細胞のインテグリンを介した接着性の制御方法
【課題】マイクロビライ形成促進因子を特定し、当該マイクロビライ形成促進能を有する遺伝子を用いる細胞表面のマイクロビライ形成促進方法、特に接着性細胞を浮遊培養可能にし、マイクロビライを有する細胞の機能を高める方法の提供。
【解決手段】細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、細胞表面におけるマイクロビライ形成を促進させる方法；（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
【解決手段】細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、細胞表面におけるマイクロビライ形成を促進させる方法；（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
細胞表面へのマイクロビライ形成促進方法、細胞のインテグリンを介した接着性の制御方法、細胞表面のインテグリンのリガンド結合に基づく作用を制御する方法、及び制御物質のスクリーニング方法。
【背景技術】
【０００２】
一般に、動物細胞は、リンパ系細胞など培養器表面にはほとんど接着しないで増殖する浮遊性細胞もあるが、ほとんどの動物細胞は培養器表面に接着して増殖する接着性細胞である。例えば、上皮性細胞、線維芽細胞などが典型的な接着性細胞であり、遺伝子導入に用いる形質転換用細胞、又は癌細胞なども通常は接着性細胞である。
接着性の動物細胞では血清中の成長因子と共に、接着した細胞外基質からのシグナルにより細胞死をまぬがれていると考えられるため、これらの細胞接着現象及びシグナルの受け渡しにはインテグリンが重要な役割を果たしている可能性があるが、その役割は十分に解明されてはおらず、インテグリンが関与する接着現象を確実に制御するには至っていない。
接着性細胞を効率的かつ安定的に浮遊化するためには、細胞表面のインテグリンを制御する必要があると考えられるが、どのように細胞表面のインテグリンを制御すれば、接着性細胞の他の性質を変化させることなく接着性を減じて浮遊化させることができるのかが不明であった。
【０００３】
一方、浮遊性細胞の代表的な白血球の形態学的な特徴の１つとして細胞表面にマイクロビライ（微絨毛）が存在していることがある。「マイクロビライ（microvilli、微絨毛）」は、「アクチンタンパク質繊維数十本が束になって芯を作っている細胞膜表面に存在する短い指状の突起」と定義でき（非特許文献１）、浮遊性の白血球のみならず、種々の細胞膜表面に存在しており、突起の長さは約1μm、太さは0.1〜0.5μm程度の大きさである。
これら白血球細胞表面のマイクロビライの働きは、よく解明されておらず、浮遊細胞である白血球同士の接着や、白血球が血管壁、各種組織を形成する細胞などと接着するのを阻害する作用がある可能性もあるが、同じ浮遊細胞で血液細胞の赤血球にはマイクロビライがないことから、少なくとも単純な接着阻害作用の役割というわけではない。リンパ球等血球系の細胞表面のマイクロビライが細胞表面タンパク質の足場となり細胞機能を調節する（非特許文献２）との報告もあり、白血球が血管壁を通って移動する際には、むしろ血管壁を形成する血管上皮細胞との相互作用に関与し、かつ細胞の隙間を通り抜ける際に重要な役割をしている可能性がある。このようにマイクロビライは細胞間のインターラクション（interaction）、メカニカルセンサーとしての役割を果たしていることが考えられる。実際に、マイクロビライは、腸粘膜や腎の近位尿細管のような吸収上皮細胞では、細胞の頂部（消化管等の管腔側）に存在して表面積を増大させて、物質や水の吸収を促進する機能を有している。また、精巣上体では溶液の吸収の為の表面積を増やす作用があり、内耳の有毛細胞では、平行、聴覚機能の感覚受容体として作用する等様々な機能を担っているとされる。
このように、各種細胞にとってマイクロビライが重要な機能を担っている点が注目され、その役割や形成のメカニズムの研究が活発化している。
【０００４】
マイクロビライ形成の促進に関しては、最近、細胞表面分子であるムチン型糖蛋白質のpodocalyxin, MCAM/CD146/Muc18/Gicerinを細胞表面に発現させるとマイクロビライの形成が促されることが報告された（非特許文献３〜５）。しかしながら、podocalyxinも、MCAM/CD146/Muc18/Gicerinも、細胞表面分子としては典型的な物質ではないことから、一般的なマイクロビライ形成に関わる主要遺伝子の特定には至っていない。また、マイクロビライに対してケモカイン処理、アクチン重合阻害剤処理、あるいはPMA処理を施すことによりマイクロビライが壊れること、及び脱リン酸化阻害剤によりマイクロビライが安定化できることの報告はなされている（非特許文献６〜８）が、マイクロビライ形成を確実に制御するにはほど遠い状況であり、マイクロビライ形成のメカニズムの解明には至っておらず、マイクロビライの細胞・生体における機能についても依然として不明なままであった。
そして、マイクロビライとインテグリンの関係についての報告はなく、マイクロビライ形成と細胞の接着現象との関連性に着目した報告もなされていなかった。
【０００５】
【非特許文献１】Bruce Alberts et al. Garland Science，4th ed.“molecular biology of the cell”（ISBN 0-8153-3218-1）
【非特許文献２】Chhabra E.S. and Higgs H.N.,Nat. Cell Biol., 2007 ; Vol. 9, 1110-1121 (PMID 17909522)
【非特許文献３】Nielsen J.S. et al., PLoS ONE. 2007; Vol.2, e237 (PMID 17311105)
【非特許文献４】Okumura S. et al., Exp. Cell Res., 2001; Vol.271, p269-276 (PMID 11716539)
【非特許文献５】Guezguez B., et al., J. Immunol., 2007; Vol. 179, p6673-85 (PMID 17982057)
【非特許文献６】Brown M.J., et al., Blood, 2003; Vol. 102, p3890-9 (PMID 12907449)
【非特許文献７】Fors B.P., et al., J. Immunol., 2001; Vol. 167, p3642-51 (PMID 11564777)
【非特許文献８】Majstoravich S. et al., Blood, 2004; Vol. 104, p1396-1403 (PMID 15130947)
【非特許文献９】Immunobiology, Janeway C. A. et al., Garland publications,（2007,7th edition）
【非特許文献１０】Arroyo A.G. et al., Cell, 1996, Vol.85, p997-1008
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、細胞表面にマイクロビライを有する各種細胞で多量に発現している典型的な細胞表面分子をコードする遺伝子の中から、マイクロビライの形成促進に関与する主要な遺伝子を特定し、当該遺伝子を用いて各種細胞表面におけるマイクロビライ形成を促進する方法を提供することであり、接着性の細胞にマイクロビライを形成して浮遊化培養可能にすることである。またマイクロビライとインテグリンとの関連性を明らかにし、細胞表面のインテグリンとリガンドとの結合に基づく作用を制御する方法を提供することを目的とするものである。また、インテグリンとリガンドとの結合に基づく作用を制御する物質のスクリーニング方法も提供しようとするものでもある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明者等は、マイクロビライ中に局在している蛋白質をコードする遺伝子に着目し、それら遺伝子のうちで、ＣＤ３４遺伝子、ＣＤ４３遺伝子及びＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２遺伝子がマイクロビライ形成促進活性を発揮する遺伝子であることと共に、これら遺伝子のうちの細胞外ドメインをコードするフラグメントがマイクロビライ形成に関わっていることを見出した。すなわち、これら遺伝子を接着性細胞に導入することで、マイクロビライを形成させることができ、その結果、接着性細胞の基盤表面からの接着性を減じ浮遊培養可能にした。さらに、この接着制御機構として、細胞表面のインテグリンを介する細胞接着が阻害されていることを明らかにした。また、インテグリンは、これらマイクロビライ形成促進活性を発揮する遺伝子を導入することで作製されたマイクロビライ上、あるいは、白血球等、元々マイクロビライを有する細胞のマイクロビライ上に局在することを確認した。また、白血球等元々マイクロビライを有する細胞でインテグリンを介した細胞接着を起こさせると接着部位からマイクロビライは排除されることを発見した。このことから、白血球等マイクロビライを有する浮遊細胞においても、マイクロビライによりインテグリンを介した接着が制御されていると推察される。以上のような知見を得たことで、細胞表面のマイクロビライの形成促進及びマイクロビライに基づく細胞の特性改善に関する本発明を完成させた。
そして、本来接着性の細胞表面にマイクロビライを形成させることで接着性を減じ浮遊細胞となった細胞を用い、被検物質が、マイクロビライ形成を促進又は阻害するか否かを観察することで、インテグリンとそのリガンドとの結合作用を増大又は減少させる物質のスクリーニング方法についての本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕 細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、細胞表面におけるマイクロビライ形成を促進させる方法；
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
〔２〕 前記細胞表面上のマイクロビライが、インテグリン分子を集約させたマイクロビライであることを特徴とする、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕 前記細胞が、本来接着性の細胞であり、細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、細胞表面のインテグリンのリガンド結合に基づく作用を制御する方法；
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
〔５〕 前記インテグリンのリガンド結合に基づく作用が、インテグリンを介した細胞接着作用である前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕 前記細胞が、血球系細胞であり、前記インテグリンのリガンド結合に基づく作用が血管内皮細胞表面への接着現象であることを特徴とする、前記〔４〕又は〔５〕に記載の方法。
〔７〕 前記細胞が、本来接着性の細胞であり、細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞である、前記〔４〕又は〔５〕に記載の方法。
〔８〕 本来接着性の細胞であって、かつ細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞に対して、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、接着性細胞を浮遊性細胞に変換する方法；
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
〔９〕 細胞表面のインテグリンのリガンド結合に基づく作用を制御する物質のスクリーニング方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法;
（ａ）本来接着性の細胞であり、細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることにより、接着性細胞を浮遊性細胞に変換する工程、
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（ｂ）（ａ）の細胞を培養し、細胞表面のマイクロビライ形成が促進された細胞を取得する工程、
（ｃ）（ｂ）の細胞に対して、被検物質を作用させ、細胞表面のマイクロビライ形成を促進するか又は抑制する効果が存在することを確認する工程。
〔１０〕 前記工程（ｂ）及び／又は（ｃ）において、細胞表面のマイクロビライ形成の促進又は抑制を、細胞の接着性の増減を観察することにより確認することを特徴とする、前記〔９〕に記載のスクリーニング方法。
〔１１〕 前記被検物質が、あるタンパク質をコードするＤＮＡであり、前記被検物質を作用させる方法が被検物質を組換えＤＮＡとして前記細胞内に導入することである、前記〔９〕又は〔１０〕に記載のスクリーニング方法。
〔１２〕 前記スクリーニング方法が、白血球由来細胞のHoming現象又は血管外遊走現象を促進又は阻害する物質の候補を選択するための方法である、前記〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔１３〕 前記スクリーニング方法が、癌細胞の浸潤転移性を阻害する物質の候補を選択するための方法である、前記〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明における、マイクロビライ形成促進活性を発揮する遺伝子を細胞内に導入することにより、細胞表面のマイクロビライ形成が促進される。その結果、細胞表面のインテグリンを介した接着性を制御することで、従来浮遊培養が困難であった接着性細胞の接着性が減じて容易に浮遊培養可能となる。また、元々マイクロビライを細胞表面に有する細胞に対して導入してマイクロビライ形成を促進した場合には、マイクロビライに基づく各種細胞特性も高められる。本来接着性の細胞表面にマイクロビライを形成させて浮遊細胞となった細胞に対して被検物質を作用させることで、光学顕微鏡などで細胞の接着性の増減を観察するだけで、インテグリンとそのリガンドとの結合作用を制御する物質のスクリーニングが可能となった。しかも、得られた阻害物質は、白血球由来細胞のHoming現象又は血管外遊走現象を促進又は阻害する物質、さらには癌細胞の浸潤転移性の阻害物質の候補ともなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明におけるマイクロビライ形成促進活性を発揮する遺伝子は、CD34遺伝子、CD43遺伝子及びPSGL-1/CD162遺伝子であるが、これらの遺伝子がコードするタンパク質は、いずれも細胞表面に存在する、シアロムチンファミリーに属するI型膜貫通糖蛋白質であって、その細胞外ドメインは多数のＯ型糖鎖を有している点で共通している。「CD34」は、造血幹細胞／前駆細胞のマーカーであって、血管内皮細胞にも発現が見られる糖タンパク質であり、「CD43」及び「PSGL-1/CD162」は、造血系細胞の多くに発現する膜抗原であって、「CD43」はWiskott-Aldrich症候群のリンパ球で発現異常が報告され、「PSGL-1/CD162」の糖鎖はセレクチン/CD62のリガンドであることが知られている。従来、マイクロビライ形成促進活性が確認されたpodocalyxin及びMCAM/CD146/Muc18/Gicerinもムチン型糖蛋白質に属する細胞表面分子ではあったが、マイクロビライを有する典型的な細胞の表面では存在が確認された例がほとんど無いマイナーな細胞表面分子である。一方、本発明において、マイクロビライ形成促進活性があることを確定できたCD34遺伝子、CD43遺伝子及びPSGL-1/CD162遺伝子は、いずれも典型的なマイクロビライを有する細胞である造血系細胞の表面で大量に発現している蛋白質をコードする遺伝子であるので、これら遺伝子がマイクロビライ形成に関わる主要遺伝子である可能性が高い。したがって、本発明ではこれら遺伝子を導入した各種細胞を用いることで、マイクロビライの本質的な形成メカニズムの解明が、はじめて可能となった。
これら各遺伝子は、哺乳動物細胞間での遺伝子配列の保存性は高く、互換性があるので、いずれの生物種由来の遺伝子でもよいが、導入する細胞の由来生物種と同一もしくは近縁の種であることが好ましい。また、本発明において、マイクロビライ形成促進のためには、これら遺伝子のうち、Ｏ型糖鎖を多数有する細胞外ドメインをコードする領域が重要であることが確認されている。すなわち、本発明におけるCD34遺伝子、CD43遺伝子及びPSGL-1/CD162遺伝子については、細胞外ドメインをコードする領域を含むフラグメントを用いることが好ましく、同一の機能を有する限り、さらに短いそのフラグメントであってもよい。
【００１１】
CD43, CD34, PSGL-1/CD162のうち、最も典型的なヒトのアミノ酸配列及び塩基配列は、以下のアクセッション番号で示される。
Homo sapiens CD34 isoform a (NP_001020280) = CD34 variant 1 (NM_001025109)
Homo sapiens CD34 isoform b (NP_001764) = CD34 variant 2 (NM_001773)
ヒトCD34遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１及び２で示す。
Homo sapiens CD43 (NP-001025459) = CD43 (NM_001030288)
Mus musculus CD43 (NP_001032899) = CD43 (NM_001037810)
ヒトCD43遺伝子及びマウスCD43遺伝子がコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４で示す。なお、ヒトCD43の細胞外ドメインは配列番号３のアミノ酸１〜２５３に相当する。
Homo sapiens CD162/PSGL-1 (NP_002997) = CD162 (NM_003006)
ヒトCD162/PSGL-1がコードするアミノ酸配列を配列番号５で示す。
本発明の実施例では、これらの遺伝子は特異的プライマーを用いてRT-PCRにより増幅・単離したものをDNAシークエンシングにて塩基配列を確認した上で使用した。
【００１２】
本発明において、例えば「ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質」というとき、「その細胞外ドメインを含む融合蛋白質」とは、少なくともＣＤ４３の細胞外ドメインを含むＣＤ４３蛋白質と、他の蛋白質との融合蛋白質を指し、通常はＣＤ４３蛋白質のＣ末端側に結合させる。ここで、「他の蛋白質」とは、ＧＦＰなどのレポーター蛋白質も含みどのような蛋白質であってもよいが、ＣＤ４３由来の蛋白質が「細胞外ドメイン」のみで構成されている場合は、当該「ＣＤ４３細胞外ドメイン」を細胞膜表面に固定するための、少なくとも「細胞膜貫通領域」を提供可能な細胞膜表面の蛋白質である。例えば、ＣＤ４４やGlycophorin-Ａ由来の「細胞膜貫通領域」、又はさらにその「細胞内ドメイン」までを含む蛋白質が好ましく用いられる。
【００１３】
本発明の各遺伝子導入に際しては、哺乳動物細胞用の各種ベクター又は他の周知の遺伝子導入方法が適用できる。典型的にはリポフェクションやリン酸カルシウム共沈法、レトロウイルスベクターなどの各種ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法が好ましく用いられる。
【００１４】
本発明の方法に用いる対象細胞としては、もともと細胞表面にマイクロビライを有していてもいなくても、また浮遊細胞であっても付着細胞であってもいずれでもよいが、マイクロビライ形成促進作用を確認し、マイクロビライ特有の機能を付与又は増強するために用いる細胞としては、マイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞である方が好ましい。本発明においてマイクロビライ形成促進活性を発揮する遺伝子であることが見出された「CD34遺伝子、CD43遺伝子及びPSGL-1/CD162遺伝子」の発現もマイクロビライ形成もほとんど無いHEK293T細胞である。マイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞は、典型的には接着性の強い付着性細胞であり、上皮性細胞、線維芽細胞、内皮細胞、及びこれら細胞に由来する各種癌細胞などの場合は典型的な付着性細胞に相当する。本発明の実施例でこれら細胞の典型例として用いたHEK293T細胞は、上皮細胞由来培養細胞である。また、ほとんどの上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞は限定的なマイクロビライしか持たず、マイクロビライ形成促進活性を発揮する遺伝子を導入することで、マイクロビライを細胞表面に形成することができ、特に付着性細胞の場合は接着性を減ずることができる。
