糖化免疫グロブリンによる疾患の判定方法
【課題】検体中の糖化免疫グロブリンを正確に測定してＩｇＡ型多発性骨髄腫等の疾患を正確に判定することができる判定方法を提供すること。
【解決手段】検体中の糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させ、次いで、その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定することにより、糖化免疫グロブリンを正確に測定することができ、ＩｇＡ型多発性骨髄腫等の疾患を正確に判定することができる。
【解決手段】検体中の糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させ、次いで、その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定することにより、糖化免疫グロブリンを正確に測定することができ、ＩｇＡ型多発性骨髄腫等の疾患を正確に判定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定することによる悪性ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症等の疾患の判定方法、糖化免疫グロブリンを測定するためのキット、検体中の免疫グロブリン分子中のキヌレニン残基のレベルを測定することによる悪性ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症等の疾患の判定方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、Ｈ鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）とＬ鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）がＳ−Ｓ結合した二量体構造である。Ｈ鎖はγ（ＩｇＧ）、α（ＩｇＡ）、μ（ＩｇＭ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）の５種類のクラスがあり、Ｌ鎖は各免疫グロブリンに共通するκ型とλ型の２種類のタイプが知られている。
免疫グロブリンは、通常、抗原構造の多様性に応じて、それぞれに対応する抗体産生細胞から、抗原結合部である可変部構造が異なる抗体が分泌されるため、電気泳動上γ分画を中心に不均一な幅広いピーク（多クローン性）を形成する。ところが、抗体産生細胞が腫瘍性、反応性に増殖すると、一つのクローン細胞から一つのクラス、タイプ、構造的に均一性の高い可変部を有する免疫グロブリン、すなわちｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ蛋白（Ｍ蛋白）が産生されてくる。この場合、電気泳動上は荷電均一性が高いため、単一のシャープなピークを示す。このようなＭ蛋白が認められるＭ蛋白血症（Ｍ−ｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ）には、悪性Ｍ蛋白血症と、良性Ｍ蛋白血症（ＭＧＵＳとも言われる）とがある（非特許文献１）。
悪性Ｍ蛋白血症の場合、一部が多発性骨髄腫、原発性マクログロブリン血症等の腫瘍性疾患と関係する。良性Ｍ蛋白血症の場合、元気な中高年にも認められることがあり、そのような疾患とほとんど無関係である。そのため、Ｍ蛋白が検出された場合、そのＭ蛋白が腫瘍性増殖による悪性Ｍ蛋白血症なのか、反応性増殖で出現する良性Ｍ蛋白血症かを鑑別しなければならない。なお、良性Ｍ蛋白血症ＭＧＵＳはＭ蛋白血症の約３／４を占める。しかし、悪性と良性とを明確に鑑別できる手段は現時点でみつかっていない。
【０００３】
一方、糖尿病診断のパラメーターである糖化蛋白のフルクトサミンの測定において、免疫グロブリン、特にＩｇＡ型Ｍ蛋白の存在が影響していることが報告されている（非特許文献２および非特許文献３）が、糖化された免疫グロブリンが悪性Ｍ蛋白血症と良性Ｍ蛋白血症の鑑別に利用できるかどうかについては明らかでない。
【非特許文献１】Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ 血液，２００５年，２０７−２２３頁
【非特許文献２】臨床検査 ｖｏｌ． ４７ ｎｏ．１０、２００３年１０月、１０６６−１０６８頁
【非特許文献３】Ｊ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００６； ５０：１９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、疾患、好適にはＩｇＡ型多発性骨髄腫等の疾患を正確に判定する方法を提供することにある。更に、本発明の課題は、検体中の糖化免疫グロブリンの測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
かかる状況において、本発明者らは、悪性ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症患者から採取したＩｇＡ・アルブミン複合体について詳細に検討したところ、悪性ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症患者から採取したＩｇＡ・アルブミン複合体のみに特異的に、糖付加し易いキヌレニン残基を有するペプチドが観察され、従って、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルの測定により、悪性ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症等の疾患を判定できるかどうかについて更に研究を重ねた結果、検体中の糖化ＩｇＡ等の糖化免疫グロブリンを測定する方法を新たに開発し、その測定方法を用いて糖化免疫グロブリンのレベルを測定することにより、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症か良性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症かなどについて簡単に判定できることを見出し、本発明を完成したものである。
【０００６】
従って、本発明は、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および／または程度を判定する判定方法に関する。
更に、本発明は、検体中の糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させ、次いで、その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定することを特徴とする糖化免疫グロブリンの測定方法に関する。
更に、本発明は、上記測定方法により、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および/または程度を判定する判定方法に関する。
更に、本発明は、検体中の糖化免疫グロブリンを測定するためのキットであって、
ｉ）糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位と結合可能な物質；および
ｉｉ）該物質に結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定するための試薬、
を含むキットに関する。
更に、本発明は、検体に存在する免疫グロブリン中のキヌレニン残基のレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および／または程度を判定する判定方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ＩｇＡ型多発性骨髄腫等の疾患を正確に判定することができる。更に、本発明により、検体中の糖化免疫グロブリンを正確に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および／または程度を判定する判定方法である。
本発明において、検体とは、血清、血漿、尿等の生体試料、あるいはそれらの希釈液、またはそれらのモデル試料等を例示できる。
