粘膜乾燥状態に関する検討
本発明は、医学的状態の診断および／または治療に関する。本発明は、被験体における粘膜乾燥状態を診断する、新規な方法に関する。この状態は、ドライアイであってもよい。本発明は、粘膜乾燥状態の治療効果をモニターする方法、粘膜乾燥状態を治療する方法、および／または粘膜乾燥状態用の診断キットも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学的状態に関する。特に、本発明は、粘膜乾燥状態に関する。
【背景技術】
【０００２】
シェーグレン症候群は、口内乾燥症およびドライアイの特定の形態を特徴とする自己免疫性炎症性疾患である。これは、涙腺の涙を分泌する能力に影響し、ドライアイ、口内乾燥症の原因となる唾液腺機能障害、および他の粘膜（ｍｕｃｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、例えば、気管支上皮、膣、および他の粘膜（ｍｕｃｏｓａ）などの乾燥をもたらす。
【０００３】
涙および唾液のこの喪失は、眼の特徴的変化（水性涙欠乏症（ａｑｕｅｏｕｓ ｔｅａｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）または乾性角結膜炎と呼ばれる）および歯の悪化、経口感染の増大、えん下困難および口痛を伴った口の特徴的変化をもたらし得る。しかし、粘膜乾燥は、非シェーグレン症候群下に分類される他の原因にもよる場合がある。この原因は、ある特定の種類の薬物の使用、炎症または感染、または甲状腺機能低下症による場合がある。粘膜乾燥状態は、いずれの原因によるものであっても、哺乳動物などの動物及びヒトの両方に影響し得る。
【０００４】
眼については、眼の眼窩内に位置する涙腺は、少量の涙液を持続的に分泌し、これは、非常に小さな管を通じて、目の表面上に放出される。ドライアイ症候群は、涙液膜の異常性を伴った涙液の喪失として定義することができる。ドライアイの他覚的徴候はほとんどなく、重要なことに、個別基準で変動する不快感が、患者によって最も認められ、患者が援助を求める動機を与える局面である［１］。重篤な場合については、眼球表面損傷および視覚喪失は珍しくない。
【０００５】
ドライアイ（乾性眼）症候群は、大勢の人々に影響を及ぼし、その罹患率は一般人口の１１〜２２％もの高さであり、西側諸国よりアジアで罹患率が高いと推定される［１］。年齢５５歳を超える人および女性においてより一般的であるが、アジアでは、ドライアイは、４５歳を超える人における要因である［２］。罹患率は、視覚表示装置の使用者およびコンタクトレンズ着用者においても著しく高い。
【０００６】
ドライアイ症候群の原因は多様であるが、基本的に、眼球表面および特に角膜上の液体の喪失による。角膜は、眼の最も重要な光学要素であり、ドライアイにより、良好な視覚および患者の生活の質が低下する。涙液層と呼ばれる、眼球表面上の液体層は、数ミクロンの厚さであるが、以下のような層、すなわち、１−最外側の脂質層、２−中間の水層および３−内側のムチン層を有する。ドライアイ症候群は、２つの主な部類、すなわち、涙分泌欠損および過剰な涙蒸発に分類される。涙液膜の脂質層の機能障害は、涙の過剰蒸発をまねく。しかし、ビタミンＡの欠乏によって多くの場合引き起こされるムチン層欠損は、開発途上国を除いてまれである。
【０００７】
ドライアイのための製薬会社による治療上の開発について、非シェーグレンドライアイは、これがこれらの患者の大部分を構成するため、第一標的である。現在、１つの実際の治療薬、すなわち、Ａｌｌｅｒｇａｎ（登録商標）からのＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）だけが市場に出ている。この薬物開発の不足の理由は、ドライアイ及び治療効果の客観的尺度の欠如に主に起因する。
【０００８】
ドライアイ症候群の診断は、自覚症状、シルマー試験（涙液の量の評価）、涙液層破壊時間（涙液膜の質の評価）、およびフルオレセイン染色、ローズベンガル染色、涙液メニスカス高測定、細胞診（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｙｔｏｌｏｇｙ）などを含む、あまり一般的ではない臨床試験に一般に基づく。研究により、臨床試験と症状との間で、および異なる臨床試験の間でさえ、相関は乏しいことが示されている［３、４］。これはまた、治療剤の評価のシナリオを困難にする［５］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、ドライアイなどの粘膜乾燥状態を判定および診断する、新規の改善された方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記の問題に対処し、特に医学的状態の診断および治療のための方法を提供する。概して、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態を診断するための新規な方法を提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態を診断する方法であって、当該被験体からの試料を準備するステップ、および、当該試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ（ここで、当該少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺（Ｖｏｎ Ｅｂｎｅｒ’ｓ ｇｌａｎｄ）タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、及び、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）を含む方法に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態の重症度を判定する方法であって、当該被験体からの試料を準備するステップ、ならびに、当該試料中のα−１−酸−糖タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、ラクトフェリン、リゾチーム、および／または、任意のそれらの誘導体もしくはそれらのフラグメント、の相対的発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態に対する治療効果をモニターする方法であって、当該被験体から試料を準備するステップ、および、当該試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ（当該少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、及び、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）を含む方法を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態を治療する方法であって、当該被験体からの試料を準備するステップ、当該試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を比較するステップ（ここで、当該少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質およびプロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）、および、当該バイオマーカー群の中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量の差異を低減させるステップを含む方法を提供する。
【００１５】
上記態様では、粘膜乾燥状態はドライアイであってもよい。比較するステップは、粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、もしくは粘膜乾燥状態の症状を経験していない、少なくとも１つの被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較とすることができ、および／または比較するステップは、粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、もしくは粘膜乾燥状態の症状を経験していない、統計的に有意な数の被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較とすることができる。試料は液体であってもよい。バイオマーカーの発現量は、少なくとも１種のバイオマーカーの存在量に反映し、またはこの存在量によって測定することができる。比較するステップは、質量分析法によるものとすることができる。被験体は、ヒトまたは哺乳動物とすることができる。
【００１６】
粘膜乾燥状態を治療するための方法において、少なくとも１種のバイオマーカーは、α−１−酸−糖タンパク質１とすることができ、発現量の差異を低減させるステップは、被験体における炎症を低減させることを含む。少なくとも１種のバイオマーカーは、プロラクチン誘導タンパク質とすることができ、発現量の差異を低減させるステップは、プロラクチンおよび／またはアンドロゲンの投与によって、被験体におけるプロラクチン誘導タンパク質の発現量を増加させることを含む。少なくとも１種のバイオマーカーは、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９とすることができ、発現量の差異を低減させるステップは、被験体におけるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の上方制御および／または複合体形成を低減させることを含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、ドライアイの状態を診断するためのバイオマーカーのパネルであって、少なくとも１つの基準値を有する、α−エノラーゼ、プロラクチン誘導タンパク質、α−１−酸−糖タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、ラクトフェリン、リゾチーム、フォンエブナー腺タンパク質、高プロリン４タンパク質、および／またはそれらの誘導体もしくはフラグメントを含むパネルを提供する。このパネルは、状態のより詳細なプロファイルを提供することができ、わずか数個の他のバイオマーカーからの結果と比較して、診断および予後の両方の情報が得られる。バイオマーカーのパネルは、固体支持体上またはゲル中に存在することができる。
【００１８】
別の態様では、本発明は、粘膜乾燥状態を診断するための診断キットであって、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質およびプロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、それらの誘導体またはフラグメント、からなる群から選択される、少なくとも１種のバイオマーカーに反応することのできる、少なくとも１種の化学物質を含む診断キットを提供する。当該少なくとも１種の化学物質は、バイオマーカーのいずれか１つに特異的な、少なくとも１種の抗体とすることができる。当該少なくとも１種の化学物質は、固体支持体上またはゲル中に存在することができる。少なくとも１種のバイオマーカーは、α−エノラーゼとすることができ、少なくとも１種の化学物質は、２−ホスホグリセレートである。この診断キットは、キットの使用に関係する情報をさらに含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書において言及する書誌参考文献は、参考文献のリストの形式で便宜上列記され、実施例の最後に加えられている。そのような書誌参考文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００２０】
定義
バイオマーカー−バイオマーカーは、特定の疾患状態の存在および重症度に関係する、解剖的、生理的、生化学的、または分子的パラメーターである。バイオマーカーは、理学的検査、実験室アッセイおよび医学画像法を包含した、様々な方法によって検出可能であり、測定可能である。本発明の下では、タンパク質、タンパク質誘導体、またはタンパク質フラグメントを、バイオマーカーとして使用することができる。
【００２１】
粘膜の乾燥、粘膜乾燥状態−これを経験している被験体が不快感を感じるような、粘膜を水和、潤滑、または洗浄する体液の自然産生または残留性の減少。
【００２２】
ドライアイ−涙液産生の減少、産生される涙液の残留性欠如または喪失により、患者が眼の不快感を経験する、様々な原因による医学的状態。
【００２３】
バイオマーカーの発現−バイオマーカーの定性的または定量的指標は、患部細胞または患部組織におけるその遺伝子、遺伝子転写物または遺伝子産物の発現から求めることができる。バイオマーカーの定量的指標は、測定されるその遺伝子、遺伝子転写物または遺伝子産物の存在量に反映する。発現量または存在量の差異は、異なるバイオマーカー間、または異なる被験体における同じバイオマーカー間で求めることができる。バイオマーカーの相対的発現量または存在量も、バイオマーカー間、または異なる被験体における同じバイオマーカー間で求めることができる。
【００２４】
粘膜（ｍｕｃｏｓａ）／粘膜（ｍｕｃｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）−すべての身体通路、例えば、瞼の裏側、眼球、および呼吸器管、消化管および尿管、ならびに粘液を分泌する細胞および付随する腺を有する組織などを裏打ちする膜。
【００２５】
タンパク質−特定の順序のアミノ酸の１本または複数本の鎖からなる生体分子。タンパク質は、アイソフォームなどの誘導体を有する場合がある。タンパク質アイソフォームは、いくつかの小さな差異を有するタンパク質のバージョン、通常スプライスバリアントまたはある翻訳後修飾の産物である。本発明の下では、タンパク質は、そのタンパク質が、１または複数の使用される方法によって検出、同定および／または定量化されるのに十分に大きい誘導体およびフラグメントを網羅する。
【００２６】
正常範囲−バイオマーカーの正常範囲は、特定の医学的状態を経験していない、または特定の医学的状態と診断されていない被験体における、バイオマーカーの発現または発現量の範囲である。したがって、この正常範囲からのバイオマーカーの任意の変動（増加または減少）は、医学的状態を示す。本条件下で、バイオマーカーの発現または発現量の正常範囲からの統計的に有意な変動は、粘膜乾燥状態、例えばドライアイの状態などを示す。本発明の下では、正常範囲からの変動は、対照試料を試験試料と並行して試験にかけることによって求めることができる。あるいは、正常基準範囲は、統計的に有意な数の対照試料から予め求めることができ、得られる値は、この正常基準範囲と比較することができる。
【００２７】
一態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態を診断する方法であって、この被験体からの試料を準備するステップ、および、当該試料中の、少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ（ここで、当該少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）ステップを含む方法に関する。別の態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態の重症度を判定する方法であって、当該被験体からの試料を準備するステップ、ならびに当該試料中のα−１−酸−糖タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、ラクトフェリン、リゾチーム、および／または、任意のそれらの誘導体もしくはそれらのフラグメントの相対的発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップを含む方法を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態に対する治療効果をモニターする方法であって、この被験体からの試料を準備するステップ、および、当該試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を比較するステップ（ここで、当該少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質およびプロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）を含む方法を提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態を治療する方法であって、当該被験体からの試料を準備するステップ、当該試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を比較するステップ（ここで、当該少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質およびプロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）、および、当該バイオマーカー群中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量の差異を低減させるステップを含む方法を提供する。
【００３０】
上記態様では、粘膜乾燥状態は、ドライアイであってもよい。比較するステップは、粘膜乾燥状態の徴候を呈さず、もしくは粘膜乾燥状態の症状を経験していない、少なくとも１つの被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較とすることができ、および／または比較するステップは、粘膜乾燥状態の徴候を呈さない、もしくは粘膜乾燥状態の症状を経験していない、統計的に有意な数の被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較とすることができる。試料は液体であってもよい。バイオマーカーの発現量は、少なくとも１種のバイオマーカーの存在量に反映し、またはこの存在量によって測定することができる。比較するステップは、質量分析法によるものとすることができる。被験体は、ヒトまたは哺乳動物とすることができる。
