別の実施形態では、本方法を用いて、皮膚疾患の処置を受ける患者に対してある種の療法または処置が所望の効果を上げられるかどうかを予測する。皮膚疾患はＡＤもしくは乾癬または別の皮膚疾患であってもよい。この実施形態では、処置の結果が角質層内のＮＭＦの相対量と相関しており、角質層内のＮＭＦの相対量を処置または療法の作用の予測マーカーとして用いる。
【００７５】
この実施形態では、第１のステップにおいて、処置を受ける何人かの患者の角質層内のＮＭＦ量を本方法を用いて判定し、処置を受ける患者の角質層内のＮＭＦ量と処置の作用との相関関係を判定する。
【００７６】
第２のステップでは、患者の角質層内のＮＭＦ量を判定し、第１のステップで確認された相関関係と併用して、患者の処置が成功する可能性を予測する。
【００７７】
任意の第３のステップでは、利用できる可能性があるいくつかの処置または療法の予測結果を比較することで、第１および第２のステップで可能な処置および療法の評価をある種の療法または処置の選択を導く手段として用いる。
【００７８】
別の実施形態では、本方法を用いてある種のパーソナル（皮膚）ケア製品の使用効果を予測する。この実施形態では、パーソナル（皮膚）ケア製品の使用の結果が角質層内のＮＭＦ相対量と相関しており、角質層内のＮＭＦ相対量をパーソナル（皮膚）ケア製品の使用効果の予測マーカーとして用いる。
【００７９】
この実施形態では、第１のステップにおいて、パーソナル（皮膚）ケア製品を使用する何人かの被検体の角質層内のＮＭＦ量を本方法を用いて判定し、製品使用前の角質層内のＮＭＦ量と前記パーソナル（皮膚）ケア製品による効果との相関関係を判定する。
【００８０】
第２のステップでは、被検体の角質層内のＮＭＦ量を判定し、第１のステップで確認された相関関係と併用して、パーソナル（皮膚）ケア製品の使用効果を予測する。
【００８１】
任意の第３のステップでは、いくつかのパーソナルケア製品の予測結果と比較することで、第１および第２のステップで可能な処置および療法の評価をある種のパーソナルケア製品の選択を導く手段として用いる。
【００８２】
別の実施形態では、本方法を用いてある種の環境条件、化学製品または他の事項に対する人の曝露の影響を予測する。この実施形態では、そうした曝露の結果が角質層内のＮＭＦ相対量と相関しており、角質層内のＮＭＦ相対量を曝露の影響の予測マーカーとして用いる。
【００８３】
この実施形態では、第１のステップにおいて、ある種の環境条件（単数または複数）、化学製品または他の事項に曝露される何人かの被検体の角質層内のＮＭＦ量を本方法を用いて判定し、曝露前の角質層内のＮＭＦ量と曝露の影響との相関関係を判定する。
【００８４】
第２のステップでは、被検体の角質層内のＮＭＦ量を判定し、第１のステップで確認された相関関係と併用して、ある種の環境条件（単数または複数）、化学製品または他の事項に対する曝露の影響を予測する。
【００８５】
任意の第３のステップでは、特定の種類の曝露の回避など、曝露に関する助言を与える手段として第１および第２のステップで可能な曝露の評価を用いる。
【００８６】
さらなる態様では、本発明は、アトピー性皮膚炎に罹患している個体を処置する方法であって、その個体に、上記のようなフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性があるかどうかを判定すること、および前記判定結果に基づき療法を調整することを含む、方法を対象とする。療法については、たとえば、より明確に皮膚バリア障害を標的にすることで調整してもよく、抗ヒスタミン剤の経口投与、エモリエントの局部投与、ドキセピンの局部投与、コルチコステロイドの局部投与、ヒドロコルチゾンの局部投与、免疫調節剤および／または紫外線療法薬の局部投与を含んでもよい。
【００８７】
本発明の方法は、魅力的で比較的安価なスクリーニング方法である。このスクリーニングの結果に基づき、追加の（より高価な）スクリーニングまたは診断が必要かどうかを判定することができる。
【実施例】
【００８８】
フィラグリン遺伝子に既知の機能喪失型突然変異を持たない個体７例、およびフィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子に既知の機能喪失型突然変異Ｒ５０１Ｘあるいは２２８２ｄｅｌ４のどちらかを持つ個体６例からなる一連の個体について測定を行った。
【００８９】
ラマン測定では、インビボ共焦点ラマンマイクロスペクトロメーター、モデル３５１０皮膚組成物アナライザーを用いた。各個体に、測定ステージに設置した溶融石英ウインドウに目的の皮膚部分を置いてもらった。ウインドウの下にある顕微鏡対物レンズでレーザー光を皮膚に集光した。皮膚表面までのレーザーの焦点距離を機器制御ソフトウェア（ＲｉｖｅｒＩＣｏｎ、リバーダイアグノスティックス）で調節した。開始ポイントと終了ポイントを決めてステップサイズが大きくなるように設定してから、ソフトウェアにより、皮膚表面まで一定範囲の距離の皮膚内で記録した一連のラマンスペクトルからなる深さプロファイルを自動記録した。
【００９０】
個体の前腕の手のひら側および母指球についてラマン測定を行った。７８５ｎｍのレーザー光を皮膚に集光し、本明細書で「フィンガープリント領域」と定義する４００〜１８００ｃｍ−１のスペクトル領域でラマンスペクトルを記録した。腕で記録した深さの範囲は０〜２０μｍ、ステップを４μｍとした。母指球で記録した深さの範囲は３０〜５０μｍ、ステップを１０μｍとした。腕および母指球での測定を個体ごとに１０回繰り返し、その間、正確な測定部位を５０〜５００μｍ程度平行移動させて若干変えた。
【００９１】
モデル３５１０皮膚組成物アナライザーの内部較正標準および機器制御ソフトウェアＲｉｖｅｒＩＣｏｎ（リバーダイアグノスティックス）により、スペクトルの波数軸のキャリブレーションを行った。また、このソフトウェアは、機器の波数依存性シグナルの検出効率の補正にも使用した。
【００９２】
皮膚解析ソフトウェアスキンツールズ（ＳｋｉｎＴｏｏｌｓ）２．０（リバーダイアグノスティックス）を用いて、フィンガープリント領域で測定した各ラマンスペクトルからＮＭＦ量を判定した。このソフトウェアによる解析方法は、キャスパースらによりジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００１年、第１１６巻、ｐ．４３４−４４２に記載されている。この解析方法には古典的な最小二乗フィッティングステップが含まれており、主な皮膚成分の基準スペクトル１セットをそれぞれ腕または手掌のラマンスペクトルにフィッティングさせる。フィッティング係数は、角質層内の乾燥質量分率が圧倒的であるケラチンのスペクトルのフィッティング係数で割った商である。この正規化ステップにより、レーザーの焦点位置から皮膚表面までの距離と共に減少する絶対ラマン強度のばらつきを補正する。解析方法の結果はＮＭＦの相対量の指標であり、ＮＭＦとケラチンとの比として任意単位で表す。
【００９３】
皮膚表面下３０〜５０μｍから測定したＮＭＦ相対量の数値平均を算出して、個体ごとに母指球の角質層内の平均ＮＭＦ量を判定した。
【００９４】
皮膚表面下４μｍで測定したＮＭＦ相対量から、個体ごとに腕の角質層内の平均ＮＭＦ量を判定した。
【００９５】
フィラグリン突然変異を持つ個体の腕および母指球で認められたＮＭＦ量は、フィラグリン突然変異を持たない対照群の腕および母指球よりも著しく少ないことが明らかになった。これを図６〜図１１に示す。
【００９６】
ＮＭＦ量には生物学的に大きなばらつきがあることが報告されてきたが、実施例に示すように、本発明を用いれば測定プロトコルを設計できるため、ある種の皮膚状態になりやすい、フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持っている可能性がある個体を確実に特定することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィラグリンをコードする遺伝子において１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を非侵襲的に測定する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
皮膚科の主要な問題にアトピー性皮膚炎（ＡＤ：ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）がある。先進国におけるアトピー性皮膚炎の有病率は１５％〜２０％に及ぶと推定される。［ロール（Ｒｏｌｌ）ら著、カレントオピニオンインアレルギーアンドクリニカルイムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２００４年、第４巻（５）、ｐ．３７３−３７８］アトピー性皮膚炎は、ヘルスケア全体の大きな負担になっている。
【０００３】
皮膚は、真皮および表皮の２層に分けられる。表皮の最外層である角質層は、水分の喪失および有害物質の侵入から体を保護する主要なバリアである。アトピー性皮膚炎は、バリア機能障害が主要事象である可能性が高い。
【０００４】