本発明において、糖化免疫グロブリンとは、免疫グロブリン部位と、その免疫グロブリン等の蛋白と結合している糖部位とを有するものであれば、特に限定しない。例えば、糖化免疫グロブリンは、免疫グロブリンとアルブミン等の免疫グロブリン以外の蛋白質とが結合している蛋白質（例えば糖化免疫グロブリン・アルブミン複合体）が糖化されたものも含む。本発明において糖化免疫グロブリン中の免疫ブロブリンとしては、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びそれら免疫グロブリン全体を例示できるが、疾患として悪性のＩｇＡ型多発性骨髄腫等の悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症であるかどうかを判定するためには、ＩｇＡが好適である。この場合、健常人や良性の糖化ＩｇＡ値は、低値であり、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症患者の糖化ＩｇＡ値は、高値を示すので、この疾患を判定することができる。
【０００９】
本発明において、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定するには、例えば、検体中の糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させ、次いで、その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定することにより達成することができる。
本発明において、免疫グロブリンと結合可能な物質としては、免疫グロブリンと特異的に結合する物質であれば特に限定しないが、抗免疫グロブリン抗体、プロテインＧ、プロテインＡ等が好ましい。測定対象として糖化免疫グロブリンが、糖化ＩｇＡ、糖化ＩｇＧ、糖化ＩｇＭ、糖化ＩｇＤ、糖化ＩｇＥの場合、免疫グロブリンと結合可能な物質としては、それぞれ、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＩｇＥ抗体を用いることが好ましい。ここで、このような抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれをも使用することができるが、特異性の点からモノクローナル抗体が好ましい。
【００１０】
検体中の糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させるには、例えば、プレート等の固相支持体に、抗ヒトＩｇＡ抗体等の免疫グロブリンと特異的に結合する物質を加え、感作する。次いで、その固相支持体を洗浄液で洗浄し、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡを含むＰＢＳ）を添加する。得たれるプレート等の固相支持体を低温で保存して抗体感作プレート等の抗体感作固相支持体を作成する。その固相支持体を使用前に洗浄液にて洗浄し、次いで、その支持体に糖化免疫グロブリンを含む可能性のある検体を加えて、抗体等と糖化免疫グロブリンとを反応させることにより、検体中の糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させることができる。
【００１１】
本発明において、その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定するには、例えば、その結合した糖化免疫グロブリンに酵素を作用させグルコースを遊離させ、そのグルコースを測定することことにより実施することができる。すなわち、その結合した糖化免疫グロブリン（好ましくは糖化ＩｇＡ）の糖の部位のレベルを測定するには、例えば、糖化免疫グロブリン中の糖部位と免疫グロブリン部位との結合部位を、その結合部位を切断する酵素によって切断し、切断されて生成するグルコース等の糖のレベルを測定することにより達成することができる。
この場合、抗体等に結合した糖化免疫グロブリン中の糖部位と免疫グロブリン部位との結合部位を切断するには、例えば、グルコシダーゼ等のその結合部位を加水分解する酵素を用いる。加水分解酵素を用いる場合、その酵素の作用によってグルコースが遊離するので、例えば、そのグルコースを測定する。グルコースを測定するには、既知の方法により測定でき特に限定されないが、ｉ)グルコースオキシダーゼを作用させて、生成する過酸化水素にトリンダー試薬とペルオキシダーゼを作用させて色素を生成させて測定する方法、ｉｉ)グルコースを、ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＮＡＤを作用させてＮＡＤＨの増加量を測定する方法、ｉｉｉ）グルコースをヘキソキナーゼでグルコース−６−リン酸に誘導し、そのグルコース−６−リン酸に、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、酸化型または還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類及び還元型または酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類の二種類の補酵素を含有する試薬を作用させて、サイクリング反応を形成させ、該反応によって変化する補酵素の量を測定することによりグルコース量を測定する方法(例えば、特開平４−３３５８９８、特開平１０−２２５３００参照)を例示できる。そのうち、測定感度の点から、上記ｉｉｉ）の酵素サイクリングさせてグルコースを測定する方法が好ましい。この場合、例えば、第一試薬にグルコシダーゼ、ヘキソキナーゼ、マグネシウムイオン、チオＮＡＤおよびグルコース−６−リン酸脱水素酵素を含ませ、第二試薬にキレート剤およびＮＡＤＨを含ませ、前記の抗体感作固相支持体に第一試薬を加え反応させ、次いで第二試薬を加えて酵素サイクリング反応をさせて固相に結合した糖化免疫グロブリンを測定することができる。
【００１２】
本発明では、検体中の糖化免疫グロブリンを測定するためにキットを利用することができる。このようなキットとしては、ｉ）糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位と結合可能な物質；および ｉｉ）該物質に結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定するための試薬を含むキットがある。キットにおいて使用する、糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位と結合可能な物質としては、上記したと同様の物質が挙げられ、糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定するための試薬についても、上記したと同様に、グルコースを測定するための試薬などが挙げられる。これらのキットには、通常使用される、緩衝液、界面活性剤などが必要に応じて含まれていてもよい。
【００１３】
本発明においては、検体中の免疫グロブリン・アルブミン複合体（例えばＩｇＡ・アルブミン複合体）等の免疫グロブリン（例えばＩｇＡ）中のキヌレニン残基のレベルを測定することにより、疾患、例えば、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症等の疾患の有無および度合いを判定することができる。以下にＩｇＡ・アルブミン複合体のキヌレニン残基のレベルを測定する方法について例として説明する。
患者検体より精製したＩｇＡ・アルブミン複合体をトリプシン処理して分解し、得られるペプチドを逆相クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にて分析し、さらにＩｇＡ・アルブミン複合体のみで検出されるペプチドの解析すると、キヌレニン残基を有するペプチドが得られる。そのペプチドの量からキヌレニン残基のレベルを測定することができる。
この場合、例えば、はじめに健常人のＩｇＡ、アルブミンを別々に精製し、１：１の割合で混合後、これを試験管内でトリプシン分解する。その後、分解されたペプチドを逆相ＨＰＬＣによって分画し基本的なペプチドマップを作成する。全く同様の操作によって精製ＩｇＡ・アルブミン複合体をトリプシン分解処理し、先に健常人で作成したペプチドマップと比較し、ＩｇＡ−アルブミン複合体のみに認められるピークを検出し解析する。そのピークについて、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行ないキヌレニン残基を含むペプチド（例えば、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−キヌレニン−Ｖａｌ）を検出する。このように、検体中のＩｇＡ、特にＩｇＡ−アルブミン複合体のキヌレニン残基を測定することにより、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症の判定ができる。
