糖鎖のアミド化法及び糖鎖の解析法
【課題】質量分析において生体分子の解析感度を向上させる方法を提供する。また、質量分析における解析感度を向上させる方法を用いて生体分子を迅速に且つ簡単に解析する方法を提供する。
【解決手段】糖鎖が有するカルボキシル基に、塩化［14Ｎ］アンモニウム及び塩化［15Ｎ］アンモニウムからなる群から選ばれるアミド化試薬と、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物とを用いてアミド化を行い、前記糖鎖のアミド化体を得る、糖鎖のアミド化法。
【解決手段】糖鎖が有するカルボキシル基に、塩化［14Ｎ］アンモニウム及び塩化［15Ｎ］アンモニウムからなる群から選ばれるアミド化試薬と、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物とを用いてアミド化を行い、前記糖鎖のアミド化体を得る、糖鎖のアミド化法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライフサイエンス基礎研究分野に関し、より詳しくは、タンパク質・ペプチド、糖鎖等の生体分子の質量分析における解析感度を向上するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、タンデム質量分析計を用いたＭＳ／ＭＳ解析手法によって、タンパク質・ペプチドの構造解析が行われている。例えば、特開平１０−９０２２６号公報において、質量分析におけるタンパク質・ペプチドのフラグメントイオンの発生を容易にする方法として、ペプチドのＮ末端やＣ末端に電荷を有するアミノ酸で化学修飾を行う方法が記載されている。
【０００３】
また、糖鎖構造解析の分野においても、タンデム質量分析計を用いたＭＳ／ＭＳ解析が主流になりつつある。例えば、Rapid Communication in Mass Spectrometry, vol. 10, 1027-1032(1996)において、MALDI-TOF-MS装置によるシアル酸の付加糖鎖の測定において、シアル酸のカルボキシル基をメチルエステル化することによって、シアル酸の脱離を抑制する方法が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−９０２２６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】アンドリュー・Ｋ・パウエル（Andrew K. Powell）、デビッド・Ｊ・ハーヴェイ（David J. Harvey）著、正イオンマトリックス支援脱離イオン化マススペクトロメトリーによる分析のためのＮ−結合型オリゴ糖及びガングリオシドにおけるシアル酸の安定化（Stabilization of Sialic Acids in N-linked Oligosaccharides and Gangliosides for Analysis by Positive Ion Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry）、「ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マス・スペクトロメトリー（Rapid Communications in Mass Spectrometry）」、１９９６年、第１０巻、ｐ．１０２７−１０３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
タンパク質・ペプチドのＭＳ／ＭＳ解析では、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基の部位において開裂が優先的に起こるため、他のアミノ酸残基の部位で開裂したフラグメントイオンが得にくい。従って、全体としてフラグメントイオンの検出率が悪く、解析が困難になる問題がある。
【０００７】
また、シアル酸含有糖鎖のＭＡＬＤＩをイオン源とする質量分析測定においては、ＩＳＤ（in source decay）やＰＳＤ（post source decay）でシアル酸の脱離が容易に起こるため、分子量関連イオンの絶対量が減少する。さらに、シアル酸含有糖鎖のＭＳ／ＭＳ解析では、シアル酸の脱離が優先的に起こり、解析に十分な他のフラグメントイオンを得ることが難しい。
【０００８】
本発明の目的は、質量分析において生体分子の解析感度を向上させる方法を提供することにある。また本発明の目的は、質量分析における解析感度を向上させる方法を用いて生体分子を迅速に且つ簡単に解析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明には、以下の発明が含まれる。
下記（１）〜（７）の発明は、標識アミド化法に向けられる。
（１）生体分子が有するカルボキシル基に、窒素原子同位体15Ｎで標識されたアミド化試薬を作用させることにより、前記生体分子の標識アミド化体を得る、標識アミド化法。
【００１０】
（２）前記生体分子がタンパク質又はペプチドである、（１）に記載の標識アミド化法。
すなわち、タンパク質又はペプチドが有するカルボキシル基に、窒素原子同位体15Ｎで標識されたアミド化試薬を作用させることにより、標識アミド化タンパク質又は標識アミド化ペプチドを得る、タンパク質又はペプチドの標識アミド化法。
（３）前記カルボキシル基が、タンパク質又はペプチドの酸性アミノ酸残基が有するカルボキシル基である、（１）又は（２）に記載の標識アミド化法。
（４）前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸及びアスパラギン酸から選ばれる、（３）に記載の標識アミド化法。
【００１１】
（５）前記生体分子が糖鎖である、（１）に記載の標識アミド化法。
すなわち、糖鎖が有するカルボキシル基に、窒素原子同位体15Ｎで標識されたアミド化試薬を作用させることにより標識糖鎖を得る、糖鎖の標識アミド化法。
（６）前記カルボキシル基が、糖鎖の酸性糖残基が有するカルボキシル基である、（
１）又は（５）に記載の標識アミド化法。
（７）前記酸性糖がシアル酸又はムラミン酸である、（６）に記載の標識アミド化法。
【００１２】
（８）前記アミド化試薬が塩化［15Ｎ］アンモニウムである、（１）〜（７）のいずれかに記載の標識アミド化法。
【００１３】
下記（９）〜（１２）の発明は、生体分子の解析方法に向けられる。
（９）生体分子が有するカルボキシル基をアミド化し、その後、得られた生体分子のアミド化体を質量分析法によって解析する、生体分子の解析方法。
（１０）（１）〜（８）のいずれかに記載の標識アミド化法によって解析すべき生体分子を標識アミド化し、その後、得られた生体分子の標識アミド化体を質量分析法によって解析する、生体分子の解析方法。
【００１４】
（１１）前記生体分子が、タンパク質又はペプチドである、（９）又は（１０）に記載の生体分子の解析方法。
すなわち、前記（９）の生体分子の解析方法においては、タンパク質又はペプチドが有するカルボキシル基をアミド化し、その後、得られたアミド化タンパク質又はアミド化ペプチドを質量分析法によって解析する、タンパク質又はペプチドの解析方法。
前記（１０）の生体分子の解析方法においては、（２）〜（４）及び（８）のいずれかに記載の標識アミド化法によって解析すべきタンパク質又はペプチドを標識アミド化し、その後、得られた標識タンパク質又は標識ペプチドを質量分析法によって解析する、タンパク質又はペプチドの解析方法。
【００１５】
（１２）前記生体分子が糖鎖である、（９）又は（１０）に記載の生体分子の解析方法。
すなわち、前記（９）の生体分子の解析方法においては、糖鎖が有するカルボキシル基をアミド化し、その後、得られたアミド化糖鎖を質量分析法によって解析する、糖鎖の解析方法。
前記（１０）の生体分子の解析方法においては、（５）〜（８）のいずれかに記載の標識アミド化法によって解析すべき糖鎖を標識アミド化し、その後、得られた標識糖鎖を質量分析法によって解析する、糖鎖の解析方法。
【００１６】
下記（１３）〜（１６）の発明は、標識アミド化体に向けられる。
（１３）カルボキシル基が15Ｎ標識アミド化された、生体分子の標識アミド化体。
（１４）前記生体分子が、質量分析により解析すべき生体分子である、（１３）に記載の標識アミド化体。
【００１７】
（１５）前記生体分子が、タンパク質又はペプチドである、（１３）又は（１４）に記載の標識アミド化体。
すなわち、前記（１３）の標識アミド化体においては、カルボキシル基が15Ｎ標識アミド化された、タンパク質又はペプチドの標識アミド化体。
前記（１４）の標識アミド化体においては、前記タンパク質又はペプチドが、質量分析により解析すべきタンパク質又はペプチドである、標識アミド化体。
【００１８】
（１６）前記生体分子が糖鎖である、（１３）又は（１４）に記載の標識アミド化体。
すなわち、前記（１３）の標識アミド化体においては、カルボキシル基が15Ｎ標識アミド化された、糖鎖の標識アミド化体。
