精製オリゴ糖画分
【課題】 N−アセチルヘパロサン由来の純度の高いオリゴ糖画分を提供すること。
【解決手段】 N−アセチルヘパロサン構造を有するオリゴ糖を含む、精製オリゴ糖画分。
【解決手段】 N−アセチルヘパロサン構造を有するオリゴ糖を含む、精製オリゴ糖画分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、オリゴ糖画分に関し、特にN−アセチルヘパロサンから得られる高純度の精製オリゴ糖画分に関する。
【背景技術】
【0002】
N−アセチルヘパロサンは、生体内においてヘパリン、ヘパラン硫酸の合成前駆体となるグリコサミノグリカン(GAG)であり、同様の構造体を大腸菌K5株の培養液から得ることができる(例えば、特許文献1参照。)。このN−アセチルヘパロサンはヒアルロナンと同様に、N−アセチルグルコサミンとグルクロン酸の交互繰り返し構造であり、硫酸基を持たない。このN−アセチルヘパロサンを低分子化し精製して得るオリゴ糖は、ヘパリン・ヘパラン硫酸の生合成の研究や、関連酵素の研究、またそれら酵素の阻害剤開発研究、さらには種々の複雑な構造の糖鎖の化学合成原料など、種々の局面において非常に有用な化合物となり得る。
非特許文献1においては、N−アセチルヘパロサンオリゴ糖を高速液体クロマトグラフィーとESI−MSにより分析しているが、それぞれのサイズのオリゴ糖の単離精製は行われていない。
【特許文献1】特開2004−018840号公報
【非特許文献1】ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(Journal of American Chemical Society)、2002年6月25日、 Vol. 124、 No.29、 p 8707-8718
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであって、その目的はN−アセチルヘパロサン由来の純度の高い精製オリゴ糖画分を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0004】
上記課題は、以下の手段により解決される。
1. N−アセチルヘパロサン構造を有するオリゴ糖を含む精製オリゴ糖画分。
2. N−アセチルヘパロサンを低分子化して得られたことを特徴とする上記1に記載の精製オリゴ糖画分。
3. オリゴ糖の純度が60%以上であることを特徴とする上記1又は2に記載の精製オリゴ糖画分。
4. 前記オリゴ糖が3〜100個の糖残基からなることを特徴とする上記1〜3のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
5. 前記オリゴ糖が偶数糖であることを特徴とする上記1〜4のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
6. 前記オリゴ糖が奇数糖であることを特徴とする上記1〜4のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
【発明の効果】
【0005】
本発明によれば、N−アセチルへパロサン由来の純度の高い新規精製オリゴ糖画分が得られる。この新規精製オリゴ糖画分は、ヘパリン・ヘパラン硫酸の生合成の研究や、関連酵素の研究、またそれら酵素の阻害剤開発研究、さらには種々の複雑な構造の糖鎖の化学合成原料など、種々の局面において非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0006】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の精製オリゴ糖画分は、N−アセチルヘパロサン構造、即ちグルクロン酸がN−アセチルグルコサミンにβ1,4結合し、N−アセチルグルコサミンがグルクロン酸にα1,4結合した直鎖状の繰り返し構造を有するオリゴ糖を含むものである。精製オリゴ糖画分は不純物が少ないことが好ましいが、必ずしも完全に精製されている必要はなく、部分的に精製されたものもこれに含まれる。オリゴ糖画分中におけるオリゴ糖の純度は、60%〜100%であることが好ましく、純度70%〜100%であることがより好ましく、90%〜100%であることがさらに好ましい。
【0007】
また、精製オリゴ糖画分に含まれるオリゴ糖は、下記に示す、偶数の糖残基からなる偶数オリゴ糖でもよいし、奇数の糖残基からなる奇数オリゴ糖でもよい。偶数オリゴ糖としては、例えば、非還元末端に不飽和ウロン酸を有する偶数糖が挙げられ、奇数オリゴ糖としては、例えば、非還元末端にN−アセチルグルコサミンを有する奇数糖(奇数オリゴ糖)が挙げられる。
【0008】
【化1】
(上記式において、mは1以上の整数を示す。また、波線は、還元末端における平衡を示し、αアノマーとβアノマーのいずれであってもよい。)
【0009】
オリゴ糖の糖鎖長としては特に制限はないが、3〜100個の糖からなることが好ましく、3〜50個の糖からなることがより好ましく、3〜21個の糖からなることがさらに好ましい。