【００１４】
本発明の別な形態によれば、キヌレニンを含むＩｇＡ中に存在する、例えば８個以上のアミノ酸配列であって、かつ、Ｇｌｕ−キヌレニン−Ｖａｌのアミノ酸配列を含むペプチド（以下キヌレニン含有ペプチド）をエピトープとする抗体（抗キヌレニン含有ＩｇＡ抗体）、好ましくはモノクローナル抗体を用いてＩｇＡ中のキヌレニン残基のレベルを測定することができる。
この場合、例えば、抗ＩｇＡ抗体と抗キヌレニン含有ＩｇＡ抗体の２つを組み合わせて用いることにより、ＩｇＡ中のキヌレニン残基のレベルを測定することができる。例えば、まず、抗ＩｇＡ抗体を、プレート等の固相支持体に加え、放置する。結合後、タンパク質の非特異的吸着部位をブロックするために、常法に基づき、ＢＳＡのようなタンパク質でブロッキングを行なう。次いで、このように固相に結合された抗ＩｇＡ抗体と、検体とを反応させ、検体中のキヌレニン含有ＩｇＡを抗原抗体反応により、前記固相に結合された抗ＩｇＡ抗体を介して固相に結合させる。次いで、洗浄後、固相に結合されたキヌレニン含有ＩｇＡと、抗キヌレニン含有ＩｇＡ抗体とを抗原抗体反応させる。キヌレニン含有ＩｇＡ抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、測定の精度を高めるためにモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１５】
次いで、洗浄後、キヌレニン含有ＩｇＡを介して固相に結合された抗キヌレニン含有ＩｇＡ抗体を測定する。これは、従来より免疫分析の分野において周知の種々の方法により行なうことができる。例えば、抗キヌレニン含有ＩｇＡ抗体を酵素、蛍光色素又は放射製物質等で標識しておき、該標識を測定することにより行なうことができる。また、キヌレニン含有ＩｇＡ抗体に特異的に反応する標識化抗体をさらに反応させ、該標識を測定することによっても行なうことができる。
【００１６】
以下、本発明を、参考例および実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら参考例および実施例に限定されるものではない。
【００１７】
参考例１
悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症患者からのＩｇＡ・アルブミン複合体の精製
悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症の多発性骨髄腫患者血清からのＩｇＡ・アルブミン複合体の精製は、文献（Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，５０巻，１９−２３頁、２００６年）に記載の以下の方法により行った。
ｐＨ７．２，０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液で平衡化したＪａｃａｌｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅ （フナコシ）カラム（０．９×１５ｃｍ）に、悪性のＩｇＡ型蛋白血症の患者血清を添加し、未結合分画を溶出させた後、０．８ ｍｏｌ／Ｌガラクトース−ｐＨ７．２，０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液にて結合したＩｇＡ分画を溶出させた。その分画をｐＨ ８．０，０．２ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液に透析後，ミニコンＢ１５にて濃縮し、さらにその試料をイオン交換体であるＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にアプライし、０から０．５ ｍｏｌ／ＬまでのＮａＣｌ直線型濃度勾配にて溶出させ、ＩｇＡ−アルブミン複合体を精製した。
【００１８】
実施例１
ＩｇＡ中のキヌレニン残基の有無による、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症の判定
患者検体より精製したＩｇＡ−アルブミン複合体、正常ヒトＩｇＡ、ヒトアルブミンをトリプシン処理後、分解し、得られるペプチドを逆相クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にて分析し、ＩｇＡ−アルブミン複合体のみで検出されるペプチドの解析したところ、ＩｇＡ−アルブミン複合体の場合にのみ、キヌレニン残基を有するペプチドを得た。
【００１９】
以下にその経過を簡単に述べる。はじめに健常人のＩｇＡ、アルブミンを別々に精製し、１：１の割合で混合後、これを試験管内でトリプシン分解した。その後、分解されたペプチドを逆相ＨＰＬＣによって分画し基本的なペプチドマップを作成した。全く同様の操作によって参考例１で得た精製ＩｇＡ・アルブミン複合体をトリプシン分解処理し、先に健常人で作成したペプチドマップと比較し、ＩｇＡ・アルブミン複合体のみに認められるピークを検出し解析した。
【００２０】
図１は、逆相ＨＰＬＣによる、ｉ）精製ＩｇＡ・アルブミン複合体、およびｉｉ）精製した正常ＩｇＡとアルブミンとの混合物のペプチドマップを比較したものである。ＩｇＡ・アルブミン複合体に特異的と思われるピークが確認されたが、そのピークについて、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行ったところ、ｆｒａｃｔｉｏｎ ６６（矢印）で酸化トリプトファンを含むペプチドが検出された。配列表の配列番号１にそのアミノ酸配列を示す。酸化トリプトファンはキヌレニンとも呼ばれる物質である。これらの結果、検体中のＩｇＡ、特にＩｇＡ−アルブミン複合体のキヌレニン残基を測定することにより、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症の判定ができることが判明した。
【００２１】
なお、このキヌレニンは，アルツハイマー病の脳内に蓄積が認められたり、目の水晶体の老化における白濁に関与していることが知られる物質であるが、血清中のＩｇＡから証明されたのは初めてである。また、キヌレニンは、３−ＯＨキヌレニン、さらに３−ＯＨキヌレニングルコシド、Ｏ−β−Ｄ−グルコシドへと糖付加しやすい部位であることが知られている。ところで、糖化を認めたＩｇＡ型Ｍ蛋白例では全例ＩｇＡ・アルブミン複合体が出現することも知られている（臨床検査，４７巻，１０６６−１０６８頁）。従って、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症では、キヌレニン残基を含むＩｇＡ−アルブミン複合体が生成し、キヌレニン残基を経由してＩｇＡが糖化され、糖化ＩｇＡ−アルブミン複合体が生成すると考えられる。
【００２２】
実施例２
糖化ＩｇＡの測定
本発明者らは、実施例１において示したとおり、ＩｇＡ・アルブミン複合体の糖化にキヌレニンの関与を初めて証明したことから、糖化ＩｇＡ量の測定は疾患（ＩｇＡ型多発性骨髄腫など）の新規マーカーとして活用できると考え、以下のような糖化ＩｇＡ測定系等の糖化免疫グロブリン測定系を構築した。この測定系は、検体中の糖化免疫グロブリン（例えば、糖化ＩｇＡ）中の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ）の部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させ、次いで、その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定する測定系である。
【００２３】
例えば、糖化ＩｇＡの測定では抗ヒトＩｇＡ抗体結合プレートを作製し、α−グルコシダーゼを含む酵素サイクリング法により免疫酵素測定法（ＥＩＡ）と同様の手技で測定を行うことができる。詳しくは９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を１００μｇ／１００μＬで加えた。４℃で１日間、感作した後、２００μＬの洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、ブロッキング剤（１．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）３００μＬを添加した。再び４℃で２日間保存して抗体感作プレートとした。プレートは使用前に洗浄液にて２００μＬで１回洗浄し、ここにインフォームド・コンセントを行ったボランティア及び患者検体５０μＬと５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）５０μＬを加えて室温、１時間反応させた。反応終了後、洗浄液３００μＬで３回洗浄し、１００μｌの下記第一試薬をプレートに加えて更に３７℃、１時間反応させ、続いて５０μｌの下記第二試薬を加えて、一定時間の後に発色値を４０５ｎｍにて比色した。
