糖尿病患者における血管リモデリングおよび心血管疾患治療のための治療薬としての非アシル化グレリンおよび類似体
本発明は、心血管疾患を治療するため、循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための方法、ならびに血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための方法に関する。この方法は、非アシル化グレリン、または配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体；ならびに非アシル化グレリン、または配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を含む医薬組成物を、治療有効量で被験体に投与することを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管リモデリングおよび血管疾患治療、心血管疾患を治療するための方法および医薬組成物、循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための方法および医薬組成物、ならびに血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための方法および医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グレリン（ＡＧ）は２８アミノ酸のペプチドであり、ラット胃から精製かつ同定され、Ｓｅｒ３残基上に存在するｎ−オクタノイル修飾を特徴とする（参考文献１）。ＡＧは成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳＲ）の内因性リガンドであり（参考文献２、３）、心血管系（心臓、脈管系および大血管内皮細胞など）でも検出されることから、成長ホルモンを放出する特性を有する他に、血管生物学、血管生理機能、ならびにアテローム発生に影響も及ぼし得ることが示されている（参考文献４、５、６）。
【０００３】
Ｄｅｓ−アシルグレリン（または非アシル化グレリン、すなわちＵＡＧ）はグレリンの非アシル化型であり、ＡＧと比較して血漿および組織中濃度が高く、ＧＨＳＲ−１ａに結合できず、いずれの中心活性も欠いている（参考文献７）。しかしながら、ＵＡＧはＡＧと多くの生物学的活性およびいくつもの末梢組織上の共通の結合部位を共有する。ＡＧとＵＡＧは類似したＧＨＳ−Ｒ非依存性の生物学的活性（細胞保護効果（参考文献９）およびインビボ脂質生成効果（参考文献１０）など）を示す。ＵＡＧ活性を検討したすべてではないがほとんどの細胞においてＧＨＳＲ−１ａは発現しなかったことから、ＡＧと共有するかかる多面的活性はＧＨＳＲ−１ａとは異なる未確認の受容体に媒介されている可能性が示唆される。
【０００４】
ＵＡＧは生物学的に（特に代謝レベルで）活性のペプチドであることが実証されており、米国特許第７，４８５，６２０号、米国特許出願公開第２００８０１５９９９１号、米国特許出願公開第２００８０３１２１３３号および国際公開第２００８／１４５７４９号に記載された抗糖尿病誘発効果を発揮することが特に示されている。
【０００５】
ＡＧとＵＡＧは心筋細胞上に直接作用し、実験的に誘発された細胞死を生存シグナル伝達経路の活性化を通じて阻害することが既に広く報告されている（参考文献８）。ＡＧは基底およびＴＮＦ−α誘発性遊走性サイトカイン産生ならびにヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）内の単核細胞付着を阻害することも示されている（参考文献５）。さらに外因性ＡＧによるヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）治療は、細胞の増殖、移動、インビトロ血管形成およびこれらの細胞内ＥＲＫ２リン酸化を有意に増加させたことが報告された（参考文献４）。最近、Ｋｌｅｉｎｚら（参考文献３５）は、ＡＧとＵＡＧはヒト血管緊張におけるパラクリン調節の役割を担うことを実証し、より具体的には、ＡＧとＵＡＧはヒト動脈の血管拡張作用を有することを示した。
【０００６】
促進された血管疾患は糖尿病患者の死亡および障害の主因である。内皮損傷は糖尿病環境下のアテローム硬化性血管疾患の発症および進行における重要な段階を成すと考えられる（参考文献１１）。
【０００７】
最終糖化産物（ＡＧＥ）は糖尿病環境下で血管リモデリング障害を引き起こすことが既に報告されている（参考文献１２）。ＡＧＥの形成および活性酸素種（ＲＯＳ）の産生は、糖尿病下のＡＧＥに対する細胞反応として、主に血管リモデリング障害を引き起こすと思われる。
【０００８】
血管リモデリングは常在内皮細胞増殖のみに依存せず、循環する血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に関与もする。最近のデータにより、心血管リスク因子の保因患者（限定されないが、糖尿病患者など）において、ＥＰＣ数が低減し、ＥＰＣ機能が損なわれていることが実証された（参考文献１３、１４、１５）。
【０００９】
２種類のＥＰＣ、すなわち初期ＥＰＣと後期ＥＰＣについてこれまでに記載されている。それらには共通の特徴があるが、形態学的効能、増殖能、およびインビトロ機能特性の面でいくつか異なる特徴がある。後期ＥＰＣとは異なり、初期ＥＰＣは典型的にはインビトロで内皮表現型を導入しないが、インビボにおいて、間接的なパラクリン様式で新血管形成を増強する。これにより、初期ＥＰＣは循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）として再定義される。ＣＡＣは単球様細胞であり、骨髄から新血管形成部位に回帰し得、血管損傷後の再内皮化に関わり、その場（ｉｎ ｓｉｔｕ）で成熟内皮細胞に分化する（参考文献１６）。
【００１０】
心血管リスク因子プロファイルが増加するにつれ、ＣＡＣ数が減少し、ＣＡＣ機能活性が損なわれ、したがってＣＡＣの、例えば、血管形成が必要とされ得る虚血部位への送達が制限されることを示す有力な証拠がある。特定のサイトカインによる治療は、ＣＡＣの骨髄（ＢＭ）動員を誘発し、続いて心血管リスクを防ぐと見込まれる（参考文献１７、１８）。
【００１１】
酸化ストレスは糖尿病に関連した血管組織損傷および内皮損傷において主な役割を担う。主に、糖尿病環境下のＲＯＳ産生は最終糖化産物（ＡＧＥ）に誘発され、特にＣＡＣから産生される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第７，４８５，６２０号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８０１５９９９１号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８０３１２１３３号
【特許文献４】国際公開第２００８／１４５７４９号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋｏｊｉｍａ Ｍ， Ｈｏｓｏｄａ Ｈ， Ｄａｔｅ Ｙ， Ｎａｋａｚａｔｏ Ｍ， Ｍａｔｓｕｏ Ｈ ａｎｄ． Ｋａｎｇａｗａ Ｋ； Ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｓ ａ ｇｒｏｗｔｈ−ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ａｃｙｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｓｔｏｍａｃｈ， Ｎａｔｕｒｅ ４０２：６５６−６６０ （１９９９）．
【非特許文献２】Ｇｎａｎａｐａｖａｎ Ｓ， Ｋｏｌａ Ｂ， Ｂｕｓｔｉｎ ＳＡ， Ｍｏｒｒｉｓ ＤＧ， ＭｃＧｅｅ Ｐ， Ｆａｉｒｃｌｏｕｇｈ Ｐ， Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ Ｓ， Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ Ｒ， Ｇｒｏｓｓｍａｎ ＡＢ ａｎｄ Ｋｏｒｂｏｎｉｔｓ Ｍ； Ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ＧＨＳ−Ｒ， ｉｎ ｈｕｍａｎｓ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８７：２９８８−２９９１ （２００２）．
【非特許文献３】Ｈｏｗａｒｄ ＡＤ， Ｆｅｉｇｈｎｅｒ ＳＤ， Ｃｕｌｌｙ ＤＦ， Ａｒｅｎａ ＪＰ， Ｌｉｂｅｒａｔｏｒ ＰＬ， Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ Ｃｌ， Ｈａｍｅｌｉｎ Ｍ， Ｈｒｅｎｉｕｋ ＤＬ， Ｐａｌｙｈａ ＯＣ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｊ， Ｐａｒｅｓｓ ＰＳ， Ｄｉａｚ Ｃ， Ｃｈｏｕ Ｍ， Ｌｉｕ ＫＫ， ＭｃＫｅｅ Ｋ−Ｋ， Ｐｏｎｇ Ｓ−Ｓ， Ｃｈａｕｎｇ Ｌ−Ｙ， Ｅｌｂｒｅｃｈｔ Ａ， Ｄａｓｈｋｅｖｉｃｚ Ｍ， Ｈｅａｖｅｎｓ Ｒ， Ｒｉｇｂｙ Ｍ， Ｓｉｒｉｎａｔｈｓｉｎｇｈｊｉ Ｄ， Ｄｅａｎ ＤＣ， Ｍｅｌｉｌｌｏ ＤＧ， Ｐａｔｃｈｅｔｔ ＡＡ， Ｎａｒｇｕｎｄ Ｒ， Ｇｒｉｆｆｉｎ ＰＲ， ＤｅＭａｒｔｉｎｏ ＪＡ， Ｇｕｐｔａ ＳＫ， Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ ＪＡ， Ｓｍｉｔｈ ＲＧ， Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ ＬＨＴ； Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｎｄ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ｔｈａｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：９７４−９７７ （１９９６）．
【非特許文献４】Ｌｉ Ａ， Ｃｈｅｎｇ Ｇ， Ｚｈｕ ＧＨ， Ｔａｒｎａｗｓｋｉ ＡＳ； Ｇｈｒｅｌｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｂｅｙｏｎｄ ＧＨ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｙｏｐｈｉｓ． Ｒｅｓ． ｃｏｍｍｕｎ． ３５３：２３８−４３ （２００７）．
【非特許文献５】Ｌｉ ＷＧ， Ｇａｖｒｉｌａ Ｄ， Ｌｉｕ Ｘ， Ｗａｎｇ Ｌ， Ｇｕｎｎｌａｕｇｓｓｏｎ Ｓ， Ｓｔｏｌｌ ＬＬ， ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ＭＬ， Ｓｉｇｍｕｎｄ ＣＤ， Ｔａｎｇ Ｃ， Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ＮＬ； Ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ Ｂ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：２２２１−６ （２００４）．
【非特許文献６】Ｄｉｘｉｔ ＶＤ， Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＥＭ， Ｐｙｌｅ ＲＳ， Ｃｏｌｌｉｎｓ ＧＤ， Ｓａｋｔｈｉｖｅｌ ＳＫ， Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎ Ｒ， Ｌｉｌｌａｒｄ ＪＷ Ｊｒ， Ｔａｕｂ ＤＤ； Ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｌｅｐｔｉｎ−ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖ． １１４：５７−６６ （２００４）．
【非特許文献７】ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｌｙ ＡＪ， Ｔｓｃｈｏｐ Ｍ， Ｈｅｉｍａｎ ＭＬ， Ｇｈｉｇｏ Ｅ； Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ， ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ， ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ ２５：４２６−４５７ （２００４）．
【非特許文献８】Ｂａｌｄａｎｚｉ Ｇ， Ｆｉｌｉｇｈｅｄｄｕ Ｎ， Ｃｕｔｒｕｐｉ Ｓ， Ｃａｔａｐａｎｏ Ｆ， Ｂｏｎｉｓｓｏｎｉ Ｓ， Ｆｕｂｉｎｉ Ａ， Ｍａｌａｎ Ｄ， Ｂａｊ Ｇ， Ｇｒａｎａｔａ Ｒ， Ｂｒｏｇｌｉｏ Ｆ， Ｐａｐｏｔｔｉ Ｍ， Ｓｕｒｉｃｏ Ｎ， Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ Ｆ， Ｉｓｇａａｒｄ Ｊ， Ｄｅｇｈｅｎｇｈｉ Ｒ， Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ Ｆ， Ｐｒａｔ Ｍ， Ｍｕｃｃｉｏｌｉ Ｇ， Ｇｈｉｇｏ Ｅ， Ｇｒａｚｉａｎｉ Ａ； Ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｄｅｓ−ａｃｙｌ ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＥＲＫ１／２ ａｎｄ Ｐｌ ３−ｋｉｎａｓｅ／ＡＫＴ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １５９：１０２９−３７ （２００２）．
【非特許文献９】Ｄｅｌｈａｎｔｙ ＰＪ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｅｒｄｅｎ ＢＣ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅ Ｍ， Ｇａｕｎａ Ｃ， Ｐｏｌｓ ＨＡ， Ｊａｈｒ Ｈ， Ｃｈｉｂａ Ｈ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｌｙ ＡＪ， ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ Ｊ； Ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｕｎａｃｙｌａｔｅｄ ｇｈｒｅｌｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｈｕｍａｎ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｖｉａ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （ＭＡＰＫ）／ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ （ＰＩ３Ｋ） ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＧＨＳ−ＲＩａ． Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １８８：３７−４７ （２００６）．
【非特許文献１０】Ｃｈｏｉ Ｋ， Ｒｏｈ ＳＧ， Ｈｏｎｇ ＹＨ， Ｓｈｒｅｓｔｈａ ＹＢ， Ｈｉｓｈｉｋａｗａ Ｄ， Ｃｈｅｎ Ｃ， Ｋｏｊｉｍａ Ｍ， Ｋａｎｇａｗａ Ｋ， Ｓａｓａｋｉ Ｓ； Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ｒａｔ ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ． １４４：７５４−９ （２００３）．
【非特許文献１１】Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ ＳＡ， Ｂａｈｌｍａｎｎ ＦＨ， Ｂｅｓｌｅｒ Ｃ， Ｍｕｌｌｅｒ Ｍ， Ｓｃｈｕｌｚ Ｓ， Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ Ｎ， Ｄｏｅｒｒｉｅｓ Ｃ， Ｈｏｒｖａｔｈ Ｔ， Ｌｉｍｂｏｕｒｇ Ａ， Ｌｉｍｂｏｕｒｇ Ｆ， Ｆｌｉｓｅｒ Ｄ， Ｈａｌｌｅｒ Ｈ， Ｄｒｅｘｌｅｒ Ｈ， Ｌａｎｄｍｅｓｓｅｒ Ｕ； Ｏｘｉｄａｎｔ ｓｔｒｅｓｓ ｉｍｐａｉｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ： ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ ａｇｏｎｉｓｔ ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１６：１６３−７３ （２００７）．
【非特許文献１２】Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｐａｖａｎ Ｍ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｇａｍｂｉｎｏ Ｒ， Ｇｒａｚｉａ Ｄｅ Ｃｅｓａｒｉｓ Ｍ， Ｇａｒｂａｒｉｎｏ Ｇ， Ｃａｍｕｓｓｉ Ｇ， Ｐａｇａｎｏ Ｇ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ； Ｄｉａｂｅｔｉｃ ＬＤＬ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｖｉａ ＳＴＡＴ５Ｂ ａｎｄ ｐ２１（ｗａｆ）． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １０９：１１１−９ （２００２）．
【非特許文献１３】Ｔｈｕｍ Ｔ， Ｆｒａｃｃａｒｏｌｌｏ Ｄ， Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓｓ Ｍ， Ｆｒｏｅｓｅ Ｓ， Ｇａｌｕｐｐｏ Ｐ， Ｗｉｄｄｅｒ ＪＤ， Ｔｓｉｋａｓ Ｄ， Ｅｒｔｌ Ｇ， Ｂａｕｅｒｓａｃｈｓ Ｊ； Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５６：６６６−７４ （２００７）．
【非特許文献１４】Ｄｉｍｍｅｌｅｒ Ｓ， Ｚｅｉｈｅｒ ＡＭ； Ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｐａｉｒ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ： ｔｈｅ ｍｉｓｓｉｎｇ ｌｉｎｋ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ？ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ８２：６７１−７ （２００４）．
【非特許文献１５】Ｔｅｐｐｅｒ ＯＭ， Ｇａｌｉａｎｏ ＲＤ， Ｃａｐｌａ ＪＭ， Ｋａｌｋａ Ｃ， Ｇａｇｎｅ ＰＪ， Ｊａｃｏｂｏｗｉｔｚ ＧＲ， Ｌｅｖｉｎｅ ＪＰ， Ｇｕｒｔｎｅｒ ＧＣ； Ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｙｐｅ ＩＩ ｄｉａｂｅｔｉｃｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ａｄｈｅｓｉｏｎ， ａｎｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０６：２７８１−６ （２００２）．
【非特許文献１６】Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ Ｔ； Ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｓｃｅｎａｒｉｏｓ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ．１０３：１５８０−５ （２００４）．
【非特許文献１７】Ｈａｔｔｏｒｉ Ｋ， Ｈｅｉｓｓｉｇ Ｂ， Ｔａｓｈｉｒｏ Ｋ， Ｈｏｎｊｏ Ｔ， Ｔａｔｅｎｏ Ｍ， Ｓｈｉｅｈ ＪＨ， Ｈａｃｋｅｔｔ ＮＲ， Ｑｕｉｔｏｒｉａｎｏ ＭＳ， Ｃｒｙｓｔａｌ ＲＧ， Ｒａｆｉｉ Ｓ， Ｍｏｏｒｅ ＭＡ； Ｐｌａｓｍａ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ ９７：３３５４−６０ （２００１）．
【非特許文献１８】Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｔ， Ｋａｌｋａ Ｃ， Ｍａｓｕｄａ Ｈ， Ｃｈｅｎ Ｄ， Ｓｉｌｖｅｒ Ｍ， Ｋｅａｒｎｅｙ Ｍ， Ｍａｇｎｅｒ Ｍ， ｌｓｎｅｒ ＪＭ， Ａｓａｈａｒａ Ｔ； Ｉｓｃｈｅｍｉａ− ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． ５：４３４−８ （１９９９）．
【非特許文献１９】Ｈｉｌｌ ＪＭ， Ｚａｌｏｓ Ｇ， Ｈａｌｃｏｘ ＪＰ， Ｓｃｈｅｎｋｅ ＷＨ， Ｗａｃｌａｗｉｗ ＭＡ， Ｑｕｙｙｕｍｉ ＡＡ， Ｆｉｎｋｅｌ Ｔ； Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ， ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｉｓｋ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３４８：５９３−６００ （２００３）．
【非特許文献２０】Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉ Ｐ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｃａｌｖｉ Ｃ， Ｇａｒｂａｒｉｎｏ Ｇ， Ｔａｒｏｎｅ Ｇ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ｂｒｉｚｚｉ； ＭＦβ１ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ＩＬ−３Ｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ＳＴＡＴ５ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６８：１０９９−１１０８ （２００５）．
【非特許文献２１】Ｚｈａｏ Ｗ， Ｄｉｚ Ｄｌ， Ｒｏｂｂｉｎｓ ＭＥ； Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ． Ｂｒ Ｊ Ｒａｄｉｏｌ． ８０：Ｓ２３−３１ （２００７）．
【非特許文献２２】Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｂａｌｓａｍｏ Ａ， Ｇａｍｂｉｎｏ Ｒ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｆａｌｃｉｏｎｉ Ｒ， Ｃａｓｓａｄｅｒ Ｍ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ｐａｇａｎｏ Ｇ， Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ； ｐ５３ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８１ ：４３３９−４７ （２００６）．
【非特許文献２３】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ， ＴＲ．， Ｂｅｒｎａｒｄｓ， Ｒ， ａｎｄ Ａｇａｍｉ， Ｒ； Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５５３ （２００２）．
【非特許文献２４】Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｂａｌｓａｍｏ Ａ， Ｃｏｌｍｅｎａｒｅｓ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ Ｓ， Ｚｅｏｌｉ Ａ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｍ， Ｃａｍｕｓｓｉ Ｇ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ； Ｃ−ＫＩＴ， ｂｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｌｉｇａｎｄ， ｒｅｃｒｕｉｔｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｉｎｆｌａｍｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ． Ｂｌｏｏｄ． １０９：４２６４−７１ （２００７）．
【非特許文献２５】Ａｒａｎｇｕｒｅｎ ＸＬ， Ｌｕｔｔｕｎ Ａ， Ｃｌａｖｅｌ Ｃら； Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｒｔｅｒｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ． １０９：２６３４−２６４２ （２００７）．
【非特許文献２６】Ｃｏｒｍｉｅｒ Ｓ， Ｖａｎｄｏｒｍａｅｌ−Ｐｏｕｒｎｉｎ Ｓ， Ｂａｂｉｎｅｔ Ｃ， Ｃｏｈｅｎ−Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ Ｍ； Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｇｅｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ． Ｐａｔｔｅｒｎｓ．；４：７１３−７１７ （２００４）．
【非特許文献２７】Ｈｏｆｆ Ｊ； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｌａｂ． Ａｎｉｍａｌ． ２９ （２０００）．
【非特許文献２８】Ｚｅｏｌｉ Ａ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｔｏｇｌｉａｔｔｏ Ｇ， Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ Ａ， Ｄａｍｉａｎｏ Ｌ， Ｆｒａｎｃｉａ ｄｉ Ｃｅｌｌｅ Ｐ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ａｌｔｒｕｄａ Ｆ， Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ； Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ （ＩＬ−３） ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＤ４５＋ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｒｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ ｖｉａ ＳＴＡＴ５ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ 近刊．
【非特許文献２９】Ｙａｍａｇｉｓｈｉ Ｓ， Ｍａｔｓｕｉ Ｔ， Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ； Ｋｉｎｅｔｉｃｓ， ｒｏｌｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ （ｓＲＡＧＥ） ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ． ８：１１３８−４３ （２００７）．
【非特許文献３０】Ｄｉｍｒｉ ＧＰ． Ｗｈａｔ ｈａｓ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｇｏｔ ｔｏ ｄｏ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ？ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ７：５０５−１２ （２００５）．
【非特許文献３１】Ｖａｓａ Ｍ， Ｆｉｃｈｔｌｓｃｈｅｒｅｒ Ｓ， Ａｉｃｈｅｒ Ａ， Ａｄｌｅｒ Ｋ， Ｕｒｂｉｃｈ Ｃ， Ｍａｒｔｉｎ Ｈ， Ｚｅｉｈｅｒ ＡＭ， Ｄｉｍｍｅｌｅｒ Ｓ． Ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ８９：Ｅ１−７ （２００１）．
【非特許文献３２】Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｊ． Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｖｅｓｓｅｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ４９：５５４−６０ （２００１）．
【非特許文献３３】Ａｂａｃｉ Ａ， Ｏｇｕｚｈａｎ Ａ， Ｋａｈｒａｍａｎ Ｓ， Ｅｒｙｏｌ ＮＫ， Ｕｎａｌ Ｓ， Ａｒｉｎｃ Ｈ， Ｅｒｇｉｎ Ａ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｖｅｓｓｅｌｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９：２２３９−４２ （１９９９）．
【非特許文献３４】Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ ＣＧ， Ｓｔｅｈｏｕｗｅｒ ＣＤ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ （Ｌｏｎｄ） １０９：１４３−５９ （２００５）．
【非特許文献３５】Ｋｌｅｉｎｚ ＭＪ， Ｍａｇｕｉｒｅ ＪＪ， Ｓｋｅｐｐｅｒ ＪＮ， Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ＡＰ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｄｅｓ−ｏｃｔａｎｏｙｌ ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｏｍｅ ｉｎ ｍａｎ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６９：２２７−２３５ （２００６）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
心血管疾患発症リスクのある患者もしくは心血管疾患患者において、心血管疾患を予防もしくは治療するため、血管リモデリングおよび新血管形成を改善するための方法を設計する重要な必要性がある。１つの解決策は、ＣＡＣ細胞数を増加させることおよび／もしくはＣＡＣ機能性を改善することであり、それはＣＡＣの骨髄からの動員を改善することによって、ＡＧＥs に誘発されるＲＯＳ産生を減少することによって、ＣＡＣの老化もしくはアポトーシス率を減少することによって、ならびにＣＡＣが動脈もしくは静脈表現型へ分化する（すなわち、インビボ血管形成する）能力を増強することによって成し遂げることができる。
【００１５】
ＡＧは血管機能障害および心保護に対する効果を有し得るという初期の観察から、血管機能障害および心保護に対するＵＡＧのインビトロおよびインビボ効果の検討、ならびにＣＡＣ生物学へのＵＡＧ効果（特に、これまでに実証されていない）の検討に至った。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一態様によると、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を治療有効量で被験体に投与することを含む、被験体の心血管疾患を治療するための方法に関する。
【００１７】
別の一態様によると、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を治療有効量で被験体に投与することを含む、被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための方法に関する。
【００１８】
別の一態様によると、本発明は、配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を治療有効量で被験体に投与することを含む、被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための方法に関する。
【００１９】
別の一態様によると、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の治療有効量を製薬上許容される担体と共に含む、心血管疾患治療における使用のための医薬組成物に関する。
【００２０】
別の一態様によると、本発明は、被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体に関する。
【００２１】
別の一態様によると、本発明は、被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体に関する。
【００２２】
別の一態様によると、本発明は、被験体の創傷治癒を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体に関する。
【００２３】
別の一態様によると、本発明は、移植関連生着を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体に関する。