これらの細胞を培養する場合、接着性が減じて浮遊細胞となっても用いる培地は特に変化させる必要はない。例えばDMEM培地、RPMI1640培地などの通常の培地を用いることができる。他の血球系細胞など本来浮遊性の細胞の場合も同様である。
【００１５】
反対に、もともとマイクロビライを表面に有している細胞は、マイクロビライ特有の特性を有しているが、その特性はマイクロビライ上のインテグリンのリガンド結合に基づく作用である可能性が大きいので、インテグリンのリガンド結合に基づく作用を観察し、その作用を制御するために好ましく用いられる。
そのような細胞として典型的な細胞は、白血球又は白血球由来などの血球系の浮遊細胞である。本発明の実施例では、最も典型的な白血球由来培養細胞株であるヒト急性骨髄性白血病細胞由来KG-1細胞を用いて、マイクロビライがインテグリンを介した接着に関与することを解明した。このタイプの細胞には、造血幹細胞／前駆細胞、及びほとんどの白血球が包含される。これらの白血球系細胞は血管を通過する場合、まず、セレクチンとPSGL-1上の糖鎖の間の結合でrollingをし、その後、ケモカイン等の刺激により白血球上のインテグリンと血管内皮細胞間の結合が起こると言われている。PSGL-1をはじめ、CD34, CD43はそのＯ型糖鎖の上にセレクチンリガンドを有することが知られているが、本発明において、これらの分子はマイクロビライ上に存在し、インテグリンもマイクロビライ上に局在することが解明されたことからみて、CD34、CD43及びPSGL-1/CD162遺伝子の働きは、マイクロビライを形成し、そのマイクロビライを介して血管内皮との結合、血管外への遊走を制御していると考えられる。
したがって、本発明において、マイクロビライの全くない、もしくは少ない血球系細胞、あるいは、一般的な付着細胞に対しては、CD34、CD43及びPSGL-1/CD162遺伝子を導入することでマイクロビライを形成させることができるのだから、その結果、これらの細胞を血管内皮に結合させたり、血管外に遊走させたりすることができる可能性が高い。
【００１６】
本発明は、細胞表面におけるインテグリンのリガンド結合に基づく作用を制御する方法にも関するが、ここで、「インテグリン(integrin))とは、細胞表面タンパク質の１種で、主に細胞外マトリックスへの細胞接着、細胞外マトリックスからの情報伝達に関与する細胞接着分子であり、歴史的には、細胞外マトリックス中の接着分子ファイブロネクチンのレセプターとして最初に同定された。細胞外マトリックス中のファイブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなどと結合して細胞とマトリックス(細胞基質）との間の接着を制御するが、一部細胞表面分子（ＶＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−１，ＭａｄＣＡＭなど）などと結合し、細胞と細胞との間の接着を制御するインテグリンも存在する。
インテグリンは、α鎖とβ鎖とで構成されるヘテロ二量体糖タンパク質であって、異なるα鎖とβ鎖が存在し多種類の組み合わせ方で分類され、インテグリンファミリーとも呼ばれる。最も一般的に知られたインテグリンの一つが「インテグリンα４β１」であり、インテグリンα４鎖(CD49d)とβ1鎖(CD29)とから構成され、別名very late antigen-4 (VLA-4)とも呼ばれる。主要な細胞表面接着分子の一つであり、VCAM-1およびファイブロネクチンCS-1ペプチドをリガンドとする。白血球や造血幹細胞／前駆細胞の接着及びHoming現象に関与することが知られている(非特許文献９)。特にリンパ球での役割は非常に重要であり、α4インテグリン遺伝子をノックアウトしたマウスでは成体のリンパ球発育が見られないことが知られている(非特許文献１０)。
【００１７】
したがって、本発明で「インテグリンのリガンド結合に基づく作用」というとき、「インテグリンを介した細胞の接着作用」以外にも、白血球細胞などに見られるインテグリンを介した「Homing作用」や「血管外遊走作用」が典型的なものとしてあげられ、他にも細胞の増殖作用、細胞のアポトーシス抑制作用又は幹細胞の分化制御作用などが含まれる。
本発明の実施態様では、「インテグリンのリガンド結合に基づく作用」として最も典型的な「インテグリンを介した細胞接着作用」を取り上げ、マイクロビライ形成が「インテグリンを介した細胞接着現象」に関与していることを確認した。
【００１８】
本発明の実施例では、インテグリンのリガンド結合に基づく作用の制御を観察するために、本来マイクロビライを形成しておらず「CD34遺伝子、CD43遺伝子及びPSGL-1/CD162遺伝子」のいずれも発現していない接着性の細胞であるHEK293T細胞を用いた。HEK293T細胞もインテグリン分子を有してはいるが、一般的なタイプではない「インテグリンαvβ１」であったため、「インテグリンα４」遺伝子を導入し、上記一般的な「インテグリンα４β１」を発現させそのリガンドであるCS-１ペプチドとの結合状態を観察した。なお、白血球細胞由来のKG-1細胞は、もともと細胞表面にマイクロビライを有し「CD34遺伝子およびCD43遺伝子」のコードする蛋白質いずれもが当該マイクロビライ表面で発現している細胞であり、血管壁でHoming現象を起こすとき以外は、通常は浮遊性の細胞であるが、このKG-1細胞中には一般的な「インテグリンα４β１」が発現している。白血球系細胞など一般的なインテグリン分子を元々発現している細胞の場合は、あえてインテグリン遺伝子を導入する必要はない。
【００１９】
インテグリンとリガンドの結合状態を観察する際、細胞が本来発現しているインテグリンであっても、またどのようなインテグリンα鎖とβ鎖の組み合わせの遺伝子であっても用いることができる。その際、インテグリンが異なれば、インテグリンと結合するリガンドも異なる。典型的な組み合わせとしては、α４β１インテグリンの場合の特異的リガンドは、ファイブロネクチンCS-1ペプチドおよびVCAM-1であるが、α3β１インテグリンの場合はコラーゲン、α5β１インテグリンの場合はファイブロネクチン、α6β１インテグリンの場合はラミニンであるなど特定のインテグリンに対し特定のリガンドがあることがわかっている。
CS-1ペプチドをリガンドとする「インテグリンα４β１」との作用を観察する場合、必要に応じて「インテグリンα４」遺伝子を導入して、細胞表面に「インテグリンα４β１」を発現させ、α４β１インテグリン特異的リガンドであるファイブロネクチンCS-1ペプチドをコーティングした基盤を用いて、インテグリンを介した結合状態を観察する。
典型的なヒトα４インテグリンのアミノ酸配列及び塩基配列は、以下のアクセッション番号で示される。
Homo sapiens a4 integrin (ITGA4) (NP_000876) = (NM_000885)
ヒトα４インテグリンをコードするアミノ酸配列を配列番号６として示す。
本発明の実施例では、当該遺伝子を特異的プライマーを用いてRT-PCRにより増幅・単離したものをDNAシークエンシングにて塩基配列を確認した上で使用した。
【００２０】
本発明において、インテグリンを発現している細胞というときは、本来インテグリンを発現している細胞であっても、インテグリンα鎖遺伝子及び／又はβ鎖遺伝子を導入し強制的に発現させた細胞であってもよい。その際に、CD34遺伝子、CD43遺伝子及び／又はPSGL-1/CD162遺伝子を同時に導入してもよい。
本来浮遊性の細胞にインテグリン遺伝子を導入するか又は導入せずに、細胞が発現しているインテグリンと相互作用をするリガンド物質（例えば、α４β１インテグリンの特異的リガンドであるファイブロネクチンCS-1ペプチド）を基盤表面に塗布して培養することで、本来浮遊性の細胞であっても基盤表面に接着させることができる。
本発明においては、KG-1 細胞に「インテグリンα４」遺伝子を導入してインテグリンα４β１を発現させたため、基盤表面にはファイブロネクチンCS-1ペプチドを塗布して用いた。
【００２１】
本発明において、マイクロビライはインテグリンとリガンドの結合を制御するが単に阻害する訳ではないことが解明されたことから、逆に、セレクチンリガンドをその上に有しマイクロビライ形成促進作用のあるこれらの遺伝子（CD34、CD43又はPSGL-1/CD162遺伝子）を発現させない試薬（具体的には、siRNA, antisenseなど）または、CD34、CD43又はPSGL-1/CD162タンパク質阻害剤（具体的には、O-sialo endglycopeptidase, 特異抗体）等により、これらの蛋白質の作用を抑制することで、マイクロビライを発現している白血球等の細胞の血管外遊走を抑制することが出来ると考えられる。
本発明では、そのうちの典型的なCD34遺伝子のsiRNAを用いてKG-1細胞中のCD34の発現を抑制したところ、マイクロビライ形成が部分的に抑制された（実施例添付せず）。
また、これらの蛋白質の量を増減させなくとも、マイクロビライを崩壊させる試薬を用いることでも白血球等の細胞の血管外遊走を抑制することができる可能性がある。本発明では、KG-1細胞をPMA処理する事でインテグリンを介する接着を誘導しているが、PMAはマイクロビライの数・長さを減弱させることが知られている（非特許文献７）。また、ケモカインや脱リン酸化酵素阻害剤などでマイクロビライが制御されることが知られている（非特許文献６、８）。リンパ節などの血管内皮細胞もCD34を発現していることが知られており、発現している内皮細胞ではマイクロビライ様構造が見られる。この構造がL-セレクチン等を介する白血球との接着に関与していることが考えられ、血管内皮細胞のマイクロビライを制御することで白血球や癌細胞のリンパ節などへの移行を制御できる可能性がある。また、造血細胞は間葉系細胞とインテグリンを介する接触をすることで増殖が制御されていると考えられており、マイクロビライ制御により造血を制御できる可能性が考えられる。癌細胞のうちでも中皮細胞由来の悪性中皮腫細胞の場合は周囲を長いマイクロビライで覆われている細胞であり、マイクロビライ形成が癌細胞の浸潤転移を促進したり免疫細胞と癌細胞の接触を抑制する可能性があるので、マイクロビライを制御することで悪性中皮腫を治療する、あるいは、治療可能にすることができる可能性がある。
【００２２】
すなわち、マイクロビライ形成を抑制する物質をスクリーニングすることで、白血球等の細胞のHoming現象又は血管外遊走現象を抑制する候補物質を得ることができ、さらには、癌細胞の浸潤転移を阻害する物質の候補物質を得ることができる。
本発明のスクリーニング法においては、本来接着性のもともとマイクロビライ形成が全くもしくはほとんど無い細胞に、CD34、CD43又はPSGL-1/CD162遺伝子を発現させ、細胞表面にマイクロビライを形成させることで接着性を減じ浮遊細胞となった細胞を用いる。
当該細胞に対して被検物質を作用させて、当該細胞のマイクロビライの量的変化を観察してもいいが、その接着性変化に基づく形態上の変化を光学顕微鏡などで観察することもできる。つまり、本来付着性細胞が浮遊性細胞になったことは、平べったい細胞が丸い細胞になるという細胞の形状変化として光学顕微鏡などで観察できる。当該細胞に対して被検物質を作用させた場合、その丸い形が平べったい形状に戻るとすれば、マイクロビライ形成を抑制する物質を取得したことに相当する。ここで、被検物質を作用させる、というとき培地中に直接被検物質を添加する場合と共に、被検物質が核酸である場合に、組換えベクターなどにより上記細胞中に導入する場合を含む。
【００２３】
本発明の具体的なスクリーニング法の実施態様としては以下の方法があるが、これに限定されない。
(1)HEK293T細胞にCD34, CD43, PSGL-1, あるいはこれら蛋白質に別のアミノ酸配列を付加した融合蛋白質の発現ベクターを導入して培養し、発現ベクターにコードされている蛋白質を発現させてHEK293Tにマイクロビライを形成させ、細胞の円型化、接着能低下を起こさせる。この系に薬剤を加え、薬剤による細胞の円型化あるいは接着能低下の阻害を検出する。検出方法としては、１細胞当たりの細胞接着面積を測定しても良く、また、細胞を培地等で穏やかに洗って洗浄液に含まれる細胞数ないし接着したままはがれない細胞数を測定しても良い。薬剤によるマイクロビライ形成阻害は、薬剤を加えて培養した細胞のマイクロビライを顕微鏡的に観察することで行う。CD34等とGFPなど蛍光蛋白質の融合蛋白質を発現させると、薬剤のマイクロビライ形成に対する影響をマイクロビライを蛍光顕微鏡を用いて観察することで明らかにできる。もしくは、薬剤添加して培養後に細胞を針つきシリンジに通し、遠心してマイクロビライ画分と細胞体を分離し、マイクロビライ画分に含まれるアクチンなどマイクロビライ構成成分を測定しても良い。
(2)KG-1細胞など元からマイクロビライを有する細胞も、薬剤のマイクロビライに対する影響を見る系として使う事が出来る。この場合には細胞に薬剤を投与し、一定時間後に細胞上のマイクロビライを顕微鏡で観察検討することで薬剤のマイクロビライに与える影響を評価する。また、薬剤添加一定時間後に細胞を針つきシリンジに通し、遠心してマイクロビライ画分と細胞体を分離し、マイクロビライ画分に含まれるアクチンなどマイクロビライ構成成分を測定しても良い。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、各実施例に記載し、図示したのは、ヒトCD34 isoform a, ヒトCD43、ヒトPSGL-1遺伝子を用いた結果であるが、ヒトCD34 isoform b、マウスCD43遺伝子を用いてもそれぞれヒトCD34 isoform aおよびヒトCD43遺伝子を用いた場合と同様の結果が得られている。
【００２５】
＜本発明実施例で用いた細胞＞
KG-1細胞及びCD34+ 臍帯血由来細胞はRIKEN BioResource Center (Tsukuba, Japan) より、HEK293T細胞はATCC (Manassas, VA) 、CD34+骨髄細胞はLonza (Wakersville, MD)から入手した。 HEK293T 細胞と KG-1細胞はそれぞれ10% fetal calf serum を加えたDMEM培地またはRPMI1600培地で培養した。
【００２６】
＜抗体＞
Poly-L-lysin(PLL), Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA), puromycin, paraformaldehyde(PFA), BSA, 及びファロイジンはSigma(St. Louis, MO)から入手した。Mowiol 4-88 ReagentはCALBIOCHEM (Darmstadt, Germany)から入手した。OSGEPはCEDARLANE Laboratories (Burlington, NC)から入手した。モノクローナル抗体： 抗CD34抗体(581), 抗α4 integrin抗体(9F10), 抗β1 integrin 抗体(MAR4), 及び抗Ezrin抗体(18)はBD Biosciences(San Jose, CA)から入手した。 ポリクローナル抗体： 抗リン酸化ERM抗体と抗ERM抗体はCell Signaling Technologies Inc. (Danvers, MA)から入手した。
【００２７】
＜本発明実施例で遺伝子導入に用いた発現ベクター＞
レトロウイルス発現ベクター、pCpuroCMVSはpCLNCMV(Imgenex, San Diego, CA)を用いて作製した。ヒトCD34の全長cDNAとヒトα4インテグリンはRT-PCR法によってクローニングし、pCpuroCMVSにサブクローニングした。GFPのDNA断片とGFPをC末端に融合させたヒトCD34 DNA断片はpCpuroCMVSにサブクローニングした。pGEX-CS1はDr. Kenjiro Kamiguchiから分与していただいた。
発現ベクターはLipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて細胞に導入した。pCpuroCMVS-α4インテグリンをHEK293T cellsに導入し、puromycin 抵抗性の細胞を選択した。
【００２８】
＜本発明で用いた解析方法＞
１．走査型電子顕微鏡法
細胞を1.2% グルタルアルデヒド/0.1M リン酸バッファー (pH 7.2)を用いて一晩固定した。5% ショ糖/0.1M リン酸バッファーで３回洗浄した後poly-L-lysine処理したガラスに貼り付けた。サンプルを1% 四酸化オスミウム / 0.1M リン酸バッファーで室温２０分間固定し、エタノールを用いた脱水処理後、臨界点乾燥を行い金−パラジウムでコーティングして走査電子顕微鏡JSM-5800LV microscope (JEOL、Tokyo, Japan)で観察した。
【００２９】
２．透過型電子顕微鏡法（超薄切片法）
細胞を1.2% グルタルアルデヒド / 0.1Mリン酸バッファー (pH 7.2)で一晩固定した。5% ショ糖 / 0.1Mリン酸バッファーで３回洗浄後、細胞を2% グルタルアルデヒド / 0.1M リン酸バッファー (pH 7.2) で一晩固定した。0.06Mカコジル酸バッファーで洗浄した後、0.5mg / mlルテニウムレッド / 1.2% グルタルアルデヒド / 0.06M カコジル酸バッファーで一晩固定した。0.15M カコジル酸バッファーで洗浄後、0.5mg / ml ルテニウムレッド / 1% ４酸化オスミウム / 0.06M カコジル酸バッファーで３時間固定した。0.15Mカコジル酸バッファー で洗浄後、エタノールの濃縮系列と酸化プロピレンを用いて脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。それぞれのサンプルの超薄切片を作製し、酢酸ウランとクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡 Hitachi H7500 electron microscope (Hitachi High-Technologies Corp, Tokyo, Japan)を用いて観察した。
【００３０】
３．免疫蛍光顕微鏡法
細胞をカバーガラスに貼り付け、4% PFA / PBSを用い、室温で10分間固定し、PBSで３回洗浄した。0.2% Triton X-100 / PBSで室温5分間透過処理を行いPBSで３回洗浄した。サンプルを1% BSA / PBSで室温10分間遮断処理した後、一次抗体溶液中で室温一時間静置した。サンプルをPBSで３回洗浄し、二次抗体溶液中で室温３０分静置した。PBSで３回洗浄した後、サンプルを、Mowiol中に包埋した。蛍光顕微鏡IX71 (OLYMPUS, Tokyo, Japan) またはBZ8000 (KEYENCE, Osaka, Japan)を用いてサンプルを観察し、BZ8000で得られたZ軸方向の重ね合わせ画像、及び断面像の解析にはBZ-Analyzer software (BZ-HIA,Ver. 3.5)を用いた。その他、得られた画像はAdobe Photoshop softwareを用いて解析を行った。
【００３１】
４．細胞接着アッセイ
遺伝子導入HEK293T 細胞を用いた接着アッセイは以下のように行った。
細胞培養プレートのコーティングは10 μg / ml のGST / PBSまたはGST-CS1 / PBS を入れて３時間CO2 incubator内で静置し、PBSで３回洗浄した後、1% BSA / PBSで室温１時間静置して遮蔽処理し、さらに PBSで３回洗浄した。遺伝子導入HEK293T細胞を回収、洗浄し、GSTまたはGST-CS1コーティング済みのプレートに捲いた。CO2 incubator内で30分間静置し、 細胞の状態を光学顕微鏡IX71 (Olympus)を用いて観察、撮影した。その後、プレートをDMEM培地で３回洗い、プレートに付着した細胞を観察、撮影した。
KG-1細胞を用いた接着アッセイは、24 well プレートに12 mm カバーガラス(Fisher) を入れ、10 μg/ml のGST-CS1 / PBSまたはPLLを入れて、CO2 incubator内に３時間静置後、PBSで３回洗浄してコーティングしたものを用いておこなった。KG-1細胞を遠心して集め、1 ng / ml PMA有無の10% FCS を含むRPMI 1640培地で再懸濁し、プレートに播いた。CO2 incubator内で30分間静置し、カバーガラスに接着した細胞を4% PFA/PBSで室温10分固定し、続く実験に用いた。
【００３２】
５．フローサイトメトリー