【００３１】
粘膜乾燥状態を治療するための方法下で、少なくとも１種のバイオマーカーは、α−１−酸−糖タンパク質１とすることができ、発現量の差異を低減させるステップは、被験体における炎症を低減させることを含む。少なくとも１種のバイオマーカーは、プロラクチン誘導タンパク質とすることができ、発現量の差異を低減させるステップは、プロラクチンおよび／またはアンドロゲンの投与によって、被験体におけるプロラクチン誘導タンパク質の発現量を増加させることを含む。少なくとも１種のバイオマーカーは、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９とすることができ、発現量の差異を低減させるステップは、被験体におけるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の上方制御および／または複合体形成を低減させることを含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、ドライアイの状態を診断するためのバイオマーカーのパネルであって、α−エノラーゼ、プロラクチン誘導タンパク質、フォンエブナー腺タンパク質、高プロリン４タンパク質、および、それらの誘導体またはフラグメントを含むパネルを提供する。このパネルは、状態のより詳細なプロファイルを提供することができ、わずか数個の他のバイオマーカーからの結果と比較して、診断および予測の両方の情報が得られる。バイオマーカーのパネルは、固体支持体上またはゲル中に存在することができる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、粘膜乾燥状態を診断するための診断キットであって、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質およびプロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、それらの誘導体またはフラグメントからなる群から選択される、少なくとも１種のバイオマーカーに反応することのできる、少なくとも１種の化学物質を含む診断キットを提供する。この少なくとも１種の化学物質は、バイオマーカーのいずれか１つに特異的な、少なくとも１種の抗体とすることができる。この少なくとも１種の化学物質は、固体支持体上またはゲル中に存在することができる。少なくとも１種のバイオマーカーは、α−エノラーゼとすることができ、少なくとも１種の化学物質は、２−ホスホグリセレートである。この診断キットは、キットの使用に関係する情報をさらに含むことができる。
【００３４】
本発明の下では、粘膜乾燥に関係するバイオマーカーの群の少なくとも１種のバイオマーカーの検出、同定、および／または定量化により、粘膜乾燥状態の診断に関する基盤が提供される。具体的には、被験体の涙液中での、バイオマーカーの群の少なくなくとも１種のバイオマーカーの検出、同定、および／または定量化により、任意の原因によるドライアイの状態を診断するための基盤が提供される。
【００３５】
バイオマーカーのこの群の任意の１種または複数種のバイオマーカーは、１つまたは複数の適当な方法によって、検出、同定、および／または定量化することができる。これらのバイオマーカーの発現量の正常範囲からの任意の変動は、被験体が状態を訴えていてもいなくても、ドライアイの状態を示す。
【００３６】
これらのバイオマーカーの１種または複数種の発現量を測定するために、被験体から涙液を得、バイオマーカーを検出、同定、および／または定量化する。免疫反応（例えば、酵素結合免疫吸着測定法）および酵素反応などの他の生化学反応などの多くの方法が、本発明下の技術分野において利用可能である。そのような反応は、色変化またはある特定の波長の光の吸光度もしくは透過の差異などの測光手段によって、バイオマーカーを検出することを含むことができる。
【００３７】
使用するのに適した別の方法は、当業者に周知の質量分析法（ＭＳ）である。最近のＭＳシステムは、イオン化、検出および分析手段を含む。試料の分析に関して、このシステムは、検出手段から得られるデータを、既知の標準と比較することによって、試料中の成分を同定することができ、またはこのシステムは、同じ試料内の異なる成分を比較することによって、結果を導出することができる。
【００３８】
本発明の下では、定量的プロテオミクス法である、ナノスケールでの２次元液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析法（ナノＬＣ−ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）を伴ったｉＴＲＡＱ技術［６］を、統計分析と組み合わせ、涙分泌の喪失を伴ったドライアイ症候群と診断された患者の涙液中のバイオマーカーを、検出、同定、および定量化するのに使用した。ナノＬＣ−ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳは、当技術分野で周知であり、複雑なタンパク質混合物を分離するために開発された［２０］。この分離は、以前は、１次元または２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１Ｄまたは２Ｄ ＰＡＧＥ）を使用して実施されたが不十分であった。
【００３９】
検出されたバイオマーカーを、ドライアイの診断に使用するのに十分な信頼度を獲得するために、ＭＳデータの分析に厳密な判定基準が設定され、その後統計分析を行うことによって、状態の重症度の指標が提供される。
【００４０】
粘膜乾燥状態の診断に関して、本発明の下でのバイオマーカーの生物学的機能は、以下の通りである。
【００４１】
α−エノラーゼ：α−エノラーゼ（ａｅ）は、多くの細胞において豊富に発現される、主要な糖分解酵素の１つである。しかし、さらに最近では、α−エノラーゼは、造血細胞（好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球）、上皮細胞、神経細胞などの細胞において、表面タンパク質として、細胞表面上にも見出された［７］。その生来の糖分解機能に加えて、α−エノラーゼは、多機能性タンパク質として認識されてきた。非常に最近の研究では、α−エノラーゼは、いくつかの疾患プロセス、例えば、多くの自己免疫障害、癌、全身性真菌症、および歯科疾患において重要な役割を果す場合があることが示されている。しかし、涙液中にα−エノラーゼが存在するのを報告するのは、これが最初である。
【００４２】
α−１−酸糖タンパク質１：α１−酸糖タンパク質１（ＡＧＰ）は、４１〜４３ｋＤａの分子量を有する、大幅にグリコシル化されたタンパク質（４５％）である［８］。これはまた、リポカリンファミリーに属する。これは、炎症反応に関係する。その合成は、糖質コルチコイド、インターロイキン−１、およびインターロイキン−６によって制御される。その抗炎症効果が注目された。ＡＧＰは、炎症誘発効果および抗炎症効果の両方を呈する。これらの２つの免疫調節効果は、ＡＧＰが、免疫応答および炎症の調節に重要な役割を果すことを示すことができる。涙液中にα１−酸糖タンパク質１を検出したのを報告するのも、これが最初である。
【００４３】
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９：Ｓ１００Ａ８およびＡ９は、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ファミリーに属する。Ｓ１００Ａ８、Ａ９およびＡ１２は、炎症誘発タンパク質の新規なグループを形成することを示す証拠が増えている［９］。炎症性疾患では、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の両方の過剰発現が、一般に見られる。これらは炎症部位で分泌される。ドライアイの涙中では、Ｓ１００Ａ８のみの過剰発現が以前に報告されている［１０］。これらの２つのタンパク質は、複合体を形成することができ、これは、高濃度で存在する場合、アポトーシスを誘発する。
【００４４】
Ｓ１００Ａ４：Ｓ１００Ａ４は、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ファミリーのメンバーである。Ｓ１００Ａ４の最もよく知られている役割は、細胞形状変化を引き起こす、その能力である。さらに最近では［１１］、Ｓ１００Ａ４は、ｉｎ ｖｉｖｏで角膜血管新生を刺激することができることが示された。Ｓ１００Ａ４はまた、成長因子シグナル伝達およびアポトーシス細胞死に明らかに関与することから、成長の恒常性に関与していると思われる。Ｓ１００Ａ４の発現が、おそらく細胞外基質を再構築し、細胞外基質中に生じる接着媒介巨大分子（ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）の再配置を促進することによって、細胞の接着性を変化させるというかなりの証拠が存在する［１２］。
【００４５】
Ｓ１００Ａ１１：これは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ファミリーの別のメンバーである。Ｓ１００Ａ１１は、アポトーシスに関与すると思われる［１３］。
【００４６】
ラクトフェリンおよびリゾチーム：これらは、周知の豊富なヒト涙タンパク質である。これらはともに、眼球表面上で抗菌活性を有する。以前の研究では、ドライアイを有する患者において、これら２つの涙タンパク質の下方制御が観察された［１４、１０］。
【００４７】
フォンエブナー腺タンパク質：涙特異的プレアルブミン（ｔｅａｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｅａｌｂｕｍｉｎ）（ＴＳＰＡ）または涙リポカリンとも呼ばれる、フォンエブナー腺タンパク質［１５］は、主要な涙タンパク質の１つであり、主要な脂質結合タンパク質として作用する。これは、上皮表面の一般的な保護因子とみなされている。
【００４８】
プロラクチン誘導タンパク質：プロラクチン誘導タンパク質（ＰＩＰ）は、いくつかの外分泌組織、例えば、涙腺、唾液腺、汗腺などにおいて一般に発現され、乳癌にも関係し得る［１６］。非常に最近の研究により、プロラクチン誘導タンパク質は、眼瞼炎患者の涙中で下方制御されることが示されたが、ドライアイとの関連を報告するのはこれが最初となるであろう［１７］。
【００４９】
高プロリン４タンパク質：これも、最近、豊富な涙タンパク質の１つとしてみなされている［１８、１０］。高プロリンタンパク質４は、涙腺において豊富に発現され、そこでこれは、腺房細胞中に見出される［１９］。これは、腺房細胞の機能を反映する可能性がある。これは、ドライアイ患者において下方制御されることが示された［１０］。
【００５０】
本発明の方法を使用して、ドライアイなどの粘膜乾燥状態の診断がされたら、当該方法をその状態のための治療効果をモニターする方法としても使用することが可能になるであろう。被験体に、治療方法を処方し、本発明の１種または複数種のバイオマーカーの発現量を定期的に求めることによって、間隔を置いてモニターすることができる。そのような粘膜乾燥状態の治療の種類および継続期間、ならびに治療効果をモニターする間隔および継続期間は、医師などの当業者に分かるであろう。本発明の方法は、薬物治験での新規な治療効果をモニターするためにも使用することができる。
【００５１】
本発明は、本発明の１種または複数種のバイオマーカーの変動の原因に対抗することにより、１種または複数種のバイオマーカーの発現量を正常範囲に戻すことによって、粘膜乾燥状態を治療する方法も提供する。
【００５２】
本発明は、診断のため、および粘膜乾燥状態をプロファイルするためのバイオマーカーのパネルも提供する。いくつかのバイオマーカーの発現量は、医学的状態によって変化する場合があるが、バイオマーカーのパネルにより、状態のより詳細で正確な診断が提供される。パネル上のバイオマーカーが測定される場合、パネル上の互いのバイオマーカーの相対的発現量または存在量により、状態の重症度を示すことができる。
【００５３】
本発明は、ドライアイなどの粘膜乾燥状態の診断のための診断キットも提供する。このキットは、１種または複数種のバイオマーカーと反応することのできる少なくとも１種の化学物質を含み、その結果反応を検出することができる。例えば、化学物質は、１種のバイオマーカーに特異的に結合する抗体とすることができる。あるいは、化学物質は、バイオマーカーのための基質とすることができる。これらの化学物質は、固体支持体またはゲルなどの支持体上に存在することができる。この診断キットにより、定性的および／または定量的結果を得ることができ、医学的状態を診断することが可能になる。
【００５４】
これまでに本発明を概ね説明してきたので、本発明は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。この実施例は、例示の目的で提供され、本発明を限定することは意図されていない。
【００５５】
方法
（実施例１）
【００５６】
患者
ドライアイ症候群と臨床的に診断された合計２８人の患者および他の眼の疾患を有していない２０人の対照被験者を採用した。すべての参加被験者からインフォームドコンセントを得、全体の手順は、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＥＲＩ）の治験審査委員会によって承認され、また、ヘルシンキ宣言の教義に従った。臨床検査は、自覚症状、シルマー試験（麻酔なし）、涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）試験、および他の一般的な眼科検査、例えば視力、ならびに眼瞼縁およびマイボーム腺評価などを包含した。ドライアイについての一般的な感情症状は、焼灼感、痒み感および刺痛感、異物感、乾燥感、視覚のぼやけ、羞明（まぶしがり）、疼痛および重い目または疲れ目を包含する。患者は、シルマー試験、ＴＢＵＴ、および自覚症状に基づいて、ドライアイを有すると分類された。
（実施例２）
【００５７】
採取および涙タンパク質溶出
すべての患者の涙液は、シルマー細片（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ ｓｔｒｉｐ）を使用して採取した。この試験のために、麻酔なしで５分間、下の瞼の中に薄い（紙の）涙用細片を置く。続いて採取した涙をこの細片から溶出した。涙の低減により、キャピラリー法を使用して涙を採取することが非現実的になったので、これを行うことができることは重要であった。採取後、シルマー細片は、分析するまで−８０℃に直ちに凍結させた。シルマー細片の最初の１０ｍｍを切断して小片にし、１５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に３時間浸漬することによって、シルマー細片から涙タンパク質を溶出した。次いで、全涙タンパク質の濃度を、各試料について、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。
（実施例３）
【００５８】
研究デザインおよびｉＴＲＡＱ（相対的および絶対的定量化ｉＴＲＡＱのためのアイソバリックタグ（ｉｓｏｂａｒｉｃ ｔａｇ））試料調製
ｉＴＲＡＱ技術により、４つの試料を同時に標識することが可能になるので、各セットにおいて２つの対照（Ｃ）および２つのドライアイ試料（ＤＥ）を使用した（合計１４セット）。これらの１４セット中、個々の対照試料を９セットにおいて使用し、プールした対照試料（５つの対照からプールした試料１種、および、３つの対照からプールした試料１種）を、別の５セットの実験において使用した。各試料からの３０μｇをｉＴＲＡＱ実験に使用した。ｉＴＲＡＱ手順は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって提供されたプロトコルに従った。ここでは、ｉＴＲＡＱ試薬キットからの、２０μｌの溶解緩衝液（トリエチルアンモニウムビカーボネート）および１μｌの変性剤（２％のＳＤＳ）を、試料に加えた。次いで、２μｌの還元試薬（トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を次いで加え、試料を６０℃で１．５時間インキュベートした。次ステップで、１μｌのシステイン遮断試薬（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）（メチルメタンチオスルホネート）を加え、室温で２０分間インキュベートした。次いで試料を、トリプシンを用いて、３７℃で一晩消化した。ｉＴＲＡＱ試薬１１４および１１５を対照試料に加え、一方、ｉＴＲＡＱ試薬１１６および１１７をドライアイ試料に加えた。次いで、試料を室温で３時間インキュベートした。各ｉＴＲＡＱ試薬で標識した試料の内容物を合わせ、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮機を使用して乾燥させた。試験のために、１０μｌのローディング緩衝液（水中０．１％のギ酸、２％のアセトニトリル）を加えることによって試料を再構成した後、２Ｄナノ−ＬＣ−ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。
（実施例４）
【００５９】
２次元ナノ−ＬＣ−ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析
ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｑ−Ｓｔａｒ ＸＬ、ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）と一体となった２次元ナノＬＣ（ＤＩＯＮＥＸ、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を分析のために使用した。ペプチドの２次元ＬＣ分離は、最も一般的な構成であり、強陽イオン交換（ＳＣＸ）とそれに続く逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーからなる。第１の次元で使用したＳＣＸカラムは、ＤＩＯＮＥＸ、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓからのもの（内径３００μｍ×１０ｃｍ 多孔度 １０Ｓ ＳＣＸ）であった。
【００６０】