前記（１４）の標識アミド化体においては、前記糖鎖が、質量分析により解析すべき糖鎖である、糖鎖の標識アミド化体。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、アミド化法を用いることにより、質量分析において生体分子の解析感度を向上させる方法を提供することができる。又本発明によると、質量分析における解析感度を向上させる方法を用いて生体分子を迅速に且つ簡単に解析する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ミオグロビントリプシン消化断片ＶＥＡＤＩＡＧＨＧＱＥＶＬＩＲ(m/z=1606）の、アミド化反応を行わなかった（non-amidation）もの、非標識アミド化反応（amidation(14Ｎ)）を行ったもの、及び標識アミド化反応（amidation(15Ｎ)）を行ったものについての質量分析結果である。
【図２】ＳＬＮＦＰ(m/z=1144)の、アミド化反応を行わなかったもの、非標識アミド化反応を行ったもの、及び標識アミド化反応を行ったものについてのMSスペクトルである。
【図３】ＳＬＮＦＰ(m/z=1144)の、アミド化反応を行わなかったもの、非標識アミド化反応を行ったもの、及び標識アミド化反応を行ったものについてのMS/MSスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の記述は、標識アミド化法に関する。
本発明は、生体分子が有するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）を15Ｎ標識アミド化して15Ｎ標識カルバモイル基（−ＣＯ15ＮＨ2基）に変換する方法である。生体分子としては、タンパク質・ペプチドや糖鎖等が挙げられる。なお本明細書において、「生体分子」とは生体高分子を含む意味で用いる。
【００２２】
以下、本発明の標識アミド化法の一例として、タンパク質又はペプチドを標識アミド化する方法について説明する。この例においては、タンパク質又はペプチドの酸性アミノ酸残基のカルボキシル基を標識アミド化する。上記酸性アミノ酸としては、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸のいずれであっても良い。α−アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。すなわち本発明によって例えばアスパラギン酸はアスパラギンに、グルタミン酸はグルタミンに変換される。なお本発明においては、標識アミド化すべきタンパク質又はペプチドが無置換のＣ末端を有している場合、Ｃ末端カルボキシル基も標識アミド化される。
【００２３】
標識アミド化の試薬としては、アミド化試薬として用いることができる化合物の、窒素同位体15Ｎによる標識体を特に限定することなく用いることができる。例えば、塩化［15Ｎ］アンモニウム等を用いることができる。標識アミド化の方法としては、標識アミド化試薬を用いることの他は特に限定することなく、公知のアミド化法を用いることができる。例えば、タンパク質又はペプチドを必要に応じて変性剤で処理し、標識アミド化剤と縮合剤とを用いて標識アミド化を行うことができる。縮合剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、シアナミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のカルボジイミド等を用いることができる。
【００２４】
本発明においては、カルボジイミドを縮合剤として用いるカルボジイミド法を用いることが好ましい。このとき、標識アミド化試薬として塩化［15Ｎ］アンモニウムを用いることが好ましい。また、カルボジイミドとしては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いることが好ましい。カルボジイミド法を用いる場合、例えば以下のように標識アミド化を行うことができる。タンパク質を、塩酸グアニジンを存在させた塩化［15Ｎ］アンモニウム水溶液に溶解し、塩酸グアニジンを存在させたカルボジイミドを加えて反応させる。塩化［15Ｎ］アンモニウムの量としては、タンパク質６００ｐｍｏｌに対して５００ｍＭ〜１Ｍ程度のものを５０μｌ用いるとよい。カルボジイミドの量としては、塩化［15Ｎ］アンモニウムの０．０８〜０．２倍当量程度を用いることができる。またこの反応は、４〜３０℃で１〜１２時間程度の条件下で行うことができる。
【００２５】
以上のようにして、タンパク質又はペプチドのカルボキシル基を標識アミド化することができる。本発明の標識アミド化は、タンパク質・ペプチドを質量分析によって解析する場合に特に有用である。
【００２６】
以下、本発明の標識アミド化法の他の一例として、糖鎖を標識アミド化する方法について説明する。この例においては、糖鎖の酸性糖残基のカルボキシル基を標識アミド化する。上記酸性糖としては、シアル酸、ムラミン酸等が挙げられる。本発明の標識アミド化法は、特にシアル酸において有用である。ここでシアル酸は、ノイラミン酸のＮ−アシル体及びその誘導体であり、具体的にはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸等が挙げられる。
【００２７】
標識アミド化の試薬としては、アミド化試薬として用いることができる化合物の、窒素同位体15Ｎによる標識体を特に限定することなく用いることができる。例えば、塩化［15Ｎ］アンモニウム等を用いることができる。標識アミド化の方法としては、標識アミド化試薬を用いることの他は特に限定することなく、公知のアミド化法を用いることができる。例えば、糖鎖を標識アミド化剤と縮合剤とを用いて標識アミド化を行うことができる。縮合剤としては、上述のタンパク質・ペプチドの標識アミド化法におけるものを用いることもできるが、好ましくは４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）が用いられる。例えば、標識アミド化剤に塩化［15Ｎ］アンモニウムを用い、縮合剤にＤＭＴ−ＭＭを用いる場合、塩化［15Ｎ］アンモニウムは糖鎖の５万〜５０万倍当量程度、ＤＭＴ−ＭＭは塩化［15Ｎ］アンモニウムの０．１〜０．５倍当量程度を用いることができる。またこの反応は、３０〜６０℃で５〜４８時間程度の条件下で行うことができる。
【００２８】
以上のようにして、糖鎖を標識アミド化することができる。本発明の標識アミド化は、糖鎖を質量分析によって解析する場合に特に有用である。
【００２９】
以下の記述は、標識アミド化体に関する。
本発明は、カルボキシル基が15Ｎ標識アミド化された、生体分子のアミド化体である。このアミド化体は、上記の標識アミド化法において記載したように、生体分子を標識アミド化することによって得ることができる。生体分子としては、タンパク質、ペプチド、糖鎖等が挙げられる。解析したい生体分子の標識アミド化体である場合は、質量分析によって解析する場合に特に有用に用いられる。
【００３０】
以下の記述は、生体分子の解析方法に関する。
本発明は、生体分子が有するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）をアミド化してカルバモイル基（−ＣＯＮＨ2基）に変換する処理を行うことにより生体分子の解析を行う方法である。解析すべき生体分子としては、タンパク質・ペプチドや糖鎖等が挙げられる。
【００３１】
以下、本発明の生体分子の解析方法の一例として、タンパク質又はペプチドを解析する方法について説明する。この例においては、タンパク質又はペプチドの酸性アミノ酸残基のカルボキシル基をアミド化する。上記酸性アミノ酸としては、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸のいずれであっても良い。α−アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。すなわち本発明によって例えばアスパラギン酸はアスパラギンに、グルタミン酸はグルタミンに変換される。なお本発明においては、アミド化すべきタンパク質又はペプチドが無置換のＣ末端を有している場合、Ｃ末端カルボキシル基もアミド化される。
【００３２】
本発明のタンパク質・ペプチドの解析法においては、解析すべきタンパク質又はペプチドのカルボキシル基をアミド化し、得られたアミド化タンパク質又はアミド化ペプチドを質量分析によって解析する。アミド化タンパク質又はアミド化ペプチドは、質量分析に供する前に、必要に応じて遠心分離、還元−カルボキシメチル化、断片化、脱塩等の処理を行うと良い。これらの処理は、公知の方法を利用して行うことができる。
【００３３】
本発明の解析方法においては、アミド化は、カルボキシル基を非標識カルバモイル基（−ＣＯ14ＮＨ2基）に変換することと、標識カルバモイル基（−ＣＯ15ＮＨ2基）に変換することとの両方を含む。非標識アミド化法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。また標識アミド化法としては、上述したタンパク質又はペプチドの標識アミド化法を用いることができる。
【００３４】
本発明の解析方法においてアミド化を行うことは、以下の点で好ましい。すなわち、優先的な開裂が起こりやすいアスパラギン酸残基やグルタミン酸残基等の酸性アミノ酸残基の部位がアミド化によって無くなるため、他のアミノ酸残基の部位においても開裂が起こりやすくなり、多種類のフラグメントイオンを検出することができる。従って、より多くの配列情報を得ることができる。
