糖鎖構造に特異的な抗体の同定方法
【課題】 ファージ提示型抗体ライブラリーと糖鎖を用いて、ある特定の構造を有する糖鎖に特異的に結合する抗体を同定する方法を提供すること。
【解決手段】 糖鎖に対してファージ提示型抗体を接触させることを含む、上記糖鎖に対して特異的に結合する抗体を同定する方法。
【解決手段】 糖鎖に対してファージ提示型抗体を接触させることを含む、上記糖鎖に対して特異的に結合する抗体を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖結合性抗体の同定方法に関する。より詳細には、本発明は、ファージ提示型抗体ライブラリーと固相固定化糖鎖との結合を解析することによって糖鎖と特異的に結合する抗体を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複合糖質分子あるいは細胞表面の糖鎖は様々な生命現象に関与している。とりわけ、癌などの疾患に伴い糖鎖の構造あるいは組織内分布が変化するという知見から、糖鎖を調べることで疾患の原因や進行のメカニズムの解明につながることが期待されている。そのため、分子あるいは組織内に分布する特定糖鎖を簡便かつ高い精度で検出することが重要視されている。
【０００３】
従来、組織内あるいは分子の特定糖鎖を検出するためには、目的とする糖鎖を認識するレクチンや抗体が用いられている。しかし、レクチンの糖に対する特異性は低く、糖残基の結合様式やオリゴ糖構造を識別するといった糖鎖構造の詳細な解析には適していない。また、免疫学的手法で作製された抗体は高い特異性を有しているが、抗原性を有する糖鎖に対する抗体が得られず、その種類も限られている。
【０００４】
一方、ファージディスプレイ法を応用した糖結合性ファージ提示型抗体は、免疫学的手法を用いないで作製されるため、免疫原性に関わりなく多種類の抗体が得られること、また、抗体特有の高い特異性で複雑な構造の糖鎖を識別可能であることが期待される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ファージ提示型抗体ライブラリーと糖鎖を用いて、ある特定の構造を有する糖鎖に特異的に結合する抗体を同定する方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、上記方法により得られる抗体並びに抗体ライブラリーを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の構造を有する糖鎖に対してファージ提示型抗体を接触させることによって上記糖鎖に対して特異的に結合する抗体を選択的に増幅し同定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば、糖鎖に対してファージ提示型抗体を接触させることを含む、上記糖鎖に対して特異的に結合する抗体を同定する方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、糖鎖は固相に固定化されている。
好ましくは、糖鎖は糖脂質であり、さらに好ましくは人工糖脂質である。
好ましくは、糖鎖を構成する糖成分としては、例えば、Ｄ−マンノース（Ｄ−Ｍａｎ）、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、またはＤ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）がある。
【０００９】
好ましくは、ファージ提示型抗体は、ヒト型一本鎖ファージライブラリーである。
好ましくは、ファージ提示型抗体は、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅し、それらを混合し鋳型として、ＰＣＲ法によりＶＨ又はＶＬ領域を増幅し、増幅したこれらのＤＮＡ断片をそれぞれ非発現型ファージミドベクターに組込み、ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーを作製し、これらの大腸菌ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーにヘルパーファージを感染させ、ファージライブラリーに変換し、これらファージ型ＶＨおよびＶＬライブラリーをＣｒｅ組換え酵素を発現する大腸菌に共感染させて大腸菌内でＶＨ・ＶＬベクター間で組換え反応を行い、この大腸菌にヘルパーファージを感染させて完全長一本鎖抗体を発現するファージを作製することにより得られるものである。
【００１０】
好ましくは、ファージ提示型抗体は、ヒト型一本鎖ファージライブラリーから、所定の糖鎖構造を有する人工糖脂質に対する結合能を指標にして回収されたものである。
【００１１】
好ましくは、本発明の方法は、ヒト型一本鎖ファージライブラリーを用意し、所定の糖鎖構造を有する人工糖脂質に対する結合能を指標にして当該糖鎖構造に結合するヒト型一本鎖ファージをパニングにより取得し、取得したヒト型一本鎖ファージを固相に固定化されている糖鎖に接触させることを含む方法である。
【００１２】
好ましくは、糖鎖とファージ提示型抗体との結合を、検出可能な物質で標識されている抗ファージ抗体を用いて検出する。
好ましくは、糖鎖とファージ提示型抗体との結合を、ＥＬＩＳＡにより検出する。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法により単離される、ある特定の糖鎖に対して特異的に結合する抗体又は抗体ライブラリーが提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、後述するＭ３−ＤＰＰＥに特異的な結合能を有する、配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列を有する抗体が提供される。本発明の抗体としては、例えば、配列番号３及び４に記載のアミノ酸配列を有する抗体である。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、並びに配列番号３及び４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、これまで単離が不可能であった各種の糖鎖に特異的な抗体を取得することが可能になり、これにより抗体ライブラリーを構築することが可能になる。本発明の方法は、個体を免疫してポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製する従来の方法とは本質的に異なる。即ち、本発明では、抗体産生機構を生体外で達成できるファージディスプレイ法を活用することにより、個体が認識できない糖鎖抗原を含む各種糖鎖に特異的かつ高親和性で結合する抗体を単離することができる。さらに本発明の方法で得られる一本鎖抗体の遺伝子操作により、改良型の二次単鎖抗体を作製することも可能であり、単鎖抗体の量産も容易である。また、本発明で得られた抗体の遺伝子操作によりトキシンや酵素などのタンパク質の糖鎖特異的デリバリーも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態についてより具体的に説明する。
（１）人工糖脂質
本発明で用いる糖脂質としては、例えば、特許第２８２８３９１号公報に記載の人工糖脂質を用いることができる。オリゴ糖を構成する糖成分の種類は特に限定されないが、例えば、Ｄ−マンノース（Ｄ−Ｍａｎ）、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）などの単糖が挙げられる。
【００１７】
さらに、シアル酸残基を有するスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドを用いることもできる。なお、ガングリオシドは、細胞膜表面に存在し、細胞の増殖、分化あるいはシグナル伝達などを調節することが知られている、また、ガングリオシドは、癌細胞の浸潤や転移において他の細胞や組織との相互作用プロセスにも関与していることが知られている。
【００１８】
オリゴ糖中で、各構成糖は、α１→２結合、α１→３結合、α１→４結合、α１→６結合またはβ１→４結合等あるいはこれらの組み合わせにより結合したものである。例えば、マンノースは上記の結合により直鎖を構成してもよく、又はα１→３結合、α１→６結合との組み合わせにより分岐構造をとってもよい。オリゴ糖中の単糖の数は、好ましくは２から１１個である。
【００１９】