遺伝子導入HEK293TをRPMI 1640培地で洗浄し、0.5% PFA / PBSで固定した。これらの細胞をフローサイトメーター(FACS Canto II, BD Biosciences)を用いて解析した。
【００３３】
６．イムノブロッティング法
遺伝子導入HEK293T細胞とKG-1細胞はPBSで洗浄し、1% Nonidet-P40 を含む可溶化溶液で可溶化した。細胞可溶化液を超音波破砕処理の後、遠心して上清を回収した。この細胞可溶化液にlameli bufferを加えて煮沸し、SDS-PAGEで分離した後、ニトロセルロース膜(Protoran, S&S)に転写して, 5% BSA / PBSで遮蔽処理を行い抗リン酸化ERM 抗体及び抗ERM抗体を用いてイムノブロッティングを行った。
【００３４】
(実施例１)ＫＧ−１細胞表面の微絨毛確認とＣＤ３４の局在
ＫＧ−１細胞は、ヒト急性骨髄性白血病細胞に由来する典型的な浮遊細胞であり、細胞表面に表面抗原のＣＤ３４を発現している培養細胞（ＣＤ３４＋培養細胞）である。
RIKEN BioResource Center (Tsukuba, Japan)から入手したＫＧ−１細胞を10% fetal calf serum を加えたDMEM培地で培養した後、まず、抗ＣＤ３４抗体（BD Biosciences社製、CA）、抗Ezrin抗体（BD Biosciences社製）あるいは抗β1-インテグリン抗体（BD Biosciences社製）及び重合アクチンを染色するファロイジン（Sigma社製）を用いて二重染色した（図１Ａ）。
次いで、KG-1細胞表面付近の透過型電子顕微鏡像と、その超薄切片像を図１Ｂに示す。
図１Ｂによれば、KG-1細胞は多数の小突起で覆われており、この小突起は平行に走るアクチン繊維を有していることからマイクロビライ（微絨毛）であることがわかる。図１Aの免疫染色でもKG-１細胞はEzrinおよびファロイジンで染色される微絨毛に覆われていることがわかる。そして、ＣＤ３４は、ＫＧ−１細胞表面上のマイクロビライの表面に局在して存在することが明らかとなった。また、β1-インテグリンもマイクロビライ上に局在していた。
従来は、ＫＧ−１細胞表面に表面抗原のＣＤ３４が存在することは知られていたが、その細胞表面にマイクロビライが存在すること、及びその生物学的意義については知られておらず、まして、ＣＤ３４とマイクロビライとの細胞表面上での位置関係が詳細に観察されたことはなかった。本実施例によるＫＧ−１細胞表面の詳細な観察の結果はじめて、ＫＧ−１細胞表面にはマイクロビライが存在し、ＣＤ３４及びβ1-インテグリンは、いずれもそのマイクロビライの表面にそれぞれ局在していることがわかった。
【００３５】
（実施例２）CD34陽性血液細胞の細胞表面構造解析
生体内のCD34陽性細胞としては造血幹細胞／前駆細胞が知られている。このCD34陽性細胞と微絨毛との関係について調べるために、ヒト骨髄や臍帯血由来のCD34陽性造血幹細胞／前駆細胞（理研バイオリソースセンターあるいはLonzaより購入。）を電子顕微鏡および免疫組織化学で解析した。
走査電顕を用いた観察により、ヒト骨髄由来、臍帯血由来CD34陽性細胞の細胞表面に微絨毛が認められた。（図２A）また、抗CD34抗体、phalloidinを用いた免疫染色により重合化アクチンを有する微絨毛が細胞表面に局在しており、その微絨毛の上にCD34が局在していることが明らかになった。（図２B）これらの結果より、造血幹細胞／前駆細胞と考えられるCD34陽性血液細胞表面にも微絨毛があり、その微絨毛の上にCD34があることが明らかになった。
CD34は造血幹細胞／前駆細胞のマーカーであるが、その機能については明らかでなかった。CD34陽性造血幹細胞／前駆細胞の細胞表面に微絨毛があり、CD34分子がその微絨毛上にあったことから、造血幹細胞／前駆細胞においてもKG-1細胞同様にCD34分子が細胞表面微絨毛形成に寄与することで細胞接着を制御している可能性が示唆された。
【００３６】
(実施例３)CD34強制発現によるHEK293T細胞の形態変化
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ヒト胎児腎臓細胞に由来する典型的な付着細胞であり、細胞表面にＣＤ３４は発現していない（ＣＤ３４−培養細胞）。このＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ATCCより入手）に対して、ＣＤ３４遺伝子発現ベクターを導入してＣＤ３４を強制発現させた。発現ベクター（Imgenex社製を改変）を用いて、ＣＤ３４遺伝子cDNA全長をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した後、２日間、３７℃５％ＣＯ２条件下で10% fetal calf serum を加えたDMEM培地で培養し、ＣＤ３４を細胞表面に発現させた。コントロールのため、空ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞も同様に培養した。
ＨＥＫ２９３Ｔ形質転換細胞表面を、以下の方法で観察した。
（１）位相差顕微鏡像による観察。(図３Ａ, a and b)
（２）重合化アクチンを検出する蛍光付きPhalloidinを用いた免疫染色で蛍光顕微鏡による観察。(図３Ｂ, b and c)
（３）蛍光蛋白質であるGFPとCD34の融合蛋白質（CD34-GFP）を発現させ、GFPの蛍光で蛍光顕微鏡による観察。(図３Ｂa)
また、CD34を発現させたHEK293T細胞を、シアロムチン細胞外ドメインを切断するO-siaologlycoprotein endopeptidase (OSGEP, CEDARLANE Laboratories社製)で処理前後に位相差顕微鏡で観察した。(図３Ａ, c and d)
【００３７】
図３Ａｂとａとの比較によりCD34発現によりHEK293T細胞が円形化して底面より浮いていることが明らかになった。また、その現象変化はOSGEP処理により部分的に元に戻ったことが、図３Ａのｄとｃとの比較によりわかった。
図３Ｂaより、CD34-GFPは細胞表面より突出した微絨毛様構造に局在していることがわかった。また、CD34発現細胞では細胞表面に多量の重合化アクチンを微絨毛様の形で検出した(図３Ｂc)のに対して、空ベクター導入細胞（図３Bb）では同様な構造の重合化アクチンははるかに少量であった。このことから、HEK293T細胞表面で発現させたCD34分子は重合化アクチンを含む微絨毛様構造に局在することがわかった。
これらの結果より、CD34を強制発現するとHEK293T細胞表面の微絨毛構造を著しく増加・伸長させ、細胞は円形化して付着底面より遊離すること、発現したCD34は重合アクチンに富む細胞表面微絨毛様構造の上に局在することが明らかになった。
【００３８】
(実施例４)CD34強制発現によるHEK293T細胞の形態変化（その２）
CD34発現によるHEK293T細胞の形態変化をより詳細に観察するために、発現細胞を、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡による電子顕微鏡法および免疫組織化学的な免疫蛍光顕微鏡法で観察した。
電顕観察の結果、図４Ａに示す様にCD34発現細胞は細胞表面より長い突起が多数出ていることが観察された(図４Ａb and d)。さらに、これらの突起内部にはアクチン繊維が平行に走行していることが観察された(図４Ａf、矢印)。一方、空ベクター導入細胞では突起の長さは短く数も少なかった(図４Ａ a and c)が、その突起にもアクチン繊維は認められた。(図４Ａe)
これらの結果から、CD34発現により細胞表面に長い微絨毛（マイクロビライ）が多量に形成されたと考えられる。
また、抗CD34抗体を用いた免疫染色の結果(図４Ｂ)、CD34発現HEK293T細胞上でCD34は細胞表面の微絨毛様構造に重合化アクチンと共局在していた。CD34発現細胞の重合化アクチンは微絨毛に局在するEzrinと共局在していたことから、微絨毛に存在していることがより明らかになった。この結果より、CD34は発現させた細胞で微絨毛上に存在することが明らかになった。
【００３９】
(実施例５)CD43強制発現によるHEK293T細胞の形態変化
KG-1細胞はCD34以外にも細胞表面ムチン型糖蛋白質であるCD43を発現している。また、上記実施例３、４で用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＣＤ43−培養細胞でもある。実施例３と同様の手順で、ＣＤ43遺伝子をHEK293T細胞に導入して強制発現させ、同様に培養し、CD43発現による細胞形態の変化を観察した。
図５ＡよりCD43発現によりHEK293T細胞が円形化して底面より浮いてきていること(図５Abと図５Aaの比較)、その現象変化がOSGEP処理により部分的に回復したこと(図５Adと図５Acの比較)がわかった。
図５Ｂaより、CD43-GFPは細胞表面より突出した微絨毛様構造にあることがわかった。また、CD43発現細胞では細胞表面に多量の重合化アクチンを微絨毛様の形で検出した(図５Ｂc)のに対して、空ベクター導入細胞では同様な構造の重合化アクチンははるかに少量であった。このことから、HEK293T細胞表面で発現させたCD43分子は重合化アクチンを含む微絨毛様構造に局在することがわかった。
【００４０】
(実施例６)CD43強制発現によるHEK293T細胞の形態変化（その２）
実施例５で得たCD43を発現させたHEK293T細胞の形態変化を実施例４と同様の手法で観察した。
電顕観察の結果、図６Aに示す様にCD43発現細胞は細胞表面より長い突起が出ていることが観察された。(図６Abおよび図６Ad)さらに、これらの突起内部にはアクチン繊維が平行に走行していることが観察された。(図６Af、矢印)。一方、空ベクター導入細胞では突起の長さは短く数も少なかった(図６Aa および図６Ac)が、その突起にもアクチン繊維は認められた。(図６Ae)これらの結果から、CD43発現により細胞表面に長い微絨毛（マイクロビライ）が多量に出来たと考えられる。
また、抗CD43抗体を用いた免疫染色の結果、CD43発現HEK293T細胞上でCD43は細胞表面の微絨毛様構造に重合化アクチンと共局在していた。（図６B, a to c）この結果より、CD43は発現させた細胞で微絨毛上に存在することが明らかになった。
これらの結果を総合すると、CD43をHEK293細胞に発現させると微絨毛形成を促進し、CD43分子は微絨毛上に局在する。
【００４１】
（実施例７）CD34発現によるインテグリンを介する細胞接着の阻害
CD34発現によるHEK293T細胞の円形化・接着面からの浮遊の機序を明らかにするために、インテグリンを介する細胞接着の変化を観察した。インテグリンは主要な細胞表面接着リセプターであり、主に細胞外マトリックスをリガンド（特異的結合パートナー）とする。付着細胞は細胞表面インテグリンと細胞外マトリックスとの結合を介して培養用プラスチックシャーレ等に付着している。
HEK293T細胞はαvβ1インテグリンという一般的でないインテグリンを発現していると考えられたので、ヒトα4インテグリンcDNAをRT-PCRを用いてヒトcDNAよりクローニングし、発現ベクターでHEK293T細胞に発現させることでα4β1インテグリンを発現する細胞（α4-HEK293T）を得た。この細胞はα4β1インテグリンの特異的リガンドであるファイブロネクチンCS-1ペプチド（のGST融合蛋白質）をコーティングした培養用プレートに特異的に接着して伸展することが明らかになった。(図７Ａ)この細胞にCD34-GFP発現ベクター、GFP発現ベクターを導入し、それぞれの蛍光蛋白質を発現させた。図７Ｂ図７Ｃでは蛍光蛋白質を発現している細胞のみ視認される。図７Ｂに示す様にGFP発現細胞は接着して伸展するのに対し、CD34-GFPを発現する細胞は伸展せず球状である。また、図７Ｃに示す様に図７Ｂの状態から洗浄すると、GFP発現細胞は接着しているのに対し、CD34-GFPを発現する細胞は洗い流されてしまう。（接着して残っている細胞数を図７Ｃcに記載。）また、接着した細胞（図７Ｃd破線）と接着しておらず洗い流された細胞（実線）の蛍光強度をFACSで比較すると、GFP発現細胞では差がないのに対し、CD34-GFP発現細胞ではCD34融合蛋白の発現量が多いほど接着しない傾向が明らかである。
これらの結果より、CD34を発現したα4インテグリン発現HEK293T細胞ではα4β1インテグリンを介する細胞接着が阻害されていることが明らかであり、細胞表面CD34、あるいは、CD34発現のため増強した微絨毛によって、インテグリンを介する細胞−基質接着が制御できることを発見した。
【００４２】
（実施例８）CD43発現によるインテグリンを介する細胞接着の阻害
CD43発現によるHEK293T細胞の円形化・接着面からの浮遊の機序を明らかにするために、実施例７と同様の手法でインテグリンを介する細胞接着の変化を観察した。
ヒトα4インテグリンcDNA発現ベクターを発現させたHEK293T細胞にCD43-GFP発現ベクター、GFP発現ベクターを導入し、それぞれの蛍光蛋白質を発現させ、α4β1インテグリンのリガンドであるCS-1ペプチドをコーティングしたプレート上で培養後、培地で洗浄し、接着した細胞を蛍光顕微鏡で観察した。図８aでは蛍光蛋白質を発現している細胞のみ視認される。図８(a and b)に示す様にGFP発現細胞に比較してCD43-GFP発現細胞は接着する細胞数が少なく、図８cに示す様にCD43-GFP発現細胞で接着した細胞はしなかった細胞に較べCD43-GFPの発現量が少ないことが明らかになった。CD43-GFP発現細胞をOSGEP処理してCD43の細胞外部分を切断した場合は接着が部分的に改善することから、CD43の細胞外部分が接着制御に重要な役割を果たしていることがわかった。
【００４３】
（実施例９）インテグリンを介する細胞接着部位（面）からのCD34および微絨毛の排除
HEK293T細胞にCD34あるいはCD43を異所性に発現させることによりマイクロビライを細胞表面に作らせると、インテグリンを介する細胞接着を阻害することを実施例７、８で示した。そこで、CD34を内在性に発現している細胞でのインテグリンを介する接着とCD34/ 微絨毛の関連を調べるために、KG-1細胞のGST-CS-1コーティングプレートへの接着を観察した。KG-1細胞は通常培養条件下では浮遊細胞であり、培養用プレートに接着しない。言い換えると、インテグリンを介する細胞接着が阻害されている。しかし、Protein kinase C (PKC)の活性化剤であるPhorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)を培地に加えるとGST-CS-1をコーティングした培養用プレートに接着する。（図９Ａ）
GST-CS-1コーティングプレートに接着した場合には細胞が伸展するのに対し、GSTをコーティングしたプレートにはほとんど接着せず接着した細胞も伸展しないことから、この細胞接着および細胞伸展はα4β1インテグリンを介したものであった（ここでは結果を示していない。）。細胞接着／伸展した細胞を各種抗体やphalloidinで染色し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、CD34および（Ezrinや重合化アクチンで描き出される）微絨毛はこの接着部位・接着面（矢印で示す）には認められなかった。（図９Ｂc and e）
一方、α4β1インテグリンは接着部位にも局在していた（図９Ｂ d and f、矢頭で示す）。
細胞表面の内、接着面以外の部位については微絨毛があり、CD34もα4β1インテグリンも局在していた。
この結果より、インテグリンを介する細胞接着が起こった細胞表面部位ではCD34および微絨毛は排除されており存在しないことが明らかになった。すなわち、インテグリンを介する細胞接着において微絨毛およびCD34分子は接着阻害因子であり、接着が起こる時には接着面より排除される。しかし、その一方で、インテグリンは微絨毛上にも局在することから、微絨毛は単位細胞表面面積当たりのインテグリン量を高く保持することに役立っている可能性が示唆された。
【００４４】
（実施例１０）微絨毛形成とERM蛋白リン酸化の関連
細胞における微絨毛などの重合アクチン関連構造の形成あるいは維持において、細胞質内のERM蛋白質(Ezrin, Radixyn, Moesinの略)の特異的リン酸化が重要な働きをしていると考えられている。そこでHEK293T細胞におけるリン酸化ERM蛋白(p-ERM)の量を抗p-ERM抗体を用いたウエスタンブロッティングで解析するとともに、p-ERMの細胞内局在を免疫組織化学で解析した。また、KG-1細胞にPMAを加えた場合の細胞内p-ERM量の継時変化をウエスタンブロッティングで、PMAを加えてGST-CS-1コーティングガラスに結合させた細胞およびPMAを加えずにpoly-L-lysinコーティングガラスに結合させた細胞を抗p-ERM抗体を用いた免疫染色で解析した。
その結果、HEK293T細胞ではCD34発現により細胞内p-ERMは著しく増大しており（図１０A右）、免疫染色ではp-ERMは微絨毛に局在していた（図１０B下）。KG-1細胞ではPMA処理によりp-ERMは著しく減少しており（図１０A左）、また、KG-1細胞でもp-ERMは微絨毛に局在していた（図１０B上）。
これらの結果より、p-ERMがHEK293TにCD34を発現させて微絨毛を形成させた時に微絨毛の形成に伴って微絨毛に局在して出現することが明らかになった。一方、KG-1細胞では元々微絨毛にp-ERMが局在しており、PMA処理によりp-ERMが減少するのと一致して細胞がインテグリンを介した接着を行える様になり、その接着面にはp-ERMは存在していないことが明らかになった。これらの結果より、p-ERMが微絨毛形成・維持と密接な関係があり、CD34発現によりERM蛋白リン酸化を介して微絨毛が形成される可能性が示唆された。
【００４５】
(実施例１１)CD43,PSGL-1強制発現によるHEK293T細胞の形態変化
HEK293T細胞に発現させると細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こすCD34, CD43はいずれも血球系細胞表面の主要なシアロムチン糖蛋白質である。そこで、本実施例では、血球系細胞に発現している他のシアロムチン型糖蛋白質、Glycophorin-AおよびPSGL-1/CD162、ならびに血球系を含む様々な細胞に発現しておりCD43同様ERM蛋白質との結合ドメインを細胞質に有するCD44についても同様の検討を行った。すなわち、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、CD43,CD44,マウスGlycophorin-A,PSGL-1,およびそれらのキメラ蛋白質を発現させ、細胞形態の変化を観察した。
その結果、GFPとのキメラ蛋白質を発現させた場合、CD43同様PSGL-1はHEK293T細胞を円形化／脱接着させるのに対して、細胞表面ムチン型糖蛋白質であるGlycophorin-Aや、細胞質内ドメインでCD43同様にERM蛋白質に結合するCD44を発現させても細胞の円形化・マイクロビライ形成は起こらなかった（図１１A）。
そこで、次に、CD43分子内のどのドメインが細胞の円形化・マイクロビライ形成に必要か調べるために、CD43とGlycophorin-AあるいはCD44とのキメラ分子をHEK293T細胞に発現させ、細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こすかどうか観察した。。図１１Bにキメラ蛋白の構造と細胞を円形化させたかどうかをプラスマイナスで示した。例えば、CD43の細胞外ドメインとCD44、あるいは、Glycophorin-Aの細胞内ドメインを持つキメラはHEK293T細胞の形態変化を誘導するのに対し、CD44、あるいは、Glycophorin-Aの細胞外ドメインとCD43の細胞内ドメインを持つキメラは誘導しない。この結果より、CD43の細胞外ドメインが形態変化に重要な役割を果たしていることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】CD34はKG-1細胞の微絨毛上に局在する。(A)KG-1細胞におけるCD34の局在。KG-1細胞を抗CD34抗体(a)抗Ezrin抗体(d),または抗b1-インテグリン抗体(g),とファロイジン(b,e and h)で二重染色した。これらの分子は微絨毛様の突起上に共局在した。c, f, and iは重ね合わせた像。Scale bars, 20 μm (a-i).(B)KG-1細胞の電子顕微鏡像。それぞれKG-1細胞の透過型電子顕微鏡像 (a) と超薄切片像 (b)KG-1細胞は多数の微絨毛で覆われている。 矢印は平行に走るアクチン繊維を示す。Scalebars, 2 μm (a) and 500 nm (b).