ペプチド混合物の溶出は、すべて３０μｌ／分の流速で、１０段階の漸増塩濃度（１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭおよび１０００ｍＭの酢酸アンモニウムの２０μｌの注入）を使用して、および０．１％ギ酸／ＡＣＮ（９５：５、ｖ：ｖ）のローディング溶媒を使用して実施した。第２の次元で使用したＲＰカラムは、自己充填ＰｉｃｏＦｒｉｔ（外径３６０μｍ、内径７５μｍ、５０ｃｍ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）から自己充填した、１０ｃｍ×内径７５μｍのマイクロキャピラリーＬＣカラムであった。このキャピラリーカラムに、自作のカラム充填装置を使用して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）からのＬｕｎａ Ｃ１８、３μｍ、１００Åを充填した。このキャピラリーカラムは、スプレーチップ（１５μｍの開口）が組み込まれていた。このチップは、ナノスプレーインターフェース（Ｐｒｏｔａｎａ、Ｏｄｅｎｓｅ、デンマーク）と直接連結して、ＡＢＩのＱ−ＴＯＦ質量分析計中につながることができる。
【００６１】
ＳＣＸ分離の後、脱塩のために、３０μＬ／分で、Ｆａｍｏｓ自動サンプラー（ＤＩＯＮＥＸ、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ）からトラップカートリッジ（ＤＩＯＮＥＸ、ＬＣ ＰａｃｋｉｎｇｓからのＣ１８、０．３×５ｍｍ）に試料を添加した。アセトニトリル／水（０．１％のギ酸を含む、２／９８、ｖ／ｖ）で５分洗浄した後、システムを切り替えて（Ｓｗｉｔｃｈｏｓ、ＤＩＯＮＥＸ、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ）、ＲＰ分析用キャピラリーカラムに合わせた。最終溶媒（ｕｌｔｉｍａｔｅ ｓｏｌｖｅｎｔ）送達システム（ＤＩＯＮＥＸ、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ）を使用して、約３００ｎＬ／分の流速での、８５分にわたる２０％から９５％のアセトニトリル（０．１％のギ酸）の直線勾配を使用することによって、トリプシン消化物を分析した。ナノスプレーおよび他の計測装置の主要なパラメーターの設定は、以下の通りであった：イオンスプレー電圧（ＩＳ）＝２２００Ｖ、カーテンガス（ＣＵＲ）＝２０、クラスター分離電位（ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＤＰ）＝６０Ｖ、集束電位（ＦＰ）＝２６５Ｖ、衝突ガス設定（ＣＡＤ）＝窒素ガスについて５、ＤＰ２＝１５。
【００６２】
すべてのデータは、Ａｎａｌｙｓｔ ＱＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともに情報依存取得（ＩＤＡ）モードを使用して取得した。ＩＤＡパラメーターについては、３００〜１２００の質量範囲において、１秒の飛行時間（ＴＯＦ）質量分析法（ＭＳ）サーベイスキャン、その後に、１００〜１５００の質量範囲において、２回のそれぞれ３秒のプロダクトイオンスキャンが続いた。「すべて強調する」機能を、ＩＤＡ実験において使用した。切り替え判定基準は、２から４の荷電状態および２０カウント／秒超の表示しきい値（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）で、質量−電荷比（ｍ／ｚ）＝３５０超およびｍ／ｚ＝１２００未満のイオンに対して設定した。前者の標的イオンは、６０秒間排除した。ＩＤＡ衝突エネルギー（ＣＥ）パラメータースクリプトを、ＣＥを自動的に制御するために使用した。
（実施例５）
【００６３】
データ分析
ｉＴＲＡＱ実験についてのデータ分析は、ＰｒｏＧｒｏｕｐ Ｖｉｅｗ １．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともにＰｒｏＱＵＡＮＴ １．０を使用して実施し、ＩＰＩ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｅｘ）のヒトデータベースｖ３．１５と対照して探索した。ＰｒｏＱＵＡＮＴ探索でのペプチド同定のために設定した質量許容誤差は、それぞれ、ＭＳについて０．１５ＤａおよびＭＳ／ＭＳについて０．１０Ｄａであった。信頼度設定のためのカットオフは７５であった。他の探索パラメーターは、システイン固定修飾（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｆｉｘｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）としてのＭＭＴＳ（メチルメタンチオスルホネート）、トリプシン切断部位の切断ミス１（１ ｍｉｓｓｅｄ ｔｒｙｐｓｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、ゾーン修飾（ｚｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）でのメチオニンへの酸化、ならびに、リジンおよびチロシンへのｉＴＲＡＱ修飾を伴った独自アミノ酸を包含する。
【００６４】
次いで、Ｐｒｏ Ｑｕａｎｔによって生じた結果を、Ｐｒｏ Ｇｒｏｕｐ Ｖｉｅｗｅｒ １．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により分析し、集計することによって、ＰｒｏＧｒｏｕｐレポートを作成した。タンパク質同定の判定基準は、以下の通りであった。（ａ）２超のＰｒｏｔＳｃｏｒｅ（９９％超の信頼度）を有するタンパク質は、すべて容認した。（ｂ）ＰｒｏｔＳｃｏｒｅ＝２（９９％の信頼度）を有するタンパク質、一般に９９％の信頼度を有する１個のペプチドは、手作業でＭＳ／ＭＳスペクトルを確認して容認した。示差的な表現のために、別個に標識した試料の組合せの間に起こり得るピペット誤差を補正するために、バイアス補正因子を適用した。
【００６５】
ｉＴＲＡＱ技術を使用した、タンパク質の相対的定量化は、ＭＳ／ＭＳスペクトルからのｍ／ｚ１１４、１１５、１１６および１１７Ｄａのピーク面積の比に基づく。２つの対照（Ｃ１およびＣ２）は、１１４および１１５でタグを付け、２つのドライアイ試料（ＤＥ１およびＤＥ２）は、１１６および１１７でタグを付けたので、相対的定量的結果は、ＤＥ１：Ｃ１、ＤＥ２：Ｃ１、ＤＥ１：Ｃ２、ＤＥ２：Ｃ２、Ｃ１：Ｃ２およびＣ２：Ｃ１として表すことができる。定量的結果については、報告する比に加えて、Ｐｒｏ Ｇｒｏｕｐにより、ｐ値および誤差因子（ＥＦ）も得られる。より小さなｐ値（０から１のスケールで）は、実際の生物学的差異から生じる発現の変化（単一でない比、例えば、病的試料対正常試料）について、より高い信頼度を多くの場合意味する。ＥＦは、任意の報告された比について９５％の不確実性範囲を表す。
（実施例６）
【００６６】
統計分析
（ａ）比の平均の計算
１４セットのｉＴＲＡＱデータから、特定のタンパク質についての比の平均を得るために、ＥＦを関与させることによる、加重平均計算を使用した。最初に、比を対数空間［ｌｏｇ（比）］に変換した。次いで、加重値としてＥＦの対数の逆数を使用した。対数空間での加重平均は、以下の式を使用して計算した。
加重値平均（対数空間）＝合計［ｌｏｇ（比）×加重値］／合計（加重値）
式中、加重値＝１／ｌｏｇ ＥＦ
最後に、これを対数空間から元に戻すことによって、「比の加重値平均」を求める。
【００６７】
（ｂ）ｔ検定によって有意な変化を見出すこと
この比を２つのグループ、すなわち、ドライアイグループ（ＤＥ１：Ｃ１、ＤＥ２：Ｃ１、ＤＥ１：Ｃ２、ＤＥ２：Ｃ２）および対照グループ（Ｃ１：Ｃ２およびＣ２：Ｃ１）に分けた。１４セットのｉＴＲＡＱ実験からのデータを合わせ、スチューデントｔ検定を実施してｐ値を計算することよって、ドライアイグループと対照グループの間の変化が有意であるかどうかを評価した（０．０５未満のｐは、有意な変化であると考えられた）。
【００６８】
（ｃ）バイオマーカーパネルの選択
ｔ検定後、１０種のバイオマーカー候補を、その０．０５未満のｐ値に基づいて選択した。高プロリンタンパク質４も、文献［１０］で報告されていたので、バイオマーカーとして採用した。線形分類器を使用して、これらのバイオマーカー候補の最良の組合せを決定することによって、バイオマーカーパネルを形成した。最初に、個々のバイオマーカー候補について、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を得た。１位に格付けされたバイオマーカー候補（α−エノラーゼ）を採用し、ドライアイの症例の同定のために使用した。α−エノラーゼによって陰性と分類された試料のために、残っている１０種のバイオマーカー候補のうちの任意の最大８種の組合せを使用する線形分類器を構築した。バイオマーカーの最適なパネルの選択は、異なる数のバイオマーカー候補の性能曲線（図１）によって決定した。結果として、３種のタンパク質（ｐ０、ｐ１およびｐ２）の線形結合
ｙ＝ｌｏｇ２比＿ｐ０ ＋ ａ１・ｌｏｇ２比＿ｐ１ ＋ ａ２・ｌｏｇ２比＿ｐ２
を、ドライアイの症例と正常な場合をさらに区別するために使用した。パラメーターａ１およびａ２は、ＲＯＣ精度（ＲＯＣ曲線下面積）の最適化に基づいて求めた。
（実施例７）
【００６９】
結果
涙タンパク質同定
タンパク質同定のための非常に厳密な判定基準（２超のＰｒｏｔＳｃｏｒｅ、９９％超の信頼度）を使用して、１４セットのｉＴＲＡＱ実験から、合計６４種の涙タンパク質を同定した。このしきい値を用いて、一般に、高信頼度を有する２個以上のペプチドを、タンパク質同定のために使用した。ＰｒｏＧｒｏｕｐ Ｖｉｅｗでは、各ペプチドは、２．０以下しかＰｒｏｔＳｃｏｒｅに寄与することができない（９９．０％以下の高さの信頼度に等価）。表１に、各タンパク質について、全ＰｒｏｔＳｃｏｒｅおよび同定されたペプチドの数を含む、タンパク質同定リストを示す。
【００７０】
【表１−１】
【００７１】
【表１−２】
【００７２】
【表１−３】
（実施例８）
【００７３】
ｉＴＲＡＱ技術によってドライアイ患者を正常な対照と比較した、涙タンパク質の相対的定量化および潜在的なバイオマーカーの発見
全体的に、統計分析により、合計で１０種のタンパク質が、ドライアイグループと正常な対照グループとの間で異なって発現され、ドライアイ患者において、６種のタンパク質が上方制御され、４種のタンパク質が下方制御されたことが示された。これら１４セットからの１０種のドライアイバイオマーカーについての比、ｐ値およびＥＦを以下に示す。
【００７４】
６種の上方制御されたタンパク質、すなわち、α−エノラーゼ、α−１−酸糖タンパク質１、Ｓ１００Ａ８（カルグラニュリンＡ）、Ｓ１００Ａ９（カルグラニュリンＢ）、Ｓ１００Ａ４およびＳ１００Ａ１１（カルギザリン）が見つかり、４種の下方制御されたタンパク質、すなわち、プロラクチン誘導タンパク質（ＰＩＰ）、フォンエブナー腺タンパク質（涙特異的プレアルブミン、リポカリン）、ラクトフェリンおよびリゾチームが見つかった（図２を参照されたい）。表２に、対照グループおよびドライアイグループについての、上記１０種のタンパク質の加重平均比およびｐ値を要約する。これらの１０種のバイオマーカーの中で、α−エノラーゼ、α−１−酸糖タンパク質１、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１およびプロラクチン誘導タンパク質は、これまで一度も報告されていなかった。図３〜５は、プロラクチン誘導タンパク質、α−エノラーゼおよびα−１−酸糖タンパク質１についての３つの代表的なＭＳ／ＭＳスペクトルを示し、これらにより、同定および定量的情報の両方が得られる。
【００７５】
【表２】
【００７６】
図３Ａは、ｍ／ｚ＝７０１．１０での、プロラクチン誘導タンパク質に由来する、１個の３価に帯電したペプチドイオン、ＴＹＬＩＳＳＩＰＬＱＧＡＦＮＹＪ（Ｊは、ｉＴＲＡＱで修飾されたリジン残基を表す）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。１００〜１２００Ｄａの質量範囲において、ｂイオンシリーズおよびｙイオンシリーズの両方が観察された。１１１．０から１２０．０ＤａにＭＳ／ＭＳスペクトルを拡大すると、ｍ／ｚ＝１１４．１、１１５．１、１１６．１および１１７．１Ｄａで、４つのｉＴＲＡＱレポーターイオンが得られる。一般に、２つの対照試料を標識するのに、ｉＴＲＡＱ試薬１１４および１１５を使用し、２つのドライアイ試料を標識するのに、ｉＴＲＡＱ試薬１１６および１１７を使用した。タンパク質の相対量は、ｍ／ｚ＝１１４．１、１１５．１、１１６．１および１１７．１Ｄａでのレポーターイオンのピーク面積の比に基づいた。図３Ｂから、ドライアイの涙中のプロラクチン誘導タンパク質の下方制御が、はっきりと観察された。図４Ａおよび５Ａは、それぞれ、α−エノラーゼに由来する、１個の３価に帯電したペプチドイオン（ｍ／ｚ＝８７７．４０ＤａでのＳＧＥＴＥＤＦＩＡＤＬＷＧＬＣＴＧＱＩＪ）およびα−１−酸糖タンパク質１に由来する、１個の４価に帯電したペプチドイオン（ｍ／ｚ＝４７５．００ＤａでのＹＶＧＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲ）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。同様に、ＭＳ／ＭＳスペクトルの拡大により（図４Ｂおよび５Ｂ）、ドライアイの涙液中でのα−エノラーゼおよびα−１−酸糖タンパク質１の過剰発現が明らかになった。
（実施例９）
【００７７】
ドライアイバイオマーカーおよびバイオマーカーパネルについてのＲＯＣ曲線
最初に、各バイオマーカー候補について、個々にＲＯＣ曲線を作成した。ＲＯＣ曲線では、ＤＥ：Ｃ比についての様々なカットオフ値の真陽性率（感度）対偽陽性率（１−特異度）がプロットされる。ＲＯＣ曲線下面積も計算した。この面積は精度である。ＲＯＣ曲線は、異なる試験の実績を比較するのに有用である。上方制御されたタンパク質の中で、最良の個々のバイオマーカー候補は、８５％の精度でα−エノラーゼであり（図６Ａ）、一方、プロラクチン誘導タンパク質は、８１％の精度で、下方制御されたタンパク質の筆頭である（図６Ｂ）。
【００７８】
線形分類を使用して、バイオマーカーの最良の組合せが、状態をプロファイルするためのバイオマーカーのパネルとして有用であることが判明した。このバイオマーカーパネルは、４種のタンパク質、すなわち、α−エノラーゼ（ａｅ）、プロラクチン誘導タンパク質（ＰＩＰ）、フォンエブナー腺タンパク質（ｖＥｇｐ）および高プロリンタンパク質４（ｐｒ４）を含有する。方法は２段階アプローチである。
【００７９】
最初に、α−エノラーゼの比（ＤＥ：Ｃ）が１．７０を超える場合、ドライアイ試料が予想されるであろう。この判定基準を満たさない試料については、ドライアイの症例をさらに同定するために、以下の式が使用されることになる。
ｙ＝ｌｏｇ２比（ｐｒ４）−ｌｏｇ２比（ＰＩＰ）−０．８ｌｏｇ２比（ｖＥｇｐ）
ｙについてのカットオフ値は、０．２から１．８の範囲である。
【００８０】
このアプローチを使用することによって、ドライアイを正確に診断するための精度を、９８％に上昇させることができる。高プロリンタンパク質４は、単一のバイオマーカーとして使用される場合、性能が非常に劣ることに注意すべきである。しかし、プロラクチン誘導タンパク質およびフォンエブナー腺タンパク質と併用すると、高プロリンタンパク質４は、著しく精度を上昇させることできる。
（実施例１０）
【００８１】
重度、中度、および軽度のドライアイを分類するのに使用することのできる、潜在的なバイオマーカー
臨床試験の１つ、すなわち、涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）の結果に基づいて、その結果を３つのグループ、すなわち、重度（ＴＵＢＴ＜２秒）、中度（ＴＢＵＴ＝２〜５秒）、および軽度（ＴＢＵＴ＝５〜１０秒）にさらに分類した。興味深いことに、上記１０種のバイオマーカーの中で、α−１−酸糖タンパク質１、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９のみが、ドライアイの重症度を差別化する傾向を示すことを見出した（図７Ａ〜７Ｄ）。例えば、α−エノラーゼについては、均一な分布が観察された。しかし、より高いレベルのα−１−酸糖タンパク質１、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、ドライアイの重症度に関係した（より短い涙液層破壊時間）。
(実施例１０Ａ)
【００８２】
涙試料中の１種または複数種のバイオマーカーの絶対レベルを提供する方法
ｉＴＲＡＱおよび内標準としての合成ペプチドを使用することによる、涙液中のドライアイのタンパク質バイオマーカー候補の絶対的定量化。これは、正常な対照被験体およびドライアイ患者からの涙液中の、Ｓ１００Ａ１１タンパク質を定量化するアプローチの例を構成する。１つの対照試料および１つのドライアイ試料を標識するのに、それぞれｉＴＲＡＱ試薬１１４および１１５を使用し、一方、２つの既知の濃度（０．５ｐｍｏｌ／μｌおよび１．２５ｐｍｏｌ／μｌ）の、アミノ酸配列（ＴＥＦＬＳＦＭＮＴＥＬＡＡＦＴＪ）を有する合成Ｓ１００Ａ１１ペプチドフラグメントを標識するのに、ｉＴＲＡＱ試薬１１６および１１７を使用した。試料調製および２Ｄ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、実施例３および実施例４における手順と同じ手順に従った。図８は、対照、ドライアイ、および２つの異なる濃度の内標準に対応した、１１４、１１５、１１６、および１１７のピーク強度を示すＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。レポーターイオン、すなわち、１１４、１１５、１１６および１１７のピーク面積を比較することによって、対照の涙およびドライアイの涙中のＳ１００Ａ１１タンパク質の絶対濃度を、それぞれ、全タンパク質１μｇ当たり１０．７ｎｇおよび全タンパク質１μｇ当たり２５．４ｎｇと計算することができる。このアプローチを使用して、既知量の異なる内標準を加えることによって、一分析で、すべてのバイオマーカーの絶対的定量化を行うことができる。この種類の情報は、ドライアイのための抗体ベースの試験に使用することができるであろう。
（実施例１１）
【００８３】
治療