具体的なオリゴ糖として、例えばマンノビオース（Ｍ２）、マンノトリオース（Ｍ３）、マンノテトラオース（Ｍ４）、マンノペンタオース（Ｍ５）、マンノヘキサオース（Ｍ６）、マンノヘプタオース（Ｍ７）、種々の混合オリゴ糖、例えば下記に示すＭ５（化１）及びＲＮ（化２）等を挙げることができる。
【００２０】
【化１】
【００２１】
【化２】
【００２２】
さらに、グルコースを含有するオリゴ糖として化３に示す構造を有するものを挙げることができ、Ｎ−アセチルグルコサミンを含むオリゴ糖として化４に示すものを挙げることができ、そしてフコースを含むオリゴ糖として化５に示すものを挙げることができる。
【００２３】
【化３】
【００２４】
【化４】
【００２５】
【化５】
【００２６】
これらのオリゴ糖は、いずれも１個の還元末端アルデヒド基を有する。そこで、このアルデヒド基を、オリゴ糖を固定化するための手段として使用することができる。すなわち、このアルデヒド基とアミノ基を有する脂質との間に反応によりシッフ塩基を形成し、次にこのシッフ塩基を常法に従って還元、好ましくは化学還元、例えばＮａＢＨ3ＣＮによりオリゴ糖と脂質とを結合することができる（水落次男・中田宗宏、グライコバイオロジー実験プロトコール、４２−４７頁、秀潤社、１９９６）。
【００２７】
上記のアミノ基を有する脂質は、好ましくはアミノ基を有するリン脂質であり、例えばジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等を使用することができる。上記のようにして得られたオリゴ糖と脂質との結合物を本発明においては人工糖脂質と称する場合がある。
【００２８】
本発明で用いる糖脂質は、前記の人工糖脂質であってもよいし、さらには、天然物、例えば牛脳、ガン細胞、またはその他の動植物から得られる糖脂質、これらの糖脂質を修飾したもの、例えば、糖転移酵素を作用させ糖鎖を付加したもの、あるいは化学合成したものを使用することができる。具体的には、例えば、ガングリオシド（ＧＴ１ａ、ＧＤ１ａ、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＭ４、ＧＱ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰ１ｃ、ＧＱ１ｃ、ＧＴ１ｃ、ＧＴ２およびＧＴ３）等が挙げられる。
【００２９】
（２）抗原コートプレート
抗原となる人工糖脂質を溶解する溶剤は特に限定しないが、クロロホルム／メタノール／水（１０：１０：３、体積比）に溶解後、さらにメタノールで、例えば４０μｇ／ｍｌに希釈することが望ましい。この溶液を、例えば９６ウェルプラスチックプレート（平底）に加えて風乾させ、人工糖脂質をウェルに固定化させる。このウェルをブロッキングし、洗浄する。かかる操作で人工糖脂質をコートしたプレートを、抗原コートプレートと称する場合がある。
【００３０】
緩衝液にはトリス緩衝生理食塩水（以下、ＴＢＳという）を用いることが望ましい。また、ブロッキング用溶液としては例えば３％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ（以下、３％ＢＳＡ／ＴＢＳという）が、洗浄溶液としては例えば０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（以下、ＴＢＳ−Ｔという）が望ましい。
【００３１】
（３）ファージ提示型抗体
ファージ提示型抗体は、公知の方法により作製することができる（Ｍａｒｋｓ ＪＤほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２巻５８１−５９７頁、１９９１年；Ｎｉｓｓｉｍ Ａほか、ＥＭＢＯ Ｊ．１３巻６９２−６９８頁、１９９４年；高柳淳・奥井理予・清水信義、超レパートリー人工抗体ライブラリ、出願番号 特願２００１−３５８６０２（国際公開番号ＷＯ０３／０４４１９号））。
【００３２】
ファージ提示型抗体ライブラリーは、繊維状ファージのコートタンパク質に抗体を融合させることにより、ファージの表面上に抗体を提示（ディスプレイ）するシステムを応用したものである。具体的には、抗体遺伝子をＰＣＲで増幅して多種類の抗体遺伝子を含むライブラリーを作製し、これをファージ上に提示させることによってファージディスプレイライブラリーとすることができる。以下に、ファージ提示型単鎖抗体の作製方法の具体例を示すが、これに限定されるものではない。
【００３３】
ヒト末梢血および脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅する。それらを混合し鋳型として、ＰＣＲ法によりＶＨ又はＶＬ領域を増幅する。増幅したこれらのＤＮＡ断片をそれぞれ非発現型ファージミドベクターに組込み、ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーを作製する。これらの大腸菌ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーに、ヘルパーファージを感染させ、ファージライブラリーに変換する。これらファージ型ＶＨおよびＶＬライブラリーをＣｒｅ組換え酵素を発現する大腸菌に共感染させ、大腸菌内でＶＨ・ＶＬベクター間で組換え反応を行う。この大腸菌にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させ、完全長一本鎖抗体を発現するファージを生成させることができる。これらのファージに混入している非組換え体を取り除くため、このファージを多重感染が起こらないように大腸菌に感染させ、さらにヘルパーファージを重感染させ、アンピシリン・カナマシン・クロラムフェニコールを含みグルコースを含まない培地で２５℃で培養する。これにより上清中に組換え一本鎖抗体を発現するファージを得ることができる。上清中のファージをポリエチレングリコールで沈殿し、再懸濁し、１０の１１乗以上のレパートリーを有する人工抗体ライブラリーを得ることができる。
【００３４】
さらに目的の糖結合性を有するファージ提示型抗体は、上記方法により作製したヒト型一本鎖ファージライブラリーから、当該糖鎖構造を有する人工糖脂質に対する結合能を指標にして選択的に回収することができる。この操作をパニングと称する場合がある。
【００３５】
（４）ファージ提示型抗体の糖結合性解析法
パニングを繰り返して得られたファージ提示型抗体の糖結合性を解析する方法としては、例えば以下に述べるＥＬＩＳＡ法を応用して解析することが、多数のファージクローン試料について同時解析できる上で望ましい。すなわち、９６ウェルプラスチックプレートに糖鎖を固定化し、ファージ提示型抗体の非特異的吸着をなくすため、例えば３％ＢＳＡを含む緩衝液でブロッキングする。これに、緩衝液で適切な濃度に調製したファージ提示型抗体の懸濁液を加え、十分に反応させた後（例えば、３７℃で２時間）、緩衝液で洗浄する。
【００３６】
糖鎖に結合したファージ提示型抗体を検出・定量するため、検出に適切な物質で標識されている抗ファージ抗体の水溶液を反応させ、緩衝液で洗浄後、標識物質の検出に最適な手法で検出・定量する。このとき、抗ファージ抗体の標識物質は特に制限されないが、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼでの標識が、簡便さの点で望ましい。また、検出に用いる検出器も特に制限されないが、例えばＥＬＩＳＡに適したプレートリーダーを用いることが望ましい。
【００３７】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
実施例１：マンノトリオースあるいはラクト−Ｎ−フコペンタオースIIIに結合
能をもつファージ提示型単鎖抗体
（１）人工糖脂質の調製
先ず、マンノトリオース（Ｍ３）またはラクト−Ｎ−フコペンタオースIII（
ＬＮＦＰIII）２．５ｍｇに６００μlの蒸留水を加え溶解してオリゴ糖溶液を調製した。次に、クロロホルム/メタノール（１：１、体積比）混合液にＤＰＰＥを５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解してＤＰＰＥ溶液を調製した。また、メタノールにＮａＢＨ3ＣＮを１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解してＮａＢＨ3ＣＮ溶液を調製した。前記オリゴ糖の各溶液６００μlに前記ＤＰＰＥ溶液９．４ｍｌおよび前記ＮａＢＨ3ＣＮ溶液１ｍｌを加えて混合した。この混合液を６０℃にて１６時間保温し、人工糖脂質を生成させた。
【００３９】
