糖鎖誘導体の製造方法、構造解析方法、及び糖鎖誘導体
【課題】糖鎖混合物から糖鎖誘導体を製造する方法の提供。
【解決手段】（ａ）糖鎖混合物中の糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物を得る工程、（ｂ）該糖鎖誘導体の混合物をセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理する工程、（ｃ）（ｂ）工程の後にアミノカラム又はアミドカラムを用いる順相クロマトグラフィーで処理する工程、および（ｄ）（ｃ）工程の前に糖加水分解酵素で処理する工程を備えた糖鎖誘導体の製造方法。
【解決手段】（ａ）糖鎖混合物中の糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物を得る工程、（ｂ）該糖鎖誘導体の混合物をセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理する工程、（ｃ）（ｂ）工程の後にアミノカラム又はアミドカラムを用いる順相クロマトグラフィーで処理する工程、および（ｄ）（ｃ）工程の前に糖加水分解酵素で処理する工程を備えた糖鎖誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖の混合物からの糖鎖誘導体の製造方法、及び糖鎖の構造解析方法に関する。更に本発明の糖鎖誘導体の製造方法によって製造された新規糖鎖誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質中の糖鎖はタンパク質の立体構造の保持、プロテアーゼからの分解を防ぐ抵抗性の獲得などの働きを担っていると考えられてきた。最近になり、糖タンパク質中の糖鎖が受精や分化、シグナル伝達、癌化、タンパク質の細胞内輸送や生理活性の調節などの生命現象に関与することが明らかにされつつある。また、細胞表面の接着分子や糖タンパク質性ホルモンなどの糖鎖とその機能との関係が明らかにされ、糖質科学コンソーシアム構想がまとめられている。現在、糖鎖機能研究の中心はその生合成を司る糖転移酵素（糖鎖遺伝子）に関する研究が中心となっているが、糖転移酵素もまたゲノム情報により保存され、他のタンパク質との協調作業により生命機能に関与することを考えれば、細胞、組織中に発現する糖鎖の全体像を捉え解析する構造グライコミクス手法により糖鎖の機能解析を進める必要がある。
糖鎖科学における構造グライコミクスの役割は、多くの生命現象で重要な役割を担っている糖鎖認識機構を網羅的に解析することであり、機能グライコミクスに不可欠な要素である。構造グライコミクスに要求される技術的要素としては高い網羅性、高スループット、高感度および高精度である。
現在、糖タンパク質糖鎖の構造解析法としては、タンパク質から切り出した糖鎖を蛍光標識後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や質量分析法（ＭＳ）を用いて解析する方法が質量分析の劇的な技術進歩により有力な手段となっており（非特許文献１〜４）、シアロ糖鎖の分離には陰イオン交換カラムクロマトグラフィーがもっぱら用いられてきた（非特許文献５）。
【非特許文献１】Ｂｉｏｍｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． １６：１０３−１１５（２００２）
【非特許文献２】Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０６：２７８−２８７（１９９２）
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ． ２１：１２１−１２５（１９９３）
【非特許文献４】Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ． １０２：３２１−３６９（２００２）
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． ７０５：１６７−１７３（１９８２）
【０００３】
しかしながら、細胞や組織中の糖鎖を網羅的に解析する場合、シアル酸やフコースなどの非還元末端修飾の多様性と糖鎖の分枝という問題が存在するために、混在する糖鎖を十分に分離することができず、満足のいく結果を得ることができなかった。特にイオン交換カラム等を用いると、特異的な分離能を有していないために十分な分離が得られないばかりか、分離操作後に脱塩処理を施さなければならず、実用的な方法とはいえない。
よって、これらの糖鎖不均一性情報に配慮しながら、細胞、組織に特徴的な糖鎖構造を詳細に解析できる実用的な手法が熱望されていた。
本発明は、細胞や組織中の糖鎖のように種々の糖鎖が混在している状態から、各糖鎖を分離し、取得する手段を提供することを課題とする。
また、本発明は、分離した各糖鎖化合物の構造を解析する手段を提供することを課題とする。
更に、本発明は、新規な糖鎖誘導体を提供することを課題とする。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は以下の発明に係る。
１．糖鎖混合物から糖鎖誘導体を製造する方法であって、（ａ）糖鎖混合物中の糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物を得る工程、及び（ｂ）該糖鎖誘導体の混合物をセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理する工程を備えたことを特徴とする糖鎖誘導体の製造方法。
２．（ｂ）工程の後に（ｃ）アミノカラム又はアミドカラムを用いる順相クロマトグラフィーで処理する工程を備えた上記記載の糖鎖誘導体の製造方法。
３．（ｃ）工程の前に（ｄ）糖加水分解酵素で処理する工程を備えた上記記載の糖鎖誘導体の製造方法。
４．糖鎖混合物中の糖鎖の構造を解析する方法であって、（ａ）糖鎖混合物中の糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物を得る工程、（ｂ）該糖鎖誘導体の混合物をセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理する工程、及び（ｅ）質量分析法に処理する工程を備えたことを特徴とする糖鎖の構造解析方法。
５．（ｂ）工程の後に（ｃ）アミノカラム又はアミドカラムを用いる順相クロマトグラフィーで処理する工程を備えた上記記載の糖鎖の構造解析方法。
６．（ｃ）工程の前に（ｄ）糖加水分解酵素で処理する工程を備えた上記記載の糖鎖の構造解析方法。
７．質量分析法が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる質量分析法である上記４記載の糖鎖の構造解析方法。
８．後述の式（１）〜（６）で表される糖鎖誘導体［式中Ｒ１は２−カルボキシフェニル基、３−カルボキシフェニル基、４−カルボキシフェニル基、ｐ−エトキシカルボニルフェニル基、又は２−ピリジル基を表す。Ｒ２は水酸基、基−Ａｓｎ又は基−Ａｓｎ−Ｒ３を表す。ここでＡｓｎはアスパラギン基を表し、Ｒ３はカーバメート系又はアミド系保護基を表す。Ａｃはアセチル基を表す。］。
９．式（１）〜（６）で表される糖鎖誘導体から誘導される癌マーカー。
本発明者等は、鋭意検討を重ねた結果、糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体とした後、シアル酸と親和性を有するセロトニンをリガンドとするアフィニティーカラムクロマトグラフィーに処理することにより、アシアロ糖鎖とシアロ糖鎖との分離、加えてシアロ糖鎖中のモノシアロ、ジシアロ、トリシアロ及びテトラシアロ糖鎖等をシアル酸残基の数によって分離できることを見出した。
更に該アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって分離した画分を、それぞれアミノカラム又はアミドカラムを使用したクロマトグラフィーに供することで分枝構造の異なる糖鎖誘導体を詳細に分離できることを見出し、単一構造の糖鎖を大量に製造することを可能とした。
また、分離した各糖鎖誘導体に適当な糖加水分解酵素を作用させ、アミノカラム又はアミドカラムを使用したクロマトグラフィーに供して単離し、得られた糖鎖誘導体を質量分析法に処することで高精度かつ網羅的に糖鎖構造を解析できることを見出し、本発明を完成した。
本発明の製造方法において使用する糖鎖混合物の糖鎖は、特に制限されずアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ−グリコシド結合型糖鎖）、ムチン型糖鎖（Ｏ−グリコシド結合型糖鎖）、遊離型糖鎖、更には糖鎖結合アスパラギンのようにアミノ酸が結合している糖鎖を包含する。
これら糖鎖は化学的手法によって調製された糖鎖であってもよいが、例えば天然の糖タンパク質に由来する糖鎖は非還元末端の糖残基がランダムに欠失した糖鎖の混合物となっており、これら糖鎖の混合物を使用するのが好ましい。また、糖鎖残基にシアル酸残基を有する糖鎖を含有する糖鎖混合物を使用するのが好ましい。
天然糖鎖の混合物としては、天然原料、例えば乳汁、ウシ由来フチュイン、卵又は生体の組織や細胞に由来する糖鎖混合物が挙げられる。特に癌組織又は癌細胞に由来する糖鎖混合物を使用することは、大変興味深い結果が期待できるので好ましい。
本発明で使用できる天然糖鎖の混合物としては、次に示す糖鎖混合物を好ましく例示できるが、シアロ糖鎖が含まれる糖鎖混合物が特に好ましい。
該天然原料から公知の方法によって糖タンパク質及び／又は糖ペプチドの混合物を得、当該混合物にタンパク質分解酵素等を作用させてペプチド部分を切断し、ゲルろ過カラムやイオン交換カラム等を用いたクロマトグラフィーで精製して得られた糖鎖結合アスパラギンの混合物を使用することができる。
また、例えば生体の組織や細胞、特に培養組織や培養細胞を用いて、培養液中の組織又は細胞をホモジネートし、次いで遠心分離して得られた細胞膜画分を２−メルカプトエタノールで処理した後、Ｎ−グリカナーゼを作用させて得られた糖鎖の混合物を使用することができる。
また、培養組織や培養細胞をホモジネートし、遠心分離した上清を採取することで得られた遊離糖鎖の混合物を使用することができる。これらの糖鎖の中には中性糖鎖として高マンノース型糖鎖や多様なシアロ糖鎖を含むので、各種の糖鎖の製造に適している。
得られた糖鎖の混合物中の糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物とする。
脂溶性基は、糖鎖の還元末端の開環アルデヒド、糖鎖結合アスパラギンのアスパラギンアミノ基又はカルボキシル基に反応して形成する脂溶性を有する置換基であり、例えば２−、３−または４−カルボキシフェニルアミノ基、ｐ−エトキシカルボニルフェニルアミノ基、２−ピリジルアミノ基等の通常蛍光標識として使用される置換基や９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等のカーバメート系又はアミド系保護基として使用される置換基を挙げることができる。
これら脂溶性基の導入は公知の方法によって行うことができ、操作の簡便さ、得られる糖鎖誘導体の安定性、励起光が水銀光源やレーザー光源に対応していることなどから２−カルボキシフェニルアミノ基、Ｆｍｏｃ基又はＢＯＣ基を好ましく使用できる。
例えば、２−アミノ安息香酸を用いて、シアノホウ素化水素ナトリウムやジメチルアミノ化ホウ素等の還元剤の存在下で糖鎖と反応させることで、アミノアルジトール誘導体とすることができる。
また、例えば９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミヂルカーボネートを用いて、炭酸水素ナトリウム存在下、糖鎖結合アスパラギンと反応させることで、アスパラギンのアミノ基にカーバメート様に結合したＦｍｏｃ基を導入することができる。