【００２４】
第一試薬組成
トリスヒドロキシアミノメタン １００ｍＭ ｐＨ ６．６０
イミダゾール １００ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍＭ
酢酸マグネシウム四水和物 １０ｍＭ
Ｎ−アセチルシステイン ２５ｍＭ
チオＮＡＤ（Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ） １ｍＭ
ヘキソキナーゼ（ＨＫ） ３０００Ｕ／Ｌ
グルコース−６−リン酸脱水素酵素
（Ｇ６ＰＤＨ） ５００００Ｕ／Ｌ
α−グルコシダーゼ ５００Ｕ／Ｌ
第二試薬組成
トリスヒドロキシアミノメタン ４００ｍＭ ｐＨ ９．００
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍＭ
ＡＴＰ ８ｍＭ
β−ＮＡＤＨ ２０ｍＭ
【００２５】
これらの反応では、下記第一試薬中のα−グルコシダーゼが、プレートに結合した糖化ＩｇＡのグリコシド結合を加水分解することによって、ＩｇＡに結合していたグルコース（糖）が得られる。次いで、このグルコースをグルコース−６−リン酸等に変換し、そのグルコース−６−リン酸を、特開平４−３３５８９８号公報に記載の酵素サイクリング法で測定する。その吸光度の測定値が、グルコース濃度、最終的に検体中の糖化ＩｇＡの量を反映しているという原理に基ずくものである。その測定原理を図２に、また、標準液のグルコース濃度と吸光度との関係を表１に示す。
【表１】
【００２６】
実施例３
糖化ＩｇＡ測定系を利用したＩｇＡ型多発性骨髄腫の判定
実施例２で確立した糖化ＩｇＡ測定系を利用して患者検体測定を行った。検体はＩｇＡ型多発性骨髄腫（Ｍ蛋白質、悪性）６例、ＩｇＡ型多発性骨髄腫（Ｍ蛋白質、良性）４例、ＩｇＧ，Ｍ型多発性骨髄腫（Ｍ蛋白質、悪性）２例、ＩｇＧ，Ｍ型多発性骨髄腫（Ｍ蛋白質、良性）２例、糖尿病１１例、健常人６例である。測定結果を表２に示す。表２に示す結果から、糖化ＩｇＡを測定することにより、多発性骨髄腫等の疾患、特にＩｇＡ型多発性骨髄腫（悪性のＭ蛋白血症）の判定ができることが示された。
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明により、検体中の糖化免疫グロブリンを正確に測定することができ、本発明の糖化免疫グロブリンの測定方法により、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定してＩｇＡ型多発性骨髄腫等の疾患を正確に判定することができる。更に、本発明により、検体中の免疫グロブリン中のキヌレニン残基を測定して、ＩｇＡ型多発性骨髄腫等の疾患を正確に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、逆相ＨＰＬＣによる、悪性ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症患者の精製ＩｇＡ・アルブミン複合体、および精製した正常ＩｇＡとアルブミンとの混合物のペプチドマップを比較したものである。
【図２】図２は、グルコースを酵素サイクリング法で測定する、測定原理を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定することによる悪性ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症等の疾患の判定方法、糖化免疫グロブリンを測定するためのキット、検体中の免疫グロブリン分子中のキヌレニン残基のレベルを測定することによる悪性ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症等の疾患の判定方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、Ｈ鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）とＬ鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）がＳ−Ｓ結合した二量体構造である。Ｈ鎖はγ（ＩｇＧ）、α（ＩｇＡ）、μ（ＩｇＭ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）の５種類のクラスがあり、Ｌ鎖は各免疫グロブリンに共通するκ型とλ型の２種類のタイプが知られている。
免疫グロブリンは、通常、抗原構造の多様性に応じて、それぞれに対応する抗体産生細胞から、抗原結合部である可変部構造が異なる抗体が分泌されるため、電気泳動上γ分画を中心に不均一な幅広いピーク（多クローン性）を形成する。ところが、抗体産生細胞が腫瘍性、反応性に増殖すると、一つのクローン細胞から一つのクラス、タイプ、構造的に均一性の高い可変部を有する免疫グロブリン、すなわちｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ蛋白（Ｍ蛋白）が産生されてくる。この場合、電気泳動上は荷電均一性が高いため、単一のシャープなピークを示す。このようなＭ蛋白が認められるＭ蛋白血症（Ｍ−ｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ）には、悪性Ｍ蛋白血症と、良性Ｍ蛋白血症（ＭＧＵＳとも言われる）とがある（非特許文献１）。
悪性Ｍ蛋白血症の場合、一部が多発性骨髄腫、原発性マクログロブリン血症等の腫瘍性疾患と関係する。良性Ｍ蛋白血症の場合、元気な中高年にも認められることがあり、そのような疾患とほとんど無関係である。そのため、Ｍ蛋白が検出された場合、そのＭ蛋白が腫瘍性増殖による悪性Ｍ蛋白血症なのか、反応性増殖で出現する良性Ｍ蛋白血症かを鑑別しなければならない。なお、良性Ｍ蛋白血症ＭＧＵＳはＭ蛋白血症の約３／４を占める。しかし、悪性と良性とを明確に鑑別できる手段は現時点でみつかっていない。
【０００３】
一方、糖尿病診断のパラメーターである糖化蛋白のフルクトサミンの測定において、免疫グロブリン、特にＩｇＡ型Ｍ蛋白の存在が影響していることが報告されている（非特許文献２および非特許文献３）が、糖化された免疫グロブリンが悪性Ｍ蛋白血症と良性Ｍ蛋白血症の鑑別に利用できるかどうかについては明らかでない。
【非特許文献１】Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ 血液，２００５年，２０７−２２３頁
【非特許文献２】臨床検査 ｖｏｌ． ４７ ｎｏ．１０、２００３年１０月、１０６６−１０６８頁
【非特許文献３】Ｊ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００６； ５０：１９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、疾患、好適にはＩｇＡ型多発性骨髄腫等の疾患を正確に判定する方法を提供することにある。更に、本発明の課題は、検体中の糖化免疫グロブリンの測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
かかる状況において、本発明者らは、悪性ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症患者から採取したＩｇＡ・アルブミン複合体について詳細に検討したところ、悪性ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症患者から採取したＩｇＡ・アルブミン複合体のみに特異的に、糖付加し易いキヌレニン残基を有するペプチドが観察され、従って、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルの測定により、悪性ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症等の疾患を判定できるかどうかについて更に研究を重ねた結果、検体中の糖化ＩｇＡ等の糖化免疫グロブリンを測定する方法を新たに開発し、その測定方法を用いて糖化免疫グロブリンのレベルを測定することにより、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症か良性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症かなどについて簡単に判定できることを見出し、本発明を完成したものである。