【図２】ヒトCD34+造血前駆細胞(HPC)における微絨毛。(A)CD34+骨髄細胞の透過型電子顕微鏡像。Scale bars: 2μm.(B)CD34+骨髄細胞の免疫蛍光抗体像。CD34+ 骨髄細胞を抗CD34抗体 (a) とphalloidin (b) で二重染色した。(c)は重ね合わせ。Scale bars:5μm.
【図３】CD34強制発現によるHEK293T細胞の形態変化(A)空ベクターまたはCD34発現ベクターを導入したHEK293T細胞の位相差顕微鏡像CD34-HEK293T細胞は円形化し、基質から脱離した(b)。一方HEK293T 細胞は扁平なままだった(a)。OSGEP処理前(c)と後(d)のCD34-HEK293T細胞。OSGEP処理後、CD34-HEK293T細胞は一部扁平な形に戻る。CD34の細胞外ドメインがOSGEPによって切断されていることはフローサイトメトリー法で確認した。（データ示さず。）Scale bars: 100μm.(B)HEK293T細胞上でのCD34の局在。遺伝子導入した細胞を基質から剥離・懸濁し、PLL処理したカバーガラスに貼付けて免疫蛍光顕微鏡法で検討した。CD34-GFP発現ベクターを導入したHEK293T細胞(CD34GFP-HEK293T細胞)(a)では、CD34-GFPは微絨毛様の突起上に局在していた。HEK293T細胞(b)とCD34-HEK293T細胞(c)をphalloidinで染色した。CD34-HEK293T細胞では長くのびた微絨毛様の突起が観察された。Scale bars: 20μm.
【図４】CD34-HEK293T細胞上でCD34は微絨毛様の突起に局在する。(A)HEK293T細胞とCD34-HEK293T細胞の電子顕微鏡像。HEK293T細胞 (a) とCD34-HEK293T細胞 (b) の走査型電子顕微鏡像。HEK293T細胞 (c) とCD34-HEK293T細胞 (d) の超薄切片透過電顕像。HEK293T細胞 (e) とCD34-HEK293T細胞 (f) との微絨毛様突起の拡大像。矢頭は脂質二重膜、矢印はアクチン繊維を示している。Scale bars, 2 μm (a, b and c), 500 (d and e) and 100 (f and g) nm.(B)CD34-HEK293T細胞上でのCD34の局在。CD34-HEK293T細胞を、抗CD34抗体 (a) または抗Ezrin抗体 (d) 、とファロイジン(bとe) で二重染色した。これらの分子は CD34-HEK293T細胞上で微絨毛様の突起上に共局在した。重ね合わせた像は(c and f).
【図５】(A)CD43発現ベクター導入によるHEK293T細胞の形態変化（左上）コントロールベクターを導入したHEK293T細胞の培養用プラスチックシャーレの上での形態（右上）CD43発現ベクターを導入したHEK293T細胞の培養用プラスチックシャーレの上での形態。細胞が丸くなっており、左の細胞のようにspread（広がった形態）をとっていないことがわかります。（左下）CD43とGFPを結合させた蛋白質を発現ベクターでHEK293T細胞に導入したもの。白く可視化されているのはCD43-GFPの蛍光。（右下）左の細胞をO-Sialoglycoprotein Endopeptidase (OSGEP)で６時間処理したもの。細胞の形態が一部spreadしている。OSGEPは細胞外ドメインを切断する酵素なので、CD43の細胞外ドメインが細胞形態変化に重要であることがわかる。(B)（上）CD43-GFPを発現ベクターで導入したHEK293T細胞。CD43-GFPが細胞表面から外側に伸びている。（左下）コントロールベクターを導入したHEK293T細胞をはがしてpoly-L-lysinをコーティングしたカバーガラスに結合させて固定後、重合アクチンを染色するphalloidinで染色したもの。表面に薄く短い突起状の染色が見られる。（右下）CD43発現ベクターを導入したHEK293T細胞を同様に染色したもの。細胞表面に長い突起が左の図よりはるかに密に見られる。
【図６】(A)CD43発現による細胞表面microvilliの形成（電顕）左側はベクターコントロール、右側はCD43発現ベクターを導入したHEK293T細胞。上２つは走査電顕、下４つは透過電顕像。走査電顕でCD43発現細胞（右上）は細胞表面に長いmicrovilliが認められるのに対し、コントロールベクター導入細胞（左上）では短いmicrovilliしか見えない。中段は透過電顕ですが、基本的に同じ意味合いで、CD43発現細胞（右中）では長いmicrovilliが見られる。下段は透過電顕の強拡で、矢印が示す線はアクチンが重合して繊維状になったもの。(B)CD43発現HEK293T細胞表面におけるCD43と重合アクチンの局在上段はCD43発現細胞のCD43を抗体で（赤）、重合アクチンをphalloidinで（緑）染色したもの。重ね合わせた（merge）図で黄色に見える部分は共局在した部分。下段はCD43-GFPとmCherry（という赤の蛍光蛋白）とERM蛋白質の一つであるmoesinのN末FERMドメインを結合させた蛋白を共に発現させたもの。CD43-GFPとmCherry-FERM domainが共局在していることがわかる。
【図７】CD34の発現によるインテグリンを介した細胞接着の阻害。(A)HEK293T細胞をもちいた伸展と接着アッセイ。HEK293T細胞(a, c, e and g) またはα4インテグリン発現ベクターを導入したHEK293T細胞 (α4-HEK293T細胞) (b, d, f and h) を GST (a, b, e and f) またはGST-CS1 (c, d, g and h) でコーティングしたウェルに播き、３０分間培養して細胞の伸展を観察した。GST-CS1でコーティングしたウェルに播いたα4-HEK293T細胞のみで伸展が見られた。これらのウェルを培地で洗浄したところ、GST-CS1でコーティングしたウェルに播いたα4-HEK293T細胞だけがウェルに残っていた (h)。他のウェルにはほとんど細胞が残っていなかった (e, f and g)。(B)CD34の強制発現がα4-HEK293細胞のインテグリンを介する伸展に与える影響。GFP発現ベクターを導入したα4-HEK293T細胞 (GFP-α4-インテグリンHEK293T細胞) (a) またはCD34-GFP 発現ベクターを導入したα4-HEK293T細胞 (CD34-GFP-α4インテグリンHEK293T細胞) (b) をGST-CS1処理したウェルに播き、これらの細胞の伸展を検討した。GFP-α4-HEK293T細胞はGST-CS1処理したウェル上で伸展した (a)。CD34-GFP-α4インテグリンHEK293T 細胞は丸いままだった (b)。Scale bar: 100μm. (C)CD34の強制発現がインテグリンを介する細胞接着に与える影響。GFP-α4インテグリンHEK293T細胞 (a)またはCD34-GFP-α4インテグリンHEK293T細胞 (b)はGST-CS1でコーティングしたウェルで30分間培養した。培地で３回洗った後、これらの細胞の接着を検討した。GFP-α4-HEK293T細胞に比べ、CD34-GFP-α4-HEK293T細胞はほとんどウェルに接着していなかった。それぞれの柱状図は接着した細胞数を示す (c) GFP-α4インテグリンHEK293T細胞、CD34-GFP-α4インテグリンHEK293T細胞、GSTおよびGST-CS1はそれぞれmock, CD34, GST and CS1で示す。(c) のデータは三回の実験の平均値標準誤差を表した。フローサイトメトリー法を用いて接着、非接着細胞におけるCD34タンパク質量を解析した (D)GST-CS1をコーティングしたウェルに接着しなかったCD34-GFP-α4-HEK293T細胞におけるCD34-GFPタンパク質の発現量は接着した細胞における発現量よりも多かった(d)。
【図８】CD43発現によるHEK293T細胞のインテグリン接着阻害。α4 インテグリンを発現させたHEK293T細胞にGFPあるいはCD43-GFPを発現ベクター導入により発現させ、α4β1 integrinの結合蛋白であるファイブロネクチンのCS-1ペプチドのGST fusion蛋白をコーティングしたプレートとの接着をみたのが(a)。CD43-GFP発現により細胞接着が阻害され、OSGEP処理により一部もどることがわかる。(b)はそれを数値化したもの。(c)はCD43-GFP発現細胞でCS-1プレートに接着したもの(bound)、接着しなかったもの(wash)、用いた細胞(total)、OSGEP処理したもので接着したもの(OSGEP)におけるGFPの発現量をFACSで調べたもの。接着しなかった細胞はCD43-GFPの発現量が高く、接着した細胞は低い。OSGEP処理した場合はGFPの発現量がやや高くなっているが、これはCD43の細胞外部分が切断されれば膜貫通部分・細胞質内部分が存在しても細胞接着を阻害しないことを示している。
【図９】細胞−基質間接着部位からのCD34排除(A)GST-CS1でコーティングしたプレート上へのKG-1細胞の伸展におけるPMAの効果。PMA処理をしたKG-1細胞 (b) は GST-CS1でコーティングしたプレート上に伸展した。一方非処理のKG-1細胞は伸展しなかった(a)。(B)インテグリンを介した接着面での微絨毛上のCD34の局在。GST-CS1でコーティングしたカバーガラスに貼付けたPMA処理KG-1細胞を抗CD34抗体 (a, c, e)または抗β1 インテグリン抗体 (b, d, f) を用いて染色した。それぞれdome-shaped cells (c and d) とspreading cells (e and f) の垂直方向の断面像を示す。GST-CS1をコーティングしたカバーガラスに貼付けたPMA処理KG-1細胞では CD34を伴った微絨毛は接着面から排除されていた (c and e)。一方、β1 インテグリンは接着面に残っていた (d and f) 。矢頭は接着面を指し示している。矢印は細胞−基質間接着面のβ1 インテグリン分子を示す。(C)PLLを介した接着面でのCD34の局在。PLL処理をしたカバーグラスに貼付けたKG-1細胞を抗CD34抗体(a)またはβ1インテグリン抗体(b)を用いて染色した。PLL処理したカバーガラスに貼付けたKG-1細胞では微絨毛上のCD34とβ1 インテグリンは接着面に残っていた (垂直方向の断面図参照)。すなわち、インテグリンを介さない物理化学的接着では、微絨毛およびCD34分子の接着面からの排除は起こらない。
【図１０】微絨毛形成とERM蛋白質リン酸化の関連(A)KG-1およびHEK293T細胞におけるERM蛋白質リン酸化の解析KG-1細胞にPMAを作用させた場合、あるいは、CD34を発現させたHEK293T細胞を細胞溶解液で溶解し、溶解液をSDS-PAGEで展開後ニトロセルロースメンブランに転写し、抗リン酸化ERM抗体および抗ERM抗体（セルシグナリング社）を用いたイムノブロッティングで解析した。その結果、KG-1細胞では元々ERM蛋白はリン酸化されているが、PMA添加により著しく減少すること、HEK293T細胞では元々ほとんどリン酸化されていないが、CD34発現により著しく増加することがわかった。(B)KG-1およびHEK293T細胞におけるリン酸化ERM蛋白質の局在リン酸化ERM蛋白質の細胞内局在について抗リン酸化ERM抗体を用いて解析した。その結果、KG-1細胞でもCD34を発現させたHEK293T細胞でもリン酸化ERMは微絨毛に局在していた。CS-1ペプチドをコートしたガラスプレート上でPMA処理したKG-1細胞が伸長した場合、微絨毛の減少に伴って抗リン酸化ERM抗体による染色は減少している。また、CD34を発現させないHEK293T細胞ではリン酸化ERMは細胞周囲のフィロポディアないしマイクロビライにわずかに認められるのに対し、細胞にCD34を発現させると細胞表面全体を覆う微絨毛上に増強して局在していた。
【図１１】(A)種々の細胞表面糖蛋白質を発現させたときのHEK293T細胞形態変化。CD34,CD43はいずれも血球系細胞表面の主要なシアロムチン糖蛋白質である。この２つの糖蛋白質はいずれもHEK293T細胞に発現させると細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こした。そこで、血球系細胞に発現している他のシアロムチン型糖蛋白質、Glycophorin-AおよびPSGL-1/CD162、ならびに血球系を含む様々な細胞に発現しておりCD43同様ERM蛋白質との結合ドメインを細胞質に有するCD44についても同様の検討を行った。GFPタグのCD43, CD44, マウスglycophorin-A, PSGL-1をHEK293Tに発現ベクターで発現させた細胞の位相差顕微鏡像とGFPを検出した蛍光顕微鏡像。CD43あるいはPSGL-1発現細胞では細胞が丸くなっているが、CD44あるいはGlycophorin発現細胞ではspreadしたままである。(B)CD43とCD44,あるいは、Glycophorin-Aとの間のキメラを用いた解析。CD43はHEK293T細胞に発現させると細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こす。一方、細胞表面ムチン型糖蛋白質であるGlycophorin-Aや、細胞質内ドメインでCD43同様にERM蛋白質に結合するCD44を発現させても細胞の円形化・マイクロビライ形成は起こらなかった。CD43分子内のどのドメインが細胞の円形化・マイクロビライ形成に必要か調べるために、CD43とGlycophorin-AあるいはCD44とのキメラ分子をHEK293T細胞に発現させ、細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こすかどうか観察した。（＋）（−）は左側に示す蛋白を発現させた時にHEK293T細胞が形態変化を起こすかどうか示している。例えば、一番上の分子だと、細胞外ドメインおよび細胞膜通過ドメインがCD43、細胞内ドメインがCD44のキメラ分子を発現させるとHEK293T細胞の形が丸く変形する。この解析の結果、CD43の細胞外ドメインと他の細胞表面蛋白質の細胞内ドメインのキメラ蛋白質はHEK293T細胞に発現させると細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こすのに対し、CD43の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインとCD44ないしGlycophorinの細胞外ドメインのキメラ蛋白質では細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こさなかった。従って、CD43の細胞外ドメインが細胞の形態変化に必要であることがわかる。
【技術分野】
【０００１】
細胞表面へのマイクロビライ形成促進方法、細胞のインテグリンを介した接着性の制御方法、細胞表面のインテグリンのリガンド結合に基づく作用を制御する方法、及び制御物質のスクリーニング方法。
【背景技術】
【０００２】
一般に、動物細胞は、リンパ系細胞など培養器表面にはほとんど接着しないで増殖する浮遊性細胞もあるが、ほとんどの動物細胞は培養器表面に接着して増殖する接着性細胞である。例えば、上皮性細胞、線維芽細胞などが典型的な接着性細胞であり、遺伝子導入に用いる形質転換用細胞、又は癌細胞なども通常は接着性細胞である。
接着性の動物細胞では血清中の成長因子と共に、接着した細胞外基質からのシグナルにより細胞死をまぬがれていると考えられるため、これらの細胞接着現象及びシグナルの受け渡しにはインテグリンが重要な役割を果たしている可能性があるが、その役割は十分に解明されてはおらず、インテグリンが関与する接着現象を確実に制御するには至っていない。
接着性細胞を効率的かつ安定的に浮遊化するためには、細胞表面のインテグリンを制御する必要があると考えられるが、どのように細胞表面のインテグリンを制御すれば、接着性細胞の他の性質を変化させることなく接着性を減じて浮遊化させることができるのかが不明であった。
【０００３】
一方、浮遊性細胞の代表的な白血球の形態学的な特徴の１つとして細胞表面にマイクロビライ（微絨毛）が存在していることがある。「マイクロビライ（microvilli、微絨毛）」は、「アクチンタンパク質繊維数十本が束になって芯を作っている細胞膜表面に存在する短い指状の突起」と定義でき（非特許文献１）、浮遊性の白血球のみならず、種々の細胞膜表面に存在しており、突起の長さは約1μm、太さは0.1〜0.5μm程度の大きさである。
これら白血球細胞表面のマイクロビライの働きは、よく解明されておらず、浮遊細胞である白血球同士の接着や、白血球が血管壁、各種組織を形成する細胞などと接着するのを阻害する作用がある可能性もあるが、同じ浮遊細胞で血液細胞の赤血球にはマイクロビライがないことから、少なくとも単純な接着阻害作用の役割というわけではない。リンパ球等血球系の細胞表面のマイクロビライが細胞表面タンパク質の足場となり細胞機能を調節する（非特許文献２）との報告もあり、白血球が血管壁を通って移動する際には、むしろ血管壁を形成する血管上皮細胞との相互作用に関与し、かつ細胞の隙間を通り抜ける際に重要な役割をしている可能性がある。このようにマイクロビライは細胞間のインターラクション（interaction）、メカニカルセンサーとしての役割を果たしていることが考えられる。実際に、マイクロビライは、腸粘膜や腎の近位尿細管のような吸収上皮細胞では、細胞の頂部（消化管等の管腔側）に存在して表面積を増大させて、物質や水の吸収を促進する機能を有している。また、精巣上体では溶液の吸収の為の表面積を増やす作用があり、内耳の有毛細胞では、平行、聴覚機能の感覚受容体として作用する等様々な機能を担っているとされる。
このように、各種細胞にとってマイクロビライが重要な機能を担っている点が注目され、その役割や形成のメカニズムの研究が活発化している。
【０００４】
マイクロビライ形成の促進に関しては、最近、細胞表面分子であるムチン型糖蛋白質のpodocalyxin, MCAM/CD146/Muc18/Gicerinを細胞表面に発現させるとマイクロビライの形成が促されることが報告された（非特許文献３〜５）。しかしながら、podocalyxinも、MCAM/CD146/Muc18/Gicerinも、細胞表面分子としては典型的な物質ではないことから、一般的なマイクロビライ形成に関わる主要遺伝子の特定には至っていない。また、マイクロビライに対してケモカイン処理、アクチン重合阻害剤処理、あるいはPMA処理を施すことによりマイクロビライが壊れること、及び脱リン酸化阻害剤によりマイクロビライが安定化できることの報告はなされている（非特許文献６〜８）が、マイクロビライ形成を確実に制御するにはほど遠い状況であり、マイクロビライ形成のメカニズムの解明には至っておらず、マイクロビライの細胞・生体における機能についても依然として不明なままであった。
そして、マイクロビライとインテグリンの関係についての報告はなく、マイクロビライ形成と細胞の接着現象との関連性に着目した報告もなされていなかった。
【０００５】
【非特許文献１】Bruce Alberts et al. Garland Science，4th ed.“molecular biology of the cell”（ISBN 0-8153-3218-1）