【００３５】
本発明の解析方法においては、以下の理由で、標識アミド化を行うことが特に好ましい。すなわち、標識アミド化によって−ＣＯＯＨ基を−ＣＯ15ＮＨ2基に変換することで、解析すべきタンパク質・ペプチドと標識アミド化タンパク質・ペプチドとの質量差がカルボキシル基１個あたり０．０１３０１９３８と極微小に抑えられる。すなわち、標識アミド化前後でタンパク質・ペプチドの質量がほとんど変わらない。このため、質量分析によって得られる質量データは、標識アミド化前のもとの解析すべきタンパク質・ペプチドの質量をほぼ反映しており、質量分析データからもとのタンパク質・ペプチドの解析をより容易に行うことができる。従って、ペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）解析やＭＳ／ＭＳイオンサーチ（ＭＩＳ）解析において、データベースとの照合が容易であり、迅速にかつ容易にタンパク質・ペプチドの同定を行うことができる。
【００３６】
一方、非標識アミド化を行った場合は、解析すべきタンパク質・ペプチドと非標識アミド化タンパク質・ペプチドとでカルボキシル基１個あたり約１の質量差が生じる。ＰＭＦ解析やＭＩＳ解析においては、非標識アミド化による質量変化が質量誤差として支障となることもある。
【００３７】
以下、本発明の生体分子の解析方法の他の一例として、糖鎖を解析する方法について説明する。この例においては、糖鎖が有する酸性糖残基のカルボキシル基をアミド化する。上記酸性糖としては、シアル酸、ムラミン酸等が挙げられる。得られたアミド化糖鎖は、質量分析によって解析する。
【００３８】
本発明の解析方法においては、アミド化は、カルボキシル基を非標識カルバモイル基（−ＣＯ14ＮＨ2基）に変換することと、標識カルバモイル基（−ＣＯ15ＮＨ2基）に変換することとの両方を含む。非標識アミド化法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。また標識アミド化法としては、上述した糖鎖の標識アミド化法を用いることができる。
【００３９】
本発明の解析方法においてアミド化を行うことは、以下の点で好ましい。例えばシアル酸含有糖鎖の場合、優先的な脱離が起こりやすいシアル酸の部位がアミド化によって無くなる。このため、ISDやPSDにおいてシアル酸の脱離が抑制される分、分子量関連イオンの絶対量が増加し、感度が向上する。またMS/MS解析においては、シアル酸の脱離が抑制され、他の部位由来のフラグメントイオンが検出される。このことを利用し、シアル酸付加イオンをプレカーサーイオンとしたMS/MSスペクトルと、シアル酸脱離イオンをプレカーサーイオンとしたMS/MSスペクトルとから、より詳細な糖鎖構造解析を行うことが可能となる。
【００４０】
本発明の解析方法においては、以下の理由で、標識アミド化を行うことが特に好ましい。すなわち、標識アミド化によって−ＣＯＯＨ基を−ＣＯ15ＮＨ2基に変換することで、解析すべき糖鎖と標識アミド化糖鎖との質量差がカルボキシル基１個あたり０．０１３０１９３８と極微小に抑えられる。すなわち、標識アミド化前後で糖鎖の質量がほとんど変わらない。このため、質量分析によって得られる質量データは、標識アミド化前のもとの解析すべき糖鎖の質量をほぼ反映しており、質量分析データからもとの糖鎖の解析をより容易に行うことができる。従って、糖鎖のデータベース解析において、質量変化を考慮する手間を省くことが可能となり、迅速にかつ容易に糖鎖の同定を行うことができる。
【００４１】
一方、非標識アミド化を行った場合は、解析すべき糖鎖と非標識アミド化糖鎖とでカルボキシル基１個あたり約１の質量差が生じる。糖鎖のデータベース解析においては、非標識アミド化による質量変化が質量誤差として支障となることもある。
【実施例】
【００４２】
［実施例１］
ミオグロビンに対し、塩化［14Ｎ］アンモニウム及び塩化［15Ｎ］アンモニウムを用いて、アミド化が行われることを質量分析によって確認する実験をそれぞれ行った。
【００４３】
非標識アミド化については、以下のように行った。
ミオグロビン６００pmolを、５Ｍ 塩酸グアニジン／１Ｍ 14ＮＨ4Ｃｌ ５０μlに溶解した。この溶液に、５Ｍ 塩酸グアニジン／０．４Ｍ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を１５μl添加して反応液を調製し、得られた反応液を室温で２時間インキュベーションした。マイクロコンＹＭ−１０（ミリポア社製）に反応液を加え、さらに０．００１Ｍ ＨＣｌを３３５μl加え、１４０００rpm、４℃で７０分遠心した。さらに０．００１Ｍ ＨＣｌを４００μl加え、１４０００rpm、４℃で７０分遠心した。その後、５０ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3を加え、溶液の全量が１００μlになるように調製した。これに１Ｍ ＤＤＴを１μl添加し、５６℃で１時間インキュベーションした。さらに１Ｍ ヨードアセトアミドを５．５μl添加し、室温で４５分インキュベーションした。その後、１００ｍＭ ＣａＣｌ2を５μl加えた。Sequencing Grade Modified Trypsin（プロメガ社製）を６pmol添加し、３７℃で１６時間インキュベーションした。０．１重量％ＴＦＡを１０μl添加し、ZipTip μ-C18（ミリポア社製）を用いて脱塩精製を行うことにより、ミオグロビンのトリプシン消化断片を得た。
【００４４】
標識アミド化については、14ＮＨ4Ｃｌの代わりに15ＮＨ4Ｃｌを用いた以外は、上記非標識アミド化と同様に行うことにより、ミオグロビンの消化断片を得た。
【００４５】
別途用意したアミド化されていないミオグロビンのトリプシン消化断片と、上記非標識及び標識アミド化によって得られたトリプシン消化断片とについて、それぞれAXIMA-QIT（島津製作所製）によって質量分析を行った結果を図１の（a）及び（b）に示す。すなわち図１の（a）及び（b）は、ＶＥＡＤＩＡＧＨＧＱＥＶＬＩＲ（配列番号１）の配列を有するミオグロビントリプシン消化断片(m/z=1606）（以下、単にペプチドと表記する。）の、アミド化反応を行わなかった（non-amidation）ものと、非標識アミド化反応（amidation(14Ｎ)）を行ったものと、標識アミド化反応（amidation(15Ｎ)）を行ったものとのスペクトルを比較して表している。なお、図１中のスペクトルはいずれも、横軸に質量／電荷（Mass/Charge）を表し、縦軸にフラグメントイオンの相対強度（%Int.）を表す。
【００４６】
図１において、（a）の下段は、アミド化反応を行わなかった（non-amidation）ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルである。このスペクトルは、（b）の下段のピーク（m/z=1606.85）をプレカーサイオン（Precursor ion）として測定した。（a）の中段は、非標識アミド化反応（amidation(14Ｎ)）を行ったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルである。このスペクトルは、（b）の中段のピーク（m/z=1603.91）をプレカーサイオン（Precursor ion）として測定した。（a）の上段は、標識アミド化反応（amidation(15Ｎ)）を行ったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルである。このスペクトルは、（b）の上段のピーク（m/z=1606.89）をプレカーサイオン（Precursor ion）として測定した。
【００４７】
ペプチドの非標識アミド化が行われれば、非標識アミド化ペプチドにおいては、アミド化反応を行わなかったペプチドよりも、反応によって変換されたカルボキシル基１個あたり質量数が約１Ｄａ小さくなる。図１によると、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいてペプチド中の同じ部位で切断されて生成したフラグメントイオン同士の質量数を比較した場合、非標識アミド化反応を行ったペプチドから生成したフラグメントイオンの方が、アミド化反応を行わなかったペプチドから生成したフラグメントイオンよりも、上記非標識アミド化反応によって変換されたカルボキシル基の数だけ小さい。以上のことから、非標識アミド化反応によってペプチドの非標識アミド化が行われたことが示された。
【００４８】
さらに、非標識アミド化によって、ペプチドにおけるアスパラギン酸及びグルタミン酸部位での優先的な開裂が抑制されたため、非標識アミド化反応を行わなかったペプチドには検出されなかった他のフラグメントイオンが検出された。また、内部配列断片（Internal fragment）のフラグメントイオンも新たに検出された。このように、ペプチドの非標識アミド化を行うことによってフラグメントイオンの検出率が向上したことが示された。
【００４９】