また、オリゴ糖の分子量としては、500〜20000の範囲が好ましく、500〜4100の範囲がより好ましい。
本発明のオリゴ糖画分は、生体において重要な働きを担うグリコサミノグリカンであるヒアルロナンを構成する糖を含んでいるため、薬剤、食品、化粧品等の原材料等として有望である。
【0010】
本発明の精製オリゴ糖画分は、N−アセチルヘパロサンを低分子化した後、単離精製することにより得られる。
N−アセチルヘパロサンは、未だ動物の生体組織から採取された実績は無いが、N−アセチルヘパロサンを産生する細菌等から採取することが可能である。N−アセチルヘパロサンを産生する細菌としては、大腸菌、パスツレラ菌等が挙げられる。大腸菌からN−アセチルヘパロサンを採取・単離する方法としては、特開平5−271305号公報、特開2004−18840号公報等に記載の方法を用いることができる。
【0011】
N−アセチルヘパロサンは、N−アセチルヘパロサンの分解酵素で処理することにより低分子化することができる。N−アセチルヘパロサンの分解酵素としては、フラボバクテリウム由来ヘパリチナーゼI、K5リアーゼ等を用いることができる。
また、ヘパリチナーゼIを用いる場合の処理条件としては、25〜60℃(より好ましくは36〜45℃)で0.5〜120分間(より好ましくは20〜60分間)インキュベーションすることが好ましい。
【0012】
上記のようにN−アセチルヘパロサンを分解酵素により処理すると、通常、種々のサイズの偶数オリゴ糖を含む混合物が得られる。この偶数オリゴ糖の混合物を精製することで、上記のような高い純度を有する偶数オリゴ糖を含む精製画分が得られる。オリゴ糖の混合物の精製は公知の精製方法を用いて行うことができ、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー等によって精製することができる。
【0013】
また、N−アセチルヘパロサンを分解酵素により処理して得られた偶数オリゴ糖を酢酸水銀と反応させることで、偶数オリゴ糖の不飽和ウロン酸を除去し、奇数オリゴ糖を含む画分を得ることができる。この方法により奇数オリゴ糖を生成するには、Glycobiology vol.10 no.10 pp.1033-1039 (2000)に記載の方法に従って行うことができる。
なお、奇数オリゴ糖の生成は、偶数オリゴ糖の精製の後に行ってもよいし、種々のサイズを含む偶数オリゴ糖の混合物から上記方法により奇数オリゴ糖を生成した後に、これを精製して精製オリゴ糖画分を得てもよい。
【実施例】
【0014】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明する。
[実施例1]
(偶数オリゴ糖混合物の調製)
特開2004−18840号公報の実施例1に記載の方法と同様にして大腸菌K5菌株を培養し、N−アセチルヘパロサン画分を得て、さらに、同公報の実施例2に記載の方法と同様にしてこのN−アセチルヘパロサン画分を高純度に精製した。
精製したN−アセチルヘパロサン画分(100mg)を濃度が10mg/mlになるように、5mM酢酸カルシウムを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に溶解した。このN−アセチルヘパロサン溶解液に、フラボバクテリウム由来ヘパリチナーゼI(0.2ユニット)を添加し、37℃で45分間インキュベーションした。
その後、沸騰水浴中で反応を停止させ、沈殿物を遠心分離(8,000rpm、20分)によって除去し、上清液を凍結乾燥した。以上のようにして、非還元末端に不飽和ウロン酸を有するN−アセチルヘパロサンのオリゴ糖混合物の凍結乾燥物を131.25mg得た(塩類を含む)。
【0015】
得られたオリゴ糖混合物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF-MS)にて分析したところ、図1に示すように、主として4〜26糖の偶数糖混合物であることが確認された。(なお、測定条件上、質量電荷比600以下を検出していないが、実際には2糖も生成している。また、28糖以上の偶数オリゴ糖も、僅少量生成していると考えられる。)
なお、質量分析装置は、ブルカー・ダルトニクス社製のUltraflexを使用し、測定用マトリックスとしてはDHB(2,5-dihydroxybenzoic acid)を用いた。
【0016】
(偶数オリゴ糖混合物の精製)
上記で得た偶数オリゴ糖混合物の凍結乾燥物(2mg)を、ゲル濾過クロマトグラフィーにて分取精製し凍結乾燥して、精製オリゴ糖画分を得た(図2参照。)。なお、ゲル濾過クロマトグラフィーには、アマシャム・バイオサイエンス社製のSuperdex Peptide 10/300GLを二本継ぎで使用した。
分取した各偶数精製オリゴ糖画分の純度を陰イオン交換HPLCにて確認した。なお、印イオン交換HPLCの分析条件は以下の通りとした。この結果を図3に示す。
HPLCカラム: YMC-Pack Polyamine II (株)ワイエムシィ
移動相(溶媒): 50mMから500mMまでのNaH2PO4による30分グラジェント
流速: 1.2ml/min.