【００２４】
別の一態様によると、本発明は、組織工学における使用のための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体に関する。
【００２５】
別の一態様によると、本発明は、被験体の心血管疾患治療のための医薬の調製における、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用に関する。
【００２６】
別の一態様によると、本発明は、被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用に関する。
【００２７】
別の一態様によると、本発明は、被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための医薬の調製における、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用に関する。
【００２８】
別の一態様によると、本発明は、被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための、治療有効量の配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用に関する。
【００２９】
別の一態様によると、本発明は、被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための医薬の調製における、治療有効量の配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】ＵＡＧの、糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を例証する。図１Ａでは、Ｓ期にあるＣＡＣの割合（％）をＦＡＣＳ分析により検討した。
【図１Ｂ】ＵＡＧの、糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を例証する。図１Ｂ〜１Ｆでは、ＣＡＣからのＲＯＳ産生を、示される期間にわたり測定した。
【図１Ｃ】ＵＡＧの、糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を例証する。図１Ｂ〜１Ｆでは、ＣＡＣからのＲＯＳ産生を、示される期間にわたり測定した。
【図１Ｄ】ＵＡＧの、糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を例証する。図１Ｂ〜１Ｆでは、ＣＡＣからのＲＯＳ産生を、示される期間にわたり測定した。
【図１Ｅ】ＵＡＧの、糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を例証する。図１Ｂ〜１Ｆでは、ＣＡＣからのＲＯＳ産生を、示される期間にわたり測定した。図１Ｅおよび１Ｆは、ＵＡＧ（６〜１３）、すなわちＵＡＧ断片も糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を有することを例証する。
【図１Ｆ】ＵＡＧの、糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を例証する。図１Ｂ〜１Ｆでは、ＣＡＣからのＲＯＳ産生を、示される期間にわたり測定した。図１Ｅおよび１Ｆは、ＵＡＧ（６〜１３）、すなわちＵＡＧ断片も糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を有することを例証する。
【図２Ａ】ＵＡＧはＣＡＣ老化を予防することを例証する。図２Ａでは、老化の検討を、ＡＧＥ、ＵＡＧおよびＡＧＥ＋ＵＡＧと共に培養したＣＡＣの酸性β−ｇａｌ活性に基づき行なった。
【図２Ｂ】ＵＡＧはＣＡＣ老化を予防することを例証する。図２Ｂでは、ＡＧＥ、ＵＡＧ、およびＡＧＥ＋ＵＡＧと共に培養したＣＡＣを、示した抗体を用いたウエスタンブロッティング法によりアッセイした。
【図２Ｃ】ＵＡＧはＣＡＣ老化を予防することを例証する。図２Ｃでは、ＣＡＣをｐ５３ ｓｉＲＮＡまたはスクランブル配列でトランスフェクトした。
【図２Ｄ】ＵＡＧはＣＡＣ老化を予防することを例証する。図２Ｄでは、生理食塩水またはＵＡＧで処置した年齢および性別を適合した糖尿病患者由来ＣＡＣの酸性β−ｇａｌ活性を検討した。
【図２Ｅ】ＵＡＧはＣＡＣ老化を予防することを例証する。図２Ｅでは、上記のとおり処置した糖尿病患者から採取したＣＡＣを、示した抗体を使用したウエスタンブロッティング法によりアッセイした。
【図３Ａ】ＵＡＧによるＣＡＣの動員誘発および動脈特異化を例証する。図３Ａでは、２型糖尿病患者から採取したＣＡＣの代表的なＦＡＣＳ分析によりＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１４６およびＣＤ１０５の発現を分析した。
【図３Ｂ】ＵＡＧによるＣＡＣの動員誘発および動脈特異化を例証する。図３Ｂでは、生理食塩水またはＵＡＧもしくはＡＧ処置後に健常ドナー（Ｎ）および糖尿病患者（Ｄ）から採取したＣＡＣを計数した。
【図３Ｃ】ＵＡＧによるＣＡＣの動員誘発および動脈特異化を例証する。図３Ｃでは、Ｓ期にある細胞の割合（％）を、ＵＡＧ、ＡＧもしくは生理食塩水で処置した糖尿病患者（Ｄ）または健常被験体（Ｎ）由来のＣＡＣについて検討した。
【図３Ｄ】ＵＡＧによるＣＡＣの動員誘発および動脈特異化を例証する。図３Ｄでは、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲを、２型糖尿病患者または健常ドナー由来でかつ上記のとおり培養したＣＡＣ細胞において実施した。示した動脈および静脈マーカーを検討した。
【図４Ａ】ＵＡＧは、糖尿病マウスにおいてＣＡＣ動員を誘発し、ＵＡＧに曝露したＣＡＣは血管新生細胞として作用することを例証する。図４Ａでは、糖尿病マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤおよびｏｂ／ｏｂ）からまたはｗｔマウスから採取したＣＡＣのＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３３およびＫＤＲ発現を分析した代表的なＦＡＣＳ分析を報告する。
【図４Ｂ】ＵＡＧは、糖尿病マウスにおいてＣＡＣ動員を誘発し、ＵＡＧに曝露したＣＡＣは血管新生細胞として作用することを例証する。図４Ｂでは、ＵＡＧもしくは生理食塩水での処置後にＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ｏｂ／ｏｂおよびｗｔマウスから採取した血液を分析した。
【図４Ｃ】ＵＡＧは、糖尿病マウスにおいてＣＡＣ動員を誘発し、ＵＡＧに曝露したＣＡＣは血管新生細胞として作用することを例証する。図４Ｃでは、ＵＡＧ処置または非処置の異なるマウスモデルから得たＣＡＣについて、Ｓ期にある細胞の割合（％）をＦＡＣＳ分析により検討した。
【図４Ｄ】ＵＡＧは、糖尿病マウスにおいてＣＡＣ動員を誘発し、ＵＡＧに曝露したＣＡＣは血管形成細胞として作用することを例証する。図４Ｄでは、上記のとおり培養した、マウスモデル由来ＣＡＣにおいてＱ−ＲＴ−ＰＣＲを実施した。示した動脈および静脈マーカーを検討した。
【図４Ｅ】ＵＡＧは、糖尿病マウスにおいてＣＡＣ動員を誘発し、ＵＡＧに曝露したＣＡＣは血管新生細胞として作用することを例証する。図４Ｅでは、ＳＣＩＤマウスに移植後に回収したＩＬ−３および標識したＣＡＣを含むマトリゲルプラグの免疫組織化学的分析を示す。パネルａ（左）は生理食塩水処置後に回収したＣＡＣに対応し、パネルｂ（右）はＵＡＧ処置後に対応する。機能的血管を形成するＣＡＣの能力をパネルａに報告する。黒色矢印は陽性ＣＡＣ細胞を示す。
【図４Ｆ】ＵＡＧは、糖尿病マウスにおいてＣＡＣ動員を誘発し、ＵＡＧに曝露したＣＡＣは血管新生細胞として作用することを例証する。図４Ｆでは、回収したマトリゲルプラグは、大多数の血管がその内部をヒトＨＬＡクラスＩ陽性細胞に覆われていることを示す。ヒトまたは宿主由来血管数をヒストグラムにて報告する。
【図５Ａ】ＵＡＧ（ＵＡＧ（１〜２８））およびＵＡＧ（６〜１３）断片はＣＡＣ膜上に結合部位を有することを例証する。
【図５Ｂ】ＵＡＧ（ＵＡＧ（１〜２８））およびＵＡＧ（６〜１３）断片はＣＡＣ膜上に結合部位を有することを例証する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
参照を容易にするため、全体を通して下記の略記および記号を用いる：
ＡＧ グレリンまたはアシル化グレリン
ＵＡＧ 非アシル化グレリンまたはＤｅｓ−アシルグレリン
ＵＡＧ（６〜１３） 配列番号１の残基６〜１３を有する非アシル化グレリン
ＧＨＳＲ 成長ホルモン分泌促進因子受容体
ＣＡＣ 循環血中の血管新生細胞
ＥＰＣ 血管内皮前駆細胞
ＡＧＥ 最終糖化産物
ＢＭ 骨髄
ＶＥＧＦ 血管内皮増殖因子
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞選別
ＲＯＳ 活性酸素種。
【００３２】
血管リモデリング障害は糖尿病環境において記載されている（参考文献３２、３３）。１型または２型糖尿病患者の両方において、ＥＰＣ数は低減し、ＥＰＣの機能的能力は損なわれる（参考文献１５、３２）。有害な代謝ストレス因子が機能活性障害を主に引き起こし、動脈損傷部位へのＣＡＣ補充を低減すると考えられる（参考文献１５、３４）。
【００３３】
血管成長誘発はいくつもの病的状態において魅力的な治療戦略を成す。心血管リスク因子（糖尿病または肥満など）はＥＰＣ利用能を低下させるという所見により、理論上それを最も必要とする患者の細胞療法による治療能が制限される。
【００３４】
本明細書で定義した発明は、ＵＡＧにより処置した細胞のインビボでの血管形成能に示されるように、ＵＡＧは、とりわけ、代謝ストレス因子を予防し、ＣＡＣの数および機能活性を修復できるという証拠を提供する。
【００３５】
本発明は、ＣＡＣに対するＵＡＧ効果という予期せぬ発見に関する。より詳細には、ＵＡＧはＣＡＣを動員し、ＣＡＣを酸化ストレスもしくは糖尿病に関連した酸化ストレスから保護し、ＣＡＣの促進された老化発現を低減し、ＣＡＣ機能活性を修復し、ＣＡＣ数を増加させ、生理状態および糖尿病環境の両方においてＣＡＣ中のＲＯＳ産生を予防し、ＣＡＣと結合するおよび／もしくはＣＡＣの機能障害を救済するという予期せぬ発見に関する。
【００３６】
したがって、本研究は、心血管リスクのある被験体もしくは患者の血管リモデリング障害を改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）または改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）ため、または心血管疾患もしくは虚血性疾患を呈する被験体もしくは患者を治療するため、ＣＡＣ数を増加させてＣＡＣ機能を改善するため、生着を改善するため、移植（例えば、臓器またはその一部の）関連もしくは移植後の生着を改善するため、インビトロまたは生体外組織工学（限定されないが、血管工学など）に用いるためまたは組織工学を促進するため、創傷治癒を改善するため、糖尿病患者（糖尿病性潰瘍を呈する糖尿病患者など）の創傷治癒を改善するためにＵＡＧを新規の治療戦略として使用できるという証拠を提供する。
【００３７】
別段の定めのない限り、本明細書で用いるすべての専門用語および科学用語は本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味である。
【００３８】
非アシル化グレリン、その断片およびその類似体
本発明の目的のため、次の用語を以下に定義する。本出願において、「グレリン」および「アシル化グレリン」または「ＡＧ」という用語は同義的に用い、同じ意味を有する。
【００３９】
用語「非アシル化グレリン」または「ＵＡＧ」とは、配列番号１（１−ＮＨ２Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−２８；配列番号１）に指定のアミノ酸配列を有するペプチドを意味することを意図している。ＵＡＧは、ＵＡＧ（１〜２８）とも呼び得る。
【００４０】
非アシル化グレリンの天然の変異体としては、コードするグレリン遺伝子もしくはその対立遺伝子のヌクレオチド配列の不連続的変化のため、または転写ＲＮＡの代替的スプライシングにより生じた１つもしくは複数のアミノ酸の置換、追加または欠失を含むペプチドが挙げられる。この変化は非アシル化グレリン変異型の特性、薬理的および生物学的性質に実質的に影響を及ぼさないことが理解される。それらのペプチドは塩の形態であり得る。特にその分子の酸性機能は、その塩誘導体（限定されないが、トリフルオロアセタート塩など）によって置換され得る。
【００４１】
「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、または化学的修飾、または非天然もしくは異常アミノ酸（Ｄ−Ｔｙｒ、オルニチン、アミノ−アジピン酸など）を含むかを問わない任意のアミノ酸鎖を意味する。これらの用語は、本出願で同義的に用いる。
【００４２】
「断片」または「その断片」という用語は、ペプチド（非アシル化グレリンなど）のアミノ酸断片を指す。非アシル化グレリン断片は２８個のアミノ酸残基より短い。したがって、非アシル化グレリン断片は、長さ２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個または４個のアミノ酸残基であり得る。例えば、ＵＡＧ断片は、
配列番号２として示される配列番号１の残基１〜１４（（ＵＡＧ１〜１４）；Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ）；
配列番号３として示される配列番号１の残基１〜１８（（ＵＡＧ１〜１８）；Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ）；
配列番号４として示される配列番号１の残基１〜５（（ＵＡＧ１〜５）；Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）；
配列番号５として示される配列番号１の残基１７〜２８（（ＵＡＧ１７〜２８）；Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）；
配列番号６として示される配列番号１の残基６〜１３（（ＵＡＧ６〜１３）；Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ）；
配列番号７として示される配列番号１の残基８〜１３（（ＵＡＧ８〜１３）；Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ）または
配列番号８として示される配列番号１の残基８〜１２（（ＵＡＧ８〜１２）；Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ）またはその類似体
を有し得る。
【００４３】
ＵＡＧの生物学的活性を保持する他の任意のＵＡＧ断片が本発明に包含される。いくつかのＵＡＧ断片は、米国特許出願シリアル番号第２００８０３１２１３３号および国際公開特許第２００８／１４５７４９号に報告されている。
【００４４】
本発明のいくつかの態様では、ポリペプチドは、「精製された」、「単離された」または「実質的に純粋」形態で用いられる。ポリペプチドが「精製された」、「単離された」または「実質的に純粋」であるのは、天然で伴う成分から分離された場合である。典型的には、化合物は、試料中総物質の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量％）の場合に実質的に純粋である。
【００４５】
「非アシル化グレリンの類似体」、「非アシル化グレリン断片の類似体」または「その類似体」という用語は、非アシル化グレリンもしくはその断片の構造類似体および機能的類似体の両方を指し、とりわけ、本出願に記載のＵＡＧの生体機能において（限定されないが、心血管疾患の予防および治療において、本出願に記載のＣＡＣ細胞を酸化ストレスからもしくは糖尿病に関連した酸化ストレスから保護することにおいて、血管リモデリングおよび新血管形成を促進することにおいて、ＣＡＣ数を増加させるにおいて、ＣＡＣ機能を改善することにおいて、ＣＡＣを酸化ストレスから保護し、ＣＡＣ中のＲＯＳ産生を予防することにおいて、生理状態および糖尿病環境の両方にてＣＡＣの促進された老化発現の阻害に関連した酸化ストレスから保護することにおいて、ＣＡＣ膜へ結合することにおいて、ならびにＣＡＣ動員の亢進および／もしくはＣＡＣ機能障害の救済においてなど）ＵＡＧと置き換えることができるものである。したがってかかる構造および機能的類似体は本出願に記載の疾患における治療利益を実現するために有用となる。
【００４６】
単純な構造類似体は、配列番号１に示される非アシル化グレリンとの相同性または任意のその断片との相同性を示すペプチドを含む。グレリン類似体の一例は、グレリン−２８（配列番号１）のアイソフォーム、すなわちｄｅｓ Ｇｌｎ−１４グレリン（ｎ−オクタン酸によって修飾されたセリン３を保有する２７アミノ酸のペプチド）であり胃に存在することが示された。それは、類似した結合親和性でＧＨＳＲ−１ａに結合する点でグレリンと機能的に同一であり、クローン化細胞内のＣａ２＋流動性を引き出し、グレリン−２８と類似した効力でＧＨ分泌を誘発する。ＵＡＧは機能的にＵＡＧと同じであるｄｅｓ Ｇｌｎ−１４ ＵＡＧも有することが予期される。
【００４７】
ＵＡＧの好ましい類似体およびＵＡＧ断片の好ましい類似体は、保存的アミノ酸置換（すなわち、別の類似の性質を有する一残基との置換）により天然ＵＡＧ配列と、もしくは天然ＵＡＧ断片配列と異なるものである。典型的な置換としては、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕとＩｌｅ間の置換；ＳｅｒとＴｈｒ間；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕ間；ＡｓｎとＧｌｎ間；塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ間；ならびに芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒ間の置換が挙げられる。いくつもの類似体のうち特に好ましいものは、例えば、５〜１０個、１〜５個、または１〜２個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは任意の組み合わせで追加されているものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＵＡＧ類似体は、ＵＡＧ配列が１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、欠失、もしくは追加、またはそれらの組み合わせにより異なり得る。
【００４８】
本明細書では、本明細書に記載のアミノ酸配列とその配列全長にわたり少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同の配列を有し、ＵＡＧの少なくとも１つの代謝効果もしくは生物学的活性を共有する本発明のペプチド類似体を提供する。当業者は非アシル化グレリンの類似体配列または非アシル化グレリン断片の類似体配列を容易に同定するであろう。
【００４９】
ＵＡＧ類似体もしくはその断片の類似体は、例えば、Ｄ−アミノ酸もしくは合成アミノ酸との置換により、またはペプチド環化によりアラニン走査から得られる類似体である。ＵＡＧもしくはその断片の類似体は、非天然コードアミノ酸を含み得、非天然コードアミノ酸とは、一般的なアミノ酸の１つまたはピロリジンもしくはセレノシステインではないアミノ酸、または天然コードアミノ酸（限定されないが、２０個の一般的なアミノ酸、またはピロリジンおよびセレノシステインなど）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって産生されるが、複合体の翻訳による成長ポリペプチド鎖に組み込まれていないアミノ酸を指す。かかる非天然アミノ酸の例としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニンおよびＯ−ホスホチロシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書で用いる「修飾」という用語は、付与されたポリペプチドに対して行なわれる任意の変化（ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造、ポリペプチドの翻訳時修飾、または翻訳後修飾など）を指す。
【００５１】
「翻訳後修飾」という用語は、ポリペプチド鎖に組み込まれた後のアミノ酸に起こる天然または非天然アミノ酸の任意の修飾を指す。この用語は、例としてのみ挙げると、インビボ翻訳時修飾、インビトロ翻訳時修飾（無細胞翻訳系など）、インビボ翻訳後修飾、およびインビトロ翻訳後修飾を含む。翻訳後修飾例としては、本発明のペプチドの特定のＣ末端エステルおよびＮ−アシル誘導体のグリコシル化、アセチル化、アシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、また塩、アミド類もしくはエステルの追加が挙げられるが、これらに限定されない。翻訳後修飾の種類は周知である。
【００５２】
本発明による特定のペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端が直接、またはリンカー部分の挿入を通じてヘッドツーテイル（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）結合した環状型でもあり得、かかる部分自体が、通常１つまたは複数のアミノ酸残基を必要に応じて含み、非環状型に関してペプチドの三次元構造の改変を避ける形で骨格に接合する。かかるペプチド誘導体は、非環状ペプチドに関連して改善された安定性およびバイオアベイラビリティを有し得る。
【００５３】
ペプチドを環化するための方法は当該分野において周知であり、例えば、２側鎖の官能基間のジスルフィド結合形成、１本側鎖の官能基と骨格α−アミノ官能基もしくはカルボキシル官能基間のアミドもしくはエステル結合形成、２本側鎖の官能基間のアミドもしくはエステル結合形成、または骨格α−アミノ官能基とカルボキシル官能基間のアミド結合形成によって達成することができる。これらの環化反応は溶液中で高希釈にて慣習的に行なわれている。環化は一般的にペプチドが樹脂に結合する間に成される。最も一般的な固体支持体上における環状ペプチド合成方法の１つは、アミノ酸側鎖を樹脂に付着することである。好適な保護的戦略を用いて、鎖会合後の樹脂上にＣ末端およびＮ末端を選択的に脱保護および環化できる。この戦略は広く用いられており、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）または９−フルオレンイルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）プロトコールに適合する。しかしながら、この戦略は、固体支持体に機能的に付着するためには、好適な側鎖を含むペプチドに限定される。有効な環状ペプチド合成を成し遂げるために、多数のアプローチを用い得る。１つの環状ペプチド合成手順は、樹脂からの同時切断による環化に基づく。好適なペプチド配列が樹脂上の固体相合成により会合後、または直線状配列が樹脂に付着した後、無保護アミノ基はその固着活性結合と反応して保護環状ペプチドを産生できる。一般的に、標的環状ペプチドを得るために最終的な脱保護工程が必要とされる。
【００５４】
ラクタム化は、環化の一形態であり、Ｆｍｏｃ合成を用いてラクタム架橋を形成するために行うことができ、側鎖に異なる保護基を有するアミノ酸（限定されないが、βエステル位でアリルエステルに保護されたアスパラギン酸（またはグルタミン）（またはγエステル位で保護されたグルタミン酸）およびＮ−εでアリルオキシカルバミン酸に保護されたリジン）を導入し得る。合成終了時、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、またはその他のＡｌｌｏｃと異なる保護基で保護されたペプチドＮ末端と、アスパラギン酸およびリジンのａｌｌｙｌ保護基およびａｌｌｏｃ保護基は、例えば、パラジウム（０価）により脱保護され得、その後ＰｙＡＯＰ（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスファート）を用いて環化され、ラクタム架橋を産生することができる。
【００５５】
別に示さない限り、本明細書でのアミノ酸はＬ型を指す。アミノ酸を説明するために、当該分野において十分認知されている略記を用い、それには、左旋性アミノ酸（Ｌ−アミノ酸またはＬまたはＬ型）および右旋性アミノ酸（Ｄ−アミノ酸またはＤまたはＤ型）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、ならびにバリン（ＶａｌまたはＶ）などが含まれる。天然ペプチド配列中のＬ−アミノ酸残基は、一般的にタンパク質に認められる２０個のＬ−アミノ酸の任意の１個または稀なアミノ酸であるＤ−アミノ酸に対応する任意の１個（限定されないが、４−ヒドロキシプロリンまたはヒドロキシリジンなど）、または非タンパク質アミノ酸（Ｐ−アラニンまたはホモセリンなど）に改変され得る。
【００５６】
ＵＡＧペプチドは、融合タンパク質の一部でもあり得る。分泌もしくはリーダー配列、プロ配列、精製に役立つ配列（複数のヒスチジン残基など）、または組換え産生中の安定性のための追加配列を含む追加アミノ酸配列を含有することがしばしば有利である。
【００５７】
ＵＡＧの生物学的活性を保持する他の任意のＵＡＧの類似体もしくはその断片、またはその他の任意の修飾されたＵＡＧもしくはその断片が、本発明に包含される。
【００５８】
ＵＡＧの機能類似体、および構造類似体またはその断片を得るための一般的な方法および合成戦略が一般的に用いられており、当該分野において周知であり、次の刊行物などに記載されている：“Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ” 編， Ｍ．Ｗ．Ｐｅｎｎｉｇｔｏｎ＆Ｂ．Ｍ．Ｄｕｎｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ３５． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ＮＪ．，１９９４； “Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” ｂｙ Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｗ．ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， １９６９ ａｎｄ Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ； ａｎｄ “Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ” Ｖｏｌ．２， ｐ．２５５ ｅｔ ｓｅｑ． （（編）Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｈｉｌｌ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７６．。
【００５９】
本明細書で用いる「相同性」という用語は、同等の生物学的活性を保持する２個のペプチド間の配列類似性を指す。相同性は、整列させた配列の各位置を比較することによって決定できる。アミノ酸配列間の相同性の程度は、配列の共通位置で同一もしくは適合するアミノ酸数の関数であり、したがって「相同配列」は相同性および同等の機能もしくは生物学的活性を共有する配列を指す。相同％の評価は当業者にとって既知である。
【００６０】
ペプチドの相同性、同一性および類似性を決定するための方法は公衆に利用可能なコンピュータプログラムによりコーディングされている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するのに好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩおよびその他のサイトから公衆に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために用い得る。
【００６１】
ポリペプチド配列比較のために好ましいパラメーターとしては、下記：
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ： Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８： ４４３−４５３ （１９７０）；
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＳＵＭ６２ ｆｒｏｍ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８９：１０９１５−１０９１９ （１９９２）； Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ： １２； Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ： ４
が挙げられる。
【００６２】
これらのパラメーターを用いる有用なプログラムはＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）から「ギャップ」プログラムとして公衆に利用可能である。上記パラメーターはアミノ酸配列比較のためのデフォルトパラメーターである（エンドギャップに対するペナルティなし）。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、当該分野において既知である任意の適切な方法によって調製し得る。かかるポリペプチドとしては、単離された天然ポリペプチド、組換え産生ポリペプチド、合成ポリペプチド、またはこれらの方法を併用して産生したポリペプチドが挙げられる。かかるポリペプチドを調製するための手段および方法は当該分野において周知である。
【００６４】
本発明の特定の態様ではＵＡＧポリヌクレオチドを用いる。ＵＡＧポリヌクレオチドとしては、本出願で定義したＵＡＧポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、断片および類似体が挙げられる。
【００６５】
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、複数のデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオシドサブユニットから成る１分子を指す。ヌクレオシドサブユニット間の結合は、ホスフェート、ホスホネート、ホスホアミデート、ホスホロチオエートなどによって、または当該分野において既知である非リン酸基（ペプチド核酸（ＰＮＡ）中で利用されるペプトイド型の結合など）によって得られる。結合基はキラルまたはアキラルであり得る。オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの長さは２個のヌクレオシドサブユニット〜数百もしくは数千個のヌクレオシドサブユニットの範囲であり得る。オリゴヌクレオチドは好ましくは長さ５〜１００個のサブユニット、より好ましくは、長さ５〜６０個のサブユニットであるが、ポリヌクレオチドはさらに長くなり得る（例えば、最大１００個）。ポリヌクレオチドは、任意のＤＮＡおよびＲＮＡであり得る。ＤＮＡは細胞もしくは組織由来のゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ、ｃＤＮＡであり得、ならびに合成ＤＮＡの任意の形態であり得る。さらに、本発明は、特定の態様においてベクター（バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、またはファージミドなど）を用い得る。
【００６６】
「生物学的活性」もしくは「生物学的特性」という語句、または「活性」という用語は、本発明のポリペプチドに関して言及する場合、本明細書中で同義的に用いられ、本発明のポリペプチドの薬理的、生物学的または細胞性能を指し、ＵＡＧの生体機能において（限定されないが、心血管疾患の予防および／もしくは治療において、ＣＡＣ細胞の酸化ストレスからもしくは糖尿病関連酸化ストレスからの保護において、血管リモデリングおよび新血管形成の促進において、ＣＡＣ数の増加において、ＣＡＣ機能の改善において、ＣＡＣの酸化ストレスからの保護において、生理状態および糖尿病環境の両方でのＣＡＣ内ＲＯＳ産生の予防において、ＣＡＣの促進された老化発現の阻害に関連した酸化ストレスからの保護、ＣＡＣ膜への結合において、ならびにＣＡＣ動員の亢進および／もしくはＣＡＣ機能障害の救済において）ＵＡＧと置き換える能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
治療的使用および治療
一態様では、本発明は、心血管疾患もしくは虚血性疾患発症リスクのある患者または発症患者などの被験体を治療するための方法を提供する。本発明は、被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための方法も提供する。さらなる一態様では、本発明は、被験体のＣＡＣ数を増加させるおよびＣＡＣ機能を改善するための方法を提供する。本発明は、生着を改善する、より詳細には移植（例えば、組織または臓器または任意のその一部の）関連もしくは移植後の生着を改善するための方法も提供する。本発明は、創傷治癒を改善し、生着を改善するおよび／または組織工学を促進するための方法も提供する。
【００６８】