また、標識アミド化反応を行ったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルにおいては、アミド化反応を行わなかったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるものとほぼ同じ質量数を有するフラグメントイオンが検出された。さらに、標識アミド化反応を行わなかったペプチドには検出されなかった他のフラグメントイオンが検出された。また、内部配列断片（Internal fragment）のフラグメントイオンも新たに検出された。このことと、上述の非標識アミド化による結果とから、標識アミド化反応によってもペプチドの標識アミド化が行われたことが示された。従って、ペプチドの標識アミド化を行うことによっても、ペプチドにおけるアスパラギン酸及びグルタミン酸部位での優先的な開裂が抑制され、その結果、フラグメントイオンの検出率が向上したことが示された。
【００５０】
上述のことから、ペプチドのアミド化によって質量分析における解析の感度が上昇したことが示された。
【００５１】
［実施例２］
シアル酸含有糖鎖であるシアリルラクト−Ｎ−フコペンタオース（Sialyllacto-N-Fucopentaose；ＳＬＮＦＰ、Exact Mass:1144.40）に対し、塩化［14Ｎ］アンモニウム及び塩化［15Ｎ］アンモニウムを用いて、アミド化が行われることを質量分析によって確認する実験をそれぞれ行った。なお、ＳＬＮＦＰは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（NeuNAc）、ガラクトース（Galactose）、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）、グルコース（Glucose）、及びフコース（Fucose）を構成糖とする糖鎖である。ＳＬＮＦＰの構造は、後述の図２中に記載した。
【００５２】
非標識アミド化については、以下のように行った。
１nmol/μl Sialyllacto-N-Fucopentaose IV（ＳＬＮＦＰ）水溶液１μlを、５０μlの１M 14ＮＨ４Ｃｌ水溶液に添加し、１５μlの１M ４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）水溶液を加え（pH４．２）、３７℃で２４時間インキュベーションした。
直径１cm×高さ５．５cmのリアクションベッセル（島津製作所製）にSephadex G-10（アマシャムバイオサイエンス製）を２．３ml充填し、大気圧下で、生成物のゲルろ過クロマトグラフィーを行った。２６〜２８drop目（１drop≒４０μl）を回収し、遠心乾燥を行った。
乾燥した回収物を５μlのＨ２Ｏに溶解し、１μlを非標識アミド化ＳＬＮＦＰの質量分析測定用試料とした。
【００５３】
標識アミド化については、14ＮＨ4Ｃｌの代わりに15ＮＨ4Ｃｌを用いた以外は、上記非標識アミド化と同様に行うことにより、標識アミド化ＳＬＮＦＰの質量分析測定用試料を得た。
【００５４】
別途用意したアミド化されていないＳＬＮＦＰと、上記非標識及び標識アミド化によって得られたＳＬＮＦＰとについて、それぞれによって質量分析を行った結果を図２及び図３に示す。図２には、ＳＬＮＦＰの構造も示す。図２のＡは、AXIMA-CFR（島津製作所製）によるMSスペクトルである。図２のＢは、Ａにおける分子量関連イオンのＮａ＋付加体のピーク（［Ｍ＋Ｎａ］＋）の拡大スペクトルである。図３は、AXIMA-QIT（島津製作所製）による、［Ｍ＋Ｎａ］＋をプレカーサーイオンとしたMS/MSスペクトルである。また、図２及び図３のスペクトルにおいて、上段スペクトルは、15ＮＨ4Ｃｌによる標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのもの、中段スペクトルは、14ＮＨ4Ｃｌによる非標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのもの、下段スペクトルは、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのものである。なお、これらのスペクトルはいずれも、横軸に質量／電荷（Mass/Charge）を表し、縦軸にフラグメントイオンの相対強度を表す。
【００５５】
糖鎖の非標識アミド化が行われれば、非標識アミド化糖鎖においては、アミド化反応を行わなかった糖鎖よりも、反応によって変換されたカルボキシル基１個あたり質量数が約１Ｄａ小さくなる。図２のＡ及びＢによると、14ＮＨ4Ｃｌによる非標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（中段）におけるＮａ＋が付加した分子量関連イオンピーク（m/z=1166.59）は、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）におけるＮａ＋が付加した分子量関連イオンピーク（m/z=1167.48）よりも１Ｄａ小さくなっている。これは、ＳＬＮＦＰが有する１個のＮ−アセチルノイラミン酸のカルボキシル基がカルバモイル基に変換されたことに相当する。このことから、14ＮＨ4Ｃｌによる非標識アミド化反応によって糖鎖の非標識アミド化が行われたことが示された。
【００５６】
さらに図２のＡ及びＢによると、非標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（中段）のシアル酸脱離ピーク（m/z=876.34）は、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）のシアル酸脱離ピーク（m/z=876.42）よりもイオン強度が小さくなっている。このことから、ISDやPSDによりシアル酸の脱離が抑制されたことが示された。
【００５７】
さらに、MS/MSの結果である図３によると、非標識アミド化されたＳＬＮＦＰのスペクトル（中段）においては、アミド化されなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）に比べてのシアル酸脱離ピーク（m/z=876付近）のイオン強度が小さくなるとともに他のフラグメントイオンが新たに検出されている。これは、非標識アミド化によって質量分析における糖鎖のシアル酸の脱離が抑制されたために他のフラグメントイオンの検出率が向上したことを示す。この結果、糖鎖の構造決定が容易になった。
【００５８】
そして、図２のＡによると、15ＮＨ4Ｃｌによる標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（上段）におけるＮａ＋が付加した分子量関連イオンピーク（m/z=1167.44）は、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）におけるＮａ＋が付加した分子量関連イオンピーク（m/z=1167.48）とほぼ同じ質量数を有するものであった。さらに、MS/MSの結果である図３によると、標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（上段）においては、非標識アミド化を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（中段）におけるように、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）に比べてシアル酸脱離ピークのイオン強度が小さくなるとともに他のフラグメントイオンの検出率が向上した。このことから、15ＮＨ4Ｃｌによる標識アミド化反応によって糖鎖の標識アミド化が行われたことが示された。さらに、非標識アミド化と標識アミド化とにおいて、同位体によって質量差の異なるピークが検出されること以外は、糖鎖の開裂パターンやイオンの検出率への同位体による影響はないことが確認された。
【００５９】
上述のことから、糖鎖のアミド化によって質量分析における解析の感度が上昇したことが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライフサイエンス基礎研究分野に関し、より詳しくは、タンパク質・ペプチド、糖鎖等の生体分子の質量分析における解析感度を向上するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、タンデム質量分析計を用いたＭＳ／ＭＳ解析手法によって、タンパク質・ペプチドの構造解析が行われている。例えば、特開平１０−９０２２６号公報において、質量分析におけるタンパク質・ペプチドのフラグメントイオンの発生を容易にする方法として、ペプチドのＮ末端やＣ末端に電荷を有するアミノ酸で化学修飾を行う方法が記載されている。
【０００３】