以上のような操作によって、脂溶性基が導入された糖鎖誘導体の混合物を得ることができる。
得られた糖鎖誘導体の混合物をセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより分離する。
本発明におけるセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーはシアル酸と親和性を有するセロトニンをリガンドとするアフィニティーカラムを使用する。
セロトニンアフィニティーカラムとしては、セロトニンを充填剤に固定化して作成してもよく、市販されているカラムを使用してもよい。市販のカラムとしては、ＬＡ−セロトニンカラム（株式会社Ｊ−オイルミルズ製）等が挙げられる。
クロマトグラフィーの分離条件は適宜設定されるものであるが、その一例を挙げると、蛍光検出器を用いて、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４２５ｎｍとし、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、移動相を超純水と酢酸アンモニウム水溶液とを使用して直線グラジエント溶出とすることで分離を達成することができる。
セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより、糖鎖誘導体の混合物を糖鎖誘導体のシアル酸残基の数によって分離することができ、シアル酸残基を有さないアシアロ糖鎖誘導体が最も早く溶出し、次いでモノシアロ糖鎖誘導体、ジシアロ糖鎖誘導体という具合にシアル酸残基の数の増加に比例して分離溶出することができる。
以上のようにセロトニンアフィニティーカラムによって分離した糖鎖誘導体を、ポリマーベースのアミノカラム又はシリカベースのアミドカラムを使用した順相ＨＰＬＣに処理することで、極めて優れた糖鎖誘導体間の分離を可能とすることができる。順相クロマトグラフィーとは、アミノ基、アミノプロピル基、アクリルアミド基など極性固定相を充填剤として用いるクロマトグラフィーであって、試料成分の固定相−移動相に対する試料成分の分配度の差に基づいて分離が達成されることを特徴する。基本的に糖鎖の親水性に基づいて分離されるモードであり、シアル酸が結合した糖鎖の異性体の分離にも好ましく用いることができる。また、希酸やノイラミニダーゼにより処理されたアシアロ型の糖鎖の分離にも好ましく用いることができる。
使用するポリマーベースのアミノカラムとしては、アミノ基をポリビニルアルコール系基材ゲル等のポリマーに結合させた固定相を充填剤として用いたカラムであって、自ら作成してもよいが、市販されているカラムを使用してもよい。
市販のアミノカラムとしては、Ａｓａｈｉ Ｓｈｏｄｅｘ ＮＨ２Ｐ−５０４Ｅ（昭和電工株式会社製）を挙げることができる。
シリカベースのアミドカラムとしては、アクリルアミド等のアミド基をシリカを固定相とする充填剤に化学結合させて導入したカラムであって、自ら作成してもよいが、市販されているカラムを使用してもよい。
市販のアミドカラムとしては、ＴＳＫ−ＧＥＬ Ａｍｉｄｅ−８０（ＴＯＳＯＨ Ｃｏｒｐ製）を挙げることができる。
クロマトグラフィーの分離条件は適宜設定されるものであるが、その一例を挙げると、蛍光検出器を用いて、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４２５ｎｍとし、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、移動相を酢酸含有アセトニトリルと酢酸及びトリエチルアミン含有水溶液とを使用して直線グラジエント溶出とすることで分離することができる。
以上のようにして単離して得られる糖鎖誘導体は、糖加水分解酵素の適用、質量分析法による分析により、その糖鎖構造を解析することができる。
糖加水分解酵素としては、公知の酵素を使用することができ、例えばシアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミダーゼ、フコシダーゼ等を挙げることができる。
質量分析方法としては、従来公知の質量分析法を採用した質量分析装置によってなされるが、近年特に糖鎖分析に用いられているＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより測定するのが好ましい。
糖鎖構造を解析するには、特定の糖加水分解酵素を作用させた後、ポリマーベースのアミノカラム又はシリカベースのアミドカラムを使用した順相ＨＰＬＣで処理し、得られた画分を質量分析して消失した質量分と加水分解酵素の特性とを考慮し、更にこの操作を繰り返すことで糖鎖構造を解析することができる。
得られる糖鎖誘導体は、その脂溶性基を除去することで種々の糖鎖を、人工的に容易にかつ大量に得ることができる。
脂溶性基の除去は従来公知の方法を適用することができる。
例えば、２−カルボキシフェニルアミノ基の除去は、酢酸中で過酸化水素と室温で反応させることで達せられ、容易に遊離型糖鎖として回収することができる。また、Ｆｍｏｃ基の除去は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中、糖鎖誘導体にモルホリンを加えて反応させることで達せられ、ＢＯＣ基の除去には弱酸を反応させることで達せられる。
糖鎖が糖鎖結合アスパラギンである場合、無水ヒドラジンと反応させた後、アセチル化する方法、塩基性水溶液中加熱還流後、アセチル化する方法等により、アスパラギン残基を除去することができる。
かかる糖鎖類は、医薬品開発等の分野において非常に有用であり、例えば癌のワクチン合成が挙げられ、得られた糖鎖類を化学的な反応や糖転移酵素による反応等を組み合わせて新たな糖残基を結合させて誘導体化し、新規ワクチンの開発を可能とする。
本発明者等は、本発明の構造解析方法及び製造方法により、各種癌細胞中にこれまで認められなかった下記式（１）〜（６）で示される糖鎖を単離することに成功した。
［式中Ｒ１は２−カルボキシフェニル基、３−カルボキシフェニル基、４−カルボキシフェニル基、ｐ−エトキシカルボニルフェニル基、又は２−ピリジル基を表す。Ｒ２は水酸基、基−Ａｓｎ又は基−Ａｓｎ−Ｒ３を表す。ここでＡｓｎはアスパラギン基を表し、Ｒ３はカーバメート系又はアミド系保護基を表す。Ａｃはアセチル基を表す。］
これら新規な糖鎖は、癌細胞中に特異的に発現するものと考えられ、これら糖鎖を癌マーカーとして利用することができる。
例えばこれら癌細胞中の特異的な糖鎖と特異的に認識するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製し、免疫学的手法により該糖鎖の検出を行うことで成される。
ポリクローナル抗体は、該糖鎖又は該糖鎖のハプテンとタンパク質等の高分子化合物（担体）と結合させた結合体を抗原としてマウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、ポリクローナル抗体を含む抗血清を調製することができる。
モノクローナル抗体は、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合により得られるハイブリドーマを調製して得ることができる。このようにして得られたハイブリドーマを培養し、産生されるモノクローナル抗体を精製すればよい。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は実施例１で得られた糖鎖誘導体のアフィニティーカラムクロマトグラムである。
【図２】図２は実施例２で得られた糖鎖誘導体のアフィニティーカラムクロマトグラムである。
【図３】図３は実施例３で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【図４】図４は実施例３で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【図５】図５は実施例３で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【図６】図６は実施例３で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【図７】図７は実施例３で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【図８】図８は実施例４で得られた糖鎖誘導体のアフィニティーカラムクロマトグラムである。
【図９】図９は実施例５で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【図１０】図１０は実施例６で得られた糖鎖誘導体のアフィニティーカラムクロマトグラムである。
【図１１】図１１は実施例７で得られた糖鎖誘導体のアフィニティーカラムクロマトグラムである。
【図１２】図１２は実施例７で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に参考例及び実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００７】
セロトニンアフィニティークロマトグラフィーによるヒト血清由来
［１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）］糖鎖の分離
ヒト血清由来ＡＧＰ（シグマアルドリッチジャパン製）１ｍｇを２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）５０μｌに溶解し、Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ Ｆ（２Ｕｎｉｔ，４μｌ）を加え、３７℃で１２時間反応させた。反応後１００℃で３分間煮沸し遠心分離後の上清を回収した。
回収した上清に２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムをそれぞれ３％となるように２％ホウ酸、４％酢酸ナトリウム混液（５００μｌ）に溶解して１００μｌ加え、８０℃で１時間反応させた。反応混合物を５０％メタノール水溶液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０カラム（０．７ｃｍ ｉ．ｄ．，３０ｃｍ）を用いて分画し、分光光度計（日立製、Ｆ−４０１０型）を用いて、励起波長３３５ｎｍ、蛍光波長４１０ｎｍで各分画を測定して、最初に溶出される蛍光性分画を回収し、糖鎖誘導体の混合物とした。
得られた混合物をセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーに供し、分離した糖鎖誘導体を得た。アフィニティーカラムクロマトグラフィーでの分離結果を図１に示す。
セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーの条件
カラム：ＬＡ−Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎカラム（４．６×１５０ｍｍ，Ｊａｐａｎ Ｏｉｌ ｍｉｌｌｓ製）
ポンプ：ＪＡＳＣＯ ＰＵ−９８０型
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＪＡＳＣＯ ＦＰ−９２０型蛍光検出器
励起波長：３５０ｎｍ
蛍光波長：４２５ｎｍ
移動相：溶液Ａとして超純水、溶液Ｂとして４０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液を用いた。グラジエント条件：試料注入後２分間を溶液Ｂ５％とし、３７分後に酢酸アンモニウム濃度が３０ｍＭとなるように、直線グラジエント溶出を行い、その後１０分間で４０ｍＭになるように行った。
なお、セロトニンアフィニティークロマトグラフィーの分離条件は以下の実施例においても同様とした。
