粗製サンプルから核酸を直接増幅する方法
本教示は、核酸を増幅するための改善された方法、キット、および反応混合物に関する。いくつかの実施形態では、最低限のサンプル精製で粗製サンプル中の核酸の直接的な増幅を可能にする新規なダイレクトバッファー配合物を提供している。本教示は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法を提供し、その方法は、デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、粗製サンプルをダイレクトバッファーと共にインキュベートするステップと、インキュベートしたダイレクトバッファーから、粗製サンプル由来のデオキシリボ核酸を含む溶出液を取り出すステップと、デオキシリボ核酸に対してＰＣＲを行うステップとを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本教示は、一般に、粗製サンプルから核酸を直接増幅する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡプロフィールの迅速および正確な検出は、法医学のケースワークサンプル分析の重要な側面である。血液および頬スワブなどの粗製サンプルは、ＰＣＲに基づく短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）型判別に使用するポリメラーゼの活性を阻害し得る物質を含有する。歴史的に、阻害剤を除去し、ＤＮＡを精製してからＰＣＲ増幅など下流の酵素的操作を行うことが必要である。種々のＤＮＡ単離および精製法ならびにキットが市販されている。しかし、それらの使用により、時間および費用が増える。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本教示は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法を提供し、その方法は、デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、粗製サンプルをダイレクトバッファーと共にインキュベートするステップと、インキュベートしたダイレクトバッファーから、粗製サンプル由来のデオキシリボ核酸を含む溶出液を取り出すステップと、デオキシリボ核酸に対してＰＣＲを行うステップとを含み、ダイレクトバッファーは、少なくとも５対のＰＣＲプライマーペア、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂ（一本鎖結合タンパク質）を含む。
【０００４】
いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ｓｓｂは、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本教示は、ヒトの同一性を決定する方法を提供し、その方法は、ヒト由来のデオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、粗製サンプルを、それぞれが短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接する複数のプライマーペアを含むダイレクトバッファーと共にインキュベートするステップと、インキュベートしたダイレクトバッファーから、粗製サンプル由来のデオキシリボ核酸を含む溶出液を取り出すステップと、粗製サンプル由来のデオキシリボ核酸に対してＰＣＲを行って、それぞれが確認可能なサイズである複数のＰＣＲ単位複製配列を形成するステップと、ＰＣＲ単位複製配列のサイズを参照することによってヒトを同定するステップとを含み、ダイレクトバッファーは、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂをさらに含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本教示は、下流の酵素的操作用に核酸を調製する方法を提供し、その方法は、デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、粗製サンプルをダイレクトバッファーと共にインキュベートして、溶出液を形成するステップと、インキュベートしたダイレクトバッファーから、粗製サンプル由来のデオキシリボ核酸を含む溶出液を取り出すステップと、溶出液に対して下流の酵素的操作を行うステップとを含み、ダイレクトバッファーは、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、下流の酵素的操作はＰＣＲである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本教示は、それぞれが短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接する複数のプライマーペアと、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含むダイレクトバッファーとを含むキットを提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本教示は、ダイレクトバッファーおよび複数のプライマーペアを含む反応混合物を提供し、各プライマーペアは、短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接し、ダイレクトバッファーは、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および２０〜６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
例示的な実施形態の説明
本出願では、特に明確に指定のない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。本出願では、特に明確に指定のない限り、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語は、「少なくとも１つ」を表す。本出願では、特に指定のない限り、「または」の使用は、「および／または」を表す。さらに、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに他の形態、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」という用語の使用は、限定的ではない。
【００１３】
本明細書で使用されている節の表題は、単に構成上の目的のためであり、記載されている主題を限定しているとみなすべきではない。それだけには限らないが、特許、特許出願、論文、本、および学術論文を含めた本出願で引用されているすべての文献、または一部の文献は、目的に応じてその全体を参照によりここに明確に組み込まれている。組み込まれている文献のうち１つまたは複数のものが、本出願中のその用語の定義と矛盾する用語を定義する場合には、本出願が支配する。
いくつかの定義
本明細書では、「粗製サンプル」という用語は、それらの核酸を単離するための重要な手順を経ていない、核酸を含有していると思われる生物学的起源の試験片を意味する。例えば、血液のサンプルは、粗製サンプルである。さらに、Ｗｈａｔｍａｎから市販されているＦＴＡペーパーなど、紙の上に染み付けた血液のサンプルは、粗製サンプルである。頬細胞の頬スワブは、粗製サンプルのもう１つの例である。血液、紙の上の血液、および頬スワブは、例示的な粗製サンプルである。当業者は、その分析が本教示によって容易になるであろう膨大な種類の他の粗製サンプルに気付くはずである。