検出: UV210nm
温度: 室温
【0017】
さらに、MALDI-TOF-MS(Ultraflex,ブルカー・ダルトニクス社製)およびESI-IT-MS(エレクトロスプレー−イオントラップ型質量分析装置;Esquire 3000 plus,ブルカー・ダルトニクス社製)にて、その分子量を確認した。この結果をそれぞれ図4及び5に示す。
【0018】
[実施例2]
(偶数オリゴ糖混合物の精製)
偶数オリゴ糖の精製は、陰イオン交換HPLCによっても実施した。
上記で得た偶数オリゴ糖混合物の凍結乾燥物(3mg)を、YMC−PA−120−S5イオン交換カラム(ワイエムシィ(株))にアプライし、流速0.5mL/min.で45分間に硫酸ナトリウム溶液を20mMから100mMまでの直線濃度勾配で溶出した。カラムから溶出した液をフラクション・コレクターにて1分毎に分取した。分取液はUV210nmの吸収にてモニターし、N−アセチルヘパロサン2糖、4糖、6糖、8糖と考えられる画分を集めた。以上の操作を15回繰り返して得た画分をセファデックスG-25カラムにより脱塩後、濃縮、凍結乾燥した。これらの操作により得た精製2糖、4糖、6糖、8糖の収量はそれぞれ、10mg、8mg、6mg、4mgであった。
【0019】
得られたオリゴ糖のうち、精製4糖、6糖、8糖について、1H-NMRスペクトルを測定した。測定装置はVARIAN社製UNITY INOVA500 (500MHZ)を使用し、各オリゴ糖試料をALDRICH社製重水に溶解し、70℃で測定を行った。内部標準をtert-ブタノール(1.23ppm)とした場合の、各オリゴ糖の測定結果は以下のとおりであり、精製4糖、6糖、8糖についてのNMRスペクトルをそれぞれ図10〜12に示す。これらの結果より、それぞれの鎖長のN-アセチルヘパロサンオリゴ糖であることが支持された。
【0020】
(精製4糖)
δ(ppm) = 5.782(br, 1H, H-4d), 5.371(br, 1H, H-1c), 5.206(br, 0.6H, H-1aα), 5,075(m, 1H, H-1d), 4.707(m, 0.4H, H-1aβ), 4.528(brd, 1H, H-1b), 3.929〜3.368(m), 2.997 (brt, 2H), 2.032(s, 3H, NH- COCH3), 2.026(s, 3H, NH-COCH3)
【0021】
(精製6糖)
δ(ppm) = 5.778(br, 1H, H-4f), 5.366(br, 2H, H-1c, H-1e), 5.199(brs, 0.6H, H-1aα), 5,067(m, 1H, H-1f), 4.707(m, 0.4H, H-1aβ), 4.527(brd, 1H, H-1b or H-1d), 4.487(brd, 1H, H-1d or H-1b), 3.947〜3.623(m), 3.367 (brt, 3H), 2.034(s, 3H, NH- COCH3), 2.029(s, 3H, NH- COCH3), 2.025(s, 3H, NH- COCH3)
【0022】
(精製8糖)
δ(ppm) = 5.778(m, 1H, H-4h), 5.366(br, 3H, H-1c, H-1e, H-1g), 5.199(brs, 0.6H, H-1aα), 5,068(d, 1H, H-1h), 4.707(brs, 0.4H, H-1aβ), 4.526(d, 1H, H-1b or H-1d or H-f), 4.481(d, 2H, H-1d or H-1f or H-1b), 3.946〜3.621(m), 3.367 (t, 4H), 2.038(s, 3H, NH- COCH3), 2.035(s, 3H, NH- COCH3), 2.026(s, 6H, NH- COCH3)
【0023】
[実施例3]
(奇数オリゴ糖混合物の調製)
上記実施例1の「偶数オリゴ糖混合物の調製」で得た偶数オリゴ糖混合物(100mg)を濃度が20mg/mlになるように蒸留水に溶解し、酢酸を用いてpHを5.0に調整した。同量の70mM酢酸水銀(pH5.0)を偶数オリゴ糖混合物の溶液に混合し、室温に10分間放置した。
その後、Hg2+を除くために陽イオン交換体(ダイヤイオン PK220;30ml)カラムを用い、酸性画分を集め、中和した後、凍結乾燥した。この凍結乾燥物(342.3mg)を少量の蒸留水に再溶解し、セファデックスG-10カラム(2.2×115cm)にアプライし、蒸留水を用いて奇数オリゴ糖混合物を溶出した。
