糖蛋白質合成
糖蛋白質のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ製造方法を提供する。１方法は非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階と、１個以上の糖部分を非天然アミノ酸に結合する段階を含む。別の方法は糖部分を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階を含む。どちらの方法により製造される蛋白質も付加糖で更に修飾することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１の反応性基を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階と；
ｂ）第２の反応性基を含む糖部分と前記蛋白質を接触させ、第１の反応性基を第２の反応性基と反応させて糖部分を非天然アミノ酸に結合する段階を含む糖蛋白質の合成方法。
【請求項２】
第１の反応性基が求電子性部分であり、第２の反応性基が求核性部分である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
求電子性部分がケト又はアルデヒド部分である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
求核性部分が−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、及び−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）（式中、各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立してＨ、又は炭素原子数１〜６のアルキルである）から構成される群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
求核性部分かヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、及びカルボヒドラジドから構成される群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
反応生成物がオキシム、アミド、ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スルホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、又はチオセミカルバゾンを含む請求項２に記載の方法。
【請求項７】
反応生成物が還元ヒドラゾンを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第１の反応性基が求核性部分であり、第２の反応性基が求電子性部分である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
求電子性部分がケト又はアルデヒド部分である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
糖部分が２個以上の糖質部分を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
糖供与体部分から糖部分に糖を転移させるために十分な時間と適切な条件下でグリコシルトランスフェラーゼ、糖供与体部分、及びグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体と糖部分を接触させる段階ｃ）を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼから構成される群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
段階（ｃ）の生成物を少なくとも第２のグリコシルトランスフェラーゼ及び第２の糖供与体部分と接触させる段階を更に含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
糖部分が末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分ＵＤＰ−Ｇａｌであり、グリコシルトランスフェラーゼがβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
糖部分が末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分がＵＰＤ−ＧｌｃＮＡｃであり、グリコシルトランスフェラーゼがβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ反応の生成物をβ１−４マンノシルトランスフェラーゼ及びＧＤＰ−マンノースと接触させ、Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をα１−３マンノシルトランスフェラーゼ及びＧＤＰ−マンノースと接触させ、Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をα１−６マンノシルトランスフェラーゼ及びＧＤＰ−マンノースと接触させ、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をβ１−２Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと接触させ、Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃｐｌ−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をβ１−２Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと接触させ、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
糖部分をβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、α１，３フコシルトランスフェラーゼ、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、α１，４フコシルトランスフェラーゼ、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼの１種以上と接触させ、二側鎖又は三側鎖オリゴ糖構造を形成する段階を更に含む請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
組込み段階をｉｎ ｖｉｖｏで実施する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
組込み段階が直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）対を使用し、Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を蛋白質に組込み、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｏ−ＲＳが配列番号１、２、又は３のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｏ−ｔＲＮＡがｍｕｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法により生産された糖蛋白質。
【請求項２７】
請求項２２に記載の方法により生産された糖蛋白質。
【請求項２８】
糖部分とポリペプチドを含む糖蛋白質であって、糖部分がポリペプチドに存在する非天然アミノ酸に結合した第１の反応性基と糖部分に結合した第２の反応性基の求核性反応の反応生成物によりポリペプチドと結合している前記糖蛋白質。
【請求項２９】
第１の反応性基が求電子性部分であり、第２の反応性基が求核性部分である請求項２８に記載の糖蛋白質。
【請求項３０】
求電子性部分がケト又はアルデヒド部分である請求項２９に記載の糖蛋白質。
【請求項３１】
求核性部分が−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、及び−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）（式中、各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立してＨ、又は炭素原子数１〜６のアルキルである）から構成される群から選択される請求項２９に記載の糖蛋白質。
【請求項３２】
求核性部分かヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、及びカルボヒドラジドから構成される群から選択される請求項３１に記載の糖蛋白質。
【請求項３３】
反応生成物がオキシム、アミド、ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スルホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、又はチオセミカルバゾンを含む請求項２８に記載の糖蛋白質。
【請求項３４】
反応生成物が還元ヒドラゾンを含む請求項３３に記載の糖蛋白質。
【請求項３５】
糖部分を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階を含む糖蛋白質の合成方法。
【請求項３６】
糖供与体部分から糖部分に糖を転移させるために十分な時間と適切な条件下でグリコシルトランスフェラーゼ、糖供与体部分、及びグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体と糖部分を接触させる段階を更に含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼから構成される群から選択される請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
グリコシルトランスフェラーゼ反応の生成物を少なくとも第２のグリコシルトランスフェラーゼ及び第２の糖供与体部分と接触させる段階を更に含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
糖部分が末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分がＵＰＤ−ＧｌｃＮＡｃであり、グリ
コシルトランスフェラーゼがβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
糖部分が末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分がＵＤＰ−Ｇａｌであり、グリコシルトランスフェラーゼがβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
組込み段階が直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）対を使用し、Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を蛋白質に組込み、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
Ｏ−ＲＳが配列番号４、５、又は６のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｏ−ｔＲＮＡがｍｕｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