【０００６】
従って、本発明は、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および／または程度を判定する判定方法に関する。
更に、本発明は、検体中の糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させ、次いで、その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定することを特徴とする糖化免疫グロブリンの測定方法に関する。
更に、本発明は、上記測定方法により、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および/または程度を判定する判定方法に関する。
更に、本発明は、検体中の糖化免疫グロブリンを測定するためのキットであって、
ｉ）糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位と結合可能な物質；および
ｉｉ）該物質に結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定するための試薬、
を含むキットに関する。
更に、本発明は、検体に存在する免疫グロブリン中のキヌレニン残基のレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および／または程度を判定する判定方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ＩｇＡ型多発性骨髄腫等の疾患を正確に判定することができる。更に、本発明により、検体中の糖化免疫グロブリンを正確に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および／または程度を判定する判定方法である。
本発明において、検体とは、血清、血漿、尿等の生体試料、あるいはそれらの希釈液、またはそれらのモデル試料等を例示できる。
本発明において、糖化免疫グロブリンとは、免疫グロブリン部位と、その免疫グロブリン等の蛋白と結合している糖部位とを有するものであれば、特に限定しない。例えば、糖化免疫グロブリンは、免疫グロブリンとアルブミン等の免疫グロブリン以外の蛋白質とが結合している蛋白質（例えば糖化免疫グロブリン・アルブミン複合体）が糖化されたものも含む。本発明において糖化免疫グロブリン中の免疫ブロブリンとしては、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びそれら免疫グロブリン全体を例示できるが、疾患として悪性のＩｇＡ型多発性骨髄腫等の悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症であるかどうかを判定するためには、ＩｇＡが好適である。この場合、健常人や良性の糖化ＩｇＡ値は、低値であり、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症患者の糖化ＩｇＡ値は、高値を示すので、この疾患を判定することができる。
【０００９】
本発明において、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定するには、例えば、検体中の糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させ、次いで、その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定することにより達成することができる。
本発明において、免疫グロブリンと結合可能な物質としては、免疫グロブリンと特異的に結合する物質であれば特に限定しないが、抗免疫グロブリン抗体、プロテインＧ、プロテインＡ等が好ましい。測定対象として糖化免疫グロブリンが、糖化ＩｇＡ、糖化ＩｇＧ、糖化ＩｇＭ、糖化ＩｇＤ、糖化ＩｇＥの場合、免疫グロブリンと結合可能な物質としては、それぞれ、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＩｇＥ抗体を用いることが好ましい。ここで、このような抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれをも使用することができるが、特異性の点からモノクローナル抗体が好ましい。
【００１０】
検体中の糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させるには、例えば、プレート等の固相支持体に、抗ヒトＩｇＡ抗体等の免疫グロブリンと特異的に結合する物質を加え、感作する。次いで、その固相支持体を洗浄液で洗浄し、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡを含むＰＢＳ）を添加する。得たれるプレート等の固相支持体を低温で保存して抗体感作プレート等の抗体感作固相支持体を作成する。その固相支持体を使用前に洗浄液にて洗浄し、次いで、その支持体に糖化免疫グロブリンを含む可能性のある検体を加えて、抗体等と糖化免疫グロブリンとを反応させることにより、検体中の糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させることができる。
【００１１】
本発明において、その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定するには、例えば、その結合した糖化免疫グロブリンに酵素を作用させグルコースを遊離させ、そのグルコースを測定することことにより実施することができる。すなわち、その結合した糖化免疫グロブリン（好ましくは糖化ＩｇＡ）の糖の部位のレベルを測定するには、例えば、糖化免疫グロブリン中の糖部位と免疫グロブリン部位との結合部位を、その結合部位を切断する酵素によって切断し、切断されて生成するグルコース等の糖のレベルを測定することにより達成することができる。
この場合、抗体等に結合した糖化免疫グロブリン中の糖部位と免疫グロブリン部位との結合部位を切断するには、例えば、グルコシダーゼ等のその結合部位を加水分解する酵素を用いる。加水分解酵素を用いる場合、その酵素の作用によってグルコースが遊離するので、例えば、そのグルコースを測定する。グルコースを測定するには、既知の方法により測定でき特に限定されないが、ｉ)グルコースオキシダーゼを作用させて、生成する過酸化水素にトリンダー試薬とペルオキシダーゼを作用させて色素を生成させて測定する方法、ｉｉ)グルコースを、ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＮＡＤを作用させてＮＡＤＨの増加量を測定する方法、ｉｉｉ）グルコースをヘキソキナーゼでグルコース−６−リン酸に誘導し、そのグルコース−６−リン酸に、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、酸化型または還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類及び還元型または酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類の二種類の補酵素を含有する試薬を作用させて、サイクリング反応を形成させ、該反応によって変化する補酵素の量を測定することによりグルコース量を測定する方法(例えば、特開平４−３３５８９８、特開平１０−２２５３００参照)を例示できる。そのうち、測定感度の点から、上記ｉｉｉ）の酵素サイクリングさせてグルコースを測定する方法が好ましい。この場合、例えば、第一試薬にグルコシダーゼ、ヘキソキナーゼ、マグネシウムイオン、チオＮＡＤおよびグルコース−６−リン酸脱水素酵素を含ませ、第二試薬にキレート剤およびＮＡＤＨを含ませ、前記の抗体感作固相支持体に第一試薬を加え反応させ、次いで第二試薬を加えて酵素サイクリング反応をさせて固相に結合した糖化免疫グロブリンを測定することができる。
【００１２】