前記のように合成した人工糖脂質はシリカゲルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）とＯＤＳカラムで精製した。シリカゲルカラムはＳｈｉｍ−ｐａｃｋ ＰＲＥＰ−ＳＩＬを用い、室温で行った。カラムをクロロホルム／メタノール／５０ｍＭ酢酸（６５：３０：５、体積比）で平衡化した後、同溶媒に溶解した人工糖脂質を含む試料を注入し、６０分間でクロロホルム、メタノールおよび５０ｍＭ酢酸の比が５０：５５：１８となる直線濃度勾配溶出を行った。流速は２ｍｌ／ｍｉｎであり、溶出液は４ｍｌずつ分画した。ＯＤＳカラムは５０ｍＭ酢酸で平衡化した後、同溶媒に溶解した人工糖脂質を含む試料をカラムに添加し、さらに同溶媒でカラムを洗浄後、５０％アセトニトリル、メタノール、およびクロロホルム／メタノール／５０ｍＭ酢酸（１０５：１００：２８、体積比）を順次流して人工糖脂質を溶出した。
【００４０】
（２）抗原コートプレートおよびファージ回収用プレートの作製
人工糖脂質をクロロホルム／メタノール／水（１０：１０：３、体積比）に１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、さらにメタノールで２５倍希釈する（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）。この溶液を９６ウェルプラスチックプレート（平底）に１ウェルあたり５０μｌ（２μｇ／ウェル）入れ、３７℃で静置し風乾させる。このウェルに３％ＢＳＡ／ＴＢＳを加え、４℃で一晩静置しブロッキングする。これをＴＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次にＴＢＳで1回洗浄する。
【００４１】
一方、別の９６ウェルプラスチックプレートに１５０μｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳを入れ、４℃で一晩静置し、ＴＢＳ−Ｔで２回、ＴＢＳで１回洗浄する。このプレートをファージ回収用プレートという場合がある。
【００４２】
（３）抗体ライブラリーの作製法
ヒト末梢血および脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅した。それらを混合し鋳型として、ＰＣＲ法によりＶＨ又はＶＬ領域を増幅した。
【００４３】
増幅したこれらのＤＮＡ断片をそれぞれ非発現型ファージミドベクターに組込み、ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーを作製した。それぞれ、１０の６乗および１０の５乗個以上のコロニーを含むように作製した。これら大腸菌ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーに、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させ、ファージライブ ラリーに変換した。これらファージ型ＶＨおよびＶＬライブラリーをＣｒｅ組換え酵素を発現する大腸菌に共感染させ、大腸菌内でＶＨ・ＶＬベクター間で組換え反応を行った。この大腸菌にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させ、完全長一本鎖抗体を発現するファージを生成させた。これらのファージに混入している非組換え体を取り除くため、このファージを多重感染が起こらないように大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株に感染させ、さらにＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを重感染させ、アンピシリン・カナマシン・クロラムフェニコールを含みグルコースを含まない培地で２５℃で培養した。これにより上清中に組換え一本鎖抗体を発現するファージを得た。上清中のファージをポリエチレングリコールで沈殿し、再懸濁し、１０の１１乗以上のレパートリーを有する人工抗体ライブラリーを得た。使用するまで−８０℃で凍結保存した。
【００４４】
（４）パニング操作
２５０μｌのヒト型一本鎖ファージライブラリー（１．８×１０15ｐｆｕ／ｍｌ）に１．３ｍｌのＴＢＳ、１．３ｍｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳおよび３０μｌの１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを混和し、３７℃で1時間保温した。
【００４５】
抗原コートプレートに、上記の処理をしたファージライブラリーを１ウェルあたり５０μｌずつ添加し、３７℃で１時間保温する。このウェルをＴＢＳ−Ｔで3回、ＴＢＳで２回洗浄後、残液を丁寧に除去した。各ウェルに１００ｍＭトリエチルアミン（以下、ＴＥＡという）を５０μｌずつ添加し、１０分間室温に静置して、結合したファージを遊離させた。
【００４６】
一方、ファージ回収用プレートに、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）と３％ＢＳＡ／ＴＢＳを２：１で混和して作製した中和液（以下、ＮＲという）を、1ウェルあたり１００μｌずつ加えた。このウェルに、上記操作で遊離したファージを含むＴＥＡを回収した。再度、上記抗原コートプレートのウェルにＴＥＡを添加し、２０分間室温に静置後、これをＮＲ中に回収した。
【００４７】
回収したファージ液に、大腸菌ＴＧ−１株の懸濁液を１ウェルあたり１００μｌずつ添加し、３７℃で１時間保温した。これをＬＢＧＣ（ＬＢ／グルコース／カルベニシリン）寒天プレートに播き、２５℃で培養してコロニーを形成させた。コロニーを回収し、カルベニシリンを含むＳＢＳ培地で２時間回転培養（２１０ｒｐｍ）した。次に、ヘルパー・ファージを添加して３７℃で１時間静置後、カナマイシンとクロラムフェニコールを添加して、２５℃で２晩回転培養（２１０ｒｐｍ）した。
【００４８】
培養液を遠心（５０００×ｇ、３０分、４℃）し、上清液に２０％ポリエチレングリコール／２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を１／４量加え、氷中で１時間静置した。これを遠心（１５０００×ｇ、３０分、４℃）後、沈殿したファージをＴＢＳで懸濁し回収した。これに等量の３％ＢＳＡ／ＴＢＳおよび１／２０量の１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを添加し、３７℃で１時間保温後、不溶性成分を遠心除去（１８０００×ｇ、５分、４℃）して、上清を一次パニング・ファージとして回収した。
【００４９】
回収したファージについて上記と同様のパニング操作を繰り返し、四次パニング・ファージを回収した。ただし、二次パニングの操作では２４ウェルプレートを、三次パニングの操作では１２ウェルプレートを、四次パニングの操作では６ウェルプレートをそれぞれ使用した。また、三次パニング以降の洗浄操作では、ＴＢＳ−ＴとＴＢＳでの洗浄に加え、１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）による洗浄も行った。
【００５０】
上記の方法に従って、マンノトリオースから作製した人工糖脂質（以下、Ｍ３−ＤＰＰＥという）あるいはラクト−Ｎ−フコペンタオースIIIから作製した人工糖脂質（以下、ＬＮＦＰIII−ＤＰＰＥという）を用いてパニングを行い、四次パニングで得られた各ファージ・クローンについて、当該人工糖脂質との結合性をそれぞれ以下に記載するＥＬＩＳＡ法で調べた。
【００５１】
（５）ＥＬＩＳＡ
９６ウェルプラスチックプレート（丸底）にカルベニシリンを含むＳＢＳ培地を１ウェルあたり５０μｌずつ入れ、これに四次パニング・ファージのコロニーを移し、３７℃で１時間回転培養した。次に、ヘルパー・ファージを加え３７℃で１時間回転培養後、カナマイシンとクロラムフェニコールを含むＳＢＳ培地を添加して２５℃で１晩回転培養した。これを遠心（１５００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液５０μｌに１００μｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳを添加し、３７℃で１時間保温した。
【００５２】