組込み段階をｉｎ ｖｉｖｏで実施する請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
非天然アミノ酸がβ−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−アセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、又はα−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニンを含む請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
請求項３５に記載の方法により生産された糖蛋白質。
【請求項４７】
ａ）糖部分を含む非天然アミノ酸と；
ｂ）セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと；
ｃ）非天然アミノ酸と直交ｔＲＮＡの結合を触媒する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
ｄ）グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドと；
ｅ）ポリペプチドをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド配列を含む糖蛋白質合成用宿主細胞。
【請求項４８】
グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼから構成される群から選択される請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
宿主細胞が哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞、真菌細胞、始原菌細胞、又は昆虫細胞である請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
翻訳系を含む組成物であって、翻訳系が直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、Ｏ−ＲＳが糖部分を含む非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡが少なくとも１個のセレクターコドンを認識する前記組成物。
【請求項５１】
Ｏ−ＲＳが配列番号４、５、もしくは６のいずれか１種又はその保存変異体を含むアミノ酸配列を含む請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
Ｏ−ＲＳが配列番号８、９、もしくは１０のいずれか１種又はその保存変異体を含むポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
Ｏ−ｔＲＮＡがｍｕｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを含む請求項５０に記載の組成物。
【請求項５４】
非天然アミノ酸がβ−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−アセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、又はα−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニンを含む請求項５０に記載の組成物。
【請求項５５】
（ａ）配列番号４〜６のいずれか１種に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号８〜１０のいずれか１種に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）（ａ）、又は（ｂ）のポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的に免疫反応性のポリペプチド；及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の保存変異を含むアミノ酸配列から構成される群から選択される人工ポリペプチド。
【請求項５６】
請求項５５に記載のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清。
【請求項５７】
（ａ）配列番号８〜１０のいずれか１種に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列に相補的であるか又はこれをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１〜６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）請求項５５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸；
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）のポリヌクレオチドと少なくとも９８％一致するポリヌクレオチド；及び
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）の保存変異を含むポリヌクレオチドから構成される群から選択される人工ポリペプチド。
【請求項１】
ａ）第１の反応性基を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階と；
ｂ）第２の反応性基を含む糖部分と前記蛋白質を接触させ、第１の反応性基を第２の反応性基と反応させて糖部分を非天然アミノ酸に結合する段階を含む糖蛋白質の合成方法。
【請求項２】
第１の反応性基が求電子性部分であり、第２の反応性基が求核性部分である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
求電子性部分がケト又はアルデヒド部分である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
求核性部分が−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、及び−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）（式中、各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立してＨ、又は炭素原子数１〜６のアルキルである）から構成される群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
求核性部分かヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、及びカルボヒドラジドから構成される群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
反応生成物がオキシム、アミド、ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スルホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、又はチオセミカルバゾンを含む請求項２に記載の方法。
【請求項７】
反応生成物が還元ヒドラゾンを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第１の反応性基が求核性部分であり、第２の反応性基が求電子性部分である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
求電子性部分がケト又はアルデヒド部分である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
糖部分が２個以上の糖質部分を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
糖供与体部分から糖部分に糖を転移させるために十分な時間と適切な条件下でグリコシルトランスフェラーゼ、糖供与体部分、及びグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体と糖部分を接触させる段階ｃ）を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼから構成される群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
段階（ｃ）の生成物を少なくとも第２のグリコシルトランスフェラーゼ及び第２の糖供与体部分と接触させる段階を更に含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
糖部分が末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分ＵＤＰ−Ｇａｌであり、グリコシルトランスフェラーゼがβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
糖部分が末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分がＵＰＤ−ＧｌｃＮＡｃであり、グリコシルトランスフェラーゼがβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ反応の生成物をβ１−４マンノシルトランスフェラーゼ及びＧＤＰ−マンノースと接触させ、Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をα１−３マンノシルトランスフェラーゼ及びＧＤＰ−マンノースと接触させ、Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をα１−６マンノシルトランスフェラーゼ及びＧＤＰ−マンノースと接触させ、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をβ１−２Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと接触させ、Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃｐｌ−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をβ１−２Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと接触させ、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖部分を形成する段階を更に含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
糖部分をβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、α１，３フコシルトランスフェラーゼ、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、α１，４フコシルトランスフェラーゼ、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼの１種以上と接触させ、二側鎖又は三側鎖オリゴ糖構造を形成する段階を更に含む請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