α−１−糖タンパク質１の発現量を減少させることによる、ドライアイの治療
本発明の下では、α−１−糖タンパク質１（ＡＧＰ）の上方制御によるドライアイの原因は、ＡＧＰ発現が関与する炎症のいずれかを低減または減少させるための、１つまたは複数の方法によって治療することができる。当業者は、ＡＧＰの発現量を低減させるための適当な抗炎症治療を選択することができ、したがって、状態を治療する、または少なくともその症状を軽減することができるであろう。
（実施例１２）
【００８４】
プロラクチン誘導タンパク質の発現量を増加させることによる、ドライアイ状態の治療
本発明の下では、プロラクチン誘導タンパク質（ＰＩＰ）の下方制御によるドライアイの原因は、ＰＩＰの発現量を増加させるための１つまたは複数の方法によって治療することができる。これは、プロラクチンおよび／またはアンドロゲンの投与によって行われ、したがって、状態を治療する、または少なくともその症状を軽減することができる。
（実施例１３）
【００８５】
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の発現量を減少させることによる、ドライアイ状態の治療
本発明の下では、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の上方制御によるドライアイの原因は、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の産生が関与する炎症のいずれかを低減または減少させるための、１つまたは複数の方法によって治療することができる。当業者は、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９を低減させるための適当な治療方法を選択することができ、したがって、状態を治療する、または少なくともその症状を軽減することができるであろう。
（実施例１４）
【００８６】
診断キット
α−エノラーゼについての診断キット
ドライアイ状態用の診断キットは、本発明の少なくとも１種のバイオマーカーと反応することのできる、少なくとも１種の化学物質を含むことができる。このような診断キットは、エノラーゼの酵素的定量のために、Ｄ−グリセリン酸２−ホスフェート（Ｄ−ＧＡ２Ｐ）［２１］または２−ホスホグリセレート（２−ＰＧ）［２２］などのエノラーゼ用の基質を含むことができる。この酵素反応は、マイクロアレイまたはナノアレイ中で、測光法で測定することもできる［２２］。
【００８７】
本発明は、哺乳動物などの動物用の獣医薬においても使用することができることが、当業者に明らかであろう。
【００８８】
本発明を実行するための具体的な実施例を提供してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、当業者によって、様々な改変および改良を行うことができることが理解されよう。
【００８９】
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(2004).
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】分類を誤った症例の割合と使用したバイオマーカーの数との関係を表す図である。
【図２】１０種の潜在的なドライアイバイオマーカーについての、ドライアイグループ（比、ＤＥ：Ｃ、１１６：１１４および１１７：１１４）と対照グループ（比、Ｃ２：Ｃ１、１１５：１１４）の比較を表す図である。スチューデントｔ検定を実施した。ｐ値を、各グラフ上に示す。
【図３】ｉＴＲＡＱを使用した、タンパク質の同定および相対的定量化を表す図である。（Ａ）ｍ／ｚ＝７０１．１０での、プロラクチン誘導タンパク質に由来する、３価に帯電したペプチドイオン、ＴＹＬＩＳＳＩＰＬＱＧＡＦＮＹＪ（Ｊは、ｉＴＲＡＱで修飾されたリジン残基を表す）のＭＳ／ＭＳスペクトル。（Ｂ）１１１．０から１２０．０ＤａにＭＳ／ＭＳスペクトルを拡大すると、ｍ／ｚ＝１１４．１、１１５．１、１１６．１および１１７．１Ｄａで、４つのｉＴＲＡＱレポーターイオンのシグナル強度が得られる。２つの対照試料を標識するのに、ｉＴＲＡＱ１１４および１１５を使用し、２つのドライアイ試料を標識するのに、ｉＴＲＡＱ１１６および１１７を使用した。相対的定量化は、レポーターイオンのピーク面積の比に基づく。
【図４】（Ａ）α−エノラーゼに由来する、１個の３価に帯電したペプチドイオンのＭＳ／ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ＝８７７．４０ＤａでのＳＧＥＴＥＤＦＩＡＤＬＷＧＬＣＴＧＱＩＪ）を表す図であり、（Ｂ）ドライアイ試料と対照試料との間の、α−エノラーゼについての相対的定量化を表す図である。
【図５】（Ａ）α−１−酸糖タンパク質１に由来する、１個の４価に帯電したペプチドイオンのＭＳ／ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ＝４７５．００ＤａでのＹＶＧＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲ）を表す図であり、（Ｂ）ドライアイ試料と対照試料との間の、α−１−酸糖タンパク質１についての相対的定量化を表す図である。
【図６】（Ａ）α−エノラーゼを唯一のバイオマーカーとして使用した場合のＲＯＣ曲線を表す図である。精度（ＲＯＣ曲線下面積）は、８５％である。（Ｂ）プロラクチン誘導タンパク質を唯一のバイオマーカーとして使用した場合のＲＯＣ曲線を表す図である。精度（ＲＯＣ曲線下面積）は、８１％である。（Ｃ）バイオマーカーパネルを使用した場合のＲＯＣ曲線を表す図である。精度（ＲＯＣ曲線下面積）は、９８％である。
【図７】（Ａ）α−エノラーゼ、（Ｂ）α−１−酸糖タンパク質１、（Ｃ）Ｓ１００Ａ９および（Ｄ）Ｓ１００Ａ８についての、各患者の涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）によって比（ＤＥ：Ｃ）を再編した図である。３つのサブグループを区別するために異なる色コードを使用した。 図７Ａ、α−エノラーゼについて （１）黄色の上の７本のバーの組：軽度（ＴＢＵＴ＝５〜１０秒） （２）橙色の中央の８本のバーの組：中度（ＴＵＢＴ＝２〜５秒） （３）赤色の下の１０本のバーの組：重度（ＴＢＵＴ＜２秒） 図７Ｂ、α−１−酸糖タンパク質１について （１）黄色の上の６本のバーの組：軽度（ＴＢＵＴ＝５〜１０秒） （２）橙色の中央の４本のバーの組：中度（ＴＵＢＴ＝２〜５秒） （３）赤色の下の９本のバーの組：重度（ＴＢＵＴ＜２秒） 図７Ｃ、Ｓ１００Ａ９について （１）黄色の上の７本のバーの組：軽度（ＴＢＵＴ＝５〜１０秒） （２）橙色の中央の６本のバーの組：中度（ＴＵＢＴ＝２〜５秒） （３）赤色の下の１０本のバーの組：重度（ＴＢＵＴ＜２秒） 図７Ｄ、Ｓ１００Ａ８について （１）黄色の上の７本のバーの組：軽度（ＴＢＵＴ＝５〜１０秒） （２）橙色の中央の８本のバーの組：中度（ＴＵＢＴ＝２〜５秒） （３）赤色の下の８本のバーの組：重度（ＴＢＵＴ＜２秒）
【図８】涙中の１種のドライアイタンパク質バイオマーカー（Ｓ１００Ａ１１）の絶対的定量化のためのｉＴＲＡＱ実験の、レポートイオン領域（１１４、１１５、１１６および１１７）のＭＳ／ＭＳスペクトルを表す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学的状態に関する。特に、本発明は、粘膜乾燥状態に関する。
【背景技術】
【０００２】
シェーグレン症候群は、口内乾燥症およびドライアイの特定の形態を特徴とする自己免疫性炎症性疾患である。これは、涙腺の涙を分泌する能力に影響し、ドライアイ、口内乾燥症の原因となる唾液腺機能障害、および他の粘膜（ｍｕｃｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、例えば、気管支上皮、膣、および他の粘膜（ｍｕｃｏｓａ）などの乾燥をもたらす。
【０００３】
涙および唾液のこの喪失は、眼の特徴的変化（水性涙欠乏症（ａｑｕｅｏｕｓ ｔｅａｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）または乾性角結膜炎と呼ばれる）および歯の悪化、経口感染の増大、えん下困難および口痛を伴った口の特徴的変化をもたらし得る。しかし、粘膜乾燥は、非シェーグレン症候群下に分類される他の原因にもよる場合がある。この原因は、ある特定の種類の薬物の使用、炎症または感染、または甲状腺機能低下症による場合がある。粘膜乾燥状態は、いずれの原因によるものであっても、哺乳動物などの動物及びヒトの両方に影響し得る。
【０００４】
眼については、眼の眼窩内に位置する涙腺は、少量の涙液を持続的に分泌し、これは、非常に小さな管を通じて、目の表面上に放出される。ドライアイ症候群は、涙液膜の異常性を伴った涙液の喪失として定義することができる。ドライアイの他覚的徴候はほとんどなく、重要なことに、個別基準で変動する不快感が、患者によって最も認められ、患者が援助を求める動機を与える局面である［１］。重篤な場合については、眼球表面損傷および視覚喪失は珍しくない。
【０００５】
ドライアイ（乾性眼）症候群は、大勢の人々に影響を及ぼし、その罹患率は一般人口の１１〜２２％もの高さであり、西側諸国よりアジアで罹患率が高いと推定される［１］。年齢５５歳を超える人および女性においてより一般的であるが、アジアでは、ドライアイは、４５歳を超える人における要因である［２］。罹患率は、視覚表示装置の使用者およびコンタクトレンズ着用者においても著しく高い。
【０００６】
ドライアイ症候群の原因は多様であるが、基本的に、眼球表面および特に角膜上の液体の喪失による。角膜は、眼の最も重要な光学要素であり、ドライアイにより、良好な視覚および患者の生活の質が低下する。涙液層と呼ばれる、眼球表面上の液体層は、数ミクロンの厚さであるが、以下のような層、すなわち、１−最外側の脂質層、２−中間の水層および３−内側のムチン層を有する。ドライアイ症候群は、２つの主な部類、すなわち、涙分泌欠損および過剰な涙蒸発に分類される。涙液膜の脂質層の機能障害は、涙の過剰蒸発をまねく。しかし、ビタミンＡの欠乏によって多くの場合引き起こされるムチン層欠損は、開発途上国を除いてまれである。
【０００７】
ドライアイのための製薬会社による治療上の開発について、非シェーグレンドライアイは、これがこれらの患者の大部分を構成するため、第一標的である。現在、１つの実際の治療薬、すなわち、Ａｌｌｅｒｇａｎ（登録商標）からのＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）だけが市場に出ている。この薬物開発の不足の理由は、ドライアイ及び治療効果の客観的尺度の欠如に主に起因する。
【０００８】
ドライアイ症候群の診断は、自覚症状、シルマー試験（涙液の量の評価）、涙液層破壊時間（涙液膜の質の評価）、およびフルオレセイン染色、ローズベンガル染色、涙液メニスカス高測定、細胞診（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｙｔｏｌｏｇｙ）などを含む、あまり一般的ではない臨床試験に一般に基づく。研究により、臨床試験と症状との間で、および異なる臨床試験の間でさえ、相関は乏しいことが示されている［３、４］。これはまた、治療剤の評価のシナリオを困難にする［５］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、ドライアイなどの粘膜乾燥状態を判定および診断する、新規の改善された方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記の問題に対処し、特に医学的状態の診断および治療のための方法を提供する。概して、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態を診断するための新規な方法を提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態を診断する方法であって、当該被験体からの試料を準備するステップ、および、当該試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ（ここで、当該少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺（Ｖｏｎ Ｅｂｎｅｒ’ｓ ｇｌａｎｄ）タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、及び、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）を含む方法に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態の重症度を判定する方法であって、当該被験体からの試料を準備するステップ、ならびに、当該試料中のα−１−酸−糖タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、ラクトフェリン、リゾチーム、および／または、任意のそれらの誘導体もしくはそれらのフラグメント、の相対的発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態に対する治療効果をモニターする方法であって、当該被験体から試料を準備するステップ、および、当該試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ（当該少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、及び、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）を含む方法を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態を治療する方法であって、当該被験体からの試料を準備するステップ、当該試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を比較するステップ（ここで、当該少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質およびプロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）、および、当該バイオマーカー群の中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量の差異を低減させるステップを含む方法を提供する。
【００１５】
上記態様では、粘膜乾燥状態はドライアイであってもよい。比較するステップは、粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、もしくは粘膜乾燥状態の症状を経験していない、少なくとも１つの被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較とすることができ、および／または比較するステップは、粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、もしくは粘膜乾燥状態の症状を経験していない、統計的に有意な数の被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較とすることができる。試料は液体であってもよい。バイオマーカーの発現量は、少なくとも１種のバイオマーカーの存在量に反映し、またはこの存在量によって測定することができる。比較するステップは、質量分析法によるものとすることができる。被験体は、ヒトまたは哺乳動物とすることができる。
【００１６】
粘膜乾燥状態を治療するための方法において、少なくとも１種のバイオマーカーは、α−１−酸−糖タンパク質１とすることができ、発現量の差異を低減させるステップは、被験体における炎症を低減させることを含む。少なくとも１種のバイオマーカーは、プロラクチン誘導タンパク質とすることができ、発現量の差異を低減させるステップは、プロラクチンおよび／またはアンドロゲンの投与によって、被験体におけるプロラクチン誘導タンパク質の発現量を増加させることを含む。少なくとも１種のバイオマーカーは、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９とすることができ、発現量の差異を低減させるステップは、被験体におけるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の上方制御および／または複合体形成を低減させることを含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、ドライアイの状態を診断するためのバイオマーカーのパネルであって、少なくとも１つの基準値を有する、α−エノラーゼ、プロラクチン誘導タンパク質、α−１−酸−糖タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、ラクトフェリン、リゾチーム、フォンエブナー腺タンパク質、高プロリン４タンパク質、および／またはそれらの誘導体もしくはフラグメントを含むパネルを提供する。このパネルは、状態のより詳細なプロファイルを提供することができ、わずか数個の他のバイオマーカーからの結果と比較して、診断および予後の両方の情報が得られる。バイオマーカーのパネルは、固体支持体上またはゲル中に存在することができる。
【００１８】
別の態様では、本発明は、粘膜乾燥状態を診断するための診断キットであって、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質およびプロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、それらの誘導体またはフラグメント、からなる群から選択される、少なくとも１種のバイオマーカーに反応することのできる、少なくとも１種の化学物質を含む診断キットを提供する。当該少なくとも１種の化学物質は、バイオマーカーのいずれか１つに特異的な、少なくとも１種の抗体とすることができる。当該少なくとも１種の化学物質は、固体支持体上またはゲル中に存在することができる。少なくとも１種のバイオマーカーは、α−エノラーゼとすることができ、少なくとも１種の化学物質は、２−ホスホグリセレートである。この診断キットは、キットの使用に関係する情報をさらに含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書において言及する書誌参考文献は、参考文献のリストの形式で便宜上列記され、実施例の最後に加えられている。そのような書誌参考文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００２０】