UV210/232nmおよび電気伝導度をモニタリングし、UV210(+)・UV232(-)画分を集め、凍結乾燥した。以上のようにして、非還元末端にヘキソサミンを有するN−アセチルヘパロサンのオリゴ糖混合物の凍結乾燥物を44.7mg得た(塩類を含む)。
得られたオリゴ糖混合物を実施例1と同様にしてMALDI-TOF-MSにて分析したところ、図1に示すように、主として5〜25糖の偶数糖混合物であることが確認された。(測定条件上、質量電荷比600以下を検出していないが、実際には単糖(N-アセチルグルコサミン)、3糖も生成している。また、27糖以上の奇数オリゴ糖も、僅少量生成していると考えられる。)
【0024】
(奇数オリゴ糖混合物の精製)
上記で得た奇数オリゴ糖混合物の凍結乾燥物(2mg)をゲル濾過クロマトグラフィー(実施例1と同様の装置を使用)にて分取精製し凍結乾燥して、精製オリゴ糖画分を得た。(図6参照。)
分取した各精製奇数オリゴ糖画分の純度を、上記実施例1と同様にして陰イオン交換HPLCにて確認した。この結果を図7に示す。(なお、図3及び図7において、各糖鎖のピークが二分されて見える場合があるのは、オリゴ糖構造中、還元末端のα/βアノマーの共存によるピーク分離であり、これは水溶液中で平衡状態にあるものであるから問題とはならない。)
また、MALDI-TOF-MSおよびESI-IT-MSにて、その分子量を確認した。この結果を図8及び9に示す。
以上の実施例より、N−アセチルヘパロサンの偶数糖及び奇数糖の精製オリゴ糖画分を高い純度で得られることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】実施例1及び実施例3により得られた偶数糖及び奇数糖のオリゴ糖混合物をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF-MS)により分析した結果を示す図である。
【図2】実施例1におけるゲル濾過クロマトグラフィーによる偶数オリゴ糖画分の分離を示す図である。
【図3】実施例1により得られた精製オリゴ糖画分の純度を示す図である。
【図4】実施例1により得られた精製オリゴ糖画分をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF-MS)により分析した結果を示す図である。
【図5】実施例1により得られた精製オリゴ糖画分をESI-IT-MS(エレクトロスプレー−イオントラップ型質量分析装置)により分析した結果を示す図である。
【図6】実施例3におけるゲル濾過クロマトグラフィーによる奇数オリゴ糖画分の分離を示す図である。
【図7】実施例3により得られた精製オリゴ糖画分の純度を示す図である。
【図8】実施例3により得られた精製オリゴ糖画分をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF-MS)により分析した結果を示す図である。
【図9】実施例3により得られた精製オリゴ糖画分をESI-IT-MS(エレクトロスプレー−イオントラップ型質量分析装置)により分析した結果を示す図である。
【図10】実施例2により得られた偶数オリゴ糖(精製4糖)画分のNMRスペクトルを示す図である。
【図11】実施例2により得られた偶数オリゴ糖(精製6糖)画分のNMRスペクトルを示す図である。
【図12】実施例2により得られた偶数オリゴ糖(精製8糖)画分のNMRスペクトルを示す図である。
【技術分野】
【0001】
本発明は、オリゴ糖画分に関し、特にN−アセチルヘパロサンから得られる高純度の精製オリゴ糖画分に関する。
【背景技術】
【0002】
N−アセチルヘパロサンは、生体内においてヘパリン、ヘパラン硫酸の合成前駆体となるグリコサミノグリカン(GAG)であり、同様の構造体を大腸菌K5株の培養液から得ることができる(例えば、特許文献1参照。)。このN−アセチルヘパロサンはヒアルロナンと同様に、N−アセチルグルコサミンとグルクロン酸の交互繰り返し構造であり、硫酸基を持たない。このN−アセチルヘパロサンを低分子化し精製して得るオリゴ糖は、ヘパリン・ヘパラン硫酸の生合成の研究や、関連酵素の研究、またそれら酵素の阻害剤開発研究、さらには種々の複雑な構造の糖鎖の化学合成原料など、種々の局面において非常に有用な化合物となり得る。