【実施例２】
【０００８】
（ヒト癌細胞由来糖鎖のセロトニンアフィニティークロマトグラフィーによる分離）
細胞培養
ヒト腎腺癌細胞ＡＣＨＮ、ヒト肺癌細胞Ａ５４９、ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５及びヒト組織球性リンパ腫Ｕ９３７を用いた。ＡＣＨＮ及びＡ５４９は予め５０℃で３０分間加熱することにより非動化したウシ血清［ＮＥＷＢＯＲＮ
ＣＡＬＦ ＳＥＲＵＭ（ＮＣＳ）、シグマアルドリッチジャパン製］を１０％含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、シグマアルドリッチジャパン製）を用い、Ｕ９３７及びＭＫＮ４５では１０％ＮＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０（シグマアルドリッチジャパン製）を用い、５％ＣＯ２存在下３７℃で組織培養シャーレ中で培養した。Ｕ９３７を除く細胞は８０％コンフルエント状態において、培養中の細胞を等張化リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、トリプシン溶液を加え、３７℃で５分間処理した後、剥離した細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄後継代培養した。
細胞膜画分の調製
細胞膜分画の調製には８０％コンフルエント状態の細胞を用い、セルスクレーパーを用い、培養器より回収した。回収した細胞はＰＢＳで洗浄後、１×１０８ｃｅｌｌ／５ｍｌの濃度となるように１％のプロテアーゼインヒビターを含む１０ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中、グラスホモジナイザーを用いてホモジナイズ後、０．５ＭのＳｕｃｒｏｓｅを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）を１０ｍｌ加え、４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離後上清を回収後、４℃、１９０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた沈殿を細胞膜画分とした。
細胞膜画分からの糖鎖の遊離
細胞膜画分（１×１０７ｃｅｌｌ）に１％ＳＤＳ溶液４０μｌを加え、２−メルカプトエタノールを１％になるように加えた後、１００℃の沸騰水浴上で５分間加熱することにより可溶化を行った。膜画分を含む溶液を室温まで冷却し、ＮＰ−４０を１％になるように加え、終濃度が２０ｍＭになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えた。さらに、Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ
Ｆ ４μｌ（２Ｕｎｉｔ、Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製）を加え、３７℃で一晩インキュベートし、１００℃の沸騰水浴上で５分間煮沸し、９５％エタノールを終濃度が７５％になるように加えた後、４℃、１５０００ｒｐｍで遠心分離し上清を減圧乾固し、細胞膜由来糖鎖とした。
調製した各細胞膜由来糖鎖に、上記実施例１と同様に２−ＡＡを導入後、セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理し、各糖鎖誘導体画分を得た。カラムクロマトグラフィーでの分離結果を図２に示す。
【実施例３】
【０００９】
（順相型アミドカラムによる癌細胞由来糖鎖の分離及び構造解析）
実施例２で得られた各画分の癌細胞由来糖鎖誘導体（１×１０７ｃｅｌｌ相当）を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）２０μｌに溶解し、シアリダーゼ４μｌ（２ｍＵ，マルキンバイオ製）を加えて３７℃で２４時間反応させた。反応後１００℃で３分間煮沸し、遠心分離後の上清を回収した。
得られた上清をアミドカラムを用いた順相ＨＰＬＣに供し、糖鎖誘導体を分取した。ＨＰＬＣでの分離結果を図３〜７に示す。
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ａｍｉｄｅ−８０（ＴＯＳＯＨ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，Ｊａｐａｎ；４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
ポンプ：ＪＡＳＣＯ ＰＵ−９８０型
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＪＡＳＣＯ ＦＰ−９２０型蛍光検出器
励起波長：３５０ｎｍ
蛍光波長：４２５ｎｍ
移動相：溶液Ａとして０．２％酢酸を含むアセトニトリル溶液、溶液Ｂとして０．１％酢酸及び０．１％トリエチルアミンを含む水溶液を用いた。
グラジエント条件：試料注入後２分間を溶液Ｂ３０％とし、６０分後に溶液Ｂが６５％となるように直線グラジエント溶出を行った。
糖加水分解酵素と質量分析法による構造解析
Ｕ９３７由来のピーク３１の糖鎖誘導体を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）２０μｌに溶解し、β−ガラクトシダーゼ１μｌ（２５ｍＵ、生化学工業社製）を加えて３７℃で２４時間反応させた。反応後１００℃で３分間煮沸し遠心分離後の上清を回収した。得られた上清をアミドカラムを用いた順相ＨＰＬＣに供して得た画分の一部をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳにより分析した。結果、分子量２７１８の糖鎖誘導体（ａ）が得られた。
その糖鎖誘導体（ａ）を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２０μｌに溶解し、β−Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ１μｌ（１０ｍＵ，生化学工業社製）を加えて３７℃で２４時間反応させた。反応後１００℃で３分間煮沸し遠心分離後の上清を回収し、得られた上清を上記と同様に分析した結果、分子量１９０６の糖鎖誘導体（ｂ）が得られた。
更に糖鎖誘導体（ｂ）をβ−ガラクトシダーゼで処理した結果、分子量１５８２の糖鎖誘導体（ｃ）が得られた。
以上の結果より、ピーク３１は下記式で表される糖鎖誘導体であることが判明した。
同様にピーク３５の糖鎖誘導体も、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ、次いでβ−ガラクトシダーゼで処理し、下記式で表される糖鎖誘導体であることが判明した。
他のピークの誘導体についても加水分解酵素を適宜使用し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析等を行い、図３〜７に示すピークに相当する糖鎖構造を表１〜５に示した。なお、表１〜１４中の分子量は糖鎖還元末端に２−アミノ安息香酸が結合した状態での分子量（ＭＷ）を示し、記号は次のものを示す。
Ｇａｌ：Ｄ−ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン、
Ｍａｎ：Ｄ−マンノース、Ｆｕｃ：フコース、２−ＡＡ：２−アミノ安息香酸、ＮｅｕＡｃ：シアル酸。
ここで糖鎖還元末端に２−アミノ安息香酸が結合した糖鎖、例えば、次式で表される糖鎖部分構造は、−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２−ＡＡと表すこととする。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析
装置にはＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を用い、リニアー／ネガティブイオンモードにより、加速電圧２０ｋＶ、グリッド電圧９６．３％、Ｄｅｌａｙｔｉｍｅ １０００ｎｓｅｃ、Ｌｅｎｓ Ｏｆｆ ｓｅｔ １．２５、レーザー強度（窒素レーザー）２７００で測定した。水に溶解したサンプル０．５μＬと２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ（ＤＨＢ）の２０ｍｇ／ｍＬメタノール溶液０．５μＬ を混和し、乾燥後、測定用試料として用いた。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【実施例４】
【００１０】
（細胞内に存在する遊離糖鎖１）
ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５をＰＢＳで洗浄後、１×１０８ｃｅｌｌ／５ｍｌの濃度となるようにグラスホモジナイザーを用いて１％のプロテアーゼインヒビターを含む１０ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中でホモジナイズ後、０．５ＭのＳｕｃｒｏｓｅを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）を１０ｍｌ加え、４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離後、上清を集め、さらに、４℃、１９０００ｒｐｍで遠心分離し、その上清を減圧乾固し遊離型糖鎖混合物を得た。
得られた遊離型糖鎖混合物に実施例１に記載の方法と同様に、２−ＡＡを導入して遊離型糖鎖誘導体の混合物を得、セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで分画して遊離型糖鎖誘導体を得た。
アフィニティーカラムクロマトグラフィーによる分離結果を図８に示す。
得られた各画分をアミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離し、遊離型糖鎖誘導体を得た。
ＨＰＬＣ条件
カラム： Ａｓａｈｉ Ｓｈｏｄｅｘ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ（Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ；４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度：５０℃
ポンプ：ＪＡＳＣＯ ＰＵ−９８０型
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＪＡＳＣＯ ＦＰ−９２０型蛍光検出器
励起波長：３５０ｎｍ
蛍光波長：４２５ｎｍ
移動相：溶液Ａとして２％酢酸を含むアセトニトリル溶液、溶液Ｂとして５％酢酸及び３％トリエチルアミンを含む水溶液を用いた。
グラジエント条件：試料注入後２分間を溶液Ｂ３０％とし、８０分後に溶液Ｂが９５％となるように直線グラジエント溶出を行い、１００分まで溶液Ｂを９５％となるように保った。
得られた遊離型糖鎖誘導体を、糖加水分解酵素（シアリダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ等）を適宜作用させ、上記アミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離後、得られた画分を凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析することにより、遊離型糖鎖誘導体の構造を解析した。