定義
バイオマーカー−バイオマーカーは、特定の疾患状態の存在および重症度に関係する、解剖的、生理的、生化学的、または分子的パラメーターである。バイオマーカーは、理学的検査、実験室アッセイおよび医学画像法を包含した、様々な方法によって検出可能であり、測定可能である。本発明の下では、タンパク質、タンパク質誘導体、またはタンパク質フラグメントを、バイオマーカーとして使用することができる。
【００２１】
粘膜の乾燥、粘膜乾燥状態−これを経験している被験体が不快感を感じるような、粘膜を水和、潤滑、または洗浄する体液の自然産生または残留性の減少。
【００２２】
ドライアイ−涙液産生の減少、産生される涙液の残留性欠如または喪失により、患者が眼の不快感を経験する、様々な原因による医学的状態。
【００２３】
バイオマーカーの発現−バイオマーカーの定性的または定量的指標は、患部細胞または患部組織におけるその遺伝子、遺伝子転写物または遺伝子産物の発現から求めることができる。バイオマーカーの定量的指標は、測定されるその遺伝子、遺伝子転写物または遺伝子産物の存在量に反映する。発現量または存在量の差異は、異なるバイオマーカー間、または異なる被験体における同じバイオマーカー間で求めることができる。バイオマーカーの相対的発現量または存在量も、バイオマーカー間、または異なる被験体における同じバイオマーカー間で求めることができる。
【００２４】
粘膜（ｍｕｃｏｓａ）／粘膜（ｍｕｃｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）−すべての身体通路、例えば、瞼の裏側、眼球、および呼吸器管、消化管および尿管、ならびに粘液を分泌する細胞および付随する腺を有する組織などを裏打ちする膜。
【００２５】
タンパク質−特定の順序のアミノ酸の１本または複数本の鎖からなる生体分子。タンパク質は、アイソフォームなどの誘導体を有する場合がある。タンパク質アイソフォームは、いくつかの小さな差異を有するタンパク質のバージョン、通常スプライスバリアントまたはある翻訳後修飾の産物である。本発明の下では、タンパク質は、そのタンパク質が、１または複数の使用される方法によって検出、同定および／または定量化されるのに十分に大きい誘導体およびフラグメントを網羅する。
【００２６】
正常範囲−バイオマーカーの正常範囲は、特定の医学的状態を経験していない、または特定の医学的状態と診断されていない被験体における、バイオマーカーの発現または発現量の範囲である。したがって、この正常範囲からのバイオマーカーの任意の変動（増加または減少）は、医学的状態を示す。本条件下で、バイオマーカーの発現または発現量の正常範囲からの統計的に有意な変動は、粘膜乾燥状態、例えばドライアイの状態などを示す。本発明の下では、正常範囲からの変動は、対照試料を試験試料と並行して試験にかけることによって求めることができる。あるいは、正常基準範囲は、統計的に有意な数の対照試料から予め求めることができ、得られる値は、この正常基準範囲と比較することができる。
【００２７】
一態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態を診断する方法であって、この被験体からの試料を準備するステップ、および、当該試料中の、少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ（ここで、当該少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）ステップを含む方法に関する。別の態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態の重症度を判定する方法であって、当該被験体からの試料を準備するステップ、ならびに当該試料中のα−１−酸−糖タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、ラクトフェリン、リゾチーム、および／または、任意のそれらの誘導体もしくはそれらのフラグメントの相対的発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップを含む方法を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態に対する治療効果をモニターする方法であって、この被験体からの試料を準備するステップ、および、当該試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を比較するステップ（ここで、当該少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質およびプロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）を含む方法を提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、被験体における粘膜乾燥状態を治療する方法であって、当該被験体からの試料を準備するステップ、当該試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を比較するステップ（ここで、当該少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質およびプロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）、および、当該バイオマーカー群中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量の差異を低減させるステップを含む方法を提供する。
【００３０】
上記態様では、粘膜乾燥状態は、ドライアイであってもよい。比較するステップは、粘膜乾燥状態の徴候を呈さず、もしくは粘膜乾燥状態の症状を経験していない、少なくとも１つの被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較とすることができ、および／または比較するステップは、粘膜乾燥状態の徴候を呈さない、もしくは粘膜乾燥状態の症状を経験していない、統計的に有意な数の被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較とすることができる。試料は液体であってもよい。バイオマーカーの発現量は、少なくとも１種のバイオマーカーの存在量に反映し、またはこの存在量によって測定することができる。比較するステップは、質量分析法によるものとすることができる。被験体は、ヒトまたは哺乳動物とすることができる。
【００３１】
粘膜乾燥状態を治療するための方法下で、少なくとも１種のバイオマーカーは、α−１−酸−糖タンパク質１とすることができ、発現量の差異を低減させるステップは、被験体における炎症を低減させることを含む。少なくとも１種のバイオマーカーは、プロラクチン誘導タンパク質とすることができ、発現量の差異を低減させるステップは、プロラクチンおよび／またはアンドロゲンの投与によって、被験体におけるプロラクチン誘導タンパク質の発現量を増加させることを含む。少なくとも１種のバイオマーカーは、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９とすることができ、発現量の差異を低減させるステップは、被験体におけるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の上方制御および／または複合体形成を低減させることを含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、ドライアイの状態を診断するためのバイオマーカーのパネルであって、α−エノラーゼ、プロラクチン誘導タンパク質、フォンエブナー腺タンパク質、高プロリン４タンパク質、および、それらの誘導体またはフラグメントを含むパネルを提供する。このパネルは、状態のより詳細なプロファイルを提供することができ、わずか数個の他のバイオマーカーからの結果と比較して、診断および予測の両方の情報が得られる。バイオマーカーのパネルは、固体支持体上またはゲル中に存在することができる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、粘膜乾燥状態を診断するための診断キットであって、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質およびプロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、それらの誘導体またはフラグメントからなる群から選択される、少なくとも１種のバイオマーカーに反応することのできる、少なくとも１種の化学物質を含む診断キットを提供する。この少なくとも１種の化学物質は、バイオマーカーのいずれか１つに特異的な、少なくとも１種の抗体とすることができる。この少なくとも１種の化学物質は、固体支持体上またはゲル中に存在することができる。少なくとも１種のバイオマーカーは、α−エノラーゼとすることができ、少なくとも１種の化学物質は、２−ホスホグリセレートである。この診断キットは、キットの使用に関係する情報をさらに含むことができる。
【００３４】
本発明の下では、粘膜乾燥に関係するバイオマーカーの群の少なくとも１種のバイオマーカーの検出、同定、および／または定量化により、粘膜乾燥状態の診断に関する基盤が提供される。具体的には、被験体の涙液中での、バイオマーカーの群の少なくなくとも１種のバイオマーカーの検出、同定、および／または定量化により、任意の原因によるドライアイの状態を診断するための基盤が提供される。
【００３５】
バイオマーカーのこの群の任意の１種または複数種のバイオマーカーは、１つまたは複数の適当な方法によって、検出、同定、および／または定量化することができる。これらのバイオマーカーの発現量の正常範囲からの任意の変動は、被験体が状態を訴えていてもいなくても、ドライアイの状態を示す。
【００３６】
これらのバイオマーカーの１種または複数種の発現量を測定するために、被験体から涙液を得、バイオマーカーを検出、同定、および／または定量化する。免疫反応（例えば、酵素結合免疫吸着測定法）および酵素反応などの他の生化学反応などの多くの方法が、本発明下の技術分野において利用可能である。そのような反応は、色変化またはある特定の波長の光の吸光度もしくは透過の差異などの測光手段によって、バイオマーカーを検出することを含むことができる。
【００３７】
使用するのに適した別の方法は、当業者に周知の質量分析法（ＭＳ）である。最近のＭＳシステムは、イオン化、検出および分析手段を含む。試料の分析に関して、このシステムは、検出手段から得られるデータを、既知の標準と比較することによって、試料中の成分を同定することができ、またはこのシステムは、同じ試料内の異なる成分を比較することによって、結果を導出することができる。
【００３８】
本発明の下では、定量的プロテオミクス法である、ナノスケールでの２次元液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析法（ナノＬＣ−ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）を伴ったｉＴＲＡＱ技術［６］を、統計分析と組み合わせ、涙分泌の喪失を伴ったドライアイ症候群と診断された患者の涙液中のバイオマーカーを、検出、同定、および定量化するのに使用した。ナノＬＣ−ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳは、当技術分野で周知であり、複雑なタンパク質混合物を分離するために開発された［２０］。この分離は、以前は、１次元または２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１Ｄまたは２Ｄ ＰＡＧＥ）を使用して実施されたが不十分であった。
【００３９】
検出されたバイオマーカーを、ドライアイの診断に使用するのに十分な信頼度を獲得するために、ＭＳデータの分析に厳密な判定基準が設定され、その後統計分析を行うことによって、状態の重症度の指標が提供される。
【００４０】
粘膜乾燥状態の診断に関して、本発明の下でのバイオマーカーの生物学的機能は、以下の通りである。
【００４１】
α−エノラーゼ：α−エノラーゼ（ａｅ）は、多くの細胞において豊富に発現される、主要な糖分解酵素の１つである。しかし、さらに最近では、α−エノラーゼは、造血細胞（好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球）、上皮細胞、神経細胞などの細胞において、表面タンパク質として、細胞表面上にも見出された［７］。その生来の糖分解機能に加えて、α−エノラーゼは、多機能性タンパク質として認識されてきた。非常に最近の研究では、α−エノラーゼは、いくつかの疾患プロセス、例えば、多くの自己免疫障害、癌、全身性真菌症、および歯科疾患において重要な役割を果す場合があることが示されている。しかし、涙液中にα−エノラーゼが存在するのを報告するのは、これが最初である。
【００４２】
α−１−酸糖タンパク質１：α１−酸糖タンパク質１（ＡＧＰ）は、４１〜４３ｋＤａの分子量を有する、大幅にグリコシル化されたタンパク質（４５％）である［８］。これはまた、リポカリンファミリーに属する。これは、炎症反応に関係する。その合成は、糖質コルチコイド、インターロイキン−１、およびインターロイキン−６によって制御される。その抗炎症効果が注目された。ＡＧＰは、炎症誘発効果および抗炎症効果の両方を呈する。これらの２つの免疫調節効果は、ＡＧＰが、免疫応答および炎症の調節に重要な役割を果すことを示すことができる。涙液中にα１−酸糖タンパク質１を検出したのを報告するのも、これが最初である。
【００４３】
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９：Ｓ１００Ａ８およびＡ９は、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ファミリーに属する。Ｓ１００Ａ８、Ａ９およびＡ１２は、炎症誘発タンパク質の新規なグループを形成することを示す証拠が増えている［９］。炎症性疾患では、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の両方の過剰発現が、一般に見られる。これらは炎症部位で分泌される。ドライアイの涙中では、Ｓ１００Ａ８のみの過剰発現が以前に報告されている［１０］。これらの２つのタンパク質は、複合体を形成することができ、これは、高濃度で存在する場合、アポトーシスを誘発する。
【００４４】
Ｓ１００Ａ４：Ｓ１００Ａ４は、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ファミリーのメンバーである。Ｓ１００Ａ４の最もよく知られている役割は、細胞形状変化を引き起こす、その能力である。さらに最近では［１１］、Ｓ１００Ａ４は、ｉｎ ｖｉｖｏで角膜血管新生を刺激することができることが示された。Ｓ１００Ａ４はまた、成長因子シグナル伝達およびアポトーシス細胞死に明らかに関与することから、成長の恒常性に関与していると思われる。Ｓ１００Ａ４の発現が、おそらく細胞外基質を再構築し、細胞外基質中に生じる接着媒介巨大分子（ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）の再配置を促進することによって、細胞の接着性を変化させるというかなりの証拠が存在する［１２］。
【００４５】
Ｓ１００Ａ１１：これは、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ファミリーの別のメンバーである。Ｓ１００Ａ１１は、アポトーシスに関与すると思われる［１３］。
【００４６】
ラクトフェリンおよびリゾチーム：これらは、周知の豊富なヒト涙タンパク質である。これらはともに、眼球表面上で抗菌活性を有する。以前の研究では、ドライアイを有する患者において、これら２つの涙タンパク質の下方制御が観察された［１４、１０］。
【００４７】
フォンエブナー腺タンパク質：涙特異的プレアルブミン（ｔｅａｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｅａｌｂｕｍｉｎ）（ＴＳＰＡ）または涙リポカリンとも呼ばれる、フォンエブナー腺タンパク質［１５］は、主要な涙タンパク質の１つであり、主要な脂質結合タンパク質として作用する。これは、上皮表面の一般的な保護因子とみなされている。
【００４８】
プロラクチン誘導タンパク質：プロラクチン誘導タンパク質（ＰＩＰ）は、いくつかの外分泌組織、例えば、涙腺、唾液腺、汗腺などにおいて一般に発現され、乳癌にも関係し得る［１６］。非常に最近の研究により、プロラクチン誘導タンパク質は、眼瞼炎患者の涙中で下方制御されることが示されたが、ドライアイとの関連を報告するのはこれが最初となるであろう［１７］。
【００４９】
高プロリン４タンパク質：これも、最近、豊富な涙タンパク質の１つとしてみなされている［１８、１０］。高プロリンタンパク質４は、涙腺において豊富に発現され、そこでこれは、腺房細胞中に見出される［１９］。これは、腺房細胞の機能を反映する可能性がある。これは、ドライアイ患者において下方制御されることが示された［１０］。
【００５０】
本発明の方法を使用して、ドライアイなどの粘膜乾燥状態の診断がされたら、当該方法をその状態のための治療効果をモニターする方法としても使用することが可能になるであろう。被験体に、治療方法を処方し、本発明の１種または複数種のバイオマーカーの発現量を定期的に求めることによって、間隔を置いてモニターすることができる。そのような粘膜乾燥状態の治療の種類および継続期間、ならびに治療効果をモニターする間隔および継続期間は、医師などの当業者に分かるであろう。本発明の方法は、薬物治験での新規な治療効果をモニターするためにも使用することができる。
【００５１】