本明細書で用いる「治療」という用語は、治療上の処置、ならびに予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）および予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。治療を必要とするものには、疾患もしくは障害もしくは病態に既に罹患しているもの、ならびに疾患、障害もしくは病態が予防されるべきものが含まれる。治療を必要とするものは、疾患、障害もしくは病態を発症し、後遺症もしくは瘢痕が残ったものでもある。治療は、疾患、障害もしくは病態に関連した症状を改善（ｉｍｐｒｏｖｅ）もしくは改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）して疾患、障害もしくは病態の重症度を軽減するもしくは治癒する上で、または疾患、障害もしくは病態が起こるのを予防する上で有効な治療物質を投与することも指す。
【００６９】
一態様では、本発明の方法は、ＵＡＧ自体と同じ潜在的治療適応を共有する本明細書で定義したポリペプチドを治療有効量で被験体に投与する工程を含む。かかるポリペプチドは、上記のとおり、配列番号１に示されるアミノ酸配列、またはその任意の断片もしくはその任意の類似体（限定されないが、ＵＡＧ（６〜１３）、ＵＡＧ（８〜１２）およびＵＡＧ（８〜１３）断片など）を含む。
【００７０】
本発明のポリペプチドを投与されて恩恵を受ける被験体としては、心血管疾患もしくは虚血性疾患発症リスクのある被験体、または発症している被験体、または既往のある被験体が挙げられるが、これらに限定されない。かかる被験体は、例えば、１型もしくは２型糖尿病を呈する被験体および／または肥満を呈する被験体であり得る。
【００７１】
本明細書で用いる「心血管疾患」という用語は、心臓または血管（動静脈）に関与する疾患を指す。この用語は、心血管系に影響する任意の疾患を指す。この用語はアテローム性動脈硬化症（動脈疾患）に関連する疾患も指す。心血管疾患としては、動脈瘤、狭心症、不整脈、心筋症、脳血管発作（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心血管疾患、うっ血性心不全、心筋炎、弁膜障害、冠動脈疾患、拡張型心筋症、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（つまり高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ））、肥大型心筋症、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、静脈血栓塞栓症、虚血および創傷治癒が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
さらに、血管合併症、心血管疾患（代謝症候群もしくはＸ症候群に関連）または肥満、アテローム性動脈硬化症、原発性アテローム硬化性血管変性症（中心および末梢動脈症など）を呈する任意の被験体もしくは発症リスクのある被験体、または血管リモデリングを必要とするもしくは新血管形成を必要とする任意の被験体が本発明のポリペプチドを投与されて恩恵を受けるであろう。本明細書で用いる場合、Ｘ症候群という表現は、心血管疾患発症リスクを含む疾患の併発を指す。
【００７３】
「酸化ストレス」という用語は、活性酸素産生と、生体系の活性中間体を速やかに解毒する能力もしくは生じた損傷を容易に修理する能力の間の不均衡を指す。
【００７４】
ＣＡＣ数増加および／もしくはＣＡＣ機能改善の恩恵を受けるであろう任意の被験体もしくは患者が本発明のポリペプチド投与の恩恵を受ける。
【００７５】
ＣＡＣ数とは、骨髄から血管リモデリング部位および／もしくは新生血管形成部位へ回帰するＣＡＣの量もしくは濃度を指す。
【００７６】
ＣＡＣ機能とは、ＣＡＣが内皮化部位に動員し（ＣＡＣ動員）、内皮細胞に分化し、内皮化に関与する特性を指す。ＣＡＣ機能改善とは、ＣＡＣ機能をより望ましい状態にすることを指し、例えば、ＣＡＣ動員を改善するとは、ＣＡＣ動員をより望ましい状態にすることを指す。
【００７７】
血管リモデリングもしくは血管修復を必要とするおよび／または新生血管形成を必要とする任意の被験体も本発明のポリペプチドを投与されて恩恵を受けるであろう。
【００７８】
「血管リモデリング」もしくは「血管修復」という用語は、成熟血管の直径、厚さ、もしくは構造における任意の持続的変化を指す。「血管リモデリング」という用語は、側副血管形成も含む。例えば、アテローム性動脈硬化症において、血管リモデリングは代償機序として作用し、動脈の狭窄（ｓｔｅｎｏｓｉｓ）または狭窄（ｎａｒｒｏｗｉｎｇ）を惹起する傾向にあるプラーク成長に対峙して血流を保持する。
【００７９】
「新血管形成」という用語は、赤血球細胞の血流を伴う機能性微小血管網の形成を指す。
【００８０】
血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成の改善とは、血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成をより望ましい状態にすることを指す。
【００８１】
本発明のポリペプチドは、移植（例えば、細胞、組織および／もしくは臓器またはその一部の）レシピエント（動物もしくはヒトなど）における生着を促進するために有用でもある。本明細書で用いる「生着」という用語は、宿主体内に移植した組織の取り込みを指す。本明細書で用いる「生着」という用語は、移植した幹細胞もしくは骨髄細胞が骨髄へ移動し、血液細胞の産生を開始するプロセスも指す。
【００８２】
本明細書に記載のポリペプチドは、再生医療もしくは組織工学において完全臓器もしくはその一部（例えば、心臓、血管、骨髄など）の組織機能を修復、維持、もしくは改善する生体置換を展開させるためにも有用である。「組織工学」という表現は、十分に機能する単位として移植できる、または成長して移植後に必要な機能を実施し得る天然もしくは合成臓器および組織の産生も指す。再生医療または組織工学の方法は当業者に既知である。
【００８３】
本明細書で定義したポリペプチドは創傷治癒を改善するためにも有用である。特定だが非制限的な例として、本明細書で定義したポリペプチドは、糖尿病患者の創傷治癒の改善（糖尿病性潰瘍治癒の改善など）にも有用である。
【００８４】
「代謝障害」という用語は、炭水化物代謝障害、アミノ酸代謝障害、有機酸代謝障害(有機酸尿)、脂肪酸酸化およびミトコンドリア代謝障害、ポルフィリン代謝障害、プリンもしくはピリミジン代謝障害、ステロイド代謝障害、ミトコンドリア機能障害、ペルオキシソーム機能障害、ならびにリソソーム保存障害を指すが、これらに限定されない。
【００８５】
「代謝症候群」という用語は、心血管疾患および糖尿病リスクを増加させる疾患の合併を指す。
【００８６】
本発明のさらなる一態様は、本明細書で定義したポリペプチドを少なくとも１つ包含する任意の医薬組成物を提供することである。
【００８７】
治療的および／もしくは製薬学的使用のため、本明細書で定義したポリペプチドは、従来の方法により、静脈内、皮下、経皮的、局所的、経口、口腔、舌下、経鼻的、吸入、経肺的、もしくは非経口投与用に製剤化し得るが、これらに限定されない。静脈内注射は、従来の期間にわたるボーラスまたは注入であり得る。本明細書で定義したポリペプチドは、被験体の標的部位に（例えば、内部もしくは外部標的部位へのバイオリスティック送達によって、または動脈内部位へのカテーテルによって）直接投与もし得る。
【００８８】
活性成分（本明細書で定義したポリペプチドなど）は、懸濁液として経口投与するために医薬品製剤分野において周知である技術により調製でき、微結晶セルロース（大量付与のため）、アルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウム（懸濁化剤として）、メチルセルロース（増粘剤として）、および甘味料／香料剤を含み得るが、これらに限定されない。即時放出錠剤として、これらの組成物は、微結晶セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよびラクトースおよび／もしくは他の賦形剤、結合剤、増量剤、錠剤分解物質、希釈剤および滑沢剤を含み得るが、これらに限定されない。活性成分は、制御放出送達系により投与し得る。
【００８９】
経鼻的に投与されるエアゾールもしくは吸入製剤は、例えば、生理食塩水溶液として、ベンジルアルコールもしくはその他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを増強する吸収プロモーターを用いて、過フッ化炭化水素を用いて、および／またはその他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて調製し得る。
【００９０】
本発明のポリペプチドは、静脈内（ボーラスおよび注入の双方）、腹腔内、皮下、局所的（閉塞ありまたはなしで）、または筋肉注射形態で投与し得る。注射投与時、注射溶液もしくは懸濁液は、当該分野において周知である適切な非毒性、許容可能な非経口希釈剤もしくは溶媒を用いて製剤化し得る。
【００９１】
本発明のポリペプチドは、局所投与用に製剤し得る。本明細書で用いる「局所的」という用語は、その化合物が皮膚または粘膜組織を覆うようにする任意の投与経路である。本明細書で定義したポリペプチドの局所投与は、例えば、被験体の創傷治癒を改善するため、または創傷治療を改善するため、またはその場（ｉｎ ｓｉｔｕ）での治療のために有用である。
【００９２】
局所塗布に適した製剤は、例えば、クリーム、ローション、溶液、ゲル、軟膏、泥膏、硬膏、ペイント、生体付着剤などの形態であり得、および／またはリポソーム、ミセル、微粒子および／またはミクロスフェアを含むように調製し得る。この製剤は、水性（すなわち、含水）でも非水性でもよく、体表面に塗布時および塗布後に体表面から蒸発する水分が製剤中に維持されるよう、任意に閉塞性オーバーレイと組み合わせて用い得る。
【００９３】
軟膏は、医薬品製剤分野において周知であるとおり、典型的にはワセリンまたは他のワセリン誘導体に基づく半固体調製物である。用いられる特定の軟膏基剤は、当業者が理解するであろうとおり、本明細書で定義したポリペプチドの最適な送達を提供し、および、好ましくは、他の所望の性質（例えば、皮膚柔軟化など）も同様に提供するものである。当該分野においてやはり周知であるクリームは、粘稠液または半固体エマルション（水中油型または油中水型のいずれか）である。クリーム基剤は水洗可能であり、油相、乳化剤、および水相を含む。医薬品製剤分野の従事者に理解されるであろうとおり、ゲルは半固体、懸濁液類系である。単相ゲルは、担体液体（典型的には水性だが、好ましくは、アルコールも含み、任意に、油も含む）全体に実質的に均一に分布した有機高分子を含む。ローションは、化粧剤の送達に好ましく、調製物を摩擦なく皮膚表面へ適用し、典型的には液体もしくは固体粒子（活性薬剤を含む）中の半液体調製物であり、水もしくはアルコール基剤に存在する。ローションは通常、固体の懸濁液である。泥膏は活性薬剤が適切な基剤中に懸濁された半固体用量形態である。基剤の性質に応じて、泥膏は脂肪泥膏または単相水性ゲル製に分類される。硬膏はペースト状混合物を含み、直接または基材材料（布など）に飽和した後に体上に広げられる。本発明の製剤は、硬膏中に溶解または分散して薬用硬膏を形成し得る。生体付着剤は体組織表面に付着する調製物である。ポリマー生体付着製剤は当該分野において周知である。
【００９４】
製剤は、リポソーム、ミセル、微粒子および／またはミクロスフェアと共に調製してもよい。リポソームは脂質二重層を含む脂質壁を有する微小胞であり、薬物送達系として使用できる。ミセルは、それらの極性頭基が外部球殻を形成して、疎水性炭化水素鎖が球の中心に向かって配向して核を形成するように調整された界面活性剤分子を含むことが当該分野において既知である。微粒子はミクロ径の範囲の粒子担体系であり、普通、ポリマーで調製され、通常、粒子中に捕捉されている薬物もしくはワクチンの送達系として使用できる。ミクロスフェアも同様に、本明細書の製剤および薬物送達系に包含し得る。リポソームおよびミセルと同様、ミクロスフェアは本質的に薬物、または製剤含有薬物を封入する。ミクロスフェアは通常、合成または天然生体適合ポリマーから形成されるがこれは必須ではなく、荷電脂質（リン脂質など）も含み得る。
【００９５】
局所投与用に適した製剤の調製は、当該分野において周知であり、関連文章および文献に記載されている。
【００９６】
一般的に、医薬組成物は、当業者に周知であろう製薬上許容される担体と共に本発明のポリペプチドを少なくとも１つ含む。この組成物はさらに、例えば、１つまたは複数の適切な賦形剤、希釈剤、充填剤、可溶化剤、防腐剤、塩、緩衝剤および当該分野において周知であるその他の材料を利用する投与形態に応じて含み得る。配合方法は当該分野において周知である。
【００９７】
本明細書の文脈において、「製薬上許容される担体」という用語は、いずれの治療効果および／または予防効果も、それ自体が実質的に有さず、かつ非毒性であるという意味で不活性である任意の材料を示すことを意図している。製薬上許容される担体は、許容可能な技術的性質を備える医薬組成物を得ることを可能にするために本発明のポリペプチドに添加し得る。
【００９８】
かかる担体の例としては、イオン交換、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（ホスフェートなど）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、または電解質（硫酸プロタミンなど）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベース物質、およびＰＥＧが挙げられる。
【００９９】
局所的もしくはゲルベースの形態のポリペプチドのための担体としては、多糖類（ナトリウムカルボキシメチルセルロースまたはメチルセルロースなど）、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ＰＥＧ、およびウッドワックスアルコールが挙げられる。
【０１００】
インビボ投与用に用いられるポリペプチドは無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再調製の前または後の、無菌ろ過膜を通したろ過によって達成することができる。ポリペプチドは、普通は凍結乾燥形態または溶液中で保存される。治療のためのポリペプチド組成物は通常は無菌アクセスポートを備える容器（例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを備える静注用溶液袋または薬瓶）内に収容される。
【０１０１】
本明細書で定義する方法における使用のため、本発明は、以下を含む製品または市販パッケージまたはキットも提供する：容器、容器上のラベル、および容器内の、指定濃度で使用時に本発明のポリペプチドを活性薬剤として含む組成物であり、とりわけ、心血管疾患治療、ならびに／または血管リモデリングもしくは新血管形成の改善、ならびに／またはＣＡＣ数の増加およびＣＡＣ機能の改善、ならびに／または創傷治癒を改善するため、ならびに／または生着および／もしくは組織工学に用いるためもしくは組織工学を促進するために有効な組成物。容器上のラベルは、組成物を使用可能な対象を示す。
【０１０２】
「治療有効量」とは、投与量で必要な期間、所望の治療成果を得るのに有効な量を指す。本明細書に記載のペプチドの治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体内で所望の反応を引き起こす化合物の能力などの因子に応じて変わり得る。投与方法は、最適な治療反応を得るように調整し得る。また治療有効量では、化合物中の任意の毒性または有害作用より治療有益効果が上回る。「予防有効量」とは、投与量で必要な期間、所望の予防成果（インスリン値および／もしくはインスリン活性に関連する病態発症の予防もしくは阻害など）を成し遂げるための有効量を指す。予防有効量は、上で治療有効量のために説明したように決定できる。いかなる特定の被験体に対しても、特定の投与方法は、個体の必要性および組成物の投与者もしくは投与監督者の専門的な判断によって経時的に調整し得る。
【０１０３】
例えば、本発明のペプチド（本明細書で「活性化合物」とも呼ぶ）の治療有効量または有効量は、心血管リスクのある被験体もしくは患者の血管リモデリング障害を改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）もしくは改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）ため、または心血管疾患もしくは虚血性疾患を有する被験体もしくは患者を治療するため、生着を改善するため、臓器もしくはその一部の移植関連もしくは移植後の生着を改善するため、インビトロまたは生体外組織工学（限定されないが、血管工学など）に用いるためまたは組織工学を改善もしくは促進するため、創傷治癒を改善するため、糖尿病患者（糖尿病性潰瘍を呈する糖尿病患者など）の創傷治癒を改善するために十分な量である。かかるパラメーターを測定するための方法および／またはアッセイは当業者に既知である。
【０１０４】
本発明の治療有効量は通常、約０．００１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で変化し、より詳細には約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、およびさらにより詳細には約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲で変化する。この範囲外であるが所望の治療効果を有する治療有効量または有効量も本発明に包含される。
【０１０５】
一態様では、上記の被験体は哺乳動物であり、さらなる一態様では、ヒトである。
【実施例】
【０１０６】
実験およびデータ分析
下記に提示する実験およびデータ分析において、心血管リスクまたは疾患状況の再現を、糖尿病環境においていくつかの実験を実施することによって行なった。得られたデータから、ＣＡＣ生体機能障害に関連することが確定されている、または確定され得る他の生理状態または環境を推定し得ることを当業者は理解するであろう。
【０１０７】
ＣＡＣ細胞動員および代謝に対するＵＡＧの効果
Ｉ． ＵＡＧはＣＡＣを酸化ストレスから保護する
酸化ストレスは、糖尿病に関連した組織損傷（参考文献２１）および内皮損傷において主要な役割を担い、主に活性酸素種（ＲＯＳ）産生に依存する。ＵＡＧまたはＡＧが内皮細胞をアポトーシスから保護するという知見（参考文献８）から、ＣＡＣ生物学に対する両グレリンアイソフォームの効果の検討に至った。
【０１０８】
初めに、ＵＡＧおよびＡＧに応答する細胞周期進行を検討した。図１Ａに示すとおり、ＵＡＧ（ただしＡＧではない）はＳ期にある細胞の割合（％）を有意に増加させることができ、この効果は培養７日後でも依然として明白であった。この効果がベースラインＲＯＳ産生阻害に依存するか否かを調査するため、ＤＣＦ−ＤＡアッセイを実施した。結果（図１Ｂに報告）は、ＵＡＧ処理は未処理細胞と比較してＲＯＳ産生ベースライン値を著しく低減することを明らかにする。保護効果は、ＡＧ使用時には検出できなかった（図１Ｂ）。図１ＥはＵＡＧ断片、すなわちＵＡＧ（６〜１３）も未処理細胞と比較してＲＯＳ産生ベースラインレベルを低減することを明らかにする。Ｈ２Ｏ２を陽性対照として用いた。ＡＧＥ媒介性損傷シグナルは主にＲＯＳ産生に依存する（参考文献２９）。図１Ｃおよび１Ｆに表されるとおり、ＡＧＥ培養細胞中ＲＯＳ産生のレベルは、細胞をＵＡＧまたはＵＡＧ（６〜１３）断片でチャレンジした場合に低減した。上記の結果と一致し、ＡＧの効果は何も検出することができなかった。さらにこれらのデータを確認するため、ＣＡＣを２型糖尿病患者から単離し、ＵＡＧまたはＡＧの処理に供した。図１Ｄに報告するデータは、ＵＡＧ（ただしＡＧではない）は採取した糖尿病性細胞において細胞内ＲＯＳ産生を低減したことを明らかにする。
【０１０９】
ＩＩ． ＵＡＧはＣＡＣ老化を予防する
ＤＮＡ損傷だけでなく、ストレスに惹起されるシグナルも老化様成長停止を誘発する（参考文献３０）。ｐ５３、ｐ２１、およびｐＲｂは老化の主要な調節因子であり、一般的にＲＯＳ産生が上流シグナルとみなされる。促進された老化発現は糖尿病患者由来のＥＰＣ中に検出され得ることが既に示されている（参考文献２２）。上記のデータにより、ＲＯＳ産生が促進された老化発現に変わるか否か、およびＵＡＧがこの作用を救済できるか否かに関する検討に至った。
【０１１０】
この目的のため、ＡＧＥ処理（単独またはＵＡＧと併用）の効果を、ＳＡ−β−ｇａｌ活性について初めに検討した。ＲＯＳ産生結果と一致し、ＵＡＧは老化細胞数を減らすことができた（図２Ａ）。さらに、ＡＧＥで培養したＣＡＣにＵＡＧを添加した場合、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞数の有意な低減も検出できた（図２Ａ）。この事象の媒介におけるｐ５３、ｐ２１およびｐＲｂの役割は、ＵＡＧがＡＧＥ誘発性のｐ５３蓄積、ｐ２１発現およびＲｂのリン酸化を予防した観察結果によって支持される（図２Ｂ）。さらに、ＡＧＥ誘発性のｐ５３蓄積および老化様成長停止がｐ５３のサイレンシングによって予防された（図２Ｃ）。
【０１１１】
これらのデータをさらに確認するため、２型糖尿病患者をＵＡＧで処置した。処置の１２時間後、ＣＡＣをＵＡＧ処置患者および未処置患者から採取して培養した。図２Ｄおよび２Ｅに示すとおり、インビボ投与時、ＵＡＧは老化細胞数を低減し、ｐ５３の蓄積、Ｒｂのリン酸化およびｐ２１発現を予防した。これらのデータにより、ｐ５３が媒介するシグナル伝達経路は糖尿病環境においてＣＡＣ機能障害を引き起こし、ＵＡＧはこれらの事象を予防できることがさらに確認された。
【０１１２】
ＩＩＩ． ＵＡＧはＣＡＣ動員に影響を及ぼす
ＣＡＣは生理的にＢＭ内に存在し、微小環境変化に反応して循環血中に動員される。ＣＡＣ動員障害は心血管リスク因子の保因患者において報告されている（参考文献１９、３１）。
【０１１３】
この観察により、ＣＡＣのＢＭ動員に対するＵＡＧ処置の効果を調査するに至った。この目的のため、健常被験体および糖尿病患者を６時間、ＵＡＧもしくは生理食塩水で処置した。処置後、ＣＡＣを４例の対照被験体および４例の糖尿病患者から採取し、ＦＡＣＳ分析により分析して、計数した。図３Ａに示すとおり、ＵＡＧ処置患者から採取したＣＡＣのＦＡＣＳ分析により、ＣＤ４５マーカーの高発現、ＣＤ１４単球マーカーの低頻度ならびに内皮分化マーカーＣＤ１４６およびＣＤ１０５の未発現により、採取した細胞は実際にＣＡＣであることが実証された。黒線は陰性対照として用いた免疫前ＩｇＧを指し、灰色線は表面マーカー発現を示す。類似の結果が、未処置の糖尿病患者または未処置もしくは処置健常被験体由来のＣＡＣを分析時に得られた（データ未記載）。興味深いことに、ＵＡＧ処置（ただし、ＡＧ処置ではない）は、健常被験体と比較して、糖尿病患者において採取した細胞数をおおいに増加させた（図３Ｂ）。ＡＧまたは生理食塩水で処置した糖尿病患者と対照の間に統計的な差は検出されなかった。
【０１１４】
それらの血管特徴を確認するため、細胞を患者および対照から採取し、ＩＬ−３と共に培養した。ＩＬ−３は、末梢血由来およびＢＭ由来の両方のＣＤ４５＋細胞の増殖および動脈形態形成を誘発できる（参考文献２８）。図３Ｃに示すとおり、ＵＡＧで処置した糖尿病患者（ただし、ＡＧで処置した糖尿病患者ではない）から採取した細胞は増殖した。さらに、図３Ｄに報告するとおり、定量的（Ｑ）−ＲＴ−ＰＣＲにより動脈マーカー（Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ４）または静脈マーカー（ＥｐｈＢ４）で動脈形態形成を評価時、ＵＡＧ処置患者より得た細胞のみが動脈特異化できたことが認められた。これらのデータにより、糖尿病関連のＣＡＣ障害はＵＡＧ負荷によって救済できることがさらに示される。
【０１１５】
ＵＡＧで処置した患者および健常対照から得られたデータをさらに確認するため、２種の異なる糖尿病モデルマウスを用いた。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスおよびｏｂ／ｏｂマウスを生理食塩水もしくはＵＡＧで異なる時間間隔で処置した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルマウスおよびｏｂ／ｏｂモデルマウスは、当業者によく知られているであろう。
【０１１６】
処置後、細胞を採取し、ＦＡＣＳ分析によりアッセイし、計数して培養した。図４Ａに示すとおり、ＦＡＣＳ分析は、対応するヒトの場合と同様に、ＵＡＧで処置したｏｂ／ｏｂマウスから採取した細胞はＣＤ４５マーカーおよびＣＤ３１、ＫＤＲを発現したが、ＣＤ３３は発現しなかったことを示す。黒線は、陰性対照として用いた免疫前ＩｇＧを示し、灰色線は表面マーカー発現を示す。未処置の糖尿病マウスならびに未処置もしくは処置野生型マウス由来のＣＡＣを分析すると類似した結果が得られた（データ未記載）。さらに、非糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスとは異なり、糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでは、ＵＡＧ負荷により採取した細胞率（％）を増加できた（図４Ｂ）。循環ＣＡＣの増加した数はＵＡＧ負荷ｏｂ／ｏｂマウスにおいても検出できた。興味深いことに、ＵＡＧ処置ｏｂ／ｏｂマウスから採取した細胞数は、未処置野生型マウスのものに匹敵し、ＵＡＧがＣＡＣ数を正常な生理学的レベルまで十分に修復することを示す（図４Ｂ）。対応するヒトの場合と一致して、ＵＡＧ負荷マウスから採取したＣＡＣは増殖でき（図４Ｃ）、ＩＬ−３の存在下で培養時に動脈型を獲得した（図４Ｄ）。
【０１１７】
ＵＡＧの血管リモデリングおよび新血管形成効果
ＩＶ． ＵＡＧ処置は糖尿病性ＣＡＣ機能障害を救済する
新たに報告されたデータは、前駆細胞は、既存の血管構造に組み込まれて新生血管を形成し、血流を改善できることを示す（参考文献３３）。ＵＡＧで処置した糖尿病患者から採取したＣＡＣがそれらの血管能を救済するか否かを検討するため、新規の血管形成をインビボでアッセイした。この目的のため、未処置もしくはＵＡＧ処置患者から採取し、ＩＬ−３およびＣＳＦＥで標識したＣＡＣを含むマトリゲルプラグをＳＣＩＤマウスに注射し、注射１５日後にマトリゲルプラグを回収して免疫組織化学により分析した。結果（図４Ｅに報告）は、これらの標識された細胞の多くが、報告されているとおり、それらの内腔中赤血球によって機能性血管を形成したことを示す（図４Ｅ、パネルｂ（右））。一方、機能性血管は、未処置患者から採取したＣＡＣを使用した場合には検出できなかった（図４Ｅ、パネルａ（左））。新生血管が宿主起源の血管性細胞由来である可能性を排除するために、免疫蛍光アッセイを、抗ヒトＨＬＡクラスＩおよび抗マウスＭＨＣ−ＩＩ抗体を用いて実施した。大部分の血管がヒトＨＬＡクラスＩ陽性細胞で覆われていることが認められた（図４Ｆ）。したがって、これらのデータにより、ＵＡＧ処置はＣＡＣの利用能および血管リモデリング能力を改善するというさらなる証拠が得られた。
【０１１８】
Ｖ． ヒトＣＡＣ上のＵＡＧ結合部位の存在
ＣＡＣ膜上のＵＡＧの特異的結合部位の存在は、かかる結合部位に対しての、１００ｎＭ非標識ＵＡＧ（１〜２８）の［１２５Ｉ−Ｔｙｒ４］−ＵＡＧ（０．２５ｎＭ）との競合能力を検討することによって調査した。結合特異性も、１００ｎＭ ＡＧ（１〜２８）（アシル化グレリン）、ＵＡＧ（２８〜１）、生物学的不活性グレリン類似体、および合成ＵＡＧ（６〜１３）−ＮＨ２断片の存在下で試験した。この競合結合試験の結果（図５Ａ）は、［１２５Ｉ−Ｔｙｒ４］−ＵＡＧのＣＡＣ膜との結合はＵＡＧ（１〜２８）とＵＡＧ（６〜１３）の両方に阻害されたが、ＡＧ（１〜２８）またはＵＡＧ（２８〜１）には阻害されなかったことを明らかにした。［１２５Ｉ−Ｔｙｒ４］−ＵＡＧの特異結合（ＵＡＧ不在下、対照、およびＵＡＧ存在下の結合間の差として計算）は対照値の約７５％（Ｐ＜０．００１）を示し、２つの異なる細胞調製物由来の新鮮ＣＡＣ膜（０．２５および０．２６ｆｍｏｌ）または凍結融解ＣＡＣ膜（０．２０および０．３３ｆｍｏｌ）のいずれかで検出された。
【０１１９】
飽和結合実験を、この実験のために十分な量の膜を得られるＣＡＣ調製物由来の膜上で実施し、ＣＡＣ膜に対する放射性リガンドの特異的結合が飽和可能であり（図５Ｂ）、最大２ｎＭ、すなわち生理的循環ＵＡＧ濃度と一致する濃度に達したことが明らかにされた。これらのデータ（データ未記載）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析により、非アシル化グレリン結合部位の単一クラス（Ｈｉｌｌ係数１付近）のＣＡＣ細胞上の存在（Ｋｄ値０．４８ｎＭおよびＢｍａｘ値１０．７ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質）が示唆される。これらの結果により、ＵＡＧはＣＡＣ細胞と高親和性で結合できることが示される。
【０１２０】
材料および技術的プロトコール
患者および対照：６人の２型糖尿病患者（性別、男／女５／１例；ＨｂＡ１ｃ値８±１．２％；年齢６２．８±１２．４６歳；ＢＭＩ値２７．１±３．２２、クレアチニン値１．０４±０．２０ｍｇ／ｄＬ；腰囲（ｃｍ）９８．２±７．５２、総コレステロール値１９２±５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＤＬコレステロール値４６±１３．９８ｍｍｏｌ／Ｌ、ＬＤＬコレステロール値１１３±３９．７７ｍｍｏｌ／Ｌ、トリグリセリド値１５７．５±５４．２３、空腹時グルコース値１２６±１９．０４ｍｇ／ｄＬ、網膜症なし、高血圧３人、血圧１４１／８７ｍｍＨｇ；Ｃｈｏｌ／ａｐｏＢ値１．３±０．１）から採血した。すべての患者は食事療法のみで治療された（糖尿病患者による他剤の使用はなかった）。８人の血液ドナーを対照として用いた（性別、男／女４／４例；年齢２６．６±４．６５歳；ＢＭＩ値２１．１４±８．０８、クレアチニン値０．９６±０．０６３ｍｇ／ｄＬ、総コレステロール値１６２．１３±１０．７９ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＤＬコレステロール値４９±１０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、ＬＤＬコレステロール値８６．２５±１７．７２ｍｍｏｌ／Ｌ、トリグリセリド値１３２．１３±２７．１０、網膜症なし、高血圧例なし：血圧１２５／７０ｍｍＨｇ、Ｃｈｏｌ／ａｐｏＢ値１．６±０．１）。
【０１２１】
全被験体に次の検査セッションを施行した：
・ＵＡＧ（０〜１２時間目の１２時間、３．０μｇ／ｋｇ／時間ｉｖ注入）；
・等張生理食塩水（０〜１２時間目注入）
。
すべての試験の実施を、一晩絶食後、留置カテーテルを前腕静脈中に配置して等張生理食塩水を遅い速度で注入３０分後の午前８時半〜９時に開始した。血液試料を０時間、６時間および１２時間後に採取した。
【０１２２】
試薬：Ｍ１９９培地（内毒素試験済）、ウシ血清アルブミン、胎児性ウシ血清（ＦＢＳ）、糖化ヒトアルブミン（ＡＧＥ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。仔ウシ血清（内毒素試験済）はＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から入手した。トリプシンをＤｉｆｃｏから購入した。ニトロセルロースフィルター、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧおよび抗マウスＩｇＧ、分子量マーカー、および化学発光試薬（ＥＣＬ）をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。酸性β−ガラクトシダーゼ染色キットをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。過酸化水素をＣａｒｌｏ Ｅｒｂａ ｒｅａｇｅｎｔｓから入手した。内毒素汚染の存在はＬｉｍｕｌｕｓアメーバー様細胞アッセイにより試験した（濃度＜０．１ｎｇ／ｍＬであった）。ヒトＩＬ−３はＳａｎｄｏｚ Ｐｈａｒｍａ Ｌｔｄ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から贈呈された。ヒトＵＡＧをＰｈｏｅｎｉｘ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０１２３】
抗体：モノクローナル抗ｐ５３クローンＤＯ−１、抗ＣＤ３１、抗Ｆｌｋ１／ＫＤＲ、抗ＣＤ３３ ＦＩＴＣ、抗βアクチン、抗ｐ２１をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ホスホＲｂをＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。抗マウスＣＤ４５ ＰＥ、抗ＣＤ１４ ＰＥ、抗ヒトＣＤ４５ ＦＩＴＣ抗血清をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。抗ＣＤ１４６−ＦＩＴＣ抗体をＢｉｏＣｙｔｅｘ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。抗ＣＤ１０５ ＦＩＴＣ抗体をＴｅｃｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓ．ｒ．ｌ．（Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）から購入した。ＦＩＴＣ二次抗体またはＰＥ二次抗体をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．から、およびＳｉｇｍａから入手した。抗ヒトＨＬＡクラスＩ抗体をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、抗マウスＭＨＣ−ＩＩ抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。
【０１２４】