非特許文献1においては、N−アセチルヘパロサンオリゴ糖を高速液体クロマトグラフィーとESI−MSにより分析しているが、それぞれのサイズのオリゴ糖の単離精製は行われていない。
【特許文献1】特開2004−018840号公報
【非特許文献1】ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(Journal of American Chemical Society)、2002年6月25日、 Vol. 124、 No.29、 p 8707-8718
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであって、その目的はN−アセチルヘパロサン由来の純度の高い精製オリゴ糖画分を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0004】
上記課題は、以下の手段により解決される。
1. N−アセチルヘパロサン構造を有するオリゴ糖を含む精製オリゴ糖画分。
2. N−アセチルヘパロサンを低分子化して得られたことを特徴とする上記1に記載の精製オリゴ糖画分。
3. オリゴ糖の純度が60%以上であることを特徴とする上記1又は2に記載の精製オリゴ糖画分。
4. 前記オリゴ糖が3〜100個の糖残基からなることを特徴とする上記1〜3のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
5. 前記オリゴ糖が偶数糖であることを特徴とする上記1〜4のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
6. 前記オリゴ糖が奇数糖であることを特徴とする上記1〜4のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
【発明の効果】
【0005】
本発明によれば、N−アセチルへパロサン由来の純度の高い新規精製オリゴ糖画分が得られる。この新規精製オリゴ糖画分は、ヘパリン・ヘパラン硫酸の生合成の研究や、関連酵素の研究、またそれら酵素の阻害剤開発研究、さらには種々の複雑な構造の糖鎖の化学合成原料など、種々の局面において非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0006】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の精製オリゴ糖画分は、N−アセチルヘパロサン構造、即ちグルクロン酸がN−アセチルグルコサミンにβ1,4結合し、N−アセチルグルコサミンがグルクロン酸にα1,4結合した直鎖状の繰り返し構造を有するオリゴ糖を含むものである。精製オリゴ糖画分は不純物が少ないことが好ましいが、必ずしも完全に精製されている必要はなく、部分的に精製されたものもこれに含まれる。オリゴ糖画分中におけるオリゴ糖の純度は、60%〜100%であることが好ましく、純度70%〜100%であることがより好ましく、90%〜100%であることがさらに好ましい。
【0007】
また、精製オリゴ糖画分に含まれるオリゴ糖は、下記に示す、偶数の糖残基からなる偶数オリゴ糖でもよいし、奇数の糖残基からなる奇数オリゴ糖でもよい。偶数オリゴ糖としては、例えば、非還元末端に不飽和ウロン酸を有する偶数糖が挙げられ、奇数オリゴ糖としては、例えば、非還元末端にN−アセチルグルコサミンを有する奇数糖(奇数オリゴ糖)が挙げられる。
【0008】
【化1】
(上記式において、mは1以上の整数を示す。また、波線は、還元末端における平衡を示し、αアノマーとβアノマーのいずれであってもよい。)
【0009】
オリゴ糖の糖鎖長としては特に制限はないが、3〜100個の糖からなることが好ましく、3〜50個の糖からなることがより好ましく、3〜21個の糖からなることがさらに好ましい。
また、オリゴ糖の分子量としては、500〜20000の範囲が好ましく、500〜4100の範囲がより好ましい。
本発明のオリゴ糖画分は、生体において重要な働きを担うグリコサミノグリカンであるヒアルロナンを構成する糖を含んでいるため、薬剤、食品、化粧品等の原材料等として有望である。
【0010】
本発明の精製オリゴ糖画分は、N−アセチルヘパロサンを低分子化した後、単離精製することにより得られる。
N−アセチルヘパロサンは、未だ動物の生体組織から採取された実績は無いが、N−アセチルヘパロサンを産生する細菌等から採取することが可能である。N−アセチルヘパロサンを産生する細菌としては、大腸菌、パスツレラ菌等が挙げられる。大腸菌からN−アセチルヘパロサンを採取・単離する方法としては、特開平5−271305号公報、特開2004−18840号公報等に記載の方法を用いることができる。