【００１４】
本明細書では、「ダイレクトバッファー」という用語は、その中に粗製サンプルを置くことができるバッファーを意味する。ダイレクトバッファーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの下流の酵素的操作を行うためのプライマーと酵素を含有する。ダイレクトバッファーは、核酸の遊離と、その他の精製を必要とせずに溶出液からそれらの増幅を可能にする。ＰＣＲのための例示的なサイクル時間および温度は、Sambrookら、Molecular Cloning、第３版に見出すことができる。本教示は、ＰＣＲのためのダイレクトバッファーの使用に注目しているが、当業者には、本教示のダイレクトバッファーを他のタイプの下流の酵素的操作、例えば逆転写酵素を用いる逆転写、またはリガーゼを用いるオリゴヌクレオチド連結アッセイのための下準備の手順として容易に使用できることが理解されよう。
【００１５】
本明細書では、「溶出液」という用語は、ダイレクトバッファーを粗製サンプルと共にインキュベーションした結果として生じる核酸含有溶液を意味する。
詳細な説明
トリス−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ｄＮＴＰ、ＢＳＡ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２、および一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を含めた所望のダイレクトバッファーの各成分のそれぞれの濃度を変えて多数の実験を行った。これらの実験は、例えば、フミン酸を、生物学的物質の分析困難なサンプル中に通常存在する阻害剤の模倣物として使用し、したがって粗製サンプルの生成容易な代用となった。これらの実験の結果から、以下の配合物を得た。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本教示は、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｎｇ／ｕｌ以上のｓｓｂを含むダイレクトバッファーを提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、および６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、例えば０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ｓｓｂは、例えば、Ａｍｂｉｏｎ、カタログ＃２４２４から市販されているバクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である。一般に、ｓｓｂの所望の濃度は、２０〜６０ｎｇ／ｕｌである。より高い濃度がもちろん可能であるが、約６０ｎｇ／ｕｌで上限が現れる。いくつかの実施形態では、ｓｓｂは、６０ｎｇ／ｕｌで存在する。
【００２０】
ダイレクトバッファーに使用する試薬は、商業供給者から容易に入手可能である。例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。ＢＳＡは、種々の供給源、例えばＲｏｃｈｅからカタログ番号１０７１１４５４００１で市販されている。ＦＴＡペーパーは、Ｗｈａｔｍａｎから市販されている。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、複数のＰＣＲプライマーペアを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、５対のプライマーペアを含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、１０対のプライマーペアを含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、１０対超のプライマーペアを含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、ＰＣＲプライマーペアを含まないが、むしろ粗製サンプル中の核酸をダイレクトバッファーで遊離させた後にＰＣＲプライマーペアを溶出液に加える。
【実施例】
【００２２】
第１の実施例では、血液をＦＴＡペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ）に塗布し、風乾させた。ＦＴＡペーパーの１．２ｍｍディスクパンチを作製し、市販されているＩｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からのＰＣＲプライマーを含有しているダイレクトバッファー中に入れた。このディスクパンチを、ダイレクトバッファー中で時々穏やかにボルテックス混合しながら室温で１０分間インキュベートし、次いで溶出液を新しいチューブ中に移した。（溶出液の追加の希釈は、必要に応じてＰＣＲマスターミックスを用いて行うことができる。）次いでＰＣＲを行った。
【００２３】
第２の実施例では、ＴＥバッファー（ｐＨ８．０の１０ｍＭトリス−Ｃｌおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて血液の１００倍希釈溶液を作製した。希釈した血液１ｕｌを使用して、ダイレクトバッファー中のＰＣＲを準備した。
【００２４】
第３の実施例では、頬スワブサンプルを収集し、ＴＥバッファー５００ｕｌ中に入れた。得られた懸濁液を９７℃で５分間加熱した。得られた懸濁液１０ｕｌを使用して、ダイレクトバッファー中のＰＣＲを準備した。
本教示のいくつかの実施形態に基づく例示的なキット
いくつかの実施形態では、本教示は、特定の方法の実施を促進するために設計されたキットも提供する。いくつかの実施形態では、キットは、方法を実施する際に使用する２つ以上の構成要素を組み合わせることによって対象の方法の性能を促進する働きをする。いくつかの実施形態では、キットは、エンドユーザーによる測定の必要性を最小限にするために、あらかじめ測定した単位量の構成要素を含有していてよい。いくつかの実施形態では、キットは、本教示の１つまたは複数の方法を実施するために使用説明書を含んでいてよい。特定の実施形態では、相互に関連して動作させるためにキット構成要素を最適化する。
【００２５】
これらの例示的な実施形態および実験データに関して本教示を記載してきたが、これらの例示的な実施形態の多くの変形形態および変更形態が、過度に実験することなく可能であることが当業者には容易に理解されよう。すべてのこのような変形形態および変更形態は、現在の教示の範囲内に含まれる。
【００２６】