末梢血単核細胞由来ＣＡＣの単離および培養：Ｈｉｌｌら（参考文献１９）によって記載されているとおり、Ｆｙｃｏｌｌ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（Ｓｉｇｍａ）により単離された末梢血単核細胞（ＰＢ−ＭＮＣ）を２０％ＦＢＳ １９９培地内で再懸濁し、フィブロネクチン被覆ディッシュ（Ｂｉｏｃｏａｔ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）のプレートに播いた。ヒトＵＡＧ試験を、健常ドナーおよび糖尿病患者から採取したＣＡＣに対して実施した。分類した細胞の純度をＦＡＣＳ分析により検討した（参考文献２０）。実験のため、単離されたＣＡＣを、ＥＧＭ２培地（１０％ＦＢＳ、ヒドロコルチゾン、ヒト線維芽細胞成長因子、血管内皮増殖因子、インスリン成長因子１、アスコルビン酸、ヒト上皮成長因子、ゲンタマイシンおよびアンフォテリシン−Ｂ（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）の単独もしくは１μＭ ＵＡＧおよび１．２ｍｇ／ｍＬ ＡＧＥとの併用を含有）中の２０μｇ／ｍＬフィブロネクチン被覆ディッシュ上で５％ＣＯ２下、３７℃で４日間培養した。選択した実験では、単離されたＣＡＣを、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３を添加したＥＢＭ２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で培養した。ＦＡＣＳを用いてそれらの表現型を分析した（抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３１、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４抗体を用いた）（参考文献２２）。
【０１２５】
動員アッセイ：ＵＡＧもしくは生理食塩水で６時間および１２時間処置した健常被験体および糖尿病患者から採取したＣＡＣを検討した。総ＭＮＣ数を３人の独立した担当者が計数した。ＣＡＣの割合（％）の計算を、ＵＡＧ、ＡＧもしくは生理食塩水により６時間および１２時間処置した糖尿病患者および健常ドナーより得たＣＡＣと、０時間目に採取したＣＡＣとを比較することによって行なった。
【０１２６】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による内因性ｐ５３のサイレンシング：ｐ５３の不活性化を得るために、健常被験体から採取してＡＧＥ存在もしくは不在下で培養したＣＡＣを、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐらによって記載されているとおり（参考文献２３）、ｐ５３ ｓｉＲＮＡもしくはスクランブルｐ５３ ｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ）配列（１．５μｇ）を含むベクターｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏを用いて、販売元の指示に従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＰＬＵＳ（商標登録）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により一時的にトランスフェクトした。ｐ５３ ｓｉＲＮＡおよびスクランブルｐ５３ ｓｉＲＮＡを含むｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏはＤｒ．Ｓ．Ｓｏｄｄｕの好意で提供された。６０時間後、全細胞抽出物を調製し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離して、抗ｐ５３抗体で免疫ブロットした。
【０１２７】
ＲＯＳ検出：ＤＣＦ−ＤＡ（最終濃度０．５μＭ）を示される培養条件下でＣＡＣに添加した。示される時刻に、細胞のＦＡＣＳ分析を行ない、既報（参考文献２２）どおり処理した。Ｈ２Ｏ２を陽性対照として用いた。
【０１２８】
ＣＡＣ老化：健常被験体から採取し、ＥＧＭ２培地で、ＵＡＧもしくはＡＧＥ＋ＵＡＧと共に４日間培養したＣＡＣ、および生理食塩水またはＵＡＧで処置した糖尿病患者から採取したＣＡＣの酸性β−ｇａｌ活性により老化を検討した（参考文献２２）。簡単に述べると、ＣＡＣをリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、３分間、室温下で２％パラホルムアルデヒド固定し、洗浄して、新たなＳＡ−β−ｇａｌ染色液（１ｍｇ／ｍＬ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）、５ｍＭ／Ｌフェロシアン化カリウム、５ｍＭ／Ｌフェリシアニド、１５０ｍＭ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｍＭ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．０１％デオキシコール酸ナトリウム、および０．０２％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）により３７℃で２４時間インキュベートした。ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞を３人の独立した担当者が手作業で計数した。
【０１２９】
ウエスタンブロット分析：健常ドナー由来のＣＡＣをＵＡＧ存在下、ＡＧＥ併用もしくは非併用下で培養し、生理食塩水もしくはＵＡＧで処置した糖尿病患者から採取したＣＡＣを溶解させた。タンパク質濃度の検出を既報（参考文献２４）どおり行なった。５０μｇタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜にトランスファーした。抗ｐ５３、抗ｐ２１および抗ホスホＲｂ抗体との反応ならびに増強した化学発光検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による検出を既報（参考文献２０）どおり実施した。
【０１３０】
ＲＮＡ単離および定量的リアルタイムＰＣＲ：ＵＡＧもしくは生理食塩水で処置した糖尿病患者、健常被験体およびマウス由来のＣＡＣをＥＧＭ２培地で培養した。ヒト動脈および静脈細胞を陽性対照として用いた。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡ定量化を既報（参考文献２４）どおり実施した。Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ４およびＥｐｈＢ４の相対発現を、比較閾値サイクル法を用いて計算した。使用したヒトおよびマウスプライマー配列は記載されている（参考文献２５、２６）。
【０１３１】
フローサイトメトリー：ＣＡＣ細胞周期進行を分析するため、糖尿病患者、健常被験体、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ｏｂ／ｏｂおよびｗｔマウスから採取した細胞をＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＥＢＭ２で培養し、ＦＡＣＳ分析を既報（参考文献２０）どおり実施した。細胞表面分子の検討をフローサイトメトリーにより既報（参考文献２４）どおり行なった。マーカー陽性細胞頻度を平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。
【０１３２】
インビボ実験
糖尿病および対照マウス：マウスを４群に分けた。各群で測定した血漿グルコース値およびインスリン値を報告する。１６匹の６週齢ｏｂ／ｏｂマウス（血糖値６００±４５ｍｇ／ｄＬ、インスリン値５．５±０．９ｎｇ／ｍＬ）；１６匹のＣ５６ＢＬ６／Ｊ野生型マウス（血糖値１５０±１８．２ｍｇ／ｄＬ、インスリン値１±０．０５ｎｇ／ｍＬ）；１０匹の７週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（血糖値１６４±１２．９ｍｇ／ｄＬ、インスリン値１．２±０．１２ｎｇ／ｍＬ）；１０匹の１７週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（血糖値５３６±３６．３ｍｇ／ｄＬ、インスリン値４．８５±０．７４ｎｇ／ｍＬ）。動物処置はＧｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９３−２３， ｒｅｖｉｓｅｄ １９８５）に準じた。
【０１３３】
血糖値および血清インスリン値の測定：血糖値測定をＯｎｅ Ｔｏｕｃｈ ＩＩグルコース測定器（Ｌｉｆｅｓｃａｎｅ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて行なった。血清インスリン値測定を、製造業者の指示に従いマウスインスリンラジオイムノアッセイキット（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）を用いて行なった。
【０１３４】
Ｃ５７ＢＬ６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ６Ｊ ｏｂ／ｏｂマウスおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス由来のＣＡＣの単離および培養：６週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ｗｔ）およびｏｂ／ｏｂマウス、７週齢および１７週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ（Ｌｅｃｃｏ，Ｉｔａｌｙ）から購入した。動物をＡｖｅｒｔｉｎ（１００ｍｇ／５０ｍＬ ｉｐ）の腹腔内注射により麻酔した。血液試料を左心室から、Ｈｏｆｆ（参考文献２７）によって記載されているとおり採取した。末梢血ＭＮＣをＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法により単離した。採取した細胞を２回洗浄した。単離された細胞を再懸濁し、ＥＧＭ２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地中の２０μｇ／ｍＬフィブロネクチン被覆ディッシュ上で培養した。選択した実験では、単離されたＣＡＣを１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３を添加したＥＢＭ２培地で培養した。
【０１３５】
動員アッセイ：マウスを１２時間ＵＡＧまたは生理食塩水で処置した。上記のとおり採取および精製されたＣＡＣを培養し、３人の独立した担当者が計数した。ＣＡＣの技術的比率を、左心室から採取した血液中ＣＡＣ数（／μＬ）と比較することによって計算した。
【０１３６】
マトリゲルプラグアッセイ：マウス血管形成アッセイのため、２型糖尿病患者より得た、未処置のまたはＵＡＧで処置したＣＡＣを計数し、ＤＭＥＭ中で再懸濁した（２５０μＬ ＤＭＥＭ中４×１０６）。細胞を氷上で冷却し、蛍光色素のカルボキシフルオセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＳＦＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識し、４℃のＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍＬ）含有マトリゲル２５０μＬに添加し、７週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腹部傍正中領域に皮下注射した（マウス５匹／群）。１５日後、マウスを屠殺し、マトリゲルプラグを採取し、１０％緩衝ホルマリン固定し、免疫組織化学のためにパラフィン包埋した。
【０１３７】
免疫組織化学および免疫蛍光検査法：免疫組織化学のため、マトリゲルプラグのパラフィン包埋ブロックの切片をポリリジン被覆したスライド上に収集した。内因性ペルオキシダーゼ活性を室温下、６％Ｈ２Ｏ２で８分間遮断した。蛍光色素ＣＳＦＥ標識した細胞を検出するため、抗フルオレセイン／Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎポリクローナル抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を一晩、４℃でスライドに載せた。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ウサギＥｎｖｉｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を３０分間インキュベートした。反応生成物を３，３−ジアミノベンジジンを用いて発色させた。一次抗体の省略または非関連ウサギ血清ＩｇＧとの置換を陰性対照として用いた。陽性細胞率（％）の計数は、各実験の４つの不連続切片において倍率４０倍で行なった。免疫蛍光検査法のため、試料を抗ヒトＨＬＡ−Ｉおよび抗マウスＭＨＣ−ＩＩ抗体を用いて、既報（参考文献２８）どおり処理した。ＭＨＣ−ＩＩまたはＨＬＡ−Ｉ陽性血管数を３つの異なる試料から無作為に選択した１０視野を計数することによって決定した。
【０１３８】
統計的分析：インビトロおよびインビボ結果は、少なくとも３回の独立した実験を表す。インビトロ実験を３回実施した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ ２５０ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒを用いたデンシトメトリー分析を用いてタンパク質の活性化または発現の誘導倍数の違いを計算した（＊および§：ｐ＜０．０５、実験値と対照値間の統計的有意差）。実験値と対照値間の有意差を、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定の分散分析を用いて計算した。類似した統計的分析をインビボ実験において実施した。
【０１３９】
本明細書中で報告するデータは、本発明を例証するためのみに用いられており、その制限を成すものとはみなされ得ないことが理解される。
【０１４０】
本発明はその特定の実施形態と共に記載しているが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般的に、本発明の原理に従った本発明の任意の変形、使用、もしくは適合化を包含し、本発明が属する分野内で既知もしくは慣行範囲であり、本明細書の上文に説明した本質的な特徴に適用し得、添付の特許請求の範囲に従うような本明細書の開示からの逸脱を含むことを意図していることが理解される。
【０１４１】
本明細書中で述べたすべての文献が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１４２】
参考文献一覧
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２６． Ｃｏｒｍｉｅｒ Ｓ， Ｖａｎｄｏｒｍａｅｌ−Ｐｏｕｒｎｉｎ Ｓ， Ｂａｂｉｎｅｔ Ｃ， Ｃｏｈｅｎ−Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ Ｍ； Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｇｅｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ． Ｐａｔｔｅｒｎｓ．；４：７１３−７１７ （２００４）．
２７． Ｈｏｆｆ Ｊ； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｌａｂ． Ａｎｉｍａｌ． ２９ （２０００）．
２８． Ｚｅｏｌｉ Ａ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｔｏｇｌｉａｔｔｏ Ｇ， Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ Ａ， Ｄａｍｉａｎｏ Ｌ， Ｆｒａｎｃｉａ ｄｉ Ｃｅｌｌｅ Ｐ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ａｌｔｒｕｄａ Ｆ， Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ； Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ （ＩＬ−３） ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＤ４５＋ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｒｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ ｖｉａ ＳＴＡＴ５ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ 近刊．
２９． Ｙａｍａｇｉｓｈｉ Ｓ， Ｍａｔｓｕｉ Ｔ， Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ； Ｋｉｎｅｔｉｃｓ， ｒｏｌｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ （ｓＲＡＧＥ） ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ． ８：１１３８−４３ （２００７）．
３０． Ｄｉｍｒｉ ＧＰ． Ｗｈａｔ ｈａｓ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｇｏｔ ｔｏ ｄｏ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ？ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ７：５０５−１２ （２００５）．
３１． Ｖａｓａ Ｍ， Ｆｉｃｈｔｌｓｃｈｅｒｅｒ Ｓ， Ａｉｃｈｅｒ Ａ， Ａｄｌｅｒ Ｋ， Ｕｒｂｉｃｈ Ｃ， Ｍａｒｔｉｎ Ｈ， Ｚｅｉｈｅｒ ＡＭ， Ｄｉｍｍｅｌｅｒ Ｓ． Ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ８９：Ｅ１−７ （２００１）．
３２． Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｊ． Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｖｅｓｓｅｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ４９：５５４−６０ （２００１）．
３３． Ａｂａｃｉ Ａ， Ｏｇｕｚｈａｎ Ａ， Ｋａｈｒａｍａｎ Ｓ， Ｅｒｙｏｌ ＮＫ， Ｕｎａｌ Ｓ， Ａｒｉｎｃ Ｈ， Ｅｒｇｉｎ Ａ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｖｅｓｓｅｌｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９：２２３９−４２ （１９９９）．
３４． Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ ＣＧ， Ｓｔｅｈｏｕｗｅｒ ＣＤ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ （Ｌｏｎｄ） １０９：１４３−５９ （２００５）．
３５． Ｋｌｅｉｎｚ ＭＪ， Ｍａｇｕｉｒｅ ＪＪ， Ｓｋｅｐｐｅｒ ＪＮ， Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ＡＰ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｄｅｓ−ｏｃｔａｎｏｙｌ ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｏｍｅ ｉｎ ｍａｎ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６９：２２７−２３５ （２００６）．
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管リモデリングおよび血管疾患治療、心血管疾患を治療するための方法および医薬組成物、循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための方法および医薬組成物、ならびに血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための方法および医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グレリン（ＡＧ）は２８アミノ酸のペプチドであり、ラット胃から精製かつ同定され、Ｓｅｒ３残基上に存在するｎ−オクタノイル修飾を特徴とする（参考文献１）。ＡＧは成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳＲ）の内因性リガンドであり（参考文献２、３）、心血管系（心臓、脈管系および大血管内皮細胞など）でも検出されることから、成長ホルモンを放出する特性を有する他に、血管生物学、血管生理機能、ならびにアテローム発生に影響も及ぼし得ることが示されている（参考文献４、５、６）。
【０００３】
Ｄｅｓ−アシルグレリン（または非アシル化グレリン、すなわちＵＡＧ）はグレリンの非アシル化型であり、ＡＧと比較して血漿および組織中濃度が高く、ＧＨＳＲ−１ａに結合できず、いずれの中心活性も欠いている（参考文献７）。しかしながら、ＵＡＧはＡＧと多くの生物学的活性およびいくつもの末梢組織上の共通の結合部位を共有する。ＡＧとＵＡＧは類似したＧＨＳ−Ｒ非依存性の生物学的活性（細胞保護効果（参考文献９）およびインビボ脂質生成効果（参考文献１０）など）を示す。ＵＡＧ活性を検討したすべてではないがほとんどの細胞においてＧＨＳＲ−１ａは発現しなかったことから、ＡＧと共有するかかる多面的活性はＧＨＳＲ−１ａとは異なる未確認の受容体に媒介されている可能性が示唆される。
【０００４】
ＵＡＧは生物学的に（特に代謝レベルで）活性のペプチドであることが実証されており、米国特許第７，４８５，６２０号、米国特許出願公開第２００８０１５９９９１号、米国特許出願公開第２００８０３１２１３３号および国際公開第２００８／１４５７４９号に記載された抗糖尿病誘発効果を発揮することが特に示されている。
【０００５】
ＡＧとＵＡＧは心筋細胞上に直接作用し、実験的に誘発された細胞死を生存シグナル伝達経路の活性化を通じて阻害することが既に広く報告されている（参考文献８）。ＡＧは基底およびＴＮＦ−α誘発性遊走性サイトカイン産生ならびにヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）内の単核細胞付着を阻害することも示されている（参考文献５）。さらに外因性ＡＧによるヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）治療は、細胞の増殖、移動、インビトロ血管形成およびこれらの細胞内ＥＲＫ２リン酸化を有意に増加させたことが報告された（参考文献４）。最近、Ｋｌｅｉｎｚら（参考文献３５）は、ＡＧとＵＡＧはヒト血管緊張におけるパラクリン調節の役割を担うことを実証し、より具体的には、ＡＧとＵＡＧはヒト動脈の血管拡張作用を有することを示した。
【０００６】
促進された血管疾患は糖尿病患者の死亡および障害の主因である。内皮損傷は糖尿病環境下のアテローム硬化性血管疾患の発症および進行における重要な段階を成すと考えられる（参考文献１１）。
【０００７】
最終糖化産物（ＡＧＥ）は糖尿病環境下で血管リモデリング障害を引き起こすことが既に報告されている（参考文献１２）。ＡＧＥの形成および活性酸素種（ＲＯＳ）の産生は、糖尿病下のＡＧＥに対する細胞反応として、主に血管リモデリング障害を引き起こすと思われる。
【０００８】
血管リモデリングは常在内皮細胞増殖のみに依存せず、循環する血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に関与もする。最近のデータにより、心血管リスク因子の保因患者（限定されないが、糖尿病患者など）において、ＥＰＣ数が低減し、ＥＰＣ機能が損なわれていることが実証された（参考文献１３、１４、１５）。
【０００９】
２種類のＥＰＣ、すなわち初期ＥＰＣと後期ＥＰＣについてこれまでに記載されている。それらには共通の特徴があるが、形態学的効能、増殖能、およびインビトロ機能特性の面でいくつか異なる特徴がある。後期ＥＰＣとは異なり、初期ＥＰＣは典型的にはインビトロで内皮表現型を導入しないが、インビボにおいて、間接的なパラクリン様式で新血管形成を増強する。これにより、初期ＥＰＣは循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）として再定義される。ＣＡＣは単球様細胞であり、骨髄から新血管形成部位に回帰し得、血管損傷後の再内皮化に関わり、その場（ｉｎ ｓｉｔｕ）で成熟内皮細胞に分化する（参考文献１６）。
【００１０】
心血管リスク因子プロファイルが増加するにつれ、ＣＡＣ数が減少し、ＣＡＣ機能活性が損なわれ、したがってＣＡＣの、例えば、血管形成が必要とされ得る虚血部位への送達が制限されることを示す有力な証拠がある。特定のサイトカインによる治療は、ＣＡＣの骨髄（ＢＭ）動員を誘発し、続いて心血管リスクを防ぐと見込まれる（参考文献１７、１８）。
【００１１】
酸化ストレスは糖尿病に関連した血管組織損傷および内皮損傷において主な役割を担う。主に、糖尿病環境下のＲＯＳ産生は最終糖化産物（ＡＧＥ）に誘発され、特にＣＡＣから産生される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第７，４８５，６２０号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８０１５９９９１号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８０３１２１３３号
【特許文献４】国際公開第２００８／１４５７４９号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋｏｊｉｍａ Ｍ， Ｈｏｓｏｄａ Ｈ， Ｄａｔｅ Ｙ， Ｎａｋａｚａｔｏ Ｍ， Ｍａｔｓｕｏ Ｈ ａｎｄ． Ｋａｎｇａｗａ Ｋ； Ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｓ ａ ｇｒｏｗｔｈ−ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ａｃｙｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｓｔｏｍａｃｈ， Ｎａｔｕｒｅ ４０２：６５６−６６０ （１９９９）．
【非特許文献２】Ｇｎａｎａｐａｖａｎ Ｓ， Ｋｏｌａ Ｂ， Ｂｕｓｔｉｎ ＳＡ， Ｍｏｒｒｉｓ ＤＧ， ＭｃＧｅｅ Ｐ， Ｆａｉｒｃｌｏｕｇｈ Ｐ， Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ Ｓ， Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ Ｒ， Ｇｒｏｓｓｍａｎ ＡＢ ａｎｄ Ｋｏｒｂｏｎｉｔｓ Ｍ； Ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ＧＨＳ−Ｒ， ｉｎ ｈｕｍａｎｓ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８７：２９８８−２９９１ （２００２）．
【非特許文献３】Ｈｏｗａｒｄ ＡＤ， Ｆｅｉｇｈｎｅｒ ＳＤ， Ｃｕｌｌｙ ＤＦ， Ａｒｅｎａ ＪＰ， Ｌｉｂｅｒａｔｏｒ ＰＬ， Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ Ｃｌ， Ｈａｍｅｌｉｎ Ｍ， Ｈｒｅｎｉｕｋ ＤＬ， Ｐａｌｙｈａ ＯＣ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｊ， Ｐａｒｅｓｓ ＰＳ， Ｄｉａｚ Ｃ， Ｃｈｏｕ Ｍ， Ｌｉｕ ＫＫ， ＭｃＫｅｅ Ｋ−Ｋ， Ｐｏｎｇ Ｓ−Ｓ， Ｃｈａｕｎｇ Ｌ−Ｙ， Ｅｌｂｒｅｃｈｔ Ａ， Ｄａｓｈｋｅｖｉｃｚ Ｍ， Ｈｅａｖｅｎｓ Ｒ， Ｒｉｇｂｙ Ｍ， Ｓｉｒｉｎａｔｈｓｉｎｇｈｊｉ Ｄ， Ｄｅａｎ ＤＣ， Ｍｅｌｉｌｌｏ ＤＧ， Ｐａｔｃｈｅｔｔ ＡＡ， Ｎａｒｇｕｎｄ Ｒ， Ｇｒｉｆｆｉｎ ＰＲ， ＤｅＭａｒｔｉｎｏ ＪＡ， Ｇｕｐｔａ ＳＫ， Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ ＪＡ， Ｓｍｉｔｈ ＲＧ， Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ ＬＨＴ； Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｎｄ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ｔｈａｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：９７４−９７７ （１９９６）．
【非特許文献４】Ｌｉ Ａ， Ｃｈｅｎｇ Ｇ， Ｚｈｕ ＧＨ， Ｔａｒｎａｗｓｋｉ ＡＳ； Ｇｈｒｅｌｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｂｅｙｏｎｄ ＧＨ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｙｏｐｈｉｓ． Ｒｅｓ． ｃｏｍｍｕｎ． ３５３：２３８−４３ （２００７）．
【非特許文献５】Ｌｉ ＷＧ， Ｇａｖｒｉｌａ Ｄ， Ｌｉｕ Ｘ， Ｗａｎｇ Ｌ， Ｇｕｎｎｌａｕｇｓｓｏｎ Ｓ， Ｓｔｏｌｌ ＬＬ， ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ＭＬ， Ｓｉｇｍｕｎｄ ＣＤ， Ｔａｎｇ Ｃ， Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ＮＬ； Ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ Ｂ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：２２２１−６ （２００４）．
【非特許文献６】Ｄｉｘｉｔ ＶＤ， Ｓｃｈａｆｆｅｒ ＥＭ， Ｐｙｌｅ ＲＳ， Ｃｏｌｌｉｎｓ ＧＤ， Ｓａｋｔｈｉｖｅｌ ＳＫ， Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎ Ｒ， Ｌｉｌｌａｒｄ ＪＷ Ｊｒ， Ｔａｕｂ ＤＤ； Ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｌｅｐｔｉｎ−ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖ． １１４：５７−６６ （２００４）．
【非特許文献７】ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｌｙ ＡＪ， Ｔｓｃｈｏｐ Ｍ， Ｈｅｉｍａｎ ＭＬ， Ｇｈｉｇｏ Ｅ； Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ， ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ， ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ ２５：４２６−４５７ （２００４）．
【非特許文献８】Ｂａｌｄａｎｚｉ Ｇ， Ｆｉｌｉｇｈｅｄｄｕ Ｎ， Ｃｕｔｒｕｐｉ Ｓ， Ｃａｔａｐａｎｏ Ｆ， Ｂｏｎｉｓｓｏｎｉ Ｓ， Ｆｕｂｉｎｉ Ａ， Ｍａｌａｎ Ｄ， Ｂａｊ Ｇ， Ｇｒａｎａｔａ Ｒ， Ｂｒｏｇｌｉｏ Ｆ， Ｐａｐｏｔｔｉ Ｍ， Ｓｕｒｉｃｏ Ｎ， Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ Ｆ， Ｉｓｇａａｒｄ Ｊ， Ｄｅｇｈｅｎｇｈｉ Ｒ， Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ Ｆ， Ｐｒａｔ Ｍ， Ｍｕｃｃｉｏｌｉ Ｇ， Ｇｈｉｇｏ Ｅ， Ｇｒａｚｉａｎｉ Ａ； Ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｄｅｓ−ａｃｙｌ ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＥＲＫ１／２ ａｎｄ Ｐｌ ３−ｋｉｎａｓｅ／ＡＫＴ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １５９：１０２９−３７ （２００２）．
【非特許文献９】Ｄｅｌｈａｎｔｙ ＰＪ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｅｒｄｅｎ ＢＣ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅ Ｍ， Ｇａｕｎａ Ｃ， Ｐｏｌｓ ＨＡ， Ｊａｈｒ Ｈ， Ｃｈｉｂａ Ｈ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｌｙ ＡＪ， ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ Ｊ； Ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｕｎａｃｙｌａｔｅｄ ｇｈｒｅｌｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｈｕｍａｎ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｖｉａ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （ＭＡＰＫ）／ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ （ＰＩ３Ｋ） ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＧＨＳ−ＲＩａ． Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １８８：３７−４７ （２００６）．