９６ウェルプラスチックプレートの各ウェルに１μｇの人工糖脂質（Ｍ３−ＤＰＰＥ、あるいはＬＮＦＰIII−ＤＰＰＥ）を固定化した後、１５０μｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳで４℃一晩ブロッキング処理した。また、コントロールとして人工糖脂質をコートしないウェルも準備した。これに上記ファージ液７５μｌを添加し、３７℃で１時間保温した。対照として、抗原を固定化していないウェルについても同様の操作を行った。ウェルを２００μｌのＴＢＳ−Ｔで５回洗浄後、５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）標識抗Ｍ１３抗体溶液を加え、３７℃で１時間保温した。ウェルを２００μｌのＴＢＳ−Ｔで１０回洗浄後、さらに２００μｌのＴＢＳで１回洗浄した。これに１００μｌのＨＲＰ発色溶液を入れて室温で反応させ、３０分後、１００μｌの２％シュウ酸を加えて反応を停止させた。これをプレートリーダーにセットし、４１５ｎｍの吸収を測定した。
【００５３】
測定結果を図１及び図２に示す。図１はＭ３−ＤＰＰＥでパニングした各ファージ・クローンのＭ３−ＤＰＰＥへの結合性を調べた一例であり、また、図２はＬＮＦＰIII−ＤＰＰＥでパニングした各ファージ・クローンのＬＮＦＰIII−ＤＰＰＥへの結合性を調べた一例である。図１と図２のグラフにおいて、当該人工糖脂質をコートした場合（図中（+））とコートしない場合（図中（-））の吸光度の比が2倍以上であったコロニーをポジティブクローンとした。
【００５４】
実施例２：ポジティブクローンのクローニングと配列決定
（１）コロニーＰＣＲおよび制限酵素処理
使用するプライマーは以下のものである。
cmf：5'-TGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGC-3'（配列番号５）
g3-R：5'-GCTAAACAACTTTCAACTTTCAATAGTCTATGGGGCAC-3'（配列番号６）
【００５５】
操作は以下のとおりである。抗原ポジティブ抗体ファージを大腸菌(ＴＧ−１株またはＸＬ−１ｂｌｕｅ株)に感染させて寒天培地に播種する。ＴＧ−１株の場合はカルベニシリン含有ＬＢＧＣ寒天培地を、ＸＬ−１ｂｌｕｅ株の場合はテトラサイクリンおよびアンピシリン含有ＬＢＧＴＡ寒天培地を用いる。２５℃で１〜２日間培養しコロニーを形成させる。ＭｇＣｌ2を含むＰＣＲ用の緩衝液に４種類のデオキシヌクレオチド三りん酸（ｄＮＴＰｓ）各０．２ｍＭ、上記の2種のプライマーを各０．５μＭ、Ｔａｑポリメラーゼを２．５Ｕ／１００μｌを添加した反応溶液を調製し、ＰＣＲ用チューブに２０μｌ入れておく。コロニーを楊子で突いて反応液に入れ楊子を数回振る。ＰＣＲ機器に装着し、９４℃で２分プレインキュベーションした後、９４℃を２０秒、５０℃を１０秒、６８℃を１分といったサイクルを３０サイクル回し、最後に４℃で保存しておく。１％アガロースゲルを調整し、ＰＣＲしたサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけ、ＰＣＲ産物の有無とサイズを確認する。
【００５６】
制限酵素処理にはＭｖａＩを用いた。操作は次のとおりである。ＴＡバッフ
ァーに添加し、３７℃で1時間保温する。４％アガロースゲル（２％スタンダードアガロース、２％低温融解アガロース）にのせて電気泳動を行い、切断パターンをクローンごとに比較する。
【００５７】
（２）ｓｃＦｖのシークエンシング
Ｍ３−ＤＰＰＥに結合能をもつファージクローンＭ３Ａ４−１２およびＭ３Ｇ４−１０のシークエンシングを行った。結果を図３及び図４に示す。ファージクローンＭ３Ａ４−１２のＶＨのアミノ酸配列（とそれをコードする塩基配列）を配列番号１、ＶＬのアミノ酸配列（とそれをコードする塩基配列）を配列番号２、ファージクローンＭ３Ｇ４−１０のＶＨのアミノ酸配列（とそれをコードする塩基配列）を配列番号３、ＶＬのアミノ酸配列（とそれをコードする塩基配列）を配列番号４に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、Ｍ３−ＤＰＰＥでパニングした得られたファージ・クローン（２４クローン）のＭ３−ＤＰＰＥへの結合性を調べた一例であり、２４クローンのうち４クローンがポジティブを示している。
【図２】図２は、ＬＮＦＰIII−ＤＰＰＥでパニングした得られたファージ・クローン（２４クローン）のＬＮＦＰIII−ＤＰＰＥへの結合性を調べた一例であり、２４クローンのうち２３クローンがポジティブを示している。
【図３】図３は、Ｍ３−ＤＰＰＥに結合能をもつファージクローンＭ３Ａ４−１２のシークエンシングの結果を示す。
【図４】図４は、Ｍ３−ＤＰＰＥに結合能をもつファージクローンＭ３Ｇ４−１０のシークエンシングの結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖結合性抗体の同定方法に関する。より詳細には、本発明は、ファージ提示型抗体ライブラリーと固相固定化糖鎖との結合を解析することによって糖鎖と特異的に結合する抗体を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複合糖質分子あるいは細胞表面の糖鎖は様々な生命現象に関与している。とりわけ、癌などの疾患に伴い糖鎖の構造あるいは組織内分布が変化するという知見から、糖鎖を調べることで疾患の原因や進行のメカニズムの解明につながることが期待されている。そのため、分子あるいは組織内に分布する特定糖鎖を簡便かつ高い精度で検出することが重要視されている。
【０００３】
従来、組織内あるいは分子の特定糖鎖を検出するためには、目的とする糖鎖を認識するレクチンや抗体が用いられている。しかし、レクチンの糖に対する特異性は低く、糖残基の結合様式やオリゴ糖構造を識別するといった糖鎖構造の詳細な解析には適していない。また、免疫学的手法で作製された抗体は高い特異性を有しているが、抗原性を有する糖鎖に対する抗体が得られず、その種類も限られている。
【０００４】
一方、ファージディスプレイ法を応用した糖結合性ファージ提示型抗体は、免疫学的手法を用いないで作製されるため、免疫原性に関わりなく多種類の抗体が得られること、また、抗体特有の高い特異性で複雑な構造の糖鎖を識別可能であることが期待される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ファージ提示型抗体ライブラリーと糖鎖を用いて、ある特定の構造を有する糖鎖に特異的に結合する抗体を同定する方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、上記方法により得られる抗体並びに抗体ライブラリーを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の構造を有する糖鎖に対してファージ提示型抗体を接触させることによって上記糖鎖に対して特異的に結合する抗体を選択的に増幅し同定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば、糖鎖に対してファージ提示型抗体を接触させることを含む、上記糖鎖に対して特異的に結合する抗体を同定する方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、糖鎖は固相に固定化されている。
好ましくは、糖鎖は糖脂質であり、さらに好ましくは人工糖脂質である。
好ましくは、糖鎖を構成する糖成分としては、例えば、Ｄ−マンノース（Ｄ−Ｍａｎ）、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、またはＤ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）がある。
【０００９】
好ましくは、ファージ提示型抗体は、ヒト型一本鎖ファージライブラリーである。
好ましくは、ファージ提示型抗体は、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅し、それらを混合し鋳型として、ＰＣＲ法によりＶＨ又はＶＬ領域を増幅し、増幅したこれらのＤＮＡ断片をそれぞれ非発現型ファージミドベクターに組込み、ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーを作製し、これらの大腸菌ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーにヘルパーファージを感染させ、ファージライブラリーに変換し、これらファージ型ＶＨおよびＶＬライブラリーをＣｒｅ組換え酵素を発現する大腸菌に共感染させて大腸菌内でＶＨ・ＶＬベクター間で組換え反応を行い、この大腸菌にヘルパーファージを感染させて完全長一本鎖抗体を発現するファージを作製することにより得られるものである。
【００１０】