本発明は、本発明の１種または複数種のバイオマーカーの変動の原因に対抗することにより、１種または複数種のバイオマーカーの発現量を正常範囲に戻すことによって、粘膜乾燥状態を治療する方法も提供する。
【００５２】
本発明は、診断のため、および粘膜乾燥状態をプロファイルするためのバイオマーカーのパネルも提供する。いくつかのバイオマーカーの発現量は、医学的状態によって変化する場合があるが、バイオマーカーのパネルにより、状態のより詳細で正確な診断が提供される。パネル上のバイオマーカーが測定される場合、パネル上の互いのバイオマーカーの相対的発現量または存在量により、状態の重症度を示すことができる。
【００５３】
本発明は、ドライアイなどの粘膜乾燥状態の診断のための診断キットも提供する。このキットは、１種または複数種のバイオマーカーと反応することのできる少なくとも１種の化学物質を含み、その結果反応を検出することができる。例えば、化学物質は、１種のバイオマーカーに特異的に結合する抗体とすることができる。あるいは、化学物質は、バイオマーカーのための基質とすることができる。これらの化学物質は、固体支持体またはゲルなどの支持体上に存在することができる。この診断キットにより、定性的および／または定量的結果を得ることができ、医学的状態を診断することが可能になる。
【００５４】
これまでに本発明を概ね説明してきたので、本発明は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。この実施例は、例示の目的で提供され、本発明を限定することは意図されていない。
【００５５】
方法
（実施例１）
【００５６】
患者
ドライアイ症候群と臨床的に診断された合計２８人の患者および他の眼の疾患を有していない２０人の対照被験者を採用した。すべての参加被験者からインフォームドコンセントを得、全体の手順は、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＥＲＩ）の治験審査委員会によって承認され、また、ヘルシンキ宣言の教義に従った。臨床検査は、自覚症状、シルマー試験（麻酔なし）、涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）試験、および他の一般的な眼科検査、例えば視力、ならびに眼瞼縁およびマイボーム腺評価などを包含した。ドライアイについての一般的な感情症状は、焼灼感、痒み感および刺痛感、異物感、乾燥感、視覚のぼやけ、羞明（まぶしがり）、疼痛および重い目または疲れ目を包含する。患者は、シルマー試験、ＴＢＵＴ、および自覚症状に基づいて、ドライアイを有すると分類された。
（実施例２）
【００５７】
採取および涙タンパク質溶出
すべての患者の涙液は、シルマー細片（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ ｓｔｒｉｐ）を使用して採取した。この試験のために、麻酔なしで５分間、下の瞼の中に薄い（紙の）涙用細片を置く。続いて採取した涙をこの細片から溶出した。涙の低減により、キャピラリー法を使用して涙を採取することが非現実的になったので、これを行うことができることは重要であった。採取後、シルマー細片は、分析するまで−８０℃に直ちに凍結させた。シルマー細片の最初の１０ｍｍを切断して小片にし、１５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に３時間浸漬することによって、シルマー細片から涙タンパク質を溶出した。次いで、全涙タンパク質の濃度を、各試料について、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。
（実施例３）
【００５８】
研究デザインおよびｉＴＲＡＱ（相対的および絶対的定量化ｉＴＲＡＱのためのアイソバリックタグ（ｉｓｏｂａｒｉｃ ｔａｇ））試料調製
ｉＴＲＡＱ技術により、４つの試料を同時に標識することが可能になるので、各セットにおいて２つの対照（Ｃ）および２つのドライアイ試料（ＤＥ）を使用した（合計１４セット）。これらの１４セット中、個々の対照試料を９セットにおいて使用し、プールした対照試料（５つの対照からプールした試料１種、および、３つの対照からプールした試料１種）を、別の５セットの実験において使用した。各試料からの３０μｇをｉＴＲＡＱ実験に使用した。ｉＴＲＡＱ手順は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって提供されたプロトコルに従った。ここでは、ｉＴＲＡＱ試薬キットからの、２０μｌの溶解緩衝液（トリエチルアンモニウムビカーボネート）および１μｌの変性剤（２％のＳＤＳ）を、試料に加えた。次いで、２μｌの還元試薬（トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を次いで加え、試料を６０℃で１．５時間インキュベートした。次ステップで、１μｌのシステイン遮断試薬（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）（メチルメタンチオスルホネート）を加え、室温で２０分間インキュベートした。次いで試料を、トリプシンを用いて、３７℃で一晩消化した。ｉＴＲＡＱ試薬１１４および１１５を対照試料に加え、一方、ｉＴＲＡＱ試薬１１６および１１７をドライアイ試料に加えた。次いで、試料を室温で３時間インキュベートした。各ｉＴＲＡＱ試薬で標識した試料の内容物を合わせ、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮機を使用して乾燥させた。試験のために、１０μｌのローディング緩衝液（水中０．１％のギ酸、２％のアセトニトリル）を加えることによって試料を再構成した後、２Ｄナノ−ＬＣ−ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。
（実施例４）
【００５９】
２次元ナノ−ＬＣ−ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析
ナノ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｑ−Ｓｔａｒ ＸＬ、ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）と一体となった２次元ナノＬＣ（ＤＩＯＮＥＸ、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を分析のために使用した。ペプチドの２次元ＬＣ分離は、最も一般的な構成であり、強陽イオン交換（ＳＣＸ）とそれに続く逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーからなる。第１の次元で使用したＳＣＸカラムは、ＤＩＯＮＥＸ、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓからのもの（内径３００μｍ×１０ｃｍ 多孔度 １０Ｓ ＳＣＸ）であった。
【００６０】
ペプチド混合物の溶出は、すべて３０μｌ／分の流速で、１０段階の漸増塩濃度（１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭおよび１０００ｍＭの酢酸アンモニウムの２０μｌの注入）を使用して、および０．１％ギ酸／ＡＣＮ（９５：５、ｖ：ｖ）のローディング溶媒を使用して実施した。第２の次元で使用したＲＰカラムは、自己充填ＰｉｃｏＦｒｉｔ（外径３６０μｍ、内径７５μｍ、５０ｃｍ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）から自己充填した、１０ｃｍ×内径７５μｍのマイクロキャピラリーＬＣカラムであった。このキャピラリーカラムに、自作のカラム充填装置を使用して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）からのＬｕｎａ Ｃ１８、３μｍ、１００Åを充填した。このキャピラリーカラムは、スプレーチップ（１５μｍの開口）が組み込まれていた。このチップは、ナノスプレーインターフェース（Ｐｒｏｔａｎａ、Ｏｄｅｎｓｅ、デンマーク）と直接連結して、ＡＢＩのＱ−ＴＯＦ質量分析計中につながることができる。
【００６１】
ＳＣＸ分離の後、脱塩のために、３０μＬ／分で、Ｆａｍｏｓ自動サンプラー（ＤＩＯＮＥＸ、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ）からトラップカートリッジ（ＤＩＯＮＥＸ、ＬＣ ＰａｃｋｉｎｇｓからのＣ１８、０．３×５ｍｍ）に試料を添加した。アセトニトリル／水（０．１％のギ酸を含む、２／９８、ｖ／ｖ）で５分洗浄した後、システムを切り替えて（Ｓｗｉｔｃｈｏｓ、ＤＩＯＮＥＸ、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ）、ＲＰ分析用キャピラリーカラムに合わせた。最終溶媒（ｕｌｔｉｍａｔｅ ｓｏｌｖｅｎｔ）送達システム（ＤＩＯＮＥＸ、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ）を使用して、約３００ｎＬ／分の流速での、８５分にわたる２０％から９５％のアセトニトリル（０．１％のギ酸）の直線勾配を使用することによって、トリプシン消化物を分析した。ナノスプレーおよび他の計測装置の主要なパラメーターの設定は、以下の通りであった：イオンスプレー電圧（ＩＳ）＝２２００Ｖ、カーテンガス（ＣＵＲ）＝２０、クラスター分離電位（ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＤＰ）＝６０Ｖ、集束電位（ＦＰ）＝２６５Ｖ、衝突ガス設定（ＣＡＤ）＝窒素ガスについて５、ＤＰ２＝１５。
【００６２】
すべてのデータは、Ａｎａｌｙｓｔ ＱＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともに情報依存取得（ＩＤＡ）モードを使用して取得した。ＩＤＡパラメーターについては、３００〜１２００の質量範囲において、１秒の飛行時間（ＴＯＦ）質量分析法（ＭＳ）サーベイスキャン、その後に、１００〜１５００の質量範囲において、２回のそれぞれ３秒のプロダクトイオンスキャンが続いた。「すべて強調する」機能を、ＩＤＡ実験において使用した。切り替え判定基準は、２から４の荷電状態および２０カウント／秒超の表示しきい値（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）で、質量−電荷比（ｍ／ｚ）＝３５０超およびｍ／ｚ＝１２００未満のイオンに対して設定した。前者の標的イオンは、６０秒間排除した。ＩＤＡ衝突エネルギー（ＣＥ）パラメータースクリプトを、ＣＥを自動的に制御するために使用した。
（実施例５）
【００６３】
データ分析
ｉＴＲＡＱ実験についてのデータ分析は、ＰｒｏＧｒｏｕｐ Ｖｉｅｗ １．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともにＰｒｏＱＵＡＮＴ １．０を使用して実施し、ＩＰＩ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｅｘ）のヒトデータベースｖ３．１５と対照して探索した。ＰｒｏＱＵＡＮＴ探索でのペプチド同定のために設定した質量許容誤差は、それぞれ、ＭＳについて０．１５ＤａおよびＭＳ／ＭＳについて０．１０Ｄａであった。信頼度設定のためのカットオフは７５であった。他の探索パラメーターは、システイン固定修飾（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｆｉｘｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）としてのＭＭＴＳ（メチルメタンチオスルホネート）、トリプシン切断部位の切断ミス１（１ ｍｉｓｓｅｄ ｔｒｙｐｓｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）、ゾーン修飾（ｚｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）でのメチオニンへの酸化、ならびに、リジンおよびチロシンへのｉＴＲＡＱ修飾を伴った独自アミノ酸を包含する。
【００６４】
次いで、Ｐｒｏ Ｑｕａｎｔによって生じた結果を、Ｐｒｏ Ｇｒｏｕｐ Ｖｉｅｗｅｒ １．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により分析し、集計することによって、ＰｒｏＧｒｏｕｐレポートを作成した。タンパク質同定の判定基準は、以下の通りであった。（ａ）２超のＰｒｏｔＳｃｏｒｅ（９９％超の信頼度）を有するタンパク質は、すべて容認した。（ｂ）ＰｒｏｔＳｃｏｒｅ＝２（９９％の信頼度）を有するタンパク質、一般に９９％の信頼度を有する１個のペプチドは、手作業でＭＳ／ＭＳスペクトルを確認して容認した。示差的な表現のために、別個に標識した試料の組合せの間に起こり得るピペット誤差を補正するために、バイアス補正因子を適用した。
【００６５】
ｉＴＲＡＱ技術を使用した、タンパク質の相対的定量化は、ＭＳ／ＭＳスペクトルからのｍ／ｚ１１４、１１５、１１６および１１７Ｄａのピーク面積の比に基づく。２つの対照（Ｃ１およびＣ２）は、１１４および１１５でタグを付け、２つのドライアイ試料（ＤＥ１およびＤＥ２）は、１１６および１１７でタグを付けたので、相対的定量的結果は、ＤＥ１：Ｃ１、ＤＥ２：Ｃ１、ＤＥ１：Ｃ２、ＤＥ２：Ｃ２、Ｃ１：Ｃ２およびＣ２：Ｃ１として表すことができる。定量的結果については、報告する比に加えて、Ｐｒｏ Ｇｒｏｕｐにより、ｐ値および誤差因子（ＥＦ）も得られる。より小さなｐ値（０から１のスケールで）は、実際の生物学的差異から生じる発現の変化（単一でない比、例えば、病的試料対正常試料）について、より高い信頼度を多くの場合意味する。ＥＦは、任意の報告された比について９５％の不確実性範囲を表す。
（実施例６）
【００６６】
統計分析
（ａ）比の平均の計算
１４セットのｉＴＲＡＱデータから、特定のタンパク質についての比の平均を得るために、ＥＦを関与させることによる、加重平均計算を使用した。最初に、比を対数空間［ｌｏｇ（比）］に変換した。次いで、加重値としてＥＦの対数の逆数を使用した。対数空間での加重平均は、以下の式を使用して計算した。
加重値平均（対数空間）＝合計［ｌｏｇ（比）×加重値］／合計（加重値）
式中、加重値＝１／ｌｏｇ ＥＦ
最後に、これを対数空間から元に戻すことによって、「比の加重値平均」を求める。
【００６７】
（ｂ）ｔ検定によって有意な変化を見出すこと
この比を２つのグループ、すなわち、ドライアイグループ（ＤＥ１：Ｃ１、ＤＥ２：Ｃ１、ＤＥ１：Ｃ２、ＤＥ２：Ｃ２）および対照グループ（Ｃ１：Ｃ２およびＣ２：Ｃ１）に分けた。１４セットのｉＴＲＡＱ実験からのデータを合わせ、スチューデントｔ検定を実施してｐ値を計算することよって、ドライアイグループと対照グループの間の変化が有意であるかどうかを評価した（０．０５未満のｐは、有意な変化であると考えられた）。
【００６８】
（ｃ）バイオマーカーパネルの選択
ｔ検定後、１０種のバイオマーカー候補を、その０．０５未満のｐ値に基づいて選択した。高プロリンタンパク質４も、文献［１０］で報告されていたので、バイオマーカーとして採用した。線形分類器を使用して、これらのバイオマーカー候補の最良の組合せを決定することによって、バイオマーカーパネルを形成した。最初に、個々のバイオマーカー候補について、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を得た。１位に格付けされたバイオマーカー候補（α−エノラーゼ）を採用し、ドライアイの症例の同定のために使用した。α−エノラーゼによって陰性と分類された試料のために、残っている１０種のバイオマーカー候補のうちの任意の最大８種の組合せを使用する線形分類器を構築した。バイオマーカーの最適なパネルの選択は、異なる数のバイオマーカー候補の性能曲線（図１）によって決定した。結果として、３種のタンパク質（ｐ０、ｐ１およびｐ２）の線形結合
ｙ＝ｌｏｇ２比＿ｐ０ ＋ ａ１・ｌｏｇ２比＿ｐ１ ＋ ａ２・ｌｏｇ２比＿ｐ２
を、ドライアイの症例と正常な場合をさらに区別するために使用した。パラメーターａ１およびａ２は、ＲＯＣ精度（ＲＯＣ曲線下面積）の最適化に基づいて求めた。
（実施例７）
【００６９】
結果
涙タンパク質同定
タンパク質同定のための非常に厳密な判定基準（２超のＰｒｏｔＳｃｏｒｅ、９９％超の信頼度）を使用して、１４セットのｉＴＲＡＱ実験から、合計６４種の涙タンパク質を同定した。このしきい値を用いて、一般に、高信頼度を有する２個以上のペプチドを、タンパク質同定のために使用した。ＰｒｏＧｒｏｕｐ Ｖｉｅｗでは、各ペプチドは、２．０以下しかＰｒｏｔＳｃｏｒｅに寄与することができない（９９．０％以下の高さの信頼度に等価）。表１に、各タンパク質について、全ＰｒｏｔＳｃｏｒｅおよび同定されたペプチドの数を含む、タンパク質同定リストを示す。
【００７０】
【表１−１】
【００７１】
【表１−２】
【００７２】
【表１−３】
（実施例８）
【００７３】
ｉＴＲＡＱ技術によってドライアイ患者を正常な対照と比較した、涙タンパク質の相対的定量化および潜在的なバイオマーカーの発見
全体的に、統計分析により、合計で１０種のタンパク質が、ドライアイグループと正常な対照グループとの間で異なって発現され、ドライアイ患者において、６種のタンパク質が上方制御され、４種のタンパク質が下方制御されたことが示された。これら１４セットからの１０種のドライアイバイオマーカーについての比、ｐ値およびＥＦを以下に示す。
【００７４】
６種の上方制御されたタンパク質、すなわち、α−エノラーゼ、α−１−酸糖タンパク質１、Ｓ１００Ａ８（カルグラニュリンＡ）、Ｓ１００Ａ９（カルグラニュリンＢ）、Ｓ１００Ａ４およびＳ１００Ａ１１（カルギザリン）が見つかり、４種の下方制御されたタンパク質、すなわち、プロラクチン誘導タンパク質（ＰＩＰ）、フォンエブナー腺タンパク質（涙特異的プレアルブミン、リポカリン）、ラクトフェリンおよびリゾチームが見つかった（図２を参照されたい）。表２に、対照グループおよびドライアイグループについての、上記１０種のタンパク質の加重平均比およびｐ値を要約する。これらの１０種のバイオマーカーの中で、α−エノラーゼ、α−１−酸糖タンパク質１、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１およびプロラクチン誘導タンパク質は、これまで一度も報告されていなかった。図３〜５は、プロラクチン誘導タンパク質、α−エノラーゼおよびα−１−酸糖タンパク質１についての３つの代表的なＭＳ／ＭＳスペクトルを示し、これらにより、同定および定量的情報の両方が得られる。