なお、α−マンノシダーゼでの処理は、糖鎖誘導体を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）２０μｌに溶解し、α−マンノシダーゼ２μｌ（１０ｍＵ，生化学工業社製）を加えて３７℃で２４時間反応させ、反応後１００℃で３分間煮沸して遠心分離後の上清を回収することでなされる。その他の糖加水分解酵素での処理は前記実施例での記載と同様とした。得られた糖鎖誘導体を表６及び７に示す。
表６及び７の遊離型糖鎖は新規化合物であり、例えばＮｏ．１の分子量１３２１である糖鎖誘導体は下記式で表される。
【表６】
【表７】
【実施例５】
【００１１】
（細胞内に存在する遊離糖鎖２）
ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５に替えて、ヒトＴ細胞リンパ腫Ｊｕｒｋａｔ２７（糖鎖導入細胞株）を用いた以外は、実施例４と同様に操作して、遊離型糖鎖混合物を得た。
得られた遊離型糖鎖混合物に実施例１に記載の方法と同様に、２−ＡＡを導入して遊離型糖鎖誘導体の混合物を得、セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで分画して遊離型糖鎖誘導体を得た。
得られた各画分をアミドカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離し、遊離型糖鎖誘導体を得た。
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ａｍｉｄｅ−８０（ＴＯＳＯＨ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，Ｊａｐａｎ；４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
ポンプ：ＪＡＳＣＯ ＰＵ−９８０型
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＪＡＳＣＯ ＦＰ−９２０型蛍光検出器
励起波長：３５０ｎｍ
蛍光波長：４２５ｎｍ
移動相：溶液Ａとして０．１％酢酸を含むアセトニトリル溶液、溶液Ｂとして０．２％酢酸及び０．２％トリエチルアミンを含む水溶液を用いた。
グラジエント条件：試料注入後２分間を溶液Ｂ３０％とし、６０分後に溶液Ｂが６５％となるように直線グラジエント溶出を行った。
ＨＰＬＣでの分離結果を図９に示す。
得られた遊離型糖鎖誘導体を、実施例４と同様に操作して、遊離型糖鎖誘導体の構造を解析した。得られた糖鎖誘導体を表８に示す。
【表８】
【実施例６】
【００１２】
（ヒト子宮頸部癌細胞の糖鎖）
ヒト子宮頸部癌細胞ＨｅＬａをあらかじめ５０℃で３０分間加熱することにより非動化したＮＣＳを１０％含むＤＭＥＭを用いて培養した。８０％コンフルエント状態において、培養中の細胞をＰＢＳで洗浄後、トリプシン溶液を加え、３７℃で５分間処理した後、剥離した細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄後継代培養し、実施例２に記載の細胞膜画分の調製、細胞膜画分からの糖鎖の遊離と同様に処理して細胞膜由来の糖鎖混合物を得、上記実施例１と同様に２−ＡＡを導入後、セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーに処理し、各糖鎖誘導体画分を得た。
カラムクロマトグラフィーでの分離結果を図１０に示す。
得られたアシアロ糖鎖誘導体画分、モノシアロ糖鎖誘導体画分及びジシアロ糖鎖誘導体画分をシアリダーゼ処理した後、アミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離して糖鎖誘導体を得た。ＨＰＬＣ条件は実施例４と同様にした。
得られた糖鎖誘導体を、糖加水分解酵素（シアリダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ等）を適宜作用させ、上記アミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離後、得られた画分を凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳで分析することにより、糖鎖誘導体の構造を解析した。
得られた糖鎖誘導体を表９〜１２に示す。
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【実施例７】
【００１３】
（癌細胞特異的抗原ＣＤ９８の糖鎖）
免疫沈降法によるＣＤ９８−ＨＣの調製
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ａｇａｒｏｓｅ ５０μｌ（シグマアルドリッチジャパン製）をＰＢＳ２００μｌにより洗浄後、ＰＢＳ５０μｌおよび抗ＣＤ９８抗体を１０μｇ／１０μｌ加え、室温にて６０分間反応させた。反応後、ＰＢＳ１ｍｌにより非吸着成分の除去し、抗ＣＤ９８抗体固定化Ａｇａｒｏｓｅを得た。抗ＣＤ９８抗体固定化Ａｇａｒｏｓｅに、１％ＮＰ−４０（４００μｌ）により可溶化したＨｅＬａ細胞の膜分画（２×１０７ｃｅｌｌ）を加え、ロータリーシェイカーを用いて４℃で一晩インキュベートした。その後、ＰＢＳを１ｍｌにより洗浄し、非吸着成分を除去し、遠心分離後、抗ＣＤ９８抗体固定化Ａｇａｒｏｓｅに解離溶液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．８／４．６％ ＳＤＳ，２０％Ｇｌｙｃｅｒｉｎ）と２−メルカプトエタノールとの９：１混液を２０μｌ加え、５分間煮沸し１５０００ｒｐｍで遠心した上清をＣＤ９８−ＨＣとし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
ゲル電気泳動装置および電源は共にＢｉｏ Ｒａｄ製を用いた。泳動ゲルは７．５％ゲルを用いた。泳動緩衝液として２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，１９８ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用いて行った。最初の１時間はゲル１枚あたり５ｍＡで、続いて１０ｍＡでゲル下辺部まで泳動を行った。
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色
ＳＤＳ−Ｐａｇｅ終了後、４０％（ｖ／ｖ）Ｍｅｔｈａｎｏｌ，１０％（ｖ／ｖ）Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ／０．２％Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０中にてタンパク質の染色を行った。１時間後、Ｍｅｔｈａｎｏｌ：Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：Ｗａｔｅｒ（＝４：１：５）を用いて脱色した。
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをＢＩＯ−ＲＡＤ製セミドライ式ブロッティング装置（トランスブロットＳＤセル）を用いて、ゲル中のタンパク試料をＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜は予めメタノールに６０秒浸し、その後４８ｍＭＴｒｉｓ，３９ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ，２０％Ｍｅｔｈａｎｏｌ（ｐＨ９．０）に１時間浸したものを使用し、１００ｍＡ定電流にて１時間電圧を印加し転写を行った。転写後、ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳにてブロッキング操作を行った後、抗ＣＤ９８抗体５μｇを含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ（５ｍｌ）を加え一晩反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＰＢＳ（２０ｍｌ）で４回洗浄後、ＨＲＰ標識Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ５μｌを含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ（５ｍｌ）を加え、１時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（２０ｍｌ）で４回洗浄し、０．０５％ＤＡＢ（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｒｉｎｅ，ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を含む１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．５，０．００３１％過酸化水素溶液 ２０ｍｌを加え発色させた。
Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ Ｆによるゲル内消化
ＣＢＢ染色によりバンドを確認した後、脱色液を水に置換し、目的のバンドを切り取り、エッペンドルフチューブへ入れた。その後アセトニトリル１００μｌを加え３０分間放置することでゲルを脱水し、アセトニトリルを除去後２ｕｎｉｔｓのＮ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ Ｆを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．５を１００μｌ加え３７℃で一晩インキュベートし糖鎖を切り出した。その後、抽出液を回収しさらに水２００μｌを加え３０分間攪拌しゲルより糖鎖混合物を得た。
以上のようにして得られた糖鎖混合物に上記実施例１と同様に２−ＡＡを導入後、セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーに処理し、各糖鎖誘導体画分を得た。
カラムクロマトグラフィーでの分離結果を図１１に示す。
得られたモノシアロ糖鎖誘導体画分及びジシアロ糖鎖誘導体画分をシアリダーゼ処理した後、アミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離して糖鎖誘導体を得た。ＨＰＬＣ条件は実施例４と同様にした。ＨＰＬＣでの分離結果を図１２に示す。
得られた糖鎖誘導体を、糖鎖加水分解酵素（シアリダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ等）を適宜作用させ、上記アミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離後、得られた画分を凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳで分析することにより、糖鎖誘導体の構造を解析した。
得られた糖鎖誘導体を表１３〜１４に示す。
【表１３】
【表１４】
【産業上の利用可能性】
【００１４】
本発明の方法によれば、特に細胞又は組織中の糖鎖混合物を詳細に分離することができ、網羅的にその糖鎖構造を解析することを可能としたことで、従来知られていなかった糖鎖及びその機能を探求することができ、今後の糖鎖研究における多大なる貢献が期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖の混合物からの糖鎖誘導体の製造方法、及び糖鎖の構造解析方法に関する。更に本発明の糖鎖誘導体の製造方法によって製造された新規糖鎖誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質中の糖鎖はタンパク質の立体構造の保持、プロテアーゼからの分解を防ぐ抵抗性の獲得などの働きを担っていると考えられてきた。最近になり、糖タンパク質中の糖鎖が受精や分化、シグナル伝達、癌化、タンパク質の細胞内輸送や生理活性の調節などの生命現象に関与することが明らかにされつつある。また、細胞表面の接着分子や糖タンパク質性ホルモンなどの糖鎖とその機能との関係が明らかにされ、糖質科学コンソーシアム構想がまとめられている。現在、糖鎖機能研究の中心はその生合成を司る糖転移酵素（糖鎖遺伝子）に関する研究が中心となっているが、糖転移酵素もまたゲノム情報により保存され、他のタンパク質との協調作業により生命機能に関与することを考えれば、細胞、組織中に発現する糖鎖の全体像を捉え解析する構造グライコミクス手法により糖鎖の機能解析を進める必要がある。