好ましくは、ファージ提示型抗体は、ヒト型一本鎖ファージライブラリーから、所定の糖鎖構造を有する人工糖脂質に対する結合能を指標にして回収されたものである。
【００１１】
好ましくは、本発明の方法は、ヒト型一本鎖ファージライブラリーを用意し、所定の糖鎖構造を有する人工糖脂質に対する結合能を指標にして当該糖鎖構造に結合するヒト型一本鎖ファージをパニングにより取得し、取得したヒト型一本鎖ファージを固相に固定化されている糖鎖に接触させることを含む方法である。
【００１２】
好ましくは、糖鎖とファージ提示型抗体との結合を、検出可能な物質で標識されている抗ファージ抗体を用いて検出する。
好ましくは、糖鎖とファージ提示型抗体との結合を、ＥＬＩＳＡにより検出する。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法により単離される、ある特定の糖鎖に対して特異的に結合する抗体又は抗体ライブラリーが提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、後述するＭ３−ＤＰＰＥに特異的な結合能を有する、配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列を有する抗体が提供される。本発明の抗体としては、例えば、配列番号３及び４に記載のアミノ酸配列を有する抗体である。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、並びに配列番号３及び４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、これまで単離が不可能であった各種の糖鎖に特異的な抗体を取得することが可能になり、これにより抗体ライブラリーを構築することが可能になる。本発明の方法は、個体を免疫してポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製する従来の方法とは本質的に異なる。即ち、本発明では、抗体産生機構を生体外で達成できるファージディスプレイ法を活用することにより、個体が認識できない糖鎖抗原を含む各種糖鎖に特異的かつ高親和性で結合する抗体を単離することができる。さらに本発明の方法で得られる一本鎖抗体の遺伝子操作により、改良型の二次単鎖抗体を作製することも可能であり、単鎖抗体の量産も容易である。また、本発明で得られた抗体の遺伝子操作によりトキシンや酵素などのタンパク質の糖鎖特異的デリバリーも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態についてより具体的に説明する。
（１）人工糖脂質
本発明で用いる糖脂質としては、例えば、特許第２８２８３９１号公報に記載の人工糖脂質を用いることができる。オリゴ糖を構成する糖成分の種類は特に限定されないが、例えば、Ｄ−マンノース（Ｄ−Ｍａｎ）、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）などの単糖が挙げられる。
【００１７】
さらに、シアル酸残基を有するスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドを用いることもできる。なお、ガングリオシドは、細胞膜表面に存在し、細胞の増殖、分化あるいはシグナル伝達などを調節することが知られている、また、ガングリオシドは、癌細胞の浸潤や転移において他の細胞や組織との相互作用プロセスにも関与していることが知られている。
【００１８】
オリゴ糖中で、各構成糖は、α１→２結合、α１→３結合、α１→４結合、α１→６結合またはβ１→４結合等あるいはこれらの組み合わせにより結合したものである。例えば、マンノースは上記の結合により直鎖を構成してもよく、又はα１→３結合、α１→６結合との組み合わせにより分岐構造をとってもよい。オリゴ糖中の単糖の数は、好ましくは２から１１個である。
【００１９】
具体的なオリゴ糖として、例えばマンノビオース（Ｍ２）、マンノトリオース（Ｍ３）、マンノテトラオース（Ｍ４）、マンノペンタオース（Ｍ５）、マンノヘキサオース（Ｍ６）、マンノヘプタオース（Ｍ７）、種々の混合オリゴ糖、例えば下記に示すＭ５（化１）及びＲＮ（化２）等を挙げることができる。
【００２０】
【化１】
【００２１】
【化２】
【００２２】
さらに、グルコースを含有するオリゴ糖として化３に示す構造を有するものを挙げることができ、Ｎ−アセチルグルコサミンを含むオリゴ糖として化４に示すものを挙げることができ、そしてフコースを含むオリゴ糖として化５に示すものを挙げることができる。
【００２３】
【化３】
【００２４】
【化４】
【００２５】
【化５】
【００２６】
これらのオリゴ糖は、いずれも１個の還元末端アルデヒド基を有する。そこで、このアルデヒド基を、オリゴ糖を固定化するための手段として使用することができる。すなわち、このアルデヒド基とアミノ基を有する脂質との間に反応によりシッフ塩基を形成し、次にこのシッフ塩基を常法に従って還元、好ましくは化学還元、例えばＮａＢＨ3ＣＮによりオリゴ糖と脂質とを結合することができる（水落次男・中田宗宏、グライコバイオロジー実験プロトコール、４２−４７頁、秀潤社、１９９６）。
【００２７】
上記のアミノ基を有する脂質は、好ましくはアミノ基を有するリン脂質であり、例えばジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等を使用することができる。上記のようにして得られたオリゴ糖と脂質との結合物を本発明においては人工糖脂質と称する場合がある。
【００２８】
本発明で用いる糖脂質は、前記の人工糖脂質であってもよいし、さらには、天然物、例えば牛脳、ガン細胞、またはその他の動植物から得られる糖脂質、これらの糖脂質を修飾したもの、例えば、糖転移酵素を作用させ糖鎖を付加したもの、あるいは化学合成したものを使用することができる。具体的には、例えば、ガングリオシド（ＧＴ１ａ、ＧＤ１ａ、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＭ４、ＧＱ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰ１ｃ、ＧＱ１ｃ、ＧＴ１ｃ、ＧＴ２およびＧＴ３）等が挙げられる。
【００２９】
（２）抗原コートプレート
抗原となる人工糖脂質を溶解する溶剤は特に限定しないが、クロロホルム／メタノール／水（１０：１０：３、体積比）に溶解後、さらにメタノールで、例えば４０μｇ／ｍｌに希釈することが望ましい。この溶液を、例えば９６ウェルプラスチックプレート（平底）に加えて風乾させ、人工糖脂質をウェルに固定化させる。このウェルをブロッキングし、洗浄する。かかる操作で人工糖脂質をコートしたプレートを、抗原コートプレートと称する場合がある。
【００３０】
緩衝液にはトリス緩衝生理食塩水（以下、ＴＢＳという）を用いることが望ましい。また、ブロッキング用溶液としては例えば３％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ（以下、３％ＢＳＡ／ＴＢＳという）が、洗浄溶液としては例えば０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（以下、ＴＢＳ−Ｔという）が望ましい。
【００３１】
（３）ファージ提示型抗体
ファージ提示型抗体は、公知の方法により作製することができる（Ｍａｒｋｓ ＪＤほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２巻５８１−５９７頁、１９９１年；Ｎｉｓｓｉｍ Ａほか、ＥＭＢＯ Ｊ．１３巻６９２−６９８頁、１９９４年；高柳淳・奥井理予・清水信義、超レパートリー人工抗体ライブラリ、出願番号 特願２００１−３５８６０２（国際公開番号ＷＯ０３／０４４１９号））。
【００３２】
ファージ提示型抗体ライブラリーは、繊維状ファージのコートタンパク質に抗体を融合させることにより、ファージの表面上に抗体を提示（ディスプレイ）するシステムを応用したものである。具体的には、抗体遺伝子をＰＣＲで増幅して多種類の抗体遺伝子を含むライブラリーを作製し、これをファージ上に提示させることによってファージディスプレイライブラリーとすることができる。以下に、ファージ提示型単鎖抗体の作製方法の具体例を示すが、これに限定されるものではない。
【００３３】