【非特許文献１０】Ｃｈｏｉ Ｋ， Ｒｏｈ ＳＧ， Ｈｏｎｇ ＹＨ， Ｓｈｒｅｓｔｈａ ＹＢ， Ｈｉｓｈｉｋａｗａ Ｄ， Ｃｈｅｎ Ｃ， Ｋｏｊｉｍａ Ｍ， Ｋａｎｇａｗａ Ｋ， Ｓａｓａｋｉ Ｓ； Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ｒａｔ ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ． １４４：７５４−９ （２００３）．
【非特許文献１１】Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ ＳＡ， Ｂａｈｌｍａｎｎ ＦＨ， Ｂｅｓｌｅｒ Ｃ， Ｍｕｌｌｅｒ Ｍ， Ｓｃｈｕｌｚ Ｓ， Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ Ｎ， Ｄｏｅｒｒｉｅｓ Ｃ， Ｈｏｒｖａｔｈ Ｔ， Ｌｉｍｂｏｕｒｇ Ａ， Ｌｉｍｂｏｕｒｇ Ｆ， Ｆｌｉｓｅｒ Ｄ， Ｈａｌｌｅｒ Ｈ， Ｄｒｅｘｌｅｒ Ｈ， Ｌａｎｄｍｅｓｓｅｒ Ｕ； Ｏｘｉｄａｎｔ ｓｔｒｅｓｓ ｉｍｐａｉｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ： ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ ａｇｏｎｉｓｔ ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１６：１６３−７３ （２００７）．
【非特許文献１２】Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｐａｖａｎ Ｍ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｇａｍｂｉｎｏ Ｒ， Ｇｒａｚｉａ Ｄｅ Ｃｅｓａｒｉｓ Ｍ， Ｇａｒｂａｒｉｎｏ Ｇ， Ｃａｍｕｓｓｉ Ｇ， Ｐａｇａｎｏ Ｇ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ； Ｄｉａｂｅｔｉｃ ＬＤＬ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｖｉａ ＳＴＡＴ５Ｂ ａｎｄ ｐ２１（ｗａｆ）． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １０９：１１１−９ （２００２）．
【非特許文献１３】Ｔｈｕｍ Ｔ， Ｆｒａｃｃａｒｏｌｌｏ Ｄ， Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓｓ Ｍ， Ｆｒｏｅｓｅ Ｓ， Ｇａｌｕｐｐｏ Ｐ， Ｗｉｄｄｅｒ ＪＤ， Ｔｓｉｋａｓ Ｄ， Ｅｒｔｌ Ｇ， Ｂａｕｅｒｓａｃｈｓ Ｊ； Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５６：６６６−７４ （２００７）．
【非特許文献１４】Ｄｉｍｍｅｌｅｒ Ｓ， Ｚｅｉｈｅｒ ＡＭ； Ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｐａｉｒ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ： ｔｈｅ ｍｉｓｓｉｎｇ ｌｉｎｋ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ？ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ８２：６７１−７ （２００４）．
【非特許文献１５】Ｔｅｐｐｅｒ ＯＭ， Ｇａｌｉａｎｏ ＲＤ， Ｃａｐｌａ ＪＭ， Ｋａｌｋａ Ｃ， Ｇａｇｎｅ ＰＪ， Ｊａｃｏｂｏｗｉｔｚ ＧＲ， Ｌｅｖｉｎｅ ＪＰ， Ｇｕｒｔｎｅｒ ＧＣ； Ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｙｐｅ ＩＩ ｄｉａｂｅｔｉｃｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ａｄｈｅｓｉｏｎ， ａｎｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０６：２７８１−６ （２００２）．
【非特許文献１６】Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ Ｔ； Ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｓｃｅｎａｒｉｏｓ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ．１０３：１５８０−５ （２００４）．
【非特許文献１７】Ｈａｔｔｏｒｉ Ｋ， Ｈｅｉｓｓｉｇ Ｂ， Ｔａｓｈｉｒｏ Ｋ， Ｈｏｎｊｏ Ｔ， Ｔａｔｅｎｏ Ｍ， Ｓｈｉｅｈ ＪＨ， Ｈａｃｋｅｔｔ ＮＲ， Ｑｕｉｔｏｒｉａｎｏ ＭＳ， Ｃｒｙｓｔａｌ ＲＧ， Ｒａｆｉｉ Ｓ， Ｍｏｏｒｅ ＭＡ； Ｐｌａｓｍａ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ ９７：３３５４−６０ （２００１）．
【非特許文献１８】Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｔ， Ｋａｌｋａ Ｃ， Ｍａｓｕｄａ Ｈ， Ｃｈｅｎ Ｄ， Ｓｉｌｖｅｒ Ｍ， Ｋｅａｒｎｅｙ Ｍ， Ｍａｇｎｅｒ Ｍ， ｌｓｎｅｒ ＪＭ， Ａｓａｈａｒａ Ｔ； Ｉｓｃｈｅｍｉａ− ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． ５：４３４−８ （１９９９）．
【非特許文献１９】Ｈｉｌｌ ＪＭ， Ｚａｌｏｓ Ｇ， Ｈａｌｃｏｘ ＪＰ， Ｓｃｈｅｎｋｅ ＷＨ， Ｗａｃｌａｗｉｗ ＭＡ， Ｑｕｙｙｕｍｉ ＡＡ， Ｆｉｎｋｅｌ Ｔ； Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ， ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｉｓｋ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３４８：５９３−６００ （２００３）．
【非特許文献２０】Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉ Ｐ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｃａｌｖｉ Ｃ， Ｇａｒｂａｒｉｎｏ Ｇ， Ｔａｒｏｎｅ Ｇ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ｂｒｉｚｚｉ； ＭＦβ１ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ＩＬ−３Ｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ＳＴＡＴ５ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６８：１０９９−１１０８ （２００５）．
【非特許文献２１】Ｚｈａｏ Ｗ， Ｄｉｚ Ｄｌ， Ｒｏｂｂｉｎｓ ＭＥ； Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ． Ｂｒ Ｊ Ｒａｄｉｏｌ． ８０：Ｓ２３−３１ （２００７）．
【非特許文献２２】Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｂａｌｓａｍｏ Ａ， Ｇａｍｂｉｎｏ Ｒ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｆａｌｃｉｏｎｉ Ｒ， Ｃａｓｓａｄｅｒ Ｍ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ｐａｇａｎｏ Ｇ， Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ； ｐ５３ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８１ ：４３３９−４７ （２００６）．
【非特許文献２３】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ， ＴＲ．， Ｂｅｒｎａｒｄｓ， Ｒ， ａｎｄ Ａｇａｍｉ， Ｒ； Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５５３ （２００２）．
【非特許文献２４】Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｂａｌｓａｍｏ Ａ， Ｃｏｌｍｅｎａｒｅｓ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ Ｓ， Ｚｅｏｌｉ Ａ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｍ， Ｃａｍｕｓｓｉ Ｇ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ； Ｃ−ＫＩＴ， ｂｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｌｉｇａｎｄ， ｒｅｃｒｕｉｔｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｉｎｆｌａｍｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ． Ｂｌｏｏｄ． １０９：４２６４−７１ （２００７）．
【非特許文献２５】Ａｒａｎｇｕｒｅｎ ＸＬ， Ｌｕｔｔｕｎ Ａ， Ｃｌａｖｅｌ Ｃら； Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｒｔｅｒｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ． １０９：２６３４−２６４２ （２００７）．
【非特許文献２６】Ｃｏｒｍｉｅｒ Ｓ， Ｖａｎｄｏｒｍａｅｌ−Ｐｏｕｒｎｉｎ Ｓ， Ｂａｂｉｎｅｔ Ｃ， Ｃｏｈｅｎ−Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ Ｍ； Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｇｅｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ． Ｐａｔｔｅｒｎｓ．；４：７１３−７１７ （２００４）．
【非特許文献２７】Ｈｏｆｆ Ｊ； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｌａｂ． Ａｎｉｍａｌ． ２９ （２０００）．
【非特許文献２８】Ｚｅｏｌｉ Ａ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｔｏｇｌｉａｔｔｏ Ｇ， Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ Ａ， Ｄａｍｉａｎｏ Ｌ， Ｆｒａｎｃｉａ ｄｉ Ｃｅｌｌｅ Ｐ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ａｌｔｒｕｄａ Ｆ， Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ； Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ （ＩＬ−３） ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＤ４５＋ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｒｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ ｖｉａ ＳＴＡＴ５ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ 近刊．
【非特許文献２９】Ｙａｍａｇｉｓｈｉ Ｓ， Ｍａｔｓｕｉ Ｔ， Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ； Ｋｉｎｅｔｉｃｓ， ｒｏｌｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ （ｓＲＡＧＥ） ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ． ８：１１３８−４３ （２００７）．
【非特許文献３０】Ｄｉｍｒｉ ＧＰ． Ｗｈａｔ ｈａｓ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｇｏｔ ｔｏ ｄｏ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ？ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ７：５０５−１２ （２００５）．
【非特許文献３１】Ｖａｓａ Ｍ， Ｆｉｃｈｔｌｓｃｈｅｒｅｒ Ｓ， Ａｉｃｈｅｒ Ａ， Ａｄｌｅｒ Ｋ， Ｕｒｂｉｃｈ Ｃ， Ｍａｒｔｉｎ Ｈ， Ｚｅｉｈｅｒ ＡＭ， Ｄｉｍｍｅｌｅｒ Ｓ． Ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ８９：Ｅ１−７ （２００１）．
【非特許文献３２】Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｊ． Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｖｅｓｓｅｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ４９：５５４−６０ （２００１）．
【非特許文献３３】Ａｂａｃｉ Ａ， Ｏｇｕｚｈａｎ Ａ， Ｋａｈｒａｍａｎ Ｓ， Ｅｒｙｏｌ ＮＫ， Ｕｎａｌ Ｓ， Ａｒｉｎｃ Ｈ， Ｅｒｇｉｎ Ａ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｖｅｓｓｅｌｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９：２２３９−４２ （１９９９）．
【非特許文献３４】Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ ＣＧ， Ｓｔｅｈｏｕｗｅｒ ＣＤ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ （Ｌｏｎｄ） １０９：１４３−５９ （２００５）．
【非特許文献３５】Ｋｌｅｉｎｚ ＭＪ， Ｍａｇｕｉｒｅ ＪＪ， Ｓｋｅｐｐｅｒ ＪＮ， Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ＡＰ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｄｅｓ−ｏｃｔａｎｏｙｌ ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｏｍｅ ｉｎ ｍａｎ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６９：２２７−２３５ （２００６）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
心血管疾患発症リスクのある患者もしくは心血管疾患患者において、心血管疾患を予防もしくは治療するため、血管リモデリングおよび新血管形成を改善するための方法を設計する重要な必要性がある。１つの解決策は、ＣＡＣ細胞数を増加させることおよび／もしくはＣＡＣ機能性を改善することであり、それはＣＡＣの骨髄からの動員を改善することによって、ＡＧＥs に誘発されるＲＯＳ産生を減少することによって、ＣＡＣの老化もしくはアポトーシス率を減少することによって、ならびにＣＡＣが動脈もしくは静脈表現型へ分化する（すなわち、インビボ血管形成する）能力を増強することによって成し遂げることができる。
【００１５】
ＡＧは血管機能障害および心保護に対する効果を有し得るという初期の観察から、血管機能障害および心保護に対するＵＡＧのインビトロおよびインビボ効果の検討、ならびにＣＡＣ生物学へのＵＡＧ効果（特に、これまでに実証されていない）の検討に至った。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一態様によると、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を治療有効量で被験体に投与することを含む、被験体の心血管疾患を治療するための方法に関する。
【００１７】
別の一態様によると、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を治療有効量で被験体に投与することを含む、被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための方法に関する。
【００１８】
別の一態様によると、本発明は、配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を治療有効量で被験体に投与することを含む、被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための方法に関する。
【００１９】
別の一態様によると、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の治療有効量を製薬上許容される担体と共に含む、心血管疾患治療における使用のための医薬組成物に関する。
【００２０】
別の一態様によると、本発明は、被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体に関する。
【００２１】
別の一態様によると、本発明は、被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体に関する。
【００２２】
別の一態様によると、本発明は、被験体の創傷治癒を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体に関する。
【００２３】
別の一態様によると、本発明は、移植関連生着を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体に関する。
【００２４】
別の一態様によると、本発明は、組織工学における使用のための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体に関する。
【００２５】
別の一態様によると、本発明は、被験体の心血管疾患治療のための医薬の調製における、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用に関する。
【００２６】
別の一態様によると、本発明は、被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用に関する。
【００２７】
別の一態様によると、本発明は、被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための医薬の調製における、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用に関する。
【００２８】
別の一態様によると、本発明は、被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための、治療有効量の配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用に関する。
【００２９】
別の一態様によると、本発明は、被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための医薬の調製における、治療有効量の配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】ＵＡＧの、糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を例証する。図１Ａでは、Ｓ期にあるＣＡＣの割合（％）をＦＡＣＳ分析により検討した。
【図１Ｂ】ＵＡＧの、糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を例証する。図１Ｂ〜１Ｆでは、ＣＡＣからのＲＯＳ産生を、示される期間にわたり測定した。
【図１Ｃ】ＵＡＧの、糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を例証する。図１Ｂ〜１Ｆでは、ＣＡＣからのＲＯＳ産生を、示される期間にわたり測定した。
【図１Ｄ】ＵＡＧの、糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を例証する。図１Ｂ〜１Ｆでは、ＣＡＣからのＲＯＳ産生を、示される期間にわたり測定した。
【図１Ｅ】ＵＡＧの、糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を例証する。図１Ｂ〜１Ｆでは、ＣＡＣからのＲＯＳ産生を、示される期間にわたり測定した。図１Ｅおよび１Ｆは、ＵＡＧ（６〜１３）、すなわちＵＡＧ断片も糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を有することを例証する。
【図１Ｆ】ＵＡＧの、糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を例証する。図１Ｂ〜１Ｆでは、ＣＡＣからのＲＯＳ産生を、示される期間にわたり測定した。図１Ｅおよび１Ｆは、ＵＡＧ（６〜１３）、すなわちＵＡＧ断片も糖尿病に関連した酸化ストレスからのＣＡＣ保護効果を有することを例証する。
【図２Ａ】ＵＡＧはＣＡＣ老化を予防することを例証する。図２Ａでは、老化の検討を、ＡＧＥ、ＵＡＧおよびＡＧＥ＋ＵＡＧと共に培養したＣＡＣの酸性β−ｇａｌ活性に基づき行なった。
【図２Ｂ】ＵＡＧはＣＡＣ老化を予防することを例証する。図２Ｂでは、ＡＧＥ、ＵＡＧ、およびＡＧＥ＋ＵＡＧと共に培養したＣＡＣを、示した抗体を用いたウエスタンブロッティング法によりアッセイした。
【図２Ｃ】ＵＡＧはＣＡＣ老化を予防することを例証する。図２Ｃでは、ＣＡＣをｐ５３ ｓｉＲＮＡまたはスクランブル配列でトランスフェクトした。
【図２Ｄ】ＵＡＧはＣＡＣ老化を予防することを例証する。図２Ｄでは、生理食塩水またはＵＡＧで処置した年齢および性別を適合した糖尿病患者由来ＣＡＣの酸性β−ｇａｌ活性を検討した。
【図２Ｅ】ＵＡＧはＣＡＣ老化を予防することを例証する。図２Ｅでは、上記のとおり処置した糖尿病患者から採取したＣＡＣを、示した抗体を使用したウエスタンブロッティング法によりアッセイした。
【図３Ａ】ＵＡＧによるＣＡＣの動員誘発および動脈特異化を例証する。図３Ａでは、２型糖尿病患者から採取したＣＡＣの代表的なＦＡＣＳ分析によりＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１４６およびＣＤ１０５の発現を分析した。
【図３Ｂ】ＵＡＧによるＣＡＣの動員誘発および動脈特異化を例証する。図３Ｂでは、生理食塩水またはＵＡＧもしくはＡＧ処置後に健常ドナー（Ｎ）および糖尿病患者（Ｄ）から採取したＣＡＣを計数した。
【図３Ｃ】ＵＡＧによるＣＡＣの動員誘発および動脈特異化を例証する。図３Ｃでは、Ｓ期にある細胞の割合（％）を、ＵＡＧ、ＡＧもしくは生理食塩水で処置した糖尿病患者（Ｄ）または健常被験体（Ｎ）由来のＣＡＣについて検討した。
【図３Ｄ】ＵＡＧによるＣＡＣの動員誘発および動脈特異化を例証する。図３Ｄでは、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲを、２型糖尿病患者または健常ドナー由来でかつ上記のとおり培養したＣＡＣ細胞において実施した。示した動脈および静脈マーカーを検討した。
【図４Ａ】ＵＡＧは、糖尿病マウスにおいてＣＡＣ動員を誘発し、ＵＡＧに曝露したＣＡＣは血管新生細胞として作用することを例証する。図４Ａでは、糖尿病マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤおよびｏｂ／ｏｂ）からまたはｗｔマウスから採取したＣＡＣのＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３３およびＫＤＲ発現を分析した代表的なＦＡＣＳ分析を報告する。
【図４Ｂ】ＵＡＧは、糖尿病マウスにおいてＣＡＣ動員を誘発し、ＵＡＧに曝露したＣＡＣは血管新生細胞として作用することを例証する。図４Ｂでは、ＵＡＧもしくは生理食塩水での処置後にＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ｏｂ／ｏｂおよびｗｔマウスから採取した血液を分析した。
【図４Ｃ】ＵＡＧは、糖尿病マウスにおいてＣＡＣ動員を誘発し、ＵＡＧに曝露したＣＡＣは血管新生細胞として作用することを例証する。図４Ｃでは、ＵＡＧ処置または非処置の異なるマウスモデルから得たＣＡＣについて、Ｓ期にある細胞の割合（％）をＦＡＣＳ分析により検討した。
【図４Ｄ】ＵＡＧは、糖尿病マウスにおいてＣＡＣ動員を誘発し、ＵＡＧに曝露したＣＡＣは血管形成細胞として作用することを例証する。図４Ｄでは、上記のとおり培養した、マウスモデル由来ＣＡＣにおいてＱ−ＲＴ−ＰＣＲを実施した。示した動脈および静脈マーカーを検討した。
【図４Ｅ】ＵＡＧは、糖尿病マウスにおいてＣＡＣ動員を誘発し、ＵＡＧに曝露したＣＡＣは血管新生細胞として作用することを例証する。図４Ｅでは、ＳＣＩＤマウスに移植後に回収したＩＬ−３および標識したＣＡＣを含むマトリゲルプラグの免疫組織化学的分析を示す。パネルａ（左）は生理食塩水処置後に回収したＣＡＣに対応し、パネルｂ（右）はＵＡＧ処置後に対応する。機能的血管を形成するＣＡＣの能力をパネルａに報告する。黒色矢印は陽性ＣＡＣ細胞を示す。
【図４Ｆ】ＵＡＧは、糖尿病マウスにおいてＣＡＣ動員を誘発し、ＵＡＧに曝露したＣＡＣは血管新生細胞として作用することを例証する。図４Ｆでは、回収したマトリゲルプラグは、大多数の血管がその内部をヒトＨＬＡクラスＩ陽性細胞に覆われていることを示す。ヒトまたは宿主由来血管数をヒストグラムにて報告する。
【図５Ａ】ＵＡＧ（ＵＡＧ（１〜２８））およびＵＡＧ（６〜１３）断片はＣＡＣ膜上に結合部位を有することを例証する。
【図５Ｂ】ＵＡＧ（ＵＡＧ（１〜２８））およびＵＡＧ（６〜１３）断片はＣＡＣ膜上に結合部位を有することを例証する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
参照を容易にするため、全体を通して下記の略記および記号を用いる：
ＡＧ グレリンまたはアシル化グレリン
ＵＡＧ 非アシル化グレリンまたはＤｅｓ−アシルグレリン
ＵＡＧ（６〜１３） 配列番号１の残基６〜１３を有する非アシル化グレリン
ＧＨＳＲ 成長ホルモン分泌促進因子受容体
ＣＡＣ 循環血中の血管新生細胞
ＥＰＣ 血管内皮前駆細胞
ＡＧＥ 最終糖化産物
ＢＭ 骨髄
ＶＥＧＦ 血管内皮増殖因子
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞選別
ＲＯＳ 活性酸素種。
【００３２】
血管リモデリング障害は糖尿病環境において記載されている（参考文献３２、３３）。１型または２型糖尿病患者の両方において、ＥＰＣ数は低減し、ＥＰＣの機能的能力は損なわれる（参考文献１５、３２）。有害な代謝ストレス因子が機能活性障害を主に引き起こし、動脈損傷部位へのＣＡＣ補充を低減すると考えられる（参考文献１５、３４）。
【００３３】
血管成長誘発はいくつもの病的状態において魅力的な治療戦略を成す。心血管リスク因子（糖尿病または肥満など）はＥＰＣ利用能を低下させるという所見により、理論上それを最も必要とする患者の細胞療法による治療能が制限される。
【００３４】
本明細書で定義した発明は、ＵＡＧにより処置した細胞のインビボでの血管形成能に示されるように、ＵＡＧは、とりわけ、代謝ストレス因子を予防し、ＣＡＣの数および機能活性を修復できるという証拠を提供する。
【００３５】
本発明は、ＣＡＣに対するＵＡＧ効果という予期せぬ発見に関する。より詳細には、ＵＡＧはＣＡＣを動員し、ＣＡＣを酸化ストレスもしくは糖尿病に関連した酸化ストレスから保護し、ＣＡＣの促進された老化発現を低減し、ＣＡＣ機能活性を修復し、ＣＡＣ数を増加させ、生理状態および糖尿病環境の両方においてＣＡＣ中のＲＯＳ産生を予防し、ＣＡＣと結合するおよび／もしくはＣＡＣの機能障害を救済するという予期せぬ発見に関する。
【００３６】
したがって、本研究は、心血管リスクのある被験体もしくは患者の血管リモデリング障害を改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）または改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）ため、または心血管疾患もしくは虚血性疾患を呈する被験体もしくは患者を治療するため、ＣＡＣ数を増加させてＣＡＣ機能を改善するため、生着を改善するため、移植（例えば、臓器またはその一部の）関連もしくは移植後の生着を改善するため、インビトロまたは生体外組織工学（限定されないが、血管工学など）に用いるためまたは組織工学を促進するため、創傷治癒を改善するため、糖尿病患者（糖尿病性潰瘍を呈する糖尿病患者など）の創傷治癒を改善するためにＵＡＧを新規の治療戦略として使用できるという証拠を提供する。
【００３７】
別段の定めのない限り、本明細書で用いるすべての専門用語および科学用語は本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味である。
【００３８】
非アシル化グレリン、その断片およびその類似体
本発明の目的のため、次の用語を以下に定義する。本出願において、「グレリン」および「アシル化グレリン」または「ＡＧ」という用語は同義的に用い、同じ意味を有する。
【００３９】
用語「非アシル化グレリン」または「ＵＡＧ」とは、配列番号１（１−ＮＨ２Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−２８；配列番号１）に指定のアミノ酸配列を有するペプチドを意味することを意図している。ＵＡＧは、ＵＡＧ（１〜２８）とも呼び得る。
【００４０】
非アシル化グレリンの天然の変異体としては、コードするグレリン遺伝子もしくはその対立遺伝子のヌクレオチド配列の不連続的変化のため、または転写ＲＮＡの代替的スプライシングにより生じた１つもしくは複数のアミノ酸の置換、追加または欠失を含むペプチドが挙げられる。この変化は非アシル化グレリン変異型の特性、薬理的および生物学的性質に実質的に影響を及ぼさないことが理解される。それらのペプチドは塩の形態であり得る。特にその分子の酸性機能は、その塩誘導体（限定されないが、トリフルオロアセタート塩など）によって置換され得る。
【００４１】
「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、または化学的修飾、または非天然もしくは異常アミノ酸（Ｄ−Ｔｙｒ、オルニチン、アミノ−アジピン酸など）を含むかを問わない任意のアミノ酸鎖を意味する。これらの用語は、本出願で同義的に用いる。
【００４２】
「断片」または「その断片」という用語は、ペプチド（非アシル化グレリンなど）のアミノ酸断片を指す。非アシル化グレリン断片は２８個のアミノ酸残基より短い。したがって、非アシル化グレリン断片は、長さ２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個または４個のアミノ酸残基であり得る。例えば、ＵＡＧ断片は、
配列番号２として示される配列番号１の残基１〜１４（（ＵＡＧ１〜１４）；Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ）；
配列番号３として示される配列番号１の残基１〜１８（（ＵＡＧ１〜１８）；Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ）；
配列番号４として示される配列番号１の残基１〜５（（ＵＡＧ１〜５）；Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）；
配列番号５として示される配列番号１の残基１７〜２８（（ＵＡＧ１７〜２８）；Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）；
配列番号６として示される配列番号１の残基６〜１３（（ＵＡＧ６〜１３）；Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ）；
配列番号７として示される配列番号１の残基８〜１３（（ＵＡＧ８〜１３）；Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ）または
配列番号８として示される配列番号１の残基８〜１２（（ＵＡＧ８〜１２）；Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ）またはその類似体