したがって、いくつかの実施形態では、本教示は、それぞれが短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接する複数のプライマーペアと、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含むダイレクトバッファーとを含むキットを提供する。このようなキットは、例えばキャピラリー電気泳動法を用いて、分析した多形マイクロサテライトの回収によって、例えば、ヒトなどの生物の同定に使用することができる。こうしたヒトの同定を行うための例示的な手順は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているＩｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ ＨＩＤキット、ならびに米国特許６２２１５９８、６４７９２３５、５８４３６６０、および７００８７７１に見出すことができる。いくつかの実施形態では、本教示によって提供されたキット、および方法および反応混合物は、例えばＤｉｍｓｏｓｋｉおよびＷｏｏによるＷＯ０５０５４５１５に見られるように、分解したサンプルのマルチプレックスＰＣＲのための手順で使用することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、キット中のダイレクトバッファーは、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、および６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、キット中のダイレクトバッファーは、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、キット中のｓｓｂは、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である。
【技術分野】
【０００１】
本教示は、一般に、粗製サンプルから核酸を直接増幅する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡプロフィールの迅速および正確な検出は、法医学のケースワークサンプル分析の重要な側面である。血液および頬スワブなどの粗製サンプルは、ＰＣＲに基づく短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）型判別に使用するポリメラーゼの活性を阻害し得る物質を含有する。歴史的に、阻害剤を除去し、ＤＮＡを精製してからＰＣＲ増幅など下流の酵素的操作を行うことが必要である。種々のＤＮＡ単離および精製法ならびにキットが市販されている。しかし、それらの使用により、時間および費用が増える。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本教示は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法を提供し、その方法は、デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、粗製サンプルをダイレクトバッファーと共にインキュベートするステップと、インキュベートしたダイレクトバッファーから、粗製サンプル由来のデオキシリボ核酸を含む溶出液を取り出すステップと、デオキシリボ核酸に対してＰＣＲを行うステップとを含み、ダイレクトバッファーは、少なくとも５対のＰＣＲプライマーペア、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂ（一本鎖結合タンパク質）を含む。
【０００４】
いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ｓｓｂは、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本教示は、ヒトの同一性を決定する方法を提供し、その方法は、ヒト由来のデオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、粗製サンプルを、それぞれが短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接する複数のプライマーペアを含むダイレクトバッファーと共にインキュベートするステップと、インキュベートしたダイレクトバッファーから、粗製サンプル由来のデオキシリボ核酸を含む溶出液を取り出すステップと、粗製サンプル由来のデオキシリボ核酸に対してＰＣＲを行って、それぞれが確認可能なサイズである複数のＰＣＲ単位複製配列を形成するステップと、ＰＣＲ単位複製配列のサイズを参照することによってヒトを同定するステップとを含み、ダイレクトバッファーは、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂをさらに含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本教示は、下流の酵素的操作用に核酸を調製する方法を提供し、その方法は、デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、粗製サンプルをダイレクトバッファーと共にインキュベートして、溶出液を形成するステップと、インキュベートしたダイレクトバッファーから、粗製サンプル由来のデオキシリボ核酸を含む溶出液を取り出すステップと、溶出液に対して下流の酵素的操作を行うステップとを含み、ダイレクトバッファーは、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、下流の酵素的操作はＰＣＲである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本教示は、それぞれが短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接する複数のプライマーペアと、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含むダイレクトバッファーとを含むキットを提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本教示は、ダイレクトバッファーおよび複数のプライマーペアを含む反応混合物を提供し、各プライマーペアは、短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接し、ダイレクトバッファーは、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および２０〜６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
例示的な実施形態の説明
本出願では、特に明確に指定のない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。本出願では、特に明確に指定のない限り、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語は、「少なくとも１つ」を表す。本出願では、特に指定のない限り、「または」の使用は、「および／または」を表す。さらに、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに他の形態、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」という用語の使用は、限定的ではない。
【００１３】
本明細書で使用されている節の表題は、単に構成上の目的のためであり、記載されている主題を限定しているとみなすべきではない。それだけには限らないが、特許、特許出願、論文、本、および学術論文を含めた本出願で引用されているすべての文献、または一部の文献は、目的に応じてその全体を参照によりここに明確に組み込まれている。組み込まれている文献のうち１つまたは複数のものが、本出願中のその用語の定義と矛盾する用語を定義する場合には、本出願が支配する。
いくつかの定義
本明細書では、「粗製サンプル」という用語は、それらの核酸を単離するための重要な手順を経ていない、核酸を含有していると思われる生物学的起源の試験片を意味する。例えば、血液のサンプルは、粗製サンプルである。さらに、Ｗｈａｔｍａｎから市販されているＦＴＡペーパーなど、紙の上に染み付けた血液のサンプルは、粗製サンプルである。頬細胞の頬スワブは、粗製サンプルのもう１つの例である。血液、紙の上の血液、および頬スワブは、例示的な粗製サンプルである。当業者は、その分析が本教示によって容易になるであろう膨大な種類の他の粗製サンプルに気付くはずである。