糖鎖科学における構造グライコミクスの役割は、多くの生命現象で重要な役割を担っている糖鎖認識機構を網羅的に解析することであり、機能グライコミクスに不可欠な要素である。構造グライコミクスに要求される技術的要素としては高い網羅性、高スループット、高感度および高精度である。
現在、糖タンパク質糖鎖の構造解析法としては、タンパク質から切り出した糖鎖を蛍光標識後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や質量分析法（ＭＳ）を用いて解析する方法が質量分析の劇的な技術進歩により有力な手段となっており（非特許文献１〜４）、シアロ糖鎖の分離には陰イオン交換カラムクロマトグラフィーがもっぱら用いられてきた（非特許文献５）。
【非特許文献１】Ｂｉｏｍｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． １６：１０３−１１５（２００２）
【非特許文献２】Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０６：２７８−２８７（１９９２）
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ． ２１：１２１−１２５（１９９３）
【非特許文献４】Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ． １０２：３２１−３６９（２００２）
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． ７０５：１６７−１７３（１９８２）
【０００３】
しかしながら、細胞や組織中の糖鎖を網羅的に解析する場合、シアル酸やフコースなどの非還元末端修飾の多様性と糖鎖の分枝という問題が存在するために、混在する糖鎖を十分に分離することができず、満足のいく結果を得ることができなかった。特にイオン交換カラム等を用いると、特異的な分離能を有していないために十分な分離が得られないばかりか、分離操作後に脱塩処理を施さなければならず、実用的な方法とはいえない。
よって、これらの糖鎖不均一性情報に配慮しながら、細胞、組織に特徴的な糖鎖構造を詳細に解析できる実用的な手法が熱望されていた。
本発明は、細胞や組織中の糖鎖のように種々の糖鎖が混在している状態から、各糖鎖を分離し、取得する手段を提供することを課題とする。
また、本発明は、分離した各糖鎖化合物の構造を解析する手段を提供することを課題とする。
更に、本発明は、新規な糖鎖誘導体を提供することを課題とする。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は以下の発明に係る。
１．糖鎖混合物から糖鎖誘導体を製造する方法であって、（ａ）糖鎖混合物中の糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物を得る工程、及び（ｂ）該糖鎖誘導体の混合物をセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理する工程を備えたことを特徴とする糖鎖誘導体の製造方法。
２．（ｂ）工程の後に（ｃ）アミノカラム又はアミドカラムを用いる順相クロマトグラフィーで処理する工程を備えた上記記載の糖鎖誘導体の製造方法。
３．（ｃ）工程の前に（ｄ）糖加水分解酵素で処理する工程を備えた上記記載の糖鎖誘導体の製造方法。
４．糖鎖混合物中の糖鎖の構造を解析する方法であって、（ａ）糖鎖混合物中の糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物を得る工程、（ｂ）該糖鎖誘導体の混合物をセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理する工程、及び（ｅ）質量分析法に処理する工程を備えたことを特徴とする糖鎖の構造解析方法。
５．（ｂ）工程の後に（ｃ）アミノカラム又はアミドカラムを用いる順相クロマトグラフィーで処理する工程を備えた上記記載の糖鎖の構造解析方法。
６．（ｃ）工程の前に（ｄ）糖加水分解酵素で処理する工程を備えた上記記載の糖鎖の構造解析方法。
７．質量分析法が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる質量分析法である上記４記載の糖鎖の構造解析方法。
８．後述の式（１）〜（６）で表される糖鎖誘導体［式中Ｒ１は２−カルボキシフェニル基、３−カルボキシフェニル基、４−カルボキシフェニル基、ｐ−エトキシカルボニルフェニル基、又は２−ピリジル基を表す。Ｒ２は水酸基、基−Ａｓｎ又は基−Ａｓｎ−Ｒ３を表す。ここでＡｓｎはアスパラギン基を表し、Ｒ３はカーバメート系又はアミド系保護基を表す。Ａｃはアセチル基を表す。］。
９．式（１）〜（６）で表される糖鎖誘導体から誘導される癌マーカー。
本発明者等は、鋭意検討を重ねた結果、糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体とした後、シアル酸と親和性を有するセロトニンをリガンドとするアフィニティーカラムクロマトグラフィーに処理することにより、アシアロ糖鎖とシアロ糖鎖との分離、加えてシアロ糖鎖中のモノシアロ、ジシアロ、トリシアロ及びテトラシアロ糖鎖等をシアル酸残基の数によって分離できることを見出した。
更に該アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって分離した画分を、それぞれアミノカラム又はアミドカラムを使用したクロマトグラフィーに供することで分枝構造の異なる糖鎖誘導体を詳細に分離できることを見出し、単一構造の糖鎖を大量に製造することを可能とした。
また、分離した各糖鎖誘導体に適当な糖加水分解酵素を作用させ、アミノカラム又はアミドカラムを使用したクロマトグラフィーに供して単離し、得られた糖鎖誘導体を質量分析法に処することで高精度かつ網羅的に糖鎖構造を解析できることを見出し、本発明を完成した。
本発明の製造方法において使用する糖鎖混合物の糖鎖は、特に制限されずアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ−グリコシド結合型糖鎖）、ムチン型糖鎖（Ｏ−グリコシド結合型糖鎖）、遊離型糖鎖、更には糖鎖結合アスパラギンのようにアミノ酸が結合している糖鎖を包含する。
これら糖鎖は化学的手法によって調製された糖鎖であってもよいが、例えば天然の糖タンパク質に由来する糖鎖は非還元末端の糖残基がランダムに欠失した糖鎖の混合物となっており、これら糖鎖の混合物を使用するのが好ましい。また、糖鎖残基にシアル酸残基を有する糖鎖を含有する糖鎖混合物を使用するのが好ましい。
天然糖鎖の混合物としては、天然原料、例えば乳汁、ウシ由来フチュイン、卵又は生体の組織や細胞に由来する糖鎖混合物が挙げられる。特に癌組織又は癌細胞に由来する糖鎖混合物を使用することは、大変興味深い結果が期待できるので好ましい。
本発明で使用できる天然糖鎖の混合物としては、次に示す糖鎖混合物を好ましく例示できるが、シアロ糖鎖が含まれる糖鎖混合物が特に好ましい。
該天然原料から公知の方法によって糖タンパク質及び／又は糖ペプチドの混合物を得、当該混合物にタンパク質分解酵素等を作用させてペプチド部分を切断し、ゲルろ過カラムやイオン交換カラム等を用いたクロマトグラフィーで精製して得られた糖鎖結合アスパラギンの混合物を使用することができる。
また、例えば生体の組織や細胞、特に培養組織や培養細胞を用いて、培養液中の組織又は細胞をホモジネートし、次いで遠心分離して得られた細胞膜画分を２−メルカプトエタノールで処理した後、Ｎ−グリカナーゼを作用させて得られた糖鎖の混合物を使用することができる。
また、培養組織や培養細胞をホモジネートし、遠心分離した上清を採取することで得られた遊離糖鎖の混合物を使用することができる。これらの糖鎖の中には中性糖鎖として高マンノース型糖鎖や多様なシアロ糖鎖を含むので、各種の糖鎖の製造に適している。
得られた糖鎖の混合物中の糖鎖に脂溶性基を導入して糖鎖誘導体の混合物とする。
脂溶性基は、糖鎖の還元末端の開環アルデヒド、糖鎖結合アスパラギンのアスパラギンアミノ基又はカルボキシル基に反応して形成する脂溶性を有する置換基であり、例えば２−、３−または４−カルボキシフェニルアミノ基、ｐ−エトキシカルボニルフェニルアミノ基、２−ピリジルアミノ基等の通常蛍光標識として使用される置換基や９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等のカーバメート系又はアミド系保護基として使用される置換基を挙げることができる。
これら脂溶性基の導入は公知の方法によって行うことができ、操作の簡便さ、得られる糖鎖誘導体の安定性、励起光が水銀光源やレーザー光源に対応していることなどから２−カルボキシフェニルアミノ基、Ｆｍｏｃ基又はＢＯＣ基を好ましく使用できる。
例えば、２−アミノ安息香酸を用いて、シアノホウ素化水素ナトリウムやジメチルアミノ化ホウ素等の還元剤の存在下で糖鎖と反応させることで、アミノアルジトール誘導体とすることができる。
また、例えば９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミヂルカーボネートを用いて、炭酸水素ナトリウム存在下、糖鎖結合アスパラギンと反応させることで、アスパラギンのアミノ基にカーバメート様に結合したＦｍｏｃ基を導入することができる。
以上のような操作によって、脂溶性基が導入された糖鎖誘導体の混合物を得ることができる。
得られた糖鎖誘導体の混合物をセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより分離する。
本発明におけるセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーはシアル酸と親和性を有するセロトニンをリガンドとするアフィニティーカラムを使用する。
セロトニンアフィニティーカラムとしては、セロトニンを充填剤に固定化して作成してもよく、市販されているカラムを使用してもよい。市販のカラムとしては、ＬＡ−セロトニンカラム（株式会社Ｊ−オイルミルズ製）等が挙げられる。
クロマトグラフィーの分離条件は適宜設定されるものであるが、その一例を挙げると、蛍光検出器を用いて、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４２５ｎｍとし、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、移動相を超純水と酢酸アンモニウム水溶液とを使用して直線グラジエント溶出とすることで分離を達成することができる。
セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより、糖鎖誘導体の混合物を糖鎖誘導体のシアル酸残基の数によって分離することができ、シアル酸残基を有さないアシアロ糖鎖誘導体が最も早く溶出し、次いでモノシアロ糖鎖誘導体、ジシアロ糖鎖誘導体という具合にシアル酸残基の数の増加に比例して分離溶出することができる。