【非特許文献２】Chhabra E.S. and Higgs H.N.,Nat. Cell Biol., 2007 ; Vol. 9, 1110-1121 (PMID 17909522)
【非特許文献３】Nielsen J.S. et al., PLoS ONE. 2007; Vol.2, e237 (PMID 17311105)
【非特許文献４】Okumura S. et al., Exp. Cell Res., 2001; Vol.271, p269-276 (PMID 11716539)
【非特許文献５】Guezguez B., et al., J. Immunol., 2007; Vol. 179, p6673-85 (PMID 17982057)
【非特許文献６】Brown M.J., et al., Blood, 2003; Vol. 102, p3890-9 (PMID 12907449)
【非特許文献７】Fors B.P., et al., J. Immunol., 2001; Vol. 167, p3642-51 (PMID 11564777)
【非特許文献８】Majstoravich S. et al., Blood, 2004; Vol. 104, p1396-1403 (PMID 15130947)
【非特許文献９】Immunobiology, Janeway C. A. et al., Garland publications,（2007,7th edition）
【非特許文献１０】Arroyo A.G. et al., Cell, 1996, Vol.85, p997-1008
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、細胞表面にマイクロビライを有する各種細胞で多量に発現している典型的な細胞表面分子をコードする遺伝子の中から、マイクロビライの形成促進に関与する主要な遺伝子を特定し、当該遺伝子を用いて各種細胞表面におけるマイクロビライ形成を促進する方法を提供することであり、接着性の細胞にマイクロビライを形成して浮遊化培養可能にすることである。またマイクロビライとインテグリンとの関連性を明らかにし、細胞表面のインテグリンとリガンドとの結合に基づく作用を制御する方法を提供することを目的とするものである。また、インテグリンとリガンドとの結合に基づく作用を制御する物質のスクリーニング方法も提供しようとするものでもある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明者等は、マイクロビライ中に局在している蛋白質をコードする遺伝子に着目し、それら遺伝子のうちで、ＣＤ３４遺伝子、ＣＤ４３遺伝子及びＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２遺伝子がマイクロビライ形成促進活性を発揮する遺伝子であることと共に、これら遺伝子のうちの細胞外ドメインをコードするフラグメントがマイクロビライ形成に関わっていることを見出した。すなわち、これら遺伝子を接着性細胞に導入することで、マイクロビライを形成させることができ、その結果、接着性細胞の基盤表面からの接着性を減じ浮遊培養可能にした。さらに、この接着制御機構として、細胞表面のインテグリンを介する細胞接着が阻害されていることを明らかにした。また、インテグリンは、これらマイクロビライ形成促進活性を発揮する遺伝子を導入することで作製されたマイクロビライ上、あるいは、白血球等、元々マイクロビライを有する細胞のマイクロビライ上に局在することを確認した。また、白血球等元々マイクロビライを有する細胞でインテグリンを介した細胞接着を起こさせると接着部位からマイクロビライは排除されることを発見した。このことから、白血球等マイクロビライを有する浮遊細胞においても、マイクロビライによりインテグリンを介した接着が制御されていると推察される。以上のような知見を得たことで、細胞表面のマイクロビライの形成促進及びマイクロビライに基づく細胞の特性改善に関する本発明を完成させた。
そして、本来接着性の細胞表面にマイクロビライを形成させることで接着性を減じ浮遊細胞となった細胞を用い、被検物質が、マイクロビライ形成を促進又は阻害するか否かを観察することで、インテグリンとそのリガンドとの結合作用を増大又は減少させる物質のスクリーニング方法についての本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕 細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、細胞表面におけるマイクロビライ形成を促進させる方法；
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
〔２〕 前記細胞表面上のマイクロビライが、インテグリン分子を集約させたマイクロビライであることを特徴とする、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕 前記細胞が、本来接着性の細胞であり、細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、細胞表面のインテグリンのリガンド結合に基づく作用を制御する方法；
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
〔５〕 前記インテグリンのリガンド結合に基づく作用が、インテグリンを介した細胞接着作用である前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕 前記細胞が、血球系細胞であり、前記インテグリンのリガンド結合に基づく作用が血管内皮細胞表面への接着現象であることを特徴とする、前記〔４〕又は〔５〕に記載の方法。
〔７〕 前記細胞が、本来接着性の細胞であり、細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞である、前記〔４〕又は〔５〕に記載の方法。
〔８〕 本来接着性の細胞であって、かつ細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞に対して、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、接着性細胞を浮遊性細胞に変換する方法；
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
〔９〕 細胞表面のインテグリンのリガンド結合に基づく作用を制御する物質のスクリーニング方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法;
（ａ）本来接着性の細胞であり、細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることにより、接着性細胞を浮遊性細胞に変換する工程、
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（ｂ）（ａ）の細胞を培養し、細胞表面のマイクロビライ形成が促進された細胞を取得する工程、
（ｃ）（ｂ）の細胞に対して、被検物質を作用させ、細胞表面のマイクロビライ形成を促進するか又は抑制する効果が存在することを確認する工程。
〔１０〕 前記工程（ｂ）及び／又は（ｃ）において、細胞表面のマイクロビライ形成の促進又は抑制を、細胞の接着性の増減を観察することにより確認することを特徴とする、前記〔９〕に記載のスクリーニング方法。
〔１１〕 前記被検物質が、あるタンパク質をコードするＤＮＡであり、前記被検物質を作用させる方法が被検物質を組換えＤＮＡとして前記細胞内に導入することである、前記〔９〕又は〔１０〕に記載のスクリーニング方法。
〔１２〕 前記スクリーニング方法が、白血球由来細胞のHoming現象又は血管外遊走現象を促進又は阻害する物質の候補を選択するための方法である、前記〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔１３〕 前記スクリーニング方法が、癌細胞の浸潤転移性を阻害する物質の候補を選択するための方法である、前記〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明における、マイクロビライ形成促進活性を発揮する遺伝子を細胞内に導入することにより、細胞表面のマイクロビライ形成が促進される。その結果、細胞表面のインテグリンを介した接着性を制御することで、従来浮遊培養が困難であった接着性細胞の接着性が減じて容易に浮遊培養可能となる。また、元々マイクロビライを細胞表面に有する細胞に対して導入してマイクロビライ形成を促進した場合には、マイクロビライに基づく各種細胞特性も高められる。本来接着性の細胞表面にマイクロビライを形成させて浮遊細胞となった細胞に対して被検物質を作用させることで、光学顕微鏡などで細胞の接着性の増減を観察するだけで、インテグリンとそのリガンドとの結合作用を制御する物質のスクリーニングが可能となった。しかも、得られた阻害物質は、白血球由来細胞のHoming現象又は血管外遊走現象を促進又は阻害する物質、さらには癌細胞の浸潤転移性の阻害物質の候補ともなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明におけるマイクロビライ形成促進活性を発揮する遺伝子は、CD34遺伝子、CD43遺伝子及びPSGL-1/CD162遺伝子であるが、これらの遺伝子がコードするタンパク質は、いずれも細胞表面に存在する、シアロムチンファミリーに属するI型膜貫通糖蛋白質であって、その細胞外ドメインは多数のＯ型糖鎖を有している点で共通している。「CD34」は、造血幹細胞／前駆細胞のマーカーであって、血管内皮細胞にも発現が見られる糖タンパク質であり、「CD43」及び「PSGL-1/CD162」は、造血系細胞の多くに発現する膜抗原であって、「CD43」はWiskott-Aldrich症候群のリンパ球で発現異常が報告され、「PSGL-1/CD162」の糖鎖はセレクチン/CD62のリガンドであることが知られている。従来、マイクロビライ形成促進活性が確認されたpodocalyxin及びMCAM/CD146/Muc18/Gicerinもムチン型糖蛋白質に属する細胞表面分子ではあったが、マイクロビライを有する典型的な細胞の表面では存在が確認された例がほとんど無いマイナーな細胞表面分子である。一方、本発明において、マイクロビライ形成促進活性があることを確定できたCD34遺伝子、CD43遺伝子及びPSGL-1/CD162遺伝子は、いずれも典型的なマイクロビライを有する細胞である造血系細胞の表面で大量に発現している蛋白質をコードする遺伝子であるので、これら遺伝子がマイクロビライ形成に関わる主要遺伝子である可能性が高い。したがって、本発明ではこれら遺伝子を導入した各種細胞を用いることで、マイクロビライの本質的な形成メカニズムの解明が、はじめて可能となった。
これら各遺伝子は、哺乳動物細胞間での遺伝子配列の保存性は高く、互換性があるので、いずれの生物種由来の遺伝子でもよいが、導入する細胞の由来生物種と同一もしくは近縁の種であることが好ましい。また、本発明において、マイクロビライ形成促進のためには、これら遺伝子のうち、Ｏ型糖鎖を多数有する細胞外ドメインをコードする領域が重要であることが確認されている。すなわち、本発明におけるCD34遺伝子、CD43遺伝子及びPSGL-1/CD162遺伝子については、細胞外ドメインをコードする領域を含むフラグメントを用いることが好ましく、同一の機能を有する限り、さらに短いそのフラグメントであってもよい。
【００１１】
CD43, CD34, PSGL-1/CD162のうち、最も典型的なヒトのアミノ酸配列及び塩基配列は、以下のアクセッション番号で示される。
Homo sapiens CD34 isoform a (NP_001020280) = CD34 variant 1 (NM_001025109)
Homo sapiens CD34 isoform b (NP_001764) = CD34 variant 2 (NM_001773)
ヒトCD34遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１及び２で示す。
Homo sapiens CD43 (NP-001025459) = CD43 (NM_001030288)
Mus musculus CD43 (NP_001032899) = CD43 (NM_001037810)
ヒトCD43遺伝子及びマウスCD43遺伝子がコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４で示す。なお、ヒトCD43の細胞外ドメインは配列番号３のアミノ酸１〜２５３に相当する。
Homo sapiens CD162/PSGL-1 (NP_002997) = CD162 (NM_003006)
ヒトCD162/PSGL-1がコードするアミノ酸配列を配列番号５で示す。
本発明の実施例では、これらの遺伝子は特異的プライマーを用いてRT-PCRにより増幅・単離したものをDNAシークエンシングにて塩基配列を確認した上で使用した。
【００１２】
本発明において、例えば「ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質」というとき、「その細胞外ドメインを含む融合蛋白質」とは、少なくともＣＤ４３の細胞外ドメインを含むＣＤ４３蛋白質と、他の蛋白質との融合蛋白質を指し、通常はＣＤ４３蛋白質のＣ末端側に結合させる。ここで、「他の蛋白質」とは、ＧＦＰなどのレポーター蛋白質も含みどのような蛋白質であってもよいが、ＣＤ４３由来の蛋白質が「細胞外ドメイン」のみで構成されている場合は、当該「ＣＤ４３細胞外ドメイン」を細胞膜表面に固定するための、少なくとも「細胞膜貫通領域」を提供可能な細胞膜表面の蛋白質である。例えば、ＣＤ４４やGlycophorin-Ａ由来の「細胞膜貫通領域」、又はさらにその「細胞内ドメイン」までを含む蛋白質が好ましく用いられる。
【００１３】
本発明の各遺伝子導入に際しては、哺乳動物細胞用の各種ベクター又は他の周知の遺伝子導入方法が適用できる。典型的にはリポフェクションやリン酸カルシウム共沈法、レトロウイルスベクターなどの各種ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法が好ましく用いられる。
【００１４】
本発明の方法に用いる対象細胞としては、もともと細胞表面にマイクロビライを有していてもいなくても、また浮遊細胞であっても付着細胞であってもいずれでもよいが、マイクロビライ形成促進作用を確認し、マイクロビライ特有の機能を付与又は増強するために用いる細胞としては、マイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞である方が好ましい。本発明においてマイクロビライ形成促進活性を発揮する遺伝子であることが見出された「CD34遺伝子、CD43遺伝子及びPSGL-1/CD162遺伝子」の発現もマイクロビライ形成もほとんど無いHEK293T細胞である。マイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞は、典型的には接着性の強い付着性細胞であり、上皮性細胞、線維芽細胞、内皮細胞、及びこれら細胞に由来する各種癌細胞などの場合は典型的な付着性細胞に相当する。本発明の実施例でこれら細胞の典型例として用いたHEK293T細胞は、上皮細胞由来培養細胞である。また、ほとんどの上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞は限定的なマイクロビライしか持たず、マイクロビライ形成促進活性を発揮する遺伝子を導入することで、マイクロビライを細胞表面に形成することができ、特に付着性細胞の場合は接着性を減ずることができる。
これらの細胞を培養する場合、接着性が減じて浮遊細胞となっても用いる培地は特に変化させる必要はない。例えばDMEM培地、RPMI1640培地などの通常の培地を用いることができる。他の血球系細胞など本来浮遊性の細胞の場合も同様である。
【００１５】
反対に、もともとマイクロビライを表面に有している細胞は、マイクロビライ特有の特性を有しているが、その特性はマイクロビライ上のインテグリンのリガンド結合に基づく作用である可能性が大きいので、インテグリンのリガンド結合に基づく作用を観察し、その作用を制御するために好ましく用いられる。
そのような細胞として典型的な細胞は、白血球又は白血球由来などの血球系の浮遊細胞である。本発明の実施例では、最も典型的な白血球由来培養細胞株であるヒト急性骨髄性白血病細胞由来KG-1細胞を用いて、マイクロビライがインテグリンを介した接着に関与することを解明した。このタイプの細胞には、造血幹細胞／前駆細胞、及びほとんどの白血球が包含される。これらの白血球系細胞は血管を通過する場合、まず、セレクチンとPSGL-1上の糖鎖の間の結合でrollingをし、その後、ケモカイン等の刺激により白血球上のインテグリンと血管内皮細胞間の結合が起こると言われている。PSGL-1をはじめ、CD34, CD43はそのＯ型糖鎖の上にセレクチンリガンドを有することが知られているが、本発明において、これらの分子はマイクロビライ上に存在し、インテグリンもマイクロビライ上に局在することが解明されたことからみて、CD34、CD43及びPSGL-1/CD162遺伝子の働きは、マイクロビライを形成し、そのマイクロビライを介して血管内皮との結合、血管外への遊走を制御していると考えられる。
したがって、本発明において、マイクロビライの全くない、もしくは少ない血球系細胞、あるいは、一般的な付着細胞に対しては、CD34、CD43及びPSGL-1/CD162遺伝子を導入することでマイクロビライを形成させることができるのだから、その結果、これらの細胞を血管内皮に結合させたり、血管外に遊走させたりすることができる可能性が高い。
【００１６】
本発明は、細胞表面におけるインテグリンのリガンド結合に基づく作用を制御する方法にも関するが、ここで、「インテグリン(integrin))とは、細胞表面タンパク質の１種で、主に細胞外マトリックスへの細胞接着、細胞外マトリックスからの情報伝達に関与する細胞接着分子であり、歴史的には、細胞外マトリックス中の接着分子ファイブロネクチンのレセプターとして最初に同定された。細胞外マトリックス中のファイブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなどと結合して細胞とマトリックス(細胞基質）との間の接着を制御するが、一部細胞表面分子（ＶＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−１，ＭａｄＣＡＭなど）などと結合し、細胞と細胞との間の接着を制御するインテグリンも存在する。