【0011】
N−アセチルヘパロサンは、N−アセチルヘパロサンの分解酵素で処理することにより低分子化することができる。N−アセチルヘパロサンの分解酵素としては、フラボバクテリウム由来ヘパリチナーゼI、K5リアーゼ等を用いることができる。
また、ヘパリチナーゼIを用いる場合の処理条件としては、25〜60℃(より好ましくは36〜45℃)で0.5〜120分間(より好ましくは20〜60分間)インキュベーションすることが好ましい。
【0012】
上記のようにN−アセチルヘパロサンを分解酵素により処理すると、通常、種々のサイズの偶数オリゴ糖を含む混合物が得られる。この偶数オリゴ糖の混合物を精製することで、上記のような高い純度を有する偶数オリゴ糖を含む精製画分が得られる。オリゴ糖の混合物の精製は公知の精製方法を用いて行うことができ、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー等によって精製することができる。
【0013】
また、N−アセチルヘパロサンを分解酵素により処理して得られた偶数オリゴ糖を酢酸水銀と反応させることで、偶数オリゴ糖の不飽和ウロン酸を除去し、奇数オリゴ糖を含む画分を得ることができる。この方法により奇数オリゴ糖を生成するには、Glycobiology vol.10 no.10 pp.1033-1039 (2000)に記載の方法に従って行うことができる。
なお、奇数オリゴ糖の生成は、偶数オリゴ糖の精製の後に行ってもよいし、種々のサイズを含む偶数オリゴ糖の混合物から上記方法により奇数オリゴ糖を生成した後に、これを精製して精製オリゴ糖画分を得てもよい。
【実施例】
【0014】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明する。
[実施例1]
(偶数オリゴ糖混合物の調製)
特開2004−18840号公報の実施例1に記載の方法と同様にして大腸菌K5菌株を培養し、N−アセチルヘパロサン画分を得て、さらに、同公報の実施例2に記載の方法と同様にしてこのN−アセチルヘパロサン画分を高純度に精製した。
精製したN−アセチルヘパロサン画分(100mg)を濃度が10mg/mlになるように、5mM酢酸カルシウムを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に溶解した。このN−アセチルヘパロサン溶解液に、フラボバクテリウム由来ヘパリチナーゼI(0.2ユニット)を添加し、37℃で45分間インキュベーションした。
その後、沸騰水浴中で反応を停止させ、沈殿物を遠心分離(8,000rpm、20分)によって除去し、上清液を凍結乾燥した。以上のようにして、非還元末端に不飽和ウロン酸を有するN−アセチルヘパロサンのオリゴ糖混合物の凍結乾燥物を131.25mg得た(塩類を含む)。
【0015】
得られたオリゴ糖混合物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF-MS)にて分析したところ、図1に示すように、主として4〜26糖の偶数糖混合物であることが確認された。(なお、測定条件上、質量電荷比600以下を検出していないが、実際には2糖も生成している。また、28糖以上の偶数オリゴ糖も、僅少量生成していると考えられる。)
なお、質量分析装置は、ブルカー・ダルトニクス社製のUltraflexを使用し、測定用マトリックスとしてはDHB(2,5-dihydroxybenzoic acid)を用いた。
【0016】
(偶数オリゴ糖混合物の精製)
上記で得た偶数オリゴ糖混合物の凍結乾燥物(2mg)を、ゲル濾過クロマトグラフィーにて分取精製し凍結乾燥して、精製オリゴ糖画分を得た(図2参照。)。なお、ゲル濾過クロマトグラフィーには、アマシャム・バイオサイエンス社製のSuperdex Peptide 10/300GLを二本継ぎで使用した。
分取した各偶数精製オリゴ糖画分の純度を陰イオン交換HPLCにて確認した。なお、印イオン交換HPLCの分析条件は以下の通りとした。この結果を図3に示す。
HPLCカラム: YMC-Pack Polyamine II (株)ワイエムシィ
移動相(溶媒): 50mMから500mMまでのNaH2PO4による30分グラジェント
流速: 1.2ml/min.