ヒト末梢血および脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅する。それらを混合し鋳型として、ＰＣＲ法によりＶＨ又はＶＬ領域を増幅する。増幅したこれらのＤＮＡ断片をそれぞれ非発現型ファージミドベクターに組込み、ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーを作製する。これらの大腸菌ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーに、ヘルパーファージを感染させ、ファージライブラリーに変換する。これらファージ型ＶＨおよびＶＬライブラリーをＣｒｅ組換え酵素を発現する大腸菌に共感染させ、大腸菌内でＶＨ・ＶＬベクター間で組換え反応を行う。この大腸菌にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させ、完全長一本鎖抗体を発現するファージを生成させることができる。これらのファージに混入している非組換え体を取り除くため、このファージを多重感染が起こらないように大腸菌に感染させ、さらにヘルパーファージを重感染させ、アンピシリン・カナマシン・クロラムフェニコールを含みグルコースを含まない培地で２５℃で培養する。これにより上清中に組換え一本鎖抗体を発現するファージを得ることができる。上清中のファージをポリエチレングリコールで沈殿し、再懸濁し、１０の１１乗以上のレパートリーを有する人工抗体ライブラリーを得ることができる。
【００３４】
さらに目的の糖結合性を有するファージ提示型抗体は、上記方法により作製したヒト型一本鎖ファージライブラリーから、当該糖鎖構造を有する人工糖脂質に対する結合能を指標にして選択的に回収することができる。この操作をパニングと称する場合がある。
【００３５】
（４）ファージ提示型抗体の糖結合性解析法
パニングを繰り返して得られたファージ提示型抗体の糖結合性を解析する方法としては、例えば以下に述べるＥＬＩＳＡ法を応用して解析することが、多数のファージクローン試料について同時解析できる上で望ましい。すなわち、９６ウェルプラスチックプレートに糖鎖を固定化し、ファージ提示型抗体の非特異的吸着をなくすため、例えば３％ＢＳＡを含む緩衝液でブロッキングする。これに、緩衝液で適切な濃度に調製したファージ提示型抗体の懸濁液を加え、十分に反応させた後（例えば、３７℃で２時間）、緩衝液で洗浄する。
【００３６】
糖鎖に結合したファージ提示型抗体を検出・定量するため、検出に適切な物質で標識されている抗ファージ抗体の水溶液を反応させ、緩衝液で洗浄後、標識物質の検出に最適な手法で検出・定量する。このとき、抗ファージ抗体の標識物質は特に制限されないが、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼでの標識が、簡便さの点で望ましい。また、検出に用いる検出器も特に制限されないが、例えばＥＬＩＳＡに適したプレートリーダーを用いることが望ましい。
【００３７】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
実施例１：マンノトリオースあるいはラクト−Ｎ−フコペンタオースIIIに結合
能をもつファージ提示型単鎖抗体
（１）人工糖脂質の調製
先ず、マンノトリオース（Ｍ３）またはラクト−Ｎ−フコペンタオースIII（
ＬＮＦＰIII）２．５ｍｇに６００μlの蒸留水を加え溶解してオリゴ糖溶液を調製した。次に、クロロホルム/メタノール（１：１、体積比）混合液にＤＰＰＥを５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解してＤＰＰＥ溶液を調製した。また、メタノールにＮａＢＨ3ＣＮを１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解してＮａＢＨ3ＣＮ溶液を調製した。前記オリゴ糖の各溶液６００μlに前記ＤＰＰＥ溶液９．４ｍｌおよび前記ＮａＢＨ3ＣＮ溶液１ｍｌを加えて混合した。この混合液を６０℃にて１６時間保温し、人工糖脂質を生成させた。
【００３９】
前記のように合成した人工糖脂質はシリカゲルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）とＯＤＳカラムで精製した。シリカゲルカラムはＳｈｉｍ−ｐａｃｋ ＰＲＥＰ−ＳＩＬを用い、室温で行った。カラムをクロロホルム／メタノール／５０ｍＭ酢酸（６５：３０：５、体積比）で平衡化した後、同溶媒に溶解した人工糖脂質を含む試料を注入し、６０分間でクロロホルム、メタノールおよび５０ｍＭ酢酸の比が５０：５５：１８となる直線濃度勾配溶出を行った。流速は２ｍｌ／ｍｉｎであり、溶出液は４ｍｌずつ分画した。ＯＤＳカラムは５０ｍＭ酢酸で平衡化した後、同溶媒に溶解した人工糖脂質を含む試料をカラムに添加し、さらに同溶媒でカラムを洗浄後、５０％アセトニトリル、メタノール、およびクロロホルム／メタノール／５０ｍＭ酢酸（１０５：１００：２８、体積比）を順次流して人工糖脂質を溶出した。
【００４０】
（２）抗原コートプレートおよびファージ回収用プレートの作製
人工糖脂質をクロロホルム／メタノール／水（１０：１０：３、体積比）に１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、さらにメタノールで２５倍希釈する（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）。この溶液を９６ウェルプラスチックプレート（平底）に１ウェルあたり５０μｌ（２μｇ／ウェル）入れ、３７℃で静置し風乾させる。このウェルに３％ＢＳＡ／ＴＢＳを加え、４℃で一晩静置しブロッキングする。これをＴＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次にＴＢＳで1回洗浄する。
【００４１】
一方、別の９６ウェルプラスチックプレートに１５０μｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳを入れ、４℃で一晩静置し、ＴＢＳ−Ｔで２回、ＴＢＳで１回洗浄する。このプレートをファージ回収用プレートという場合がある。
【００４２】
（３）抗体ライブラリーの作製法
ヒト末梢血および脾臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅した。それらを混合し鋳型として、ＰＣＲ法によりＶＨ又はＶＬ領域を増幅した。
【００４３】
増幅したこれらのＤＮＡ断片をそれぞれ非発現型ファージミドベクターに組込み、ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーを作製した。それぞれ、１０の６乗および１０の５乗個以上のコロニーを含むように作製した。これら大腸菌ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーに、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させ、ファージライブ ラリーに変換した。これらファージ型ＶＨおよびＶＬライブラリーをＣｒｅ組換え酵素を発現する大腸菌に共感染させ、大腸菌内でＶＨ・ＶＬベクター間で組換え反応を行った。この大腸菌にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させ、完全長一本鎖抗体を発現するファージを生成させた。これらのファージに混入している非組換え体を取り除くため、このファージを多重感染が起こらないように大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株に感染させ、さらにＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを重感染させ、アンピシリン・カナマシン・クロラムフェニコールを含みグルコースを含まない培地で２５℃で培養した。これにより上清中に組換え一本鎖抗体を発現するファージを得た。上清中のファージをポリエチレングリコールで沈殿し、再懸濁し、１０の１１乗以上のレパートリーを有する人工抗体ライブラリーを得た。使用するまで−８０℃で凍結保存した。
【００４４】
（４）パニング操作
２５０μｌのヒト型一本鎖ファージライブラリー（１．８×１０15ｐｆｕ／ｍｌ）に１．３ｍｌのＴＢＳ、１．３ｍｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳおよび３０μｌの１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを混和し、３７℃で1時間保温した。
【００４５】
抗原コートプレートに、上記の処理をしたファージライブラリーを１ウェルあたり５０μｌずつ添加し、３７℃で１時間保温する。このウェルをＴＢＳ−Ｔで3回、ＴＢＳで２回洗浄後、残液を丁寧に除去した。各ウェルに１００ｍＭトリエチルアミン（以下、ＴＥＡという）を５０μｌずつ添加し、１０分間室温に静置して、結合したファージを遊離させた。