を有し得る。
【００４３】
ＵＡＧの生物学的活性を保持する他の任意のＵＡＧ断片が本発明に包含される。いくつかのＵＡＧ断片は、米国特許出願シリアル番号第２００８０３１２１３３号および国際公開特許第２００８／１４５７４９号に報告されている。
【００４４】
本発明のいくつかの態様では、ポリペプチドは、「精製された」、「単離された」または「実質的に純粋」形態で用いられる。ポリペプチドが「精製された」、「単離された」または「実質的に純粋」であるのは、天然で伴う成分から分離された場合である。典型的には、化合物は、試料中総物質の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量％）の場合に実質的に純粋である。
【００４５】
「非アシル化グレリンの類似体」、「非アシル化グレリン断片の類似体」または「その類似体」という用語は、非アシル化グレリンもしくはその断片の構造類似体および機能的類似体の両方を指し、とりわけ、本出願に記載のＵＡＧの生体機能において（限定されないが、心血管疾患の予防および治療において、本出願に記載のＣＡＣ細胞を酸化ストレスからもしくは糖尿病に関連した酸化ストレスから保護することにおいて、血管リモデリングおよび新血管形成を促進することにおいて、ＣＡＣ数を増加させるにおいて、ＣＡＣ機能を改善することにおいて、ＣＡＣを酸化ストレスから保護し、ＣＡＣ中のＲＯＳ産生を予防することにおいて、生理状態および糖尿病環境の両方にてＣＡＣの促進された老化発現の阻害に関連した酸化ストレスから保護することにおいて、ＣＡＣ膜へ結合することにおいて、ならびにＣＡＣ動員の亢進および／もしくはＣＡＣ機能障害の救済においてなど）ＵＡＧと置き換えることができるものである。したがってかかる構造および機能的類似体は本出願に記載の疾患における治療利益を実現するために有用となる。
【００４６】
単純な構造類似体は、配列番号１に示される非アシル化グレリンとの相同性または任意のその断片との相同性を示すペプチドを含む。グレリン類似体の一例は、グレリン−２８（配列番号１）のアイソフォーム、すなわちｄｅｓ Ｇｌｎ−１４グレリン（ｎ−オクタン酸によって修飾されたセリン３を保有する２７アミノ酸のペプチド）であり胃に存在することが示された。それは、類似した結合親和性でＧＨＳＲ−１ａに結合する点でグレリンと機能的に同一であり、クローン化細胞内のＣａ２＋流動性を引き出し、グレリン−２８と類似した効力でＧＨ分泌を誘発する。ＵＡＧは機能的にＵＡＧと同じであるｄｅｓ Ｇｌｎ−１４ ＵＡＧも有することが予期される。
【００４７】
ＵＡＧの好ましい類似体およびＵＡＧ断片の好ましい類似体は、保存的アミノ酸置換（すなわち、別の類似の性質を有する一残基との置換）により天然ＵＡＧ配列と、もしくは天然ＵＡＧ断片配列と異なるものである。典型的な置換としては、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕとＩｌｅ間の置換；ＳｅｒとＴｈｒ間；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕ間；ＡｓｎとＧｌｎ間；塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ間；ならびに芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒ間の置換が挙げられる。いくつもの類似体のうち特に好ましいものは、例えば、５〜１０個、１〜５個、または１〜２個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは任意の組み合わせで追加されているものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＵＡＧ類似体は、ＵＡＧ配列が１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、欠失、もしくは追加、またはそれらの組み合わせにより異なり得る。
【００４８】
本明細書では、本明細書に記載のアミノ酸配列とその配列全長にわたり少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同の配列を有し、ＵＡＧの少なくとも１つの代謝効果もしくは生物学的活性を共有する本発明のペプチド類似体を提供する。当業者は非アシル化グレリンの類似体配列または非アシル化グレリン断片の類似体配列を容易に同定するであろう。
【００４９】
ＵＡＧ類似体もしくはその断片の類似体は、例えば、Ｄ−アミノ酸もしくは合成アミノ酸との置換により、またはペプチド環化によりアラニン走査から得られる類似体である。ＵＡＧもしくはその断片の類似体は、非天然コードアミノ酸を含み得、非天然コードアミノ酸とは、一般的なアミノ酸の１つまたはピロリジンもしくはセレノシステインではないアミノ酸、または天然コードアミノ酸（限定されないが、２０個の一般的なアミノ酸、またはピロリジンおよびセレノシステインなど）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって産生されるが、複合体の翻訳による成長ポリペプチド鎖に組み込まれていないアミノ酸を指す。かかる非天然アミノ酸の例としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニンおよびＯ−ホスホチロシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書で用いる「修飾」という用語は、付与されたポリペプチドに対して行なわれる任意の変化（ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造、ポリペプチドの翻訳時修飾、または翻訳後修飾など）を指す。
【００５１】
「翻訳後修飾」という用語は、ポリペプチド鎖に組み込まれた後のアミノ酸に起こる天然または非天然アミノ酸の任意の修飾を指す。この用語は、例としてのみ挙げると、インビボ翻訳時修飾、インビトロ翻訳時修飾（無細胞翻訳系など）、インビボ翻訳後修飾、およびインビトロ翻訳後修飾を含む。翻訳後修飾例としては、本発明のペプチドの特定のＣ末端エステルおよびＮ−アシル誘導体のグリコシル化、アセチル化、アシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、また塩、アミド類もしくはエステルの追加が挙げられるが、これらに限定されない。翻訳後修飾の種類は周知である。
【００５２】
本発明による特定のペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端が直接、またはリンカー部分の挿入を通じてヘッドツーテイル（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）結合した環状型でもあり得、かかる部分自体が、通常１つまたは複数のアミノ酸残基を必要に応じて含み、非環状型に関してペプチドの三次元構造の改変を避ける形で骨格に接合する。かかるペプチド誘導体は、非環状ペプチドに関連して改善された安定性およびバイオアベイラビリティを有し得る。
【００５３】
ペプチドを環化するための方法は当該分野において周知であり、例えば、２側鎖の官能基間のジスルフィド結合形成、１本側鎖の官能基と骨格α−アミノ官能基もしくはカルボキシル官能基間のアミドもしくはエステル結合形成、２本側鎖の官能基間のアミドもしくはエステル結合形成、または骨格α−アミノ官能基とカルボキシル官能基間のアミド結合形成によって達成することができる。これらの環化反応は溶液中で高希釈にて慣習的に行なわれている。環化は一般的にペプチドが樹脂に結合する間に成される。最も一般的な固体支持体上における環状ペプチド合成方法の１つは、アミノ酸側鎖を樹脂に付着することである。好適な保護的戦略を用いて、鎖会合後の樹脂上にＣ末端およびＮ末端を選択的に脱保護および環化できる。この戦略は広く用いられており、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）または９−フルオレンイルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）プロトコールに適合する。しかしながら、この戦略は、固体支持体に機能的に付着するためには、好適な側鎖を含むペプチドに限定される。有効な環状ペプチド合成を成し遂げるために、多数のアプローチを用い得る。１つの環状ペプチド合成手順は、樹脂からの同時切断による環化に基づく。好適なペプチド配列が樹脂上の固体相合成により会合後、または直線状配列が樹脂に付着した後、無保護アミノ基はその固着活性結合と反応して保護環状ペプチドを産生できる。一般的に、標的環状ペプチドを得るために最終的な脱保護工程が必要とされる。
【００５４】
ラクタム化は、環化の一形態であり、Ｆｍｏｃ合成を用いてラクタム架橋を形成するために行うことができ、側鎖に異なる保護基を有するアミノ酸（限定されないが、βエステル位でアリルエステルに保護されたアスパラギン酸（またはグルタミン）（またはγエステル位で保護されたグルタミン酸）およびＮ−εでアリルオキシカルバミン酸に保護されたリジン）を導入し得る。合成終了時、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、またはその他のＡｌｌｏｃと異なる保護基で保護されたペプチドＮ末端と、アスパラギン酸およびリジンのａｌｌｙｌ保護基およびａｌｌｏｃ保護基は、例えば、パラジウム（０価）により脱保護され得、その後ＰｙＡＯＰ（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスファート）を用いて環化され、ラクタム架橋を産生することができる。
【００５５】
別に示さない限り、本明細書でのアミノ酸はＬ型を指す。アミノ酸を説明するために、当該分野において十分認知されている略記を用い、それには、左旋性アミノ酸（Ｌ−アミノ酸またはＬまたはＬ型）および右旋性アミノ酸（Ｄ−アミノ酸またはＤまたはＤ型）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、ならびにバリン（ＶａｌまたはＶ）などが含まれる。天然ペプチド配列中のＬ−アミノ酸残基は、一般的にタンパク質に認められる２０個のＬ−アミノ酸の任意の１個または稀なアミノ酸であるＤ−アミノ酸に対応する任意の１個（限定されないが、４−ヒドロキシプロリンまたはヒドロキシリジンなど）、または非タンパク質アミノ酸（Ｐ−アラニンまたはホモセリンなど）に改変され得る。
【００５６】
ＵＡＧペプチドは、融合タンパク質の一部でもあり得る。分泌もしくはリーダー配列、プロ配列、精製に役立つ配列（複数のヒスチジン残基など）、または組換え産生中の安定性のための追加配列を含む追加アミノ酸配列を含有することがしばしば有利である。
【００５７】
ＵＡＧの生物学的活性を保持する他の任意のＵＡＧの類似体もしくはその断片、またはその他の任意の修飾されたＵＡＧもしくはその断片が、本発明に包含される。
【００５８】
ＵＡＧの機能類似体、および構造類似体またはその断片を得るための一般的な方法および合成戦略が一般的に用いられており、当該分野において周知であり、次の刊行物などに記載されている：“Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ” 編， Ｍ．Ｗ．Ｐｅｎｎｉｇｔｏｎ＆Ｂ．Ｍ．Ｄｕｎｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ３５． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ＮＪ．，１９９４； “Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” ｂｙ Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｗ．ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， １９６９ ａｎｄ Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ； ａｎｄ “Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ” Ｖｏｌ．２， ｐ．２５５ ｅｔ ｓｅｑ． （（編）Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｈｉｌｌ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７６．。
【００５９】
本明細書で用いる「相同性」という用語は、同等の生物学的活性を保持する２個のペプチド間の配列類似性を指す。相同性は、整列させた配列の各位置を比較することによって決定できる。アミノ酸配列間の相同性の程度は、配列の共通位置で同一もしくは適合するアミノ酸数の関数であり、したがって「相同配列」は相同性および同等の機能もしくは生物学的活性を共有する配列を指す。相同％の評価は当業者にとって既知である。
【００６０】
ペプチドの相同性、同一性および類似性を決定するための方法は公衆に利用可能なコンピュータプログラムによりコーディングされている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するのに好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩおよびその他のサイトから公衆に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために用い得る。
【００６１】
ポリペプチド配列比較のために好ましいパラメーターとしては、下記：
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ： Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８： ４４３−４５３ （１９７０）；
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＳＵＭ６２ ｆｒｏｍ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８９：１０９１５−１０９１９ （１９９２）； Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ： １２； Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ： ４
が挙げられる。
【００６２】
これらのパラメーターを用いる有用なプログラムはＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）から「ギャップ」プログラムとして公衆に利用可能である。上記パラメーターはアミノ酸配列比較のためのデフォルトパラメーターである（エンドギャップに対するペナルティなし）。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、当該分野において既知である任意の適切な方法によって調製し得る。かかるポリペプチドとしては、単離された天然ポリペプチド、組換え産生ポリペプチド、合成ポリペプチド、またはこれらの方法を併用して産生したポリペプチドが挙げられる。かかるポリペプチドを調製するための手段および方法は当該分野において周知である。
【００６４】
本発明の特定の態様ではＵＡＧポリヌクレオチドを用いる。ＵＡＧポリヌクレオチドとしては、本出願で定義したＵＡＧポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、断片および類似体が挙げられる。
【００６５】
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、複数のデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオシドサブユニットから成る１分子を指す。ヌクレオシドサブユニット間の結合は、ホスフェート、ホスホネート、ホスホアミデート、ホスホロチオエートなどによって、または当該分野において既知である非リン酸基（ペプチド核酸（ＰＮＡ）中で利用されるペプトイド型の結合など）によって得られる。結合基はキラルまたはアキラルであり得る。オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの長さは２個のヌクレオシドサブユニット〜数百もしくは数千個のヌクレオシドサブユニットの範囲であり得る。オリゴヌクレオチドは好ましくは長さ５〜１００個のサブユニット、より好ましくは、長さ５〜６０個のサブユニットであるが、ポリヌクレオチドはさらに長くなり得る（例えば、最大１００個）。ポリヌクレオチドは、任意のＤＮＡおよびＲＮＡであり得る。ＤＮＡは細胞もしくは組織由来のゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ、ｃＤＮＡであり得、ならびに合成ＤＮＡの任意の形態であり得る。さらに、本発明は、特定の態様においてベクター（バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、またはファージミドなど）を用い得る。
【００６６】
「生物学的活性」もしくは「生物学的特性」という語句、または「活性」という用語は、本発明のポリペプチドに関して言及する場合、本明細書中で同義的に用いられ、本発明のポリペプチドの薬理的、生物学的または細胞性能を指し、ＵＡＧの生体機能において（限定されないが、心血管疾患の予防および／もしくは治療において、ＣＡＣ細胞の酸化ストレスからもしくは糖尿病関連酸化ストレスからの保護において、血管リモデリングおよび新血管形成の促進において、ＣＡＣ数の増加において、ＣＡＣ機能の改善において、ＣＡＣの酸化ストレスからの保護において、生理状態および糖尿病環境の両方でのＣＡＣ内ＲＯＳ産生の予防において、ＣＡＣの促進された老化発現の阻害に関連した酸化ストレスからの保護、ＣＡＣ膜への結合において、ならびにＣＡＣ動員の亢進および／もしくはＣＡＣ機能障害の救済において）ＵＡＧと置き換える能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
治療的使用および治療
一態様では、本発明は、心血管疾患もしくは虚血性疾患発症リスクのある患者または発症患者などの被験体を治療するための方法を提供する。本発明は、被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための方法も提供する。さらなる一態様では、本発明は、被験体のＣＡＣ数を増加させるおよびＣＡＣ機能を改善するための方法を提供する。本発明は、生着を改善する、より詳細には移植（例えば、組織または臓器または任意のその一部の）関連もしくは移植後の生着を改善するための方法も提供する。本発明は、創傷治癒を改善し、生着を改善するおよび／または組織工学を促進するための方法も提供する。
【００６８】
本明細書で用いる「治療」という用語は、治療上の処置、ならびに予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）および予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。治療を必要とするものには、疾患もしくは障害もしくは病態に既に罹患しているもの、ならびに疾患、障害もしくは病態が予防されるべきものが含まれる。治療を必要とするものは、疾患、障害もしくは病態を発症し、後遺症もしくは瘢痕が残ったものでもある。治療は、疾患、障害もしくは病態に関連した症状を改善（ｉｍｐｒｏｖｅ）もしくは改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）して疾患、障害もしくは病態の重症度を軽減するもしくは治癒する上で、または疾患、障害もしくは病態が起こるのを予防する上で有効な治療物質を投与することも指す。
【００６９】
一態様では、本発明の方法は、ＵＡＧ自体と同じ潜在的治療適応を共有する本明細書で定義したポリペプチドを治療有効量で被験体に投与する工程を含む。かかるポリペプチドは、上記のとおり、配列番号１に示されるアミノ酸配列、またはその任意の断片もしくはその任意の類似体（限定されないが、ＵＡＧ（６〜１３）、ＵＡＧ（８〜１２）およびＵＡＧ（８〜１３）断片など）を含む。
【００７０】
本発明のポリペプチドを投与されて恩恵を受ける被験体としては、心血管疾患もしくは虚血性疾患発症リスクのある被験体、または発症している被験体、または既往のある被験体が挙げられるが、これらに限定されない。かかる被験体は、例えば、１型もしくは２型糖尿病を呈する被験体および／または肥満を呈する被験体であり得る。
【００７１】
本明細書で用いる「心血管疾患」という用語は、心臓または血管（動静脈）に関与する疾患を指す。この用語は、心血管系に影響する任意の疾患を指す。この用語はアテローム性動脈硬化症（動脈疾患）に関連する疾患も指す。心血管疾患としては、動脈瘤、狭心症、不整脈、心筋症、脳血管発作（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心血管疾患、うっ血性心不全、心筋炎、弁膜障害、冠動脈疾患、拡張型心筋症、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（つまり高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ））、肥大型心筋症、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、静脈血栓塞栓症、虚血および創傷治癒が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
さらに、血管合併症、心血管疾患（代謝症候群もしくはＸ症候群に関連）または肥満、アテローム性動脈硬化症、原発性アテローム硬化性血管変性症（中心および末梢動脈症など）を呈する任意の被験体もしくは発症リスクのある被験体、または血管リモデリングを必要とするもしくは新血管形成を必要とする任意の被験体が本発明のポリペプチドを投与されて恩恵を受けるであろう。本明細書で用いる場合、Ｘ症候群という表現は、心血管疾患発症リスクを含む疾患の併発を指す。
【００７３】
「酸化ストレス」という用語は、活性酸素産生と、生体系の活性中間体を速やかに解毒する能力もしくは生じた損傷を容易に修理する能力の間の不均衡を指す。
【００７４】
ＣＡＣ数増加および／もしくはＣＡＣ機能改善の恩恵を受けるであろう任意の被験体もしくは患者が本発明のポリペプチド投与の恩恵を受ける。
【００７５】
ＣＡＣ数とは、骨髄から血管リモデリング部位および／もしくは新生血管形成部位へ回帰するＣＡＣの量もしくは濃度を指す。
【００７６】
ＣＡＣ機能とは、ＣＡＣが内皮化部位に動員し（ＣＡＣ動員）、内皮細胞に分化し、内皮化に関与する特性を指す。ＣＡＣ機能改善とは、ＣＡＣ機能をより望ましい状態にすることを指し、例えば、ＣＡＣ動員を改善するとは、ＣＡＣ動員をより望ましい状態にすることを指す。
【００７７】
血管リモデリングもしくは血管修復を必要とするおよび／または新生血管形成を必要とする任意の被験体も本発明のポリペプチドを投与されて恩恵を受けるであろう。
【００７８】
「血管リモデリング」もしくは「血管修復」という用語は、成熟血管の直径、厚さ、もしくは構造における任意の持続的変化を指す。「血管リモデリング」という用語は、側副血管形成も含む。例えば、アテローム性動脈硬化症において、血管リモデリングは代償機序として作用し、動脈の狭窄（ｓｔｅｎｏｓｉｓ）または狭窄（ｎａｒｒｏｗｉｎｇ）を惹起する傾向にあるプラーク成長に対峙して血流を保持する。
【００７９】
「新血管形成」という用語は、赤血球細胞の血流を伴う機能性微小血管網の形成を指す。
【００８０】
血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成の改善とは、血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成をより望ましい状態にすることを指す。
【００８１】
本発明のポリペプチドは、移植（例えば、細胞、組織および／もしくは臓器またはその一部の）レシピエント（動物もしくはヒトなど）における生着を促進するために有用でもある。本明細書で用いる「生着」という用語は、宿主体内に移植した組織の取り込みを指す。本明細書で用いる「生着」という用語は、移植した幹細胞もしくは骨髄細胞が骨髄へ移動し、血液細胞の産生を開始するプロセスも指す。
【００８２】
本明細書に記載のポリペプチドは、再生医療もしくは組織工学において完全臓器もしくはその一部（例えば、心臓、血管、骨髄など）の組織機能を修復、維持、もしくは改善する生体置換を展開させるためにも有用である。「組織工学」という表現は、十分に機能する単位として移植できる、または成長して移植後に必要な機能を実施し得る天然もしくは合成臓器および組織の産生も指す。再生医療または組織工学の方法は当業者に既知である。
【００８３】
本明細書で定義したポリペプチドは創傷治癒を改善するためにも有用である。特定だが非制限的な例として、本明細書で定義したポリペプチドは、糖尿病患者の創傷治癒の改善（糖尿病性潰瘍治癒の改善など）にも有用である。
【００８４】
「代謝障害」という用語は、炭水化物代謝障害、アミノ酸代謝障害、有機酸代謝障害(有機酸尿)、脂肪酸酸化およびミトコンドリア代謝障害、ポルフィリン代謝障害、プリンもしくはピリミジン代謝障害、ステロイド代謝障害、ミトコンドリア機能障害、ペルオキシソーム機能障害、ならびにリソソーム保存障害を指すが、これらに限定されない。
【００８５】
「代謝症候群」という用語は、心血管疾患および糖尿病リスクを増加させる疾患の合併を指す。
【００８６】
本発明のさらなる一態様は、本明細書で定義したポリペプチドを少なくとも１つ包含する任意の医薬組成物を提供することである。
【００８７】
治療的および／もしくは製薬学的使用のため、本明細書で定義したポリペプチドは、従来の方法により、静脈内、皮下、経皮的、局所的、経口、口腔、舌下、経鼻的、吸入、経肺的、もしくは非経口投与用に製剤化し得るが、これらに限定されない。静脈内注射は、従来の期間にわたるボーラスまたは注入であり得る。本明細書で定義したポリペプチドは、被験体の標的部位に（例えば、内部もしくは外部標的部位へのバイオリスティック送達によって、または動脈内部位へのカテーテルによって）直接投与もし得る。
【００８８】
活性成分（本明細書で定義したポリペプチドなど）は、懸濁液として経口投与するために医薬品製剤分野において周知である技術により調製でき、微結晶セルロース（大量付与のため）、アルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウム（懸濁化剤として）、メチルセルロース（増粘剤として）、および甘味料／香料剤を含み得るが、これらに限定されない。即時放出錠剤として、これらの組成物は、微結晶セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよびラクトースおよび／もしくは他の賦形剤、結合剤、増量剤、錠剤分解物質、希釈剤および滑沢剤を含み得るが、これらに限定されない。活性成分は、制御放出送達系により投与し得る。
【００８９】
経鼻的に投与されるエアゾールもしくは吸入製剤は、例えば、生理食塩水溶液として、ベンジルアルコールもしくはその他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを増強する吸収プロモーターを用いて、過フッ化炭化水素を用いて、および／またはその他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて調製し得る。
【００９０】
本発明のポリペプチドは、静脈内（ボーラスおよび注入の双方）、腹腔内、皮下、局所的（閉塞ありまたはなしで）、または筋肉注射形態で投与し得る。注射投与時、注射溶液もしくは懸濁液は、当該分野において周知である適切な非毒性、許容可能な非経口希釈剤もしくは溶媒を用いて製剤化し得る。
【００９１】
本発明のポリペプチドは、局所投与用に製剤し得る。本明細書で用いる「局所的」という用語は、その化合物が皮膚または粘膜組織を覆うようにする任意の投与経路である。本明細書で定義したポリペプチドの局所投与は、例えば、被験体の創傷治癒を改善するため、または創傷治療を改善するため、またはその場（ｉｎ ｓｉｔｕ）での治療のために有用である。
【００９２】
局所塗布に適した製剤は、例えば、クリーム、ローション、溶液、ゲル、軟膏、泥膏、硬膏、ペイント、生体付着剤などの形態であり得、および／またはリポソーム、ミセル、微粒子および／またはミクロスフェアを含むように調製し得る。この製剤は、水性（すなわち、含水）でも非水性でもよく、体表面に塗布時および塗布後に体表面から蒸発する水分が製剤中に維持されるよう、任意に閉塞性オーバーレイと組み合わせて用い得る。
【００９３】
軟膏は、医薬品製剤分野において周知であるとおり、典型的にはワセリンまたは他のワセリン誘導体に基づく半固体調製物である。用いられる特定の軟膏基剤は、当業者が理解するであろうとおり、本明細書で定義したポリペプチドの最適な送達を提供し、および、好ましくは、他の所望の性質（例えば、皮膚柔軟化など）も同様に提供するものである。当該分野においてやはり周知であるクリームは、粘稠液または半固体エマルション（水中油型または油中水型のいずれか）である。クリーム基剤は水洗可能であり、油相、乳化剤、および水相を含む。医薬品製剤分野の従事者に理解されるであろうとおり、ゲルは半固体、懸濁液類系である。単相ゲルは、担体液体（典型的には水性だが、好ましくは、アルコールも含み、任意に、油も含む）全体に実質的に均一に分布した有機高分子を含む。ローションは、化粧剤の送達に好ましく、調製物を摩擦なく皮膚表面へ適用し、典型的には液体もしくは固体粒子（活性薬剤を含む）中の半液体調製物であり、水もしくはアルコール基剤に存在する。ローションは通常、固体の懸濁液である。泥膏は活性薬剤が適切な基剤中に懸濁された半固体用量形態である。基剤の性質に応じて、泥膏は脂肪泥膏または単相水性ゲル製に分類される。硬膏はペースト状混合物を含み、直接または基材材料（布など）に飽和した後に体上に広げられる。本発明の製剤は、硬膏中に溶解または分散して薬用硬膏を形成し得る。生体付着剤は体組織表面に付着する調製物である。ポリマー生体付着製剤は当該分野において周知である。
【００９４】
製剤は、リポソーム、ミセル、微粒子および／またはミクロスフェアと共に調製してもよい。リポソームは脂質二重層を含む脂質壁を有する微小胞であり、薬物送達系として使用できる。ミセルは、それらの極性頭基が外部球殻を形成して、疎水性炭化水素鎖が球の中心に向かって配向して核を形成するように調整された界面活性剤分子を含むことが当該分野において既知である。微粒子はミクロ径の範囲の粒子担体系であり、普通、ポリマーで調製され、通常、粒子中に捕捉されている薬物もしくはワクチンの送達系として使用できる。ミクロスフェアも同様に、本明細書の製剤および薬物送達系に包含し得る。リポソームおよびミセルと同様、ミクロスフェアは本質的に薬物、または製剤含有薬物を封入する。ミクロスフェアは通常、合成または天然生体適合ポリマーから形成されるがこれは必須ではなく、荷電脂質（リン脂質など）も含み得る。
【００９５】
局所投与用に適した製剤の調製は、当該分野において周知であり、関連文章および文献に記載されている。
【００９６】
一般的に、医薬組成物は、当業者に周知であろう製薬上許容される担体と共に本発明のポリペプチドを少なくとも１つ含む。この組成物はさらに、例えば、１つまたは複数の適切な賦形剤、希釈剤、充填剤、可溶化剤、防腐剤、塩、緩衝剤および当該分野において周知であるその他の材料を利用する投与形態に応じて含み得る。配合方法は当該分野において周知である。
【００９７】
本明細書の文脈において、「製薬上許容される担体」という用語は、いずれの治療効果および／または予防効果も、それ自体が実質的に有さず、かつ非毒性であるという意味で不活性である任意の材料を示すことを意図している。製薬上許容される担体は、許容可能な技術的性質を備える医薬組成物を得ることを可能にするために本発明のポリペプチドに添加し得る。
【００９８】
かかる担体の例としては、イオン交換、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（ホスフェートなど）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、または電解質（硫酸プロタミンなど）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベース物質、およびＰＥＧが挙げられる。
【００９９】
局所的もしくはゲルベースの形態のポリペプチドのための担体としては、多糖類（ナトリウムカルボキシメチルセルロースまたはメチルセルロースなど）、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ＰＥＧ、およびウッドワックスアルコールが挙げられる。
【０１００】
インビボ投与用に用いられるポリペプチドは無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再調製の前または後の、無菌ろ過膜を通したろ過によって達成することができる。ポリペプチドは、普通は凍結乾燥形態または溶液中で保存される。治療のためのポリペプチド組成物は通常は無菌アクセスポートを備える容器（例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを備える静注用溶液袋または薬瓶）内に収容される。
【０１０１】
本明細書で定義する方法における使用のため、本発明は、以下を含む製品または市販パッケージまたはキットも提供する：容器、容器上のラベル、および容器内の、指定濃度で使用時に本発明のポリペプチドを活性薬剤として含む組成物であり、とりわけ、心血管疾患治療、ならびに／または血管リモデリングもしくは新血管形成の改善、ならびに／またはＣＡＣ数の増加およびＣＡＣ機能の改善、ならびに／または創傷治癒を改善するため、ならびに／または生着および／もしくは組織工学に用いるためもしくは組織工学を促進するために有効な組成物。容器上のラベルは、組成物を使用可能な対象を示す。