アトピー性皮膚炎は、皮膚の痒み、炎症を特徴とするありふれた慢性炎症性皮膚疾患である。［ロールら著、カレントオピニオンインアレルギーアンドクリニカルイムノロジー、２００４年、第４巻（５）、ｐ．３７３−３７８およびステムラー（Ｓｔｅｍｍｌｅｒ）ら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）２００７年、第１２７巻、ｐ．７２２−７２４］また、アトピー性皮膚炎の素因がある人は、美容業および料理業などのある種の職業に携われない恐れがあることもよく知られている。
【０００５】
現在では、低年齢児のアトピー性皮膚炎の発症素因を早期に検出し、皮膚バリアの標的処置を行えば、その後のアトピー症候群の発症を予防できると考えられている。
【０００６】
タンパク質フィラグリンは、皮膚バリアの形成および維持に決定的に重要である。このタンパク質は、ケラチン繊維が安定なマクロ構造をとるのに必須であり、かつ天然保湿因子（ＮＭＦ：ｎａｔｕｒａｌ ｍｏｉｓｔｕｒｉｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）の産生のためのアミノ酸を与える。
【０００７】
アトピー性皮膚炎には、フィラグリンをコードする遺伝子における機能喪失型突然変異が関係していると考えられてきた。［ロールら著、カレントオピニオンインアレルギーアンドクリニカルイムノロジー、２００４年、第４巻（５）、ｐ．３７３−３７８；ステムラーら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００７年、第１２７巻、ｐ．７２２−７２４；サンディランズ（Ｓａｎｄｉｌａｎｄｓ）ら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００６年、第１２６巻、ｐ．１７７０−１７７５；サンディランズら著、ネイチャージェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、２００６年、第３８巻、ｐ．３３７−３４２；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら著、ネイチャージェネティクス、２００７年、第３９巻、ｐ．６５０−６５４］フィラグリンの産生能が部分的または完全に喪失すると、バリア機能障害が起こる。そのため、体はアレルゲン曝露を受けやすくなり、結果としてアトピー性皮膚炎が起こる恐れがある。フィラグリン遺伝子における機能喪失型突然変異は、先進国の主要問題であると同時に深刻化する問題であるアトピー性皮膚炎および喘息の強い素因である。［サンディランズら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００６年、第１２６巻、ｐ．１７７０−１７７５；サンディランズら著、ネイチャージェネティクス、２００６年、第３８巻、ｐ．３３７−３４２；スミスら著、ネイチャージェネティクス、２００７年、第３９巻、ｐ．６５０−６５４；およびアービン（Ｉｒｖｉｎｅ）ら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００６年、第１２６巻、ｐ．１２００−１２０２］ただし、フィラグリン遺伝子おける機能喪失型突然変異とアトピー性皮膚炎とに相関関係はあるものの、直接的な関係は認められない。遺伝子突然変異を持たない人がアトピー性皮膚炎を発症する場合もあり、遺伝子突然変異を持つ人が必ずしもアトピー性皮膚炎であるとは限らない。
【０００８】
欧州系の人は約１０％がフィラグリン遺伝子の突然変異を持っている。［サンディランズら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００６年、第１２６巻、ｐ．１７７０−１７７５］フィラグリン遺伝子のホモ接合型変異は、フィラグリンの産生能の完全な喪失を示す。
【０００９】
フィラグリン遺伝子の突然変異を判定する既知の方法は、特殊な遺伝子型判定法を用いる。たとえば、米国特許出願公開第２００３／０１２４５５３号を参照されたい。フィラグリンをコードする遺伝子に特異的な突然変異を検出するには、特定の生化学的分析が必要である。遺伝子型判定法では、複数サイクルのＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）増幅およびシーケンシングを行い、フィラグリンをコードするＤＮＡを単離し、増幅する必要がある。次いで特定の遺伝子型判定アッセイにより各フィラグリン突然変異を解析する。こうしたアッセイの大部分は市販されておらず、フィラグリン遺伝子突然変異を研究している研究機関の中には、独自にアッセイを開発してきたところもある。サンディランズら著、ネイチャージェネティクス、２００６年、第３８巻、ｐ．３３７−３４２にはフィラグリン突然変異の１５種の変異体の解析が記載されている。こうした遺伝子型判定方法は費用と時間がかかるうえ、非常に特殊な研究施設および人員を必要とする。遺伝子型判定方法は、集団スクリーニングの目的には不適である。
【００１０】
したがって、フィラグリン遺伝子に機能喪失型突然変異が存在する可能性を集団スクリーニングする短時間で簡便な方法が求められている。
【００１１】
さらに、疾患を正しく診断し、適切な処置を選択するため、アトピー性皮膚炎患者にフィラグリン遺伝子における機能喪失型突然変異が存在するかどうかを判定する短時間で簡便な方法も求められている。
【００１２】
インビボでの角質層のラマン分光測定によって、その主な供給源がタンパク質フィラグリンであり天然保湿因子（ＮＭＦ）と総称される、アミノ酸とアミノ酸誘導体との複合体の相対濃度を判定することができる。フィラグリンは角質層の底部の狭い領域に存在し、そこで酵素分解されＮＭＦになる。［スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら著、バイオケミカエトバイオフィジカアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）、１９８２年、第７１９巻（１）、ｐ．１１０−１１７およびローリングス（Ｒａｗｌｉｎｇｓ）ら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、１９９４年、第１０３巻、ｐ．７３１−７４１］このため、フィラグリンをコードする遺伝子における機能喪失型突然変異は、皮膚内のＮＭＦ量に関与している。しかしながら、皮膚内のＮＭＦ量は他の多くの要因によって決まるものであり、機能喪失型遺伝子突然変異よりもはるかに大きな影響を与えるものもある。
【００１３】
したがって、フィラグリン遺伝子に機能喪失型突然変異があると、皮膚内のＮＭＦ量が減少する場合があるけれども、その逆はまず起こらない。一方、ＮＭＦ量が異常に少なくても遺伝子突然変異が原因とは限らない。遺伝子転写およびプロフィラグリン産生のプロセス、フィラグリンへの酵素的プロセシング、およびその後のフィラグリンからＮＭＦへの酵素／タンパク質分解は多くの要因の影響を受けるためである。とりわけ、このことが原因で、同じ機能的プロフィラグリン遺伝子が至るところに存在するにもかかわらず、ＮＭＦ量は身体の部位によって大きく異なる。さらに、ＮＭＦ量は年齢、入浴、石鹸による洗浄および環境などの要因にも影響される。これは、たとえば、フィラグリン（本質的にフィラグリン遺伝子がコードするタンパク質であるプロフィラグリンの酵素的プロセシングの産物）の酵素およびタンパク質分解によるＮＭＦ生成のプロセスについて記載しているローリングスら［ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、１９９４年、第１０３巻、ｐ．７３１−７４１］により説明されている。ローリングスらは、病状とＮＭＦの欠損との相関関係、およびＮＭＦの産生能の欠如が、単純な乾燥症から重度の乾癬に至る皮膚の病に関与する重要なメカニズムである可能性があることを記載している。また、ローリングスらは、洗浄により表面の角質層からＮＭＦの大部分が流れ出ることについても言及している。さらに、合成活性の低下に起因して、角質層のＮＭＦ量が加齢に伴い２分の１以上と大きく減少することも指摘している。加えて、フィラグリンからＮＭＦへの変換は水分活性に左右され、角質層が、曝される環境条件に合わせてこのプロセスを調整していることも述べている。ＮＭＦ量は、臨床的に正常な皮膚を持つ個体間で大きく異なることが明らかになっている。身体の部位との関連で変化するのと同様に、年齢および季節的要因に応じて変化することも明らかにされている。［ファンデルポール（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌ）ら著、アブストラクトＩＦＳＣＣミーティング（Ａｂｓｔｒａｃｔ ＩＦＳＣＣ ｍｅｅｔｉｎｇ）、アムステルダム、オランダ、２００７年９月２４〜２７日およびファンデルポールら著、アブストラクトＩＳＢＳナショナルミーティング（Ａｂｓｔｒａｃｔ ＩＳＢＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ）、ストーンマウンテン（Ｓｔｏｎｅ Ｍｏｕｎｔａｉｎ）ＧＡ、米国、２００６年１０月１２〜１４日］。
【００１４】
また、アトピー性皮膚炎の観点から記載されてきた異常な落屑などの作用が、皮膚内のＮＭＦ量にどの程度影響を与えるかは不明である。