本発明では、検体中の糖化免疫グロブリンを測定するためにキットを利用することができる。このようなキットとしては、ｉ）糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位と結合可能な物質；および ｉｉ）該物質に結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定するための試薬を含むキットがある。キットにおいて使用する、糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位と結合可能な物質としては、上記したと同様の物質が挙げられ、糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定するための試薬についても、上記したと同様に、グルコースを測定するための試薬などが挙げられる。これらのキットには、通常使用される、緩衝液、界面活性剤などが必要に応じて含まれていてもよい。
【００１３】
本発明においては、検体中の免疫グロブリン・アルブミン複合体（例えばＩｇＡ・アルブミン複合体）等の免疫グロブリン（例えばＩｇＡ）中のキヌレニン残基のレベルを測定することにより、疾患、例えば、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症等の疾患の有無および度合いを判定することができる。以下にＩｇＡ・アルブミン複合体のキヌレニン残基のレベルを測定する方法について例として説明する。
患者検体より精製したＩｇＡ・アルブミン複合体をトリプシン処理して分解し、得られるペプチドを逆相クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にて分析し、さらにＩｇＡ・アルブミン複合体のみで検出されるペプチドの解析すると、キヌレニン残基を有するペプチドが得られる。そのペプチドの量からキヌレニン残基のレベルを測定することができる。
この場合、例えば、はじめに健常人のＩｇＡ、アルブミンを別々に精製し、１：１の割合で混合後、これを試験管内でトリプシン分解する。その後、分解されたペプチドを逆相ＨＰＬＣによって分画し基本的なペプチドマップを作成する。全く同様の操作によって精製ＩｇＡ・アルブミン複合体をトリプシン分解処理し、先に健常人で作成したペプチドマップと比較し、ＩｇＡ−アルブミン複合体のみに認められるピークを検出し解析する。そのピークについて、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行ないキヌレニン残基を含むペプチド（例えば、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−キヌレニン−Ｖａｌ）を検出する。このように、検体中のＩｇＡ、特にＩｇＡ−アルブミン複合体のキヌレニン残基を測定することにより、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症の判定ができる。
【００１４】
本発明の別な形態によれば、キヌレニンを含むＩｇＡ中に存在する、例えば８個以上のアミノ酸配列であって、かつ、Ｇｌｕ−キヌレニン−Ｖａｌのアミノ酸配列を含むペプチド（以下キヌレニン含有ペプチド）をエピトープとする抗体（抗キヌレニン含有ＩｇＡ抗体）、好ましくはモノクローナル抗体を用いてＩｇＡ中のキヌレニン残基のレベルを測定することができる。
この場合、例えば、抗ＩｇＡ抗体と抗キヌレニン含有ＩｇＡ抗体の２つを組み合わせて用いることにより、ＩｇＡ中のキヌレニン残基のレベルを測定することができる。例えば、まず、抗ＩｇＡ抗体を、プレート等の固相支持体に加え、放置する。結合後、タンパク質の非特異的吸着部位をブロックするために、常法に基づき、ＢＳＡのようなタンパク質でブロッキングを行なう。次いで、このように固相に結合された抗ＩｇＡ抗体と、検体とを反応させ、検体中のキヌレニン含有ＩｇＡを抗原抗体反応により、前記固相に結合された抗ＩｇＡ抗体を介して固相に結合させる。次いで、洗浄後、固相に結合されたキヌレニン含有ＩｇＡと、抗キヌレニン含有ＩｇＡ抗体とを抗原抗体反応させる。キヌレニン含有ＩｇＡ抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、測定の精度を高めるためにモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１５】
次いで、洗浄後、キヌレニン含有ＩｇＡを介して固相に結合された抗キヌレニン含有ＩｇＡ抗体を測定する。これは、従来より免疫分析の分野において周知の種々の方法により行なうことができる。例えば、抗キヌレニン含有ＩｇＡ抗体を酵素、蛍光色素又は放射製物質等で標識しておき、該標識を測定することにより行なうことができる。また、キヌレニン含有ＩｇＡ抗体に特異的に反応する標識化抗体をさらに反応させ、該標識を測定することによっても行なうことができる。
【００１６】
以下、本発明を、参考例および実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら参考例および実施例に限定されるものではない。
【００１７】
参考例１
悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症患者からのＩｇＡ・アルブミン複合体の精製
悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症の多発性骨髄腫患者血清からのＩｇＡ・アルブミン複合体の精製は、文献（Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，５０巻，１９−２３頁、２００６年）に記載の以下の方法により行った。
ｐＨ７．２，０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液で平衡化したＪａｃａｌｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅ （フナコシ）カラム（０．９×１５ｃｍ）に、悪性のＩｇＡ型蛋白血症の患者血清を添加し、未結合分画を溶出させた後、０．８ ｍｏｌ／Ｌガラクトース−ｐＨ７．２，０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液にて結合したＩｇＡ分画を溶出させた。その分画をｐＨ ８．０，０．２ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液に透析後，ミニコンＢ１５にて濃縮し、さらにその試料をイオン交換体であるＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にアプライし、０から０．５ ｍｏｌ／ＬまでのＮａＣｌ直線型濃度勾配にて溶出させ、ＩｇＡ−アルブミン複合体を精製した。
【００１８】
実施例１
ＩｇＡ中のキヌレニン残基の有無による、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症の判定
患者検体より精製したＩｇＡ−アルブミン複合体、正常ヒトＩｇＡ、ヒトアルブミンをトリプシン処理後、分解し、得られるペプチドを逆相クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にて分析し、ＩｇＡ−アルブミン複合体のみで検出されるペプチドの解析したところ、ＩｇＡ−アルブミン複合体の場合にのみ、キヌレニン残基を有するペプチドを得た。
【００１９】
以下にその経過を簡単に述べる。はじめに健常人のＩｇＡ、アルブミンを別々に精製し、１：１の割合で混合後、これを試験管内でトリプシン分解した。その後、分解されたペプチドを逆相ＨＰＬＣによって分画し基本的なペプチドマップを作成した。全く同様の操作によって参考例１で得た精製ＩｇＡ・アルブミン複合体をトリプシン分解処理し、先に健常人で作成したペプチドマップと比較し、ＩｇＡ・アルブミン複合体のみに認められるピークを検出し解析した。
【００２０】
図１は、逆相ＨＰＬＣによる、ｉ）精製ＩｇＡ・アルブミン複合体、およびｉｉ）精製した正常ＩｇＡとアルブミンとの混合物のペプチドマップを比較したものである。ＩｇＡ・アルブミン複合体に特異的と思われるピークが確認されたが、そのピークについて、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行ったところ、ｆｒａｃｔｉｏｎ ６６（矢印）で酸化トリプトファンを含むペプチドが検出された。配列表の配列番号１にそのアミノ酸配列を示す。酸化トリプトファンはキヌレニンとも呼ばれる物質である。これらの結果、検体中のＩｇＡ、特にＩｇＡ−アルブミン複合体のキヌレニン残基を測定することにより、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症の判定ができることが判明した。