【００１４】
本明細書では、「ダイレクトバッファー」という用語は、その中に粗製サンプルを置くことができるバッファーを意味する。ダイレクトバッファーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの下流の酵素的操作を行うためのプライマーと酵素を含有する。ダイレクトバッファーは、核酸の遊離と、その他の精製を必要とせずに溶出液からそれらの増幅を可能にする。ＰＣＲのための例示的なサイクル時間および温度は、Sambrookら、Molecular Cloning、第３版に見出すことができる。本教示は、ＰＣＲのためのダイレクトバッファーの使用に注目しているが、当業者には、本教示のダイレクトバッファーを他のタイプの下流の酵素的操作、例えば逆転写酵素を用いる逆転写、またはリガーゼを用いるオリゴヌクレオチド連結アッセイのための下準備の手順として容易に使用できることが理解されよう。
【００１５】
本明細書では、「溶出液」という用語は、ダイレクトバッファーを粗製サンプルと共にインキュベーションした結果として生じる核酸含有溶液を意味する。
詳細な説明
トリス−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ｄＮＴＰ、ＢＳＡ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２、および一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を含めた所望のダイレクトバッファーの各成分のそれぞれの濃度を変えて多数の実験を行った。これらの実験は、例えば、フミン酸を、生物学的物質の分析困難なサンプル中に通常存在する阻害剤の模倣物として使用し、したがって粗製サンプルの生成容易な代用となった。これらの実験の結果から、以下の配合物を得た。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本教示は、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｎｇ／ｕｌ以上のｓｓｂを含むダイレクトバッファーを提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、および６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、例えば０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ｓｓｂは、例えば、Ａｍｂｉｏｎ、カタログ＃２４２４から市販されているバクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である。一般に、ｓｓｂの所望の濃度は、２０〜６０ｎｇ／ｕｌである。より高い濃度がもちろん可能であるが、約６０ｎｇ／ｕｌで上限が現れる。いくつかの実施形態では、ｓｓｂは、６０ｎｇ／ｕｌで存在する。
【００２０】
ダイレクトバッファーに使用する試薬は、商業供給者から容易に入手可能である。例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。ＢＳＡは、種々の供給源、例えばＲｏｃｈｅからカタログ番号１０７１１４５４００１で市販されている。ＦＴＡペーパーは、Ｗｈａｔｍａｎから市販されている。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、複数のＰＣＲプライマーペアを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、５対のプライマーペアを含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、１０対のプライマーペアを含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、１０対超のプライマーペアを含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトバッファーは、ＰＣＲプライマーペアを含まないが、むしろ粗製サンプル中の核酸をダイレクトバッファーで遊離させた後にＰＣＲプライマーペアを溶出液に加える。
【実施例】
【００２２】
第１の実施例では、血液をＦＴＡペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ）に塗布し、風乾させた。ＦＴＡペーパーの１．２ｍｍディスクパンチを作製し、市販されているＩｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からのＰＣＲプライマーを含有しているダイレクトバッファー中に入れた。このディスクパンチを、ダイレクトバッファー中で時々穏やかにボルテックス混合しながら室温で１０分間インキュベートし、次いで溶出液を新しいチューブ中に移した。（溶出液の追加の希釈は、必要に応じてＰＣＲマスターミックスを用いて行うことができる。）次いでＰＣＲを行った。
【００２３】
第２の実施例では、ＴＥバッファー（ｐＨ８．０の１０ｍＭトリス−Ｃｌおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて血液の１００倍希釈溶液を作製した。希釈した血液１ｕｌを使用して、ダイレクトバッファー中のＰＣＲを準備した。
【００２４】
第３の実施例では、頬スワブサンプルを収集し、ＴＥバッファー５００ｕｌ中に入れた。得られた懸濁液を９７℃で５分間加熱した。得られた懸濁液１０ｕｌを使用して、ダイレクトバッファー中のＰＣＲを準備した。
本教示のいくつかの実施形態に基づく例示的なキット
いくつかの実施形態では、本教示は、特定の方法の実施を促進するために設計されたキットも提供する。いくつかの実施形態では、キットは、方法を実施する際に使用する２つ以上の構成要素を組み合わせることによって対象の方法の性能を促進する働きをする。いくつかの実施形態では、キットは、エンドユーザーによる測定の必要性を最小限にするために、あらかじめ測定した単位量の構成要素を含有していてよい。いくつかの実施形態では、キットは、本教示の１つまたは複数の方法を実施するために使用説明書を含んでいてよい。特定の実施形態では、相互に関連して動作させるためにキット構成要素を最適化する。
【００２５】
これらの例示的な実施形態および実験データに関して本教示を記載してきたが、これらの例示的な実施形態の多くの変形形態および変更形態が、過度に実験することなく可能であることが当業者には容易に理解されよう。すべてのこのような変形形態および変更形態は、現在の教示の範囲内に含まれる。
【００２６】