【００１５】
皮膚状態の処置の有効性の臨床徴候が観察できるようになるには、処置の開始からしばらく経ってからであることも珍しくない。たとえば、ラプティバ（Ｒａｐｔｉｖａ）（登録商標）（エファリズマブ、メルクセローノインターナショナル（Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）Ｓ．Ａ．、ジュネーブ、スイス）を用いた乾癬処置のオランダのガイドラインによれば、処置を１２週間継続してから処置の継続または中止を臨床医が決定する。一方で、臨床的改善は、根底にある分子的変化に遅行する。このため、ＮＭＦ量の変化などの分子的変化をモニターする方法を用いれば、従来の臨床評価よりもかなり速く皮膚処置の有効性を判定できると考えられる。
【００１６】
本発明は、被検体、特にヒト被験者においてフィラグリン遺伝子の１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を迅速かつ非侵襲的に測定する方法および器具を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明はさらに、フィラグリン遺伝子におけるホモ接合機能喪失型突然変異とヘテロ接合機能喪失型突然変異とを識別する迅速かつ客観的な方法を提供することを目的とする。
【００１８】
本発明はさらに、局部塗布した生成物の浸透性および／または作用の判定に関する試験に好適な個体の集団を構成するための迅速かつ客観的な方法を提供すること、すなわち、各個体を試験群に含めるか、除外するかの客観的な指標を提供することを目的とする。
【００１９】
本発明はさらに、職業性の皮膚病を発症するリスクが高いため、ある種の職業または活動に個体が不適であるか、あるいは少なくとも好適とは言い難いかどうかを判定する客観的方法を提供することを目的とする。
【００２０】
本発明はさらに、フィラグリン遺伝子における１つまたは複数の機能喪失型突然変異に関連する皮膚状態の素因を低年齢児が持つかどうかを判定し、それにより予防処置による介入を早期実施できるようにし、および／または追加の診断検査を患者に指示するための集団スクリーニングを容易にする客観的方法を提供することを目的とする。
【００２１】
本発明はさらに、アトピー性皮膚炎に罹患している個体がフィラグリンの欠損が原因で皮膚バリアに障害があるかどうかを判定し、それに合わせて療法を調整する客観的方法を提供することを目的とする。
【００２２】
本発明はさらに、アトピー性皮膚炎の治療処置の有効性を判定する客観的方法を提供することを目的とする。
【００２３】
本発明はさらに、改善の臨床徴候が認められる前にアトピー性皮膚炎の治療処置の有効性を判定する客観的方法を提供することを目的とする。
【００２４】
本発明はさらに、皮膚疾患の療法または処置の結果を予測する迅速かつ客観的な方法を提供することを目的とする。
【００２５】
本発明はさらに、パーソナルケア製品による皮膚処置の作用を予測する迅速かつ客観的な方法を提供することを目的とする。
【００２６】
本発明はさらに、皮膚疾患の適切な処置または療法を選択する指針となる迅速かつ客観的な方法を提供することを目的とする。
【００２７】
本発明はさらに、皮膚ケア用のパーソナルケア製品の選択の指針となる迅速かつ客観的な方法を提供することを目的とする。
【００２８】
本発明はさらに、ある種の環境条件、化学製品およびその他の事項に対する皮膚曝露の影響を予測する迅速かつ客観的な方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２９】
第１の態様では、本発明は、個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を非侵襲的に測定する方法であって、
（ｉ）個体の角質層から振動スペクトルを得ること；
（ｉｉ）得られた振動スペクトルから局所の天然保湿因子の量を判定すること；
（ｉｉｉ）任意にステップ（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すこと；および
（ｉｖ）個体の局所の天然保湿因子の量を基準値と比較すること
を含み、前記角質層は、フィラグリンをコードする遺伝子の前記１つまたは複数の機能喪失型突然変異が、天然保湿因子の濃度に影響を与える他の要素よりも天然保湿因子の濃度に強い影響を与える、前記個体の身体部位の角質層である、測定法を対象とする。
【００３０】
さらに、本発明は、個体のフィラグリン遺伝子におけるホモ接合機能喪失型突然変異とヘテロ接合機能喪失型突然変異を区別する方法であって、天然保湿因子の量に応じて機能喪失型突然変異を分類することを含む、方法を対象とする。
【００３１】
さらに、本発明は、皮膚疾患の処置を受けている個体の療法または処置が所望の効果を上げる可能性があるかどうかを予測する方法であって、
− 本発明に記載の方法により前記皮膚疾患の処置を受けている一群の個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を判定すること；
− 一群の個体の角質層における天然保湿因子の量と処置の効果との相関関係を判定すること；
− 前記個体の角質層の天然保湿因子の量を判定すること；
− 前記相関関係により前記個体の前記療法または処置が有効であるかどうかを予測すること
を含む、方法を対象とする。
【００３２】
本発明はさらに、個体による皮膚のパーソナルケア製品の使用効果を予測する方法であって、
− 本発明に記載の方法により前記皮膚のパーソナルケア製品を使用している一群の個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を判定すること；
− 前記群の個体の角質層における天然保湿因子の量と前記皮膚のパーソナルケア製品の使用効果との相関関係を判定すること；
− 前記個体の角質層の天然保湿因子の量を判定すること；
− 前記相関関係を用いて前記個体による前記皮膚のパーソナルケア製品の使用効果を予測すること
を含む、方法も対象とする。
【００３３】
さらに、本発明は、環境条件、化学製品または他の事項に対する個体の曝露の影響を予測する方法であって、
− 本発明に記載の方法を用いて、前記環境条件、化学製品または他の事項に曝露される一群の個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を判定すること；
− 一群の個体の角質層における天然保湿因子の量と曝露の影響との相関関係を判定すること；
− 前記個体の角質層の天然保湿因子の量を判定すること；
− 前記相関関係を用いて前記環境条件、化学製品または他の事項に対する前記個体の曝露の影響を予測すること
を含む、方法を対象とする。
【００３４】
さらに、本発明は、アトピー性皮膚炎に罹患している個体を処置する方法であって、フィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異がその個体に存在する可能性があるかどうかを判定すること、および前記判定結果に基づき療法を調整することを含む、方法を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】フィラグリン突然変異を持たない個体の腕の角質層のラマンスペクトルである。黒の領域（番号１および２）はＮＭＦのラマンバンドを示す。灰色の部分（番号３）は角質層組織のラマンバンドを示す。
【図２】フィラグリン突然変異を持つ個体の腕の角質層のラマンスペクトルである。黒の領域（番号１および２）はＮＭＦのラマンバンドを示す。灰色の部分（番号３）は、角質層組織のラマンバンドを示す。
【図３】振動シグナルからＮＭＦ量を判定する一方法を図示する、角質層のラマンスペクトルである。
【図４】天然保湿因子のラマンスペクトルである。
【図５】ヒト皮膚のラマンスペクトルである。
【図６】フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない個体の天然保湿因子の皮膚の深さプロファイルである
【図７】フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持つ個体の天然保湿因子の皮膚の深さプロファイルである。
【図８】フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない個体の腕における天然保湿因子の相対量を示す。破線はＮＭＦ量の中央値を示す。
【図９】フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持つ個体の腕における天然保湿因子の相対量を示す。破線は、フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない個体の腕におけるＮＭＦ量の中央値を示す。
【図１０】フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない個体の母指球における天然保湿因子の相対量を示す。破線はＮＭＦ量の中央値を示す。