以上のようにセロトニンアフィニティーカラムによって分離した糖鎖誘導体を、ポリマーベースのアミノカラム又はシリカベースのアミドカラムを使用した順相ＨＰＬＣに処理することで、極めて優れた糖鎖誘導体間の分離を可能とすることができる。順相クロマトグラフィーとは、アミノ基、アミノプロピル基、アクリルアミド基など極性固定相を充填剤として用いるクロマトグラフィーであって、試料成分の固定相−移動相に対する試料成分の分配度の差に基づいて分離が達成されることを特徴する。基本的に糖鎖の親水性に基づいて分離されるモードであり、シアル酸が結合した糖鎖の異性体の分離にも好ましく用いることができる。また、希酸やノイラミニダーゼにより処理されたアシアロ型の糖鎖の分離にも好ましく用いることができる。
使用するポリマーベースのアミノカラムとしては、アミノ基をポリビニルアルコール系基材ゲル等のポリマーに結合させた固定相を充填剤として用いたカラムであって、自ら作成してもよいが、市販されているカラムを使用してもよい。
市販のアミノカラムとしては、Ａｓａｈｉ Ｓｈｏｄｅｘ ＮＨ２Ｐ−５０４Ｅ（昭和電工株式会社製）を挙げることができる。
シリカベースのアミドカラムとしては、アクリルアミド等のアミド基をシリカを固定相とする充填剤に化学結合させて導入したカラムであって、自ら作成してもよいが、市販されているカラムを使用してもよい。
市販のアミドカラムとしては、ＴＳＫ−ＧＥＬ Ａｍｉｄｅ−８０（ＴＯＳＯＨ Ｃｏｒｐ製）を挙げることができる。
クロマトグラフィーの分離条件は適宜設定されるものであるが、その一例を挙げると、蛍光検出器を用いて、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４２５ｎｍとし、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、移動相を酢酸含有アセトニトリルと酢酸及びトリエチルアミン含有水溶液とを使用して直線グラジエント溶出とすることで分離することができる。
以上のようにして単離して得られる糖鎖誘導体は、糖加水分解酵素の適用、質量分析法による分析により、その糖鎖構造を解析することができる。
糖加水分解酵素としては、公知の酵素を使用することができ、例えばシアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミダーゼ、フコシダーゼ等を挙げることができる。
質量分析方法としては、従来公知の質量分析法を採用した質量分析装置によってなされるが、近年特に糖鎖分析に用いられているＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより測定するのが好ましい。
糖鎖構造を解析するには、特定の糖加水分解酵素を作用させた後、ポリマーベースのアミノカラム又はシリカベースのアミドカラムを使用した順相ＨＰＬＣで処理し、得られた画分を質量分析して消失した質量分と加水分解酵素の特性とを考慮し、更にこの操作を繰り返すことで糖鎖構造を解析することができる。
得られる糖鎖誘導体は、その脂溶性基を除去することで種々の糖鎖を、人工的に容易にかつ大量に得ることができる。
脂溶性基の除去は従来公知の方法を適用することができる。
例えば、２−カルボキシフェニルアミノ基の除去は、酢酸中で過酸化水素と室温で反応させることで達せられ、容易に遊離型糖鎖として回収することができる。また、Ｆｍｏｃ基の除去は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中、糖鎖誘導体にモルホリンを加えて反応させることで達せられ、ＢＯＣ基の除去には弱酸を反応させることで達せられる。
糖鎖が糖鎖結合アスパラギンである場合、無水ヒドラジンと反応させた後、アセチル化する方法、塩基性水溶液中加熱還流後、アセチル化する方法等により、アスパラギン残基を除去することができる。
かかる糖鎖類は、医薬品開発等の分野において非常に有用であり、例えば癌のワクチン合成が挙げられ、得られた糖鎖類を化学的な反応や糖転移酵素による反応等を組み合わせて新たな糖残基を結合させて誘導体化し、新規ワクチンの開発を可能とする。
本発明者等は、本発明の構造解析方法及び製造方法により、各種癌細胞中にこれまで認められなかった下記式（１）〜（６）で示される糖鎖を単離することに成功した。
［式中Ｒ１は２−カルボキシフェニル基、３−カルボキシフェニル基、４−カルボキシフェニル基、ｐ−エトキシカルボニルフェニル基、又は２−ピリジル基を表す。Ｒ２は水酸基、基−Ａｓｎ又は基−Ａｓｎ−Ｒ３を表す。ここでＡｓｎはアスパラギン基を表し、Ｒ３はカーバメート系又はアミド系保護基を表す。Ａｃはアセチル基を表す。］
これら新規な糖鎖は、癌細胞中に特異的に発現するものと考えられ、これら糖鎖を癌マーカーとして利用することができる。
例えばこれら癌細胞中の特異的な糖鎖と特異的に認識するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製し、免疫学的手法により該糖鎖の検出を行うことで成される。
ポリクローナル抗体は、該糖鎖又は該糖鎖のハプテンとタンパク質等の高分子化合物（担体）と結合させた結合体を抗原としてマウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、ポリクローナル抗体を含む抗血清を調製することができる。
モノクローナル抗体は、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合により得られるハイブリドーマを調製して得ることができる。このようにして得られたハイブリドーマを培養し、産生されるモノクローナル抗体を精製すればよい。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は実施例１で得られた糖鎖誘導体のアフィニティーカラムクロマトグラムである。
【図２】図２は実施例２で得られた糖鎖誘導体のアフィニティーカラムクロマトグラムである。
【図３】図３は実施例３で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【図４】図４は実施例３で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【図５】図５は実施例３で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【図６】図６は実施例３で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【図７】図７は実施例３で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【図８】図８は実施例４で得られた糖鎖誘導体のアフィニティーカラムクロマトグラムである。
【図９】図９は実施例５で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【図１０】図１０は実施例６で得られた糖鎖誘導体のアフィニティーカラムクロマトグラムである。
【図１１】図１１は実施例７で得られた糖鎖誘導体のアフィニティーカラムクロマトグラムである。
【図１２】図１２は実施例７で得られた糖鎖誘導体のＨＰＬＣでのクロマトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に参考例及び実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００７】
セロトニンアフィニティークロマトグラフィーによるヒト血清由来
［１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）］糖鎖の分離
ヒト血清由来ＡＧＰ（シグマアルドリッチジャパン製）１ｍｇを２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）５０μｌに溶解し、Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ Ｆ（２Ｕｎｉｔ，４μｌ）を加え、３７℃で１２時間反応させた。反応後１００℃で３分間煮沸し遠心分離後の上清を回収した。
回収した上清に２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムをそれぞれ３％となるように２％ホウ酸、４％酢酸ナトリウム混液（５００μｌ）に溶解して１００μｌ加え、８０℃で１時間反応させた。反応混合物を５０％メタノール水溶液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０カラム（０．７ｃｍ ｉ．ｄ．，３０ｃｍ）を用いて分画し、分光光度計（日立製、Ｆ−４０１０型）を用いて、励起波長３３５ｎｍ、蛍光波長４１０ｎｍで各分画を測定して、最初に溶出される蛍光性分画を回収し、糖鎖誘導体の混合物とした。
得られた混合物をセロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーに供し、分離した糖鎖誘導体を得た。アフィニティーカラムクロマトグラフィーでの分離結果を図１に示す。
セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーの条件
カラム：ＬＡ−Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎカラム（４．６×１５０ｍｍ，Ｊａｐａｎ Ｏｉｌ ｍｉｌｌｓ製）
ポンプ：ＪＡＳＣＯ ＰＵ−９８０型
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＪＡＳＣＯ ＦＰ−９２０型蛍光検出器
励起波長：３５０ｎｍ
蛍光波長：４２５ｎｍ
移動相：溶液Ａとして超純水、溶液Ｂとして４０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液を用いた。グラジエント条件：試料注入後２分間を溶液Ｂ５％とし、３７分後に酢酸アンモニウム濃度が３０ｍＭとなるように、直線グラジエント溶出を行い、その後１０分間で４０ｍＭになるように行った。
なお、セロトニンアフィニティークロマトグラフィーの分離条件は以下の実施例においても同様とした。
【実施例２】
【０００８】
（ヒト癌細胞由来糖鎖のセロトニンアフィニティークロマトグラフィーによる分離）
細胞培養
ヒト腎腺癌細胞ＡＣＨＮ、ヒト肺癌細胞Ａ５４９、ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５及びヒト組織球性リンパ腫Ｕ９３７を用いた。ＡＣＨＮ及びＡ５４９は予め５０℃で３０分間加熱することにより非動化したウシ血清［ＮＥＷＢＯＲＮ
ＣＡＬＦ ＳＥＲＵＭ（ＮＣＳ）、シグマアルドリッチジャパン製］を１０％含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、シグマアルドリッチジャパン製）を用い、Ｕ９３７及びＭＫＮ４５では１０％ＮＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０（シグマアルドリッチジャパン製）を用い、５％ＣＯ２存在下３７℃で組織培養シャーレ中で培養した。Ｕ９３７を除く細胞は８０％コンフルエント状態において、培養中の細胞を等張化リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、トリプシン溶液を加え、３７℃で５分間処理した後、剥離した細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄後継代培養した。
細胞膜画分の調製