【００４６】
一方、ファージ回収用プレートに、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）と３％ＢＳＡ／ＴＢＳを２：１で混和して作製した中和液（以下、ＮＲという）を、1ウェルあたり１００μｌずつ加えた。このウェルに、上記操作で遊離したファージを含むＴＥＡを回収した。再度、上記抗原コートプレートのウェルにＴＥＡを添加し、２０分間室温に静置後、これをＮＲ中に回収した。
【００４７】
回収したファージ液に、大腸菌ＴＧ−１株の懸濁液を１ウェルあたり１００μｌずつ添加し、３７℃で１時間保温した。これをＬＢＧＣ（ＬＢ／グルコース／カルベニシリン）寒天プレートに播き、２５℃で培養してコロニーを形成させた。コロニーを回収し、カルベニシリンを含むＳＢＳ培地で２時間回転培養（２１０ｒｐｍ）した。次に、ヘルパー・ファージを添加して３７℃で１時間静置後、カナマイシンとクロラムフェニコールを添加して、２５℃で２晩回転培養（２１０ｒｐｍ）した。
【００４８】
培養液を遠心（５０００×ｇ、３０分、４℃）し、上清液に２０％ポリエチレングリコール／２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を１／４量加え、氷中で１時間静置した。これを遠心（１５０００×ｇ、３０分、４℃）後、沈殿したファージをＴＢＳで懸濁し回収した。これに等量の３％ＢＳＡ／ＴＢＳおよび１／２０量の１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを添加し、３７℃で１時間保温後、不溶性成分を遠心除去（１８０００×ｇ、５分、４℃）して、上清を一次パニング・ファージとして回収した。
【００４９】
回収したファージについて上記と同様のパニング操作を繰り返し、四次パニング・ファージを回収した。ただし、二次パニングの操作では２４ウェルプレートを、三次パニングの操作では１２ウェルプレートを、四次パニングの操作では６ウェルプレートをそれぞれ使用した。また、三次パニング以降の洗浄操作では、ＴＢＳ−ＴとＴＢＳでの洗浄に加え、１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）による洗浄も行った。
【００５０】
上記の方法に従って、マンノトリオースから作製した人工糖脂質（以下、Ｍ３−ＤＰＰＥという）あるいはラクト−Ｎ−フコペンタオースIIIから作製した人工糖脂質（以下、ＬＮＦＰIII−ＤＰＰＥという）を用いてパニングを行い、四次パニングで得られた各ファージ・クローンについて、当該人工糖脂質との結合性をそれぞれ以下に記載するＥＬＩＳＡ法で調べた。
【００５１】
（５）ＥＬＩＳＡ
９６ウェルプラスチックプレート（丸底）にカルベニシリンを含むＳＢＳ培地を１ウェルあたり５０μｌずつ入れ、これに四次パニング・ファージのコロニーを移し、３７℃で１時間回転培養した。次に、ヘルパー・ファージを加え３７℃で１時間回転培養後、カナマイシンとクロラムフェニコールを含むＳＢＳ培地を添加して２５℃で１晩回転培養した。これを遠心（１５００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液５０μｌに１００μｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳを添加し、３７℃で１時間保温した。
【００５２】
９６ウェルプラスチックプレートの各ウェルに１μｇの人工糖脂質（Ｍ３−ＤＰＰＥ、あるいはＬＮＦＰIII−ＤＰＰＥ）を固定化した後、１５０μｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳで４℃一晩ブロッキング処理した。また、コントロールとして人工糖脂質をコートしないウェルも準備した。これに上記ファージ液７５μｌを添加し、３７℃で１時間保温した。対照として、抗原を固定化していないウェルについても同様の操作を行った。ウェルを２００μｌのＴＢＳ−Ｔで５回洗浄後、５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）標識抗Ｍ１３抗体溶液を加え、３７℃で１時間保温した。ウェルを２００μｌのＴＢＳ−Ｔで１０回洗浄後、さらに２００μｌのＴＢＳで１回洗浄した。これに１００μｌのＨＲＰ発色溶液を入れて室温で反応させ、３０分後、１００μｌの２％シュウ酸を加えて反応を停止させた。これをプレートリーダーにセットし、４１５ｎｍの吸収を測定した。
【００５３】
測定結果を図１及び図２に示す。図１はＭ３−ＤＰＰＥでパニングした各ファージ・クローンのＭ３−ＤＰＰＥへの結合性を調べた一例であり、また、図２はＬＮＦＰIII−ＤＰＰＥでパニングした各ファージ・クローンのＬＮＦＰIII−ＤＰＰＥへの結合性を調べた一例である。図１と図２のグラフにおいて、当該人工糖脂質をコートした場合（図中（+））とコートしない場合（図中（-））の吸光度の比が2倍以上であったコロニーをポジティブクローンとした。
【００５４】
実施例２：ポジティブクローンのクローニングと配列決定
（１）コロニーＰＣＲおよび制限酵素処理
使用するプライマーは以下のものである。
cmf：5'-TGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGC-3'（配列番号５）
g3-R：5'-GCTAAACAACTTTCAACTTTCAATAGTCTATGGGGCAC-3'（配列番号６）
【００５５】
操作は以下のとおりである。抗原ポジティブ抗体ファージを大腸菌(ＴＧ−１株またはＸＬ−１ｂｌｕｅ株)に感染させて寒天培地に播種する。ＴＧ−１株の場合はカルベニシリン含有ＬＢＧＣ寒天培地を、ＸＬ−１ｂｌｕｅ株の場合はテトラサイクリンおよびアンピシリン含有ＬＢＧＴＡ寒天培地を用いる。２５℃で１〜２日間培養しコロニーを形成させる。ＭｇＣｌ2を含むＰＣＲ用の緩衝液に４種類のデオキシヌクレオチド三りん酸（ｄＮＴＰｓ）各０．２ｍＭ、上記の2種のプライマーを各０．５μＭ、Ｔａｑポリメラーゼを２．５Ｕ／１００μｌを添加した反応溶液を調製し、ＰＣＲ用チューブに２０μｌ入れておく。コロニーを楊子で突いて反応液に入れ楊子を数回振る。ＰＣＲ機器に装着し、９４℃で２分プレインキュベーションした後、９４℃を２０秒、５０℃を１０秒、６８℃を１分といったサイクルを３０サイクル回し、最後に４℃で保存しておく。１％アガロースゲルを調整し、ＰＣＲしたサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけ、ＰＣＲ産物の有無とサイズを確認する。
【００５６】
制限酵素処理にはＭｖａＩを用いた。操作は次のとおりである。ＴＡバッフ
ァーに添加し、３７℃で1時間保温する。４％アガロースゲル（２％スタンダードアガロース、２％低温融解アガロース）にのせて電気泳動を行い、切断パターンをクローンごとに比較する。
【００５７】
（２）ｓｃＦｖのシークエンシング
Ｍ３−ＤＰＰＥに結合能をもつファージクローンＭ３Ａ４−１２およびＭ３Ｇ４−１０のシークエンシングを行った。結果を図３及び図４に示す。ファージクローンＭ３Ａ４−１２のＶＨのアミノ酸配列（とそれをコードする塩基配列）を配列番号１、ＶＬのアミノ酸配列（とそれをコードする塩基配列）を配列番号２、ファージクローンＭ３Ｇ４−１０のＶＨのアミノ酸配列（とそれをコードする塩基配列）を配列番号３、ＶＬのアミノ酸配列（とそれをコードする塩基配列）を配列番号４に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、Ｍ３−ＤＰＰＥでパニングした得られたファージ・クローン（２４クローン）のＭ３−ＤＰＰＥへの結合性を調べた一例であり、２４クローンのうち４クローンがポジティブを示している。
【図２】図２は、ＬＮＦＰIII−ＤＰＰＥでパニングした得られたファージ・クローン（２４クローン）のＬＮＦＰIII−ＤＰＰＥへの結合性を調べた一例であり、２４クローンのうち２３クローンがポジティブを示している。
【図３】図３は、Ｍ３−ＤＰＰＥに結合能をもつファージクローンＭ３Ａ４−１２のシークエンシングの結果を示す。
【図４】図４は、Ｍ３−ＤＰＰＥに結合能をもつファージクローンＭ３Ｇ４−１０のシークエンシングの結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖に対してファージ提示型抗体を接触させることを含む、上記糖鎖に対して特異的に結合する抗体を同定する方法。