【０１０２】
「治療有効量」とは、投与量で必要な期間、所望の治療成果を得るのに有効な量を指す。本明細書に記載のペプチドの治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体内で所望の反応を引き起こす化合物の能力などの因子に応じて変わり得る。投与方法は、最適な治療反応を得るように調整し得る。また治療有効量では、化合物中の任意の毒性または有害作用より治療有益効果が上回る。「予防有効量」とは、投与量で必要な期間、所望の予防成果（インスリン値および／もしくはインスリン活性に関連する病態発症の予防もしくは阻害など）を成し遂げるための有効量を指す。予防有効量は、上で治療有効量のために説明したように決定できる。いかなる特定の被験体に対しても、特定の投与方法は、個体の必要性および組成物の投与者もしくは投与監督者の専門的な判断によって経時的に調整し得る。
【０１０３】
例えば、本発明のペプチド（本明細書で「活性化合物」とも呼ぶ）の治療有効量または有効量は、心血管リスクのある被験体もしくは患者の血管リモデリング障害を改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）もしくは改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）ため、または心血管疾患もしくは虚血性疾患を有する被験体もしくは患者を治療するため、生着を改善するため、臓器もしくはその一部の移植関連もしくは移植後の生着を改善するため、インビトロまたは生体外組織工学（限定されないが、血管工学など）に用いるためまたは組織工学を改善もしくは促進するため、創傷治癒を改善するため、糖尿病患者（糖尿病性潰瘍を呈する糖尿病患者など）の創傷治癒を改善するために十分な量である。かかるパラメーターを測定するための方法および／またはアッセイは当業者に既知である。
【０１０４】
本発明の治療有効量は通常、約０．００１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で変化し、より詳細には約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、およびさらにより詳細には約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲で変化する。この範囲外であるが所望の治療効果を有する治療有効量または有効量も本発明に包含される。
【０１０５】
一態様では、上記の被験体は哺乳動物であり、さらなる一態様では、ヒトである。
【実施例】
【０１０６】
実験およびデータ分析
下記に提示する実験およびデータ分析において、心血管リスクまたは疾患状況の再現を、糖尿病環境においていくつかの実験を実施することによって行なった。得られたデータから、ＣＡＣ生体機能障害に関連することが確定されている、または確定され得る他の生理状態または環境を推定し得ることを当業者は理解するであろう。
【０１０７】
ＣＡＣ細胞動員および代謝に対するＵＡＧの効果
Ｉ． ＵＡＧはＣＡＣを酸化ストレスから保護する
酸化ストレスは、糖尿病に関連した組織損傷（参考文献２１）および内皮損傷において主要な役割を担い、主に活性酸素種（ＲＯＳ）産生に依存する。ＵＡＧまたはＡＧが内皮細胞をアポトーシスから保護するという知見（参考文献８）から、ＣＡＣ生物学に対する両グレリンアイソフォームの効果の検討に至った。
【０１０８】
初めに、ＵＡＧおよびＡＧに応答する細胞周期進行を検討した。図１Ａに示すとおり、ＵＡＧ（ただしＡＧではない）はＳ期にある細胞の割合（％）を有意に増加させることができ、この効果は培養７日後でも依然として明白であった。この効果がベースラインＲＯＳ産生阻害に依存するか否かを調査するため、ＤＣＦ−ＤＡアッセイを実施した。結果（図１Ｂに報告）は、ＵＡＧ処理は未処理細胞と比較してＲＯＳ産生ベースライン値を著しく低減することを明らかにする。保護効果は、ＡＧ使用時には検出できなかった（図１Ｂ）。図１ＥはＵＡＧ断片、すなわちＵＡＧ（６〜１３）も未処理細胞と比較してＲＯＳ産生ベースラインレベルを低減することを明らかにする。Ｈ２Ｏ２を陽性対照として用いた。ＡＧＥ媒介性損傷シグナルは主にＲＯＳ産生に依存する（参考文献２９）。図１Ｃおよび１Ｆに表されるとおり、ＡＧＥ培養細胞中ＲＯＳ産生のレベルは、細胞をＵＡＧまたはＵＡＧ（６〜１３）断片でチャレンジした場合に低減した。上記の結果と一致し、ＡＧの効果は何も検出することができなかった。さらにこれらのデータを確認するため、ＣＡＣを２型糖尿病患者から単離し、ＵＡＧまたはＡＧの処理に供した。図１Ｄに報告するデータは、ＵＡＧ（ただしＡＧではない）は採取した糖尿病性細胞において細胞内ＲＯＳ産生を低減したことを明らかにする。
【０１０９】
ＩＩ． ＵＡＧはＣＡＣ老化を予防する
ＤＮＡ損傷だけでなく、ストレスに惹起されるシグナルも老化様成長停止を誘発する（参考文献３０）。ｐ５３、ｐ２１、およびｐＲｂは老化の主要な調節因子であり、一般的にＲＯＳ産生が上流シグナルとみなされる。促進された老化発現は糖尿病患者由来のＥＰＣ中に検出され得ることが既に示されている（参考文献２２）。上記のデータにより、ＲＯＳ産生が促進された老化発現に変わるか否か、およびＵＡＧがこの作用を救済できるか否かに関する検討に至った。
【０１１０】
この目的のため、ＡＧＥ処理（単独またはＵＡＧと併用）の効果を、ＳＡ−β−ｇａｌ活性について初めに検討した。ＲＯＳ産生結果と一致し、ＵＡＧは老化細胞数を減らすことができた（図２Ａ）。さらに、ＡＧＥで培養したＣＡＣにＵＡＧを添加した場合、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞数の有意な低減も検出できた（図２Ａ）。この事象の媒介におけるｐ５３、ｐ２１およびｐＲｂの役割は、ＵＡＧがＡＧＥ誘発性のｐ５３蓄積、ｐ２１発現およびＲｂのリン酸化を予防した観察結果によって支持される（図２Ｂ）。さらに、ＡＧＥ誘発性のｐ５３蓄積および老化様成長停止がｐ５３のサイレンシングによって予防された（図２Ｃ）。
【０１１１】
これらのデータをさらに確認するため、２型糖尿病患者をＵＡＧで処置した。処置の１２時間後、ＣＡＣをＵＡＧ処置患者および未処置患者から採取して培養した。図２Ｄおよび２Ｅに示すとおり、インビボ投与時、ＵＡＧは老化細胞数を低減し、ｐ５３の蓄積、Ｒｂのリン酸化およびｐ２１発現を予防した。これらのデータにより、ｐ５３が媒介するシグナル伝達経路は糖尿病環境においてＣＡＣ機能障害を引き起こし、ＵＡＧはこれらの事象を予防できることがさらに確認された。
【０１１２】
ＩＩＩ． ＵＡＧはＣＡＣ動員に影響を及ぼす
ＣＡＣは生理的にＢＭ内に存在し、微小環境変化に反応して循環血中に動員される。ＣＡＣ動員障害は心血管リスク因子の保因患者において報告されている（参考文献１９、３１）。
【０１１３】
この観察により、ＣＡＣのＢＭ動員に対するＵＡＧ処置の効果を調査するに至った。この目的のため、健常被験体および糖尿病患者を６時間、ＵＡＧもしくは生理食塩水で処置した。処置後、ＣＡＣを４例の対照被験体および４例の糖尿病患者から採取し、ＦＡＣＳ分析により分析して、計数した。図３Ａに示すとおり、ＵＡＧ処置患者から採取したＣＡＣのＦＡＣＳ分析により、ＣＤ４５マーカーの高発現、ＣＤ１４単球マーカーの低頻度ならびに内皮分化マーカーＣＤ１４６およびＣＤ１０５の未発現により、採取した細胞は実際にＣＡＣであることが実証された。黒線は陰性対照として用いた免疫前ＩｇＧを指し、灰色線は表面マーカー発現を示す。類似の結果が、未処置の糖尿病患者または未処置もしくは処置健常被験体由来のＣＡＣを分析時に得られた（データ未記載）。興味深いことに、ＵＡＧ処置（ただし、ＡＧ処置ではない）は、健常被験体と比較して、糖尿病患者において採取した細胞数をおおいに増加させた（図３Ｂ）。ＡＧまたは生理食塩水で処置した糖尿病患者と対照の間に統計的な差は検出されなかった。
【０１１４】
それらの血管特徴を確認するため、細胞を患者および対照から採取し、ＩＬ−３と共に培養した。ＩＬ−３は、末梢血由来およびＢＭ由来の両方のＣＤ４５＋細胞の増殖および動脈形態形成を誘発できる（参考文献２８）。図３Ｃに示すとおり、ＵＡＧで処置した糖尿病患者（ただし、ＡＧで処置した糖尿病患者ではない）から採取した細胞は増殖した。さらに、図３Ｄに報告するとおり、定量的（Ｑ）−ＲＴ−ＰＣＲにより動脈マーカー（Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ４）または静脈マーカー（ＥｐｈＢ４）で動脈形態形成を評価時、ＵＡＧ処置患者より得た細胞のみが動脈特異化できたことが認められた。これらのデータにより、糖尿病関連のＣＡＣ障害はＵＡＧ負荷によって救済できることがさらに示される。
【０１１５】
ＵＡＧで処置した患者および健常対照から得られたデータをさらに確認するため、２種の異なる糖尿病モデルマウスを用いた。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスおよびｏｂ／ｏｂマウスを生理食塩水もしくはＵＡＧで異なる時間間隔で処置した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルマウスおよびｏｂ／ｏｂモデルマウスは、当業者によく知られているであろう。
【０１１６】
処置後、細胞を採取し、ＦＡＣＳ分析によりアッセイし、計数して培養した。図４Ａに示すとおり、ＦＡＣＳ分析は、対応するヒトの場合と同様に、ＵＡＧで処置したｏｂ／ｏｂマウスから採取した細胞はＣＤ４５マーカーおよびＣＤ３１、ＫＤＲを発現したが、ＣＤ３３は発現しなかったことを示す。黒線は、陰性対照として用いた免疫前ＩｇＧを示し、灰色線は表面マーカー発現を示す。未処置の糖尿病マウスならびに未処置もしくは処置野生型マウス由来のＣＡＣを分析すると類似した結果が得られた（データ未記載）。さらに、非糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスとは異なり、糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでは、ＵＡＧ負荷により採取した細胞率（％）を増加できた（図４Ｂ）。循環ＣＡＣの増加した数はＵＡＧ負荷ｏｂ／ｏｂマウスにおいても検出できた。興味深いことに、ＵＡＧ処置ｏｂ／ｏｂマウスから採取した細胞数は、未処置野生型マウスのものに匹敵し、ＵＡＧがＣＡＣ数を正常な生理学的レベルまで十分に修復することを示す（図４Ｂ）。対応するヒトの場合と一致して、ＵＡＧ負荷マウスから採取したＣＡＣは増殖でき（図４Ｃ）、ＩＬ−３の存在下で培養時に動脈型を獲得した（図４Ｄ）。
【０１１７】
ＵＡＧの血管リモデリングおよび新血管形成効果
ＩＶ． ＵＡＧ処置は糖尿病性ＣＡＣ機能障害を救済する
新たに報告されたデータは、前駆細胞は、既存の血管構造に組み込まれて新生血管を形成し、血流を改善できることを示す（参考文献３３）。ＵＡＧで処置した糖尿病患者から採取したＣＡＣがそれらの血管能を救済するか否かを検討するため、新規の血管形成をインビボでアッセイした。この目的のため、未処置もしくはＵＡＧ処置患者から採取し、ＩＬ−３およびＣＳＦＥで標識したＣＡＣを含むマトリゲルプラグをＳＣＩＤマウスに注射し、注射１５日後にマトリゲルプラグを回収して免疫組織化学により分析した。結果（図４Ｅに報告）は、これらの標識された細胞の多くが、報告されているとおり、それらの内腔中赤血球によって機能性血管を形成したことを示す（図４Ｅ、パネルｂ（右））。一方、機能性血管は、未処置患者から採取したＣＡＣを使用した場合には検出できなかった（図４Ｅ、パネルａ（左））。新生血管が宿主起源の血管性細胞由来である可能性を排除するために、免疫蛍光アッセイを、抗ヒトＨＬＡクラスＩおよび抗マウスＭＨＣ−ＩＩ抗体を用いて実施した。大部分の血管がヒトＨＬＡクラスＩ陽性細胞で覆われていることが認められた（図４Ｆ）。したがって、これらのデータにより、ＵＡＧ処置はＣＡＣの利用能および血管リモデリング能力を改善するというさらなる証拠が得られた。
【０１１８】
Ｖ． ヒトＣＡＣ上のＵＡＧ結合部位の存在
ＣＡＣ膜上のＵＡＧの特異的結合部位の存在は、かかる結合部位に対しての、１００ｎＭ非標識ＵＡＧ（１〜２８）の［１２５Ｉ−Ｔｙｒ４］−ＵＡＧ（０．２５ｎＭ）との競合能力を検討することによって調査した。結合特異性も、１００ｎＭ ＡＧ（１〜２８）（アシル化グレリン）、ＵＡＧ（２８〜１）、生物学的不活性グレリン類似体、および合成ＵＡＧ（６〜１３）−ＮＨ２断片の存在下で試験した。この競合結合試験の結果（図５Ａ）は、［１２５Ｉ−Ｔｙｒ４］−ＵＡＧのＣＡＣ膜との結合はＵＡＧ（１〜２８）とＵＡＧ（６〜１３）の両方に阻害されたが、ＡＧ（１〜２８）またはＵＡＧ（２８〜１）には阻害されなかったことを明らかにした。［１２５Ｉ−Ｔｙｒ４］−ＵＡＧの特異結合（ＵＡＧ不在下、対照、およびＵＡＧ存在下の結合間の差として計算）は対照値の約７５％（Ｐ＜０．００１）を示し、２つの異なる細胞調製物由来の新鮮ＣＡＣ膜（０．２５および０．２６ｆｍｏｌ）または凍結融解ＣＡＣ膜（０．２０および０．３３ｆｍｏｌ）のいずれかで検出された。
【０１１９】
飽和結合実験を、この実験のために十分な量の膜を得られるＣＡＣ調製物由来の膜上で実施し、ＣＡＣ膜に対する放射性リガンドの特異的結合が飽和可能であり（図５Ｂ）、最大２ｎＭ、すなわち生理的循環ＵＡＧ濃度と一致する濃度に達したことが明らかにされた。これらのデータ（データ未記載）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析により、非アシル化グレリン結合部位の単一クラス（Ｈｉｌｌ係数１付近）のＣＡＣ細胞上の存在（Ｋｄ値０．４８ｎＭおよびＢｍａｘ値１０．７ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質）が示唆される。これらの結果により、ＵＡＧはＣＡＣ細胞と高親和性で結合できることが示される。
【０１２０】
材料および技術的プロトコール
患者および対照：６人の２型糖尿病患者（性別、男／女５／１例；ＨｂＡ１ｃ値８±１．２％；年齢６２．８±１２．４６歳；ＢＭＩ値２７．１±３．２２、クレアチニン値１．０４±０．２０ｍｇ／ｄＬ；腰囲（ｃｍ）９８．２±７．５２、総コレステロール値１９２±５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＤＬコレステロール値４６±１３．９８ｍｍｏｌ／Ｌ、ＬＤＬコレステロール値１１３±３９．７７ｍｍｏｌ／Ｌ、トリグリセリド値１５７．５±５４．２３、空腹時グルコース値１２６±１９．０４ｍｇ／ｄＬ、網膜症なし、高血圧３人、血圧１４１／８７ｍｍＨｇ；Ｃｈｏｌ／ａｐｏＢ値１．３±０．１）から採血した。すべての患者は食事療法のみで治療された（糖尿病患者による他剤の使用はなかった）。８人の血液ドナーを対照として用いた（性別、男／女４／４例；年齢２６．６±４．６５歳；ＢＭＩ値２１．１４±８．０８、クレアチニン値０．９６±０．０６３ｍｇ／ｄＬ、総コレステロール値１６２．１３±１０．７９ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＤＬコレステロール値４９±１０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、ＬＤＬコレステロール値８６．２５±１７．７２ｍｍｏｌ／Ｌ、トリグリセリド値１３２．１３±２７．１０、網膜症なし、高血圧例なし：血圧１２５／７０ｍｍＨｇ、Ｃｈｏｌ／ａｐｏＢ値１．６±０．１）。
【０１２１】
全被験体に次の検査セッションを施行した：
・ＵＡＧ（０〜１２時間目の１２時間、３．０μｇ／ｋｇ／時間ｉｖ注入）；
・等張生理食塩水（０〜１２時間目注入）
。
すべての試験の実施を、一晩絶食後、留置カテーテルを前腕静脈中に配置して等張生理食塩水を遅い速度で注入３０分後の午前８時半〜９時に開始した。血液試料を０時間、６時間および１２時間後に採取した。
【０１２２】
試薬：Ｍ１９９培地（内毒素試験済）、ウシ血清アルブミン、胎児性ウシ血清（ＦＢＳ）、糖化ヒトアルブミン（ＡＧＥ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。仔ウシ血清（内毒素試験済）はＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から入手した。トリプシンをＤｉｆｃｏから購入した。ニトロセルロースフィルター、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧおよび抗マウスＩｇＧ、分子量マーカー、および化学発光試薬（ＥＣＬ）をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。酸性β−ガラクトシダーゼ染色キットをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。過酸化水素をＣａｒｌｏ Ｅｒｂａ ｒｅａｇｅｎｔｓから入手した。内毒素汚染の存在はＬｉｍｕｌｕｓアメーバー様細胞アッセイにより試験した（濃度＜０．１ｎｇ／ｍＬであった）。ヒトＩＬ−３はＳａｎｄｏｚ Ｐｈａｒｍａ Ｌｔｄ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から贈呈された。ヒトＵＡＧをＰｈｏｅｎｉｘ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０１２３】
抗体：モノクローナル抗ｐ５３クローンＤＯ−１、抗ＣＤ３１、抗Ｆｌｋ１／ＫＤＲ、抗ＣＤ３３ ＦＩＴＣ、抗βアクチン、抗ｐ２１をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ホスホＲｂをＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。抗マウスＣＤ４５ ＰＥ、抗ＣＤ１４ ＰＥ、抗ヒトＣＤ４５ ＦＩＴＣ抗血清をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。抗ＣＤ１４６−ＦＩＴＣ抗体をＢｉｏＣｙｔｅｘ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。抗ＣＤ１０５ ＦＩＴＣ抗体をＴｅｃｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓ．ｒ．ｌ．（Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）から購入した。ＦＩＴＣ二次抗体またはＰＥ二次抗体をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．から、およびＳｉｇｍａから入手した。抗ヒトＨＬＡクラスＩ抗体をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、抗マウスＭＨＣ−ＩＩ抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。
【０１２４】
末梢血単核細胞由来ＣＡＣの単離および培養：Ｈｉｌｌら（参考文献１９）によって記載されているとおり、Ｆｙｃｏｌｌ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（Ｓｉｇｍａ）により単離された末梢血単核細胞（ＰＢ−ＭＮＣ）を２０％ＦＢＳ １９９培地内で再懸濁し、フィブロネクチン被覆ディッシュ（Ｂｉｏｃｏａｔ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）のプレートに播いた。ヒトＵＡＧ試験を、健常ドナーおよび糖尿病患者から採取したＣＡＣに対して実施した。分類した細胞の純度をＦＡＣＳ分析により検討した（参考文献２０）。実験のため、単離されたＣＡＣを、ＥＧＭ２培地（１０％ＦＢＳ、ヒドロコルチゾン、ヒト線維芽細胞成長因子、血管内皮増殖因子、インスリン成長因子１、アスコルビン酸、ヒト上皮成長因子、ゲンタマイシンおよびアンフォテリシン−Ｂ（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）の単独もしくは１μＭ ＵＡＧおよび１．２ｍｇ／ｍＬ ＡＧＥとの併用を含有）中の２０μｇ／ｍＬフィブロネクチン被覆ディッシュ上で５％ＣＯ２下、３７℃で４日間培養した。選択した実験では、単離されたＣＡＣを、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３を添加したＥＢＭ２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で培養した。ＦＡＣＳを用いてそれらの表現型を分析した（抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３１、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４抗体を用いた）（参考文献２２）。
【０１２５】
動員アッセイ：ＵＡＧもしくは生理食塩水で６時間および１２時間処置した健常被験体および糖尿病患者から採取したＣＡＣを検討した。総ＭＮＣ数を３人の独立した担当者が計数した。ＣＡＣの割合（％）の計算を、ＵＡＧ、ＡＧもしくは生理食塩水により６時間および１２時間処置した糖尿病患者および健常ドナーより得たＣＡＣと、０時間目に採取したＣＡＣとを比較することによって行なった。
【０１２６】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による内因性ｐ５３のサイレンシング：ｐ５３の不活性化を得るために、健常被験体から採取してＡＧＥ存在もしくは不在下で培養したＣＡＣを、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐらによって記載されているとおり（参考文献２３）、ｐ５３ ｓｉＲＮＡもしくはスクランブルｐ５３ ｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ）配列（１．５μｇ）を含むベクターｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏを用いて、販売元の指示に従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＰＬＵＳ（商標登録）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により一時的にトランスフェクトした。ｐ５３ ｓｉＲＮＡおよびスクランブルｐ５３ ｓｉＲＮＡを含むｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏはＤｒ．Ｓ．Ｓｏｄｄｕの好意で提供された。６０時間後、全細胞抽出物を調製し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離して、抗ｐ５３抗体で免疫ブロットした。
【０１２７】
ＲＯＳ検出：ＤＣＦ−ＤＡ（最終濃度０．５μＭ）を示される培養条件下でＣＡＣに添加した。示される時刻に、細胞のＦＡＣＳ分析を行ない、既報（参考文献２２）どおり処理した。Ｈ２Ｏ２を陽性対照として用いた。
【０１２８】
ＣＡＣ老化：健常被験体から採取し、ＥＧＭ２培地で、ＵＡＧもしくはＡＧＥ＋ＵＡＧと共に４日間培養したＣＡＣ、および生理食塩水またはＵＡＧで処置した糖尿病患者から採取したＣＡＣの酸性β−ｇａｌ活性により老化を検討した（参考文献２２）。簡単に述べると、ＣＡＣをリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、３分間、室温下で２％パラホルムアルデヒド固定し、洗浄して、新たなＳＡ−β−ｇａｌ染色液（１ｍｇ／ｍＬ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）、５ｍＭ／Ｌフェロシアン化カリウム、５ｍＭ／Ｌフェリシアニド、１５０ｍＭ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｍＭ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．０１％デオキシコール酸ナトリウム、および０．０２％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）により３７℃で２４時間インキュベートした。ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞を３人の独立した担当者が手作業で計数した。
【０１２９】
ウエスタンブロット分析：健常ドナー由来のＣＡＣをＵＡＧ存在下、ＡＧＥ併用もしくは非併用下で培養し、生理食塩水もしくはＵＡＧで処置した糖尿病患者から採取したＣＡＣを溶解させた。タンパク質濃度の検出を既報（参考文献２４）どおり行なった。５０μｇタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜にトランスファーした。抗ｐ５３、抗ｐ２１および抗ホスホＲｂ抗体との反応ならびに増強した化学発光検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による検出を既報（参考文献２０）どおり実施した。
【０１３０】
ＲＮＡ単離および定量的リアルタイムＰＣＲ：ＵＡＧもしくは生理食塩水で処置した糖尿病患者、健常被験体およびマウス由来のＣＡＣをＥＧＭ２培地で培養した。ヒト動脈および静脈細胞を陽性対照として用いた。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡ定量化を既報（参考文献２４）どおり実施した。Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ４およびＥｐｈＢ４の相対発現を、比較閾値サイクル法を用いて計算した。使用したヒトおよびマウスプライマー配列は記載されている（参考文献２５、２６）。
【０１３１】
フローサイトメトリー：ＣＡＣ細胞周期進行を分析するため、糖尿病患者、健常被験体、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ｏｂ／ｏｂおよびｗｔマウスから採取した細胞をＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＥＢＭ２で培養し、ＦＡＣＳ分析を既報（参考文献２０）どおり実施した。細胞表面分子の検討をフローサイトメトリーにより既報（参考文献２４）どおり行なった。マーカー陽性細胞頻度を平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。
【０１３２】
インビボ実験
糖尿病および対照マウス：マウスを４群に分けた。各群で測定した血漿グルコース値およびインスリン値を報告する。１６匹の６週齢ｏｂ／ｏｂマウス（血糖値６００±４５ｍｇ／ｄＬ、インスリン値５．５±０．９ｎｇ／ｍＬ）；１６匹のＣ５６ＢＬ６／Ｊ野生型マウス（血糖値１５０±１８．２ｍｇ／ｄＬ、インスリン値１±０．０５ｎｇ／ｍＬ）；１０匹の７週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（血糖値１６４±１２．９ｍｇ／ｄＬ、インスリン値１．２±０．１２ｎｇ／ｍＬ）；１０匹の１７週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（血糖値５３６±３６．３ｍｇ／ｄＬ、インスリン値４．８５±０．７４ｎｇ／ｍＬ）。動物処置はＧｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９３−２３， ｒｅｖｉｓｅｄ １９８５）に準じた。
【０１３３】
血糖値および血清インスリン値の測定：血糖値測定をＯｎｅ Ｔｏｕｃｈ ＩＩグルコース測定器（Ｌｉｆｅｓｃａｎｅ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて行なった。血清インスリン値測定を、製造業者の指示に従いマウスインスリンラジオイムノアッセイキット（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）を用いて行なった。
【０１３４】
Ｃ５７ＢＬ６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ６Ｊ ｏｂ／ｏｂマウスおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス由来のＣＡＣの単離および培養：６週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ｗｔ）およびｏｂ／ｏｂマウス、７週齢および１７週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ（Ｌｅｃｃｏ，Ｉｔａｌｙ）から購入した。動物をＡｖｅｒｔｉｎ（１００ｍｇ／５０ｍＬ ｉｐ）の腹腔内注射により麻酔した。血液試料を左心室から、Ｈｏｆｆ（参考文献２７）によって記載されているとおり採取した。末梢血ＭＮＣをＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法により単離した。採取した細胞を２回洗浄した。単離された細胞を再懸濁し、ＥＧＭ２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地中の２０μｇ／ｍＬフィブロネクチン被覆ディッシュ上で培養した。選択した実験では、単離されたＣＡＣを１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−３を添加したＥＢＭ２培地で培養した。
【０１３５】
動員アッセイ：マウスを１２時間ＵＡＧまたは生理食塩水で処置した。上記のとおり採取および精製されたＣＡＣを培養し、３人の独立した担当者が計数した。ＣＡＣの技術的比率を、左心室から採取した血液中ＣＡＣ数（／μＬ）と比較することによって計算した。
【０１３６】
マトリゲルプラグアッセイ：マウス血管形成アッセイのため、２型糖尿病患者より得た、未処置のまたはＵＡＧで処置したＣＡＣを計数し、ＤＭＥＭ中で再懸濁した（２５０μＬ ＤＭＥＭ中４×１０６）。細胞を氷上で冷却し、蛍光色素のカルボキシフルオセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＳＦＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識し、４℃のＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍＬ）含有マトリゲル２５０μＬに添加し、７週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腹部傍正中領域に皮下注射した（マウス５匹／群）。１５日後、マウスを屠殺し、マトリゲルプラグを採取し、１０％緩衝ホルマリン固定し、免疫組織化学のためにパラフィン包埋した。
【０１３７】
免疫組織化学および免疫蛍光検査法：免疫組織化学のため、マトリゲルプラグのパラフィン包埋ブロックの切片をポリリジン被覆したスライド上に収集した。内因性ペルオキシダーゼ活性を室温下、６％Ｈ２Ｏ２で８分間遮断した。蛍光色素ＣＳＦＥ標識した細胞を検出するため、抗フルオレセイン／Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎポリクローナル抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を一晩、４℃でスライドに載せた。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ウサギＥｎｖｉｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を３０分間インキュベートした。反応生成物を３，３−ジアミノベンジジンを用いて発色させた。一次抗体の省略または非関連ウサギ血清ＩｇＧとの置換を陰性対照として用いた。陽性細胞率（％）の計数は、各実験の４つの不連続切片において倍率４０倍で行なった。免疫蛍光検査法のため、試料を抗ヒトＨＬＡ−Ｉおよび抗マウスＭＨＣ−ＩＩ抗体を用いて、既報（参考文献２８）どおり処理した。ＭＨＣ−ＩＩまたはＨＬＡ−Ｉ陽性血管数を３つの異なる試料から無作為に選択した１０視野を計数することによって決定した。
【０１３８】
統計的分析：インビトロおよびインビボ結果は、少なくとも３回の独立した実験を表す。インビトロ実験を３回実施した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ ２５０ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒを用いたデンシトメトリー分析を用いてタンパク質の活性化または発現の誘導倍数の違いを計算した（＊および§：ｐ＜０．０５、実験値と対照値間の統計的有意差）。実験値と対照値間の有意差を、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定の分散分析を用いて計算した。類似した統計的分析をインビボ実験において実施した。
【０１３９】
本明細書中で報告するデータは、本発明を例証するためのみに用いられており、その制限を成すものとはみなされ得ないことが理解される。
【０１４０】
本発明はその特定の実施形態と共に記載しているが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般的に、本発明の原理に従った本発明の任意の変形、使用、もしくは適合化を包含し、本発明が属する分野内で既知もしくは慣行範囲であり、本明細書の上文に説明した本質的な特徴に適用し得、添付の特許請求の範囲に従うような本明細書の開示からの逸脱を含むことを意図していることが理解される。
【０１４１】
本明細書中で述べたすべての文献が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１４２】