組込み段階をｉｎ ｖｉｖｏで実施する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
組込み段階が直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）対を使用し、Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を蛋白質に組込み、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｏ−ＲＳが配列番号１、２、又は３のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｏ−ｔＲＮＡがｍｕｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法により生産された糖蛋白質。
【請求項２７】
請求項２２に記載の方法により生産された糖蛋白質。
【請求項２８】
糖部分とポリペプチドを含む糖蛋白質であって、糖部分がポリペプチドに存在する非天然アミノ酸に結合した第１の反応性基と糖部分に結合した第２の反応性基の求核性反応の反応生成物によりポリペプチドと結合している前記糖蛋白質。
【請求項２９】
第１の反応性基が求電子性部分であり、第２の反応性基が求核性部分である請求項２８に記載の糖蛋白質。
【請求項３０】
求電子性部分がケト又はアルデヒド部分である請求項２９に記載の糖蛋白質。
【請求項３１】
求核性部分が−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、及び−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）（式中、各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立してＨ、又は炭素原子数１〜６のアルキルである）から構成される群から選択される請求項２９に記載の糖蛋白質。
【請求項３２】
求核性部分かヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、及びカルボヒドラジドから構成される群から選択される請求項３１に記載の糖蛋白質。
【請求項３３】
反応生成物がオキシム、アミド、ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スルホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、又はチオセミカルバゾンを含む請求項２８に記載の糖蛋白質。
【請求項３４】
反応生成物が還元ヒドラゾンを含む請求項３３に記載の糖蛋白質。
【請求項３５】
糖部分を含む非天然アミノ酸を蛋白質に組込む段階を含む糖蛋白質の合成方法。
【請求項３６】
糖供与体部分から糖部分に糖を転移させるために十分な時間と適切な条件下でグリコシルトランスフェラーゼ、糖供与体部分、及びグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体と糖部分を接触させる段階を更に含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼから構成される群から選択される請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
グリコシルトランスフェラーゼ反応の生成物を少なくとも第２のグリコシルトランスフェラーゼ及び第２の糖供与体部分と接触させる段階を更に含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
糖部分が末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分がＵＰＤ−ＧｌｃＮＡｃであり、グリ
コシルトランスフェラーゼがβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
糖部分が末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与体部分がＵＤＰ−Ｇａｌであり、グリコシルトランスフェラーゼがβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
組込み段階が直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ）対を使用し、Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を蛋白質に組込み、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
Ｏ−ＲＳが配列番号４、５、又は６のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｏ−ｔＲＮＡがｍｕｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
組込み段階をｉｎ ｖｉｖｏで実施する請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
非天然アミノ酸がβ−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−アセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、又はα−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニンを含む請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
請求項３５に記載の方法により生産された糖蛋白質。
【請求項４７】
ａ）糖部分を含む非天然アミノ酸と；
ｂ）セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと；
ｃ）非天然アミノ酸と直交ｔＲＮＡの結合を触媒する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
ｄ）グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドと；
ｅ）ポリペプチドをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド配列を含む糖蛋白質合成用宿主細胞。
【請求項４８】
グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、及びオリゴサッカリルトランスフェラーゼから構成される群から選択される請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
宿主細胞が哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞、真菌細胞、始原菌細胞、又は昆虫細胞である請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
翻訳系を含む組成物であって、翻訳系が直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、Ｏ−ＲＳが糖部分を含む非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡが少なくとも１個のセレクターコドンを認識する前記組成物。
【請求項５１】
Ｏ−ＲＳが配列番号４、５、もしくは６のいずれか１種又はその保存変異体を含むアミノ酸配列を含む請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
Ｏ−ＲＳが配列番号８、９、もしくは１０のいずれか１種又はその保存変異体を含むポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
Ｏ−ｔＲＮＡがｍｕｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを含む請求項５０に記載の組成物。
【請求項５４】
非天然アミノ酸がβ−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−アセチル−β−ＧｌｃＮＡｃ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−スレオニン、又はα−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−スレオニンを含む請求項５０に記載の組成物。
【請求項５５】
（ａ）配列番号４〜６のいずれか１種に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号８〜１０のいずれか１種に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）（ａ）、又は（ｂ）のポリペプチドに特異的な抗体に対して特異的に免疫反応性のポリペプチド；及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の保存変異を含むアミノ酸配列から構成される群から選択される人工ポリペプチド。
【請求項５６】
請求項５５に記載のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清。
【請求項５７】
（ａ）配列番号８〜１０のいずれか１種に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列に相補的であるか又はこれをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１〜６のいずれか１種に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）請求項５５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸；
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）のポリヌクレオチドと少なくとも９８％一致するポリヌクレオチド；及び
（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）の保存変異を含むポリヌクレオチドから構成される群から選択される人工ポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【公表番号】特表２００６−５０７３５８（Ｐ２００６−５０７３５８Ａ）
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０１４４０（Ｐ２００５−５０１４４０）
【出願日】平成１５年１０月１５日（２００３．１０．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３２８７０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５６０５
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月１５日（２００３．１０．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３２８７０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５６０５
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
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