また、糖鎖構造解析の分野においても、タンデム質量分析計を用いたＭＳ／ＭＳ解析が主流になりつつある。例えば、Rapid Communication in Mass Spectrometry, vol. 10, 1027-1032(1996)において、MALDI-TOF-MS装置によるシアル酸の付加糖鎖の測定において、シアル酸のカルボキシル基をメチルエステル化することによって、シアル酸の脱離を抑制する方法が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−９０２２６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】アンドリュー・Ｋ・パウエル（Andrew K. Powell）、デビッド・Ｊ・ハーヴェイ（David J. Harvey）著、正イオンマトリックス支援脱離イオン化マススペクトロメトリーによる分析のためのＮ−結合型オリゴ糖及びガングリオシドにおけるシアル酸の安定化（Stabilization of Sialic Acids in N-linked Oligosaccharides and Gangliosides for Analysis by Positive Ion Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry）、「ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マス・スペクトロメトリー（Rapid Communications in Mass Spectrometry）」、１９９６年、第１０巻、ｐ．１０２７−１０３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
タンパク質・ペプチドのＭＳ／ＭＳ解析では、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基の部位において開裂が優先的に起こるため、他のアミノ酸残基の部位で開裂したフラグメントイオンが得にくい。従って、全体としてフラグメントイオンの検出率が悪く、解析が困難になる問題がある。
【０００７】
また、シアル酸含有糖鎖のＭＡＬＤＩをイオン源とする質量分析測定においては、ＩＳＤ（in source decay）やＰＳＤ（post source decay）でシアル酸の脱離が容易に起こるため、分子量関連イオンの絶対量が減少する。さらに、シアル酸含有糖鎖のＭＳ／ＭＳ解析では、シアル酸の脱離が優先的に起こり、解析に十分な他のフラグメントイオンを得ることが難しい。
【０００８】
本発明の目的は、質量分析において生体分子の解析感度を向上させる方法を提供することにある。また本発明の目的は、質量分析における解析感度を向上させる方法を用いて生体分子を迅速に且つ簡単に解析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明には、以下の発明が含まれる。
下記（１）〜（７）の発明は、標識アミド化法に向けられる。
（１）生体分子が有するカルボキシル基に、窒素原子同位体15Ｎで標識されたアミド化試薬を作用させることにより、前記生体分子の標識アミド化体を得る、標識アミド化法。
【００１０】
（２）前記生体分子がタンパク質又はペプチドである、（１）に記載の標識アミド化法。
すなわち、タンパク質又はペプチドが有するカルボキシル基に、窒素原子同位体15Ｎで標識されたアミド化試薬を作用させることにより、標識アミド化タンパク質又は標識アミド化ペプチドを得る、タンパク質又はペプチドの標識アミド化法。
（３）前記カルボキシル基が、タンパク質又はペプチドの酸性アミノ酸残基が有するカルボキシル基である、（１）又は（２）に記載の標識アミド化法。
（４）前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸及びアスパラギン酸から選ばれる、（３）に記載の標識アミド化法。
【００１１】
（５）前記生体分子が糖鎖である、（１）に記載の標識アミド化法。
すなわち、糖鎖が有するカルボキシル基に、窒素原子同位体15Ｎで標識されたアミド化試薬を作用させることにより標識糖鎖を得る、糖鎖の標識アミド化法。
（６）前記カルボキシル基が、糖鎖の酸性糖残基が有するカルボキシル基である、（
１）又は（５）に記載の標識アミド化法。
（７）前記酸性糖がシアル酸又はムラミン酸である、（６）に記載の標識アミド化法。
【００１２】
（８）前記アミド化試薬が塩化［15Ｎ］アンモニウムである、（１）〜（７）のいずれかに記載の標識アミド化法。
【００１３】
下記（９）〜（１２）の発明は、生体分子の解析方法に向けられる。
（９）生体分子が有するカルボキシル基をアミド化し、その後、得られた生体分子のアミド化体を質量分析法によって解析する、生体分子の解析方法。
（１０）（１）〜（８）のいずれかに記載の標識アミド化法によって解析すべき生体分子を標識アミド化し、その後、得られた生体分子の標識アミド化体を質量分析法によって解析する、生体分子の解析方法。
【００１４】
（１１）前記生体分子が、タンパク質又はペプチドである、（９）又は（１０）に記載の生体分子の解析方法。
すなわち、前記（９）の生体分子の解析方法においては、タンパク質又はペプチドが有するカルボキシル基をアミド化し、その後、得られたアミド化タンパク質又はアミド化ペプチドを質量分析法によって解析する、タンパク質又はペプチドの解析方法。
前記（１０）の生体分子の解析方法においては、（２）〜（４）及び（８）のいずれかに記載の標識アミド化法によって解析すべきタンパク質又はペプチドを標識アミド化し、その後、得られた標識タンパク質又は標識ペプチドを質量分析法によって解析する、タンパク質又はペプチドの解析方法。
【００１５】
（１２）前記生体分子が糖鎖である、（９）又は（１０）に記載の生体分子の解析方法。
すなわち、前記（９）の生体分子の解析方法においては、糖鎖が有するカルボキシル基をアミド化し、その後、得られたアミド化糖鎖を質量分析法によって解析する、糖鎖の解析方法。
前記（１０）の生体分子の解析方法においては、（５）〜（８）のいずれかに記載の標識アミド化法によって解析すべき糖鎖を標識アミド化し、その後、得られた標識糖鎖を質量分析法によって解析する、糖鎖の解析方法。
【００１６】
下記（１３）〜（１６）の発明は、標識アミド化体に向けられる。
（１３）カルボキシル基が15Ｎ標識アミド化された、生体分子の標識アミド化体。
（１４）前記生体分子が、質量分析により解析すべき生体分子である、（１３）に記載の標識アミド化体。
【００１７】
（１５）前記生体分子が、タンパク質又はペプチドである、（１３）又は（１４）に記載の標識アミド化体。
すなわち、前記（１３）の標識アミド化体においては、カルボキシル基が15Ｎ標識アミド化された、タンパク質又はペプチドの標識アミド化体。
前記（１４）の標識アミド化体においては、前記タンパク質又はペプチドが、質量分析により解析すべきタンパク質又はペプチドである、標識アミド化体。
【００１８】
（１６）前記生体分子が糖鎖である、（１３）又は（１４）に記載の標識アミド化体。
すなわち、前記（１３）の標識アミド化体においては、カルボキシル基が15Ｎ標識アミド化された、糖鎖の標識アミド化体。
前記（１４）の標識アミド化体においては、前記糖鎖が、質量分析により解析すべき糖鎖である、糖鎖の標識アミド化体。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、アミド化法を用いることにより、質量分析において生体分子の解析感度を向上させる方法を提供することができる。又本発明によると、質量分析における解析感度を向上させる方法を用いて生体分子を迅速に且つ簡単に解析する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ミオグロビントリプシン消化断片ＶＥＡＤＩＡＧＨＧＱＥＶＬＩＲ(m/z=1606）の、アミド化反応を行わなかった（non-amidation）もの、非標識アミド化反応（amidation(14Ｎ)）を行ったもの、及び標識アミド化反応（amidation(15Ｎ)）を行ったものについての質量分析結果である。
【図２】ＳＬＮＦＰ(m/z=1144)の、アミド化反応を行わなかったもの、非標識アミド化反応を行ったもの、及び標識アミド化反応を行ったものについてのMSスペクトルである。
【図３】ＳＬＮＦＰ(m/z=1144)の、アミド化反応を行わなかったもの、非標識アミド化反応を行ったもの、及び標識アミド化反応を行ったものについてのMS/MSスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の記述は、標識アミド化法に関する。
本発明は、生体分子が有するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）を15Ｎ標識アミド化して15Ｎ標識カルバモイル基（−ＣＯ15ＮＨ2基）に変換する方法である。生体分子としては、タンパク質・ペプチドや糖鎖等が挙げられる。なお本明細書において、「生体分子」とは生体高分子を含む意味で用いる。
【００２２】
以下、本発明の標識アミド化法の一例として、タンパク質又はペプチドを標識アミド化する方法について説明する。この例においては、タンパク質又はペプチドの酸性アミノ酸残基のカルボキシル基を標識アミド化する。上記酸性アミノ酸としては、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸のいずれであっても良い。α−アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。すなわち本発明によって例えばアスパラギン酸はアスパラギンに、グルタミン酸はグルタミンに変換される。なお本発明においては、標識アミド化すべきタンパク質又はペプチドが無置換のＣ末端を有している場合、Ｃ末端カルボキシル基も標識アミド化される。