したがって、いくつかの実施形態では、本教示は、それぞれが短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接する複数のプライマーペアと、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含むダイレクトバッファーとを含むキットを提供する。このようなキットは、例えばキャピラリー電気泳動法を用いて、分析した多形マイクロサテライトの回収によって、例えば、ヒトなどの生物の同定に使用することができる。こうしたヒトの同定を行うための例示的な手順は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているＩｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ ＨＩＤキット、ならびに米国特許６２２１５９８、６４７９２３５、５８４３６６０、および７００８７７１に見出すことができる。いくつかの実施形態では、本教示によって提供されたキット、および方法および反応混合物は、例えばＤｉｍｓｏｓｋｉおよびＷｏｏによるＷＯ０５０５４５１５に見られるように、分解したサンプルのマルチプレックスＰＣＲのための手順で使用することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、キット中のダイレクトバッファーは、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、および６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、キット中のダイレクトバッファーは、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、キット中のｓｓｂは、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法であって、
デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、
前記粗製サンプルをダイレクトバッファーと共にインキュベートするステップと、
前記インキュベートしたダイレクトバッファーから、前記粗製サンプル由来の前記デオキシリボ核酸を含む溶出液を取り出すステップと、
前記デオキシリボ核酸に対してＰＣＲを行うステップと
を含み、前記ダイレクトバッファーが、少なくとも５対のＰＣＲプライマーペア、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む方法。
【請求項２】
前記ダイレクトバッファーが、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ダイレクトバッファーが、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｓｓｂが、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ヒトの同一性を決定する方法であって、
前記ヒト由来のデオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、
前記粗製サンプルを、それぞれが短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接する複数のプライマーペアを含むダイレクトバッファーと共にインキュベートするステップと、
前記インキュベートしたダイレクトバッファーから、前記粗製サンプル由来の前記デオキシリボ核酸を含む前記溶出液を取り出すステップと、
前記粗製サンプル由来の前記デオキシリボ核酸に対してＰＣＲを行って、それぞれが確認可能なサイズである複数のＰＣＲ単位複製配列を形成するステップと、
前記ＰＣＲ単位複製配列のサイズを参照することによって前記ヒトを同定するステップと
を含み、前記ダイレクトバッファーが、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂをさらに含む方法。
【請求項６】
前記ダイレクトバッファーが、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、および６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ダイレクトバッファーが、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｓｓｂが、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
下流の酵素的操作のために核酸を調製する方法であって、
デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、
前記粗製サンプルをダイレクトバッファーと共にインキュベートして、溶出液を形成するステップと、
前記インキュベートしたダイレクトバッファーから、前記粗製サンプル由来の前記デオキシリボ核酸を含む前記溶出液を取り出すステップと、
前記溶出液に対して下流の酵素的操作を行うステップと
を含み、前記ダイレクトバッファーが、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む方法。
【請求項１０】
前記下流の酵素的操作がＰＣＲである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ダイレクトバッファーが、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、および６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ダイレクトバッファーが、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｓｓｂが、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
それぞれが短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接する複数のプライマーペアと、
１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含むダイレクトバッファーと
を含むキット。
【請求項１５】
前記ダイレクトバッファーが、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、および６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記ダイレクトバッファーが、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記ｓｓｂが、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
ダイレクトバッファーおよび複数のプライマーペアを含む反応混合物であって、各プライマーペアが、短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接し、前記ダイレクトバッファーが、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む、反応混合物。
【請求項１９】
前記ダイレクトバッファーが、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、および６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む、請求項１８に記載の反応混合物。
【請求項２０】
前記ダイレクトバッファーが、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む、請求項１９に記載の反応。
【請求項２１】
前記ｓｓｂが、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である、請求項１９に記載の反応混合物。
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法であって、
デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、
前記粗製サンプルをダイレクトバッファーと共にインキュベートするステップと、