【００２１】
なお、このキヌレニンは，アルツハイマー病の脳内に蓄積が認められたり、目の水晶体の老化における白濁に関与していることが知られる物質であるが、血清中のＩｇＡから証明されたのは初めてである。また、キヌレニンは、３−ＯＨキヌレニン、さらに３−ＯＨキヌレニングルコシド、Ｏ−β−Ｄ−グルコシドへと糖付加しやすい部位であることが知られている。ところで、糖化を認めたＩｇＡ型Ｍ蛋白例では全例ＩｇＡ・アルブミン複合体が出現することも知られている（臨床検査，４７巻，１０６６−１０６８頁）。従って、悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症では、キヌレニン残基を含むＩｇＡ−アルブミン複合体が生成し、キヌレニン残基を経由してＩｇＡが糖化され、糖化ＩｇＡ−アルブミン複合体が生成すると考えられる。
【００２２】
実施例２
糖化ＩｇＡの測定
本発明者らは、実施例１において示したとおり、ＩｇＡ・アルブミン複合体の糖化にキヌレニンの関与を初めて証明したことから、糖化ＩｇＡ量の測定は疾患（ＩｇＡ型多発性骨髄腫など）の新規マーカーとして活用できると考え、以下のような糖化ＩｇＡ測定系等の糖化免疫グロブリン測定系を構築した。この測定系は、検体中の糖化免疫グロブリン（例えば、糖化ＩｇＡ）中の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ）の部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させ、次いで、その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定する測定系である。
【００２３】
例えば、糖化ＩｇＡの測定では抗ヒトＩｇＡ抗体結合プレートを作製し、α−グルコシダーゼを含む酵素サイクリング法により免疫酵素測定法（ＥＩＡ）と同様の手技で測定を行うことができる。詳しくは９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を１００μｇ／１００μＬで加えた。４℃で１日間、感作した後、２００μＬの洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、ブロッキング剤（１．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）３００μＬを添加した。再び４℃で２日間保存して抗体感作プレートとした。プレートは使用前に洗浄液にて２００μＬで１回洗浄し、ここにインフォームド・コンセントを行ったボランティア及び患者検体５０μＬと５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）５０μＬを加えて室温、１時間反応させた。反応終了後、洗浄液３００μＬで３回洗浄し、１００μｌの下記第一試薬をプレートに加えて更に３７℃、１時間反応させ、続いて５０μｌの下記第二試薬を加えて、一定時間の後に発色値を４０５ｎｍにて比色した。
【００２４】
第一試薬組成
トリスヒドロキシアミノメタン １００ｍＭ ｐＨ ６．６０
イミダゾール １００ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍＭ
酢酸マグネシウム四水和物 １０ｍＭ
Ｎ−アセチルシステイン ２５ｍＭ
チオＮＡＤ（Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ） １ｍＭ
ヘキソキナーゼ（ＨＫ） ３０００Ｕ／Ｌ
グルコース−６−リン酸脱水素酵素
（Ｇ６ＰＤＨ） ５００００Ｕ／Ｌ
α−グルコシダーゼ ５００Ｕ／Ｌ
第二試薬組成
トリスヒドロキシアミノメタン ４００ｍＭ ｐＨ ９．００
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍＭ
ＡＴＰ ８ｍＭ
β−ＮＡＤＨ ２０ｍＭ
【００２５】
これらの反応では、下記第一試薬中のα−グルコシダーゼが、プレートに結合した糖化ＩｇＡのグリコシド結合を加水分解することによって、ＩｇＡに結合していたグルコース（糖）が得られる。次いで、このグルコースをグルコース−６−リン酸等に変換し、そのグルコース−６−リン酸を、特開平４−３３５８９８号公報に記載の酵素サイクリング法で測定する。その吸光度の測定値が、グルコース濃度、最終的に検体中の糖化ＩｇＡの量を反映しているという原理に基ずくものである。その測定原理を図２に、また、標準液のグルコース濃度と吸光度との関係を表１に示す。
【表１】
【００２６】
実施例３
糖化ＩｇＡ測定系を利用したＩｇＡ型多発性骨髄腫の判定
実施例２で確立した糖化ＩｇＡ測定系を利用して患者検体測定を行った。検体はＩｇＡ型多発性骨髄腫（Ｍ蛋白質、悪性）６例、ＩｇＡ型多発性骨髄腫（Ｍ蛋白質、良性）４例、ＩｇＧ，Ｍ型多発性骨髄腫（Ｍ蛋白質、悪性）２例、ＩｇＧ，Ｍ型多発性骨髄腫（Ｍ蛋白質、良性）２例、糖尿病１１例、健常人６例である。測定結果を表２に示す。表２に示す結果から、糖化ＩｇＡを測定することにより、多発性骨髄腫等の疾患、特にＩｇＡ型多発性骨髄腫（悪性のＭ蛋白血症）の判定ができることが示された。
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明により、検体中の糖化免疫グロブリンを正確に測定することができ、本発明の糖化免疫グロブリンの測定方法により、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定してＩｇＡ型多発性骨髄腫等の疾患を正確に判定することができる。更に、本発明により、検体中の免疫グロブリン中のキヌレニン残基を測定して、ＩｇＡ型多発性骨髄腫等の疾患を正確に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、逆相ＨＰＬＣによる、悪性ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症患者の精製ＩｇＡ・アルブミン複合体、および精製した正常ＩｇＡとアルブミンとの混合物のペプチドマップを比較したものである。
【図２】図２は、グルコースを酵素サイクリング法で測定する、測定原理を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および／または程度を判定する判定方法。
【請求項２】
糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンがＩｇＡである、請求項１の判定方法。
【請求項３】
疾患が悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症である、請求項１または２の判定方法。
【請求項４】
疾患がＩｇＡ型多発性骨髄腫である請求項１から３のいずれかの判定方法。
【請求項５】
糖化免疫グロブリンが糖化免疫グロブリン・アルブミン複合体である、請求項１から４のいずれかの判定方法。
【請求項６】
検体中の糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させ、次いで、その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定することを特徴とする糖化免疫グロブリンの測定方法。
【請求項７】
糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンがＩｇＡである請求項６の測定方法。
【請求項８】
その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定することが、糖化免疫グロブリンに酵素を作用させグルコースを遊離させ、そのグルコースを測定することである請求項６または７の測定方法。
【請求項９】
グルコースをヘキソキナーゼでグルコース−６−リン酸に誘導し、そのグルコース−６−リン酸に、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、酸化型または還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類及び還元型または酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類の二種類の補酵素を含有する試薬を作用させて、サイクリング反応を形成させ、該反応によって変化する補酵素の量を測定することによりグルコース量を測定する、請求項８の測定方法。