インテグリンは、α鎖とβ鎖とで構成されるヘテロ二量体糖タンパク質であって、異なるα鎖とβ鎖が存在し多種類の組み合わせ方で分類され、インテグリンファミリーとも呼ばれる。最も一般的に知られたインテグリンの一つが「インテグリンα４β１」であり、インテグリンα４鎖(CD49d)とβ1鎖(CD29)とから構成され、別名very late antigen-4 (VLA-4)とも呼ばれる。主要な細胞表面接着分子の一つであり、VCAM-1およびファイブロネクチンCS-1ペプチドをリガンドとする。白血球や造血幹細胞／前駆細胞の接着及びHoming現象に関与することが知られている(非特許文献９)。特にリンパ球での役割は非常に重要であり、α4インテグリン遺伝子をノックアウトしたマウスでは成体のリンパ球発育が見られないことが知られている(非特許文献１０)。
【００１７】
したがって、本発明で「インテグリンのリガンド結合に基づく作用」というとき、「インテグリンを介した細胞の接着作用」以外にも、白血球細胞などに見られるインテグリンを介した「Homing作用」や「血管外遊走作用」が典型的なものとしてあげられ、他にも細胞の増殖作用、細胞のアポトーシス抑制作用又は幹細胞の分化制御作用などが含まれる。
本発明の実施態様では、「インテグリンのリガンド結合に基づく作用」として最も典型的な「インテグリンを介した細胞接着作用」を取り上げ、マイクロビライ形成が「インテグリンを介した細胞接着現象」に関与していることを確認した。
【００１８】
本発明の実施例では、インテグリンのリガンド結合に基づく作用の制御を観察するために、本来マイクロビライを形成しておらず「CD34遺伝子、CD43遺伝子及びPSGL-1/CD162遺伝子」のいずれも発現していない接着性の細胞であるHEK293T細胞を用いた。HEK293T細胞もインテグリン分子を有してはいるが、一般的なタイプではない「インテグリンαvβ１」であったため、「インテグリンα４」遺伝子を導入し、上記一般的な「インテグリンα４β１」を発現させそのリガンドであるCS-１ペプチドとの結合状態を観察した。なお、白血球細胞由来のKG-1細胞は、もともと細胞表面にマイクロビライを有し「CD34遺伝子およびCD43遺伝子」のコードする蛋白質いずれもが当該マイクロビライ表面で発現している細胞であり、血管壁でHoming現象を起こすとき以外は、通常は浮遊性の細胞であるが、このKG-1細胞中には一般的な「インテグリンα４β１」が発現している。白血球系細胞など一般的なインテグリン分子を元々発現している細胞の場合は、あえてインテグリン遺伝子を導入する必要はない。
【００１９】
インテグリンとリガンドの結合状態を観察する際、細胞が本来発現しているインテグリンであっても、またどのようなインテグリンα鎖とβ鎖の組み合わせの遺伝子であっても用いることができる。その際、インテグリンが異なれば、インテグリンと結合するリガンドも異なる。典型的な組み合わせとしては、α４β１インテグリンの場合の特異的リガンドは、ファイブロネクチンCS-1ペプチドおよびVCAM-1であるが、α3β１インテグリンの場合はコラーゲン、α5β１インテグリンの場合はファイブロネクチン、α6β１インテグリンの場合はラミニンであるなど特定のインテグリンに対し特定のリガンドがあることがわかっている。
CS-1ペプチドをリガンドとする「インテグリンα４β１」との作用を観察する場合、必要に応じて「インテグリンα４」遺伝子を導入して、細胞表面に「インテグリンα４β１」を発現させ、α４β１インテグリン特異的リガンドであるファイブロネクチンCS-1ペプチドをコーティングした基盤を用いて、インテグリンを介した結合状態を観察する。
典型的なヒトα４インテグリンのアミノ酸配列及び塩基配列は、以下のアクセッション番号で示される。
Homo sapiens a4 integrin (ITGA4) (NP_000876) = (NM_000885)
ヒトα４インテグリンをコードするアミノ酸配列を配列番号６として示す。
本発明の実施例では、当該遺伝子を特異的プライマーを用いてRT-PCRにより増幅・単離したものをDNAシークエンシングにて塩基配列を確認した上で使用した。
【００２０】
本発明において、インテグリンを発現している細胞というときは、本来インテグリンを発現している細胞であっても、インテグリンα鎖遺伝子及び／又はβ鎖遺伝子を導入し強制的に発現させた細胞であってもよい。その際に、CD34遺伝子、CD43遺伝子及び／又はPSGL-1/CD162遺伝子を同時に導入してもよい。
本来浮遊性の細胞にインテグリン遺伝子を導入するか又は導入せずに、細胞が発現しているインテグリンと相互作用をするリガンド物質（例えば、α４β１インテグリンの特異的リガンドであるファイブロネクチンCS-1ペプチド）を基盤表面に塗布して培養することで、本来浮遊性の細胞であっても基盤表面に接着させることができる。
本発明においては、KG-1 細胞に「インテグリンα４」遺伝子を導入してインテグリンα４β１を発現させたため、基盤表面にはファイブロネクチンCS-1ペプチドを塗布して用いた。
【００２１】
本発明において、マイクロビライはインテグリンとリガンドの結合を制御するが単に阻害する訳ではないことが解明されたことから、逆に、セレクチンリガンドをその上に有しマイクロビライ形成促進作用のあるこれらの遺伝子（CD34、CD43又はPSGL-1/CD162遺伝子）を発現させない試薬（具体的には、siRNA, antisenseなど）または、CD34、CD43又はPSGL-1/CD162タンパク質阻害剤（具体的には、O-sialo endglycopeptidase, 特異抗体）等により、これらの蛋白質の作用を抑制することで、マイクロビライを発現している白血球等の細胞の血管外遊走を抑制することが出来ると考えられる。
本発明では、そのうちの典型的なCD34遺伝子のsiRNAを用いてKG-1細胞中のCD34の発現を抑制したところ、マイクロビライ形成が部分的に抑制された（実施例添付せず）。
また、これらの蛋白質の量を増減させなくとも、マイクロビライを崩壊させる試薬を用いることでも白血球等の細胞の血管外遊走を抑制することができる可能性がある。本発明では、KG-1細胞をPMA処理する事でインテグリンを介する接着を誘導しているが、PMAはマイクロビライの数・長さを減弱させることが知られている（非特許文献７）。また、ケモカインや脱リン酸化酵素阻害剤などでマイクロビライが制御されることが知られている（非特許文献６、８）。リンパ節などの血管内皮細胞もCD34を発現していることが知られており、発現している内皮細胞ではマイクロビライ様構造が見られる。この構造がL-セレクチン等を介する白血球との接着に関与していることが考えられ、血管内皮細胞のマイクロビライを制御することで白血球や癌細胞のリンパ節などへの移行を制御できる可能性がある。また、造血細胞は間葉系細胞とインテグリンを介する接触をすることで増殖が制御されていると考えられており、マイクロビライ制御により造血を制御できる可能性が考えられる。癌細胞のうちでも中皮細胞由来の悪性中皮腫細胞の場合は周囲を長いマイクロビライで覆われている細胞であり、マイクロビライ形成が癌細胞の浸潤転移を促進したり免疫細胞と癌細胞の接触を抑制する可能性があるので、マイクロビライを制御することで悪性中皮腫を治療する、あるいは、治療可能にすることができる可能性がある。
【００２２】
すなわち、マイクロビライ形成を抑制する物質をスクリーニングすることで、白血球等の細胞のHoming現象又は血管外遊走現象を抑制する候補物質を得ることができ、さらには、癌細胞の浸潤転移を阻害する物質の候補物質を得ることができる。
本発明のスクリーニング法においては、本来接着性のもともとマイクロビライ形成が全くもしくはほとんど無い細胞に、CD34、CD43又はPSGL-1/CD162遺伝子を発現させ、細胞表面にマイクロビライを形成させることで接着性を減じ浮遊細胞となった細胞を用いる。
当該細胞に対して被検物質を作用させて、当該細胞のマイクロビライの量的変化を観察してもいいが、その接着性変化に基づく形態上の変化を光学顕微鏡などで観察することもできる。つまり、本来付着性細胞が浮遊性細胞になったことは、平べったい細胞が丸い細胞になるという細胞の形状変化として光学顕微鏡などで観察できる。当該細胞に対して被検物質を作用させた場合、その丸い形が平べったい形状に戻るとすれば、マイクロビライ形成を抑制する物質を取得したことに相当する。ここで、被検物質を作用させる、というとき培地中に直接被検物質を添加する場合と共に、被検物質が核酸である場合に、組換えベクターなどにより上記細胞中に導入する場合を含む。
【００２３】
本発明の具体的なスクリーニング法の実施態様としては以下の方法があるが、これに限定されない。
(1)HEK293T細胞にCD34, CD43, PSGL-1, あるいはこれら蛋白質に別のアミノ酸配列を付加した融合蛋白質の発現ベクターを導入して培養し、発現ベクターにコードされている蛋白質を発現させてHEK293Tにマイクロビライを形成させ、細胞の円型化、接着能低下を起こさせる。この系に薬剤を加え、薬剤による細胞の円型化あるいは接着能低下の阻害を検出する。検出方法としては、１細胞当たりの細胞接着面積を測定しても良く、また、細胞を培地等で穏やかに洗って洗浄液に含まれる細胞数ないし接着したままはがれない細胞数を測定しても良い。薬剤によるマイクロビライ形成阻害は、薬剤を加えて培養した細胞のマイクロビライを顕微鏡的に観察することで行う。CD34等とGFPなど蛍光蛋白質の融合蛋白質を発現させると、薬剤のマイクロビライ形成に対する影響をマイクロビライを蛍光顕微鏡を用いて観察することで明らかにできる。もしくは、薬剤添加して培養後に細胞を針つきシリンジに通し、遠心してマイクロビライ画分と細胞体を分離し、マイクロビライ画分に含まれるアクチンなどマイクロビライ構成成分を測定しても良い。
(2)KG-1細胞など元からマイクロビライを有する細胞も、薬剤のマイクロビライに対する影響を見る系として使う事が出来る。この場合には細胞に薬剤を投与し、一定時間後に細胞上のマイクロビライを顕微鏡で観察検討することで薬剤のマイクロビライに与える影響を評価する。また、薬剤添加一定時間後に細胞を針つきシリンジに通し、遠心してマイクロビライ画分と細胞体を分離し、マイクロビライ画分に含まれるアクチンなどマイクロビライ構成成分を測定しても良い。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、各実施例に記載し、図示したのは、ヒトCD34 isoform a, ヒトCD43、ヒトPSGL-1遺伝子を用いた結果であるが、ヒトCD34 isoform b、マウスCD43遺伝子を用いてもそれぞれヒトCD34 isoform aおよびヒトCD43遺伝子を用いた場合と同様の結果が得られている。
【００２５】
＜本発明実施例で用いた細胞＞
KG-1細胞及びCD34+ 臍帯血由来細胞はRIKEN BioResource Center (Tsukuba, Japan) より、HEK293T細胞はATCC (Manassas, VA) 、CD34+骨髄細胞はLonza (Wakersville, MD)から入手した。 HEK293T 細胞と KG-1細胞はそれぞれ10% fetal calf serum を加えたDMEM培地またはRPMI1600培地で培養した。
【００２６】
＜抗体＞
Poly-L-lysin(PLL), Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA), puromycin, paraformaldehyde(PFA), BSA, 及びファロイジンはSigma(St. Louis, MO)から入手した。Mowiol 4-88 ReagentはCALBIOCHEM (Darmstadt, Germany)から入手した。OSGEPはCEDARLANE Laboratories (Burlington, NC)から入手した。モノクローナル抗体： 抗CD34抗体(581), 抗α4 integrin抗体(9F10), 抗β1 integrin 抗体(MAR4), 及び抗Ezrin抗体(18)はBD Biosciences(San Jose, CA)から入手した。 ポリクローナル抗体： 抗リン酸化ERM抗体と抗ERM抗体はCell Signaling Technologies Inc. (Danvers, MA)から入手した。
【００２７】
＜本発明実施例で遺伝子導入に用いた発現ベクター＞
レトロウイルス発現ベクター、pCpuroCMVSはpCLNCMV(Imgenex, San Diego, CA)を用いて作製した。ヒトCD34の全長cDNAとヒトα4インテグリンはRT-PCR法によってクローニングし、pCpuroCMVSにサブクローニングした。GFPのDNA断片とGFPをC末端に融合させたヒトCD34 DNA断片はpCpuroCMVSにサブクローニングした。pGEX-CS1はDr. Kenjiro Kamiguchiから分与していただいた。
発現ベクターはLipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて細胞に導入した。pCpuroCMVS-α4インテグリンをHEK293T cellsに導入し、puromycin 抵抗性の細胞を選択した。
【００２８】
＜本発明で用いた解析方法＞
１．走査型電子顕微鏡法
細胞を1.2% グルタルアルデヒド/0.1M リン酸バッファー (pH 7.2)を用いて一晩固定した。5% ショ糖/0.1M リン酸バッファーで３回洗浄した後poly-L-lysine処理したガラスに貼り付けた。サンプルを1% 四酸化オスミウム / 0.1M リン酸バッファーで室温２０分間固定し、エタノールを用いた脱水処理後、臨界点乾燥を行い金−パラジウムでコーティングして走査電子顕微鏡JSM-5800LV microscope (JEOL、Tokyo, Japan)で観察した。
【００２９】
２．透過型電子顕微鏡法（超薄切片法）
細胞を1.2% グルタルアルデヒド / 0.1Mリン酸バッファー (pH 7.2)で一晩固定した。5% ショ糖 / 0.1Mリン酸バッファーで３回洗浄後、細胞を2% グルタルアルデヒド / 0.1M リン酸バッファー (pH 7.2) で一晩固定した。0.06Mカコジル酸バッファーで洗浄した後、0.5mg / mlルテニウムレッド / 1.2% グルタルアルデヒド / 0.06M カコジル酸バッファーで一晩固定した。0.15M カコジル酸バッファーで洗浄後、0.5mg / ml ルテニウムレッド / 1% ４酸化オスミウム / 0.06M カコジル酸バッファーで３時間固定した。0.15Mカコジル酸バッファー で洗浄後、エタノールの濃縮系列と酸化プロピレンを用いて脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。それぞれのサンプルの超薄切片を作製し、酢酸ウランとクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡 Hitachi H7500 electron microscope (Hitachi High-Technologies Corp, Tokyo, Japan)を用いて観察した。
【００３０】
３．免疫蛍光顕微鏡法
細胞をカバーガラスに貼り付け、4% PFA / PBSを用い、室温で10分間固定し、PBSで３回洗浄した。0.2% Triton X-100 / PBSで室温5分間透過処理を行いPBSで３回洗浄した。サンプルを1% BSA / PBSで室温10分間遮断処理した後、一次抗体溶液中で室温一時間静置した。サンプルをPBSで３回洗浄し、二次抗体溶液中で室温３０分静置した。PBSで３回洗浄した後、サンプルを、Mowiol中に包埋した。蛍光顕微鏡IX71 (OLYMPUS, Tokyo, Japan) またはBZ8000 (KEYENCE, Osaka, Japan)を用いてサンプルを観察し、BZ8000で得られたZ軸方向の重ね合わせ画像、及び断面像の解析にはBZ-Analyzer software (BZ-HIA,Ver. 3.5)を用いた。その他、得られた画像はAdobe Photoshop softwareを用いて解析を行った。
【００３１】
４．細胞接着アッセイ
遺伝子導入HEK293T 細胞を用いた接着アッセイは以下のように行った。
細胞培養プレートのコーティングは10 μg / ml のGST / PBSまたはGST-CS1 / PBS を入れて３時間CO2 incubator内で静置し、PBSで３回洗浄した後、1% BSA / PBSで室温１時間静置して遮蔽処理し、さらに PBSで３回洗浄した。遺伝子導入HEK293T細胞を回収、洗浄し、GSTまたはGST-CS1コーティング済みのプレートに捲いた。CO2 incubator内で30分間静置し、 細胞の状態を光学顕微鏡IX71 (Olympus)を用いて観察、撮影した。その後、プレートをDMEM培地で３回洗い、プレートに付着した細胞を観察、撮影した。
KG-1細胞を用いた接着アッセイは、24 well プレートに12 mm カバーガラス(Fisher) を入れ、10 μg/ml のGST-CS1 / PBSまたはPLLを入れて、CO2 incubator内に３時間静置後、PBSで３回洗浄してコーティングしたものを用いておこなった。KG-1細胞を遠心して集め、1 ng / ml PMA有無の10% FCS を含むRPMI 1640培地で再懸濁し、プレートに播いた。CO2 incubator内で30分間静置し、カバーガラスに接着した細胞を4% PFA/PBSで室温10分固定し、続く実験に用いた。
【００３２】
５．フローサイトメトリー
遺伝子導入HEK293TをRPMI 1640培地で洗浄し、0.5% PFA / PBSで固定した。これらの細胞をフローサイトメーター(FACS Canto II, BD Biosciences)を用いて解析した。
【００３３】
６．イムノブロッティング法
遺伝子導入HEK293T細胞とKG-1細胞はPBSで洗浄し、1% Nonidet-P40 を含む可溶化溶液で可溶化した。細胞可溶化液を超音波破砕処理の後、遠心して上清を回収した。この細胞可溶化液にlameli bufferを加えて煮沸し、SDS-PAGEで分離した後、ニトロセルロース膜(Protoran, S&S)に転写して, 5% BSA / PBSで遮蔽処理を行い抗リン酸化ERM 抗体及び抗ERM抗体を用いてイムノブロッティングを行った。
【００３４】
(実施例１)ＫＧ−１細胞表面の微絨毛確認とＣＤ３４の局在
ＫＧ−１細胞は、ヒト急性骨髄性白血病細胞に由来する典型的な浮遊細胞であり、細胞表面に表面抗原のＣＤ３４を発現している培養細胞（ＣＤ３４＋培養細胞）である。
RIKEN BioResource Center (Tsukuba, Japan)から入手したＫＧ−１細胞を10% fetal calf serum を加えたDMEM培地で培養した後、まず、抗ＣＤ３４抗体（BD Biosciences社製、CA）、抗Ezrin抗体（BD Biosciences社製）あるいは抗β1-インテグリン抗体（BD Biosciences社製）及び重合アクチンを染色するファロイジン（Sigma社製）を用いて二重染色した（図１Ａ）。
次いで、KG-1細胞表面付近の透過型電子顕微鏡像と、その超薄切片像を図１Ｂに示す。
図１Ｂによれば、KG-1細胞は多数の小突起で覆われており、この小突起は平行に走るアクチン繊維を有していることからマイクロビライ（微絨毛）であることがわかる。図１Aの免疫染色でもKG-１細胞はEzrinおよびファロイジンで染色される微絨毛に覆われていることがわかる。そして、ＣＤ３４は、ＫＧ−１細胞表面上のマイクロビライの表面に局在して存在することが明らかとなった。また、β1-インテグリンもマイクロビライ上に局在していた。