【請求項２】
糖鎖が固相に固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖鎖が糖脂質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
糖鎖が人工糖脂質である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
糖鎖を構成する糖成分が、Ｄ−マンノース（Ｄ−Ｍａｎ）、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）、またはシアル酸である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
ファージ提示型抗体が、ヒト型一本鎖ファージライブラリーである、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
ファージ提示型抗体が、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅し、それらを混合し鋳型として、ＰＣＲ法によりＶＨ又はＶＬ領域を増幅し、増幅したこれらのＤＮＡ断片をそれぞれ非発現型ファージミドベクターに組込み、ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーを作製し、これらの大腸菌ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーにヘルパーファージを感染させ、ファージライブラリーに変換し、これらファージ型ＶＨおよびＶＬライブラリーをＣｒｅ組換え酵素を発現する大腸菌に共感染させて大腸菌内でＶＨ・ＶＬベクター間で組換え反応を行い、この大腸菌にヘルパーファージを感染させて完全長一本鎖抗体を発現するファージを作製することにより得られるものである、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
ファージ提示型抗体が、ヒト型一本鎖ファージライブラリーから、所定の糖鎖構造を有する人工糖脂質に対する結合能を指標にして回収されたものである、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
ヒト型一本鎖ファージライブラリーを用意し、所定の糖鎖構造を有する人工糖脂質に対する結合能を指標にして当該糖鎖構造に結合するヒト型一本鎖ファージをパニングにより取得し、取得したヒト型一本鎖ファージを固相に固定化されている糖鎖に接触させることを含む、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
糖鎖とファージ提示型抗体との結合を、検出可能な物質で標識されている抗ファージ抗体を用いて検出する、請求項１から９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
糖鎖とファージ提示型抗体との結合を、ＥＬＩＳＡにより検出する、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１の何れかに記載の方法により単離される、ある特定の糖鎖に対して特異的に結合する抗体又は抗体ライブラリー。
【請求項１３】
Ｍ３−ＤＰＰＥに特異的な結合能を有する、配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列を有する抗体。
【請求項１４】
Ｍ３−ＤＰＰＥに特異的な結合能を有する、配列番号３及び４に記載のアミノ酸配列を有する抗体。
【請求項１５】
配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１６】
配列番号３及び４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１】
糖鎖に対してファージ提示型抗体を接触させることを含む、上記糖鎖に対して特異的に結合する抗体を同定する方法。
【請求項２】
糖鎖が固相に固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖鎖が糖脂質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
糖鎖が人工糖脂質である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
糖鎖を構成する糖成分が、Ｄ−マンノース（Ｄ−Ｍａｎ）、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）、またはシアル酸である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
ファージ提示型抗体が、ヒト型一本鎖ファージライブラリーである、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
ファージ提示型抗体が、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅し、それらを混合し鋳型として、ＰＣＲ法によりＶＨ又はＶＬ領域を増幅し、増幅したこれらのＤＮＡ断片をそれぞれ非発現型ファージミドベクターに組込み、ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーを作製し、これらの大腸菌ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーにヘルパーファージを感染させ、ファージライブラリーに変換し、これらファージ型ＶＨおよびＶＬライブラリーをＣｒｅ組換え酵素を発現する大腸菌に共感染させて大腸菌内でＶＨ・ＶＬベクター間で組換え反応を行い、この大腸菌にヘルパーファージを感染させて完全長一本鎖抗体を発現するファージを作製することにより得られるものである、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
ファージ提示型抗体が、ヒト型一本鎖ファージライブラリーから、所定の糖鎖構造を有する人工糖脂質に対する結合能を指標にして回収されたものである、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
ヒト型一本鎖ファージライブラリーを用意し、所定の糖鎖構造を有する人工糖脂質に対する結合能を指標にして当該糖鎖構造に結合するヒト型一本鎖ファージをパニングにより取得し、取得したヒト型一本鎖ファージを固相に固定化されている糖鎖に接触させることを含む、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
糖鎖とファージ提示型抗体との結合を、検出可能な物質で標識されている抗ファージ抗体を用いて検出する、請求項１から９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
糖鎖とファージ提示型抗体との結合を、ＥＬＩＳＡにより検出する、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１の何れかに記載の方法により単離される、ある特定の糖鎖に対して特異的に結合する抗体又は抗体ライブラリー。
【請求項１３】
Ｍ３−ＤＰＰＥに特異的な結合能を有する、配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列を有する抗体。
【請求項１４】
Ｍ３−ＤＰＰＥに特異的な結合能を有する、配列番号３及び４に記載のアミノ酸配列を有する抗体。
【請求項１５】
配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１６】
配列番号３及び４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−５５１４１（Ｐ２００６−５５１４１Ａ）
【公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２４３１９９（Ｐ２００４−２４３１９９）
【出願日】平成１６年８月２４日（２００４．８．２４）
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月２４日（２００４．８．２４）
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
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