【図１１】フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持つ個体の母指球における天然保湿因子の相対量を示す。破線は、フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない個体の母指球におけるＮＭＦ量の中央値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
「振動分光」という語は、本明細書で使用する場合、分子の振動モードおよび／または回転モードの解析が可能な任意の分光学的手法と定義する。
【００３７】
「ラマン分光」という語は、本明細書で使用する場合、ある系において振動モードおよび／または回転モードの調査に用いる分光学的手法と定義し、通常、可視、近赤外または近紫外領域のレーザーからの単色光の非弾性散乱（ラマン散乱とも呼ばれる）を利用する。入射レーザー光は系の振動エネルギーおよび／または回転エネルギーの量を増減させ、その結果、レーザーの光子エネルギーが変化する場合がある。このレーザーの光子エネルギーの変化によりスペクトルシフトが起こり、系の振動モードおよび／または回転モードに関する情報が得られる。一般に、レーザービームをサンプルに照射する。照射スポットからの光はレンズで集光され、スペクトロメーターを通して送られる。（弾性レイリー散乱による）レーザー線に近い波長は除外され、レーザー線から離れた一定のスペクトル窓の波長が検出器に分散される。
【００３８】
ラマンスペクトルは、入射光に照射されたときに目的分子から放射される、非常に狭い一連のスペクトル線である。各スペクトル線の幅は入射光のスペクトル幅に強く影響されるため、レーザーなどの単色性に優れた光源を使用する。各ラマン線の波長は、ラマン線と入射光との波数の差である、入射光に対する波数シフトで表す。絶対波数でないラマン線の波数シフトは、分子内の特定の原子団に特有である。ラマンスペクトルは、分子構造により、特にメチレン、エチレン、アミド、ホスファートまたはスルフィドなどの原子団により決定されるその分子の振動モードおよび／または回転モードを測定する。
【００３９】
生物学におけるラマン分光は、巨大分子または関連する小分子の振動モードおよび／または回転モードの変化に関係して使用されるのが大部分である。原子団における１本のラマン線の波数シフトの変化あるいは２本以上のラマン線の相対強度の変化は、巨大分子における立体構造変化を示すと解釈されている。このため、ラマン分光は主に、生物学において分子および分子動力学の定性試験に使用されている。ラマンスペクトルを容易かつ明確に解釈するため、この手法の使用は主として精製材料およびその酵素反応などの系に限定されてきた。しかしながら、ラマンスペクトルは原子団に特有の振動および／または回転に基礎を置いているため、フィンガープリンティングと同様の方法により分子の混合物を原子団の組成物として特徴付けを行い、定量するために使用することもできる。ラマンスペクトルはサンプルの組成を化学物質のリストとして完全に決定することはできないが、一方で、最も多く含まれる分子種であれば、自然環境における分子組成および経時的変化の概略を与える。
【００４０】
「局所の天然保湿因子の量」という語は、本明細書で使用する場合、前腕の手のひら側または母指球（手のひら）など、身体の所定の部位における角質層内、および皮膚表面下の所定距離の角質層内のＮＭＦ量またはＮＭＦ濃度と定義する。
【００４１】
本発明は、多くの要因が皮膚の角質層（ｃｏｒｎｅｕｍ ｓｔｒａｔｕｍ）内のＮＭＦ量のＮＭＦ濃度に影響を与えており、したがって、ＮＭＦ量に対する機能喪失型遺伝子突然変異の作用は顕在化しないものの、プロフィラグリン（ｐｒｏｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の機能喪失型突然変異以外の要因およびプロセスによりＮＭＦ濃度が比較的影響を受けない部位が個体の身体に存在するとの知見に基づく。この知見によれば、好適な測定手法を選択すれば、個体がフィラグリン遺伝子における機能喪失型突然変異を持っていることにより、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎などに対するリスクが高いという信頼できる診断が得られる。フィラグリン産生に障害があると、個体の角質層内のＮＭＦが正常濃度よりも低くなることが明らかになっているが、これを振動分光により検出することができる。これまでに遺伝子突然変異の存在を判定する方法としてＮＭＦ濃度を用いることは示唆されたことがなかったが、驚くべきことにこれが可能になりそうである。
【００４２】
フィラグリン遺伝子における１つまたは複数の機能喪失型突然変異が、ＮＭＦ濃度に影響を与える他の要因よりもＮＭＦ濃度に対して強い影響を及ぼす個体の身体部位は、以下のように発見することができる。
【００４３】
試験用身体部位の選択後、フィラグリン遺伝子の既知の機能喪失型突然変異を持つ一群の１例または複数例の個体の試験用身体部位の角質層から振動スペクトルを得て、振動スペクトルの解析により試験用身体部位の天然保湿因子の量を判定する。さらに、フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない一群の１例または複数例の個体の試験用身体部位の角質層から振動スペクトルを得る。やはり、振動スペクトルの解析により試験用身体部位の天然保湿因子の量を判定する。最後に、フィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の既知の機能喪失型突然変異を持つ一群の個体における試験用身体部位の角質層内の天然保湿因子の量が、フィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない一群の個体よりも少ないかどうかを評価して、試験用身体部位のフィラグリンをコードする遺伝子の機能喪失型突然変異が、天然保湿因子の濃度に影響を与える他の要因よりも天然保湿因子の濃度に対して強い影響を及ぼすかどうかを判定する。フィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の既知の機能喪失型突然変異を持つ一群の個体およびフィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない一群の個体はそれぞれ、好ましくは少なくとも６例の個体、一層好ましくは少なくとも１２例の個体を含む。
【００４４】
本発明の方法を用いれば、角質層内の検出可能なＮＭＦ量がある程度少ない可能性がある、フィラグリン突然変異のヘテロ接合キャリアと、角質層内の検出可能なＮＭＦがほぼ完全に存在しない可能性がある、フィラグリン突然変異のホモ接合キャリアとを区別できる。
【００４５】
本発明の方法によれば、個体の角質層の振動スペクトルまたはその選択部分を測定する。振動スペクトルは、任意の振動分光手法を用いて測定することができる。好ましい分光法はラマン分光法である。他の分光法として、たとえば、ボーマナン（Ｂｏｍｍａｎｎａｎ）ら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、１９９０年、第９５巻（４）、ｐ．４０３−４０８に記載されているような近赤外分光法、フーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ：Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ）分光法または減衰全反射（ＡＴＲ：ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｏｔａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）赤外分光法などの赤外分光法が挙げられる。
【００４６】
振動スペクトルは、サンプルの分子組成を表す。以下のやり方のいずれかで振動スペクトルから角質層内のＮＭＦ量を測定することができる。
【００４７】
一実施形態では、内部基準の振動シグナルの強度に対するＮＭＦの振動シグナルの強度としてＮＭＦ量を測定する。好適な内部基準は、たとえば、ケラチンのシグナルである。したがって、ＮＭＦのシグナル強度とケラチンのシグナル強度との比としてＮＭＦ量を測定してもよい。ただし、ＮＭＦを共に構成する分子化合物群に属さない、皮膚に共通の他の成分を好適な内部基準として用いても構わない。たとえば、そうした内部基準は、ＮＭＦを共に構成する分子化合物の全部または大部分を除去した後の角質層組織のサンプルの振動シグナルであってもよい。角質層のサンプルからＮＭＦを抽出する方法は、キャスパース（Ｃａｓｐｅｒｓ）ら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００１年、第１１６巻、ｐ．４３４−４４２に記載されている。この論文では、ＮＭＦ量の個体間のばらつきを検出する可能性のほか、ラマン分光を用いて追加の特定を行わない、疾患のプロセスおよび処置に起因する皮膚内の分子の濃度差の研究が示唆されている。
【００４８】