検出: UV210nm
温度: 室温
【0017】
さらに、MALDI-TOF-MS(Ultraflex,ブルカー・ダルトニクス社製)およびESI-IT-MS(エレクトロスプレー−イオントラップ型質量分析装置;Esquire 3000 plus,ブルカー・ダルトニクス社製)にて、その分子量を確認した。この結果をそれぞれ図4及び5に示す。
【0018】
[実施例2]
(偶数オリゴ糖混合物の精製)
偶数オリゴ糖の精製は、陰イオン交換HPLCによっても実施した。
上記で得た偶数オリゴ糖混合物の凍結乾燥物(3mg)を、YMC−PA−120−S5イオン交換カラム(ワイエムシィ(株))にアプライし、流速0.5mL/min.で45分間に硫酸ナトリウム溶液を20mMから100mMまでの直線濃度勾配で溶出した。カラムから溶出した液をフラクション・コレクターにて1分毎に分取した。分取液はUV210nmの吸収にてモニターし、N−アセチルヘパロサン2糖、4糖、6糖、8糖と考えられる画分を集めた。以上の操作を15回繰り返して得た画分をセファデックスG-25カラムにより脱塩後、濃縮、凍結乾燥した。これらの操作により得た精製2糖、4糖、6糖、8糖の収量はそれぞれ、10mg、8mg、6mg、4mgであった。
【0019】
得られたオリゴ糖のうち、精製4糖、6糖、8糖について、1H-NMRスペクトルを測定した。測定装置はVARIAN社製UNITY INOVA500 (500MHZ)を使用し、各オリゴ糖試料をALDRICH社製重水に溶解し、70℃で測定を行った。内部標準をtert-ブタノール(1.23ppm)とした場合の、各オリゴ糖の測定結果は以下のとおりであり、精製4糖、6糖、8糖についてのNMRスペクトルをそれぞれ図10〜12に示す。これらの結果より、それぞれの鎖長のN-アセチルヘパロサンオリゴ糖であることが支持された。
【0020】
(精製4糖)
δ(ppm) = 5.782(br, 1H, H-4d), 5.371(br, 1H, H-1c), 5.206(br, 0.6H, H-1aα), 5,075(m, 1H, H-1d), 4.707(m, 0.4H, H-1aβ), 4.528(brd, 1H, H-1b), 3.929〜3.368(m), 2.997 (brt, 2H), 2.032(s, 3H, NH- COCH3), 2.026(s, 3H, NH-COCH3)
【0021】
(精製6糖)
δ(ppm) = 5.778(br, 1H, H-4f), 5.366(br, 2H, H-1c, H-1e), 5.199(brs, 0.6H, H-1aα), 5,067(m, 1H, H-1f), 4.707(m, 0.4H, H-1aβ), 4.527(brd, 1H, H-1b or H-1d), 4.487(brd, 1H, H-1d or H-1b), 3.947〜3.623(m), 3.367 (brt, 3H), 2.034(s, 3H, NH- COCH3), 2.029(s, 3H, NH- COCH3), 2.025(s, 3H, NH- COCH3)
【0022】
(精製8糖)
δ(ppm) = 5.778(m, 1H, H-4h), 5.366(br, 3H, H-1c, H-1e, H-1g), 5.199(brs, 0.6H, H-1aα), 5,068(d, 1H, H-1h), 4.707(brs, 0.4H, H-1aβ), 4.526(d, 1H, H-1b or H-1d or H-f), 4.481(d, 2H, H-1d or H-1f or H-1b), 3.946〜3.621(m), 3.367 (t, 4H), 2.038(s, 3H, NH- COCH3), 2.035(s, 3H, NH- COCH3), 2.026(s, 6H, NH- COCH3)
【0023】
[実施例3]
(奇数オリゴ糖混合物の調製)
上記実施例1の「偶数オリゴ糖混合物の調製」で得た偶数オリゴ糖混合物(100mg)を濃度が20mg/mlになるように蒸留水に溶解し、酢酸を用いてpHを5.0に調整した。同量の70mM酢酸水銀(pH5.0)を偶数オリゴ糖混合物の溶液に混合し、室温に10分間放置した。
その後、Hg2+を除くために陽イオン交換体(ダイヤイオン PK220;30ml)カラムを用い、酸性画分を集め、中和した後、凍結乾燥した。この凍結乾燥物(342.3mg)を少量の蒸留水に再溶解し、セファデックスG-10カラム(2.2×115cm)にアプライし、蒸留水を用いて奇数オリゴ糖混合物を溶出した。
UV210/232nmおよび電気伝導度をモニタリングし、UV210(+)・UV232(-)画分を集め、凍結乾燥した。以上のようにして、非還元末端にヘキソサミンを有するN−アセチルヘパロサンのオリゴ糖混合物の凍結乾燥物を44.7mg得た(塩類を含む)。
得られたオリゴ糖混合物を実施例1と同様にしてMALDI-TOF-MSにて分析したところ、図1に示すように、主として5〜25糖の偶数糖混合物であることが確認された。(測定条件上、質量電荷比600以下を検出していないが、実際には単糖(N-アセチルグルコサミン)、3糖も生成している。また、27糖以上の奇数オリゴ糖も、僅少量生成していると考えられる。)
【0024】
(奇数オリゴ糖混合物の精製)
上記で得た奇数オリゴ糖混合物の凍結乾燥物(2mg)をゲル濾過クロマトグラフィー(実施例1と同様の装置を使用)にて分取精製し凍結乾燥して、精製オリゴ糖画分を得た。(図6参照。)
分取した各精製奇数オリゴ糖画分の純度を、上記実施例1と同様にして陰イオン交換HPLCにて確認した。この結果を図7に示す。(なお、図3及び図7において、各糖鎖のピークが二分されて見える場合があるのは、オリゴ糖構造中、還元末端のα/βアノマーの共存によるピーク分離であり、これは水溶液中で平衡状態にあるものであるから問題とはならない。)
また、MALDI-TOF-MSおよびESI-IT-MSにて、その分子量を確認した。この結果を図8及び9に示す。