細胞膜分画の調製には８０％コンフルエント状態の細胞を用い、セルスクレーパーを用い、培養器より回収した。回収した細胞はＰＢＳで洗浄後、１×１０８ｃｅｌｌ／５ｍｌの濃度となるように１％のプロテアーゼインヒビターを含む１０ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中、グラスホモジナイザーを用いてホモジナイズ後、０．５ＭのＳｕｃｒｏｓｅを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）を１０ｍｌ加え、４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離後上清を回収後、４℃、１９０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた沈殿を細胞膜画分とした。
細胞膜画分からの糖鎖の遊離
細胞膜画分（１×１０７ｃｅｌｌ）に１％ＳＤＳ溶液４０μｌを加え、２−メルカプトエタノールを１％になるように加えた後、１００℃の沸騰水浴上で５分間加熱することにより可溶化を行った。膜画分を含む溶液を室温まで冷却し、ＮＰ−４０を１％になるように加え、終濃度が２０ｍＭになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えた。さらに、Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ
Ｆ ４μｌ（２Ｕｎｉｔ、Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製）を加え、３７℃で一晩インキュベートし、１００℃の沸騰水浴上で５分間煮沸し、９５％エタノールを終濃度が７５％になるように加えた後、４℃、１５０００ｒｐｍで遠心分離し上清を減圧乾固し、細胞膜由来糖鎖とした。
調製した各細胞膜由来糖鎖に、上記実施例１と同様に２−ＡＡを導入後、セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで処理し、各糖鎖誘導体画分を得た。カラムクロマトグラフィーでの分離結果を図２に示す。
【実施例３】
【０００９】
（順相型アミドカラムによる癌細胞由来糖鎖の分離及び構造解析）
実施例２で得られた各画分の癌細胞由来糖鎖誘導体（１×１０７ｃｅｌｌ相当）を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）２０μｌに溶解し、シアリダーゼ４μｌ（２ｍＵ，マルキンバイオ製）を加えて３７℃で２４時間反応させた。反応後１００℃で３分間煮沸し、遠心分離後の上清を回収した。
得られた上清をアミドカラムを用いた順相ＨＰＬＣに供し、糖鎖誘導体を分取した。ＨＰＬＣでの分離結果を図３〜７に示す。
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ａｍｉｄｅ−８０（ＴＯＳＯＨ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，Ｊａｐａｎ；４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
ポンプ：ＪＡＳＣＯ ＰＵ−９８０型
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＪＡＳＣＯ ＦＰ−９２０型蛍光検出器
励起波長：３５０ｎｍ
蛍光波長：４２５ｎｍ
移動相：溶液Ａとして０．２％酢酸を含むアセトニトリル溶液、溶液Ｂとして０．１％酢酸及び０．１％トリエチルアミンを含む水溶液を用いた。
グラジエント条件：試料注入後２分間を溶液Ｂ３０％とし、６０分後に溶液Ｂが６５％となるように直線グラジエント溶出を行った。
糖加水分解酵素と質量分析法による構造解析
Ｕ９３７由来のピーク３１の糖鎖誘導体を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）２０μｌに溶解し、β−ガラクトシダーゼ１μｌ（２５ｍＵ、生化学工業社製）を加えて３７℃で２４時間反応させた。反応後１００℃で３分間煮沸し遠心分離後の上清を回収した。得られた上清をアミドカラムを用いた順相ＨＰＬＣに供して得た画分の一部をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳにより分析した。結果、分子量２７１８の糖鎖誘導体（ａ）が得られた。
その糖鎖誘導体（ａ）を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２０μｌに溶解し、β−Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ１μｌ（１０ｍＵ，生化学工業社製）を加えて３７℃で２４時間反応させた。反応後１００℃で３分間煮沸し遠心分離後の上清を回収し、得られた上清を上記と同様に分析した結果、分子量１９０６の糖鎖誘導体（ｂ）が得られた。
更に糖鎖誘導体（ｂ）をβ−ガラクトシダーゼで処理した結果、分子量１５８２の糖鎖誘導体（ｃ）が得られた。
以上の結果より、ピーク３１は下記式で表される糖鎖誘導体であることが判明した。
同様にピーク３５の糖鎖誘導体も、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ、次いでβ−ガラクトシダーゼで処理し、下記式で表される糖鎖誘導体であることが判明した。
他のピークの誘導体についても加水分解酵素を適宜使用し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析等を行い、図３〜７に示すピークに相当する糖鎖構造を表１〜５に示した。なお、表１〜１４中の分子量は糖鎖還元末端に２−アミノ安息香酸が結合した状態での分子量（ＭＷ）を示し、記号は次のものを示す。
Ｇａｌ：Ｄ−ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン、
Ｍａｎ：Ｄ−マンノース、Ｆｕｃ：フコース、２−ＡＡ：２−アミノ安息香酸、ＮｅｕＡｃ：シアル酸。
ここで糖鎖還元末端に２−アミノ安息香酸が結合した糖鎖、例えば、次式で表される糖鎖部分構造は、−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−２−ＡＡと表すこととする。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析
装置にはＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を用い、リニアー／ネガティブイオンモードにより、加速電圧２０ｋＶ、グリッド電圧９６．３％、Ｄｅｌａｙｔｉｍｅ １０００ｎｓｅｃ、Ｌｅｎｓ Ｏｆｆ ｓｅｔ １．２５、レーザー強度（窒素レーザー）２７００で測定した。水に溶解したサンプル０．５μＬと２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ（ＤＨＢ）の２０ｍｇ／ｍＬメタノール溶液０．５μＬ を混和し、乾燥後、測定用試料として用いた。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【実施例４】
【００１０】
（細胞内に存在する遊離糖鎖１）
ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５をＰＢＳで洗浄後、１×１０８ｃｅｌｌ／５ｍｌの濃度となるようにグラスホモジナイザーを用いて１％のプロテアーゼインヒビターを含む１０ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中でホモジナイズ後、０．５ＭのＳｕｃｒｏｓｅを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）を１０ｍｌ加え、４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離後、上清を集め、さらに、４℃、１９０００ｒｐｍで遠心分離し、その上清を減圧乾固し遊離型糖鎖混合物を得た。
得られた遊離型糖鎖混合物に実施例１に記載の方法と同様に、２−ＡＡを導入して遊離型糖鎖誘導体の混合物を得、セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで分画して遊離型糖鎖誘導体を得た。
アフィニティーカラムクロマトグラフィーによる分離結果を図８に示す。
得られた各画分をアミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離し、遊離型糖鎖誘導体を得た。
ＨＰＬＣ条件
カラム： Ａｓａｈｉ Ｓｈｏｄｅｘ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ（Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ；４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度：５０℃
ポンプ：ＪＡＳＣＯ ＰＵ−９８０型
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＪＡＳＣＯ ＦＰ−９２０型蛍光検出器
励起波長：３５０ｎｍ
蛍光波長：４２５ｎｍ
移動相：溶液Ａとして２％酢酸を含むアセトニトリル溶液、溶液Ｂとして５％酢酸及び３％トリエチルアミンを含む水溶液を用いた。
グラジエント条件：試料注入後２分間を溶液Ｂ３０％とし、８０分後に溶液Ｂが９５％となるように直線グラジエント溶出を行い、１００分まで溶液Ｂを９５％となるように保った。
得られた遊離型糖鎖誘導体を、糖加水分解酵素（シアリダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ等）を適宜作用させ、上記アミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離後、得られた画分を凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析することにより、遊離型糖鎖誘導体の構造を解析した。
なお、α−マンノシダーゼでの処理は、糖鎖誘導体を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）２０μｌに溶解し、α−マンノシダーゼ２μｌ（１０ｍＵ，生化学工業社製）を加えて３７℃で２４時間反応させ、反応後１００℃で３分間煮沸して遠心分離後の上清を回収することでなされる。その他の糖加水分解酵素での処理は前記実施例での記載と同様とした。得られた糖鎖誘導体を表６及び７に示す。
表６及び７の遊離型糖鎖は新規化合物であり、例えばＮｏ．１の分子量１３２１である糖鎖誘導体は下記式で表される。
【表６】
【表７】
【実施例５】
【００１１】
（細胞内に存在する遊離糖鎖２）
ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５に替えて、ヒトＴ細胞リンパ腫Ｊｕｒｋａｔ２７（糖鎖導入細胞株）を用いた以外は、実施例４と同様に操作して、遊離型糖鎖混合物を得た。
得られた遊離型糖鎖混合物に実施例１に記載の方法と同様に、２−ＡＡを導入して遊離型糖鎖誘導体の混合物を得、セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーで分画して遊離型糖鎖誘導体を得た。
得られた各画分をアミドカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離し、遊離型糖鎖誘導体を得た。
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ａｍｉｄｅ−８０（ＴＯＳＯＨ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，Ｊａｐａｎ；４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
ポンプ：ＪＡＳＣＯ ＰＵ−９８０型
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＪＡＳＣＯ ＦＰ−９２０型蛍光検出器
励起波長：３５０ｎｍ
蛍光波長：４２５ｎｍ