シグナル強度は、ＮＭＦシグナルの関与が有力である１つまたは複数の波長幅、および内部基準シグナルの関与が有力である１つまたは複数の波長幅における振動シグナルから好適に判定することができる。次いで、ＮＭＦシグナルの関与が有力である１つまたは複数の波長幅の曲線下面積Ａ１からＮＭＦのシグナル強度を判定すればよい（図１および図２の番号１および２の領域を参照されたい）。基準シグナル強度については、内部基準からのシグナルの関与が有力である１つまたは複数の波長幅の曲線下面積Ａ２から判定すればよい（図１および図２の番号３の領域を参照されたい）。したがって、ＮＭＦ量（Ｒ）の有用な指標は、Ｒ＝Ａ１／Ａ２の比から得ることができる。
【００４９】
別の実施形態では、ＮＭＦシグナルの関与が有力である１つまたは複数の波長幅、内部基準シグナルの関与が有力である１つまたは複数の波長幅、およびほとんどあるいはまったくラマンシグナルが予測されないため、バックグラウンドのシグナル強度の推定に役立つ場合がある１つまたは（ｏｒｅ）複数のスペクトル間隔からシグナル強度を測定する。次いで図３に示すように、ＮＭＦシグナルが有力な曲線下面積Ａ３および内部基準シグナルの曲線下面積Ａ４からＮＭＦ量を判定することができる。曲線下面積については、以下の式に従って様々な波長幅で測定したシグナル強度から判定することができる。式中、Ｉｎはスペクトル間隔ｎから測定したシグナル強度、Ａｎはスペクトル間隔ｎの曲線下面積、ｘｎはスペクトル間隔ｎの中心波数、ｙｎはスペクトル間隔ｎの平均シグナル強度、およびｄｎはスペクトル間隔ｎの幅である（図３を参照）。ＮＭＦの曲線下面積Ａ３は、以下を用いて判定することができる。
【００５０】
【数１】
【００５１】
内部基準シグナルの曲線下面積Ａ４は以下を用いて判定することができる。
【００５２】
【数２】
【００５３】
ここで、以下の曲線下面積Ａ３とＡ４との比からＮＭＦ量の指標を得ることができる。
ＣＮＭＦ＝Ａ３／Ａ４
【００５４】
当業者であれば、他のシグナル強度比を用いてもＮＭＦ量の推定値が得られることを理解するであろう。本発明の方法の場合、ＮＭＦ量測定の指標がＮＭＦ量と比例関係にあることは重要ではない。たとえば、指標はＮＭＦ量と単調関係にあれば十分である。
【００５５】
好ましい実施形態では、内部基準の振動シグナルの強度に対するＮＭＦの振動シグナルの強度からＮＭＦ量を測定する。好適な内部基準は、たとえば、ケラチンである。
【００５６】
好ましい実施形態では、スペクトルフィッティングによりＮＭＦ量を判定する。皮膚の振動スペクトルまたは皮膚の振動スペクトルの大部分を含む一連の基準振動スペクトルから、皮膚の振動スペクトルに対する各基準スペクトルの寄与を判定する。相対的寄与は、基準スペクトルまたは基準スペクトルの選択したスペクトル領域を皮膚の振動スペクトルまたは皮膚の振動スペクトルの選択したスペクトル領域にフィッティングさせれば判定することができる。フィッティング係数は、各基準スペクトルの相対的寄与である。［キャスパースら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００１年、第１１６巻、ｐ．４３４−４４２］好ましくは、基準スペクトルの１つは、ＮＭＦのスペクトルである。あるいは、１個または複数個の基準スペクトルは、ＮＭＦの成分のスペクトルである。基準スペクトルのセットをインビトロで純粋な皮膚成分、純粋な皮膚成分の溶液および／または純粋な皮膚成分の集合体から集めてもよい。基準スペクトルに用いてもよい特に好ましい皮膚成分は、ケラチンである。
【００５７】
別の実施形態では、ＮＭＦの振動スペクトルまたはＮＭＦの成分のスペクトルにおける１つまたは複数のピークの強度、および内部基準のスペクトルにおける１つまたは複数のピークの強度を算出してＮＭＦ量を測定する。好適な内部基準は、たとえば、ケラチンである。ただし、ＮＭＦを共に構成する分子化合物群に属さない、角質層に共通の他の成分を好適な内部基準として用いても構わない。
【００５８】
振動スペクトル、具体的にはラマンスペクトルは、振動スペクトルから角質層内のＮＭＦ量を算出するようにプログラムされたパーソナルコンピューターを用いてリアルタイムで自動解析することができる。これを用いれば、解析結果をすぐに利用できる。別の実施形態では、振動スペクトルを保管して後で解析する。
【００５９】
好ましくは、インビボで皮膚の振動スペクトルを直接記録してＮＭＦ量を判定する。ただし、エキソビボで個体から採取した角質層サンプルの振動スペクトルを記録してＮＭＦ量を判定してもよい。
【００６０】
本発明の特別な実施形態では、皮膚の表面までの距離に応じて振動スペクトルを測定することで局所のＮＭＦ量を判定する。こうすれば、いわゆるＮＭＦの深さプロファイルが得られる。
【００６１】
別の実施形態では、所定の身体部位の皮膚表面から最適な一定距離離れたところ、好ましくは角質層の中心部の振動スペクトルを測定して皮膚内のＮＭＦ量を判定する。母指球の角質層の振動スペクトルは、皮膚表面下１〜７０μｍ、好ましくは皮膚表面下２〜５０μｍ、一層好ましくは皮膚表面下３〜３０μｍのところで測定してもよい。たとえば、前腕の手のひら側の角質層の振動スペクトルは、皮膚表面下１〜１０μｍ、好ましくは皮膚表面下２〜８μｍ、一層好ましくは皮膚表面下３〜６μｍで測定してもよい。
【００６２】
別の実施形態では、角質層の全層または特定の深さ距離における平均ＮＭＦ量として角質層内のＮＭＦ量全体を判定する。ＮＭＦ量は、皮膚表面下のいくつもの距離で、たとえば、皮膚下の３つの距離で測定してもよい。母指球について測定する場合、好ましくは皮膚表面下約３０、４０および５０μｍでＮＭＦ量を測定する。前腕内側について測定する場合、好ましくは皮膚表面下約４、６および８μｍでＮＭＦ量を測定する。その後、様々な深さで測定したＮＭＦ量を平均すればＮＭＦ量の単一値を得ることができる。
【００６３】
別の実施形態では、角質層の全層または層の一部における平均ＮＭＦ量として角質層内のＮＭＦ量全体を測定する。ラマン機器は、角質層の全層または層の一部として大きさ、軸方向寸法ごとに同じ深さ分解能を持つことができる。振動スペクトルは、所定の身体部位の皮膚表面から最適な一定距離離れたところ、好ましくは角質層（ｓｔｒａｔｕｍ）の中心部から測定することができる。このため、角質層の全層または層の一部の振動スペクトルは、１回の測定で測定することができる。
【００６４】
別の実施形態では、本方法を用いて、異常なＮＭＦ量と関連する皮膚状態、たとえば、アトピー性皮膚炎の処置を受けている患者の角質層内のＮＭＦ量における変化または変化のないことをモニターする。こうした実施形態では、本方法は、処置の有効性に直接関係する臨床情報を提供する。
【００６５】
個体の角質層からは１個または複数個の振動スペクトルを測定することができる。複数個のスペクトル、たとえば、少なくとも２個のスペクトル、好ましくは少なくとも５個のスペクトル、一層好ましくは少なくとも１０個のスペクトルを測定することが好ましい。ＮＭＦ量の生物学的な横方向の変化を平均するため、若干異なる部位でＮＭＦ量の測定を数回（２〜１０回など）繰り返してもよい。若干異なる部位は、たとえば、０．０５〜１ｍｍ、好ましくは０．１〜０．７５ｍｍ、一層好ましくは０．２〜０．５ｍｍにわたって平行移動させてもよい。
【００６６】
特に好ましい実施形態では、個体の母指球の振動スペクトルを記録する。振動スペクトルを得るのに好ましい別の部位としては、個体の前腕の手のひら側がある。ただし、原則として、個体の体表であれば他のどのような部分の振動スペクトルを記録してもよい。
【００６７】
好ましくは、振動スペクトルはラマン分光により測定する。特別な実施形態では、キャスパースらが記載したようなインビボ共焦点ラマンマイクロスペクトロメーターを用いて振動スペクトルを記録してもよい。［キャスパースら著、バイオスペクトロスコピー（Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、１９９８年、第４巻、ｐ．３１−３９およびキャスパースら著、ジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００１年、第１１６巻、ｐ．４３４−４４２］インビボ共焦点ラマンマイクロスペクトロメーターの別の例として、モデル３５１０皮膚組成物アナライザー（Ｓｋｉｎ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ）（リバーダイアグノスティックス（Ｒｉｖｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ロッテルダム、オランダ）がある。しかしながら、本発明の方法を実施するには、単純なラマンスペクトロメーターも好適である。
【００６８】
単純かつ安価な実施形態では、皮膚表面から一定の距離のところにレーザー光を集光させる。厚さが１００μｍ程度の比較的厚い母指球の角質層の場合、この一定距離は、皮膚表面下１〜７０μｍ、好ましくは２〜５０μｍ、一層好ましくは３〜３０μｍであってもよい。前腕の手のひら側など１２〜２５μｍの比較的薄いの角質層の場合、一定距離は、１〜１０μｍ、好ましくは２〜８μｍ、一層好ましくは３〜６μｍであってもよい。この距離であれば、モデル３５１０皮膚組成物アナライザー（リバーダイアグノスティックス）などの市販されている共焦点システムの一部である正確なダイナミックフォーカス装置は必要ない。こうした正確なダイナミックフォーカス装置を用いると、本発明による方法を実施するための機器費用が必要以上にかさむことになる。