前記インキュベートしたダイレクトバッファーから、前記粗製サンプル由来の前記デオキシリボ核酸を含む溶出液を取り出すステップと、
前記デオキシリボ核酸に対してＰＣＲを行うステップと
を含み、前記ダイレクトバッファーが、少なくとも５対のＰＣＲプライマーペア、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む方法。
【請求項２】
前記ダイレクトバッファーが、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ダイレクトバッファーが、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｓｓｂが、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ヒトの同一性を決定する方法であって、
前記ヒト由来のデオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、
前記粗製サンプルを、それぞれが短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接する複数のプライマーペアを含むダイレクトバッファーと共にインキュベートするステップと、
前記インキュベートしたダイレクトバッファーから、前記粗製サンプル由来の前記デオキシリボ核酸を含む前記溶出液を取り出すステップと、
前記粗製サンプル由来の前記デオキシリボ核酸に対してＰＣＲを行って、それぞれが確認可能なサイズである複数のＰＣＲ単位複製配列を形成するステップと、
前記ＰＣＲ単位複製配列のサイズを参照することによって前記ヒトを同定するステップと
を含み、前記ダイレクトバッファーが、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂをさらに含む方法。
【請求項６】
前記ダイレクトバッファーが、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、および６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ダイレクトバッファーが、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｓｓｂが、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
下流の酵素的操作のために核酸を調製する方法であって、
デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供するステップと、
前記粗製サンプルをダイレクトバッファーと共にインキュベートして、溶出液を形成するステップと、
前記インキュベートしたダイレクトバッファーから、前記粗製サンプル由来の前記デオキシリボ核酸を含む前記溶出液を取り出すステップと、
前記溶出液に対して下流の酵素的操作を行うステップと
を含み、前記ダイレクトバッファーが、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む方法。
【請求項１０】
前記下流の酵素的操作がＰＣＲである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ダイレクトバッファーが、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、および６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ダイレクトバッファーが、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｓｓｂが、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
それぞれが短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接する複数のプライマーペアと、
１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含むダイレクトバッファーと
を含むキット。
【請求項１５】
前記ダイレクトバッファーが、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、および６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記ダイレクトバッファーが、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記ｓｓｂが、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
ダイレクトバッファーおよび複数のプライマーペアを含む反応混合物であって、各プライマーペアが、短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）を含有するゲノム座位に隣接し、前記ダイレクトバッファーが、１０〜１６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２５〜７５ｍＭのＫＣｌ、各２００〜４００ｕＭのｄＮＴＰ、１６０〜９６０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、２Ｕ〜８ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．２５〜２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、および少なくとも２０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む、反応混合物。
【請求項１９】
前記ダイレクトバッファーが、１０ｍＭ ｐＨ８．３のトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、８００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１６単位／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、および６０ｎｇ／ｕｌのｓｓｂを含む、請求項１８に記載の反応混合物。
【請求項２０】
前記ダイレクトバッファーが、０．２パーセントのアジ化ナトリウムをさらに含む、請求項１９に記載の反応。
【請求項２１】
前記ｓｓｂが、バクテリオファージＴ４由来のＴ４遺伝子３２タンパク質である、請求項１９に記載の反応混合物。
【公表番号】特表２０１０−５２７２４５（Ｐ２０１０−５２７２４５Ａ）
【公表日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０８６１５（Ｐ２０１０−５０８６１５）
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６３９６７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４４５５６
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６３９６７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４４５５６
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
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