参考文献一覧
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１２． Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｐａｖａｎ Ｍ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｇａｍｂｉｎｏ Ｒ， Ｇｒａｚｉａ Ｄｅ Ｃｅｓａｒｉｓ Ｍ， Ｇａｒｂａｒｉｎｏ Ｇ， Ｃａｍｕｓｓｉ Ｇ， Ｐａｇａｎｏ Ｇ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ； Ｄｉａｂｅｔｉｃ ＬＤＬ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｖｉａ ＳＴＡＴ５Ｂ ａｎｄ ｐ２１（ｗａｆ）． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １０９：１１１−９ （２００２）．
１３． Ｔｈｕｍ Ｔ， Ｆｒａｃｃａｒｏｌｌｏ Ｄ， Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓｓ Ｍ， Ｆｒｏｅｓｅ Ｓ， Ｇａｌｕｐｐｏ Ｐ， Ｗｉｄｄｅｒ ＪＤ， Ｔｓｉｋａｓ Ｄ， Ｅｒｔｌ Ｇ， Ｂａｕｅｒｓａｃｈｓ Ｊ； Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５６：６６６−７４ （２００７）．
１４． Ｄｉｍｍｅｌｅｒ Ｓ， Ｚｅｉｈｅｒ ＡＭ； Ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｐａｉｒ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ： ｔｈｅ ｍｉｓｓｉｎｇ ｌｉｎｋ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ？ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ８２：６７１−７ （２００４）．
１５． Ｔｅｐｐｅｒ ＯＭ， Ｇａｌｉａｎｏ ＲＤ， Ｃａｐｌａ ＪＭ， Ｋａｌｋａ Ｃ， Ｇａｇｎｅ ＰＪ， Ｊａｃｏｂｏｗｉｔｚ ＧＲ， Ｌｅｖｉｎｅ ＪＰ， Ｇｕｒｔｎｅｒ ＧＣ； Ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｙｐｅ ＩＩ ｄｉａｂｅｔｉｃｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ａｄｈｅｓｉｏｎ， ａｎｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０６：２７８１−６ （２００２）．
１６． Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ Ｔ； Ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｓｃｅｎａｒｉｏｓ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ．１０３：１５８０−５ （２００４）．
１７． Ｈａｔｔｏｒｉ Ｋ， Ｈｅｉｓｓｉｇ Ｂ， Ｔａｓｈｉｒｏ Ｋ， Ｈｏｎｊｏ Ｔ， Ｔａｔｅｎｏ Ｍ， Ｓｈｉｅｈ ＪＨ， Ｈａｃｋｅｔｔ ＮＲ， Ｑｕｉｔｏｒｉａｎｏ ＭＳ， Ｃｒｙｓｔａｌ ＲＧ， Ｒａｆｉｉ Ｓ， Ｍｏｏｒｅ ＭＡ； Ｐｌａｓｍａ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ ９７：３３５４−６０ （２００１）．
１８． Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｔ， Ｋａｌｋａ Ｃ， Ｍａｓｕｄａ Ｈ， Ｃｈｅｎ Ｄ， Ｓｉｌｖｅｒ Ｍ， Ｋｅａｒｎｅｙ Ｍ， Ｍａｇｎｅｒ Ｍ， ｌｓｎｅｒ ＪＭ， Ａｓａｈａｒａ Ｔ； Ｉｓｃｈｅｍｉａ− ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． ５：４３４−８ （１９９９）．
１９． Ｈｉｌｌ ＪＭ， Ｚａｌｏｓ Ｇ， Ｈａｌｃｏｘ ＪＰ， Ｓｃｈｅｎｋｅ ＷＨ， Ｗａｃｌａｗｉｗ ＭＡ， Ｑｕｙｙｕｍｉ ＡＡ， Ｆｉｎｋｅｌ Ｔ； Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ， ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｉｓｋ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３４８：５９３−６００ （２００３）．
２０． Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉ Ｐ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｃａｌｖｉ Ｃ， Ｇａｒｂａｒｉｎｏ Ｇ， Ｔａｒｏｎｅ Ｇ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ｂｒｉｚｚｉ； ＭＦβ１ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ＩＬ−３Ｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ＳＴＡＴ５ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６８：１０９９−１１０８ （２００５）．
２１． Ｚｈａｏ Ｗ， Ｄｉｚ Ｄｌ， Ｒｏｂｂｉｎｓ ＭＥ； Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ． Ｂｒ Ｊ Ｒａｄｉｏｌ． ８０：Ｓ２３−３１ （２００７）．
２２． Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｂａｌｓａｍｏ Ａ， Ｇａｍｂｉｎｏ Ｒ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｆａｌｃｉｏｎｉ Ｒ， Ｃａｓｓａｄｅｒ Ｍ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ｐａｇａｎｏ Ｇ， Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ； ｐ５３ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８１ ：４３３９−４７ （２００６）．
２３． Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ， ＴＲ．， Ｂｅｒｎａｒｄｓ， Ｒ， ａｎｄ Ａｇａｍｉ， Ｒ； Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５５３ （２００２）．
２４． Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｂａｌｓａｍｏ Ａ， Ｃｏｌｍｅｎａｒｅｓ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ Ｓ， Ｚｅｏｌｉ Ａ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｍ， Ｃａｍｕｓｓｉ Ｇ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ； Ｃ−ＫＩＴ， ｂｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｌｉｇａｎｄ， ｒｅｃｒｕｉｔｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｉｎｆｌａｍｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ． Ｂｌｏｏｄ． １０９：４２６４−７１ （２００７）．
２５． Ａｒａｎｇｕｒｅｎ ＸＬ， Ｌｕｔｔｕｎ Ａ， Ｃｌａｖｅｌ Ｃら； Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｒｔｅｒｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ． １０９：２６３４−２６４２ （２００７）．
２６． Ｃｏｒｍｉｅｒ Ｓ， Ｖａｎｄｏｒｍａｅｌ−Ｐｏｕｒｎｉｎ Ｓ， Ｂａｂｉｎｅｔ Ｃ， Ｃｏｈｅｎ−Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ Ｍ； Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｇｅｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ． Ｐａｔｔｅｒｎｓ．；４：７１３−７１７ （２００４）．
２７． Ｈｏｆｆ Ｊ； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ． Ｌａｂ． Ａｎｉｍａｌ． ２９ （２０００）．
２８． Ｚｅｏｌｉ Ａ， Ｄｅｎｔｅｌｌｉ Ｐ， Ｒｏｓｓｏ Ａ， Ｔｏｇｌｉａｔｔｏ Ｇ， Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ Ａ， Ｄａｍｉａｎｏ Ｌ， Ｆｒａｎｃｉａ ｄｉ Ｃｅｌｌｅ Ｐ， Ｐｅｇｏｒａｒｏ Ｌ， Ａｌｔｒｕｄａ Ｆ， Ｂｒｉｚｚｉ ＭＦ； Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ （ＩＬ−３） ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＤ４５＋ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｒｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ ｖｉａ ＳＴＡＴ５ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ 近刊．
２９． Ｙａｍａｇｉｓｈｉ Ｓ， Ｍａｔｓｕｉ Ｔ， Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ； Ｋｉｎｅｔｉｃｓ， ｒｏｌｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ （ｓＲＡＧＥ） ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ． ８：１１３８−４３ （２００７）．
３０． Ｄｉｍｒｉ ＧＰ． Ｗｈａｔ ｈａｓ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｇｏｔ ｔｏ ｄｏ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ？ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ７：５０５−１２ （２００５）．
３１． Ｖａｓａ Ｍ， Ｆｉｃｈｔｌｓｃｈｅｒｅｒ Ｓ， Ａｉｃｈｅｒ Ａ， Ａｄｌｅｒ Ｋ， Ｕｒｂｉｃｈ Ｃ， Ｍａｒｔｉｎ Ｈ， Ｚｅｉｈｅｒ ＡＭ， Ｄｉｍｍｅｌｅｒ Ｓ． Ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ８９：Ｅ１−７ （２００１）．
３２． Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｊ． Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｖｅｓｓｅｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ４９：５５４−６０ （２００１）．
３３． Ａｂａｃｉ Ａ， Ｏｇｕｚｈａｎ Ａ， Ｋａｈｒａｍａｎ Ｓ， Ｅｒｙｏｌ ＮＫ， Ｕｎａｌ Ｓ， Ａｒｉｎｃ Ｈ， Ｅｒｇｉｎ Ａ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｖｅｓｓｅｌｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９：２２３９−４２ （１９９９）．
３４． Ｓｃｈａｌｋｗｉｊｋ ＣＧ， Ｓｔｅｈｏｕｗｅｒ ＣＤ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ （Ｌｏｎｄ） １０９：１４３−５９ （２００５）．
３５． Ｋｌｅｉｎｚ ＭＪ， Ｍａｇｕｉｒｅ ＪＪ， Ｓｋｅｐｐｅｒ ＪＮ， Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ＡＰ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｄｅｓ−ｏｃｔａｎｏｙｌ ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｏｍｅ ｉｎ ｍａｎ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６９：２２７−２３５ （２００６）．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を治療有効量で被験体に投与することを含む、被験体の心血管疾患を治療するための方法。
【請求項２】
血管リモデリングおよび／または新血管形成を改善するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／またはＣＡＣ機能を改善するための、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＡＣを酸化ストレスから保護するための、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＡＣ動員を改善するための、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
ＣＡＣ老化を低減するための、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが約０．００１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で変わる用量で投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記心血管疾患が１型または２型糖尿病に関連している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記心血管疾患が肥満に関連している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記心血管疾患が代謝症候群に関連している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記心血管疾患がアテローム硬化性血管変性症に関連している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記その断片が配列番号１の残基８〜１２またはその類似体を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記その断片が配列番号１の残基６〜１３またはその類似体を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記その断片が配列番号６、配列番号７、配列番号８およびその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記その断片が配列番号６のアミノ酸配列からなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体がヒトである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を治療有効量で被験体に投与することを含む、被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／またはＣＡＣ機能を改善するための方法。
【請求項１８】
ＣＡＣを酸化ストレスから保護するための、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＡＣ動員を改善するための、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＡＣ老化を低減するための、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
血管リモデリングおよび／または新血管形成を改善するための、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が心血管疾患発症リスクのあるまたは心血管疾患を有している、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記被験体が１型または２型糖尿病である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが約０．００１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で変わる用量で投与される、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記その断片が配列番号１の残基８〜１２またはその類似体を含む、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記その断片が配列番号１の残基６〜１３またはその類似体を含む、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記その断片が配列番号６、配列番号７、配列番号８およびその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記その断片が配列番号６のアミノ酸配列からなる、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を治療有効量で被験体に投与することを含む、被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための方法。
【請求項３０】
循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／またはＣＡＣ機能を改善するための、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが約０．００１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で変わる用量で投与される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記その断片が配列番号１の残基８〜１２またはその類似体を含む、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記その断片が配列番号１の残基６〜１３またはその類似体を含む、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記その断片が配列番号６、配列番号７、配列番号８およびその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記その断片が配列番号６のアミノ酸配列からなる、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
治療有効量のポリペプチドを製薬上許容される担体と共に含む、心血管疾患の治療における使用のための医薬組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体である、上記組成物。
【請求項３７】
被験体の心血管疾患の治療における使用のための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体。
【請求項３８】
被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体。
【請求項３９】
被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体。
【請求項４０】
被験体の創傷治癒を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体。
【請求項４１】
前記被験体が糖尿病性潰瘍に罹患している、請求項４０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
移植関連生着を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体。
【請求項４３】
前記生着が臓器移植後の生着である、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
組織工学における使用のための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体。
【請求項４５】
被験体の心血管疾患の治療のための、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用。
【請求項４６】
被験体の心血管疾患治療のための医薬の調製における、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用。
【請求項４７】
被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用。
【請求項４８】
被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための医薬の調製における、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用。
【請求項４９】
被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための、治療有効量の配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用。
【請求項５０】
被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための医薬の調製における、治療有効量の配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用。
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を治療有効量で被験体に投与することを含む、被験体の心血管疾患を治療するための方法。
【請求項２】
血管リモデリングおよび／または新血管形成を改善するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／またはＣＡＣ機能を改善するための、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＡＣを酸化ストレスから保護するための、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＡＣ動員を改善するための、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
ＣＡＣ老化を低減するための、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが約０．００１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で変わる用量で投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記心血管疾患が１型または２型糖尿病に関連している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記心血管疾患が肥満に関連している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記心血管疾患が代謝症候群に関連している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記心血管疾患がアテローム硬化性血管変性症に関連している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記その断片が配列番号１の残基８〜１２またはその類似体を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記その断片が配列番号１の残基６〜１３またはその類似体を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記その断片が配列番号６、配列番号７、配列番号８およびその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記その断片が配列番号６のアミノ酸配列からなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体がヒトである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を治療有効量で被験体に投与することを含む、被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／またはＣＡＣ機能を改善するための方法。
【請求項１８】
ＣＡＣを酸化ストレスから保護するための、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＡＣ動員を改善するための、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＡＣ老化を低減するための、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
血管リモデリングおよび／または新血管形成を改善するための、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が心血管疾患発症リスクのあるまたは心血管疾患を有している、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記被験体が１型または２型糖尿病である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが約０．００１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で変わる用量で投与される、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記その断片が配列番号１の残基８〜１２またはその類似体を含む、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記その断片が配列番号１の残基６〜１３またはその類似体を含む、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記その断片が配列番号６、配列番号７、配列番号８およびその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記その断片が配列番号６のアミノ酸配列からなる、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体を治療有効量で被験体に投与することを含む、被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための方法。
【請求項３０】
循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／またはＣＡＣ機能を改善するための、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが約０．００１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で変わる用量で投与される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記その断片が配列番号１の残基８〜１２またはその類似体を含む、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記その断片が配列番号１の残基６〜１３またはその類似体を含む、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記その断片が配列番号６、配列番号７、配列番号８およびその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記その断片が配列番号６のアミノ酸配列からなる、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
治療有効量のポリペプチドを製薬上許容される担体と共に含む、心血管疾患の治療における使用のための医薬組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体である、上記組成物。
【請求項３７】
被験体の心血管疾患の治療における使用のための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体。
【請求項３８】
被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体。
【請求項３９】
被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体。
【請求項４０】
被験体の創傷治癒を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体。
【請求項４１】
前記被験体が糖尿病性潰瘍に罹患している、請求項４０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
移植関連生着を改善するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体。
【請求項４３】
前記生着が臓器移植後の生着である、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
組織工学における使用のための、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその断片もしくはその類似体。
【請求項４５】
被験体の心血管疾患の治療のための、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用。
【請求項４６】
被験体の心血管疾患治療のための医薬の調製における、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用。
【請求項４７】
被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用。
【請求項４８】
被験体の循環血中の血管新生細胞（ＣＡＣ）数を増加させるおよび／もしくはＣＡＣ機能を改善するための医薬の調製における、治療有効量の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用。
【請求項４９】
被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための、治療有効量の配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用。
【請求項５０】
被験体の血管リモデリングおよび／もしくは新血管形成を改善するための医薬の調製における、治療有効量の配列番号１に示される配列を含むポリペプチド、または配列番号１の生物学的活性を有するその断片もしくはその類似体の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５２２８６４（Ｐ２０１１−５２２８６４Ａ）
【公表日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２９８８（Ｐ２０１１−５１２９８８）
【出願日】平成２１年６月１２日（２００９．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５７２６３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５０２１４
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５０９３２７９２１）アリゼ ファーマ エスアーエス (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１２日（２００９．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５７２６３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５０２１４
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５０９３２７９２１）アリゼ ファーマ エスアーエス (2)
【Ｆターム（参考）】
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