【００６９】
ラマンスペクトロメーターは高い空間分解能を備えている必要はない。実際のところ、中程度または低い空間分解能でも、１回の測定で、たとえば、角質層の比較的大きな部分１個からシグナルを集められるため有用である場合がある。したがって、光の照射および検出の経路には、比較的簡便で割安な光学的要素を用いてもよい。
【００７０】
さらに、スペクトル分解能が低くてもラマンスペクトルの複数の選択部分を検出し、正常なＮＭＦ量と異常なＮＭＦ量を識別するのに十分な情報を与えるラマンスペクトロメーターを用いて構わない。ＮＭＦのシグナルの関与は主に３つのスペクトル窓８００〜９００ｃｍ−１、１２８０〜１４８０ｃｍ−１および１６４０〜１６６０ｃｍ−１で起こる。図４を参照されたい。好ましい実施形態では、前述のスペクトル領域の１つまたは複数からＮＭＦのラマンシグナルを記録し、重複しないあるいは部分的に重複するスペクトル領域から内部標準のラマンスペクトルを記録する。図５を参照されたい。
【００７１】
市販されているラマン皮膚アナライザーを用いても構わない。たとえば、モデル３５１０皮膚組成物アナライザー（リバーダイアグノスティックス）を用いてもよい。このシステムは、皮膚の分子組成を迅速かつ非侵襲的に解析できるように設計されている。この装置を用いれば、皮膚表面下の一定範囲の深さで皮膚のラマンスペクトルを測定することができ、したがって、皮膚表面までの距離に応じて皮膚内の分子濃度または量の定量的および半定量的解析が可能になる。
【００７２】
本発明の方法により、個々の個体がある種の職業（美容師またはコックなど）または活動に不適であるか、または少なくとも好適とは言い難いかどうかを判定することができる。
【００７３】
さらに、本発明の方法により、天然保湿因子の量に応じて機能喪失型突然変異を分類することで、個体のフィラグリン遺伝子におけるホモ接合機能喪失型突然変異とヘテロ接合機能喪失型突然変異とを区別することもできる。角質層内の検出可能なＮＭＦ量がある程度少なければ、フィラグリン突然変異のヘテロ接合キャリアであることが示唆されるのに対し、角質層内に検出可能なＮＭＦがほぼ完全に存在しなければ、フィラグリン突然変異のホモ接合キャリアであることが示唆される。
【００７４】
別の実施形態では、本方法を用いて、皮膚疾患の処置を受ける患者に対してある種の療法または処置が所望の効果を上げられるかどうかを予測する。皮膚疾患はＡＤもしくは乾癬または別の皮膚疾患であってもよい。この実施形態では、処置の結果が角質層内のＮＭＦの相対量と相関しており、角質層内のＮＭＦの相対量を処置または療法の作用の予測マーカーとして用いる。
【００７５】
この実施形態では、第１のステップにおいて、処置を受ける何人かの患者の角質層内のＮＭＦ量を本方法を用いて判定し、処置を受ける患者の角質層内のＮＭＦ量と処置の作用との相関関係を判定する。
【００７６】
第２のステップでは、患者の角質層内のＮＭＦ量を判定し、第１のステップで確認された相関関係と併用して、患者の処置が成功する可能性を予測する。
【００７７】
任意の第３のステップでは、利用できる可能性があるいくつかの処置または療法の予測結果を比較することで、第１および第２のステップで可能な処置および療法の評価をある種の療法または処置の選択を導く手段として用いる。
【００７８】
別の実施形態では、本方法を用いてある種のパーソナル（皮膚）ケア製品の使用効果を予測する。この実施形態では、パーソナル（皮膚）ケア製品の使用の結果が角質層内のＮＭＦ相対量と相関しており、角質層内のＮＭＦ相対量をパーソナル（皮膚）ケア製品の使用効果の予測マーカーとして用いる。
【００７９】
この実施形態では、第１のステップにおいて、パーソナル（皮膚）ケア製品を使用する何人かの被検体の角質層内のＮＭＦ量を本方法を用いて判定し、製品使用前の角質層内のＮＭＦ量と前記パーソナル（皮膚）ケア製品による効果との相関関係を判定する。
【００８０】
第２のステップでは、被検体の角質層内のＮＭＦ量を判定し、第１のステップで確認された相関関係と併用して、パーソナル（皮膚）ケア製品の使用効果を予測する。
【００８１】
任意の第３のステップでは、いくつかのパーソナルケア製品の予測結果と比較することで、第１および第２のステップで可能な処置および療法の評価をある種のパーソナルケア製品の選択を導く手段として用いる。
【００８２】
別の実施形態では、本方法を用いてある種の環境条件、化学製品または他の事項に対する人の曝露の影響を予測する。この実施形態では、そうした曝露の結果が角質層内のＮＭＦ相対量と相関しており、角質層内のＮＭＦ相対量を曝露の影響の予測マーカーとして用いる。
【００８３】
この実施形態では、第１のステップにおいて、ある種の環境条件（単数または複数）、化学製品または他の事項に曝露される何人かの被検体の角質層内のＮＭＦ量を本方法を用いて判定し、曝露前の角質層内のＮＭＦ量と曝露の影響との相関関係を判定する。
【００８４】
第２のステップでは、被検体の角質層内のＮＭＦ量を判定し、第１のステップで確認された相関関係と併用して、ある種の環境条件（単数または複数）、化学製品または他の事項に対する曝露の影響を予測する。
【００８５】
任意の第３のステップでは、特定の種類の曝露の回避など、曝露に関する助言を与える手段として第１および第２のステップで可能な曝露の評価を用いる。
【００８６】
さらなる態様では、本発明は、アトピー性皮膚炎に罹患している個体を処置する方法であって、その個体に、上記のようなフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性があるかどうかを判定すること、および前記判定結果に基づき療法を調整することを含む、方法を対象とする。療法については、たとえば、より明確に皮膚バリア障害を標的にすることで調整してもよく、抗ヒスタミン剤の経口投与、エモリエントの局部投与、ドキセピンの局部投与、コルチコステロイドの局部投与、ヒドロコルチゾンの局部投与、免疫調節剤および／または紫外線療法薬の局部投与を含んでもよい。
【００８７】
本発明の方法は、魅力的で比較的安価なスクリーニング方法である。このスクリーニングの結果に基づき、追加の（より高価な）スクリーニングまたは診断が必要かどうかを判定することができる。
【実施例】
【００８８】
フィラグリン遺伝子に既知の機能喪失型突然変異を持たない個体７例、およびフィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子に既知の機能喪失型突然変異Ｒ５０１Ｘあるいは２２８２ｄｅｌ４のどちらかを持つ個体６例からなる一連の個体について測定を行った。
【００８９】
ラマン測定では、インビボ共焦点ラマンマイクロスペクトロメーター、モデル３５１０皮膚組成物アナライザーを用いた。各個体に、測定ステージに設置した溶融石英ウインドウに目的の皮膚部分を置いてもらった。ウインドウの下にある顕微鏡対物レンズでレーザー光を皮膚に集光した。皮膚表面までのレーザーの焦点距離を機器制御ソフトウェア（ＲｉｖｅｒＩＣｏｎ、リバーダイアグノスティックス）で調節した。開始ポイントと終了ポイントを決めてステップサイズが大きくなるように設定してから、ソフトウェアにより、皮膚表面まで一定範囲の距離の皮膚内で記録した一連のラマンスペクトルからなる深さプロファイルを自動記録した。
【００９０】
個体の前腕の手のひら側および母指球についてラマン測定を行った。７８５ｎｍのレーザー光を皮膚に集光し、本明細書で「フィンガープリント領域」と定義する４００〜１８００ｃｍ−１のスペクトル領域でラマンスペクトルを記録した。腕で記録した深さの範囲は０〜２０μｍ、ステップを４μｍとした。母指球で記録した深さの範囲は３０〜５０μｍ、ステップを１０μｍとした。腕および母指球での測定を個体ごとに１０回繰り返し、その間、正確な測定部位を５０〜５００μｍ程度平行移動させて若干変えた。
【００９１】
モデル３５１０皮膚組成物アナライザーの内部較正標準および機器制御ソフトウェアＲｉｖｅｒＩＣｏｎ（リバーダイアグノスティックス）により、スペクトルの波数軸のキャリブレーションを行った。また、このソフトウェアは、機器の波数依存性シグナルの検出効率の補正にも使用した。
【００９２】
皮膚解析ソフトウェアスキンツールズ（ＳｋｉｎＴｏｏｌｓ）２．０（リバーダイアグノスティックス）を用いて、フィンガープリント領域で測定した各ラマンスペクトルからＮＭＦ量を判定した。このソフトウェアによる解析方法は、キャスパースらによりジャーナルオブインベスティゲーティブデルマトロジー、２００１年、第１１６巻、ｐ．４３４−４４２に記載されている。この解析方法には古典的な最小二乗フィッティングステップが含まれており、主な皮膚成分の基準スペクトル１セットをそれぞれ腕または手掌のラマンスペクトルにフィッティングさせる。フィッティング係数は、角質層内の乾燥質量分率が圧倒的であるケラチンのスペクトルのフィッティング係数で割った商である。この正規化ステップにより、レーザーの焦点位置から皮膚表面までの距離と共に減少する絶対ラマン強度のばらつきを補正する。解析方法の結果はＮＭＦの相対量の指標であり、ＮＭＦとケラチンとの比として任意単位で表す。