【００７５】
【表２】
【００７６】
図３Ａは、ｍ／ｚ＝７０１．１０での、プロラクチン誘導タンパク質に由来する、１個の３価に帯電したペプチドイオン、ＴＹＬＩＳＳＩＰＬＱＧＡＦＮＹＪ（Ｊは、ｉＴＲＡＱで修飾されたリジン残基を表す）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。１００〜１２００Ｄａの質量範囲において、ｂイオンシリーズおよびｙイオンシリーズの両方が観察された。１１１．０から１２０．０ＤａにＭＳ／ＭＳスペクトルを拡大すると、ｍ／ｚ＝１１４．１、１１５．１、１１６．１および１１７．１Ｄａで、４つのｉＴＲＡＱレポーターイオンが得られる。一般に、２つの対照試料を標識するのに、ｉＴＲＡＱ試薬１１４および１１５を使用し、２つのドライアイ試料を標識するのに、ｉＴＲＡＱ試薬１１６および１１７を使用した。タンパク質の相対量は、ｍ／ｚ＝１１４．１、１１５．１、１１６．１および１１７．１Ｄａでのレポーターイオンのピーク面積の比に基づいた。図３Ｂから、ドライアイの涙中のプロラクチン誘導タンパク質の下方制御が、はっきりと観察された。図４Ａおよび５Ａは、それぞれ、α−エノラーゼに由来する、１個の３価に帯電したペプチドイオン（ｍ／ｚ＝８７７．４０ＤａでのＳＧＥＴＥＤＦＩＡＤＬＷＧＬＣＴＧＱＩＪ）およびα−１−酸糖タンパク質１に由来する、１個の４価に帯電したペプチドイオン（ｍ／ｚ＝４７５．００ＤａでのＹＶＧＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲ）のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。同様に、ＭＳ／ＭＳスペクトルの拡大により（図４Ｂおよび５Ｂ）、ドライアイの涙液中でのα−エノラーゼおよびα−１−酸糖タンパク質１の過剰発現が明らかになった。
（実施例９）
【００７７】
ドライアイバイオマーカーおよびバイオマーカーパネルについてのＲＯＣ曲線
最初に、各バイオマーカー候補について、個々にＲＯＣ曲線を作成した。ＲＯＣ曲線では、ＤＥ：Ｃ比についての様々なカットオフ値の真陽性率（感度）対偽陽性率（１−特異度）がプロットされる。ＲＯＣ曲線下面積も計算した。この面積は精度である。ＲＯＣ曲線は、異なる試験の実績を比較するのに有用である。上方制御されたタンパク質の中で、最良の個々のバイオマーカー候補は、８５％の精度でα−エノラーゼであり（図６Ａ）、一方、プロラクチン誘導タンパク質は、８１％の精度で、下方制御されたタンパク質の筆頭である（図６Ｂ）。
【００７８】
線形分類を使用して、バイオマーカーの最良の組合せが、状態をプロファイルするためのバイオマーカーのパネルとして有用であることが判明した。このバイオマーカーパネルは、４種のタンパク質、すなわち、α−エノラーゼ（ａｅ）、プロラクチン誘導タンパク質（ＰＩＰ）、フォンエブナー腺タンパク質（ｖＥｇｐ）および高プロリンタンパク質４（ｐｒ４）を含有する。方法は２段階アプローチである。
【００７９】
最初に、α−エノラーゼの比（ＤＥ：Ｃ）が１．７０を超える場合、ドライアイ試料が予想されるであろう。この判定基準を満たさない試料については、ドライアイの症例をさらに同定するために、以下の式が使用されることになる。
ｙ＝ｌｏｇ２比（ｐｒ４）−ｌｏｇ２比（ＰＩＰ）−０．８ｌｏｇ２比（ｖＥｇｐ）
ｙについてのカットオフ値は、０．２から１．８の範囲である。
【００８０】
このアプローチを使用することによって、ドライアイを正確に診断するための精度を、９８％に上昇させることができる。高プロリンタンパク質４は、単一のバイオマーカーとして使用される場合、性能が非常に劣ることに注意すべきである。しかし、プロラクチン誘導タンパク質およびフォンエブナー腺タンパク質と併用すると、高プロリンタンパク質４は、著しく精度を上昇させることできる。
（実施例１０）
【００８１】
重度、中度、および軽度のドライアイを分類するのに使用することのできる、潜在的なバイオマーカー
臨床試験の１つ、すなわち、涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）の結果に基づいて、その結果を３つのグループ、すなわち、重度（ＴＵＢＴ＜２秒）、中度（ＴＢＵＴ＝２〜５秒）、および軽度（ＴＢＵＴ＝５〜１０秒）にさらに分類した。興味深いことに、上記１０種のバイオマーカーの中で、α−１−酸糖タンパク質１、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９のみが、ドライアイの重症度を差別化する傾向を示すことを見出した（図７Ａ〜７Ｄ）。例えば、α−エノラーゼについては、均一な分布が観察された。しかし、より高いレベルのα−１−酸糖タンパク質１、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、ドライアイの重症度に関係した（より短い涙液層破壊時間）。
(実施例１０Ａ)
【００８２】
涙試料中の１種または複数種のバイオマーカーの絶対レベルを提供する方法
ｉＴＲＡＱおよび内標準としての合成ペプチドを使用することによる、涙液中のドライアイのタンパク質バイオマーカー候補の絶対的定量化。これは、正常な対照被験体およびドライアイ患者からの涙液中の、Ｓ１００Ａ１１タンパク質を定量化するアプローチの例を構成する。１つの対照試料および１つのドライアイ試料を標識するのに、それぞれｉＴＲＡＱ試薬１１４および１１５を使用し、一方、２つの既知の濃度（０．５ｐｍｏｌ／μｌおよび１．２５ｐｍｏｌ／μｌ）の、アミノ酸配列（ＴＥＦＬＳＦＭＮＴＥＬＡＡＦＴＪ）を有する合成Ｓ１００Ａ１１ペプチドフラグメントを標識するのに、ｉＴＲＡＱ試薬１１６および１１７を使用した。試料調製および２Ｄ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、実施例３および実施例４における手順と同じ手順に従った。図８は、対照、ドライアイ、および２つの異なる濃度の内標準に対応した、１１４、１１５、１１６、および１１７のピーク強度を示すＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。レポーターイオン、すなわち、１１４、１１５、１１６および１１７のピーク面積を比較することによって、対照の涙およびドライアイの涙中のＳ１００Ａ１１タンパク質の絶対濃度を、それぞれ、全タンパク質１μｇ当たり１０．７ｎｇおよび全タンパク質１μｇ当たり２５．４ｎｇと計算することができる。このアプローチを使用して、既知量の異なる内標準を加えることによって、一分析で、すべてのバイオマーカーの絶対的定量化を行うことができる。この種類の情報は、ドライアイのための抗体ベースの試験に使用することができるであろう。
（実施例１１）
【００８３】
治療
α−１−糖タンパク質１の発現量を減少させることによる、ドライアイの治療
本発明の下では、α−１−糖タンパク質１（ＡＧＰ）の上方制御によるドライアイの原因は、ＡＧＰ発現が関与する炎症のいずれかを低減または減少させるための、１つまたは複数の方法によって治療することができる。当業者は、ＡＧＰの発現量を低減させるための適当な抗炎症治療を選択することができ、したがって、状態を治療する、または少なくともその症状を軽減することができるであろう。
（実施例１２）
【００８４】
プロラクチン誘導タンパク質の発現量を増加させることによる、ドライアイ状態の治療
本発明の下では、プロラクチン誘導タンパク質（ＰＩＰ）の下方制御によるドライアイの原因は、ＰＩＰの発現量を増加させるための１つまたは複数の方法によって治療することができる。これは、プロラクチンおよび／またはアンドロゲンの投与によって行われ、したがって、状態を治療する、または少なくともその症状を軽減することができる。
（実施例１３）
【００８５】
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の発現量を減少させることによる、ドライアイ状態の治療
本発明の下では、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の上方制御によるドライアイの原因は、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の産生が関与する炎症のいずれかを低減または減少させるための、１つまたは複数の方法によって治療することができる。当業者は、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９を低減させるための適当な治療方法を選択することができ、したがって、状態を治療する、または少なくともその症状を軽減することができるであろう。
（実施例１４）
【００８６】
診断キット
α−エノラーゼについての診断キット
ドライアイ状態用の診断キットは、本発明の少なくとも１種のバイオマーカーと反応することのできる、少なくとも１種の化学物質を含むことができる。このような診断キットは、エノラーゼの酵素的定量のために、Ｄ−グリセリン酸２−ホスフェート（Ｄ−ＧＡ２Ｐ）［２１］または２−ホスホグリセレート（２−ＰＧ）［２２］などのエノラーゼ用の基質を含むことができる。この酵素反応は、マイクロアレイまたはナノアレイ中で、測光法で測定することもできる［２２］。
【００８７】
本発明は、哺乳動物などの動物用の獣医薬においても使用することができることが、当業者に明らかであろう。
【００８８】
本発明を実行するための具体的な実施例を提供してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、当業者によって、様々な改変および改良を行うことができることが理解されよう。
【００８９】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】分類を誤った症例の割合と使用したバイオマーカーの数との関係を表す図である。
【図２】１０種の潜在的なドライアイバイオマーカーについての、ドライアイグループ（比、ＤＥ：Ｃ、１１６：１１４および１１７：１１４）と対照グループ（比、Ｃ２：Ｃ１、１１５：１１４）の比較を表す図である。スチューデントｔ検定を実施した。ｐ値を、各グラフ上に示す。
【図３】ｉＴＲＡＱを使用した、タンパク質の同定および相対的定量化を表す図である。（Ａ）ｍ／ｚ＝７０１．１０での、プロラクチン誘導タンパク質に由来する、３価に帯電したペプチドイオン、ＴＹＬＩＳＳＩＰＬＱＧＡＦＮＹＪ（Ｊは、ｉＴＲＡＱで修飾されたリジン残基を表す）のＭＳ／ＭＳスペクトル。（Ｂ）１１１．０から１２０．０ＤａにＭＳ／ＭＳスペクトルを拡大すると、ｍ／ｚ＝１１４．１、１１５．１、１１６．１および１１７．１Ｄａで、４つのｉＴＲＡＱレポーターイオンのシグナル強度が得られる。２つの対照試料を標識するのに、ｉＴＲＡＱ１１４および１１５を使用し、２つのドライアイ試料を標識するのに、ｉＴＲＡＱ１１６および１１７を使用した。相対的定量化は、レポーターイオンのピーク面積の比に基づく。
【図４】（Ａ）α−エノラーゼに由来する、１個の３価に帯電したペプチドイオンのＭＳ／ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ＝８７７．４０ＤａでのＳＧＥＴＥＤＦＩＡＤＬＷＧＬＣＴＧＱＩＪ）を表す図であり、（Ｂ）ドライアイ試料と対照試料との間の、α−エノラーゼについての相対的定量化を表す図である。
【図５】（Ａ）α−１−酸糖タンパク質１に由来する、１個の４価に帯電したペプチドイオンのＭＳ／ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ＝４７５．００ＤａでのＹＶＧＧＱＥＨＦＡＨＬＬＩＬＲ）を表す図であり、（Ｂ）ドライアイ試料と対照試料との間の、α−１−酸糖タンパク質１についての相対的定量化を表す図である。
【図６】（Ａ）α−エノラーゼを唯一のバイオマーカーとして使用した場合のＲＯＣ曲線を表す図である。精度（ＲＯＣ曲線下面積）は、８５％である。（Ｂ）プロラクチン誘導タンパク質を唯一のバイオマーカーとして使用した場合のＲＯＣ曲線を表す図である。精度（ＲＯＣ曲線下面積）は、８１％である。（Ｃ）バイオマーカーパネルを使用した場合のＲＯＣ曲線を表す図である。精度（ＲＯＣ曲線下面積）は、９８％である。
【図７】（Ａ）α−エノラーゼ、（Ｂ）α−１−酸糖タンパク質１、（Ｃ）Ｓ１００Ａ９および（Ｄ）Ｓ１００Ａ８についての、各患者の涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）によって比（ＤＥ：Ｃ）を再編した図である。３つのサブグループを区別するために異なる色コードを使用した。 図７Ａ、α−エノラーゼについて （１）黄色の上の７本のバーの組：軽度（ＴＢＵＴ＝５〜１０秒） （２）橙色の中央の８本のバーの組：中度（ＴＵＢＴ＝２〜５秒） （３）赤色の下の１０本のバーの組：重度（ＴＢＵＴ＜２秒） 図７Ｂ、α−１−酸糖タンパク質１について （１）黄色の上の６本のバーの組：軽度（ＴＢＵＴ＝５〜１０秒） （２）橙色の中央の４本のバーの組：中度（ＴＵＢＴ＝２〜５秒） （３）赤色の下の９本のバーの組：重度（ＴＢＵＴ＜２秒） 図７Ｃ、Ｓ１００Ａ９について （１）黄色の上の７本のバーの組：軽度（ＴＢＵＴ＝５〜１０秒） （２）橙色の中央の６本のバーの組：中度（ＴＵＢＴ＝２〜５秒） （３）赤色の下の１０本のバーの組：重度（ＴＢＵＴ＜２秒） 図７Ｄ、Ｓ１００Ａ８について （１）黄色の上の７本のバーの組：軽度（ＴＢＵＴ＝５〜１０秒） （２）橙色の中央の８本のバーの組：中度（ＴＵＢＴ＝２〜５秒） （３）赤色の下の８本のバーの組：重度（ＴＢＵＴ＜２秒）
【図８】涙中の１種のドライアイタンパク質バイオマーカー（Ｓ１００Ａ１１）の絶対的定量化のためのｉＴＲＡＱ実験の、レポートイオン領域（１１４、１１５、１１６および１１７）のＭＳ／ＭＳスペクトルを表す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における粘膜乾燥状態を診断する方法であって、
前記被験体からの試料を準備するステップ、および、
前記試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ（ここで、前記少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）
を含む方法。
【請求項２】
前記粘膜乾燥状態がドライアイである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または前記粘膜乾燥状態の症状を経験していない、少なくとも１つの被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または粘膜乾燥状態の症状を経験していない、統計的に有意な数の被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が液体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記発現量が、前記少なくとも１種のバイオマーカーの存在量である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記比較するステップが質量分析法によるものである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記比較するステップがｉＴＲＡＱによるものである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
被験体における粘膜乾燥状態の重症度を判定する方法であって、
前記被験体からの試料を準備するステップ、および、
前記試料中のα−１−酸−糖タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、ラクトフェリン、リゾチーム、および／または、任意のそれらの誘導体もしくはそれらのフラグメント、の相対的発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ
を含む方法。
【請求項１０】
前記粘膜乾燥状態がドライアイである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または前記粘膜乾燥状態の症状を経験していない、少なくとも１つの被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項９から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または粘膜乾燥状態の症状を経験していない、統計的に有意な数の被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が液体である、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記相対的発現量が、前記少なくとも１種のバイオマーカーの相対的存在量である、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記比較するステップが質量分析法によるものである、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記比較するステップがｉＴＲＡＱによるものである、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
被験体における粘膜乾燥状態に対する治療効果をモニターする方法であって、
前記被験体からの試料を準備するステップ、および、
前記試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ（ここで、前記少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）
を含む方法。
【請求項１８】