移動相：溶液Ａとして０．１％酢酸を含むアセトニトリル溶液、溶液Ｂとして０．２％酢酸及び０．２％トリエチルアミンを含む水溶液を用いた。
グラジエント条件：試料注入後２分間を溶液Ｂ３０％とし、６０分後に溶液Ｂが６５％となるように直線グラジエント溶出を行った。
ＨＰＬＣでの分離結果を図９に示す。
得られた遊離型糖鎖誘導体を、実施例４と同様に操作して、遊離型糖鎖誘導体の構造を解析した。得られた糖鎖誘導体を表８に示す。
【表８】
【実施例６】
【００１２】
（ヒト子宮頸部癌細胞の糖鎖）
ヒト子宮頸部癌細胞ＨｅＬａをあらかじめ５０℃で３０分間加熱することにより非動化したＮＣＳを１０％含むＤＭＥＭを用いて培養した。８０％コンフルエント状態において、培養中の細胞をＰＢＳで洗浄後、トリプシン溶液を加え、３７℃で５分間処理した後、剥離した細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄後継代培養し、実施例２に記載の細胞膜画分の調製、細胞膜画分からの糖鎖の遊離と同様に処理して細胞膜由来の糖鎖混合物を得、上記実施例１と同様に２−ＡＡを導入後、セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーに処理し、各糖鎖誘導体画分を得た。
カラムクロマトグラフィーでの分離結果を図１０に示す。
得られたアシアロ糖鎖誘導体画分、モノシアロ糖鎖誘導体画分及びジシアロ糖鎖誘導体画分をシアリダーゼ処理した後、アミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離して糖鎖誘導体を得た。ＨＰＬＣ条件は実施例４と同様にした。
得られた糖鎖誘導体を、糖加水分解酵素（シアリダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ等）を適宜作用させ、上記アミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離後、得られた画分を凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳで分析することにより、糖鎖誘導体の構造を解析した。
得られた糖鎖誘導体を表９〜１２に示す。
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【実施例７】
【００１３】
（癌細胞特異的抗原ＣＤ９８の糖鎖）
免疫沈降法によるＣＤ９８−ＨＣの調製
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ａｇａｒｏｓｅ ５０μｌ（シグマアルドリッチジャパン製）をＰＢＳ２００μｌにより洗浄後、ＰＢＳ５０μｌおよび抗ＣＤ９８抗体を１０μｇ／１０μｌ加え、室温にて６０分間反応させた。反応後、ＰＢＳ１ｍｌにより非吸着成分の除去し、抗ＣＤ９８抗体固定化Ａｇａｒｏｓｅを得た。抗ＣＤ９８抗体固定化Ａｇａｒｏｓｅに、１％ＮＰ−４０（４００μｌ）により可溶化したＨｅＬａ細胞の膜分画（２×１０７ｃｅｌｌ）を加え、ロータリーシェイカーを用いて４℃で一晩インキュベートした。その後、ＰＢＳを１ｍｌにより洗浄し、非吸着成分を除去し、遠心分離後、抗ＣＤ９８抗体固定化Ａｇａｒｏｓｅに解離溶液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．８／４．６％ ＳＤＳ，２０％Ｇｌｙｃｅｒｉｎ）と２−メルカプトエタノールとの９：１混液を２０μｌ加え、５分間煮沸し１５０００ｒｐｍで遠心した上清をＣＤ９８−ＨＣとし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
ゲル電気泳動装置および電源は共にＢｉｏ Ｒａｄ製を用いた。泳動ゲルは７．５％ゲルを用いた。泳動緩衝液として２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，１９８ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用いて行った。最初の１時間はゲル１枚あたり５ｍＡで、続いて１０ｍＡでゲル下辺部まで泳動を行った。
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色
ＳＤＳ−Ｐａｇｅ終了後、４０％（ｖ／ｖ）Ｍｅｔｈａｎｏｌ，１０％（ｖ／ｖ）Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ／０．２％Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０中にてタンパク質の染色を行った。１時間後、Ｍｅｔｈａｎｏｌ：Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：Ｗａｔｅｒ（＝４：１：５）を用いて脱色した。
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをＢＩＯ−ＲＡＤ製セミドライ式ブロッティング装置（トランスブロットＳＤセル）を用いて、ゲル中のタンパク試料をＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜は予めメタノールに６０秒浸し、その後４８ｍＭＴｒｉｓ，３９ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ，２０％Ｍｅｔｈａｎｏｌ（ｐＨ９．０）に１時間浸したものを使用し、１００ｍＡ定電流にて１時間電圧を印加し転写を行った。転写後、ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳにてブロッキング操作を行った後、抗ＣＤ９８抗体５μｇを含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ（５ｍｌ）を加え一晩反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＰＢＳ（２０ｍｌ）で４回洗浄後、ＨＲＰ標識Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ５μｌを含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ（５ｍｌ）を加え、１時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（２０ｍｌ）で４回洗浄し、０．０５％ＤＡＢ（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｒｉｎｅ，ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を含む１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．５，０．００３１％過酸化水素溶液 ２０ｍｌを加え発色させた。
Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ Ｆによるゲル内消化
ＣＢＢ染色によりバンドを確認した後、脱色液を水に置換し、目的のバンドを切り取り、エッペンドルフチューブへ入れた。その後アセトニトリル１００μｌを加え３０分間放置することでゲルを脱水し、アセトニトリルを除去後２ｕｎｉｔｓのＮ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ Ｆを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．５を１００μｌ加え３７℃で一晩インキュベートし糖鎖を切り出した。その後、抽出液を回収しさらに水２００μｌを加え３０分間攪拌しゲルより糖鎖混合物を得た。
以上のようにして得られた糖鎖混合物に上記実施例１と同様に２−ＡＡを導入後、セロトニンアフィニティーカラムクロマトグラフィーに処理し、各糖鎖誘導体画分を得た。
カラムクロマトグラフィーでの分離結果を図１１に示す。
得られたモノシアロ糖鎖誘導体画分及びジシアロ糖鎖誘導体画分をシアリダーゼ処理した後、アミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離して糖鎖誘導体を得た。ＨＰＬＣ条件は実施例４と同様にした。ＨＰＬＣでの分離結果を図１２に示す。
得られた糖鎖誘導体を、糖鎖加水分解酵素（シアリダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ等）を適宜作用させ、上記アミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離後、得られた画分を凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
ＭＳで分析することにより、糖鎖誘導体の構造を解析した。
得られた糖鎖誘導体を表１３〜１４に示す。
【表１３】
【表１４】
【産業上の利用可能性】
【００１４】
本発明の方法によれば、特に細胞又は組織中の糖鎖混合物を詳細に分離することができ、網羅的にその糖鎖構造を解析することを可能としたことで、従来知られていなかった糖鎖及びその機能を探求することができ、今後の糖鎖研究における多大なる貢献が期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で表される糖鎖誘導体からなる群より選択されるいずれか一つの糖鎖誘導体。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
［式中Ｒ４は２−カルボキシフェニル基、３−カルボキシフェニル基、４−カルボキシフェニル基、ｐ−エトキシカルボニルフェニル基、２−ピリジル基、水酸基、又は、基−Ａｓｎ−Ｒ５を表わす。ここでＡｓｎはアスパラギン基を表し、Ｒ５はカーバメート系又はアミド系保護基を表す。Ａｃはアセチル基を表す。］
【請求項１】
下記式で表される糖鎖誘導体からなる群より選択されるいずれか一つの糖鎖誘導体。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
［式中Ｒ４は２−カルボキシフェニル基、３−カルボキシフェニル基、４−カルボキシフェニル基、ｐ−エトキシカルボニルフェニル基、２−ピリジル基、水酸基、又は、基−Ａｓｎ−Ｒ５を表わす。ここでＡｓｎはアスパラギン基を表し、Ｒ５はカーバメート系又はアミド系保護基を表す。Ａｃはアセチル基を表す。］
【図３】
【図５】
【図６】
【図１】
【図２】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図５】
【図６】
【図１】
【図２】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１２−１６２５４２（Ｐ２０１２−１６２５４２Ａ）
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−７７９５８（Ｐ２０１２−７７９５８）
【出願日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【分割の表示】特願２００７−５２５５２０（Ｐ２００７−５２５５２０）の分割
【原出願日】平成１８年７月１９日（２００６．７．１９）
【出願人】（０００２０６９０１）大塚化学株式会社 (55)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【分割の表示】特願２００７−５２５５２０（Ｐ２００７−５２５５２０）の分割
【原出願日】平成１８年７月１９日（２００６．７．１９）
【出願人】（０００２０６９０１）大塚化学株式会社 (55)
【Ｆターム（参考）】
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