【００９３】
皮膚表面下３０〜５０μｍから測定したＮＭＦ相対量の数値平均を算出して、個体ごとに母指球の角質層内の平均ＮＭＦ量を判定した。
【００９４】
皮膚表面下４μｍで測定したＮＭＦ相対量から、個体ごとに腕の角質層内の平均ＮＭＦ量を判定した。
【００９５】
フィラグリン突然変異を持つ個体の腕および母指球で認められたＮＭＦ量は、フィラグリン突然変異を持たない対照群の腕および母指球よりも著しく少ないことが明らかになった。これを図６〜図１１に示す。
【００９６】
ＮＭＦ量には生物学的に大きなばらつきがあることが報告されてきたが、実施例に示すように、本発明を用いれば測定プロトコルを設計できるため、ある種の皮膚状態になりやすい、フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持っている可能性がある個体を確実に特定することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を非侵襲的に測定する方法であって、
（ｉ）前記個体の角質層から振動スペクトルを得ること；
（ｉｉ）前記得られた振動スペクトルから局所の天然保湿因子の量を判定すること；
（ｉｉｉ）任意にステップ（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すこと；および
（ｉｖ）前記個体の局所の天然保湿因子の量を基準値と比較すること
を含み、前記角質層は、フィラグリンをコードする遺伝子の前記１つまたは複数の機能喪失型突然変異が、天然保湿因子の濃度に影響を与える他の要素よりも天然保湿因子の濃度に強い影響を与える、前記個体の身体部位の角質層である、測定法。
【請求項２】
前記個体の前記身体部位は、
ａ）試験用身体部位を選択すること；
ｂ）フィラグリン遺伝子の既知の機能喪失型突然変異を持つ一群の１例または複数例の個体の前記試験用身体部位の角質層から振動スペクトルを得ること、および前記振動スペクトルの解析から前記試験用身体部位の天然保湿因子の量を判定すること；
ｃ）フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない一群の１例または複数例の個体の前記試験用身体部位の角質層から振動スペクトルを得ること、および前記振動スペクトルの解析から前記試験用身体部位の天然保湿因子の量を判定すること；
ｄ）フィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の既知の機能喪失型突然変異を持つ前記群の個体における前記試験用身体部位の角質層内の天然保湿因子の量がフィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない前記群の個体より少ないかどうかを評価して、前記試験用身体部位でフィラグリンをコードする遺伝子の機能喪失型突然変異が、天然保湿因子の濃度に影響を与える他の要因よりも天然保湿因子の濃度に対して強い影響を及ぼすかどうかを判定すること
により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フィラグリン遺伝子の既知の機能喪失型突然変異を持つ前記群の個体、およびフィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない前記群の個体はそれぞれ少なくとも６例の個体、好ましくは少なくとも１２例の個体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記振動スペクトルはインビボで得られる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記振動スペクトルは、エキソビボで前記個体から採取される角質層サンプルから得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記振動スペクトルはラマンスペクトルである、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記振動スペクトルは皮膚の表面までの距離に応じて得られる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記振動スペクトルは前記個体の皮膚表面下１〜７０μｍ、好ましくは２〜５０μｍ、一層好ましくは３〜３０μｍの母指球の角質層から得られる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記振動スペクトルは前記個体の皮膚表面下１〜１０μｍ、好ましくは２〜８μｍ、一層好ましくは３〜６μｍの前腕の手のひら側の角質層から得られる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法
【請求項１０】
前記局所の天然保湿因子の量は、内部基準の振動シグナルの強度に対する天然保湿因子の振動シグナルの強度から判定される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のステップｉ）およびｉｉ）は少なくとも２回、好ましくは少なくとも５回、一層好ましくは１０回繰り返される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のステップ（ｉｉ）は、皮膚成分の少なくとも１つの基準スペクトルを前記得られた振動スペクトルにフィッティングさせることを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
フィッティング係数は内部基準スペクトルのフィッティング係数で割った商である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記内部基準はケラチンである、請求項１０または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ある種の職業または活動に対して個体が不適であるか、または少なくとも好適とは言い難いかどうかを判定する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
個体のフィラグリン遺伝子におけるホモ接合機能喪失型突然変異とヘテロ接合機能喪失型突然変異を区別する方法であって、天然保湿因子の量に応じて前記機能喪失型突然変異を分類することを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
皮膚疾患の処置を受けている個体の療法または処置が所望の効果を上げる可能性があるかどうかを予測する方法であって、
− 請求項１〜１４および１６のいずれか１項に記載の方法により前記皮膚疾患の処置を受けている一群の個体のフィラグリンをコードする遺伝子において１つまたは複数の機能喪失型突然変異の存在する可能性を判定すること；
− 前記群の個体の角質層における天然保湿因子の量と前記処置の効果との相関関係を判定すること；
− 前記個体の角質層の天然保湿因子の量を判定すること；
− 前記相関関係により前記個体の前記療法または処置が有効であるかどうかを予測すること
を含む、方法。
【請求項１８】
個体による皮膚のパーソナルケア製品の使用効果を予測する方法であって、
− 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により前記皮膚のパーソナルケア製品を使用している一群の個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を判定すること；
− 前記群の個体の角質層における天然保湿因子の量と前記皮膚のパーソナルケア製品の使用効果との相関関係を判定すること；
− 前記個体の角質層の天然保湿因子の量を判定すること；
− 前記相関関係を用いて前記個体による前記皮膚のパーソナルケア製品の使用効果を予測すること
を含む、方法。
【請求項１９】
環境条件、化学製品または他の事項に対する個体の曝露の影響を予測する方法であって、
請求項１〜１４および１６のいずれか１項に記載の方法を用いて、前記環境条件、化学製品または他の事項に曝露される一群の個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を判定すること；
前記群の個体の角質層における天然保湿因子の量と前記曝露の影響との相関関係を判定すること；
前記個体の角質層の天然保湿因子の量を判定すること；
前記相関関係を用いて前記環境条件、化学製品または他の事項に対する前記個体の前記曝露の影響を予測すること
を含む、方法。
【請求項２０】
アトピー性皮膚炎に罹患している個体を処置する方法であって、請求項１〜１４に記載のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が前記個体に存在する可能性があるかどうかを判定すること、および前記判定結果に基づき療法を調整することを含む、方法。
【請求項１】
個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を非侵襲的に測定する方法であって、
（ｉ）前記個体の角質層から振動スペクトルを得ること；