【００２３】
標識アミド化の試薬としては、アミド化試薬として用いることができる化合物の、窒素同位体15Ｎによる標識体を特に限定することなく用いることができる。例えば、塩化［15Ｎ］アンモニウム等を用いることができる。標識アミド化の方法としては、標識アミド化試薬を用いることの他は特に限定することなく、公知のアミド化法を用いることができる。例えば、タンパク質又はペプチドを必要に応じて変性剤で処理し、標識アミド化剤と縮合剤とを用いて標識アミド化を行うことができる。縮合剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、シアナミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のカルボジイミド等を用いることができる。
【００２４】
本発明においては、カルボジイミドを縮合剤として用いるカルボジイミド法を用いることが好ましい。このとき、標識アミド化試薬として塩化［15Ｎ］アンモニウムを用いることが好ましい。また、カルボジイミドとしては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いることが好ましい。カルボジイミド法を用いる場合、例えば以下のように標識アミド化を行うことができる。タンパク質を、塩酸グアニジンを存在させた塩化［15Ｎ］アンモニウム水溶液に溶解し、塩酸グアニジンを存在させたカルボジイミドを加えて反応させる。塩化［15Ｎ］アンモニウムの量としては、タンパク質６００ｐｍｏｌに対して５００ｍＭ〜１Ｍ程度のものを５０μｌ用いるとよい。カルボジイミドの量としては、塩化［15Ｎ］アンモニウムの０．０８〜０．２倍当量程度を用いることができる。またこの反応は、４〜３０℃で１〜１２時間程度の条件下で行うことができる。
【００２５】
以上のようにして、タンパク質又はペプチドのカルボキシル基を標識アミド化することができる。本発明の標識アミド化は、タンパク質・ペプチドを質量分析によって解析する場合に特に有用である。
【００２６】
以下、本発明の標識アミド化法の他の一例として、糖鎖を標識アミド化する方法について説明する。この例においては、糖鎖の酸性糖残基のカルボキシル基を標識アミド化する。上記酸性糖としては、シアル酸、ムラミン酸等が挙げられる。本発明の標識アミド化法は、特にシアル酸において有用である。ここでシアル酸は、ノイラミン酸のＮ−アシル体及びその誘導体であり、具体的にはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸等が挙げられる。
【００２７】
標識アミド化の試薬としては、アミド化試薬として用いることができる化合物の、窒素同位体15Ｎによる標識体を特に限定することなく用いることができる。例えば、塩化［15Ｎ］アンモニウム等を用いることができる。標識アミド化の方法としては、標識アミド化試薬を用いることの他は特に限定することなく、公知のアミド化法を用いることができる。例えば、糖鎖を標識アミド化剤と縮合剤とを用いて標識アミド化を行うことができる。縮合剤としては、上述のタンパク質・ペプチドの標識アミド化法におけるものを用いることもできるが、好ましくは４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）が用いられる。例えば、標識アミド化剤に塩化［15Ｎ］アンモニウムを用い、縮合剤にＤＭＴ−ＭＭを用いる場合、塩化［15Ｎ］アンモニウムは糖鎖の５万〜５０万倍当量程度、ＤＭＴ−ＭＭは塩化［15Ｎ］アンモニウムの０．１〜０．５倍当量程度を用いることができる。またこの反応は、３０〜６０℃で５〜４８時間程度の条件下で行うことができる。
【００２８】
以上のようにして、糖鎖を標識アミド化することができる。本発明の標識アミド化は、糖鎖を質量分析によって解析する場合に特に有用である。
【００２９】
以下の記述は、標識アミド化体に関する。
本発明は、カルボキシル基が15Ｎ標識アミド化された、生体分子のアミド化体である。このアミド化体は、上記の標識アミド化法において記載したように、生体分子を標識アミド化することによって得ることができる。生体分子としては、タンパク質、ペプチド、糖鎖等が挙げられる。解析したい生体分子の標識アミド化体である場合は、質量分析によって解析する場合に特に有用に用いられる。
【００３０】
以下の記述は、生体分子の解析方法に関する。
本発明は、生体分子が有するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）をアミド化してカルバモイル基（−ＣＯＮＨ2基）に変換する処理を行うことにより生体分子の解析を行う方法である。解析すべき生体分子としては、タンパク質・ペプチドや糖鎖等が挙げられる。
【００３１】
以下、本発明の生体分子の解析方法の一例として、タンパク質又はペプチドを解析する方法について説明する。この例においては、タンパク質又はペプチドの酸性アミノ酸残基のカルボキシル基をアミド化する。上記酸性アミノ酸としては、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸のいずれであっても良い。α−アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。すなわち本発明によって例えばアスパラギン酸はアスパラギンに、グルタミン酸はグルタミンに変換される。なお本発明においては、アミド化すべきタンパク質又はペプチドが無置換のＣ末端を有している場合、Ｃ末端カルボキシル基もアミド化される。
【００３２】
本発明のタンパク質・ペプチドの解析法においては、解析すべきタンパク質又はペプチドのカルボキシル基をアミド化し、得られたアミド化タンパク質又はアミド化ペプチドを質量分析によって解析する。アミド化タンパク質又はアミド化ペプチドは、質量分析に供する前に、必要に応じて遠心分離、還元−カルボキシメチル化、断片化、脱塩等の処理を行うと良い。これらの処理は、公知の方法を利用して行うことができる。
【００３３】
本発明の解析方法においては、アミド化は、カルボキシル基を非標識カルバモイル基（−ＣＯ14ＮＨ2基）に変換することと、標識カルバモイル基（−ＣＯ15ＮＨ2基）に変換することとの両方を含む。非標識アミド化法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。また標識アミド化法としては、上述したタンパク質又はペプチドの標識アミド化法を用いることができる。
【００３４】
本発明の解析方法においてアミド化を行うことは、以下の点で好ましい。すなわち、優先的な開裂が起こりやすいアスパラギン酸残基やグルタミン酸残基等の酸性アミノ酸残基の部位がアミド化によって無くなるため、他のアミノ酸残基の部位においても開裂が起こりやすくなり、多種類のフラグメントイオンを検出することができる。従って、より多くの配列情報を得ることができる。
【００３５】
本発明の解析方法においては、以下の理由で、標識アミド化を行うことが特に好ましい。すなわち、標識アミド化によって−ＣＯＯＨ基を−ＣＯ15ＮＨ2基に変換することで、解析すべきタンパク質・ペプチドと標識アミド化タンパク質・ペプチドとの質量差がカルボキシル基１個あたり０．０１３０１９３８と極微小に抑えられる。すなわち、標識アミド化前後でタンパク質・ペプチドの質量がほとんど変わらない。このため、質量分析によって得られる質量データは、標識アミド化前のもとの解析すべきタンパク質・ペプチドの質量をほぼ反映しており、質量分析データからもとのタンパク質・ペプチドの解析をより容易に行うことができる。従って、ペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）解析やＭＳ／ＭＳイオンサーチ（ＭＩＳ）解析において、データベースとの照合が容易であり、迅速にかつ容易にタンパク質・ペプチドの同定を行うことができる。
【００３６】
一方、非標識アミド化を行った場合は、解析すべきタンパク質・ペプチドと非標識アミド化タンパク質・ペプチドとでカルボキシル基１個あたり約１の質量差が生じる。ＰＭＦ解析やＭＩＳ解析においては、非標識アミド化による質量変化が質量誤差として支障となることもある。
【００３７】
以下、本発明の生体分子の解析方法の他の一例として、糖鎖を解析する方法について説明する。この例においては、糖鎖が有する酸性糖残基のカルボキシル基をアミド化する。上記酸性糖としては、シアル酸、ムラミン酸等が挙げられる。得られたアミド化糖鎖は、質量分析によって解析する。
【００３８】
本発明の解析方法においては、アミド化は、カルボキシル基を非標識カルバモイル基（−ＣＯ14ＮＨ2基）に変換することと、標識カルバモイル基（−ＣＯ15ＮＨ2基）に変換することとの両方を含む。非標識アミド化法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。また標識アミド化法としては、上述した糖鎖の標識アミド化法を用いることができる。
【００３９】