【請求項１０】
糖化免疫グロブリンが糖化免疫グロブリン・アルブミン複合体である、請求項６から９のいずれかの測定方法。
【請求項１１】
免疫グロブリンと結合可能な物質が抗免疫グロブリン抗体、プロテインＣまたはプロテインＡである請求項６から１０のいずれかの測定方法。
【請求項１２】
請求項６から１１のいずれかの測定方法により、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および/または程度を判定する判定方法。
【請求項１３】
疾患が悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症である、請求項１２の判定方法。
【請求項１４】
悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症がＩｇＡ型多発性骨髄腫である請求項１３の判定方法。
【請求項１５】
検体中の糖化免疫グロブリンを測定するためのキットであって、
ｉ）糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位と結合可能な物質；および ｉｉ）該物質に結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定するための試薬、
を含むキット。
【請求項１６】
検体中の免疫グロブリン中のキヌレニン残基のレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および／または程度を判定する判定方法。
【請求項１７】
免疫グロブリンが免疫グロブリン・アルブミン複合体である、請求項１６の判定方法。
【請求項１８】
免疫グロブリンがＩｇＡである請求項１６または１７の判定方法。
【請求項１９】
疾患が悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症である、請求項１６から１８のいずれかの判定方法。
【請求項２０】
悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症がＩｇＡ型多発性骨髄腫である請求項１９の判定方法。
【請求項２１】
免疫グロブリン中のキヌレニン残基のレベルを、Ｇｌｕ−キヌレニン−Ｖａｌのアミノ酸配列を含むペプチドをエピトープとする抗体により測定する、請求項１６から２０のいずれかの判定方法。
【請求項２２】
免疫グロブリン中のキヌレニン残基のレベルを、抗免疫グロブリン抗体と、Ｇｌｕ−キヌレニン−Ｖａｌのアミノ酸配列を含むペプチドをエピトープとする抗体とにより測定する、請求項２１の判定方法。
【請求項１】
検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および／または程度を判定する判定方法。
【請求項２】
糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンがＩｇＡである、請求項１の判定方法。
【請求項３】
疾患が悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症である、請求項１または２の判定方法。
【請求項４】
疾患がＩｇＡ型多発性骨髄腫である請求項１から３のいずれかの判定方法。
【請求項５】
糖化免疫グロブリンが糖化免疫グロブリン・アルブミン複合体である、請求項１から４のいずれかの判定方法。
【請求項６】
検体中の糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位を、免疫グロブリンと結合可能な物質と結合させ、次いで、その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定することを特徴とする糖化免疫グロブリンの測定方法。
【請求項７】
糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンがＩｇＡである請求項６の測定方法。
【請求項８】
その結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定することが、糖化免疫グロブリンに酵素を作用させグルコースを遊離させ、そのグルコースを測定することである請求項６または７の測定方法。
【請求項９】
グルコースをヘキソキナーゼでグルコース−６−リン酸に誘導し、そのグルコース−６−リン酸に、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、酸化型または還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類及び還元型または酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類の二種類の補酵素を含有する試薬を作用させて、サイクリング反応を形成させ、該反応によって変化する補酵素の量を測定することによりグルコース量を測定する、請求項８の測定方法。
【請求項１０】
糖化免疫グロブリンが糖化免疫グロブリン・アルブミン複合体である、請求項６から９のいずれかの測定方法。
【請求項１１】
免疫グロブリンと結合可能な物質が抗免疫グロブリン抗体、プロテインＣまたはプロテインＡである請求項６から１０のいずれかの測定方法。
【請求項１２】
請求項６から１１のいずれかの測定方法により、検体中の糖化免疫グロブリンのレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および/または程度を判定する判定方法。
【請求項１３】
疾患が悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症である、請求項１２の判定方法。
【請求項１４】
悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症がＩｇＡ型多発性骨髄腫である請求項１３の判定方法。
【請求項１５】
検体中の糖化免疫グロブリンを測定するためのキットであって、
ｉ）糖化免疫グロブリン中の免疫グロブリンの部位と結合可能な物質；および ｉｉ）該物質に結合した糖化免疫グロブリンの糖の部位のレベルを測定するための試薬、
を含むキット。
【請求項１６】
検体中の免疫グロブリン中のキヌレニン残基のレベルを測定し、そのレベルの大小から、疾患の有無および／または程度を判定する判定方法。
【請求項１７】
免疫グロブリンが免疫グロブリン・アルブミン複合体である、請求項１６の判定方法。
【請求項１８】
免疫グロブリンがＩｇＡである請求項１６または１７の判定方法。
【請求項１９】
疾患が悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症である、請求項１６から１８のいずれかの判定方法。
【請求項２０】
悪性のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症がＩｇＡ型多発性骨髄腫である請求項１９の判定方法。
【請求項２１】
免疫グロブリン中のキヌレニン残基のレベルを、Ｇｌｕ−キヌレニン−Ｖａｌのアミノ酸配列を含むペプチドをエピトープとする抗体により測定する、請求項１６から２０のいずれかの判定方法。
【請求項２２】
免疫グロブリン中のキヌレニン残基のレベルを、抗免疫グロブリン抗体と、Ｇｌｕ−キヌレニン−Ｖａｌのアミノ酸配列を含むペプチドをエピトープとする抗体とにより測定する、請求項２１の判定方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−１４４２０（Ｐ２００９−１４４２０Ａ）
【公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１７４７０６（Ｐ２００７−１７４７０６）
【出願日】平成１９年７月３日（２００７．７．３）
【出願人】（０００００３９７５）日東紡績株式会社 (251)
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月３日（２００７．７．３）
【出願人】（０００００３９７５）日東紡績株式会社 (251)
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]