前記粘膜乾燥状態がドライアイである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または前記粘膜乾燥状態の症状を経験していない、少なくとも１つの被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項１７から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または粘膜乾燥状態の症状を経験していない、統計的に有意な数の被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が液体である、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記相対的発現量が、前記少なくとも１種のバイオマーカーの相対的存在量である、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記比較するステップが質量分析法によるものである、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記比較するステップがｉＴＲＡＱによるものである、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
被験体における粘膜乾燥状態を治療する方法であって、
前記被験体からの試料を準備するステップ、
前記試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ（ここで、前記少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質およびプロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）、および、
バイオマーカーの前記群中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量の差異を低減させるステップ
を含む方法。
【請求項２６】
前記粘膜乾燥状態がドライアイである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または前記粘膜乾燥状態の症状を経験していない、少なくとも１つの被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項２５から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または前記粘膜乾燥状態の症状を経験していない、統計的に有意な数の被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が液体である、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記相対的発現量が、前記少なくとも１種のバイオマーカーの相対的存在量である、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記比較するステップが質量分析法によるものである、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記比較するステップがｉＴＲＡＱによるものである、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１種のバイオマーカーがα−１−糖タンパク質１であり、前記発現量の差異を低減させるステップが、前記被験体における炎症を低減させることを含む、請求項２５から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１種のバイオマーカーがプロラクチン誘導タンパク質であり、前記発現量の差異を低減させるステップが、プロラクチンおよび／またはアンドロゲンの投与によって、前記被験体におけるプロラクチン誘導タンパク質の発現量を増加させることを含む、請求項２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１種のバイオマーカーがＳ１００Ａ８および／またはＳ１００Ａ９であり、前記発現量の差異を低減させるステップが、前記被験体における１００Ａ８および／またはＳ１００Ａ９の上方制御および／または複合体形成を低減させることを含む、請求項２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体がヒトである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記被験体が哺乳動物である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
ドライアイの状態を診断するためのバイオマーカーのパネルであって、α−１−酸−糖タンパク質、α−エノラーゼ、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および／または、それらの誘導体もしくはフラグメント、を含むパネル。
【請求項３９】
前記パネルが固体支持体上またはゲル中に存在する、請求項３８に記載のバイオマーカーのパネル。
【請求項４０】
粘膜乾燥状態を診断するための診断キットであって、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、それらの誘導体またはフラグメント、からなる群から選択される、少なくとも１種のバイオマーカーに反応することのできる、少なくとも１種の化学物質を含む診断キット。
【請求項４１】
前記少なくとも１種の化学物質が、前記バイオマーカーの任意の１つに特異的な、少なくとも１種の抗体である、請求項４０に記載の診断キット。
【請求項４２】
前記少なくとも１種の化学物質が固体支持体上またはゲル中に存在する、請求項４０から４１のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項４３】
前記少なくとも１種のバイオマーカーがα−エノラーゼであり、前記少なくとも１種の化学物質が２−ホスホグリセレートである、請求項４０に記載の診断キット。
【請求項１】
被験体における粘膜乾燥状態を診断する方法であって、
前記被験体からの試料を準備するステップ、および、
前記試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ（ここで、前記少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）
を含む方法。
【請求項２】
前記粘膜乾燥状態がドライアイである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または前記粘膜乾燥状態の症状を経験していない、少なくとも１つの被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または粘膜乾燥状態の症状を経験していない、統計的に有意な数の被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が液体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記発現量が、前記少なくとも１種のバイオマーカーの存在量である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記比較するステップが質量分析法によるものである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記比較するステップがｉＴＲＡＱによるものである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
被験体における粘膜乾燥状態の重症度を判定する方法であって、
前記被験体からの試料を準備するステップ、および、
前記試料中のα−１−酸−糖タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、ラクトフェリン、リゾチーム、および／または、任意のそれらの誘導体もしくはそれらのフラグメント、の相対的発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ
を含む方法。
【請求項１０】
前記粘膜乾燥状態がドライアイである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または前記粘膜乾燥状態の症状を経験していない、少なくとも１つの被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項９から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または粘膜乾燥状態の症状を経験していない、統計的に有意な数の被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が液体である、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記相対的発現量が、前記少なくとも１種のバイオマーカーの相対的存在量である、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記比較するステップが質量分析法によるものである、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記比較するステップがｉＴＲＡＱによるものである、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
被験体における粘膜乾燥状態に対する治療効果をモニターする方法であって、
前記被験体からの試料を準備するステップ、および、
前記試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ（ここで、前記少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）
を含む方法。
【請求項１８】
前記粘膜乾燥状態がドライアイである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または前記粘膜乾燥状態の症状を経験していない、少なくとも１つの被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項１７から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または粘膜乾燥状態の症状を経験していない、統計的に有意な数の被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が液体である、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記相対的発現量が、前記少なくとも１種のバイオマーカーの相対的存在量である、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記比較するステップが質量分析法によるものである、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記比較するステップがｉＴＲＡＱによるものである、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
被験体における粘膜乾燥状態を治療する方法であって、
前記被験体からの試料を準備するステップ、
前記試料中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量を、少なくとも１つの基準値と比較するステップ（ここで、前記少なくとも１種のバイオマーカーが、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質およびプロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、任意のそれらの誘導体またはそれらのフラグメント、からなる群から選択される）、および、
バイオマーカーの前記群中の少なくとも１種のバイオマーカーの発現量の差異を低減させるステップ
を含む方法。
【請求項２６】
前記粘膜乾燥状態がドライアイである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または前記粘膜乾燥状態の症状を経験していない、少なくとも１つの被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項２５から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記比較するステップが、前記粘膜乾燥状態の徴候を呈していない、または前記粘膜乾燥状態の症状を経験していない、統計的に有意な数の被験体から決定された少なくとも１つの基準値との比較である、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が液体である、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記相対的発現量が、前記少なくとも１種のバイオマーカーの相対的存在量である、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記比較するステップが質量分析法によるものである、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記比較するステップがｉＴＲＡＱによるものである、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１種のバイオマーカーがα−１−糖タンパク質１であり、前記発現量の差異を低減させるステップが、前記被験体における炎症を低減させることを含む、請求項２５から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１種のバイオマーカーがプロラクチン誘導タンパク質であり、前記発現量の差異を低減させるステップが、プロラクチンおよび／またはアンドロゲンの投与によって、前記被験体におけるプロラクチン誘導タンパク質の発現量を増加させることを含む、請求項２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１種のバイオマーカーがＳ１００Ａ８および／またはＳ１００Ａ９であり、前記発現量の差異を低減させるステップが、前記被験体における１００Ａ８および／またはＳ１００Ａ９の上方制御および／または複合体形成を低減させることを含む、請求項２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体がヒトである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記被験体が哺乳動物である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
ドライアイの状態を診断するためのバイオマーカーのパネルであって、α−１−酸−糖タンパク質、α−エノラーゼ、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および／または、それらの誘導体もしくはフラグメント、を含むパネル。
【請求項３９】
前記パネルが固体支持体上またはゲル中に存在する、請求項３８に記載のバイオマーカーのパネル。
【請求項４０】
粘膜乾燥状態を診断するための診断キットであって、α−エノラーゼ、α−１−酸−糖タンパク質、プロラクチン誘導タンパク質、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ１１、フォンエブナー腺タンパク質、ラクトフェリン、リゾチーム、高プロリン４タンパク質、および、それらの誘導体またはフラグメント、からなる群から選択される、少なくとも１種のバイオマーカーに反応することのできる、少なくとも１種の化学物質を含む診断キット。
【請求項４１】
前記少なくとも１種の化学物質が、前記バイオマーカーの任意の１つに特異的な、少なくとも１種の抗体である、請求項４０に記載の診断キット。
【請求項４２】
前記少なくとも１種の化学物質が固体支持体上またはゲル中に存在する、請求項４０から４１のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項４３】
前記少なくとも１種のバイオマーカーがα−エノラーゼであり、前記少なくとも１種の化学物質が２−ホスホグリセレートである、請求項４０に記載の診断キット。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図２Ｉ】
【図２Ｊ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図２Ｉ】
【図２Ｊ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５３５６２０（Ｐ２００９−５３５６２０Ａ）
【公表日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０７６４５（Ｐ２００９−５０７６４５）
【出願日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００７／０００１１８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２６３９１
【国際公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【出願人】（５０８３２０７２３）シンガポール ヘルス サービシーズ ピーティーイー リミテッド (3)
【出願人】（５０８３２０７３４）エイジェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００７／０００１１８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２６３９１
【国際公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【出願人】（５０８３２０７２３）シンガポール ヘルス サービシーズ ピーティーイー リミテッド (3)
【出願人】（５０８３２０７３４）エイジェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (7)
【Ｆターム（参考）】
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