本発明の解析方法においてアミド化を行うことは、以下の点で好ましい。例えばシアル酸含有糖鎖の場合、優先的な脱離が起こりやすいシアル酸の部位がアミド化によって無くなる。このため、ISDやPSDにおいてシアル酸の脱離が抑制される分、分子量関連イオンの絶対量が増加し、感度が向上する。またMS/MS解析においては、シアル酸の脱離が抑制され、他の部位由来のフラグメントイオンが検出される。このことを利用し、シアル酸付加イオンをプレカーサーイオンとしたMS/MSスペクトルと、シアル酸脱離イオンをプレカーサーイオンとしたMS/MSスペクトルとから、より詳細な糖鎖構造解析を行うことが可能となる。
【００４０】
本発明の解析方法においては、以下の理由で、標識アミド化を行うことが特に好ましい。すなわち、標識アミド化によって−ＣＯＯＨ基を−ＣＯ15ＮＨ2基に変換することで、解析すべき糖鎖と標識アミド化糖鎖との質量差がカルボキシル基１個あたり０．０１３０１９３８と極微小に抑えられる。すなわち、標識アミド化前後で糖鎖の質量がほとんど変わらない。このため、質量分析によって得られる質量データは、標識アミド化前のもとの解析すべき糖鎖の質量をほぼ反映しており、質量分析データからもとの糖鎖の解析をより容易に行うことができる。従って、糖鎖のデータベース解析において、質量変化を考慮する手間を省くことが可能となり、迅速にかつ容易に糖鎖の同定を行うことができる。
【００４１】
一方、非標識アミド化を行った場合は、解析すべき糖鎖と非標識アミド化糖鎖とでカルボキシル基１個あたり約１の質量差が生じる。糖鎖のデータベース解析においては、非標識アミド化による質量変化が質量誤差として支障となることもある。
【実施例】
【００４２】
［実施例１］
ミオグロビンに対し、塩化［14Ｎ］アンモニウム及び塩化［15Ｎ］アンモニウムを用いて、アミド化が行われることを質量分析によって確認する実験をそれぞれ行った。
【００４３】
非標識アミド化については、以下のように行った。
ミオグロビン６００pmolを、５Ｍ 塩酸グアニジン／１Ｍ 14ＮＨ4Ｃｌ ５０μlに溶解した。この溶液に、５Ｍ 塩酸グアニジン／０．４Ｍ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を１５μl添加して反応液を調製し、得られた反応液を室温で２時間インキュベーションした。マイクロコンＹＭ−１０（ミリポア社製）に反応液を加え、さらに０．００１Ｍ ＨＣｌを３３５μl加え、１４０００rpm、４℃で７０分遠心した。さらに０．００１Ｍ ＨＣｌを４００μl加え、１４０００rpm、４℃で７０分遠心した。その後、５０ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3を加え、溶液の全量が１００μlになるように調製した。これに１Ｍ ＤＤＴを１μl添加し、５６℃で１時間インキュベーションした。さらに１Ｍ ヨードアセトアミドを５．５μl添加し、室温で４５分インキュベーションした。その後、１００ｍＭ ＣａＣｌ2を５μl加えた。Sequencing Grade Modified Trypsin（プロメガ社製）を６pmol添加し、３７℃で１６時間インキュベーションした。０．１重量％ＴＦＡを１０μl添加し、ZipTip μ-C18（ミリポア社製）を用いて脱塩精製を行うことにより、ミオグロビンのトリプシン消化断片を得た。
【００４４】
標識アミド化については、14ＮＨ4Ｃｌの代わりに15ＮＨ4Ｃｌを用いた以外は、上記非標識アミド化と同様に行うことにより、ミオグロビンの消化断片を得た。
【００４５】
別途用意したアミド化されていないミオグロビンのトリプシン消化断片と、上記非標識及び標識アミド化によって得られたトリプシン消化断片とについて、それぞれAXIMA-QIT（島津製作所製）によって質量分析を行った結果を図１の（a）及び（b）に示す。すなわち図１の（a）及び（b）は、ＶＥＡＤＩＡＧＨＧＱＥＶＬＩＲ（配列番号１）の配列を有するミオグロビントリプシン消化断片(m/z=1606）（以下、単にペプチドと表記する。）の、アミド化反応を行わなかった（non-amidation）ものと、非標識アミド化反応（amidation(14Ｎ)）を行ったものと、標識アミド化反応（amidation(15Ｎ)）を行ったものとのスペクトルを比較して表している。なお、図１中のスペクトルはいずれも、横軸に質量／電荷（Mass/Charge）を表し、縦軸にフラグメントイオンの相対強度（%Int.）を表す。
【００４６】
図１において、（a）の下段は、アミド化反応を行わなかった（non-amidation）ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルである。このスペクトルは、（b）の下段のピーク（m/z=1606.85）をプレカーサイオン（Precursor ion）として測定した。（a）の中段は、非標識アミド化反応（amidation(14Ｎ)）を行ったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルである。このスペクトルは、（b）の中段のピーク（m/z=1603.91）をプレカーサイオン（Precursor ion）として測定した。（a）の上段は、標識アミド化反応（amidation(15Ｎ)）を行ったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルである。このスペクトルは、（b）の上段のピーク（m/z=1606.89）をプレカーサイオン（Precursor ion）として測定した。
【００４７】
ペプチドの非標識アミド化が行われれば、非標識アミド化ペプチドにおいては、アミド化反応を行わなかったペプチドよりも、反応によって変換されたカルボキシル基１個あたり質量数が約１Ｄａ小さくなる。図１によると、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいてペプチド中の同じ部位で切断されて生成したフラグメントイオン同士の質量数を比較した場合、非標識アミド化反応を行ったペプチドから生成したフラグメントイオンの方が、アミド化反応を行わなかったペプチドから生成したフラグメントイオンよりも、上記非標識アミド化反応によって変換されたカルボキシル基の数だけ小さい。以上のことから、非標識アミド化反応によってペプチドの非標識アミド化が行われたことが示された。
【００４８】
さらに、非標識アミド化によって、ペプチドにおけるアスパラギン酸及びグルタミン酸部位での優先的な開裂が抑制されたため、非標識アミド化反応を行わなかったペプチドには検出されなかった他のフラグメントイオンが検出された。また、内部配列断片（Internal fragment）のフラグメントイオンも新たに検出された。このように、ペプチドの非標識アミド化を行うことによってフラグメントイオンの検出率が向上したことが示された。
【００４９】
また、標識アミド化反応を行ったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルにおいては、アミド化反応を行わなかったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるものとほぼ同じ質量数を有するフラグメントイオンが検出された。さらに、標識アミド化反応を行わなかったペプチドには検出されなかった他のフラグメントイオンが検出された。また、内部配列断片（Internal fragment）のフラグメントイオンも新たに検出された。このことと、上述の非標識アミド化による結果とから、標識アミド化反応によってもペプチドの標識アミド化が行われたことが示された。従って、ペプチドの標識アミド化を行うことによっても、ペプチドにおけるアスパラギン酸及びグルタミン酸部位での優先的な開裂が抑制され、その結果、フラグメントイオンの検出率が向上したことが示された。
【００５０】
上述のことから、ペプチドのアミド化によって質量分析における解析の感度が上昇したことが示された。
【００５１】
［実施例２］
シアル酸含有糖鎖であるシアリルラクト−Ｎ−フコペンタオース（Sialyllacto-N-Fucopentaose；ＳＬＮＦＰ、Exact Mass:1144.40）に対し、塩化［14Ｎ］アンモニウム及び塩化［15Ｎ］アンモニウムを用いて、アミド化が行われることを質量分析によって確認する実験をそれぞれ行った。なお、ＳＬＮＦＰは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（NeuNAc）、ガラクトース（Galactose）、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）、グルコース（Glucose）、及びフコース（Fucose）を構成糖とする糖鎖である。ＳＬＮＦＰの構造は、後述の図２中に記載した。
【００５２】
非標識アミド化については、以下のように行った。
１nmol/μl Sialyllacto-N-Fucopentaose IV（ＳＬＮＦＰ）水溶液１μlを、５０μlの１M 14ＮＨ４Ｃｌ水溶液に添加し、１５μlの１M ４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）水溶液を加え（pH４．２）、３７℃で２４時間インキュベーションした。