以上の実施例より、N−アセチルヘパロサンの偶数糖及び奇数糖の精製オリゴ糖画分を高い純度で得られることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】実施例1及び実施例3により得られた偶数糖及び奇数糖のオリゴ糖混合物をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF-MS)により分析した結果を示す図である。
【図2】実施例1におけるゲル濾過クロマトグラフィーによる偶数オリゴ糖画分の分離を示す図である。
【図3】実施例1により得られた精製オリゴ糖画分の純度を示す図である。
【図4】実施例1により得られた精製オリゴ糖画分をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF-MS)により分析した結果を示す図である。
【図5】実施例1により得られた精製オリゴ糖画分をESI-IT-MS(エレクトロスプレー−イオントラップ型質量分析装置)により分析した結果を示す図である。
【図6】実施例3におけるゲル濾過クロマトグラフィーによる奇数オリゴ糖画分の分離を示す図である。
【図7】実施例3により得られた精製オリゴ糖画分の純度を示す図である。
【図8】実施例3により得られた精製オリゴ糖画分をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF-MS)により分析した結果を示す図である。
【図9】実施例3により得られた精製オリゴ糖画分をESI-IT-MS(エレクトロスプレー−イオントラップ型質量分析装置)により分析した結果を示す図である。
【図10】実施例2により得られた偶数オリゴ糖(精製4糖)画分のNMRスペクトルを示す図である。
【図11】実施例2により得られた偶数オリゴ糖(精製6糖)画分のNMRスペクトルを示す図である。
【図12】実施例2により得られた偶数オリゴ糖(精製8糖)画分のNMRスペクトルを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
N−アセチルヘパロサン構造を有するオリゴ糖を含む、精製オリゴ糖画分。
【請求項2】
N−アセチルヘパロサンを低分子化して得られたことを特徴とする請求項1に記載の精製オリゴ糖画分。
【請求項3】
オリゴ糖の純度が60%以上であることを特徴とする請求項1又は2に記載の精製オリゴ糖画分。
【請求項4】
前記オリゴ糖が3〜100個の糖残基からなることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
【請求項5】
前記オリゴ糖が偶数糖であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
【請求項6】
前記オリゴ糖が奇数糖であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
【請求項1】
N−アセチルヘパロサン構造を有するオリゴ糖を含む、精製オリゴ糖画分。
【請求項2】
N−アセチルヘパロサンを低分子化して得られたことを特徴とする請求項1に記載の精製オリゴ糖画分。
【請求項3】
オリゴ糖の純度が60%以上であることを特徴とする請求項1又は2に記載の精製オリゴ糖画分。
【請求項4】
前記オリゴ糖が3〜100個の糖残基からなることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
【請求項5】
前記オリゴ糖が偶数糖であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
【請求項6】
前記オリゴ糖が奇数糖であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の精製オリゴ画分。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【公開番号】特開2006−291102(P2006−291102A)
【公開日】平成18年10月26日(2006.10.26)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2005−116013(P2005−116013)
【出願日】平成17年4月13日(2005.4.13)
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】(出願人による申告)国等の委託研究の成果に係る特許出願(平成15年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、糖鎖エンジニアリングプロジェクト/糖鎖構造解析技術開発委託研究、産業活力再生特別措置法第30条の適用を受けるもの)
【出願人】(301021533)独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】(000195524)生化学工業株式会社 (143)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成18年10月26日(2006.10.26)
【国際特許分類】
【出願日】平成17年4月13日(2005.4.13)
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】(出願人による申告)国等の委託研究の成果に係る特許出願(平成15年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、糖鎖エンジニアリングプロジェクト/糖鎖構造解析技術開発委託研究、産業活力再生特別措置法第30条の適用を受けるもの)
【出願人】(301021533)独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】(000195524)生化学工業株式会社 (143)
【Fターム(参考)】
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