従来は、ＫＧ−１細胞表面に表面抗原のＣＤ３４が存在することは知られていたが、その細胞表面にマイクロビライが存在すること、及びその生物学的意義については知られておらず、まして、ＣＤ３４とマイクロビライとの細胞表面上での位置関係が詳細に観察されたことはなかった。本実施例によるＫＧ−１細胞表面の詳細な観察の結果はじめて、ＫＧ−１細胞表面にはマイクロビライが存在し、ＣＤ３４及びβ1-インテグリンは、いずれもそのマイクロビライの表面にそれぞれ局在していることがわかった。
【００３５】
（実施例２）CD34陽性血液細胞の細胞表面構造解析
生体内のCD34陽性細胞としては造血幹細胞／前駆細胞が知られている。このCD34陽性細胞と微絨毛との関係について調べるために、ヒト骨髄や臍帯血由来のCD34陽性造血幹細胞／前駆細胞（理研バイオリソースセンターあるいはLonzaより購入。）を電子顕微鏡および免疫組織化学で解析した。
走査電顕を用いた観察により、ヒト骨髄由来、臍帯血由来CD34陽性細胞の細胞表面に微絨毛が認められた。（図２A）また、抗CD34抗体、phalloidinを用いた免疫染色により重合化アクチンを有する微絨毛が細胞表面に局在しており、その微絨毛の上にCD34が局在していることが明らかになった。（図２B）これらの結果より、造血幹細胞／前駆細胞と考えられるCD34陽性血液細胞表面にも微絨毛があり、その微絨毛の上にCD34があることが明らかになった。
CD34は造血幹細胞／前駆細胞のマーカーであるが、その機能については明らかでなかった。CD34陽性造血幹細胞／前駆細胞の細胞表面に微絨毛があり、CD34分子がその微絨毛上にあったことから、造血幹細胞／前駆細胞においてもKG-1細胞同様にCD34分子が細胞表面微絨毛形成に寄与することで細胞接着を制御している可能性が示唆された。
【００３６】
(実施例３)CD34強制発現によるHEK293T細胞の形態変化
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ヒト胎児腎臓細胞に由来する典型的な付着細胞であり、細胞表面にＣＤ３４は発現していない（ＣＤ３４−培養細胞）。このＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ATCCより入手）に対して、ＣＤ３４遺伝子発現ベクターを導入してＣＤ３４を強制発現させた。発現ベクター（Imgenex社製を改変）を用いて、ＣＤ３４遺伝子cDNA全長をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した後、２日間、３７℃５％ＣＯ２条件下で10% fetal calf serum を加えたDMEM培地で培養し、ＣＤ３４を細胞表面に発現させた。コントロールのため、空ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞も同様に培養した。
ＨＥＫ２９３Ｔ形質転換細胞表面を、以下の方法で観察した。
（１）位相差顕微鏡像による観察。(図３Ａ, a and b)
（２）重合化アクチンを検出する蛍光付きPhalloidinを用いた免疫染色で蛍光顕微鏡による観察。(図３Ｂ, b and c)
（３）蛍光蛋白質であるGFPとCD34の融合蛋白質（CD34-GFP）を発現させ、GFPの蛍光で蛍光顕微鏡による観察。(図３Ｂa)
また、CD34を発現させたHEK293T細胞を、シアロムチン細胞外ドメインを切断するO-siaologlycoprotein endopeptidase (OSGEP, CEDARLANE Laboratories社製)で処理前後に位相差顕微鏡で観察した。(図３Ａ, c and d)
【００３７】
図３Ａｂとａとの比較によりCD34発現によりHEK293T細胞が円形化して底面より浮いていることが明らかになった。また、その現象変化はOSGEP処理により部分的に元に戻ったことが、図３Ａのｄとｃとの比較によりわかった。
図３Ｂaより、CD34-GFPは細胞表面より突出した微絨毛様構造に局在していることがわかった。また、CD34発現細胞では細胞表面に多量の重合化アクチンを微絨毛様の形で検出した(図３Ｂc)のに対して、空ベクター導入細胞（図３Bb）では同様な構造の重合化アクチンははるかに少量であった。このことから、HEK293T細胞表面で発現させたCD34分子は重合化アクチンを含む微絨毛様構造に局在することがわかった。
これらの結果より、CD34を強制発現するとHEK293T細胞表面の微絨毛構造を著しく増加・伸長させ、細胞は円形化して付着底面より遊離すること、発現したCD34は重合アクチンに富む細胞表面微絨毛様構造の上に局在することが明らかになった。
【００３８】
(実施例４)CD34強制発現によるHEK293T細胞の形態変化（その２）
CD34発現によるHEK293T細胞の形態変化をより詳細に観察するために、発現細胞を、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡による電子顕微鏡法および免疫組織化学的な免疫蛍光顕微鏡法で観察した。
電顕観察の結果、図４Ａに示す様にCD34発現細胞は細胞表面より長い突起が多数出ていることが観察された(図４Ａb and d)。さらに、これらの突起内部にはアクチン繊維が平行に走行していることが観察された(図４Ａf、矢印)。一方、空ベクター導入細胞では突起の長さは短く数も少なかった(図４Ａ a and c)が、その突起にもアクチン繊維は認められた。(図４Ａe)
これらの結果から、CD34発現により細胞表面に長い微絨毛（マイクロビライ）が多量に形成されたと考えられる。
また、抗CD34抗体を用いた免疫染色の結果(図４Ｂ)、CD34発現HEK293T細胞上でCD34は細胞表面の微絨毛様構造に重合化アクチンと共局在していた。CD34発現細胞の重合化アクチンは微絨毛に局在するEzrinと共局在していたことから、微絨毛に存在していることがより明らかになった。この結果より、CD34は発現させた細胞で微絨毛上に存在することが明らかになった。
【００３９】
(実施例５)CD43強制発現によるHEK293T細胞の形態変化
KG-1細胞はCD34以外にも細胞表面ムチン型糖蛋白質であるCD43を発現している。また、上記実施例３、４で用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＣＤ43−培養細胞でもある。実施例３と同様の手順で、ＣＤ43遺伝子をHEK293T細胞に導入して強制発現させ、同様に培養し、CD43発現による細胞形態の変化を観察した。
図５ＡよりCD43発現によりHEK293T細胞が円形化して底面より浮いてきていること(図５Abと図５Aaの比較)、その現象変化がOSGEP処理により部分的に回復したこと(図５Adと図５Acの比較)がわかった。
図５Ｂaより、CD43-GFPは細胞表面より突出した微絨毛様構造にあることがわかった。また、CD43発現細胞では細胞表面に多量の重合化アクチンを微絨毛様の形で検出した(図５Ｂc)のに対して、空ベクター導入細胞では同様な構造の重合化アクチンははるかに少量であった。このことから、HEK293T細胞表面で発現させたCD43分子は重合化アクチンを含む微絨毛様構造に局在することがわかった。
【００４０】
(実施例６)CD43強制発現によるHEK293T細胞の形態変化（その２）
実施例５で得たCD43を発現させたHEK293T細胞の形態変化を実施例４と同様の手法で観察した。
電顕観察の結果、図６Aに示す様にCD43発現細胞は細胞表面より長い突起が出ていることが観察された。(図６Abおよび図６Ad)さらに、これらの突起内部にはアクチン繊維が平行に走行していることが観察された。(図６Af、矢印)。一方、空ベクター導入細胞では突起の長さは短く数も少なかった(図６Aa および図６Ac)が、その突起にもアクチン繊維は認められた。(図６Ae)これらの結果から、CD43発現により細胞表面に長い微絨毛（マイクロビライ）が多量に出来たと考えられる。
また、抗CD43抗体を用いた免疫染色の結果、CD43発現HEK293T細胞上でCD43は細胞表面の微絨毛様構造に重合化アクチンと共局在していた。（図６B, a to c）この結果より、CD43は発現させた細胞で微絨毛上に存在することが明らかになった。
これらの結果を総合すると、CD43をHEK293細胞に発現させると微絨毛形成を促進し、CD43分子は微絨毛上に局在する。
【００４１】
（実施例７）CD34発現によるインテグリンを介する細胞接着の阻害
CD34発現によるHEK293T細胞の円形化・接着面からの浮遊の機序を明らかにするために、インテグリンを介する細胞接着の変化を観察した。インテグリンは主要な細胞表面接着リセプターであり、主に細胞外マトリックスをリガンド（特異的結合パートナー）とする。付着細胞は細胞表面インテグリンと細胞外マトリックスとの結合を介して培養用プラスチックシャーレ等に付着している。
HEK293T細胞はαvβ1インテグリンという一般的でないインテグリンを発現していると考えられたので、ヒトα4インテグリンcDNAをRT-PCRを用いてヒトcDNAよりクローニングし、発現ベクターでHEK293T細胞に発現させることでα4β1インテグリンを発現する細胞（α4-HEK293T）を得た。この細胞はα4β1インテグリンの特異的リガンドであるファイブロネクチンCS-1ペプチド（のGST融合蛋白質）をコーティングした培養用プレートに特異的に接着して伸展することが明らかになった。(図７Ａ)この細胞にCD34-GFP発現ベクター、GFP発現ベクターを導入し、それぞれの蛍光蛋白質を発現させた。図７Ｂ図７Ｃでは蛍光蛋白質を発現している細胞のみ視認される。図７Ｂに示す様にGFP発現細胞は接着して伸展するのに対し、CD34-GFPを発現する細胞は伸展せず球状である。また、図７Ｃに示す様に図７Ｂの状態から洗浄すると、GFP発現細胞は接着しているのに対し、CD34-GFPを発現する細胞は洗い流されてしまう。（接着して残っている細胞数を図７Ｃcに記載。）また、接着した細胞（図７Ｃd破線）と接着しておらず洗い流された細胞（実線）の蛍光強度をFACSで比較すると、GFP発現細胞では差がないのに対し、CD34-GFP発現細胞ではCD34融合蛋白の発現量が多いほど接着しない傾向が明らかである。
これらの結果より、CD34を発現したα4インテグリン発現HEK293T細胞ではα4β1インテグリンを介する細胞接着が阻害されていることが明らかであり、細胞表面CD34、あるいは、CD34発現のため増強した微絨毛によって、インテグリンを介する細胞−基質接着が制御できることを発見した。
【００４２】
（実施例８）CD43発現によるインテグリンを介する細胞接着の阻害
CD43発現によるHEK293T細胞の円形化・接着面からの浮遊の機序を明らかにするために、実施例７と同様の手法でインテグリンを介する細胞接着の変化を観察した。
ヒトα4インテグリンcDNA発現ベクターを発現させたHEK293T細胞にCD43-GFP発現ベクター、GFP発現ベクターを導入し、それぞれの蛍光蛋白質を発現させ、α4β1インテグリンのリガンドであるCS-1ペプチドをコーティングしたプレート上で培養後、培地で洗浄し、接着した細胞を蛍光顕微鏡で観察した。図８aでは蛍光蛋白質を発現している細胞のみ視認される。図８(a and b)に示す様にGFP発現細胞に比較してCD43-GFP発現細胞は接着する細胞数が少なく、図８cに示す様にCD43-GFP発現細胞で接着した細胞はしなかった細胞に較べCD43-GFPの発現量が少ないことが明らかになった。CD43-GFP発現細胞をOSGEP処理してCD43の細胞外部分を切断した場合は接着が部分的に改善することから、CD43の細胞外部分が接着制御に重要な役割を果たしていることがわかった。
【００４３】
（実施例９）インテグリンを介する細胞接着部位（面）からのCD34および微絨毛の排除
HEK293T細胞にCD34あるいはCD43を異所性に発現させることによりマイクロビライを細胞表面に作らせると、インテグリンを介する細胞接着を阻害することを実施例７、８で示した。そこで、CD34を内在性に発現している細胞でのインテグリンを介する接着とCD34/ 微絨毛の関連を調べるために、KG-1細胞のGST-CS-1コーティングプレートへの接着を観察した。KG-1細胞は通常培養条件下では浮遊細胞であり、培養用プレートに接着しない。言い換えると、インテグリンを介する細胞接着が阻害されている。しかし、Protein kinase C (PKC)の活性化剤であるPhorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)を培地に加えるとGST-CS-1をコーティングした培養用プレートに接着する。（図９Ａ）
GST-CS-1コーティングプレートに接着した場合には細胞が伸展するのに対し、GSTをコーティングしたプレートにはほとんど接着せず接着した細胞も伸展しないことから、この細胞接着および細胞伸展はα4β1インテグリンを介したものであった（ここでは結果を示していない。）。細胞接着／伸展した細胞を各種抗体やphalloidinで染色し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、CD34および（Ezrinや重合化アクチンで描き出される）微絨毛はこの接着部位・接着面（矢印で示す）には認められなかった。（図９Ｂc and e）
一方、α4β1インテグリンは接着部位にも局在していた（図９Ｂ d and f、矢頭で示す）。
細胞表面の内、接着面以外の部位については微絨毛があり、CD34もα4β1インテグリンも局在していた。
この結果より、インテグリンを介する細胞接着が起こった細胞表面部位ではCD34および微絨毛は排除されており存在しないことが明らかになった。すなわち、インテグリンを介する細胞接着において微絨毛およびCD34分子は接着阻害因子であり、接着が起こる時には接着面より排除される。しかし、その一方で、インテグリンは微絨毛上にも局在することから、微絨毛は単位細胞表面面積当たりのインテグリン量を高く保持することに役立っている可能性が示唆された。
【００４４】
（実施例１０）微絨毛形成とERM蛋白リン酸化の関連
細胞における微絨毛などの重合アクチン関連構造の形成あるいは維持において、細胞質内のERM蛋白質(Ezrin, Radixyn, Moesinの略)の特異的リン酸化が重要な働きをしていると考えられている。そこでHEK293T細胞におけるリン酸化ERM蛋白(p-ERM)の量を抗p-ERM抗体を用いたウエスタンブロッティングで解析するとともに、p-ERMの細胞内局在を免疫組織化学で解析した。また、KG-1細胞にPMAを加えた場合の細胞内p-ERM量の継時変化をウエスタンブロッティングで、PMAを加えてGST-CS-1コーティングガラスに結合させた細胞およびPMAを加えずにpoly-L-lysinコーティングガラスに結合させた細胞を抗p-ERM抗体を用いた免疫染色で解析した。
その結果、HEK293T細胞ではCD34発現により細胞内p-ERMは著しく増大しており（図１０A右）、免疫染色ではp-ERMは微絨毛に局在していた（図１０B下）。KG-1細胞ではPMA処理によりp-ERMは著しく減少しており（図１０A左）、また、KG-1細胞でもp-ERMは微絨毛に局在していた（図１０B上）。
これらの結果より、p-ERMがHEK293TにCD34を発現させて微絨毛を形成させた時に微絨毛の形成に伴って微絨毛に局在して出現することが明らかになった。一方、KG-1細胞では元々微絨毛にp-ERMが局在しており、PMA処理によりp-ERMが減少するのと一致して細胞がインテグリンを介した接着を行える様になり、その接着面にはp-ERMは存在していないことが明らかになった。これらの結果より、p-ERMが微絨毛形成・維持と密接な関係があり、CD34発現によりERM蛋白リン酸化を介して微絨毛が形成される可能性が示唆された。
【００４５】
(実施例１１)CD43,PSGL-1強制発現によるHEK293T細胞の形態変化
HEK293T細胞に発現させると細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こすCD34, CD43はいずれも血球系細胞表面の主要なシアロムチン糖蛋白質である。そこで、本実施例では、血球系細胞に発現している他のシアロムチン型糖蛋白質、Glycophorin-AおよびPSGL-1/CD162、ならびに血球系を含む様々な細胞に発現しておりCD43同様ERM蛋白質との結合ドメインを細胞質に有するCD44についても同様の検討を行った。すなわち、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、CD43,CD44,マウスGlycophorin-A,PSGL-1,およびそれらのキメラ蛋白質を発現させ、細胞形態の変化を観察した。
その結果、GFPとのキメラ蛋白質を発現させた場合、CD43同様PSGL-1はHEK293T細胞を円形化／脱接着させるのに対して、細胞表面ムチン型糖蛋白質であるGlycophorin-Aや、細胞質内ドメインでCD43同様にERM蛋白質に結合するCD44を発現させても細胞の円形化・マイクロビライ形成は起こらなかった（図１１A）。
そこで、次に、CD43分子内のどのドメインが細胞の円形化・マイクロビライ形成に必要か調べるために、CD43とGlycophorin-AあるいはCD44とのキメラ分子をHEK293T細胞に発現させ、細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こすかどうか観察した。。図１１Bにキメラ蛋白の構造と細胞を円形化させたかどうかをプラスマイナスで示した。例えば、CD43の細胞外ドメインとCD44、あるいは、Glycophorin-Aの細胞内ドメインを持つキメラはHEK293T細胞の形態変化を誘導するのに対し、CD44、あるいは、Glycophorin-Aの細胞外ドメインとCD43の細胞内ドメインを持つキメラは誘導しない。この結果より、CD43の細胞外ドメインが形態変化に重要な役割を果たしていることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】CD34はKG-1細胞の微絨毛上に局在する。(A)KG-1細胞におけるCD34の局在。KG-1細胞を抗CD34抗体(a)抗Ezrin抗体(d),または抗b1-インテグリン抗体(g),とファロイジン(b,e and h)で二重染色した。これらの分子は微絨毛様の突起上に共局在した。c, f, and iは重ね合わせた像。Scale bars, 20 μm (a-i).(B)KG-1細胞の電子顕微鏡像。それぞれKG-1細胞の透過型電子顕微鏡像 (a) と超薄切片像 (b)KG-1細胞は多数の微絨毛で覆われている。 矢印は平行に走るアクチン繊維を示す。Scalebars, 2 μm (a) and 500 nm (b).
【図２】ヒトCD34+造血前駆細胞(HPC)における微絨毛。(A)CD34+骨髄細胞の透過型電子顕微鏡像。Scale bars: 2μm.(B)CD34+骨髄細胞の免疫蛍光抗体像。CD34+ 骨髄細胞を抗CD34抗体 (a) とphalloidin (b) で二重染色した。(c)は重ね合わせ。Scale bars:5μm.