直径１cm×高さ５．５cmのリアクションベッセル（島津製作所製）にSephadex G-10（アマシャムバイオサイエンス製）を２．３ml充填し、大気圧下で、生成物のゲルろ過クロマトグラフィーを行った。２６〜２８drop目（１drop≒４０μl）を回収し、遠心乾燥を行った。
乾燥した回収物を５μlのＨ２Ｏに溶解し、１μlを非標識アミド化ＳＬＮＦＰの質量分析測定用試料とした。
【００５３】
標識アミド化については、14ＮＨ4Ｃｌの代わりに15ＮＨ4Ｃｌを用いた以外は、上記非標識アミド化と同様に行うことにより、標識アミド化ＳＬＮＦＰの質量分析測定用試料を得た。
【００５４】
別途用意したアミド化されていないＳＬＮＦＰと、上記非標識及び標識アミド化によって得られたＳＬＮＦＰとについて、それぞれによって質量分析を行った結果を図２及び図３に示す。図２には、ＳＬＮＦＰの構造も示す。図２のＡは、AXIMA-CFR（島津製作所製）によるMSスペクトルである。図２のＢは、Ａにおける分子量関連イオンのＮａ＋付加体のピーク（［Ｍ＋Ｎａ］＋）の拡大スペクトルである。図３は、AXIMA-QIT（島津製作所製）による、［Ｍ＋Ｎａ］＋をプレカーサーイオンとしたMS/MSスペクトルである。また、図２及び図３のスペクトルにおいて、上段スペクトルは、15ＮＨ4Ｃｌによる標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのもの、中段スペクトルは、14ＮＨ4Ｃｌによる非標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのもの、下段スペクトルは、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのものである。なお、これらのスペクトルはいずれも、横軸に質量／電荷（Mass/Charge）を表し、縦軸にフラグメントイオンの相対強度を表す。
【００５５】
糖鎖の非標識アミド化が行われれば、非標識アミド化糖鎖においては、アミド化反応を行わなかった糖鎖よりも、反応によって変換されたカルボキシル基１個あたり質量数が約１Ｄａ小さくなる。図２のＡ及びＢによると、14ＮＨ4Ｃｌによる非標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（中段）におけるＮａ＋が付加した分子量関連イオンピーク（m/z=1166.59）は、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）におけるＮａ＋が付加した分子量関連イオンピーク（m/z=1167.48）よりも１Ｄａ小さくなっている。これは、ＳＬＮＦＰが有する１個のＮ−アセチルノイラミン酸のカルボキシル基がカルバモイル基に変換されたことに相当する。このことから、14ＮＨ4Ｃｌによる非標識アミド化反応によって糖鎖の非標識アミド化が行われたことが示された。
【００５６】
さらに図２のＡ及びＢによると、非標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（中段）のシアル酸脱離ピーク（m/z=876.34）は、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）のシアル酸脱離ピーク（m/z=876.42）よりもイオン強度が小さくなっている。このことから、ISDやPSDによりシアル酸の脱離が抑制されたことが示された。
【００５７】
さらに、MS/MSの結果である図３によると、非標識アミド化されたＳＬＮＦＰのスペクトル（中段）においては、アミド化されなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）に比べてのシアル酸脱離ピーク（m/z=876付近）のイオン強度が小さくなるとともに他のフラグメントイオンが新たに検出されている。これは、非標識アミド化によって質量分析における糖鎖のシアル酸の脱離が抑制されたために他のフラグメントイオンの検出率が向上したことを示す。この結果、糖鎖の構造決定が容易になった。
【００５８】
そして、図２のＡによると、15ＮＨ4Ｃｌによる標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（上段）におけるＮａ＋が付加した分子量関連イオンピーク（m/z=1167.44）は、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）におけるＮａ＋が付加した分子量関連イオンピーク（m/z=1167.48）とほぼ同じ質量数を有するものであった。さらに、MS/MSの結果である図３によると、標識アミド化反応を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（上段）においては、非標識アミド化を行ったＳＬＮＦＰのスペクトル（中段）におけるように、アミド化反応を行わなかったＳＬＮＦＰのスペクトル（下段）に比べてシアル酸脱離ピークのイオン強度が小さくなるとともに他のフラグメントイオンの検出率が向上した。このことから、15ＮＨ4Ｃｌによる標識アミド化反応によって糖鎖の標識アミド化が行われたことが示された。さらに、非標識アミド化と標識アミド化とにおいて、同位体によって質量差の異なるピークが検出されること以外は、糖鎖の開裂パターンやイオンの検出率への同位体による影響はないことが確認された。
【００５９】
上述のことから、糖鎖のアミド化によって質量分析における解析の感度が上昇したことが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖が有するカルボキシル基に、塩化［14Ｎ］アンモニウム及び塩化［15Ｎ］アンモニウムからなる群から選ばれるアミド化試薬と、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物とを用いてアミド化を行い、前記糖鎖のアミド化体を得る、糖鎖のアミド化法。
【請求項２】
前記カルボキシル基が、糖鎖の酸性糖残基が有するカルボキシル基である、請求項１に記載のアミド化法。
【請求項３】
前記酸性糖がシアル酸又はムラミン酸である、請求項２に記載のアミド化法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のアミド化法によって解析すべき糖鎖をアミド化し、その後、得られた生体分子のアミド化体を質量分析法によって解析する、糖鎖の解析方法。
【請求項１】
糖鎖が有するカルボキシル基に、塩化［14Ｎ］アンモニウム及び塩化［15Ｎ］アンモニウムからなる群から選ばれるアミド化試薬と、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物とを用いてアミド化を行い、前記糖鎖のアミド化体を得る、糖鎖のアミド化法。
【請求項２】
前記カルボキシル基が、糖鎖の酸性糖残基が有するカルボキシル基である、請求項１に記載のアミド化法。
【請求項３】
前記酸性糖がシアル酸又はムラミン酸である、請求項２に記載のアミド化法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のアミド化法によって解析すべき糖鎖をアミド化し、その後、得られた生体分子のアミド化体を質量分析法によって解析する、糖鎖の解析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１５６７１９（Ｐ２０１０−１５６７１９Ａ）
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９５２４８（Ｐ２０１０−９５２４８）
【出願日】平成２２年４月１６日（２０１０．４．１６）
【分割の表示】特願２００４−２４１７１４（Ｐ２００４−２４１７１４）の分割
【原出願日】平成１６年８月２０日（２００４．８．２０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年６月４日日本質量分析学会主催の「第５２回資料分析総合討論会」において文書をもって発表
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【出願人】（５０６２８６９２８）地方独立行政法人 大阪府立病院機構 (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１６日（２０１０．４．１６）
【分割の表示】特願２００４−２４１７１４（Ｐ２００４−２４１７１４）の分割
【原出願日】平成１６年８月２０日（２００４．８．２０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年６月４日日本質量分析学会主催の「第５２回資料分析総合討論会」において文書をもって発表
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【出願人】（５０６２８６９２８）地方独立行政法人 大阪府立病院機構 (13)
【Ｆターム（参考）】
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