（ｉｉ）前記得られた振動スペクトルから局所の天然保湿因子の量を判定すること；
（ｉｉｉ）任意にステップ（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すこと；および
（ｉｖ）前記個体の局所の天然保湿因子の量を基準値と比較すること
を含み、前記角質層は、フィラグリンをコードする遺伝子の前記１つまたは複数の機能喪失型突然変異が、天然保湿因子の濃度に影響を与える他の要素よりも天然保湿因子の濃度に強い影響を与える、前記個体の身体部位の角質層である、測定法。
【請求項２】
前記個体の前記身体部位は、
ａ）試験用身体部位を選択すること；
ｂ）フィラグリン遺伝子の既知の機能喪失型突然変異を持つ一群の１例または複数例の個体の前記試験用身体部位の角質層から振動スペクトルを得ること、および前記振動スペクトルの解析から前記試験用身体部位の天然保湿因子の量を判定すること；
ｃ）フィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない一群の１例または複数例の個体の前記試験用身体部位の角質層から振動スペクトルを得ること、および前記振動スペクトルの解析から前記試験用身体部位の天然保湿因子の量を判定すること；
ｄ）フィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の既知の機能喪失型突然変異を持つ前記群の個体における前記試験用身体部位の角質層内の天然保湿因子の量がフィラグリン（ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない前記群の個体より少ないかどうかを評価して、前記試験用身体部位でフィラグリンをコードする遺伝子の機能喪失型突然変異が、天然保湿因子の濃度に影響を与える他の要因よりも天然保湿因子の濃度に対して強い影響を及ぼすかどうかを判定すること
により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フィラグリン遺伝子の既知の機能喪失型突然変異を持つ前記群の個体、およびフィラグリン遺伝子の機能喪失型突然変異を持たない前記群の個体はそれぞれ少なくとも６例の個体、好ましくは少なくとも１２例の個体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記振動スペクトルはインビボで得られる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記振動スペクトルは、エキソビボで前記個体から採取される角質層サンプルから得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記振動スペクトルはラマンスペクトルである、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記振動スペクトルは皮膚の表面までの距離に応じて得られる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記振動スペクトルは前記個体の皮膚表面下１〜７０μｍ、好ましくは２〜５０μｍ、一層好ましくは３〜３０μｍの母指球の角質層から得られる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記振動スペクトルは前記個体の皮膚表面下１〜１０μｍ、好ましくは２〜８μｍ、一層好ましくは３〜６μｍの前腕の手のひら側の角質層から得られる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法
【請求項１０】
前記局所の天然保湿因子の量は、内部基準の振動シグナルの強度に対する天然保湿因子の振動シグナルの強度から判定される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のステップｉ）およびｉｉ）は少なくとも２回、好ましくは少なくとも５回、一層好ましくは１０回繰り返される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のステップ（ｉｉ）は、皮膚成分の少なくとも１つの基準スペクトルを前記得られた振動スペクトルにフィッティングさせることを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
フィッティング係数は内部基準スペクトルのフィッティング係数で割った商である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記内部基準はケラチンである、請求項１０または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ある種の職業または活動に対して個体が不適であるか、または少なくとも好適とは言い難いかどうかを判定する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
個体のフィラグリン遺伝子におけるホモ接合機能喪失型突然変異とヘテロ接合機能喪失型突然変異を区別する方法であって、天然保湿因子の量に応じて前記機能喪失型突然変異を分類することを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
皮膚疾患の処置を受けている個体の療法または処置が所望の効果を上げる可能性があるかどうかを予測する方法であって、
− 請求項１〜１４および１６のいずれか１項に記載の方法により前記皮膚疾患の処置を受けている一群の個体のフィラグリンをコードする遺伝子において１つまたは複数の機能喪失型突然変異の存在する可能性を判定すること；
− 前記群の個体の角質層における天然保湿因子の量と前記処置の効果との相関関係を判定すること；
− 前記個体の角質層の天然保湿因子の量を判定すること；
− 前記相関関係により前記個体の前記療法または処置が有効であるかどうかを予測すること
を含む、方法。
【請求項１８】
個体による皮膚のパーソナルケア製品の使用効果を予測する方法であって、
− 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により前記皮膚のパーソナルケア製品を使用している一群の個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を判定すること；
− 前記群の個体の角質層における天然保湿因子の量と前記皮膚のパーソナルケア製品の使用効果との相関関係を判定すること；
− 前記個体の角質層の天然保湿因子の量を判定すること；
− 前記相関関係を用いて前記個体による前記皮膚のパーソナルケア製品の使用効果を予測すること
を含む、方法。
【請求項１９】
環境条件、化学製品または他の事項に対する個体の曝露の影響を予測する方法であって、
請求項１〜１４および１６のいずれか１項に記載の方法を用いて、前記環境条件、化学製品または他の事項に曝露される一群の個体のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が存在する可能性を判定すること；
前記群の個体の角質層における天然保湿因子の量と前記曝露の影響との相関関係を判定すること；
前記個体の角質層の天然保湿因子の量を判定すること；
前記相関関係を用いて前記環境条件、化学製品または他の事項に対する前記個体の前記曝露の影響を予測すること
を含む、方法。
【請求項２０】
アトピー性皮膚炎に罹患している個体を処置する方法であって、請求項１〜１４に記載のフィラグリンをコードする遺伝子に１つまたは複数の機能喪失型突然変異が前記個体に存在する可能性があるかどうかを判定すること、および前記判定結果に基づき療法を調整することを含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５３２８６５（Ｐ２０１０−５３２８６５Ａ）
【公表日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１４６６２（Ｐ２０１０−５１４６６２）
【出願日】平成２０年６月２５日（２００８．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０４１９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００２１７０
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５１０００３２７６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２５日（２００８．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０４１９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００２１７０
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５１０００３２７６）
【Ｆターム（参考）】
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