【図３】CD34強制発現によるHEK293T細胞の形態変化(A)空ベクターまたはCD34発現ベクターを導入したHEK293T細胞の位相差顕微鏡像CD34-HEK293T細胞は円形化し、基質から脱離した(b)。一方HEK293T 細胞は扁平なままだった(a)。OSGEP処理前(c)と後(d)のCD34-HEK293T細胞。OSGEP処理後、CD34-HEK293T細胞は一部扁平な形に戻る。CD34の細胞外ドメインがOSGEPによって切断されていることはフローサイトメトリー法で確認した。（データ示さず。）Scale bars: 100μm.(B)HEK293T細胞上でのCD34の局在。遺伝子導入した細胞を基質から剥離・懸濁し、PLL処理したカバーガラスに貼付けて免疫蛍光顕微鏡法で検討した。CD34-GFP発現ベクターを導入したHEK293T細胞(CD34GFP-HEK293T細胞)(a)では、CD34-GFPは微絨毛様の突起上に局在していた。HEK293T細胞(b)とCD34-HEK293T細胞(c)をphalloidinで染色した。CD34-HEK293T細胞では長くのびた微絨毛様の突起が観察された。Scale bars: 20μm.
【図４】CD34-HEK293T細胞上でCD34は微絨毛様の突起に局在する。(A)HEK293T細胞とCD34-HEK293T細胞の電子顕微鏡像。HEK293T細胞 (a) とCD34-HEK293T細胞 (b) の走査型電子顕微鏡像。HEK293T細胞 (c) とCD34-HEK293T細胞 (d) の超薄切片透過電顕像。HEK293T細胞 (e) とCD34-HEK293T細胞 (f) との微絨毛様突起の拡大像。矢頭は脂質二重膜、矢印はアクチン繊維を示している。Scale bars, 2 μm (a, b and c), 500 (d and e) and 100 (f and g) nm.(B)CD34-HEK293T細胞上でのCD34の局在。CD34-HEK293T細胞を、抗CD34抗体 (a) または抗Ezrin抗体 (d) 、とファロイジン(bとe) で二重染色した。これらの分子は CD34-HEK293T細胞上で微絨毛様の突起上に共局在した。重ね合わせた像は(c and f).
【図５】(A)CD43発現ベクター導入によるHEK293T細胞の形態変化（左上）コントロールベクターを導入したHEK293T細胞の培養用プラスチックシャーレの上での形態（右上）CD43発現ベクターを導入したHEK293T細胞の培養用プラスチックシャーレの上での形態。細胞が丸くなっており、左の細胞のようにspread（広がった形態）をとっていないことがわかります。（左下）CD43とGFPを結合させた蛋白質を発現ベクターでHEK293T細胞に導入したもの。白く可視化されているのはCD43-GFPの蛍光。（右下）左の細胞をO-Sialoglycoprotein Endopeptidase (OSGEP)で６時間処理したもの。細胞の形態が一部spreadしている。OSGEPは細胞外ドメインを切断する酵素なので、CD43の細胞外ドメインが細胞形態変化に重要であることがわかる。(B)（上）CD43-GFPを発現ベクターで導入したHEK293T細胞。CD43-GFPが細胞表面から外側に伸びている。（左下）コントロールベクターを導入したHEK293T細胞をはがしてpoly-L-lysinをコーティングしたカバーガラスに結合させて固定後、重合アクチンを染色するphalloidinで染色したもの。表面に薄く短い突起状の染色が見られる。（右下）CD43発現ベクターを導入したHEK293T細胞を同様に染色したもの。細胞表面に長い突起が左の図よりはるかに密に見られる。
【図６】(A)CD43発現による細胞表面microvilliの形成（電顕）左側はベクターコントロール、右側はCD43発現ベクターを導入したHEK293T細胞。上２つは走査電顕、下４つは透過電顕像。走査電顕でCD43発現細胞（右上）は細胞表面に長いmicrovilliが認められるのに対し、コントロールベクター導入細胞（左上）では短いmicrovilliしか見えない。中段は透過電顕ですが、基本的に同じ意味合いで、CD43発現細胞（右中）では長いmicrovilliが見られる。下段は透過電顕の強拡で、矢印が示す線はアクチンが重合して繊維状になったもの。(B)CD43発現HEK293T細胞表面におけるCD43と重合アクチンの局在上段はCD43発現細胞のCD43を抗体で（赤）、重合アクチンをphalloidinで（緑）染色したもの。重ね合わせた（merge）図で黄色に見える部分は共局在した部分。下段はCD43-GFPとmCherry（という赤の蛍光蛋白）とERM蛋白質の一つであるmoesinのN末FERMドメインを結合させた蛋白を共に発現させたもの。CD43-GFPとmCherry-FERM domainが共局在していることがわかる。
【図７】CD34の発現によるインテグリンを介した細胞接着の阻害。(A)HEK293T細胞をもちいた伸展と接着アッセイ。HEK293T細胞(a, c, e and g) またはα4インテグリン発現ベクターを導入したHEK293T細胞 (α4-HEK293T細胞) (b, d, f and h) を GST (a, b, e and f) またはGST-CS1 (c, d, g and h) でコーティングしたウェルに播き、３０分間培養して細胞の伸展を観察した。GST-CS1でコーティングしたウェルに播いたα4-HEK293T細胞のみで伸展が見られた。これらのウェルを培地で洗浄したところ、GST-CS1でコーティングしたウェルに播いたα4-HEK293T細胞だけがウェルに残っていた (h)。他のウェルにはほとんど細胞が残っていなかった (e, f and g)。(B)CD34の強制発現がα4-HEK293細胞のインテグリンを介する伸展に与える影響。GFP発現ベクターを導入したα4-HEK293T細胞 (GFP-α4-インテグリンHEK293T細胞) (a) またはCD34-GFP 発現ベクターを導入したα4-HEK293T細胞 (CD34-GFP-α4インテグリンHEK293T細胞) (b) をGST-CS1処理したウェルに播き、これらの細胞の伸展を検討した。GFP-α4-HEK293T細胞はGST-CS1処理したウェル上で伸展した (a)。CD34-GFP-α4インテグリンHEK293T 細胞は丸いままだった (b)。Scale bar: 100μm. (C)CD34の強制発現がインテグリンを介する細胞接着に与える影響。GFP-α4インテグリンHEK293T細胞 (a)またはCD34-GFP-α4インテグリンHEK293T細胞 (b)はGST-CS1でコーティングしたウェルで30分間培養した。培地で３回洗った後、これらの細胞の接着を検討した。GFP-α4-HEK293T細胞に比べ、CD34-GFP-α4-HEK293T細胞はほとんどウェルに接着していなかった。それぞれの柱状図は接着した細胞数を示す (c) GFP-α4インテグリンHEK293T細胞、CD34-GFP-α4インテグリンHEK293T細胞、GSTおよびGST-CS1はそれぞれmock, CD34, GST and CS1で示す。(c) のデータは三回の実験の平均値標準誤差を表した。フローサイトメトリー法を用いて接着、非接着細胞におけるCD34タンパク質量を解析した (D)GST-CS1をコーティングしたウェルに接着しなかったCD34-GFP-α4-HEK293T細胞におけるCD34-GFPタンパク質の発現量は接着した細胞における発現量よりも多かった(d)。
【図８】CD43発現によるHEK293T細胞のインテグリン接着阻害。α4 インテグリンを発現させたHEK293T細胞にGFPあるいはCD43-GFPを発現ベクター導入により発現させ、α4β1 integrinの結合蛋白であるファイブロネクチンのCS-1ペプチドのGST fusion蛋白をコーティングしたプレートとの接着をみたのが(a)。CD43-GFP発現により細胞接着が阻害され、OSGEP処理により一部もどることがわかる。(b)はそれを数値化したもの。(c)はCD43-GFP発現細胞でCS-1プレートに接着したもの(bound)、接着しなかったもの(wash)、用いた細胞(total)、OSGEP処理したもので接着したもの(OSGEP)におけるGFPの発現量をFACSで調べたもの。接着しなかった細胞はCD43-GFPの発現量が高く、接着した細胞は低い。OSGEP処理した場合はGFPの発現量がやや高くなっているが、これはCD43の細胞外部分が切断されれば膜貫通部分・細胞質内部分が存在しても細胞接着を阻害しないことを示している。
【図９】細胞−基質間接着部位からのCD34排除(A)GST-CS1でコーティングしたプレート上へのKG-1細胞の伸展におけるPMAの効果。PMA処理をしたKG-1細胞 (b) は GST-CS1でコーティングしたプレート上に伸展した。一方非処理のKG-1細胞は伸展しなかった(a)。(B)インテグリンを介した接着面での微絨毛上のCD34の局在。GST-CS1でコーティングしたカバーガラスに貼付けたPMA処理KG-1細胞を抗CD34抗体 (a, c, e)または抗β1 インテグリン抗体 (b, d, f) を用いて染色した。それぞれdome-shaped cells (c and d) とspreading cells (e and f) の垂直方向の断面像を示す。GST-CS1をコーティングしたカバーガラスに貼付けたPMA処理KG-1細胞では CD34を伴った微絨毛は接着面から排除されていた (c and e)。一方、β1 インテグリンは接着面に残っていた (d and f) 。矢頭は接着面を指し示している。矢印は細胞−基質間接着面のβ1 インテグリン分子を示す。(C)PLLを介した接着面でのCD34の局在。PLL処理をしたカバーグラスに貼付けたKG-1細胞を抗CD34抗体(a)またはβ1インテグリン抗体(b)を用いて染色した。PLL処理したカバーガラスに貼付けたKG-1細胞では微絨毛上のCD34とβ1 インテグリンは接着面に残っていた (垂直方向の断面図参照)。すなわち、インテグリンを介さない物理化学的接着では、微絨毛およびCD34分子の接着面からの排除は起こらない。
【図１０】微絨毛形成とERM蛋白質リン酸化の関連(A)KG-1およびHEK293T細胞におけるERM蛋白質リン酸化の解析KG-1細胞にPMAを作用させた場合、あるいは、CD34を発現させたHEK293T細胞を細胞溶解液で溶解し、溶解液をSDS-PAGEで展開後ニトロセルロースメンブランに転写し、抗リン酸化ERM抗体および抗ERM抗体（セルシグナリング社）を用いたイムノブロッティングで解析した。その結果、KG-1細胞では元々ERM蛋白はリン酸化されているが、PMA添加により著しく減少すること、HEK293T細胞では元々ほとんどリン酸化されていないが、CD34発現により著しく増加することがわかった。(B)KG-1およびHEK293T細胞におけるリン酸化ERM蛋白質の局在リン酸化ERM蛋白質の細胞内局在について抗リン酸化ERM抗体を用いて解析した。その結果、KG-1細胞でもCD34を発現させたHEK293T細胞でもリン酸化ERMは微絨毛に局在していた。CS-1ペプチドをコートしたガラスプレート上でPMA処理したKG-1細胞が伸長した場合、微絨毛の減少に伴って抗リン酸化ERM抗体による染色は減少している。また、CD34を発現させないHEK293T細胞ではリン酸化ERMは細胞周囲のフィロポディアないしマイクロビライにわずかに認められるのに対し、細胞にCD34を発現させると細胞表面全体を覆う微絨毛上に増強して局在していた。
【図１１】(A)種々の細胞表面糖蛋白質を発現させたときのHEK293T細胞形態変化。CD34,CD43はいずれも血球系細胞表面の主要なシアロムチン糖蛋白質である。この２つの糖蛋白質はいずれもHEK293T細胞に発現させると細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こした。そこで、血球系細胞に発現している他のシアロムチン型糖蛋白質、Glycophorin-AおよびPSGL-1/CD162、ならびに血球系を含む様々な細胞に発現しておりCD43同様ERM蛋白質との結合ドメインを細胞質に有するCD44についても同様の検討を行った。GFPタグのCD43, CD44, マウスglycophorin-A, PSGL-1をHEK293Tに発現ベクターで発現させた細胞の位相差顕微鏡像とGFPを検出した蛍光顕微鏡像。CD43あるいはPSGL-1発現細胞では細胞が丸くなっているが、CD44あるいはGlycophorin発現細胞ではspreadしたままである。(B)CD43とCD44,あるいは、Glycophorin-Aとの間のキメラを用いた解析。CD43はHEK293T細胞に発現させると細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こす。一方、細胞表面ムチン型糖蛋白質であるGlycophorin-Aや、細胞質内ドメインでCD43同様にERM蛋白質に結合するCD44を発現させても細胞の円形化・マイクロビライ形成は起こらなかった。CD43分子内のどのドメインが細胞の円形化・マイクロビライ形成に必要か調べるために、CD43とGlycophorin-AあるいはCD44とのキメラ分子をHEK293T細胞に発現させ、細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こすかどうか観察した。（＋）（−）は左側に示す蛋白を発現させた時にHEK293T細胞が形態変化を起こすかどうか示している。例えば、一番上の分子だと、細胞外ドメインおよび細胞膜通過ドメインがCD43、細胞内ドメインがCD44のキメラ分子を発現させるとHEK293T細胞の形が丸く変形する。この解析の結果、CD43の細胞外ドメインと他の細胞表面蛋白質の細胞内ドメインのキメラ蛋白質はHEK293T細胞に発現させると細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こすのに対し、CD43の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインとCD44ないしGlycophorinの細胞外ドメインのキメラ蛋白質では細胞の円形化・マイクロビライ形成を起こさなかった。従って、CD43の細胞外ドメインが細胞の形態変化に必要であることがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、細胞表面におけるマイクロビライ形成を促進させる方法；
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
【請求項２】
前記細胞表面上のマイクロビライが、インテグリン分子を集約させたマイクロビライであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、本来接着性の細胞であり、細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、細胞表面のインテグリンのリガンド結合に基づく作用を制御する方法；
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
【請求項５】
前記インテグリンのリガンド結合に基づく作用が、インテグリンを介した細胞接着作用である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、血球系細胞であり、前記インテグリンのリガンド結合に基づく作用が血管内皮細胞表面への接着現象であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、本来接着性の細胞であり、細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項８】
本来接着性の細胞であって、かつ細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞に対して、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、接着性細胞を浮遊性細胞に変換する方法；
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
【請求項９】
細胞表面のインテグリンのリガンド結合に基づく作用を制御する物質のスクリーニング方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法;
（ａ）本来接着性の細胞であり、細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることにより、接着性細胞を浮遊性細胞に変換する工程、
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（ｂ）（ａ）の細胞を培養し、細胞表面のマイクロビライ形成が促進された細胞を取得する工程、
（ｃ）（ｂ）の細胞に対して、被検物質を作用させ、細胞表面のマイクロビライ形成を促進するか又は抑制する効果が存在することを確認する工程。
【請求項１０】
前記工程（ｂ）及び／又は（ｃ）において、細胞表面のマイクロビライ形成の促進又は抑制を、細胞の接着性の増減を観察することにより確認することを特徴とする、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記被検物質が、あるタンパク質をコードするＤＮＡであり、前記被検物質を作用させる方法が被検物質を組換えＤＮＡとして前記細胞内に導入することである、請求項９又は１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記スクリーニング方法が、白血球由来細胞のHoming現象又は血管外遊走現象を促進又は阻害する物質の候補を選択するための方法である、請求項９〜１１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記スクリーニング方法が、癌細胞の浸潤転移性を阻害する物質の候補を選択するための方法である、請求項９〜１１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、細胞表面におけるマイクロビライ形成を促進させる方法；
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
【請求項２】
前記細胞表面上のマイクロビライが、インテグリン分子を集約させたマイクロビライであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、本来接着性の細胞であり、細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、細胞表面のインテグリンのリガンド結合に基づく作用を制御する方法；
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
【請求項５】
前記インテグリンのリガンド結合に基づく作用が、インテグリンを介した細胞接着作用である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、血球系細胞であり、前記インテグリンのリガンド結合に基づく作用が血管内皮細胞表面への接着現象であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、本来接着性の細胞であり、細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項８】
本来接着性の細胞であって、かつ細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞に対して、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることを特徴とする、接着性細胞を浮遊性細胞に変換する方法；
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質。
【請求項９】
細胞表面のインテグリンのリガンド結合に基づく作用を制御する物質のスクリーニング方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法;
（ａ）本来接着性の細胞であり、細胞表面にマイクロビライを全く、もしくはほとんど形成していない細胞に、下記の（１）〜（３）の群から選ばれる少なくとも1つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを導入し、当該蛋白質を細胞表面で発現させることにより、接着性細胞を浮遊性細胞に変換する工程、
（１）ＣＤ３４蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（２）ＣＤ４３蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（３）ＰＳＧＬ−１／ＣＤ１６２蛋白質又は少なくともその細胞外ドメインを含む融合蛋白質、
（ｂ）（ａ）の細胞を培養し、細胞表面のマイクロビライ形成が促進された細胞を取得する工程、
（ｃ）（ｂ）の細胞に対して、被検物質を作用させ、細胞表面のマイクロビライ形成を促進するか又は抑制する効果が存在することを確認する工程。
【請求項１０】
前記工程（ｂ）及び／又は（ｃ）において、細胞表面のマイクロビライ形成の促進又は抑制を、細胞の接着性の増減を観察することにより確認することを特徴とする、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記被検物質が、あるタンパク質をコードするＤＮＡであり、前記被検物質を作用させる方法が被検物質を組換えＤＮＡとして前記細胞内に導入することである、請求項９又は１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記スクリーニング方法が、白血球由来細胞のHoming現象又は血管外遊走現象を促進又は阻害する物質の候補を選択するための方法である、請求項９〜１１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記スクリーニング方法が、癌細胞の浸潤転移性を阻害する物質の候補を選択するための方法である、請求項９〜１１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１０−９４０７７（Ｐ２０１０−９４０７７Ａ）
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６７６７８（Ｐ２００８−２６７６７８）
【出願日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年７月２９日 日本糖質学会発行の「第２８回日本糖質学会年会講演概要集」に発表
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究「健康安心プログラム／糖鎖機能活用技術開発」産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年７月２９日 日本糖質学会発行の「第２８回日本糖質学会年会講演概要集」に発表
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究「健康安心プログラム／糖鎖機能活用技術開発」産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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